BR112012006567A2

BR112012006567A2 - moduladores.

Info

Publication number: BR112012006567A2
Application number: BR112012006567-0A
Authority: BR
Inventors: John Corbin; Mark Leslie White; Susan R. Watson; Vinay Bhaskar
Original assignee: Xoma Technology Ltd
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2010-09-25
Publication date: 2021-04-27
Also published as: IL245984A0; US20220227857A1; CN102985110A; US8926976B2; AU2010298037B2; ES2565058T3; DK2480254T3; US9944698B2; US11261247B2; WO2011038302A3; IL218770A; US20110076284A1; CA3061383A1; NZ625360A; BR112012006567B1; JP2013505953A; JP6309940B2; HK1173668A1; ES2733629T3; CA2773099C

Abstract

ANTICORPO, COMPOSIÇÃO ESTÉRIL, MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA ESTÉRIL E USO DE UM ANTICORPO. A presente invenção refere-se a anticorpos que modulam sinalização de receptor de insulina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO, COMPOSIÇÃO ESTÉRIL, MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSI- ÇÃO FARMACÊUTICA ESTÉRIL E USO DE UM ANTICORPO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório US 61/246.067, depositado em 25 de setembro de 2009, Pedido de Patente Provisório US 61/306.321, depositado em 19 de fevereiro de 2010, e Pedido de Patente Provisório US 61/358.749, deposi- tado em 25 de junho de 2010, cada uma dos quais sendo incorporado neste documento por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO - A presente invenção refere-se a novos moduladores e/ou ago- nistas de complexos de sinalização de receptor de insulina — insulina e aos Í métodos de rastreio desses moduladores e/ou agonistas. Tais moduladores e/ou agonistas podem, por exemplo, ser usados para tratar um sujeito mamí- fero que sofre de diabetes Tipo 2, obesidade, hiperglicemia, hiperinsuline- 7 mia, overdose de insulina, doença renal crônica, diabetes Tipo 1, resistência à insulina e estados de doença e condições caracterizadas por resistência à insulina ou para prevenir a ocorrência dos mesmos em um sujeito em risco.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente descrição diz respeito a novos moduladores e/ou agonistas do complexo de sinalização de receptor de insulina - insulina, a métodos de rastreio para esses moduladores e/ou agonistas e ao uso des- ses moduladores e/ou agonistas no tratamento ou prevenção de condições e estados de doença caracterizados por uma produção e/ou utilização anormal de insulina.

A insulina é um hormônio peptídico principal regulador da ho- meostase da glicose e crescimento celular. A primeira etapa na ação da insulina é a ligação do hormônio para o receptor de insulina (INSR), uma glicoproteina de membrana integral, também designada como CD220 ou HHF5. O INSR pertence à superfamília de receptor do fator de crescimento se ligam à insulina, e duas subunidades B transmembranas com atividade de tirosina cinase intrínseca. A sequência de aminoácidos de INSR é descrita em US 4.761.371 e como sequência de referência NCBI NP 000199.2. O INSR é expresso em duas isoformas, INSR-A e INSR-B. A estrutura tridi- mensional do fragmento do ectodomínio homodimérico intacto de INSR humanatem sido elucidada usando cristalografia de raios X (WO07/147213). As isoformas de INSR também formam heterodímeros, INSR-A/INSR-B e receptores de INSR/IGF-1R híbridos, cujo papel na fisiologia e doença ainda não está completamente compreendido (Belfiore et al., Endocrine Rev., 30(6):586-623, 2009).

Quando a insulina se liga ao INSR, o receptor é ativado por autofosforilação de tirosina e a tirosina cinase de INSR fosforila várias molé- culas efetoras, incluindo o substrato de receptor de insulina 1 (IRS-1), levan- do a ação do hormônio (Ullrich et al, Nature 313: 756-761, 1985; Goldfine et al, Endocrine Reviews 8: 235-255, 1987; White e Kahn, Journal Biol. Chem.

269: 1-4,1994). A fosforilação e a ligação de IRS-1 eventualmente levam a um aumento das moléculas transportadoras de glicose de alta afinidade (Glut4) na membrana externa de tecidos responsivos à insulina, incluindo as células do músculo e tecido adiposo e, portanto, a um aumento na absorção da glicose do sangue para estes tecidos. A Glut4 é transportada a partir de vesículas celulares para a superfície celular onde, em seguida, pode mediar o transporte de glicose na célula. Uma diminuição na sinalização de INSR leva a uma redução na absorção de glicose por células, a hiperglicemia (um aumento na circulação de glicose), e todas as sequelas resultantes.

A redução da absorção de glicose pode resultar na resistência à insulina, que descreve uma condição em que as quantidades fisiológicas de insulina são inadequadas para a produção de uma resposta normal de insulina a partir de células ou tecidos. A resistência à insulina grave está as- sociada com diabetes, enquanto que a resistência à insulina menos grave também está associada com uma série de estados e condições de doença presentes em aproximadamente 30-40% de indivíduos não diabéticos (revis- to em Woods et al, End, Metab & Immune Disorders -Drug Targets 9: 187- 198, 2009).

Os tratamentos atuais para a resistência a diabetes e à insulina são dirigidos para melhorar a secreção de insulina, reduzindo a produção de glicose, e aumentando a ação da insulina.

Atualmente, existem várias abordagens farmacológicas para o tratamento de diabetes Tipo 2 (Scheen et al., Diabetes Care, 22(9):1568- 1577, 1999; Zangeneh et al, Mayo Clin.

Proc. 78: 471-479, 2003; Mohler et al, Med Res Rev 29(1): 125-195, 2009). Eles atuam através de diferentes modos de ação: 1) sulfoniluréias (por exemplo, glimepirida, glisentida, sulfonilureia, AY31637) essencialmente estimulam a secreção de insulina; 2) biguanidas agem (por exemplo, a metformina) promovendo o uso de glicose, reduzindo a produção de glicose hepática e diminuindo a produção de glicose intestinal; 3) inibidores de alfa-glicosidase (por exemplo, acarbose, miglitol) abrandam a digestão de carboidrato e, consequentemente, a absor- ção do intestino e reduzem a hiperglicemia pós-prandial, 4) tiazol-idinedionas (por exemplo, troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, glipizida, balaglitazo- na, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazona, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, PIN 223, NIP 221, MK 0767, ciglitazona, adaglitazona, CLX 0921, darglitazona, CP 92768, BM 152054) intensificam a ação da insulina, promovendo assim o uso de glicose nos tecidos periféricos; 5) peptídeos tipo glucagon e agonistas (por exemplo, exendina) ou estabili- zantes dos mesmos (por exemplo, inibidores de DPPA, tais como sitaglipti- na) potencializam a secreção de insulina estimulada por glicose, e 6) insulina ou seus análogos (por exemplo, LANTUSO) estimulam o uso de glicose do tecido e inibem a produção de glicose hepática.

As abordagens farmacoló- —gicas acima mencionadas podem ser usadas individualmente ou em terapia de combinação.

No entanto, cada abordagem tem suas limitações e efeitos adversos.

Ao longo do tempo, uma grande porcentagem de sujeitos com diabetes Tipo 2 perdem a sua resposta a estes agentes. 63% dos pacientes com diabetes tipo 2 não conseguem atingir níveis globais de HDAic <7% como recomendado por American Diabetes Association, e são, portanto, de alto risco para desenvolver complicações.

Além disso, os pacientes progri- dem quase que invariavelmente até os estágios de declínio da função pan-

creática. O tratamento com insulina é geralmente instituído depois que a dieta, exercício e medicações orais não conseguiram controlar adequada- mente a glicose no sangue. Os inconvenientes de tratamento com insulina são a necessidade de injeção de fármacos, o potencial para a hipoglicemia, eoganho de peso. Consequentemente, existe ainda uma necessidade ur- gente de novos agentes antidiabéticos.

Anticorpos de ligação a INSR humana têm sido relatados em Soos et al., Biochem. J. 235: 199-208, 1986; Taylor et al, Biochem. J. 242: 123-129, 1987; Prigent et al, J. Biol. Chem. 265(17):9970-9977, 1990; Brindle et al., Biochem. J. 268: 615-620, 1990; Steele-Perkins e Roth, J. Biol. Chem. 265(16): 9458-9463, 1990; McKern et al, Nature 443(14): 218-221; Boado et al, Biotech e BioEng. 96(2): 381-3891; WO04/050016; Roth et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7312-7316, 1982; Morgan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 328-332, 1986; Lebrun et al., J. Bl. Chem. 268(15): 11272-11277, 1993; Forsayeth et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3448- 3451, 1987; Forsayeth et al, J. Biol. Chem. 262(9): 4134-4140, Goodman et al, J. Receptor Res. 14(6-8), 381-398, 1994; Ganderton et al, Biochem J. 288: 195-205, 1992; Spasov et al, Bull. of Exp. Biol. e Med. 144(1): 46-48, 2007; EP 2 036 574 A1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente descrição é dirigida aos agentes de ligação polipep- tídica, por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos, que modulam e/ou ago- nizam o complexo de sinalização de insulina-INSR pela ligação a regiões ex- tracelulares de INSR não complexado com insulina, para o INSR complexa- do com insulina, ou para ambos. INSR é um receptor de superfície celular ligado à membrana.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao receptor de insulina e/ou um complexo compreendendo insulina e o receptor de insulina com uma constante de dissociação de equilíbrio KW de 10º M ou menos, que é capaz de reforçar o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre a insulina e receptor de insulina (INSR) em cerca de 5 ve- zes a 200 vezes. Em uma modalidade, o anticorpo é capaz de reforçar o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre a insulina e o receptor de insulina pou cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes, ou cerca de 2 vezes a 25 vezes.

É ainda contemplado que a modulação seja de cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 ve- zes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ouaté4o0 vezes,ou até 30 vezes, ou até 20 vezes, ou até 10 vezes.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo reforça o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação em 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes ou mais, ou qualquer faixa entre qualquer um destes valores.

Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é qualquer um de Ka, Kp, a razão de uma taxa dividida pela taxa de dissociação, ou a razão de taxa de dissociação dividida pela taxa de associação.

Em modali- dades específicas exemplares, o anticorpo aumenta o Ka pelo número de vezes desejado, ou diminui Kp pelo número de vezes desejado, ou aumenta a razão de taxa de associação para taxa de dissociação pelo número de vezes desejado, ou diminui a razão da taxa de dissociação para taxa de associação o número de vezes desejado.

Em algumas modalidades, o parâà- metro de taxa de ligação é a taxa de associação ou taxa de dissociação.

Em modalidades específicas exemplares, o anticorpo aumenta a taxa de asso- ciação ou diminui a taxa de dissociação.

Alternativamente, em algumas mo- dalidades em que a afinidade de ligação não muda de forma detectável ou significativa, o aumento da taxa de associação e o aumento da taxa de dis- sociação pode deslocar a via de sinalização fora da sinalização mitogênica em direção à sinalização metabólica (absorção de glicose). Em uma modalidade, um anticorpo que reforça a afinidade de ligação entre a insulina e INSR é um modulador positivo.

Em um outro aspecto, o anticorpo é um agonista.

Em um aspecto relacionado, um anticorpo que ativa o INSR sem dependência de insulina é um agonista alostérico. Em certas modalidades, a invenção fornece um anticorpo agonista alostérico que se liga ao receptor de insulina com uma afinidade de pelo menos 10º,10, 107, 10º, 10º M e (a) exibe atividade agonista máxima que é de 20% -80% que a atividade ago- nista máxima de insulina quando medida em um ensaio de pAKT, (b) quando presente, não altera a ECs5,o de insulina para INSR por mais de 2 vezes, e (c), quando presente, não altera o Kp de insulina para INSR por mais de 2 ve- zes.

Em uma modalidade relacionada, o agonista alostérico exibe uma resposta agonista máxima que é 80% ou menos da resposta agonista máxima de insulina, por exemplo, 15% -80%, 20-60%, 20%-40% ou 15%- 30%. Em certas modalidades, os anticorpos constitutivamente ativam INSR com uma resposta agonista máxima que é pelo menos cerca de 15%, 20%,

15. 25%, 30%, 35%, 40%, e até 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75% ou 80% da resposta agonista máxima de insulina. Entende-se que qualquer combi- nação de qualquer um dessas faixas de pontos finais é contemplada sem ter de recitar cada combinação possível.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga a um receptor de insulina e/ou um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina com uma constante de dissociação de equilíbrio KW de 10ºM ou menos, que é capaz de enfraquecer o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre a insulina e o receptor de insulina pou cerca de 1,5 vezes a 100 vezes. Em uma modalidade, o anticorpo é capaz de enfraquecer o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre a insulina e o receptor de insulina pou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou 1,5 vezes a 25 vezes, ou 2 vezes a 50 vezes. É ainda contemplado que a modulação é de cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 Vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ou até 40 vezes, ou até 30 vezes, ou até 20 vezes, ou até 10 vezes. Em uma modalidade adicional, o anticorpo enfraquece o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação em 1,5, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 vezes ou mais, ou qualquer faixa entre qualquer um destes valores. Em algumas modalidade, a afinidade de ligação é qualquer um de Ka, Ko, a razão da taxa de associação dividida pela taxa de dissociação, a razão da taxa de dissociação dividida pela taxa de associação. Em modalidades específicas exemplares, o anticorpo diminui Ka pelo número de vezes desejado, ou aumenta Kp pelo número de vezes desejado, ou diminui a razão de taxa de associação para taxa de dissocia- ção pelo número de vezes desejado, ou aumenta a a razão de taxa-ff para taxa de associação pelo número de vezes desejado. Em algumas modali- dades, o parâmetro de taxa de ligação é a taxa de associação ou taxa de dissociação. Em modalidades específicas exemplares, o anticorpo diminui a taxa de associação ou aumenta a taxa de dissociação.

Em uma modalidade, um anticorpo que enfraquece a afinidade de ligação entre a insulina e INSR é um modulador negativo. Em algumas modalidades específicas, um anticorpo que enfraquece a afinidade de liga- ção entre a insulina e INSR é um antagonista. Em ainda outra modalidade, um anticorpo que reforça ou enfra- quece o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre insulina e receptor de insulina compreende pelo menos uma CDR de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), estabelecida pela SEQ ID: 151-3803. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende uma região variável de ca- deia pesada madura de SEQ ID NO: 151-303. É contemplado que qualquer um dos anticorpos acima compreende ainda uma região constante derivada de humano ou consenso humana ou humana adequada, por exemplo, IgG1, IgG2,1/gG3, ou IgG4 ou um híbrido da mesma. Em uma modalidade adicional, o anticorpo que reforça ou enfra- quece o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre a insu-

lina e o receptor de insulina compreende pelo menos uma CDR de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, ou LCDR3) definida na SEQ ID NOS: 1-150. Em ainda outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve madura de SEQ ID NO: 1-150. É contemplado que qualquer um dos anticorpos acima compreende ainda região constante de cadeia leve kappa ou lambda humana.

Em uma modalidade, o anticorpo se liga ao receptor de insulina. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo se liga à subunidade a de INSR. Em uma modalidade adicional, o anticorpo se liga à subunidade B de INSR.Em ainda outra modalidade, o anticorpo se liga à subunidade a e B do receptor. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo se liga a um comple- xo de receptor de insulina/insulina. Em uma outra modalidade, o anticorpo que se liga ao complexo de insulina/INSR não se liga de forma detectável ao receptor de insulina individualmente, por exemplo, na ausência de insulina, ouinsulina individualmente.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente ao receptor de insulina e/ou um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina com uma constante de dissociação de equilíbrio Ko de 10ºM ou menos, compreendendo pelo menos uma CDR de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) de SEQ ID NOS: 151-303. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 151-303. É contemplado que qualquer um dos anticorpos acima compreende ainda uma região constante derivada de humano ou consenso humana ou humana adequada, por exemplo, IgG1, IgG2,1/g9G3, ou IgG4 ou um híbrido da mesma.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo que se liga especifi- camente ao receptor de insulina e/ou um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina com uma constante de dissociação de equilíbrio Kp de 10ºM ou menos, compreende pelo menos uma CDR de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, ou LCDR3) estabelecida na SEQ ID NOS: 1-150. Em ainda outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável de ca- deia leve de SEQ ID NO: 1-150. É contemplado que qualquer um dos anticorpos acima compreende ainda região constante de cadeia leve kappa ou lambda humana.

É ainda contemplado que qualquer um dos anticorpos descritos acima compreende Uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada estabelecidas na SEQ ID NO: 151-303. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende uma, duas ou três CDRs da cadeia leve estabele- cidas na SEQ ID NO: 1-150.

Em uma modalidade, o anticorpo se liga ao receptor de insulina.

Em uma modalidade relacionada, o anticorpo se liga a um complexo de in- sulina/INSR. Em uma outra modalidade, o anticorpo que se liga ao complexo de insulina/INSR não se liga de forma detectável ao receptor de insulina indi- vidualmente ou insulina individualmente.

É ainda contemplado que um anticorpo que reforça o parâmetro detaxade ligação ou afinidade de ligação da insulina e receptor de insulina ativa o receptor de insulina em pelo menos 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente em um ensaio de AKT fosforilado. Em uma modalidade rela- cionada, o INSR é ativado pou pelo menos 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ou 80% do sinal máximo de insulina. Em outra modalidade, o anticorpo que reforça o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de insulina/INSR ativa menos de 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente em um ensaio de AKT fosforilado. Em uma modalidade relacionada, o INSR é ativado por me- nos de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do sinal máximo de insu- lina. Em algumas modalidades, o INSR não é detectável ativado pelo anti- corpo.

É ainda contemplado que o anticorpo reduz os níveis de glicose no sangue em jejum, em um sujeito que tem glicose elevada no sangue, hiperglicemia, ou distúrbio associado com resistência à insulina, para a faixa —normalde níveis de glicose. Em uma modalidade, o anticorpo ou agonista de modulação positiva reduz os níveis de glicose no sangue em jejum no sujeito por aproximadamente 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais.

Em uma modalidade, o anticorpo refere-se a um anticorpo ou fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Exemplos de anticorpos ou fragmentos de anticorpos incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anti- corpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos multiespecífico, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio (dAb), fragmen- tos de região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos enxer- tados em CDR, anticorpos de cadeia única (scFv), fragmentos de anticorpos de cadeia única, anticorpos quiméricos, diacorpo e triacorpo e tetracorpo e —minicorpo, anticorpo linear; anticorpo recombinante quelante, tricorpo ou bi- corpo, um intracorpo, um nanocorpo, um imunofarmaceutico modular peque- no (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação ao antígeno, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH, ou uma variante ou um derivado do mesmo, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação ao antígeno específica para o polipeptídeo, tais como sequências de uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo é um anticorpo humano.

Em algumas modalidades específicas, a invenção exclui anticor- pos de roedores, ou seja, anticorpos produzidos por um hibridoma de células de roedor (por exemplo, de murino, rato). Tais anticorpos, sejam produzidos pelo hibridoma ou de forma recombinante, teriam sequências de aminoáci- dos de estrutura de roedor e seriam imunogênicos, se administrados a hu- manos. Em algumas modalidades específicas, a invenção exclui os anticor- pos de roedores divulgados em qualquer uma das seguintes referências, incorporadas neste documento por referência na sua totalidade: Soos et al., Biochem. J. 235: 199-208, 1986; Taylor et al., Biochem. J. 242: 123-129, 1987; Prigent et al., J. Biol. Chem. 265 (17) :9970-9977, 1990; Brindle et al., Biochem.dJ. 268: 615-620, 1990; Steele-Perkins e Roth, J. Biol. Chem. 265 (16): 9458-9463, 1990; McKern et al., Nature 443 (14): 218-221; Boado et al., Biotech e Bioeng. 96 (2): 3881-391; WO04/050016; Roth et al., Proc. Natl.

Acad.

Sci.

EUA 79: 7312-7316, 1982; Morgan et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 83: 328-332, 1986; Lebrun et al., J.

Bl.

Chem. 268 (15): 11.272-11.277, 1993; Forsayeth et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA 84: 3448-3451, 1987; Forsayeth et al., J.

Biol.

Chem. 262 (9): 4134-4140, Goodman et al., 'J.

Receptor Res. 14 (6-8), 381-398, 1994; Ganderton et al., Biochem J. 288: 195-205, 1992; Spássov et al., Buli. de Exp.. Biol. e Med. 144 (1): 46-48, 2007; PE 2 036 574 Al.

No entanto, a invenção pode incluir versões humanizadas de tais anticorpos de roedores, métodos de tratamento usando tais anticorpos humanizados, e composições farmacêuticas estéreis compre- endendo tais anticorpos humanizados.

Em algumas modalidades específi- cas, a invenção exclui o anticorpo humanizado 83-14 relatado em Boado et al., Biotech e Bioeng. 96 (2): 381-391 ou WO04/050016. Em modalidades exemplares, a invenção contempla: um anticorpo monoclonal que retém qualquer uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, ou LCDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 151-303 e SEQ ID NOs: 1-150, respectivamente, incluindo opcionalmente uma ou duas mutações em tal CDR(s), por exemplo, uma substituição conservativa ou não conservativa, e, opcionalmente, emparelhadas como estabelecido na Tabela 3; um anticorpo monoclonal que retém todas as HCDR1, HCDR?2, HCDR3, ou a região variável de cadeia pesada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 151-303, incluindo opcionalmente uma ou duas mutações em qualquer uma de tal CDR(s), opcionalmente compreendendo ainda qualquer região constante de cadeia pesada adequada, por exemplo, IgG1, IgG2, 1gG3, IgG4,!gM, IgA1, IgA2, ou IgE ou um híbrido da mesma; um anticorpo monoclonal que retém todas a LCDR1, LOCDR?2, LCDR3, ou a região variável de cadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-150, incluindo opcionalmente uma ou duas mutações em qualquer uma de tal CDR(s), opcionalmente compreendendo ainda qualquer região constante de cadeia leve adequada, por exemplo, uma região constante da cadeia leve kappa ou lambda; uma preparação purificada de um anticorpo monocional, com-

preendendo a região variável de cadeia leve e as regiões variáveis de cadeia pesada conforme definidas na SEQ ID NOs: 1-303 e emparelhadas como estabelecido na Tabela 3; um anticorpo monoclional que se liga ao mesmo epítopo linear ou tridimensional de INSR como um anticorpo compreendendo uma região variável definida na SEQ ID NO: 1-303, por exemplo, como determinado através de cristalografia de raios X ou outras técnicas biofísicas e bioquími- cas, como a troca de deutério acoplada à espectrometria de massa, digita- lização de alanina e ELISA de fragmento peptídico; um anticorpo monoclonal que compete com um anticorpo com- preendendo uma região variável definida na SEQ ID NO: 1-303, opcional- mente emparelhado como na Tabela 3, para a ligação a INSR humano por mais do que cerca de 75%, mais do que cerca de 80%, ou mais do que cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende todas as três CDRs da cadeia leve, todas as trêê CDRs de cadeia pesada, ou todas as seis CDRs de um anticorpo compreendendo uma região variável definida na SEQ ID NO: 1-303. Em algumas modalidades exemplares, duas CDRs da cadeialeve de um anticorpo podem ser combinadas com uma terceira CDR de cadeia leve de um anticorpo diferente. Alternativamente, uma LCDR1 a partir de um anticorpo pode ser combinada com uma LCDR?2 a partir de um anticorpo diferente e uma LCDR3 de ainda outro anticorpo, particularmente onde as CDRs são altamente homólogas. Da mesma forma, duas CDRs de cadeia pesada de um anticorpo podem ser combinadas com uma terceira CDR de cadeia pesada de um anticorpo diferente, ou uma HCDR1 a partir de um anticorpo pode ser combinada com uma HCDR?2 a partir de um anticorpo diferente e uma HCDR3 de ainda um outro anticorpo, particular- mente onde as CDRs são altamente homólogas.

As CDRs de consenso podem também ser usadas. Qualquer uma das CDRs consenso derivadas neste documento podem ser combina- das com outros duas CDRs da mesma cadeia (por exemplo, pesada ou leve)

de qualquer um dos anticorpos descritos neste documento, por exemplo, para formar uma região variável de cadeia pesada ou leve adequada.

Em um aspecto, a invenção fornece variantes ou derivados de anticorpos descritos neste documento. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo é marcado com uma fração detectável como descrito neste documento. Em uma modalidade adicional, o anticorpo é conjugado com um grupo hidrofóbico descrito neste documento.

As variantes dos anticorpos incluem anticorpos tendo uma muta- ção ou alteração em uma sequência de aminoácidos fornecida aqui, inclu- indo uma inserção, deleção ou substituição de aminoácido, por exemplo, uma substituição conservativa ou não conservativa.

Em algumas modalidades, um anticorpo é fornecido o qual com- preende um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à região variável de cadeia pesada definida na SEQ ID NO: 151-303 e/ou uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à região variável de cadeia leve estabelecida na SEQ ID NO: 1-150, o anticorpo compreendendo ainda, pelo menos, uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 ou CDRL3. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos com a identidade percentual para a região variável de cadeia leve pode compreender uma, duas ou três das —CDRs de cadeia leve. Em outras modalidades, a sequência de aminoácidos com a identidade percentual para a região variável de cadeia pesada pode compreender uma, duas ou três das CDRs de cadeia pesada.

É contemplado que os anticorpos da invenção podem ter uma, ou duas ou mais substituições de aminoácidos nas regiões CDR do anticor- po,porexemplo, substituições conservativas.

Em uma modalidade relacionada, os resíduos da estrutura são alterados. As regiões de estrutura de cadeia pesada que podem ser alteradas se encontram dentro de regiões designadas H-FR1, H-FR2, H-FR3 e H-FR4, que circundam os resíduos de CDR de cadeia pesada, e os resí- duos das regiões de estrutura de cadeia leve que podem ser alterados encontram-se dentro das regiões designadas L-FR1, L-FR2, L-FR3 e L-FRA4, que circundam os resíduos de CDR de cadeia leve. Um aminoácido dentro da região de estrutura pode ser substituído, por exemplo, com qualquer aminoácido adequado identificado em uma estrutura humana ou estrutura de consenso humana.

É ainda contemplado que a invenção fornece um polipeptídeo purificado compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-150 fundidas com qualquer uma das sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 151-303, opcionalmente emparelhadas como as regiões variáveis de cadeia leve/pesada estabelecidas na Tabela 3, ou seus frag- mentos, que incluem pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 1-150 e SEQ 1IDNO:151-303, opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3, em que o polipeptídeo se liga receptor de insulina, a insulina ou complexo de receptor de insulina/insulina.

É contemplado que os anticorpos da invenção, incluindo os polipeptídeos compreendendo a totalidade ou uma porção de um fragmento de ligação ao antígeno, em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-303, retém afinidade de ligação, por exemplo, tal como medido por Kp, para o receptor de insulina, insulina ou um complexo de insulina/INSR de 10,108, 107, 10, 10º M ou menos (em que um valor mais baixo indica uma afinidade de liga- ção mais elevada), opcionalmente, como medido por ressonância de plas- monde superfície.

Em algumas das modalidades anteriores, a invenção contempla um anticorpo que se liga ao receptor de insulina e/ou um complexo compre- endendo insulina e receptor de insulina, com uma constante de dissociação de equilíbrio Ky de 10ºM ou menos, que é capaz de reforçar a afinidade de ligação entre insulina e o receptor de insulina em cerca de 5 vezes a 500 vezes. Em uma modalidade, o anticorpo é caracterizado pelas seguintes pro- priedades de ligação de constante de dissociação de equilíbrio Kp: (i) dito anticorpo liga-se com uma constante de dissociação de equilíbrio KW de cerca de 10ºM, 108, 107, 108, 10º, 10º, 10º M ou menos, para um com- plexo compreendendo insulina (C1) e receptor de insulina (C2), e (ii) qual- quer de K fcicaja, K facajo1, OU K facijca é pelo menos cerca de 5 vezes mais baixado que qualquer dos Kac2 ou Kaci. Em uma modalidade relacionada, qualquer um dos Krcicaja, Kiacalo1, OU Kfacijca é de cerca de 5 vezes a 200 vezes menor do que qualquer dos Kaca Ou Kac1. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um complexo de receptor de insulina/insulina. Em outras modalidades, o anticorpo se liga ao receptor de insulina individualmente, em uma forma não complexada. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo não se liga de forma detectável ao receptor de insulina individualmente, por exemplo, na ausência de insulina. Em certas modalidades, o anticorpo é capaz de reforçar a afinidade de liga- ção entre a insulina e o receptor de insulina em pelo menos cerca de 5 ve- zes, opcionalmente até cerca de 200 vezes, opcionalmente, para cerca de 100 vezes. É ainda contemplado que, em algumas modalidades, a afinidade de ligação é qualquer um de Ka, Kp, a razão da taxa de associação para taxa de dissociação, ou a razão da taxa de dissociação para taxa de associação.

Em algumas modalidades, para qualquer um dos anticorpos des- critos neste documento, a diferença na afinidade de ligação ou parâmetros de taxa de ligação varia de cerca de 1,5 vezes a cerca de 1000 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 500 vezes, cerca de 1,5 vezes para cerca de 100 vezes, ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 500 vezes, ou cerca de 5 vezes a cerca de 200 vezes, por exemplo, pelo menos cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes,18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 500 vezes, ou até 200 vezes, ou até 150 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ou até 40 vezes, até 30 vezes, até 20 vezes, ou até 10 vezes, ou até 5 vezes ou até 3 vezes.

Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo ago- nista que se liga ao receptor de insulina com uma afinidade, por exemplo, Ko, de 10,108, 107, 108, 10º 10º, 10** M ou menos, opcionalmente, que exibe atividade agonista máxima que é de 20% -100% a de atividade agonis- ta máxima de insulina quando medida no ensaio de pAKT. Em um aspecto relacionado, a invenção contempla um anticorpo agonista alostérico que se liga ao receptor de insulina com uma afinidade, por exemplo, Kp de 10,10, 107, 108, 10º, 10º, 10 M ou menos e (a) exibe atividade agonista máxi- ma que é de 20% -80% da atividade agonista máxima de insulina quando medida no ensaio de pAKT, (b) quando presente não altera a ECso de insulina para INSR por mais de 2 vezes ou 3 vezes, e (c) quando presente não altera o Kp de insulina para INSR por mais do que 2 vezes ou 3 vezes. É ainda contemplado que, em algumas modalidades, a afinidade de ligação é qualquer uma de Ka, Kp, a razão da taxa de associação para taxa de disso- ciação, ou a razão da taxa de dissociação para taxa de associação.

É contemplado, em certas modalidades, que qualquer dos anti- corpos acima pode também exibir atividade agonista fraca, por exemplo, ati- va o receptor de insulina pou pelo menos 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente, em um ensaio de AKT fosforilado. Em uma modalidade adi- cional, o anticorpo ativa o receptor de insulina por menos de 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente, em um ensaio de AKT fosforilado.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo em se- —quênciasda região variável de cadeia pesada madura estabelecidas na SEQ ID NOs:, 281, 278, 277, 209, 275, 223, 284, 276, e 236 e uma região variável de cadeia leve selecionada dentre o grupo consistindo em sequências da região variável de cadeia leve madura estabelecidas na SEQ ID NOs: 141, 138, 137, 35, 135, 57, 144, 136, e 98, opcionalmente emparelhadas como estabelecidas na Tabela 3.

Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende (a) a região variável de cadeia pesada de qualquer de AbOO6, AbO3O, AbOO4, AbO13,

Ab0o09, AbOO07, AbO11, ABOO1, AbO12, AbO1O, AbOO3, AbOO8, AbOO2, AbOO5, AbO76, AboO77, AbO79, AbO8O, AbO83, AbO59, AbO78, AbO85 ou estabelecida na SEQ ID NO: 291, 196, 239, 267 e 271 e a região variável de cadeia leve de qualquer de AbOO6, AbO30, AbOO4, AbO13, AbOO9, AbOO7, AbO11, ABOO1, AbO012, AbO1O, AbOO3, AbOO8, AbOO2, AbOOS5, AboO76, AbO077, AbO79, AbO8O, AbO83, AbO59, AbO78, AbO8S5 ou estabelecida na SEQ ID NO: 76, 80, 101, 128 e 132, opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3 e preferencialmente as porções maduras das mesmas, ou (b) uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada de qualquer um de AbOO6, AbO3O, AbOO4, AbO13, AbOO9, AbOO7, AbO11, AbOO1, AbO12, AbO10, AbOO3, AbOO8, AbOO2, AbOOS5, AbO76, Abo77, AbO79, AbO8SO, AbO8B3, AbO59, AbO78, AbO8S ou estabelecida na SEQ ID NO: 291, 196, 239, 267 e 271 e/ou uma, duas ou três CDRs de cadeia leve de qualquer de Ab0OO6, AbO3O, AbOO4, AbO 13, AbOO9, AbOO7, AbO11, AbOO1, AbO12, AbO1O, AbOO3, —AbOO8, AbOO2, AbOOS5, AbO76, Abo77, AbO79, AbO8O, AbO83, AbO59, AbO78, AbO85 ou estabelecida na SEQ ID NO: 76, 80, 101, 128, e 132, incluindo opcionalmente uma ou duas mutações em qualquer uma, duas ou três de tais CDRs de cadeia pesada ou leve, por exemplo, uma substituição conser- vativa ou não consertiva, opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3, ou (c)todas as seis CDRs de qualquer de AbOO6, AbO3O, AbO04, AbO013, AbOO9, AbOO7, AbO11, ABOO1, AbO12, AbO1O, AbOO3, AbOO8, AbOO2, AbOOS5, Abo76, Abo77, AbO79, AbO8O, AbO83, AbO59, AbO78, AbO85 ou anticorpos tendo a regiões variáveis estabelecidas na SEQ ID NO: 76, 80, 101, 128, 132, 291, 196, 239, 267, 271 e, opcionalmente emparelha- dascomo estabelecido na Tabela 3.

Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo que compete com qualquer um dos anticorpos descritos neste documento, por exemplo, pou pelo menos 70%, 75%, ou 80%. Em certas modalidades, o anticorpo exibe competição maior ou igual a 70%, por exemplo, pelo menos 75% ou pelo menos 80% de competição, com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab079, Ab076, AbO083, AbO8O, AbO62, AbO20, AbO19, AbO88, e AbO89 e, opcionalmente,

exibe competição maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab086, AbO64, ABOO1, e Ab018. Opcionalmente, o anticorpo não compete com um ou mais de AbO062 e AbO86 e, opcionalmente, podem se ligar ao complexo ou receptor deinsulinahumana e de murino.

Em uma modalidade relacionada, o anticorpo exibe competição maior ou igual a 70%, por exemplo, pelo menos 75% ou, pelo menos, 80% de competição, com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecio- nados do grupo consistindo em Ab040, AbO062, AbOSO, ABOO1, e AbO18 e, opcionalmente, exibe competição maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab037, Abo78, AbO8S, AbO8SO, e AbO85. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo não compete com qualquer um, dois, três ou mais dos anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab053, AbO64, 83-7, ADO 19, AbO8S8, e —AbO89. Opcionalmente, o anticorpo liga-se ao complexo ou receptor de insu- lina humana ou de murino. Em uma outra modalidade, o anticorpo exibe competição maior ou igual a 70%, por exemplo, pelo menos 75% ou pelo menos 80% de competição, com qualquer um, dois, três ou todos os anticor- pos selecionados do grupo consistindo em Ab064, Ab062, AbO85, e AbO78.

Opcionalmente, o anticorpo não exibe competição com qualquer um, dois, três ou mais dos anticorpos selecionados dentre o grupo consistindo em Ab077, ABOO1, AbO18, AbO3O, AbO37, AbO79, AbO76, AbOS3, AbO19, AbO88, AbO89, e AbO40. Opcionalmente, o anticorpo liga-se tanto ao recep- tor ou complexo de insulina humana quanto de murino.

Em um outro aspecto, uma invenção fornece um anticorpo que se liga um receptor de insulina e/ou um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina com uma constante de dissociação de equilíbrio Ko de 10ºM ou menos, que é capaz de enfraquecer a afinidade de ligação entre a insulina e o receptor de insulina pou pelo menos cerca de 3 vezes, opcional- mente até 1000 vezes. Em certas modalidades, o anticorpo enfraquece a afinidade entre a dita insulina e o receptor de insulina pou cerca de 3 vezes a 500 vezes. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é qualquer uma de Ka, Kp, a razão da taxa de associação para taxa de dissociação, ou a razão da taxa de dissociação para taxa de associação. Em algumas modalidades, para qualquer um dos anticorpos des- critos neste documento, a diferença no parâmetro de taxa de ligação ou afi- —nidade de ligação varia entre cerca de 1,5 vezes a cerca de 1000 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 500 vezes, cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 Vezes, Ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, cerca de 5 vezes a cerca de 500 vezes, ou cerca de 5 vezes a cerca de 200 vezes, por exemplo, pelo menos cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 500 vezes, ou até 200 vezes, ou até 150 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ou até 40 vezes, até 30 vezes, até 20 vezes, ou até 10 vezes, ou até 5 vezes ou até 3 vezes.

Em uma modalidade relacionada, o anticorpo aumenta a EC50 de atividade de sinalização de insulina por cerca de 2 vezes a 1000 vezes, opcionalmente em um ensaio de pAKT. Em certas modalidades, o anticorpo aumenta a EC50 pou pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 vezes.

Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em sequências de região variável de cadeia pesada madura estabelecidas na SEQ ID NOs: 241, 279, 258, 155, e 228 e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em sequências de região variável de cadeia leve ma- dura estabelecidas na SEQ ID NOs: 103, 139, 119, 8, e 89, opcionalmente emparelhadas como estabelecidas na Tabela 3.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende (a) a re- gião variável de cadeia pesada de qualquer de Ab087, AbO019, AbO88, AbO89, AbO20, AbOSO, AbO52, AbOSS, AbOS57, AbO61, AbO63, AbO6S, AbO7O,

AbO072, AbO74, AbO81 e a região variável de cadeia leve de qualquer de AbO87, AbO0 19, AbO88, AbO89, AbO20, AbOSO, AbO52, AbOSS, AbO57, AbOG61, AbO63, AbO65, AbO70, AbO72, AbO74, AbO81, preferencialmente as porções maduras das mesmas, ou (b) uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada de qualquer de Ab087, AbO19, AbO88, AbO8S9, AbO20, AbOSO, AbO52, AbOS5, AbO57, AbO61, AbO63, AbO65, AbO70, AbO72, AbO74, AbO8B1 e/ou uma, duas ou três CDRs de cadeia leve de qualquer de Ab087, AbO19, AbO88, AbO89, Ab020, AbO5O, AbO52, AbOS55, AbO57, AbO61, AbO63, AbO6GS, AbO70, AbO72, Ab074, AbO81, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer uma, duas ou três de tais CDRs de cadeia pesada ou leve, por exemplo, uma substituição conservativa ou não conservativa; ou (c) todas as seis CDRs de qualquer de Ab087, Ab0 19, AbO88, AbO89, AbO20, AbOSO, AbOS52, AbO55, AbO57, AbO61, AbO63, AbO6GS, AbO70, AbO72, AboO74, AbO81. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um anticorpo que compete com os anticorpos acima, em que o anticorpo exibe competi- ção maior que ou igual a 70%, por exemplo, pelo menos 75% ou pelo menos 80% de competição, com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab079, Ab076, Ab083, AbO8O, AbOG6?2, e Ab020, AbO019, AbO88, AbO89. Opcionalmente, o anticorpo não exibe com- petiçãocom qualquer um, dois, três ou mais dos anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab062, AbO86, AbOO1, AbO18, AbOSO, AbO37, AbO64; e opcionalmente, o anticorpo é apenas reativo a humano, e não se liga a complexo ou receptor de insulina de murino.

Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo que é um agonista, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em sequências de região variável de cadeia pesada madura estabelecidas na SEQ ID NOs: 195, 220, 303, 197, 208, 243, 245 e 251 e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em sequências de região variável de cadeia leve madura estabelecidas na SEQ ID NOs: 77, 50, 90, 84, 34, 104, 106 e 112, opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende (a) a região variável de cadeia pesada de qualquer de Ab021, Ab029, Ab022, AbO017, Ab023, AbO24, Abo025, Abo26, AbO31, AbO35, Ab027, AbOS6, AbO37, Ab028, AbO38, AbO39, AbO40, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO44, AbO45, AbO46, Ab047, AbO 18, AbO33, AbO48, AbO14, AbO15, AbO49, AbOSA4, AbOS1,

—AbO53,AbO54, AbO5S6, AbO58, AbO62, AbO64, AbOG6, AbO67, AbO6G8, AbO86, AbO69, AbO71, Abo73, AbO75, AbO82, AbO84 estabelecida na SEQ ID NOs:

252, 253, 263, 265 e 269 e a região variável de cadeia leve de qualquer de Ab021, Ab029, Abo22, Ab0 17, Abo23, AbO24, AbO25, AbO26, AbO31, AbO3S, Ab027, AbO36, AbO37, Abo28, AbO38, AbO39, AbO40, AbO41, AbO42, AbO32,

AbO43, Ab044, AbO45, AbO46, Abo47, AbO18, AbO33, AbO48, AbO14, AbO1S, Ab049, AbO34, AbOS1, AbO5S3, AbOS4, AbOS6, AbO58, AbO62, AbO6G4, AbOGG6, AbO67, AbO68, AbO86, AbO69, AbO71, AbO73, AbO75, AbO82, AbO84 ou estabelecida na SEQ ID NOs: 7, 113, 114, 124, 126 e 130, opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3 e preferencialmente as por-

çõesmaduras das mesmas, ou (b) uma, duas ou três CDRs de cadeia pesa- da de qualquer de Ab021, Ab029, Ab022, AbO17, Ab023, Ab0O24, AbO25, Ab026, AbO31, AbO35, Abo027, AbO36, AbO37, AbO28, AbO38, AbO39, AbO4O, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO44, AbO45, AbO46, AbO47, AbO18, AbO33, AbO48, Ab0 14, AbO15, AbO49, AbO34, AbOS1, AbO53, AbOS4, AbOS6, AbOS8,

—AbO62,AbO64, AbO66, AbO67, AbOG8, AbOS6, AbO69, AbO71, AboO73, AbO7S5, AbO082, AbO84 ou estabelecida na SEQ ID NOs: 252, 253, 263, 265 e 269 e/ou uma, duas ou três CDRs de cadeia leve de qualquer de Ab021, Ab029, Ab022, Ab0 17, Ab023, Abo024, AbO25, AbO26, AbO31, AbO35, AbO27, AbO36, AbO037, Ab028, AbO38, AbO39, AbO40, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO44,

—AbO45,Ab046, Ab047, AbO18, AbO33, AbO48, AbO14, AbO15, AbO49, AbOSA, AbOS51, AbO53, AbOS4, AbOS6, AbO58, AbO62, AbO64, AbOGG6, AbO67, AbOGS8, AbO86, AbO69, AbO71, AbO73, AbO75, AbO82, AbO84 ou estabelecida na SEQ ID NOs: 7, 113, 114, 124, 126 e 130, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer uma, duas ou três de tais CDRs de cadeia pe-

sada ou leve, por exemplo, uma substituição conservativa ou não conser- vativa, opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3; (c) to-

das as seis CDRs de qualquer de Ab021, Ab029, Ab022, AbO017, Ab023,

Ab024, Ab025, Ab026, AbO31, AbO35, Ab027, AbO36, AbO37, AbO28, AbO38, AbO39, AbO40, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO44, AbO45, AbO46, AbO47, AbO018, AbO33, AbO48, AbO 14, AbO15, AbO49, AbO3S4, AbOS1, AbO5S3, AbOSA, AbO56, AbO58, AbO62, AbO64, AbO66, AbO67, AbO68, AbOSG, AbO6G9, AbO71, —Ab073,Ab075, AbO82, AbO84 ou estabelecida na SEQ ID NOs: 7, 113, 114, 124, 126, 130, 252, 253, 263, 265 e 269, opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3. Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece um anticor- po que compete com os anticorpos acima para ligação ao alvo, em que o anticorpo exibe competição maior que ou igual a 70%, por exemplo, pelo menos 75% ou pelo menos 80% de competição, com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab030, AbO0S37, AbO53, AbOO01, AbO18, AbO6G4, AbO40 e opcionalmente exibe competição maior que ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticor- pos selecionados do grupo consistindo em Ab085 e AbO86. Opcionalmente, o anticorpo não exibe nenhuma competição com qualquer um, dois, três ou mais dos anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab079, AbO76 e Ab088; e opcionalmente liga-se ao complexo ou receptor de insulina tanto de humano quanto de murino.

Em um outro aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos que codificam anticorpos e polipeptídeos da invenção, vetores compreendendo tais polinucleotídeos, células hospedeiras compreendendo tais polinucleotí- deos ou vetores, e métodos para produção de anticorpos e polipeptídeos da invenção compreendendo o crescimento de tais células hospedeiras no meio de culturaem condições adequadas e opcionalmente isolamento do anticor- po ou polipeptídeo codificado das células hospedeiras ou meio de cultura, opcionalmente seguido por purificação adicional do anticorpo ou polipeptí- deo, por exemplo, como descrito neste documento.

Os anticorpos com as propriedades descritas neste documento — podem ser isolados usando um método de rastreio para determinar a ligação a INSR e modulação do complexo de insulina/INSR.

Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo de modu-

lação positiva que reforça a ligação de um primeiro componente (C1) a um segundo componente (C2) de um complexo de sinalização, dito anticorpo caracterizado pelas seguintes propriedades de ligação de constante de dis- sociação de equilíbrio Kp: (i) dito anticorpo se liga com uma constante de dissociação de equilíbrio K, de cerca de 10ºM ou menos, por exemplo, 10 SM ou menos, ou 107M ou menos, ou 10ºM ou menos, para qualquer um de C1, C2, ou um complexo compreendendo C1 e C2 (C1C2); e (ii) qualquer um de Krceicajas Kiacaic1, ou Kfacijca é pelo menos cerca de 50% (1,5 vezeses) menor que qualquer um de Kac2 ou Kac1. Em algumas modalidades qualquer um de Krcicaja, Kiacac1i, OU Kaacijca é cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes menor que qualquer um de Kaca2 ou Kaci; Ou cerca de 2 vezes a 25 Vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até cerca de 100 vezes, ou até cerca de 90 vezes, ou até cerca de 80 vezes, ou até cerca de 70 vezes, ou até cerca de 60 vezes, ou até cerca de 50 vezes, ou até cerca de 40 vezes, ou até cerca de 30 vezes, ou até cerca de 20 vezes, ou até cerca de 10 vezes menor.

Em algumas modalidades, qual- quer um de Krcicaja: Kaacalc1, OU Kiacijca é pelo menos cerca de 1,5 vezes menor que both of Kaca2 ou Kaci1; ou 1,5 vezes a cerca de 100 vezes menor, Ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de50 vezes, por exemplo, pelo menos cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 ve- zes ou 20 vezes, ou até cerca de 100 vezes, ou até cerca de 90 vezes, ou até cerca de 80 vezes, ou até cerca de 70 vezes, ou até cerca de 60 vezes, ou até cerca de 50 vezes, ou até cerca de 40 vezes, ou até cerca de 30 vezes, ou até cerca de 20 vezes, ou até cerca de 10 vezes menor.

Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo de modulação negativa que enfraquece a ligação de um primeiro documento (C1) a um segundo componente (C2) de um complexo de sinalização, dito anticorpo caracterizado pelas seguintes propriedades de ligação de constan- te de dissociação de equilíbrio Kp: (i) dito anticorpo se liga com uma cons- tante de dissociação de equilíbrio K, de cerca de 10ºM ou menos, por exemplo, 10ºM ou menos, ou 107M ou menos, ou 10ºM ou menos, para qualquer um de C1, C2, ou um complexo compreendendo C1 e C2 (C1C2), e (ii) qualquer um de Kac2 ou Kac: é pelo menos cerca de 50% (1,5 vezes) menor que qualquer um de Krcicaja;s Kaacaicis OU Kaacijca Em algumas modalidades, qualquer um de Kaca ou Kac: é pelo menos cerca de 1,5 vezes a 100 vezes menor que qualquer um de Krcicaja, Kiaacalci, OU Kfacijca; OU cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até cerca de 100 vezes, ou até cerca de 90 vezes, ou até cerca de 80 vezes, ou até cerca de 70 vezes, ou até cerca de 60 vezes, ou até cerca de 50 vezes, ou até cerca de 40 vezes, ou até cerca de 30 vezes, ou até cerca de 20 vezes, ou até cerca de 10 vezes menor.

Em algumas modalidades, qualquer um de Kaca ou Kac: é pelo menos cerca de 1,5 vezes menor que todos de Kricaja, Kiacajo1, OU Kac1jca; OU 1,5 vezes a cerca de 100 vezes menor, ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 Vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cercade 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 ve- zes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até cerca de 100 vezes, ou até cerca de 90 vezes, ou até cerca de 80 vezes, ou até cerca de 70 vezes, ou até cerca de 60 vezes, ou até cerca de 50 vezes, ou até cerca de 40 vezes, ou até cerca de 30 vezes menor, ou até cerca de 20 vezes, ou até cerca de 10 vezes.

Em modalidades específicas, C1 e C2 são selecionados dentre o grupo consistindo em insulina e receptor de insulina.

Em outro aspecto, a invenção contempla um método de prepa- ração de uma composição farmacêutica estéril, compreendendo a adição de um diluente estéril farmaceuticamente aceitável a um anticorpo da invenção. Opcionalmente quantidades pequenas de um conservante tal como um agente bactericida ou bacteriostático também estão incluídas na composi- ção.

Também contemplada é uma composição estéril compreenden- do um anticorpo da invenção e um diluente estéril farmaceuticamente acei- tável.

A invenção ainda contempla que os anticorpos da invenção mo- dulam a ligação entre o INSR e insulina ou análogos de insulina ou mimé- ticos de insulina. Os anticorpos da invenção preferencialmente também exi- bem propriedades biológicas desejáveis, incluindo, mas não se limitando a intensificação de absorção de glicose in vitro ou in vivo em modelos animais, e preferencialmente a absorção de glicose induzida por insulina exógena. Em algumas modalidades, os anticorpos são capazes de aumentar a veloci- dade ou quantidade total de absorção de glicose, ou ambos.

Em um outro aspecto, a invenção contempla um método de tra- tamento de um distúrbio associado com a resistência à insulina, compreen- dendo a administração a um sujeito em necessidade do mesmo de um anti- corpo positivo modulando ou anticorpo agonista da invenção numa quanti- dade eficaz para tratar a resistência à insulina. Em uma modalidade relacio- nada, o tratamento intensifica a absorção de glicose. Em uma modalidade adicional, a absorção de glicose intensificada é selecionada do grupo consis- tindo em uma elevação na taxa de absorção de glicose, uma elevação na quantidade total de absorção de glicose, ou ambas. É ainda contemplado que o tratamento reduz os níveis de glicose no sangue em jejum, em um su- jeito tendo níveis elevados de glicose no sangue, hiperglicemia, ou um distúrbio associado com resistência à insulina, de volta para a faixa normal de níveis de glicose no sangue em jejum. Em uma modalidade relacionada,

a glicose no sangue em jejum é reduzida em aproximadamente 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais em comparação com um sujeito não tratado.

Em aspectos relacionados, o tratamento reduz os níveis eleva- dosdeHbAlc, que são um marcador de níveis elevados de glicose durante o período de vários meses anteriores, e são indicativos de diabetes. Em modalidade adicionaiss, o tratamento melhora a tolerância à glicose preju- dicada. Em uma modalidade de tolerância à glicose é medida pelo teste de tolerância à glicose (GTT).

Em outras modalidades, o tratamento retarda, reduz ou normali- za o ganho de peso de um sujeito. Em uma modalidade, o tratamento reduz ou retarda o ganho de peso em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% em comparação com um sujeito não tratado. Em algumas modalidades, o tratamento retarda, reduz ou normaliza a perda de peso de um sujeito. Em uma modalidade, o tratamento reduz ou retarda a perda de peso em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% em comparação com um sujeito não tratado.

Em um aspecto relacionado, é contemplado que os anticorpos ou polipeptídeos descritos neste documento promovem ou induzem a perda de peso em um indivíduo. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para promover ou induzir a perda de peso pela administração de um anticorpo de modulação, seu fragmento ou polipeptídeo como descrito neste documento. Em uma modalidade, o anticorpo de modulação é um modulador positivo ou agonista parcial. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo de modulação é um modulador negativo.

Em certas modalidades, o tratamento resulta ainda na melhoria de um, dois, três ou mais sintomas de diabetes ou a resistência à insulina selecionado dentre o grupo consistindo em dislipidemia, triglicerídeos no plasma elevados, HOMA-IR elevado, colesterol não esterificado no plasma elevado, colesterol total no plasma elevado, insulina no plasma elevada (indicativo de resistência à insulina), razão de colesterol não-HDL/HDL baixa (ou razão de colesterol total/colesterol HDL baixa), e os níveis de leptina no plasma elevados (indicativo da resistência à leptina).

É ainda contemplado que os efeitos do tratamento também são medidos usando análise in vitro e in vivo usando fatores como descrito na descrição detalhada.

Em uma modalidade, o distúrbio associado com a resistência à insulina é selecionado do grupo consistindo em hiperglicemia, pré-diabetes, síndrome metabólica (também referida como síndrome de resistência à insulina), diabetes melitus Tipo 2, doença do ovário policístico (PCOS), doença do fígado gorduroso não-alcoólico (NAFLD), esteatohepatite não alcoólica (NASH), esteatose, obesidade, dislipidemia, síndrome de Rabson- Mendenhall, síndrome de Donohue ou Leprechaunism.

Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma condição ou distúrbio associado com a hiperinsulinemia, produção de anormal e/ou sensibilidade à insulina que se manifesta como excesso de sinalização de insulina, compreendendo a administração a um sujeito em ne- cessidade do mesmo de um anticorpo de modulação negativa ou um anticor- po antagonista da invenção em uma quantidade eficaz para tratar a super- produção e/ou sensibilidade de insulina. Em uma modalidade, o distúrbio as- sociado com a sensibilidade à insulina é selecionado do grupo consistindo em câncer, sarcoma de Kaposi, insulinoma, doença renal diabética, hipogli- cemia, nesidioblastose (doença difusa KATP-HI, doença focal de KATP-HI, ou "PHHI"), GDH-HI (Síndrome de Hiperinsulinismo/hiperamoniemia (HI/HA), hipoglicemia sensível à leucina, ou hipoglicemia sensível a diazóxido), sín- drome de desregulação de células de ilhotas, hipoglicemia da infância idio- pática, Hipoglicemia Hiperinsulinêmica Persistente da Infância (PHHI), Hi- perinsulinismo Congênito, hipoglicemia devido a falha renal (aguda ou crôni- ca) e hipoglicemia devido à doença dos rins crônica, por exemplo, tipo III, IV ou V.

O uso de qualquer dos anticorpos ou polipeptídeos anteriores da invenção que modulam a interação de sinalização de insulina-INSR na pre- paração de um medicamento para o tratamento de qualquer um dos distúr- bios aqui descritos está também contemplado. Seringas, por exemplo, serin-

gas pré-preenchidas ou de uso simples, ou recipientes estéreis selados, por exemplo, frascos, garrafas, vasos, e/ou kits ou pacotes compreendendo qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos anteriores, opcionalmente com instruções adequadas para o uso, são também contemplados.

Qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos anteriores da invenção pode ser administrado concomitantemente com quaisquer agentes antidiabéticos conhecidos na técnica ou descritos neste documento, como terapia adjunta. As composições compreendem qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos anteriores da invenção em conjunto com outros agentes —antidiabéticos são também contemplados.

Um certo número de agentes antidiabéticos são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a: 1) sulfonilureias (por exemplo, glime- pirida, glisentida, sulfonilureias, AY31637), 2) biguanidas (por exemplo, a metformina), 3) inibidores alfa-glicosidase (por exemplo, acarbose, miglitol); 4) tiazol-idinodionas (por exemplo, troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, glipizida, balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazo- na, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, PIN 223, NIP 221, MK 0767, ciglitazona, adaglitazona, CLX 0921, darglitazona, CP 92768, BM 152054); 5) peptídeos tipo glucagon (BPL) e análogos de GLP ou agonistas de receptor de GLP-1 (por exemplo, exendina) ou estabilizantes dos mes- mos (por exemplo, inibidores DPPA4, tais como sitagliptina); e 6) insulina ou análogos ou miméticos dos mesmos (por exemplo, LANTUSO).

Em um aspecto relacionado, a invenção fornece um método de diagnóstico de resistência à insulina ou sensibilidade à insulina usando anticorpos como descrito neste documento. Em uma modalidade, o método compreende os níveis de medição de insulina ou receptor de insulina em uma amostra a partir de um sujeito, usando um anticorpo de receptor de insulina descrito neste documento, em que um nível aumentado de insulina ou receptor isento de insulina, ou um nível diminuído de receptor de insulina ligado àmembrana indica que o sujeito tem ou está em risco de diabetes ou resistência à insulina e, opcionalmente, a administração de um terapêutico de diabetes ao dito sujeito que tem ou está em risco de ter diabetes ou re-

sistência à insulina. Em uma outra modalidade, o método compreende a medição dos níveis de receptor de insulina em uma amostra a partir de um sujeito, usando um anticorpo de receptor de insulina descrito neste docu- mento, em que um aumento do nível de receptor isento de insulina ou um nível diminuído de receptor de insulina ligado à membrana indica que o sujeito tem ou está em risco de ter câncer e, opcionalmente, a administração de um terapêutico de câncer ao dito sujeito.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos para a identi- ficação de anticorpos que modulam a ligação da insulina ao receptor de insulina como descrito neste documento.

Entende-se que cada característica ou modalidade, ou combi- nação, descrita neste documento é um exemplo não limitativo, ilustrativo de qualquer um dos aspectos da invenção e, como tal, deve ser combinada com qualquer outra característica ou modalidade, ou combinação, descritas neste documento. Por exemplo, onde as características são descritas com uma linguagem como "uma modalidade", "algumas modalidades", "modalida- des adicionais", "modalidades exemplares específicas", e/ou "outra modali- dade", cada um destes tipos de modalidades é um exemplo não limitante de uma característica que se destina a ser combinada com qualquer outra característica, ou a combinação de características descritas neste documen- to, sem ter de listar todas as combinações possíveis. Tais características ou combinações de características se aplicam a qualquer um dos aspectos da invenção. De modo semelhante, quando um método descreve a identificação de agentes de ligação polipeptídica, tais como anticorpos, caracterizados por certas características, os agentes de ligação polipeptídica caracterizados por essas características são também contemplados pela invenção. Quando exemplos de valores que caem dentro das faixas são divulgados, qualquer um destes exemplos é contemplado como pontos finais possíveis de uma faixa, quaisquer e todos os valores numéricos entre tais parâmetros são contemplados, e quaisquer e todas as combinações de pontos finais superio- res e inferior essão previstas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 representa resultados representativos de umo rastreio de ocupação de receptor INSR mostrando anticorpos de teste que se ligam às células IM-9 que expressam o INSR na presença e ausência de insulina.

A figura 2 mostra resultados representativos de umo rastreio de ligação biotinilada mostrando os efeitos de anticorpos de teste na insulina de ligação ao receptor de insulina.

A figura 3 mostra os resultados de um ensaio de medição da capacidade de anticorpos de teste para modular a fosforilação de PIRS-1 dependente de insulino.

A figura 4 representa os resultados de um ensaio de atividade de PIRS-1 mostrando a ligação de anticorpos representativos para INSR a partir de diferentes classes funcionais. A) Moduladores Positivos; B) Moduladores positivos com agonismo significativo; C) não moduladores; D) Anticorpos agonistas; E) Moduladores negativos.

A figura 5 é uma tabela mostrando valores de EC50 de insulina para os anticorpos representativos do ensaio de PIRS-1 classificado de acordo com a razão de EC50 +Ab /-Ab.

A figura 6 mostra os resultados de um ensaio de pAKT para anticorpos representativos: A) Modulador Positivo com agonismo muito bai- xo;B)Modulador Positivo com agonismo; C) Anticorpos Agonistas; D) 83-7; E) Insulina e Resposta de base na ausência de anticorpo.

A figura 7 é uma tabela mostrando agonismo e propriedades de reatividade cruzada do camundongo de anticorpos de teste representativo. (Nd = não determinado).

A figura 8 mostra os resultados do ensaio de pAKT mostrando alterações na sensibilidade (EC50, a mudança vezes em EC50) e cooperati- vidade (encosta) da resposta à dose de insulina efetuada por um anticorpo INSR modulador positivo em quatro diferentes concentrações. A figura 8A mostra os resultados graficamente enquanto figura 8B mostra os resultados emforma tabular.

A figura 9 ilustra a intensificação da absorção de glicose depen- dente de insulina por um anticorpo modulador positivo. Absorção de *H-2-

desoxiglicose em células 3T3-L1 foi induzida por 0,8 nM de insulina na presença de 10 ug/ml de anticorpo de teste ABOO1 ou controle de isotipo anti-KLH. A figura 10 mostra os níveis de glicose no sangue em camun- —dongos DIO com 20 semanas de idade alimentados com uma dieta rica em gordura e tratados com anticorpos anti-|NSR agonistas parciais: A. Gráfico de linha de níveis de glicose. B. Gráfico de barras dos níveis de glicose mos- trando redução estatisticamente significativa da glicose no sangue após a injeção de anticorpo anti-|NSR agonista parcial.

A figura 11 ilustra que a administração de um agonista parcial de anticorpo anti-|lNSR melhora o controle glicêmico em camundongos DIO: A. Curso do tempo de teste de tolerância à glicose; jejum B. Níveis de glicose no sangue em jejum; C. teste de tolerância à glicose; área sob a curva (AUC).

A figura 12 mostra que um anticorpo anti-|NSR modulador posi- tivo melhora a sensibilidade à insulina em camundongos DIO: A. Curso do tempo de teste de tolerância à Insulina; B. Níveis de glicose no sangue em jejum; C. Teste de tolerância à insulina; área sob a curva (AUC).

A figura 13 mostra que um anticorpo anti-|l NSR modulador positi- vo melhora o controle glicêmico em camundongos DIO: A. Curso do tempo de teste de tolerância à glicose; B. Níveis de glicose no sangue jejum; C. Teste de tolerância à glicose; área sob a curva (AUC).

A figura 14 demonstra que os anticorpos anti-|NSR agonistas parciais e moduladores positivos melhoram os níveis de triglicerídeos e colesterol em camundongos DIO. Os níveis de triglicerídeos e colesterol no plasma foram medidos em camundongos DIO com 30 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com ABOO1, AbO0S7 ou controle de isotipo (10 mg/kg; * p <0,05 em relação ao controle de isotipo/HFD): A. Níveis de Triglicerídeos do plasma; B. Níveis plasmáticos de colesterol.

A figura 15 ilustra a melhoria do controle glicêmico em camun- dongos DIO após a administração dos anticorpos anti-|NSR agonistas par- ciais e moduladores positivos. Medições de controle glicêmico foram obser-

vadas em camundongos DIO injetados intraperitonealmente (IP) com ABOO1, Ab037, AbO83, ALO8S ou controle de isotipo (10 mg/Kg; * p <0,05 em relação ao controle de isotipo/HFD): A. Curso do tempo de teste de tolerância à glicose; B. Teste de tolerância à glicose; área sob a curva (AUC); C. Níveis deglicoseno sangue em jejum.

A figura 16 mostra que anticorpos anti-I|NSR agonistas parciais e moduladores positivos melhoram os parâmetros de glicemia, resistência à insulina e/ou dislipidemia em camundongos DIO com 18 semanas tratados com mAb por 4 semanas. A análise de plasma de camundongos DIO injeta- dos intraperitonealmente (IP) com Ab001, AbOS7, AbO83, AbO8S5 ou controle de isotipo, durante 4 semanas (10 mg/kg; * p <0,05 em relação ao controle de isotipo/HFD) foi realizada. A. Níveis de glicose no plasma B. Níveis de in- sulina no plasma; C. HOMA-IR; D. Níveis de triglicerídeos no plasma; E. Níveis de colesterol não esterificados no plasma; F. Níveis de colesterol! total no plasma; G. Níveis de colesterol não HDL no Plasma; H. Razão de coles- terol não HDL/HDL no Plasma.

A figura 17 demonstra que os anticorpos anti-|NSR agonistas parciais e moduladores positivos reduzem o ganho de peso em camundon- gos DIO como avaliado por medições de peso do corpo em camundongos DIOde18 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com Ab0O01, Ab037, AbO83, AbO85 ou controle de isotipo por 3 semanas (10 mg/kg; * p <0,05 em relação ao controle de isotipo/HFD): A. Alteração percentual no peso do corpo em relação ao peso pré-dose; B. Alteração percentual no pe- so de corpo em relação ao peso pré-dose: Área sob a curva.

A figura 18 representa normalização induzida por anticorpo anti- INSR agonista parcial e modulador positivo de ganho de peso em camun- dongos db/db analisados por medições de peso do corpo em 5 semanas de idade camundongos db/db injetados intraperitonealmente (IP) com AbOO1 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), AbOS7 (10 mg/kg) ou controle de isotipo (1 mg/kg ou 10 mg/kg) durante 14 semanas (* p <0,05 em relação ao controle de isotipo): A. Alteração percentual no peso do corpo em relação ao peso pré-dose até 35 dias do estudo; B. Alteração percentual no peso do corpo em relação ao peos no dia 35 do estudo; C.

Alteração percentual no peso do corpo em relação ao peso pré-dose até o dia 35 de estudo: Área sob a curva; D.

Alteração percentual no peso do corpo em relação ao peso no dia 35 do estudo: Área sob a curva.

A figura 19 mostra que o anticorpo modulador positivo reduz HbA1c e glicose no sangue em jejum em camundongos db/db tal como ava- liado usando medições de controle glicêmico em camundongos db/db com 5 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com AbOO1 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), Ab037 (10 mg/kg) ou controle de isotipo (1 mg/kg ou 10 mg/kg) por 14 semanas (*p <0,05 em relação ao controle de isotipo na mes- ma dose): A.

Níveis de glicose no sangue em jejum; B.

Níveis de % HbAlc.

A figura 20 ilustra que a administração de anticorpo modulador positivo melhora dislipidemia em camundongos db/db.

A análise de plasma a partir de camundongos db/db com 5 semanas de idade injetados intraperi- tonealmente (IP) com AbOO01 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), AbOS7 (10 mg/kg) ou controle de isotipo (1 mg/kg ou 10 mg/kg) durante 14 semanas (* p <0,05 em relação ao controle de isotipo na mesma dose) foi realizada.

A.

Níveis de in- sulina no plasma, B.

Níveis de triglicerídeos no plasma; C.

Níveis de coleste- rol não esterificado no plasma; D.

Níveis de colesterol! total no plasma; E.

Ní- veisde HDlL-colesterol no plasma; F.

Razão de colesterol não HDL/HDL no plasma.

A figura 21 mostra que a administração de anticorpo modulador positivo reduz a glicose no sangue em jejum em camundongos db/db.

A avaliação de glicose no sangue em jejum semanal de camundongos db/db com5 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com Ab001 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), AbOS7 (10 mg/kg) ou controle de isotipo (1 mg/kg ou 10 mg/kg) durante 14 semanas (* p <0,05 para Ab0O85 em relação ao controle de isotipo na mesma dose). A figura 22 ilustra que os anticorpos moduladores positivos me- lhoram a resistência à insulina em camundongos db/db como avaliado por análise de plasma a partir de camundongos db/db com 5 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com AbOO01 e AbOS7 e AbO83 e AbO8S ou controle de isotipo, durante 4 semanas (10 mg/kg; * p <0,05 em relação ao controle de isotipo na mesma dose) e mostra avaliação de modelo homeos- tático de resistência à insulina (HOMA-IR) após 4 semanas de adminis- tração.

A figura 23 ilustra que anticorpos anti-|NSR agonistas parciais e moduladores positivos melhoram o controle glicêmico em camundongos MLDS/HFD. As medições de controle glicêmico foram obtidas a partir de ca- mundongos MLDS/HFD com 10 semanas de idade injetados intraperitoneal- mente (IP) com AbOO01, Ab037 ou controle de isotipo (10 mg/kg; *p<0,05 em relação ao controle de isotipo): A. Curso de tempo do Teste de Tolerância à Glicose; B. Teste de tolerância à glicose; área sob a curva (AUC); C. Níveis de glicose no sangue em jejum.

A figura 24 mostra que a administração de um anticorpo ago- nista parcial reduz a glicose sanguínea alimentada e HDAtc em camundon- gos MLDS/HFD. As Medições de controle glicêmico foram tomadas em ca- mundongos MLDS/HFD com 10 semanas de idade injetados intraperitoneal- mente (IP) com Ab001, AbO3S7 ou controle de isotipo por 6 semanas (10 mg/kg; * p <0,05 em relação ao controle de isotipo): A. Níveis de glicose no sangue alimento; B. Níveis de % de HbAlc.

A figura 25 mostra que os anticorpos anti-|NSR agonistas par- ciais e/ou moduladores positivos corrigem parcialmente os níveis de insulina, leptina e colesterol não HDL/HDL, em camundongos MLDS/HFD. Os níveis plasmáticos de insulina, leptina e colesterol foram medidos em camundon- gos MLDS/HFD com 10 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com AbOO01, AbO37 ou controle de isotipo durante 6 semanas (10 mg/kg; *p <0,05 em relação ao controle de isotipo): A. Razão de colesterol não- HDL/HDL, B. Níveis de insulina no plasma; C. Níveis de leptina no plasma.

A figura 26 ilustra que os anticorpos anti-|NSR agonistas parciais e moduladores positivos não afetam o peso do corpo em camundongos —“MLDS/HFD. As medições de peso do corpo foram realizadas em camundon- gos MLDS/HFD com 10 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com Ab0O01, AbOS7 ou controle de isotipo durante 6 semanas (10 mg/Kkg;) e os resultados expressos como alteração percentual no peso do corpo em relação ao peso pré-dose.

A figura 27 ilustra que os anticorpos anti-|NSR agonistas parciais e moduladores positivos melhoram o controle glicêmico em camundongos MLDS/HFD. Um teste de tolerância à glicose (GTTc) foi realizado em ca- mundongos MLDS/HFD com 10 semanas de idade injetados intraperitoneal- mente (IP) com Ab001, AbO8S3, AbO85, AbOS7 ou controle de isotipo durante 3 semanas (10 mg/Kg; *p <0,05 em relação ao controle de isotipo). A. Curso de tempo de teste de tolerância à tolerância à glicose; B. teste de tolerância àdglicose; área sob a curva (AUC).

A figura 28 mostra que anticorpos anti-I|NSR agonistas parciais e moduladores positivos melhoram o controle glicêmico em camundongos MLDS/HFD como determinado por uma avaliação de glicose sanguínea em jejum semanal de camundongos MLDS/HFD com 10 semanas de idade inje- tados por via intraperitoneal (IP) com Ab0O01 e ALO83 e AbO85, AbO3S7 ou controle de isotipo durante 6 semanas (10 mg/kg; *p <0,05 para Ab083 e Ab037 em relação ao controle de isotipo).

A figura 29 ilustra que anticorpos anti-|NSR agonistas parciais e moduladores positivos melhoram a dislipidemia em camundongos "MLDS/HFD. A análise de plasma a partir de camundongos MLDS/HFD com 10 semanas de idade injetados intraperitonealmente (IP) com AbO0O01, AbO083, AbO085, AbO37 ou controle de isotipo durante 6 semanas (10 mg/kg; *“p <0,05 em relação ao controle de isotipo) foi realizada. A. Níveis de triglicerídeos do plasma; B. Níveis de ácidos graxos livres no plasma; C. Níveis de colesterol não esterificado no plasma; D. Níveis de colesterol total no plasma; E. Níveis de colesterol-HDL no plasma; F. Razão de colesterol não-HDL/HDL.

A figura 30 mostra que os anticorpos anti-|NSR agonistas par- ciais e moduladores positivos melhoram o controle glicêmico (HbAtc) em ca- mundongos MLDS/HFD conforme determinado por uma avaliação de HDAtc no sangue em camundongos MLDS/HFD com 10 semanas de idade injeta- dos por via intraperitoneal (IP) com Ab0O01 e AbO8S3 e AbO8S, AbO37 ou con- trole de isotipo durante 6 semanas (10 mg/kg; *p <0,05 para Ab083 e Abo037 em relação ao controle de isotipo).

A figura 31 mostra que os anticorpos anti-|NSR agonistas par- ciais e moduladores positivos geralmente não afetam o peso do corpo em camundongos MLDS/HFD, tal como determinado através de medições de pesodo corpo em camundongos MLDS/HFD com 10 semanas de idade inje- tados intraperitonealmente (IP) com Ab0OO01, AbO8S3, AbO8S5, AbO3S7 ou contro- le de isotipo durante 6 semanas (10 mg/kg).

A figura 32 mostra que os anticorpos anti-INSR agonistas parciais e moduladores positivos aumentam a sinalização de insulina in vivo.

Camundongos C56BL/6 com dez semanas de idade machos foram injetados com Ab083, Ab085, AbOS7 ou controle de isotipo (10 mg/kg) por 24 horas, e os efeitos no fígado (A) e músculo (B) da fosforilação de INSR tirosina foram determinados por ELISA após um bolus de insulina.

A figura 33 é uma tabela que mostra as características de ligação de anticorpos específicos de INSR reformatados com uma região constante de IgG2.

A figura 34 ilustra a resposta à dose de um anticorpo anti-|NSR agonista alostérico parcial em comparação com a resposta à dose ao ligante endógeno (A) ou ativação pelo ligante na presença ou ausência do anticorpo agonista alostérico (B).

A figura 35 mostra a resposta à dose a partir de um anticorpo modulador positivo em comparação com a resposta à dose para o ligante endógeno (A) ou a resposta à dose de um ligante endógeno na presença e na ausência de um anticorpo modulador positivo (B).

A figura 36 ilustra os parâmetros de ativação de um conjunto de agonistas alostéricos parciais isoladamente em relação à insulina de ligante endógeno. Dados obtidos a partir de medições do percentual de fosforilação Akt em Ser473.

A figura 37 ilustra as propriedades de ativação de insulina na presença de 10 ug/ml de anticorpos agonistas alostéricos parciais em rela- ção à resposta máxima ao ligante endógeno na presença de um anticorpo de controle negativo. Dados obtidos a partir de medições do percentual de fosforilação AKkt em Ser473.

As figuras 38-40 ilustram a ativação de pAKkt por anticorpos na ausência de insulina, ou na presença de uma concentração submáxima de insulina para células CHO-K1 parentais, células CHO-K1 expressando o re- ceptor de insulina humana e células CHO-K1 expressando o receptor de insulina de camundongo. As figuras 388A-C mostram os efeitos de Abs sensi- bilizador (Ab077, AbO78, AbO85) com pouco ou nenhum agonismo de ativi- dade de pAkt (<10% de ativação pAkt na ausência de insulina com 50 ug/ml de anticorpo). As figuras 39A-C mostram os efeitos de Abs sensibilizador (AbOO1, AbO79, AbO83) com agonismo de fraco a moderado de atividade de pAkt (ativação de pAkt 10-20%, na ausência de insulina com 50 ug/ml anticorpo). A figura 40 ilustra os efeitos de um Ab sensibilizador (ADO80) com agonismo moderado da atividade de pAkt (>20% de ativação de pAkt na ausência de insulina com 50 ug/ml de anticorpo).

A figura 41 mostra a ativação de pAkt dependente de insulina em células CHO expressando o INSR humano (A e C) ou um de camun- dongo (B) na presença de concentrações fixas de sensibilização de anticor- pos anti-INSR.

A figura 42 demonstra a ativação de pAkt em células CHO expressando o INSR humano (A) ou de camundongo (B) por anticorpos agonistas alostéricos parciais na ausência de insulina comparado com a insulina individualmente.

A figura 43 representa os resultados de ativação de pAkt depen- dente de insulina em células CHO expressando o INSR humano na presen- cade concentrações fixas de anticorpos agonistas alostéricos parciais.

A figura 44 mostra os resultados do ensaio de pAKT para o anticorpo 83-7 e AbOO01 em células CHOK1 que expressam: (A) INSR humano, ou (B) INSR de camundongo.

A figura 45 mostra a porcentagem de insulina livre plotada contra a concentração estimada do receptor de insulina. O nível de insulina foi fixado em 50pM e a concentração do anticorpo foi 10ug/mL (67nM) para todos os clones exceto Ab078 que foi testado a 25ug/mL (167nNM). As curvas mostradas são o ajuste de prisma de regressão não linear usada para calcular EC50.

A figura 46 mostra a porcentagem de insulina livre plotada contra a concentração de receptor de insulina estimada. O nível de insulina foi fixado em 50pM e a concentração do anticorpo foi 10ug/mL (67nM) para todos os clones. As curvas mostradas são o ajuste de prisma de regressão não linear usada para calcular EC50.

A figura 47 mostra que o TNFa induz a dessensibilização da absorção de ácido graxo mediada por insulina em adipócitos 3T3-L1 na presença de anticorpo anti-|lNSR AbO085.

As figuras 48 e 49 ilustram os efeitos de anticorpos anti-|NSR moduladores positivos purificados ADO001 e AbO37 e AbO77 e AbO79 e AbO8O e Ab083 em INSR de humano (figura 48) e INSR de camundongo (figura 49). Como medido no ensaio de pAKT.

As figuras 50 e 51 demonstram a % de pAKT relativo de anticor- pos agonistas purificados Ab037, AbOSO, AbOS5S3 e AbO62 em INSR de huma- no (figura 50) e INSR de camundongo (figura 51).

A figura 52 demonstra que os anticorpos anti-|NSR purificados AbO30, Abo37, AbO5S3, AbOO1, AbO79, AbO8O e AbO83 são capazes de indu- zira fosforilação de AKT (% de pAKT relativa) após a ativação de INSR de Macaco.

A figura 53 mostra a % de pAKT relativa de anticorpos modula- dores negativos AbO61, AbO70 e AbO81 medidos em células CHOK1que expressam INSR de humano.

A figura 54 é uma tabela mostrando a reatividade cruzada de anticorpos do receptor de insulina, e ilustra que certos anticorpos que se |li- gam ao receptor de insulina humano também se ligam ao receptor de insu- lina de coelho e cinomolgos e que esta ligação foi modulada pela presença de insulina.

DESCRIÇÃO DETALHADA A invenção fornece anticorpos específicos para o receptor de insulina (INSR) ou complexo de insulina-receptor de insulina e seus usos no tratamento de distúrbios relacionados com os níveis de glicose aberrantes, por exemplo, hiperglicemia ou hipoglicemia, níveis de insulina aberrantes ou sensibilidade à insulina aberrante, por exemplo, distúrbios da resistência à insulina ou distúrbios de sensibilidade à insulina. Estes anticorpos podem induzir quer um efeito positivo ou negativo sobre a resposta celular no INSR por alteração das constantes de taxa cinéticas para a montagem e disso- ciação dos componentes dos complexos de sinalização de INSR-INS ou por outros mecanismos, incluindo a alteração do estado estrutural do complexo de sinalização, por exemplo, por ligação a um estado de transição e acele- ração da ativação da sinalização.

A modulação de um complexo de sinalização pode resultar em um aumento ou diminuição na sensibilidade à entrada de sinal e concomitan- tes aumentos ou diminuições na transdução de sinal. A administração de anticorpos moduladores aumenta ou diminui a sensibilidade da via celular e/ou níveis absolutos de resposta celular. Os moduladores da invenção, dependendo de suas propriedades, podem funcionar como um modulador, regulador, intensificador, efetor ou sensibilizador.

Muitos fármacos de anticorpos agem para bloquear as vias de sinalização através da ligação, quer de um receptor da superfície celular ou de seuligando cognato e eliminação da capacidade do ligante para se ligar e ativar o receptor. Tais fármacos bloqueadores medeiam o seu efeito este- quiometricamente, impedindo a formação de complexo de receptor-ligante.

O tratamento com sucesso de algumas doenças pode exigir a atenuação em vez de completa inibição das vias de sinalização para res- taurar um estado fisiológico normal com perfis de efeitos colaterais aceitá- veis. Espera-se que os anticorpos fornecidos pela invenção forneçam estas vantagens.

Outros fármacos terapêuticos afetam as vias de sinalização celu- lar pela ligação a um receptor de superfície celular e alteração da atividade do receptor. Tais fármacos agonistas diretos podem mediar os seus efeitos imitando a atividade natural do ligante e, assim, têm uma atividade inerente, isto é, eles não requerem a presença de ligante para mediar os seus efeitos.

Outros fármacos terapêuticos afetam as vias de sinalização celular pela liga- ção a um ligante.

Tais fármacos agonistas indiretos podem mediar os seus efeitos através da alteração da estabilidade ou valência do ligante.

Os processos biológicos são geralmente regulados de uma ma- neira contínua em vez de binária e, assim, em muitos casos, a modulação da atividade da via pode ser uma estratégia terapêutica mais apropriada do que o bloqueio ou estimulo completo da via.

A realização de triagens funcionais, baseadas em células para a modulação da atividade da via, em vez do blo- queio ou estimulo completo da via, é trabalhosa e não pode ser prontamente realizada de uma maneira com rendimento elevado, uma vez que tais tria- gens geralmente requerem uma concentração conhecida do composto de teste e podem ser sensíveis a quaisquer impurezas na preparação do com- posto de teste.

Em particular, a capacidade de realizar triagens funcionais, baseadas em células, com elevado rendimento para a modulação da ativida- dedavia é restrita às moléculas impermeáveis a células que são incapazes de entrar no ambiente intracelular e, especialmente para moléculas bioló- gicas recombinantes que podem ter diferentes níveis de expressão, graus de pureza e estabilidade no sistema de produção usado.

Além disso, algumas interações de ligação podem não ter nenhuma saída de sinalização para —medirem umo rastreio funcional (por exemplo, no caso de receptores decoy, substratos decoy, ou formas inativas de um alvo) o que torna difícil identificar agentes que perturbam estas interações.

A presente invenção supera estas desvantagens e fornece um meio para a identificação de moduladores positivos e negativos da atividade delNSRe potência desejada do fármaco em uma maneira com elevado ren- dimento.

A presente invenção também fornece moduladores positivos e negativos da atividade de INSR com uma faixa desejada de modulação da atividade, e fornece dados que mostram que estes moduladores exibem o efeito biológico desejado de alterar a absorção de glicose.

Definições O termo "composto" refere-se a qualquer composto químico, or- gânico ou inorgânico, endógeno ou exógeno, incluindo, sem limitação, po-

lipeptídeos, proteínas, peptídeos, moléculas pequenas, ácidos nucleicos (por exemplo, DNA e RNA), carboidratos, lípidos, ácidos graxos, esteróides, puri- nas, pirimidinas, peptidomiméticos e policetídeos e derivados, análogos es- truturais ou suas combinações. "Endógeno" significa que ocorre naturalmen- teemum mamífero, enquanto "exógeno" não significa que não ocorre natu- ralmente nos mamíferos, por exemplo, um composto estranho administrado.

O termo "agente de ligação de polipeptídeo" refere-se a um po- lipeptídeo que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno, por exem- plo, um alvo ou seu parceiro de sinalização, ou que é capaz de se ligar a um antígeno com uma afinidade de ligação mensurável. Exemplos de agentes de ligação polipeptídica incluem anticorpos, pepticorpos, polipeptídeos e peptídeos, opcionalmente conjugados com outras frações peptídicas ou ou- tras frações não peptídicas. Antígenos para os quais um agente de ligação de polipeptídeo pode se ligar incluem qualquer molécula proteica ou não proteica que é capaz de eliciar uma resposta de anticorpos, ou que é capaz de se ligar a um agente de ligação de polipeptídeo com afinidade de ligação detectável maior do que a ligação não específica. O antígeno ao qual um agente de ligação de polipeptídeo de modulação se liga pode incluir um alvo, um parceiro de sinalização de um alvo, e/ou um complexo compreendendo o alvoeo seu parceiro de sinalização.

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e inclui anti- corpos completamente montados, anticorpos tetraméricos, anticorpos mono- clonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecífico (por exemplo, anti- corpos biespecíficos), fragmentos de anticorpos que podem se ligar a um antígeno (por exemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia única, diacor- pos), e peptídeos recombinantes compreendendo os antecedentes desde que exibam a atividade biológica desejada. Uma "imunoglobulina" ou "anti- corpo tetramérico" é uma glicoproteína tetramérica consistindo em duas ca- deias pesadas e duas cadeias leves, cada uma compreendendo uma região variávele uma região constante. As porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimá- tica ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de anticorpos ou porções de ligação ao antígeno incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio (dAB), fragmentos de regiões determinantes de com- plementaridade (CDR), anticorpos enxertados em CDR, anticorpos de ca- deia única (scFv), fragmentos de anticorpos de cadeia única, anticorpos quiméricos, diacorpos e triacorpos e tetracorpos e minicorpo, anticorpo linear; anticorpo recombinante quelante, um tricorpo ou bicorpo, um intracor- po, um nanocorpo, um pequeno imunofarmaceutico modular (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação ao antígeno, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH, ou uma variante ou um seu derivado, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir a ligação do antígeno especí- fico ao polipeptídeo, tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou seis sequên- cias de CDR, contanto que o anticorpo retenha a atividade biológica dese- jada.

"Anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, ou seja, anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores.

"Variante de anticorpo" tal como usado neste documento se refere a uma sequência polipeptídica de anticorpo que contém pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácidos na região variável dos domínios da região variável de anticorpos naturais. As variantes podem ser substancialmente homólogas ou substancialmente idênticas à do anticorpo não modificado.

Um "anticorpo quimérico," tal como usado neste documento, refere-se a uma sequência contendo anticorpo derivada de dois anticorpos diferentes (ver, por exemplo, Patente US 4.816.567), que tipicamente são originários de espécies diferentes. Mais tipicamente, os anticorpos quiméri- cos compreendem fragmentos de anticorpos humanos e de roedores, geral- mente regiões constantes humanas e variáveis de camundongo.

Um "anticorpo neutralizante" é uma molécula de anticorpo que é capaz de eliminar ou reduzir significativamente uma função biológica de um antígeno ao qual se liga. Por conseguinte, um anticorpo "neutralizante" é capaz de eliminar ou reduzir significativamente uma função biológica, tal co- mo a atividade enzimática, a ligação ao ligante, ou a sinalização intracelular. Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Componen- tes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que iriam interferir com os usos terapêuticos ou de diagnóstico para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso do anticorpo, tal como determinado pelo método de Lowry, e mais preferencialmente mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE em condições não redutoras ou redutoras usando azul de Coomassie ou, preferencialmente, corante de prata. O anti- corpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será prepa- —rado pou pelo menos uma etapa de purificação.

A "região variável de cadeia pesada" tal como usado neste do- cumento se refere à região da molécula de anticorpo compreendendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) do dito anti- corpo de domínio variável de cadeia pesada. A região variável de cadeia pe- —sada pode conter uma, duas ou três CDR de cadeia pesada de dito anticor- po.

A "região variável de cadeia leve", tal como usado neste docu- mento se refere à região de uma molécula de anticorpo, incluindo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) do dito — domínio variável de cadeia leve de anticorpo. A região variável de cadeia le- ve pode conter uma, duas ou três CDR de dita cadeia leve de anticorpo, que pode ser ou uma cadeia leve kappa ou lambda, dependendo do anticorpo.

Como usado neste documento, um anticorpo que "se liga especi- ficamente" é "específico para antígeno", é "específico para" alvo de antígeno ou é "imunorreativo" com um antígeno refere-se a um anticorpo ou agente de ligação de polipeptídeo da invenção que se liga um antígeno com maior afinidade do que outros antígenos de sequência semelhante. Em um aspec- to, os agentes de ligação polipeptídica da invenção, ou fragmentos, varian- tes, ou seus derivados, se ligarão com uma maior afinidade ao antígeno hu- mano, em comparação com a sua afinidade de ligação a antígenos seme- lhantes de outros, isto é, espécies não humanas, mas agentes de ligação —polipeptídica que reconhecem e se ligam a ortólogos de alvos estão dentro do escopo da invenção.

Por exemplo, um agente de ligação de polipeptídeo que é um anticorpo ou fragmento do mesmo "específico para" seu antígeno cognato indica que as regiões variáveis dos anticorpos reconhecem e se ligam ao antígeno desejado com uma preferência detectável (por exemplo, onde o antígeno desejado é um polipeptídeo, as regiões variáveis dos anticorpos são capazes de distinguir o polipeptídeo de antígeno a partir de outros polipeptídeos conhecidos da mesma família, em virtude das diferenças men- suráveis na afinidade de ligação, apesar da existência possível de identidade de sequência localizada, homologia, ou similaridade entre os membros da família). Será entendido que os anticorpos específicos podem também inte- ragir com outras proteínas (por exemplo, proteína A de S. aureus ou de ou- tros anticorpos em técnicas de ELISA) através de interações com sequên- cias de fora da região variável dos anticorpos e, em particular, na região constante da molécula. Testes de rastreio para determinar a especificidade de ligação de um agente de ligação de polipeptídeo, por exemplo, anticorpo, para o uso nos métodos da invenção são bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Para uma discussão abrangente de tais ensaios, ver Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual;. Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6. Anticorpos para o uso na invenção podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica.

O termo "epítopo" refere-se à porção de qualquer molécula ca- paz de ser reconhecida e ligada por um agente de ligação seletivo a uma ou mais das regiões de ligação ao antígeno. Epítopos geralmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas, tais como, cadeias laterais de aminoácidos ou carboidratos, e têm características estru- turais tridimensionais específicas bem como características de carga especí- ficas. Epítopos como usado neste documento podem ser contíguos ou não contíguos.

O termo "derivado" quando usado em conexão com agentes de ligação polipeptídica e polipeptídeos da invenção refere-se a polipeptídeos quimicamente modificados por técnicas tais como a ubiquitinação, conjuga- ção a agentes terapêuticos ou de diagnóstico, a embalagem (por exemplo, com radionuclídeos ou enzimas diferentes), a ligação covalente do polímero tais como PEGilação (derivatização com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos, tais como a ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. Os derivados retêm as propriedades de ligação de moléculas de não derivadas da invenção. A "fração detectável" ou uma "marcação" refere-se a uma com- posição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Por exemplo, as marcações úteis incluem 32P, 35S, corantes fluorescentes, reagentes de eletro-densos, enzimas (por exemplo, como vulgarmente usado em um teste ELISA), biotina-estreptava- din e dioxigenina, haptenos e proteínas para as quais os anticorpos antiso- ros ou monoclonais estão disponíveis, ou moléculas de ácido nucleico com uma sequência complementar a outra molécula de ácido nucleico marcado. A fração detectável frequentemente gera um sinal mensurável, tal como um sinal radioativo, cromogênico, ou fluorescente, que pode ser usado para quantificar a quantidade de fração detectável ligada em uma amostra. Os "peptídeos" ou "oligopeptídeos" são sequências de aminoáci- dos curtas, tipicamente entre 3 e 100 resíduos de aminoácidos de compri- mento e abrangem resíduos de aminoácidos de ocorrência naturale análo- gos de resíduos de ocorrência não natural que podem ser usados isolada-

mente ou em combinação com resíduos de aminoácido de ocorrência natu- ral, a fim de dar ao peptídeo uma especificidade conformacional particular ou uma atividade biológica particular, tais como a resistência à proteólise. Os peptídeos incluem repetições de sequências peptídicas e podem incluir 2, 3, 4,5,6,7,8,9,10 ou mais cópias de uma sequência de aminoácidos dis- postas de frente-a-cauda ou de cabeça-a-cabeça. Os peptídeos podem ser conjugados com frações não peptídicas, por exemplo [Expansão]. Os peptí- deos incluem dímeros, trímeros ou multímeros de ordem mais alta, por exemplo, formados através da conjugação a outras frações poliméricas ou não poliméricas, tais como PEG.

Os "polipeptídeos" são sequências de aminoácidos mais longas, tipicamente 100 ou mais resíduos de aminoácidos de comprimento, e abran- gem resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e análogos de resíduos de ocorrência não natural que podem ser usados isoladamente ou em com- binação com resíduos de aminoácidos de ocorrência natural, a fim para dar ao polipeptídeo especificidade uma especificidade conformacional particular ou uma atividade biológica particular, tais como a resistência à proteólise.

Como usado neste documento, um "pepticorpo" é um polipeptí- deo de fusão compreendendo um ou mais peptídeos fundidos à totalidade ou uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Ig). Ver, por exemplo, Patente US 6.660.843. O peptídeo pode ser qualquer peptídeo de ocorrência natural ou peptídeo preparado recombinantemente ou quimica- mente sintetizado, que se liga ao antígeno. O peptídeo pode ser repetido e pode incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais cópias de uma sequência de aminoácidos dispostos de frente-a-cauda ou de cabeça-a-cabeça. A porção da região constante de lg pode incluir pelo menos um domínio da região constante (por exemplo, CH1, CH2, CH3, e/ou CH4), múltiplos domínios (por exemplo, CH2 com CH3), várias cópias de domínios (por exemplo, CH2- CH2), qualquer fragmento de um domínio constante que retém a atividade desejada, por exemplo, o epítopo do receptor de salvamento responsável pela meia vida prolongada de imunoglobulinas em circulação, ou quaisquer combinações dos mesmos.

Uma molécula "pequena" ou molécula orgânica "pequena" é definida aqui como um composto químico não polimérico orgânico tendo um peso molecular de cerca de 1000 Daltons ou menos.

Como usado neste documento, um "complexo de sinalização" é um conjunto de proteínas e/ou compostos endógenos ou exógenos que me- deiam a transdução de um sinal celular. Exemplos de um complexo de sinal- ização incluem, mas não estão limitados a, um ligante ligado a um receptor ligado à membrana, uma enzima ligada a um substrato ou quaisquer molé- culas celulares que se associam para propagar reações bioquímicas que estão envolvidas na cascata de um sinal. Os complexos de sinalização po- dem também incluir correceptores, cofatores, proteínas de suporte, modula- dores alostéricos e numerosos outros tipos de proteínas e moléculas que estão envolvidas na transdução de sinal celular. Os complexos de sinaliza- ção podem ser formados transientemente ou podem ser de vida longa. Os constituintes ou componentes moleculares de um complexo de sinalização podem variar ao longo do tempo e podem ser dependentes do estado de ativação de cada componente e do ambiente celular. Os complexos de sina- lização podem sofrer modificação e regulação química que pode induzir a um espectro de efeitos sobre o complexo, incluindo mudanças sutis na ati- vidade de transdução, inativação completa e ativação constitutiva, ou tanto a modulação positiva quanto negativa.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é usado neste documento para indicar a quantidade de composição específica para alvo da invenção que é eficaz para melhorar ou diminuir os sintomas ou sinais de — doença associados com a sinalização anormal (por exemplo, anormalmente elevado ou anormalmente baixo) do complexo de sinalização.

Tal como usado neste documento "ligação" é a associação física entre duas ou mais entidades moleculares distintas que resultam de uma rede específica de interações não covalentes consistindo em uma ou mais de forças fracas, incluindo ligações de hidrogênio, interações de Van der Waals, fon-dipolo e hidrofóbicas e as fortes ligações com força iônica. O ní- vel ou grau de ligação pode ser medido em termos de afinidade. A afinidade é uma medida da força da interação de ligação entre duas ou mais entidades moleculares distintas que podem ser definidas por constantes de ligação de equilíbrio ou parâmetros de taxa de ligação cinética.

Exemplos de constan- tes ou parâmetros adequados e suas unidades de medição são bem conhe- cidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, constante de asso- ciação de equilíbrio (Ka), por exemplo, cerca de 10ºM” ou maior, cerca de 10ºM” ou maior, cerca de 10"M” ou maior, cerca de 10ºM” ou maior, cerca de 10ºM”* ou maior, cerca de 10ººM” ou maior, cerca de 10" M” ou maior, ou cerca de 10ºº*M” ou maior; constante de dissociação de equilíbrio (Kp), por exemplo, cerca de 10ºM ou menos, ou cerca de 10ºM ou menos, ou cerca de 107M ou menos, ou cerca de 10ºM ou menos, ou cerca de 10ºM ou menos, ou cerca de 10 ºM ou menos, ou cerca de 10 '"M ou menos, ou cerca de 10 ?M ou menos; taxa de associação (por exemplo, s", mol”) e ta- xa de dissociação (por exemplo, s)). No caso de Ka, valores mais elevados significam ligação de afinidade "mais forte" ou "reforçada", enquanto no caso de Kp, valores menores significam ligação de afinidade "mais forte" ou "reforçada". Como usado neste documento, um parâmetro de taxa de liga- ção "reforçado" significa o tempo de residência aumentado, associação mais forte ou dissociação mais fraca.

Como usado neste documento, um parâme- trode taxa de ligação "enfraquecido" significa o tempo de residência reduzi- do, associação mais fraco ou dissociação mais forte.

No caso de taxa de associação, valores mais elevados, significam associação mais rápida ou mais frequente e assim geralmente resultam na afinidade de ligação reforça- da.

No caso de taxa de dissociação, valores mais baixos, geralmente signifi- cam dissociação mais lenta de e, portanto, geralmente resultam em afinida- de de ligação mais forte.

No entanto, é a razão entre a taxa de associação e a taxa de dissociação que indica a afinidade de ligação, tal como explicado em maior detalhe adiante.

A afinidade entre dois compostos, por exemplo, entre um anticorpo e um antígeno, ou entre o primeiro e segundo componentes de um complexo de sinalização, pode ser medida diretamente ou indiretamente.

À medição indireta de afinidade pode ser realizada usando as propriedades de substituição, que são indicativas de, e/ou proporcionais a, afinidade. Tais propriedades de substituição incluem: a quantidade ou nível de ligação de um primeiro componente a um segundo componente de um complexo de sinalização, ou uma característica biofísica do primeiro componente ou o segundo componente que é indicativa de ou correlacionada com a afinidade aparente de ligação do primeiro componente para o segundo componente. Exemplos específicos incluem a medição da quantidade ou nível de ligação do primeiro componente a um segundo componente, a uma concentração de subsaturação do primeiro ou do segundo componente. Outras características biofísicas que podem ser medidas incluem, mas não estão limitadas a, a car- ga líquida molecular, a atividade de rotação, a taxa de difusão, a temperatu- ra de fusão, direção eletrostática, ou conformação de um ou de ambos os primeiro e segundo componentes. No entanto, outras características biofísi- cas que podem ser medidas incluem a estabilidade de determinação de uma interação de ligação ao impacto das variações de temperatura, pH, força ou iônica.

A afinidade medida é dependente das condições exatas usadas para fazer a medição incluindo, entre muitos outros fatores, a concentração de componentes de ligação, a configuração do ensaio, a valência de compo- nentes de ligação, composição do tampão, pH, força iônica e temperatura, bem como componentes adicionais adicionados à reação de ligação, tais co- mo moduladores alostéricos e reguladores. Métodos quantitativos e qualita- tivos podem ser usados para medir tanto a força absoluta quanto relativa das interações de ligação.

A afinidade aparente é uma medida da força da interação de ligação entre duas ou mais entidades moleculares distintas, em condições onde a afinidade é alterada por condições ou componentes na reação de ligação, tais como moduladores alostéricos, inibidores, valência do compo- nente de ligação etc..

Tal como usado neste documento uma "concentração de subsa- turação" é uma concentração de um ou mais componentes de uma reação de ligação que é significativamente abaixo da afinidade de ligação Kp e/ou uma concentração de um componente em uma reação de ligação que é menor do que é necessário para ocupar todos os sítios de ligação do outro componente(s). Em condições de subsaturação uma porcentagem significati- va de um dos componentes de ligação na reação de ligação tem sítios de ligação disponíveis.

Tal como usado neste documento um "ensaio biofísico" é qual- quer método que mede, de forma absoluta ou relativa, a ligação, associação, dissociação, afinidade de ligação, nível de ligação, ou os parâmetros de taxa de ligação entre pelo menos dois compostos. Os ensaios biofísicos são geralmente realizados in vitro e podem ser efetuados com componentes de ligação purificados, componentes não purificados, componentes associados a células, bem como uma combinação de componentes associados a celu- lares e purificados.

Um "agonista" é um termo usado para descrever um tipo de ligante ou fármaco que se liga e ativa a sinalização de um receptor. A capa- cidade de alterar a atividade de um receptor, também conhecida como a eficácia do agonista, é uma propriedade que o distingue de antagonistas, um tipo de ligante de receptor que também se liga um receptor, mas que não ativa a sinalização do receptor. A eficácia de um agonista pode ser positiva, causando um aumento na atividade do receptor, ou negativa, causando uma diminuição da atividade do receptor. Agonistas totais se ligam e ativam um receptor, exibindo eficácia completa naquele receptor. Agonistas parciais também ligam e ativam um dado receptor, mas têm uma eficácia apenas parcial no receptor em relação a um agonista total. Um agonista inverso é um agente que se liga ao mesmo sítio de ligação do receptor, como um ago- nista para o receptor e atividade constitutiva reversa de receptores. Agonis- tas inversos exercem o efeito farmacológico oposto de um agonista do receptor. O co-agonista trabalha com outros co-agonistas para produzir o efeito desejado em conjunto.

Os agonistas competitivos, ou ortoestéricos se ligam reversivel- mente a receptores no mesmo sítio de ligação (sítio ativo) que o ligante, desse modo competindo com o ligante pelo mesmo sítio de ligação no receptor.

Em um aspecto diferente, os anticorpos divulgados neste docu- mento atuam como agonistas alostéricos. Eles se ligam a uma porção de INSR que é distinta do sítio de ligação à insulina ativa, e não alteram significativamente a afinidade de ligação à insulina e INSR por mais de 2 vezes. Eles também não afetam a EC50 de ativação de insulina de INSR, por exemplo, alteram EC50 por menos de 2 vezes. Tais anticorpos ativam INSR constitutivamente com uma resposta agonista máxima que é 80% ou menos da resposta agonista máxima de insulina, por exemplo, 15%-80%, 20-60%, 20%-40% ou 15%-30%. Em certas modalidades, os anticorpos ativam INSR constitutivamente com uma resposta agonista máxima que é pelo menos cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, e até 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75% ou 80% da resposta agonista máxima de insulina. Entende-se que qualquer combinação de qualquer uma dessas fai- xas de ponto final é contemplada sem ter de recitar cada combinação pos- sível. Em algumas modalidades, a resposta agonista máxima é medida por ensaio de Akt. Em modalidades adicionais, a invenção fornece um anticorpo agonista alostérico que se liga ao receptor de insulina com uma afinidade de 10,108, 107, 103, 10º, 107º, 10** M ou menos M. Sem estar ligado por uma teoria da invenção, a atividade agonista fraca de agonistas alostéricos serve para mimetizar o efeito de níveis de secreção de insulina basal natural, permitindo que a insulina administrada exogenamente tenha o seu efeito de redução de glicose normal. Em certas modalidades, um agonista alostérico é um agonista alostérico parcial. Um antagonista bloqueia um receptor de ati- vação por agonistas. Um agonista seletivo é seletivo para um determinado ti- po de receptor. O mesmo pode adicionalmente ser de qualquer um dos tipos acima mencionados.

A potência de um agonista é geralmente definida como sendo o inverso do seu valor de EC50. Esta pode ser calculada para um dado ago- nista por determinação da concentração de agonista necessária para eliciar a metade da resposta biológica máxima do agonista. Quanto menor ECB50, maior a potência do agonista.

Um "antagonista" receptor é um tipo de ligante ou fármaco de receptor que não provoca uma resposta biológica em si mediante ligação a um receptor, mas bloqueia ou amortece respostas mediadas por agonista. Os antagonistas podem ter afinidade, mas nenhuma eficácia para os seus receptores cognatos, e a ligação irá romper a interação e inibir a função de um agonista ou agonista inverso nos receptores. Os antagonistas medeiam os seus efeitos pela ligação ao sítio ativo ou sítios alostéricos nos recepto- res, ou eles podem interagir em sítios de ligação únicos, normalmente não envolvidos na regulação biológica da atividade do receptor. A atividade anta- gonista pode ser reversível ou irreversível, dependendo da longevidade do complexo de antagonista - receptor, a qual, por sua vez, depende da natu- reza de ligação do receptor de antagonista. A maioria dos antagonistas atinge a sua potência, competindo com ligantes ou substratos endógenos em sítios de ligação definidos estruturalmente nos receptores.

Os antagonistas não exibem nenhuma eficácia para ativar os receptores a que eles se ligam. Uma vez ligados, no entanto, os antagonis- tas podem inibir a função de agonistas, agonistas inversos e agonistas par- ciais. Em ensaios de antagonistas funcionais, uma curva de dose-resposta mede o efeito da capacidade de uma faixa de concentrações de antagonis- tasparareverter a atividade de um agonista. A potência de um antagonista é geralmente definida pelo seu valor de IC50. A mesma pode ser calculada para um dado antagonista por determinação da concentração do antagonista necessária para eliciar uma metade da inibição da resposta máxima bioló- gica de um agonista. Quanto mais baixo o IC50, maior será a potência do antagonista.

Os antagonistas competitivos, ou ortoestéricos, reversivelmente se ligam a receptores no mesmo sítio de ligação (sítio ativo) que o ligante ou agonista, mas sem ativar o receptor, desse modo competindo com o agonis- ta para o mesmo sítio de ligação no receptor. Os antagonistas não compe- titivos ou alostéricos se ligam a um sítio de ligação separado do agonista, exercendo a sua ação ao receptor via o sítio de ligação separado. Assim, eles não competem com agonistas para ligação. Os antagonistas não com-

petítivos diferem de antagonistas não competitivos em que eles requerem ativação do receptor por um agonista antes que eles possam se ligar a um sítio de ligação alostérico separado.

A "resistência à insulina" descreve uma condição em que as quantidades fisiológicas de insulina são inadequadas para a produção de uma resposta normal de insulina a partir de células ou tecidos.

O "sensibilizador de insulina" é um composto ou fármaco que aumenta a sensibilidade de células ou tecido à insulina resultando em níveis mais elevados de absorção de glicose para uma dada concentração de —subsaturação de insulina.

Vantagens A presente invenção refere-se à verificação de que é possível desenvolver agentes terapêuticos que modulam o complexo de sinalização de insulina - INSR por ligação a regiões extracelulares de INSR. Novos métodos de seleção e de rastreio são empregados para identificar, por exemplo, sensibilizadores de insulina que têm como alvo as regiões extrace- lulares de INSR e potencializam a ação da insulina. Em particular, alguns dos anticorpos identificados aqui são anticorpos não agonísticos que se ligam às regiões extracelulares de INSR e modulam positivamente ou negativamente o complexo de sinalização de insulina - INSR.

A presente invenção abrange moduladores de complexos de sinalização de insulina - INSR que oferecem vantagens únicas sobre as terapias existentes. Eles atuam ao nível do INSR, que deve permitir a indu- ção de toda a faixa de ações da insulina, minimizando os efeitos colaterais indesejados. Ao evita-se o agonismo de INSR deve-se reduzir o risco de hipoglicemia funcional. Além disso, um controle mais preciso dos níveis de glicose pode ser alcançado. Assim, quando os níveis de glicose no sangue aumentam, levando a elevação dos níveis de insulina, tal modulador teria um efeito maior. O alvo da região extracelular do INSR permite o uso de molécu- las biológicas como moduladores de complexos de sinalização de insulina - INSR que modulam o efeito da insulina endógena ou exógena, análogos de insulina ou miméticos de insulina; estes podem ter vantagens tais como meia vida melhorada, dosagem reduzida ou frequência de dosagem, toxicidade reduzida e maior facilidade de fabricação.

A presente invenção abrange moduladores de complexos de sinalização de insulina - INSR que são espe- rados para reduzir a resistência à insulina periférica e melhorar o controle glicêmico.

O efeito sensibilizador dos moduladores deve permitir níveis me- lhorados de absorção de glicose pelos tecidos periféricos em pacientes cujos níveis de insulina não são suficientemente elevados para estimular a absor- ção de glicose adequada na ausência de terapia com insulina exógena.

As- sim, a administração de anticorpos da invenção pode ser usada nos estágios iniciais de resistência à insulina no lugar de outros fármacos, ou como uma terapia adjuvante para outros agentes antidiabéticos.

Quando administrados como uma terapia adjuvante de outros agentes antidiabéticos, os anticorpos da invenção podem reduzir a quantidade diária total de agente antidiabético necessário para manter os níveis de glicose no sangue mais próximos da fai- xanormal, ou podem reduzir a frequência de dosagem do agente antidiabéti- co, ou podem alcançar um controle glicêmico melhorado com a mesma dose e/ou frequência, por exemplo, com poucos episódios de hiperglicemia ou um nível reduzido de hiperglicemia máxima (redução no nível de glicose anormal mais elevada observada). O Receptor de Insulina (INSR) O INSR é um receptor de tirosina cinase encontrado em organis- mos tão primitivos quanto cnidários e insetos.

Em organismos superiores, o mesmo é essencial para a homeostase da glicose.

Estudos de knockout de camundongo mostraram também que o INSR é importante na adipogenese, —neovascularização, a regulação da síntese de glicose hepática e secreção de insulina pancreática induzida por glicose (Kitamura et al., Ann.

Rev.

Physiol, 65:313-332 2003). A sinalização INSR é também importante no cérebro, onde está envolvido na regulação da ingestão de alimentos, depo- sição de gordura periférica e no eixo endócrino reprodutivo, bem como na aprendizagem e memória (Wada et al., J.

Pharmacol Sci. 99:128 - 143, 2005). A sinalização de INSR disfuncional foi implicada em doenças, inclu- indo o diabetes tipo | e tipo Il, demência e câncer.

Os domínios do receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR-1) estreitamente relacionados exibem elevada (47-67%) iden- tidade de aminoácidos com o INSR.

Embora semelhante na estrutura, o IGF- IR e INSR servem diferentes funções fisiológicas.

Yo IGF-IR é expresso em — quase todos os tecidos adultos normais, exceto o fígado, o qual é em si o principal sítio de produção de IGF-Il.

O INSR é principalmente envolvido em funções metabólicas, enquanto que o IGF-IR medeia o crescimento e a diferenciação (Adams et al., Cell.

Mol.

Life Sci. 57:1050-1093, 2000). O INSR existe como duas isoformas de variantes de splice, INSR-AelNSR-B, que respectivamente, não possuem ou contêm os 12 ami- noácidos codificados pelo exon 11. A variante mais longa, INSR-B, é a iso- forma responsável pelas respostas de sinalização metabólicas.

Em contras- te, o INSR-A sinaliza predominantemente respostas mitogênicas, é a isofor- ma preferencialmente expressa em vários cânceres (Denley et al., Horm.

Metab.

Res. 35:778-785, 2003) e é capaz de fator de crescimento semelhan- te à insulina 2 (IGF-Il) com uma elevada afinidade de ligação (Denley et al.,

Mol.

Endocrinol. 18:2502-2512, 2004). O INSR humano maduro é um homodímero compreendendo duas subunidades a e duas subunidades B (cadeias). As cadeias a e B são codificadas por um gene único e surgem a partir da clivagem pós-tradução de um precursor de aminoácido 1370 em um sítio de clivagem de furina localizado nos resíduos 720-723. A cadeia-a e 194 resíduos da cadeia B- compreendem o próton extracelular de INSR.

Existe uma sequência trans- membrana única e um domínio citoplasmático de resíduo 403 contendo uma tirosina cinase.

A metade N-terminal de cada monômero de ectodomínio consiste em dois domínios de repetição ricos em leucina homólogos (L1 e L2) de aproximadamente 150 aminoácidos, separados por uma região rica em cisteína (CR), também de aproximadamente 150 aminoácidos de tama- nho.

A metade C-terminal de cada monômero de ectodomínio (aproximada- mente 460 resíduos) consiste em três domínios de fibronectina tipo II! (Fnlll- 1, Fnlll-2 e Fnlll-3). O domínio Fnlll-2 contém um domínio de inserção (ID) de aproximadamente 120 resíduos, dentro do qual se encontra o sítio de clivagem de furina que gera as cadeias a e B do receptor maduro.

Intrace- lularmente, cada monômero contém um domínio catalítico de tirosina-cinase flanqueado por duas regiões reguladoras (a região justamembrana e a cau- da-C) que contêm os sítios de ligação de fosfotirosina para moléculas de sinalização (Ward et al., Acta Physiol. 192:3-9, 2008). Os modelos atuais para a ligação de insulina propõem que, no estado basal, o homodímero de INSR contém dois pares idênticos de sítios de ligação (designados por sítio 1 e sítio 2) em cada monômero (De Meyts e Bioessays, 26: 1351-1362, 2004). A ligação de insulina a um sítio de baixa afinidade (sítio 1) sobre uma subunidade-a é seguido por um segundo evento de ligação entre a insulina ligada e uma região diferente da segunda subunidade a de INSR (sítio 2). Esta ligação mediada por ponte entre as duas subunidades a gera o estado de elevada afinidade que resulta na transdução de sinal.

Em contraste, o ectodomínio de INSR solúvel, que não ficapreso no seu terminal C, não pode gerar a alta afinidade de complexo de receptor-ligante.

O mesmo pode ligar duas moléculas de insulina, simulta- neamente, em dois dos seus sítios 1, mas apenas com baixa afinidade (Adams et al., Cell.

Mol.

Life Sci. 57:1050-1093, 2000). Acredita-se que o sítio 1 é constituído por elementos da folha B central do domínio L1 e os últimos 16 resíduos da cadeia-a (referido como o peptídeo CT). O sítio 2 inclui mais provavelmente os laços na junção de Fnill-1 e Fnlll-2. Acredita-se que a ligação da insulina envolve as mudanças estruturais na insulina e seu receptor (Ward e Lawrence, BioEssays 31: 422-434, 2009). Uma vez que uma molécula de insulina tenha se encaixado sobreo receptor e efetuado a sua ação, a mesma pode ser liberada de volta para o ambiente extracelular, ou pode ser degradado pela célula.

A degra- dação normalmente envolve a endocitose do complexo de insulina-INSR se- guido pela ação de enzimas degradantes de insulina.

A maioria das molécu- las de insulina é degradada pelas células do fígado.

Estimou-se que uma — molécula de insulina típica é finalmente degradada em cerca de 71 minutos após a sua liberação inicial na circulação (Duckworth et al., Endocr Rev. 19(5):608-24, 1998).

Sinalização da Insulina A insulina induz uma rede de sinalização de moléculas, trans- portando a informação a partir do INSR para as proteínas efetoras envol- vidas no metabolismo e crescimento. A ligação de insulina para INSR induz uma alteração conformacional que promove a ativação de uma atividade de tirosina cinase intrínseca, levando a autofosforilação de subunidade-B de INSR. As proteínas de substrato de receptores da insulina (IRS) são recru- tadas para a membrana de plasma através de uma interação com o INSR fosforilado, e estes se tornam também fosforilados em resíduos de tirosina, promovendo o recrutamento de proteínas de sinalização adicionais para o complexo resultante na sinalização através de duas vias principais (1) a via PI38 cinase/PDK1/PKB que regula o metabolismo primariamente, com algu- ma influência no crescimento ad (2) a via mitogênica de Ras/ERK que prin- cipalmente regula o crescimento celular.

Certos análogos de insulina comercializados têm sido relatados como exibindo atividades mitogênicas e antiapoptótica tipo IGF-1 em células cancerosas cultivadas, levantando questões sobre a sua segurança em longo prazo em humanos (Weinstein et al., Diabetes Metab Res Rev 25: 41- 49, 2009). Portanto, seria desejável obter um agonista de INSR que não alte- raoequilíbrio na sinalização metabólica vs INSR mitogênica, ou sinalização metabólica promovida preferencialmente ao longo da sinalização mitogênica de INSR.

Métodos de Identificação de anticorpos que são moduladores A invenção fornece métodos de identificação de um agente de ligação de polipeptídeo candidato, por exemplo, um anticorpo, que modula a ligação entre o primeiro e o segundo componentes de um complexo de sina- lização, por exemplo, um receptor, tais como o receptor da insulina e sua insulina ligante.

Sem estar ligado por uma teoria da invenção, a presente divul- gação prevê que a perturbação cinética de uma interação entre dois com- ponentes (primeiro componente, C1 e segundo componente, C2) de um complexo de sinalização com um modulador (M) pode ser descrita matema-

ticamente como: Keica = Keica (1 + M/Kwmes) (1 + M/ Kmca) (1 + M/K reicawm) onde a mudança no equilíbrio da constante de ligação entre os componentes (Kcico) é uma função da constante de equilíbrio entre os componentes (Kcic2), concentração de modulador (M), afinidade de modulador para o complexo (K [cicawm) e afinidade de modulador para o primeiro componente (Kvmci1) ou o segundo componente (Kuca). Nos casos em que o complexo de sinalização é um complexo de receptor-ligante, e o modulador é um anticorpo, a perturbação cinética da interação de receptor-ligante com um anticorpo pode ser descrita matemati- camente como: ha) K, = Kra, AR AL E A ] Kra onde a mudança na constante de equilíbrio de ligação de receptor-ligante (Kal) é uma função da constante de equilíbrio de receptor-ligante (KR), a concentração de anticorpo (A), a afinidade do anticorpo para o complexo (K RM) ea afinidade de anticorpo quer para o receptor (Kar) quer para o ligante (Ka). Um modulador se liga ao alvo, ou a seu parceiro de sinalização, ou um complexo do alvo e o parceiro de sinalização, de tal maneira que o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do alvo para o seu parceiro de sinalização é enfraquecida ou reforçada.

Por exemplo, onde o alvo ou é um receptor ou ligante, o parâmetro de taxa de ligação ou afini- dade de ligação do ligante para o seu receptor é enfraquecida ou reforçada na presença do modulador.

Um modulador com a atividade de bloqueio completa representa uma condição de contorno nesta análise, uma vez que quando K rcicawm é suficientemente alta, K'cica se aproxima do infinito.

Uma implicação deste modelo é que o grau de modulação de sinalização é inde- pendente da concentração do modulador quando a concentração do modu-

lador ([M]) é suficientemente acima do constante de dissociação de equilíbrio (Kp) para a interação de modulador/antígeno ser saturante para a ligação ao ligante. Assim, a modulação da interação está relacionada com a razão de afinidade para o complexo versus os componentes onde [M] > Kp para o moduladoreo seu antígeno.

A presente descrição prevê que as propriedades biofísicas de interações de modulador com um alvo e/ou o seu parceiro de sinalização podem ser usadas para prever o efeito funcional do modulador na via de sinalização alvo. Os moduladores que alteram a via de sinalização podem, portanto, ser identificados com base na sua afinidade relativa para o alvo (e/ou o seu parceiro de sinalização) na forma complexada versus não com- plexada. A invenção contempla que a perturbação cinética de uma interação entre dois componentes (primeiro componente, C1 e o componente segun- do, C2) de um complexo de sinalização com um modulador (M) pode ser prevista da seguinte maneira: Kreicamm ou Kimeaje: ou Kimenca < Kmc2 ou Kmc: leva à modulação positiva Kreicam ou Kmmeae: ou Kmmesca = Kmc2a ou Kmc: não leva à nenhuma modulação Kre1camm ou Kimezje: ou Kimenca > Kmca ou Kmc: leva à modulação negativa Em casos onde o complex de sinalização é um complex de receptor (R) — ligante (L), e o modulador cinético é um anticorpo (A), a pertubação cinética pode ser prevista da seguinte maneira: Kirya ou Kaaur OU Kar < Kai OU Kar leva à modulação cinética positiva Kirya Ou Kar Ou Kar = Kar ou Kar não leva a nenhuma modulação Kirya ou Kaaur OU Kar > Kai OU Kar leva à modulação cinética negativa Em algumas modalidades, um modulador, tal como um anticorpo (A) pode ser identificado pela sua capacidade para alterar uma interação de ligação, tal como uma interação de receptor (R) - ligante (L), em qualquer dada concentração subsaturante do primeiro ou segundo componente (por exemplo, concentração de ligante (L)). Um anticorpo ou polipeptídeo modu- lador poderia efetivamente deslocar a afinidade e a resposta à dose corres- pondente da interação ligante-receptor da interação de 500pM, quer a 10pM (modulador positivo) ou 10 nM (modulador negativo) como representado.

Em algumas modalidades do modulador irá produzir um nível mais elevado de ligação R-L a uma dada concentração de ligante, deslocando a curva de ensaio para a esquerda (modulação positiva). Em outras modalidades, o modulador irá produzir um nível mais baixo de ligação R-L a uma dada con- centração do ligante, deslocando a curva de ensaio para a direita (modula- ção negativa). Em algumas modalidades, o deslocamento é uniforme.

Em outras modalidades, a mudança é não uniforme, o que reflete o envolvi- mento de outros fatores, por exemplo, proteínas acessórias no complexo,

internalização do receptor, etc.

As propriedades de ligação de interação (s) entre o modulador e O alvo, o seu parceiro de sinalização e/ou um complexo compreendendo o alvo e de seu parceiro de sinalização, são geralmente de preditivas do efeito funcional do modulador cinético da via de sinalização de alvo.

Dependendo doalvoa ser estudado, certos outros fatores podem precisar ser considera- dos.

Estes incluem: (1) a concentração do modulador cinético, a concentra- ção do alvo, e/ou a concentração do seu parceiro de sinalização (por exem- plo, a predição é otimizada se a concentração do modulador ([M]) é signifi- cativamente maior do que o Kp da ligação entre o modulador e o seu antíge- no), (2) a forma estrutural do modulador usado, por exemplo, monovalente ou bivalente vs divalente, (3) reticulação do alvo inter/intra, o que pode rstringir a conformação do alvo e/ou causar a ativação do alvo, (4) a capa- cidade do modulador de alterar o conjunto ou encaixe, ou alterar os compo- nentes adicionais dos complexos de sinalização por mecanismos estéricos ou alostéricos, (5) propriedades específicas da via de sinalização, tais como alterações na via do sinal, devido a doença que introduz um "gargalo", (6) regulação por feedback negativo/positivo da via de sinalização (7), alteração das taxas de depuração/internalização dos componentes do complexo de sinalização, (8) alterações no alvo que desacoplam ou diferencialmente alte- ram a ligação ao ligante e ativação, por exemplo, um modulador intensifica a ligação do ligante mas aprisiona seu receptor em um estado dessensibili- zado, ou um modulador atenua a ligação do ligante, mas induz uma altera- ção conformacional no seu receptor que está ativando.

Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para medir a ligação diferencial de um primeiro componente de um complexo de sinaliza- ção para um segundo componente do complexo de sinalização na presença ou ausência de um agente polipeptídico de teste. Nestes aspectos, a ligação diferencial é preferencialmente observada quando existem concentrações subsaturantes do primeiro ou segundo componente. Em algumas modalida- des preferidas, a concentração do primeiro ou segundo componente de pode ser reduzida para fornecer subcondições saturantes.

Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para medir a ligação diferencial de um agente de ligação de polipeptídeo de teste, por exemplo, anticorpo, para alvo e/ou seu parceiro de sinalização, na forma complexada e não complexado. Nestes aspectos, a ligação diferencial é preferencialmente observada quando existem concentrações subsaturantes de agente de ligação de polipeptídeo de teste. Em algumas modalidades preferidas, a concentração do agente de ligação de polipeptídeo de teste po- de ser reduzido para proporcionar condições subsaturantes.

Em algumas modalidades, o teste na ausência de um agente polipeptídico de teste é realizado usando um composto de controle que é preferencialmente um composto que pertencente a uma classe estrutural semelhante a do agente polipeptídico de teste, mas que se liga a um antí- geno diferente, que não tem nenhum efeito sobre a sinalização do complexo a ser testado. Por exemplo, um controle para um anticorpo de teste pode ser um anticorpo de isotipo de correspondência que se liga a um antígeno não relacionado, por exemplo, hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH).

Para moduladores positivos, a uma dada concentração subsatu- rante de C1, a maior afinidade de C1 será refletida em um sinal mais elevado para ligação de C1 a C2 na presença do modulador positivo.

À ligação preferencial do modulador será refletida em um sinal mais elevado para o complexo compreendendo C1 e C2, comparado com o sinal tanto para C1 individualmente quanto C2 individualmente.

Em alguns aspectos, — pode haver ligação do modulador para o complexo de C1 e C2, mas nenhu- ma ligação mensurável quer para C1 individualmente ou C2 individualmente.

Para moduladores negativos, a uma dada concentração subsa- turante de C1, a menor afinidade de C1 será refletida em um sinal mais bai- xo para a ligação de C2 a C1 na presença do modulador.

A ligação prefe- rencial do modulador será refletida em um sinal mais elevado para a ligação do modulador a C1 individualmente, ou a C2 individualmente, em com-

paração com o sinal para a ligação do modulador ao complexo de C1 e C2. A invenção fornece métodos de identificação de um agente de ligação de polipeptídeo candidato, por exemplo, um anticorpo, que modula a ligação entre o primeiro e segundo componentes de um complexo de sinalização.

Em algumas modalidades, os primeiro e segundo componentes são polipeptídeos.

Em modalidades exemplares específicas, os primeiro e segundo componentes são endógenos.

Em um aspecto, os métodos de identificação de um anticorpo modulador candidato incluem (a) medir um parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do dito primeiro componente para o dito segundo componente, na presença de um agente de ligação de polipeptídeo de teste, por exemplo, anticorpo, (b) medir um parâmetro de taxa de ligação ou afi- nidade de ligação do dito primeiro componente para o dito segundo com- ponente na ausência do dito agente de ligação de polipeptídeo de teste, e (c) identificar o dito agente de ligação de polipeptídeo de teste como um fár- maco modulador candidato quando o dito agente de ligação de polipeptídeo de teste exibe pelo menos uma diferença de 1,5 vezes no parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação medido nas etapas (a) e (b). Em algumas modalidades, a diferença no parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação varia entre cerca de 1,5 vezes (isto é, 50%) a cerca de 1000 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes, ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes.

Em algumas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste é identificado como um modulador candidato positivo se o agente polipeptídico de teste reforça o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre o dito primeiro componente e dito segundo componente. Em outras modalidades, o agente polipeptídico de teste é identificado como um modulador candidato negativo se o agente polipeptídico de teste enfraquece o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação entre o dito primeiro componente e dito segundo componente.

Se uma alteração (aumento ou redução) de um valor de afini- dade de ligação particular ou valor do parâmetro de taxa de ligação repre- sento parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação "reforçado" (ou mais forte) ou "enfraquecido" (ou mais fraco) vai depender do valor do parâmetro e suas unidades, e é bem conhecido na técnica. Por exemplo, no caso do parâmetro Ka, os valores mais elevados significam afinidade de liga- ção "reforçada", de tal modo que um K, de cerca de 10ºM” é mais forte do que um Ka, de cerca de 10ºM. Como outro exemplo, no caso do parâmetro Kp, valores mais baixos significam afinidade de ligação "reforçada", de tal modo que um Kp de cerca de 10ºM é mais forte do que um Kp de cerca de 10ºM. Inversamente, no caso de Ka, valores mais baixos significam afini- dade de ligação "enfraquecida", de tal modo que um Ka de cerca de 10ºM' é de uma afinidade de ligação enfraquecida em comparação com um K, de cerca de 10ºM. Como outro exemplo, no caso de Kp, os valores mais elevados significam afinidade de ligação "enfraquecida", de tal modo que um Kp de cerca de 10ºM é de afinidade de ligação enfraquecida em compa- ração com um Kp de cerca de 10º M.

Como usado neste documento, um parâmetro de taxa de ligação "reforçado" significa tempo de residência aumentado, associação mais forte ou dissociação mais fraca. Como usado neste documento, um parâmetro de taxa de ligação "enfraquecido" significa o tempo de residência reduzido, associação mais fraca ou dissociação mais forte.

Afinidade de ligação também pode ser determinada através da razão dos parâmetros de taxa de ligação de taxa de associação e taxa de dissociação.

Geralmente, no caso de taxa de associação, valores mais ele- vados significam associação mais rápida ou associaçãomais forte ou tempo de residência maior, e tipicamente resultam em afinidade de ligação mais forte.

Inversamente, os valores mais baixos para a taxa de associação signi- ficam associação mais lenta ou mais fraca ou diminuição do tempo de residência, e tipicamente resultam em afinidade de ligação mais fraca.

Geral- mente, no caso de taxa de dissociação, valores mais elevados significam uma dissociação mais rápida ou tempo de residência diminuído, e tipicamen- te resultam em afinidade de ligação mais fraca.

Por outro lado, valores mais baixos para taxa de dissociação significam dissociação mais lenta ou tempo de residência aumentado, e normalmente resultam em forte afinidade de ligação.

Isto é porque a razão de taxa de dissociação para taxa de associa- ção, ou de taxa de associação para taxa de dissociação, indica a afinidade de ligação como mostrado nas equações abaixo.

Kp = L[AlTaxa de dissociação Affinity | [Ataxa de associação Ka = [Ataxa de dissociação [Altaxa de associação onde Kon A+L AL Korr Mesmo quando a afinidade de ligação não é detectável ou signi- ficativamente alterada, no entanto, a alteração no tempo de residência, isto é, um tempo de residência aumentado através da on-taxa aumentada ou taxa de dissociação diminuída, ou um tempo de residência diminuído através de uma taxa de associação diminuída ou taxa de dissociação aumentada, ainda pode resultar em ativação diferencial das vias de sinalização.

Por exemplo, em alguns casos em que um receptor pode ativar duas vias dife- rentes, as vias diferem no grau de ativação do receptor necessário para um efeito completo.

Uma via de sinalização pode ser completamente ativada em baixos níveis de ativação do receptor ou tempo de residência, enquanto que a ativação completa da segunda via requer níveis mais elevados de ativação do receptor ou tempo de residência. A correlação prevista de características de ligação para efeito funcional é representada na tabela abaixo. deslocamento de pAKT) e eo fera [monao posta — | o | eo dane [montão posta — | eo fame [monaopostva = | o od fee [monãonegama — | eo E o leo [veduçãonegava — | Exemplos ilustrativos de dados que mostram que os efeitos fun- cionais de anticorpos anti-|NSR se correlacionam com as suas característi- cas de ligação são mostrados na tabela a seguir.

Características de Ligação de Alvo Razões de KD | Efeito funcional (en- saio de deslocamen- to de pAKT), vezes de diminuição de EC59 de insulin com relação ao controle de isotipo Ab)*

PR [erevso E [xs Imoueçãoposta | | avozs jForadatanas | seo | ag >| | anos | mentumatigação || Jeso | = | [erevso [4 xe moneãoposta | [voor [1268 | asso [aaa = or ===> [ano fase | asso [44 = r [anoso f128 = | Jeso me la >|

[amos [7660 = | [axe [aa = as ==> [erviso 1 geo [Nsomoniadoes | | anos? [nosero O fan [a [remmumamedanca | | anoss [aasero | fasem 45 | remmumamedanca | [anosa [nato O jose [ne rennumamdanca | Assim, as propriedades de ligação da(s) interação(s) entre o mo- dulador e o alvo, o seu parceiro de sinalização e/ou um complexo compre- endendo o alvo e o seu parceiro de sinalização, são geralmente de predi- tivas do efeito funcional do polipeptídeo modulador na via de sinalização do alvo.

Em um outro aspecto, os métodos de identificação de um anticorpo modulador candidato incluem (a) (i) medição de um parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de um agente de ligação de polipep- tídeo de teste, por exemplo, anticorpo, para o dito primeiro componente na presença do dito segundo componente, ou (ii) medição de um parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de um agente de ligação de polipep- tídeo de teste para o dito segundo componente na presença do dito primeiro componente, e (b) (i) medição de um parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do dito agente de ligação de polipeptídeo de teste para odito primeiro componente na ausência do dito segundo componente, ou (ii) medição de um parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do dito agente de ligação de polipeptídeo de teste para o dito segundo componente na ausência do dito primeiro componente, e (c) identificação do dito agente de ligação de polipeptídeo de teste como um fármaco modulador de cinética candidato quando o dito agente de ligação de polipeptídeo de teste exibe pelo menos uma diferença de 1,5 vezes (isto é, 50%) nos parâmetros de taxa de ligação ou afinidade de ligação medidos nas etapas (a) e (b).

Em algumas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste é identificado como um modulador candidato positivo se o parâà- metrode taxa de ligação ou afinidade de ligação medido na etapa (a) é de pelo menos 1,5 vezes (isto é, 50%) mais forte do que o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação medido na etapa (b). Em modalidades espe-

cíficas, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação medido na etapa (a) em relação ao que foi medido na etapa (b) é de cerca de 1,5 vezes (isto é, 50%) a cerca de 1000 vezes mais forte para a etapa (a) vs. a etapa (b), ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes, ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 500 vezes, ou até 200 vezes, ou até 150 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ou até 40 vezes, até 30 vezes, até 20 vezes, ou até 10 vezes.

Em outras modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste é identificado como um modulador candidato negativo se o parâmetro detaxade ligação ou afinidade de ligação medido na etapa (b) é pelo menos 1,5 vezes (ou seja, 50%) mais forte que o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação medido na etapa (a). Em modalidades específicas, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação medido na etapa (b) comparado ao medido na etapa (a) é cerca de 1,5 vezes (ou seja, 50%) a cerca de 1000 vezes mais forte para a etapa (b) vs. etapa (a), ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes, ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos 1,5 Vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 500 vezes, ou até 200 vezes, ou até 150 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ou até 40 vezes, até 30 vezes, até 20 vezes, ou até 10 vezes.

Em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para o primeiro componente individualmente é medido. Em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para o segundo componente individualmente é medido.

Em algumas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo detesteé identificado como um modulador candidato positivo se um ou mais parâmetros de taxa de ligação ou de afinidade selecionados do grupo con- sistindo em (A) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para um complexo compreen- dendo o primeiro e o segundo componentes, opcionalmente Krcicam, (B) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do primeiro compo- nente para um complexo compreendendo o agente de ligação de polipeptí- deo e o segundo componente, opcionalmente Kimcajc1, ou (C) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do segundo componente para um complexo compreendendo o agente de ligação de polipeptídeo e o primeiro componente, opcionalmente Kimc1ca2, é pelo menos cerca de 1,5 vezes mais forte que um ou mais parâmetros de taxa de ligação ou afinidade de ligação selecionados do grupo consistindo em (1) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para o segundo componente individualmente, opcionalmente Kumc2 ou (2) o parà- metro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para o primeiro componente individualmente, opcional- mente Kwmc:. Em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação ou qualquer um ou mais de (A), (B) ou (C) é cerca de 1,5 vezes (ou seja, 50%) a cerca de 1000 vezes mais forte que o parâmetro detaxade ligação ou afinidade de ligação ou qualquer um ou mais de (1) ou (2); ou alternativamente, cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes mais forte, Ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes,6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 500 vezes, ou até 200 vezes, ou até 150 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ou até 40 vezes, até 30 vezes, até 20 vezes, ou até 10 vezes. Por exemplo, em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação ou qualquer um ou mais de (A), (B) ou (C) é mais forte que o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de ambos (1) e (2). Em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de (1) é mais forte que o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de (2). Em outras modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de (2) é mais forte que o parâ- metro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de (1). Em algumas modali- dades, dois ou mais parâmetros de taxa de ligação ou afinidade de ligação são medidos e comparados, por exemplo taxa de dissociação e taxa de associação, ou K, e Kp, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em modalidades específicas, quando a afinidade de ligação me- didaé a constante de dissociação de equilíbrio Kp, qualquer um de Krcicam, Krvcaje1, ou Kimetjca é menor, por exemplo, cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor, que qualquer um de Kuca ou Kuci, Similarmente, quando a afinidade de ligação medida é a taxa de dissociação, qualquer uma das taxas-off entre (A) [C1C2] e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2 são menores, por exemplo cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor, que qualquer uma das taxas-off entre (1) M e C2 ou (2) M e C1. Em uma modalidade exemplar, Kreicam é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kumc2. Em outra modalidade exemplar, Krvc2ajc: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kumc2. Em outra modalidade exemplar, Kfmcenca é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kyuc2. Em outra modalidade exemplar, Krcicam é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kwc:. Em outra modalidade exemplar, Kmmcajc1 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Knc1. Em ainda outras modalidades exemplares, Krvc1jc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kuc1. Exemplos similares podem ser previstos para cada uma das taxas- offentre(A)[C1C2] e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2, comparado com cada uma taxa de dissociaçãos entre (1) Me C2 ou (2) Me C1, Em contrapartida, quando a afinidade de ligação medida é a constante de associação de equilíbrio Ka, qualquer um de Krcicamm; Kimeajess ou Kmme1nca é maior, por exemplo, cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior, que qualquer um de Kumc2 ou Kumci, Similarmente, quando afinidade de liga- ção medida é a taxa de associação, qualquer uma das taxas-on entre (A) [CIC2] e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2 são maiores, por exemplo, cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior, que qualquer uma das taxas-on entre (1) M e C2 ou (2) M e C1. Em uma modalidade exemplar, Kreicam é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kwmc2. Em outra modalidade exemplar, Kivcajc1: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kwmco Em outra modalidade exemplar, Kivc1jc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kmc2. Em outra modalidade exemplar, Krcicawm é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kumci.

Em outra modalidade exemplar, Kmcac1 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Knmc1. Em ainda outras modalidades exemplares, Kivc1jc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que kKmwci.

Exemplos similares podem ser previstos para cada uma das taxas- on entre (A) [C1C2] e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2, em comparação com cada uma das taxas-on entre (1) Me C2 ou (2) Me C1. Em algumas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste é identificado como um modulador candidato negativo se um ou mais parâmetros de taxa de ligação ou de afinidade selecionados do grupo consistindo em (1) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para o segundo componente individualmente, opcionalmente Kumc2, ou (2) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para o primeiro componente individualmente, opcionalmente Kuc1, é pelo menos cerca de 1,5 vezes mais forte que um ou mais parâmetros de taxa de ligação ou afinidade de ligação selecionados do grupo consistindo em (A) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do agente de ligação de polipeptídeo de teste para um complexo compreendendo o primeiro e o segundo componentes, opcionalmente Krcicam, (B) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do primeiro componente para um complexo compreendendo o agente de ligação de polipeptídeo e o segundo compo-

nente, opcionalmente Krvcac1, ou (C) o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do segundo componente para um complexo compre- endendo o agente de ligação de polipeptídeo e o primeiro componente, opcionalmente Krvcijc2a.

Em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação ou qualquer um ou mais de (1) ou (2) é cerca de 1,5 vezes (ou seja, 50%) a cerca de 1000 vezes mais forte que o parà- metro de taxa de ligação ou afinidade de ligação ou qualquer um ou mais de (A), (B) ou (C); ou alternativamente, cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 ve- zes mais forte, ou cerca de 2 vezes a 25 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 50 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, por exemplo, pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes, ou até 500 vezes, ou até 200 vezes, ou até 150 vezes, ou até 100 vezes, ou até 90 vezes, ou até 80 vezes, ou até 70 vezes, ou até 60 vezes, ou até 50 vezes, ou até 40 vezes, até 30 vezes, até vezes, ou até 10 vezes.

Em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de qualquer de (1) ou (2) é mais forte que o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de todos de (A), (B) e 20 (C). Em algumas modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de (1) é mais forte que o parâmetro de taxa de ligação ou afini- dade de ligação de (2). Em outras modalidades, o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de (2) é mais forte que o parâmetro de taxa de ligação ou afinidade de ligação de (1). Em algumas modalidades, dois ou mais parâmetros de taxa de ligação ou afinidade de ligação são medidos e comparados, por exemplo taxa de dissociação e taxa de associação, ou K, e

Kp, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em modalidades específicas, quando a afinidade de ligação medida é a constante de dissociação de equilíbrio Kpn, qualquer um de Kuca —oukKmc: é menor, por exemplo, cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor, que qualquer um de Krcicalm, Kimeaje1, ou Kimenca, Similarmente, quando a afini- dade de ligação medida é a taxa de dissociação, qualquer uma das taxas-off entre (1) M e C2 ou (2) M e C1 são menores, por exemplo cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor, que qualquer uma das taxas-off entre (A) [0C1C2] e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2. Em uma modalidade exemplar Kmc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Krcicalm.

Em outra mo- dalidade exemplar, Kvwc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kmmcac1. Em outra modalidade exemplar, Kvc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kjvcijc2. Em outra modalidade exemplar, Kvc: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Krcicawm.

Em outra modalidade exemplar, Kumc: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kivcajc1. Em ainda outras modalidades exemplares, Kvc: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes menor que Kmmcica, Exemplos similares podem ser previstos para cada uma das taxas-off entre (1) M e C2 ou (2) M e C1, comparado com cada uma taxa de dissociaçãos entre (A) [C1C2] e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2. Em contrapartida, quando a afinidade de ligação é a constante de associação de equilíbrio Ka, qualquer um de Kwmc2 ou Kmc: é maior, por exemplo, cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior, que qualquer um de Krescawm: Kimeae1, ou Kimonos, Similarmente, quando a afinidade de ligação medida é a taxa de associação, qualquer uma das taxas-on entre (1) Me C2 ou (2) M e C1 são maiores, por exemplo, cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior, que qualquer uma das taxas-on entre (A) [C1C2] e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2. Em uma modalidade exemplar Kuc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Krcicawm.

Em outra modalidade exemplar, Kvc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kivcajc1. Em outra modalidade exemplar, Kmc2 é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kivc1jc2. Em outramodalidade exemplar, Kvc: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kreicam.

Em outra modalidade exemplar, Kvc: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Krmc2aici, Em ainda outras modalidades exemplares, Kmc: é cerca de 1,5 vezes a 1000 vezes maior que Kmcijc2a, Exemplos similares podem ser previstos para cada uma das taxas-on entre (1) M e C2 ou(2)MeCl1,em comparação com cada uma das taxas-on entre (A) [01C2]

e M, ou (B) [MC2] e C1, ou (C) [MC1] e C2. Em certas modalidades, o modulador é um anticorpo e C1 e C2 são selecionados dentre o grupo consistindo em insulina e receptor de insu- lina.

Em qualquer destas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste e o segundo componente podem ser contatados com múltiplas diferentes concentrações do referido primeiro componente. Em qualquer destas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste e o primeiro componente podem ser contatados com múltiplas diferentes con- centrações de dito segundo componente. Em qualquer destas modalidades, várias concentrações diferentes do agente de ligação de polipeptídeo de tes- te podem ser contatadas com o dito primeiro componente e o dito segundo componente.

Quando o efeito do agente de ligação de polipeptídeo de teste sobre a interação de ligação entre o primeiro componente e o segundo componente é determinada, em algumas modalidades específicas, quando o antígeno para o agente de ligação de polipeptídeo de teste é o primeiro componente, por exemplo, o ligante, o agente de ligação de polipeptídeo de teste está a uma concentração saturante comparada com a concentração do primeiro componente. Alternativamente, quando o antígeno para o agente de ligação de polipeptídeo de teste é o segundo componente, por exemplo, o receptor, o agente de ligação de polipeptídeo de teste está a uma concen- tração saturante comparada com a concentração do segundo componente. Em algumas modalidades, a concentração do agente de ligação de polipep- tídeo de teste é maior que, ou igual ao Kp do agente de ligação de polipep- tídeo de teste para um complexo compreendendo o primeiro componente e o — segundo componente. Em outras modalidades, a concentração do segundo componente é menor que o Kp do agente de ligação de polipeptídeo de teste para o primeiro componente, por exemplo, o ligante. Em ainda outras moda- lidades, a concentração do primeiro componente, por exemplo, ligante, está a uma concentração de subsaturação para a ligação do primeiro compo- — nente ao segundo componente, por exemplo, receptor. Em algumas modali- dades, a concentração do primeiro componente, por exemplo, ligante está dentro da faixa de cerca de EC2xy para ECgo para a interação do primeiro componente com o segundo componente. Em algumas modalidades, um ou mais concentrações do agente de ligação de polipeptídeo de teste é con- tatada com múltiplas diferentes concentrações do primeiro componente, por exemplo, ligante, na presença de uma ou mais concentrações do segundo componente, por exemplo, receptor. Em algumas modalidades, uma ou mais concentrações do agente de ligação de polipeptídeo de teste é contatada com múltiplas concentrações diferentes do segundo componente, por exemplo, receptor, na presença de uma ou mais concentrações do primeiro componente, por exemplo, ligante.

Quando a ligação diferencial de agente de ligação de polipeptí- deo de teste ao alvo complexado vs não complexado e/ou o parceiro de sinalização é determinada de modo a identificar um modulador positivo, em algumas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste está uma concentração saturante de um complexo compreendendo o primeiro componente e o segundo componente. Em algumas modalidades, a concen- tração do agente de ligação de polipeptídeo de teste é maior que, ou igual ao Kp do agente de ligação de polipeptídeo de teste para um complexo compreendendo o primeiro componente, por exemplo, o ligante, e o segundo componente, por exemplo, receptor. Em outras modalidades, a concentração do segundo componente, por exemplo, o receptor, é maior do que o Kp do segundo componente, por exemplo, o receptor, para o primeiro componente, por exemplo, ligante. Em outras modalidades, a concentração do primeiro componente, por exemplo, o ligante, é uma concentração saturante para o segundo componente, por exemplo, o receptor. Em ainda outras modalida- des,o agente de ligação de polipeptídeo de teste está a uma concentração de subsaturação para um complexo compreendendo o primeiro componente eo segundo componente. Em algumas modalidades, a concentração do agente de ligação de polipeptídeo está dentro da faixa de cerca de EC2, para ECgo para a interação do primeiro componente com o segundo componente.

Em algumas modalidades, a concentração do segundo componente, por exemplo, o receptor, é maior do que o Kp do segundo componente, por exemplo, o receptor, para o primeiro componente, por exemplo, o ligante.

Em algumas modalidades, a concentração do primeiro componente, por exemplo, o ligante, é uma concentração saturante para o segundo compo- nente, por exemplo, o receptor.

Quando a ligação diferencial de agente de ligação de polipeptí- deo de teste ao alvo complexado vs não complexado e/ou o parceiro de sinalização é determinada de modo a identificar um modulador negativo, em algumas modalidades, quando o antígeno para o qual o agente de ligação de polipeptídeo de teste se liga é o primeiro componente, por exemplo, o ligante, o agente de ligação de polipeptídeo de teste está a uma concentra- ção de subsaturação para o primeiro componente. Quando o antígeno para o qual o agente de ligação de polipeptídeo de teste se liga é o segundo componente, por exemplo, o receptor, o agente de ligação de polipeptídeo de teste está a uma concentração de subsaturação para o segundo compo- nente. Em outras modalidades, a concentração do agente de ligação de —polipeptídeo está dentro da faixa de cerca de EC2xo para ECsgo para a inte- ração do primeiro componente com o segundo componente. Em outras mo- dalidades, a concentração do segundo componente, por exemplo, o recep- tor, é maior do que o Kp do segundo componente, por exemplo, o receptor, para o primeiro componente, por exemplo, o ligante. Em outras modalidades, a concentração do primeiro componente, por exemplo, o ligante, é uma con- centração saturante para o segundo componente, por exemplo, o receptor. Em algumas modalidades, os métodos envolvem ainda o ensaio de uma pluralidade de agentes de ligação de polipeptídeo de teste, por exemplo, anticorpos, por afinidade de ligação para qualquer um de (a) o primeiro componente, (b) o segundo componente, ou (c) um complexo com- preendendo o primeiro componente e o segundo componente. Em algumas modalidades específicas, os agentes de ligação polipeptídica têm uma afini- dade de ligação caracterizada, por exemplo, por uma constante de disso- ciação de equilíbrio Kp de cerca de 10ºM ou menos, ou cerca de 10ºM ou — menos, ou cerca de 107M ou menos, ou cerca de 10ºM ou menos, onde um Kp menor significa afinidade de ligação mais forte. Em algumas modalida- des, a pluralidade de agentes de ligação de polipeptídeo de teste rastreada é variante de um agente de ligação de polipeptídeo de origem feita através da introdução de uma ou mais mutações diferentes em um agente de ligação de polipeptídeo de origem.

Em outras modalidades, os agentes de ligação de polipeptídeo podem ser rastreados para a seletividade do efeito para o primeiro ou segundo componente, em comparação com um parceiro de ligação diferente tal como um receptor decoy, receptor de depuração, ou componente da via de sinal alternativa. Tais métodos podem envolver a identificação de um agente de ligação de polipeptídeo que não altera significativamente o parâà- metro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do primeiro componente ou segundo para um parceiro de ligação diferente, tal como o parceiro de ligação que não é nem o primeiro componente nem o segundo. Em algumas modalidades, a presença do agente de ligação de polipeptídeo altera o parà- metro de taxa de ligação ou afinidade de ligação do primeiro ou segundo componente para um parceiro de ligação diferente não mais do que 5 vezes, ou não mais do que 10 vezes, ou não mais do que 20 vezes, ou não mais do que 30 vezes, ou não mais do que 40 vezes, ou não mais do que 50 vezes.

Qualquer um dos métodos anteriores pode ainda incluir a medi- ção do nível de sinalização mediada pelo complexo de sinalização na pre- sençae na ausência do agente de ligação de polipeptídeo de teste, e deter- minação de se o agente de ligação de polipeptídeo de teste é adicional- mente um agonista, agonista parcial, antagonista ou parcial antagonista. O antagonismo ou agonismo podem ser medidos em qualquer ensaio in vitro ou in vivo conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados à sinalização emum ensaio de fosforilação, ensaio de fluxo de íons, ensaio de transporte molecular, ou ensaio de expressão do gene.

Em algumas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste desloca (positiva ou negativamente) a curva de dose-resposta da interação do primeiro componente, por exempl, o ligante, com o segundo componente, por exemplo, o receptor. O deslocamento pode manifestar-se como uma EC50 aumentada ou diminuída de pelo menos cerca de 1,5 vezes, por exemplo, cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes. Em algumas modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste não alterar signi- ficativamente a resposta agonista máxima do sinal produzido pela interação dos primeiro e segundo componentes do complexo de sinalização. Em outras modalidades, o agente de ligação de polipeptídeo de teste em si atua como um antagonista (por exemplo, reduz a resposta máxima do agonista de sinalização produzida pelo dito complexo de sinalização) ou agonista (por exemplo, aumenta a resposta máxima do agonista de sinalização produzida pelo dito complexo de sinalização).

Quando o agente de ligação de polipeptídeo de teste atua como um antagonista ou antagonista parcial, a resposta agonista máxima pode ser diminuída, por exemplo, por cerca de 1,5 vezes a cerca de 100 vezes, ou cerca de 2 vezes a cerca de 25 vezes, ou cerca de 1,5 vezes a cerca de 50 vezes, ou, diminuída por cerca de 10%, 25%, 50% (1,5 vezes), 75%, 2 vezes, 3 vezes, ou 4 -, 5-, 6 -, 7 -, 8 -, 9 -, ou 10 vezes. Alternativamente, ondeo agente de ligação de polipeptídeo de teste atua como um agonista ou agonista parcial, a resposta máxima agonista pode ser aumentada, por exemplo, pelo menos cerca de 10%, 25%, 50% (1,5 vezes), 75%, 2 vezes, 3 vezes, ou 4 -, 5-, 6 -, 7 -, 8 -, 9 -, ou 10 - vezes. Além disso, quando o agente de ligação de polipeptídeo de teste atua como um antagonista ou antagonista parcial, o IC50 pode ser 1x10º ou menos. O agente de ligação de polipeptídeo de teste pode apresentar outras características desejáveis, por exemplo, o agente de ligação de polipeptídeo de teste não diminui signi- ficativamente a depuração do dito primeiro componente, ou do dito segundo componente, ou do dito complexo de sinalização compreendendo dito pri- —meiroe segundo componentes.

Métodos de identificação de agentes moduladores, por exemplo, agentes moduladores cinéticos, são descritos adicionalmente no Pedido de Patente US 61/246.079, copendente, de copropriedade, depositado em 25 de setembro de 2009, Pedido de Patente US 61/306.324, depositado em 19 de fevereiro de 2010, e Pedido de Patente Internacional No. ; depositado 24 de setembro de 2010 (Protocolo No. 27129/41726).

O agente de ligação de polipeptídeo de teste pode apresentar outras características desejáveis, por exemplo, o agente de ligação de polipeptídeo de teste não diminui significativamente a depuração do dito pri- meiro componente, ou dito segundo componente, ou dito complexo de sina- lização compreendendo dito primeiro e segundo componentes.

Em um aspecto relacionado, a invenção fornece métodos de identificação de moduladores do complexo de sinalização de insulina/recep- tor de insulina e um anticorpo ou outro modulador identificado por qualquer um dos métodos descritos acima ou em qualquer parte do presente pedido.

Tipos e Fontes de Anticorpos A presente invenção abrange anticorpos específicos para alvo que se ligam à insulina, receptor de insulina ou complexo de receptor de insulina/insulina. Em modalidades exemplares, um anticorpo específico para alvo da invenção pode compreender uma cadeia leve kappa (K) humana ou lambda (A) humana ou uma sequência de aminoácidos derivada da mesma, ou uma cadeia pesada humana ou uma sequência derivada da mesma, ou ambas as cadeias pesada e leve em conjunto com uma cadeia única, dimérica, tetramérica ou outra forma. Em algumas modalidades, uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina alvo específica são dife- rentes moléculas de aminoácidos. Em outras modalidades, a mesma molé- culade aminoácido contém uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo específico para alvo.

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos completamente montados, anticorpos tetraméricos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecífico (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos e humanizados, fragmentos de anticorpos capazes de se ligar a um antígeno (por exemplo, Fab', F'(ab)>, Fv, anticorpos de cadeia única, diacorpos), e peptídeos recombinantes com- preendendo a renúncia desde que exibam a atividade biológica desejada. Uma "imunoglobulina" ou "anticorpo tetramérico" é uma glicoproteína tetra- —mérica consistindo em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, cada uma compreendendo uma região variável e uma região constante. As por- ções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos.

Os fragmentos de anticorpos ou porções de ligação ao antígeno incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio (dAB), fragmentos de regiões determinantes de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), fragmentos de anticorpo de cadeia única, anticorpos quiméri- cos, diacorpos e triacorpos e tetracorpos e minicorpo, anticorpo linear; anticorpo recombinante quelante, um tricorpo ou bicorpo, um intracorpo, um nanocorpo, um pequeno imunofarmaceutico modular (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina do domínio de ligação de antígeno, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH, ou uma variante ou um seu deri- vado, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imuno- globulina que é suficiente para conferir o antígeno de ligação específico para o polipeptídeo, enquanto o anticorpo retém a atividade biológica desejada.

Em uma imunoglobulina de ocorrência natural, cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno.

A porção carboxi-terminal de cada cadeia de- fine uma região constante primariamente responsável pela função efetora.

Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa («) e lambda (A). Cadeias pesadas são classificadas como mu (yu), delta (A), gama (y), alfa (a), e epsilon (e), e definem o isotipo do anticorpo como IgM, 1gD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente.

Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 a mais aminoácidos.

Ver em geral, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2º ed.

Raven Press, NY (1989)) (incorpo- rado por referência na sua totalidade para todos os fins). As regiões variá- veisde cada par de cadeia leve / pesada formam o sítio de ligação do anti- corpo de tal modo que uma imunoglobulina intacta tem dois sítios de ligação.

Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio va-

riável (V4) seguido por um número de domínios constantes.

Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (V.) e um domínio cons- tante na sua outra extremidade, o domínio constante de cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante de cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pe- sada.

Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada (Chothia et al., J.

Mol.

Biol. 196:901-917, 1987). Os domínios variáveis de imunoglobulinas exibem a mesma estrutura geral de regiões de estrutura relativamente conservadas (FR) uni- das por três regiões hipervariáveis ou CDRs.

A partir do N-terminal para C- terminal, ambas as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FRA4. A atribuição de aminoácidos para cada domínio está em conformidade com as definições de Sequências Kabat de proteínas de interesse imunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia e Lesk, (J.

Mol.

Biol. 196:901-917, 1987); Chothia et al., (Nature 342:878-883, 1989). A região hipervariável de um anticorpo refere-se aos resíduos de aminoácidos de CDR de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno.

A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos a partir de uma CDR [isto é, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50 - 65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada, como descrito por Kabat et al., as se- quências de proteínas de interesse imunológico, 5a ed.

Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991)] e/ou os resíduos de um laço hipervariável (ou seja, os resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada, tal como descrito por [Chothia et al., J.

Mol.Biol 196,.: 901-917 (1987)]. No entanto, um versado na técnica sabe que a localização real dos resíduos de CDR pode variar a partir dos resíduos projetados descritos acima, quando a sequência do anticorpo particular é identificada.

Resíduos estruturais ou FR são aqueles resíduos do domínio variável que não são os resíduos da região hipervariável.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constan- te das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que podem ser ainda divididas em subclasses ou isotipos, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA! e IgA2. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Isotipos diferen- tes têm diferentes funções efetoras, por exemplo, os isotipos I9G1 e IgG3 têm atividade de ADCC. Um anticorpo da invenção, se ele compreende um domínio constante, pode ser de qualquer uma destas subclasses ou isotipos.

Em modalidades exemplares, um anticorpo da invenção pode compreender uma cadeia leve capa (kK) humana ou lambda (A) humana ou uma sequência de aminoácidos derivada da mesma, ou uma cadeia pesada humana ou uma sequência derivada da mesma, ou ambas as cadeias pesa- da e leve juntamente em cadeia única, dimérica, tetramérica ou de outra for- ma.

O anticorpo monoclonal refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos. Os anticor- pos monoclonais são geralmente altamente específicos, e podem ser dirigi- dos contra um único sítio antigênico, em contraste com preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos). Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que são sintetizados pela cultura homogênea, não contaminada por outras imu- noglobulinas com diferentes especificidades e características.

Os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma primeiro des- crito por Kohler et al., (Nature, 256:495-7, 1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente US 4.816.567). Os anticorpos monoclonais podem também ser isolados a partir de bibliote- cas de anticorpos de fagos usando as técnicas descritas, por exemplo, em

Clackson et al., (Nature 352:624-628, 1991) e Marks et al., (J.

Mol.

Biol. 222:581-597, 1991). No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hos- pedeiro apropriado, tal como um hamster ou macaco, é imunizado para eliciarlinfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se irão se ligar especificamente à proteína usada para imunização (Harlow e Lane; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1988). Produção Recombinante de Anticorpos A presente invenção também abrange moléculas de ácido nu- cleico que codificam os anticorpos da invenção.

Em algumas modalidades, diferentes moléculas de ácidos nucleicos codificam uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo especí- fico para antígeno.

Em outras modalidades, a mesma molécula de ácido —nucleico codifica uma cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo específico para antígeno.

O DNA que codifica o anticorpo monoclonal da invenção pode ser isolado e sequenciado a partir de uma célula de hibridoma que secreta o anticorpo usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando son- dasde oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a ge- nes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). A determinação da sequência irá geralmente requerer o isolamento de pelo menos uma porção do gene ou cDNA de interesse.

Normalmente, isso re- quer a clonagem do DNA ou, preferencialmente, MRNA (ou seja, cDNA) que codificaos anticorpos monoclonais.

A clonagem é realizada usando técnicas padrões (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, que é aqui incorpora- da por referência). Por exemplo, uma biblioteca de cDNA pode ser construí- da por transcrição inversa de poliA +mRNA, preferencialmente mRNA asso- ciadoàmembrana, e à biblioteca rastreada usando sondas específicas para as sequências de genes de polipeptídeos de imunoglobulina humana.

As reações de sonda nucleotídica e outras reações de hibridação de nucleotí-

deos são realizadas em condições que permitem a identificação de polinu- cleotídeos que hibridizam com o outro em condições especificadas. As con- dições de hibridação podem ser calculadas como descrito em Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 a 9.51.

Em uma modalidade preferida, a reação em cadeia da polime- rase (PCR) é usada para amplificar cCDNAs (ou porções de cDNAs de com- primento completo) que codificam um segmento do gene da imunoglobulina de interesse (por exemplo, um segmento variável de cadeia leve). As se- quências amplificadas podem ser facilmente clonadas em qualquer vetor adequado, por exemplo, vetores de expressão, vetores de minigene, ou vetores de exibição de fagos. Será apreciado que o método particular de clo- nagem usado não é crítico, contanto que seja possível determinar a se- quência de alguma porção do polipeptídeo de imunoglobulina de interesse.

Como usado neste documento, uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou sequência de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é ou (1) identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte na- tural do ácido nucleico ou (2) clonada, amplificada, marcada, ou de outra forma, distinguida dos ácidos nucleicos de fundo de tal forma que a sequên- cia de ácidos nucleicos de interesse possa ser determinada, é considerada isolada. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra que não na forma ou configuração em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas, por conseguinte, são distinguidas a partir da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. No entanto, uma molé- cula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente expressam o anticorpo, onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossômica diferente da localização das células naturais.

Uma fonte para o RNA usado para clonagem e sequenciamento é um hibridoma produzido pela obtenção de uma célula B a partir do camun- dongo transgênico e fusão da célula B a um celular imortal. Alternativamen-

te, o RNA pode ser isolado a partir de células B (ou baço total) do animal imunizado.

Quando outras fontes são usadas, que não os hibridomas, pode ser desejável o rastreio de sequências que codificam imunoglobulinas ou polipeptídeos de imunoglobulinas com características de ligação específicas.

Um método para o rastreio é o uso de tecnologia de exibição de fagos.

À exibição de fagos é descrita mais adiante neste documento e também é bem conhecida na técnica.

Ver, por exemplo, Dower et al, WO 91/17271, McCatfferty et al., WO 92/01047, e Caton e Koprowski, (Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 87:6450-54 (1990)), cada um dos quais sendo incorporado neste documento por referência.

Em uma modalidade, o cDNA a partir de um camundongo transgênico imunizado (por exemplo, cDNA de baço total) é isolado, a reação em cadeia da polimerase é usada para amplificar as se- quências de cDNA que codificam uma porção de uma imunoglobulina de polipeptídeo, por exemplo, as regiões CDR, e as sequências amplificadas são inseridas em um vetor de fago.

OS peptídeos de codificação de cDONAs de interesse, por exemplo, os peptídeos da região variável com caracterís- ticas de ligação desejadas, são identificados por meio de técnicas padrões de exibição de fagos como a técnica de panning.

A sequência de ácidos nucleicos amplificada ou clonada é então determinada.

Tipicamente, a sequência que codifica uma região variável inteira do polipeptídeo de imunoglobulina é determinada, no entanto, ela será por vezes adequada para sequenciar apenas uma porção de uma região variável, por exemplo, a porção de codificação de CDR.

Tipicamente a porção sequenciada será de pelo menos 30 bases de comprimento, mais frequentemente com base que codifica pelo menos cerca de um terço ou pelo menos cerca de um meio do comprimento da região variável que será sequenciada.

O sequenciamento pode ser realizado em clones isolados a par- tir de uma biblioteca de cDNA, ou, quando o PCR é usado, após subclo- nagem da sequência amplificada ou por sequenciamento direto por PCR do segmento amplificado.

O sequenciamento é realizado usando técnicas pa- drões (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: À

Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, and Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, que é incorporado neste documento por referência). Ao comparar a sequência de ácido nucleico clo- nada com as sequências publicadas de genes de imunoglobulina humana e oscDNAs, uma pessoa versada na técnica será prontamente capaz de de- terminar, dependendo da região sequenciada, (i) o uso do segmento de |i- nhagem germinativa do polipeptídeo de imunoglobulina de hibridoma (inclu- indo o isotipo de cadeia pesada) e (ii) a sequência das regiões variáveis de cadeia pesada e leve, incluindo as sequências resultantes a partir da adição de região-Ne do processo de mutação somática. Uma fonte de informação de sequência do gene da imunoglobulina é o, National Center for Biotech- nology Information (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia), National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de rim embrionário humano 293 (por exemplo, células 293E), células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas célu- las hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos é bem conhecida na técnica.

As sequências de controle de expressão se referem às sequên- cias de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codifica- ção operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequadas para procarióticas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um sítio de ligação ao ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas por utiliza- rem promotores, sinais de poliadenilação e intensificadores.

Em uma modalidade alternativa, a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina de interesse pode ser determinada por sequenciamento direto de proteína. As sequências de codificação de nucleotídeos adequadas podem ser concebidas de acordo com uma tabela de códon universal.

Variantes de sequências de aminoácidos do anticorpo desejado podem ser preparadas por introdução de alterações de nucleotídeos apro- priadas no DNA de codificação, ou por síntese de peptídeos. Tais variantes incluem, por exemplo, deleções a partir de, e/ou inserções em e/ou substi- tuições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos dos anticorpos. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para che- gar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar os proces- sos pós-tradução do anticorpo, tais como alteração do número ou posição de sítios de glicosilação.

As moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por muta- gênese mediada por oligonucleotídeos (ou sítio-dirigida), de mutagênese por PCR, e mutagênese de cassete de uma variante preparada mais cedo ou uma versão não variante do anticorpo.

A invenção também fornece anticorpos isolados de ácido nuclei- code codificação da invenção, opcionalmente operativamente ligados a se- quências de controle reconhecidas por uma célula hospedeira, vetores e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos, e técnicas recom- binantes para a produção dos anticorpos que podem compreender a cultura da célula hospedeira de modo que o ácido nucleico seja expresso e, opcio- nalmente, a recuperação do anticorpo a partir da cultura da célula hospe- deira ou meio de cultura. Vários sistemas e métodos para a produção de anticorpos são revisados por Birch & Racher (Adv. Drug Deliv. Rev. 671-685 (2006)).

Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucleico que codifica o mesmo é isolado e inserido em um vetor replicável para clo- nagem adicional (amplificação de DNA) ou para expressão. O DNA que codi- fica o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e sequenciado usando pro-

cedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotí- deos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um oumaisdos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores seletivos, um elemento intensificador, um promo- tor e uma sequência de terminação da transcrição.

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui são procarióticas, de levedura, ou células eucarió- ticas superiores. Os procariótas adequados para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tals como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P revelado no DD 266.710 publicada 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem preferido de E. coli é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras cepas tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) e E.

coliW3110 (ATCC 27,825) sejam adequados. Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos.

Além dos procarióticos, os micróbios eucarióticos tais como fun- gos ou leveduras filamentosos são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores de codificação de anticorpos. Saccharomyces cere- visiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais vulgarmente usado entre os micro-organismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, uma série de outros gêneros, espécies e cepas estão comumente disponíveis e aqui úteis, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromy- ces tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltir (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia

(EP 244,234); Neurospora crassay Schwanniomyces such as Schwanniomyces occidentalis; e filamentous fungi such as, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e Aspergillus hosts such as A. nidulans e A. niger.

Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são derivados de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem as células de plantas e de insetos. Numerosa ce- pas de baculovírus e variantes e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (cater- pillar, Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção está disponível ao público, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como os virus aqui de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de célu- las Spodoptera frugiperda.

Culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, tabaco, Lemna, e outras células de plantas também podem ser usadas como hospedeiras.

Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis são as células de ovário de hamster chinês, incluindo células CHOK1 (ATCC CCL61) e DXB-11, DG-44 e células de ovário de hamster chinês /- DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lihhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de camundongo Sertoli (TM4, Mather, (Biol. Reprod 23:. 243- 251, 1980);. células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células humanas de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL 2); células de rim de canino (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC

CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células do fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51);. células TRI (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de — hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com a expressão descrita acima, ou vetores de clonagem para a produção de anticorpos e cultivadas em meios de cultura convencionais modificados con- forme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. Além disso, novas linhagens de células transfectadas e vetores com múltiplas cópias de unidades de transcrição separadas por um marcador seletivo são particular- mente úteis e preferidas para a expressão de anticorpos que se ligam ao antígeno desejado.

As células hospedeiras que contêm as sequências de ácidos nucleicos de anticorpos desejados podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio Dulbecco modificado por Eagle ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Além disso, qualguer um dos meios des- critos em Ham et al., (Meth. Enz. 58: 44, 1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90103430; WO 87/00195;. ou Patente US Re 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras.

Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento. (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como, cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotí- deos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como fármaco —“GENTAMICINA'”), elementos traços (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que são conhecidas pelos versados na técniaca. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são as anteriormente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para oespecialistano assunto.

Quando são usadas técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente no espaço periplasmático, ou diretamente segregado no meio, inclusive a partir de culturas microbianas. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os detritos de parti- culado, seja de células hospedeiras ou de fragmentos lisados, são remo- vidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Better et al. (Science 240:1041-43, 1988; ICSU Short Reports 10:105 (1990); and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:457-461 (1993) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaço periplásmico de E. coli. [Ver também, (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))].

A composição de anticorpos preparada a partir de células micro- bianas ou de mamífero pode ser purificada usando, por exemplo, cromato- grafia de hidroxilapatite ou cromatografia de troca de cátions ou aviária, e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação de proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas humanas v1, y2, ou y4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13, 1983). A proteína Gé recomendada para todos os isotipos de camundongos e para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade está ligado é mais frequentemente de agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como poli(estirenodivinil)benzeno ou vidro poroso controlado permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do queaqueles que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio Ch3, a resina Bakerbond ABX"Y (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para a purificação.

Outras técnicas para a purificação de proteínas, tais como fracionamento sobre uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE"", cromatografia sobre uma resina de troca catiônica ou aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amônio também estão disponí- veis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Anticorpos da Invenção A presente invenção abrange anticorpos específicos para alvo que se ligam à insulina, receptores de insulina e/ou o complexo de receptor de insulina/insulina, e preferencialmente alteram (por exemplo, aumentam ou diminuem) a sinalização do receptor de insulina e/ou o seu efeito sobre os níveis de glicose e absorção de glicose.

Em modalidades exemplares, um anticorpo específico para alvo da invenção pode compreender uma cadeia leve kappa (k) humana ou lambda (A) humana ou uma sequência de ami- noácidos derivada da mesma, ou uma cadeia pesada humana ou uma se- quência derivada da mesma, ou ambas as cadeias pesada e leve em uma cadeia única, dimérica, tetramérica ou de outra forma.

Em algumas modali- dades, uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina alvo específica são diferentes moléculas de aminoácidos.

Em outras modalida- des, a mesma molécula de aminoácido contém uma região variável de ca- deia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo específico para alvo.

Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do anticorpo anti-calvo compreende uma ou mais CDRs de uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve madura (ou seja, sem sequência sinal) (V.) de anticorpos na SEQ ID NO: 1-150 ou variante das mesmas.

Em algumas modalidades, a V. compreende uma sequência de aminoácidos do começo da CDR1 ao fim da CDR3 de cadeia leve de qualquerum dos anticorpos antecetendes.

Em uma modalidade, o anticorpo específico para alvo compre- ende uma CDR1, CDR2 ou CDR3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) de cadeia leve,

cada uma das quais sendo independentemente selecionadas das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo tendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da região V, estabelecida na SEQ ID NOs: 1- 150. Em um aspect, a CDR1 de cadeia leve está dentro dos resíduos 24-36, CDR2 está dentro dos resíduos 50-56 e CDR3 está dentro dos resíduos 89-101, de acordo com a numeração de Chothia. Um polipeptídeo do anticorpo específico para alvo pode compreender as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo tendo a sequência de aminoácidos da região VL selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 1- 150.

Em algumas modalidades, o anticorpo específico para alvo com- preende uma ou mais CDRs de uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada madura (ou seja, sem sequência sinal) (Vu) de anticorpos estabelecida na SEQ ID NOs: 151-303 ou variante das mesmas. Em algumas modalidades, a V4 compreende a sequência de aminoácidos do começo de CDR1 para o fim de CDR3 de qualquer uma das cadeias pesa- das dos anticorpos antecedentes.

Em uma modalidade, o anticorpo específico para alvo compre- ende uma CDR1, CDR2 ou CDR3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) de cadeia le- ve, cada uma das quais sendo independentemente selecionadas das regiões CDR1,CDR2 e CDR3 de um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da região V, estabele- cida na SEQ ID NOs: 151-303. É também contemplado que um anticorpo específico para alvo compreende uma CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada, cada uma das quais sendo independentemente selecionadas das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos da região Vx estabelecida na SEQ ID NOs: 151-303. Em um aspecto as CDRs de cadeia pesada estão localizadas de acordo com a numeração de Chothia: CDR1 está dentro dos resíduos 26-35, CDR2 está dentro dos resíduos 50-58 e CDR3 está dentro dos resíduos 95-111 ou 97-118. Um polipeptídeo do anticorpo específico para alvo pode compreender as regiõêês CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo tendo a sequência de aminoácidos da região Vx selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 151-303, CDRs nas tabelas 1 e 2 e SEQ ID NO: 1-303 foram determi- nadas de acordo com o sistema de IMGT, LeFranc et al IMGT, the INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEMO, Nucl.

—Ac.Res.33D593-597 (2005).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variá- vel de cadeia leve madura como divulgado acima e uma região variável de cadeia pesada madura como divulgado acima, emparelhadas como estabe- lecido na Tabela 3. Em uma outra modalidade, a invenção contempla uma preparação purificada de um anticorpo monoclonal, compreendendo a região variável de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos estabelecidos na SEQ ID NOs: 1-303 e emparelhadas como estabelecido na Tabela 3.

Em uma modalidade exemplar, a invenção contempla: um anticorpo monoclonal que retém qualquer uma, duas, três, quatro, cinco ou seis de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LOCDR2, ou LCDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 151-303 e SEQ ID NOs: 1-150, respectivamente, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qual- quer uma de tais CDR(s), por exemplo, uma substituição conservativa ou não conservativa, e opcionalmente emparelhadas como estabelecido na Tabela 3; um anticorpo monoclonal que retém todas de HCDR1, HCDR2, HCDR3, ou a região variável de cadeia pesada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 151-303, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer uma de tais CDR(s), opcionalmente compreendendo ainda qualquer região constante de cadeia pesada adequada, por exemplo, IgG1, IgG2, 1gG3, IgG4, I9M, IgA1, IgA2, ou IgE, uma sequência humana da mesma, ou um híbrido da mesma ou um consenso humano da mesma; um anticorpo monoclonal que retém todas de LCDR1, LODR?2, LCDR3,oua região variável de cadeia leve de qualquer uma SEQ ID NOs: 1-150, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer uma de tais CDR(s), opcionalmente compreendendo ainda qualquer região constan-

te de cadeia leve adequada, por exemplo, uma região constante de cadeia leve kappa ou lambda, uma sequência humana da mesma, ou um híbrido da mesma ou um consenso humano da mesma; um anticorpo monoclional que se liga ao mesmo epítopo linear outridimensional de INSR como um anticorpo compreendendo regiões variá- veis estabelecidas na SEQ ID NO: 1-303, por exemplo, como determinado através de cristalografia de raios-X ou outras técnicas biofísicas ou bioquíi- micas tais como troca de deutério por espectrometria de massa, varredura de alanina e ELISA de fragment peptídico; um anticorpo monoclonal que compete com um anticorpo com- preendendo regiões variáveis estabelecidas na SEQ ID NO: 1-303 por liga- ção a INSR humano por mais que cerca de 75%, mais que cerca de 80%, ou mais que cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende todas as três CDRs de cadeia leve, todas as três CDRs de cadeia pesada, ou todas as seis CDRs de cadeia leve e pesada, emparelhadas como estabelecido na Tabela 3. Em algumas modalidades exemplares, duas CDRs de cadeia leve de um anticorpo podem ser combinadas com uma terceira CDR de cadeia levede um anticorpo diferente. Alternativamente, uma LCDR1 de um anticor- po pode ser combinada com uma LCDR2 de um anticorpo diferente e uma LCDR3 de um outro anticorpo, particularmente onde as CDRs são altamente homólogas. Similarmente, duas CDRs de cadeia pesada de um anticorpo podem ser combinadas com uma terceira CDR de cadeia pesada de um anticorpo diferente; ou uma HCDR1 de um anticorpo pode ser combinada com uma HCDR2 de um anticorpo diferente e uma HCDR3 de um outro anticorpo, particularmente onde as CDRs são altamente homólogas.

As CDRs de consenso podem ser usadas. Qualquer uma das CDRs de consenso derivadas aqui pode ser combinada com outras duas —CDRs da mesma cadeia (por exemplo, pesada ou leve) de qualquer um dos anticorpos, por exemplo, para formar uma região variável de cadeia leve leve ou pesada adequada.

Em algumas modalidades, um anticorpo é fornecido o qual com- preende um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma região variável de cadeia pesada estabelecida na SEQ ID NO: 148-284 e/ou uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma região variável de cadeia leve estabelecida na SEQ ID NO: 1-150, o anticorpo compreendendo ainda pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou todas de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 ou CDRL3. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos com identidade percen- tual a uma região variável de cadeia leve pode compreender uma, duas ou três das CDRs de cadeia leve. Em outras modalidades, a sequência de ami- —noácidos com identidade percentual a uma região variável de cadeia pesada pode compreender uma, duas ou três das CDRs de cadeia pesada.

É contemplado que os anticorpos da invenção podem ter uma, ou duas ou mais substituições de aminoácidos nas regiões CDR do anticor- po, por exemplo, substituições não conservativas ou conservativas.

Em uma modalidade relacionada, os resíduos de estrutura são alterados. As regiões de estrutura de cadeia pesada que podem ser alte- radas se encontram dentro de regiões designadas H-FR1, H-FR2, H-FR3 e H-FRA4, que rodeiam os resíduos de CDR de cadeia pesada, e os resíduos das regiões de estrutura de cadeia leve que podem ser alteradas encontram- se dentro das regiões designadas L-FR1, FR2 L-, L-FR3 e L-FR4, que circundam os resíduos de CDR de cadeia leve. Um aminoácido dentro da re- gião estrutural pode ser substituído, por exemplo, com qualquer aminoácido adequado identificado em uma estrutura humana ou esquema de consenso humano.

É ainda contemplado que a invenção fornece um polipeptídeo purificado compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-150 fundidas com qualquer uma das sequências de ami-

noácidos de SEQ ID NO: 151-303, opcionalmente emparelhadas como as regiões variáveis de cadeia leve/pesada como estabelecido na Tabela 3, ou seus fragmentos, que incluem pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 1- 150 e SEQ ID NO: 151-303, opcionalmente emparelhada como estabelecido naTabela3,em que o polipeptídeo se liga ao receptor de insulina, a insulina ou complexo de receptor de insulina/insulina.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo puri- ficado compreendendo pelo menos uma CDR de uma região variável de cadeia leve descrita aqui, em que a região variável de cadeia leve compre- ende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica às sequên- cias LCDR estabelecidas na SEQ ID NO: 1-150. Em uma modalidade, o polipeptídeo pode ser 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico a qual- quer uma das LCDRs estabelecidas na SEQ ID NO: 1-150. Em um outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo purificado compreendendo pelo menos uma CDR de uma região variável de cadeia pesada descrita aqui, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de ami- noácidos pelo menos 90% idêntica às sequências HCDR estabelecidas na SEQ ID NO: 151-303. Em uma modalidade, o polipeptídeo pode ser 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico a qualguer uma das HCDRs esta- —belecidasnaSEQ ID NO: 151-303.

É ainda contemplado que a CDR das cadeias pesadas e leves de anticorpos compreendem sequências de aminoácidos variantes que po- dem melhorar a afinidade de ligação do anticorpo e são derivadas através de, por exemplo, maturação por afinidade. Em um aspecto, é contemplado que um anticorpo da invenção compreende uma sequência de HCDR2 de cadeia pesada com cerca de 35% de identidade de uma HCDR2 de uma sequência de anticorpo de origem definida nas SEQ ID NOs: 151-303. Em um aspecto relacionado, é contemplado que um anticorpo da invenção com- preende uma sequência de HCDR3 de cadeia pesada com cerca de 50% de identidade a uma HCDR3 de uma sequência de anticorpo de origem definida nas SEQ ID NOs: 151-303.

Em uma modalidade, a invenção fornece compostos de ligação ao antígeno, incluindo fragmentos funcionais, tendo uma região variável de sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-150 e 151-303. Em uma modalidade relacionada, um composto de ligação ao antígeno acima mencionado é selecionado do grupo consistindo em um anticorpo tetramérico completamente montado, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo HUMAN ENGINEEREDT"Y; um anticorpo humanizado, um anticorpo humano; um anticorpo quimérico; um anticorpo multiespecífico, um fragmento de anticorpo, Fab, F(ab')2; Fv; scFv de cadeia única ou fragmento de anticorpo; um diacorpo; triacorpo, tetracor- po, minicorpo, anticorpo linear; anticorpo recombinante quelante, um tricorpo ou bicorpo, um intracorpo, um nanocorpo, um pequeno imunofarmaceutico modular (SMIP), uma proteína de fusão de imunoglobulina de ligação do domínio, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo Vu, ou uma variante ou derivado de qualquer um destes anticorpos, compreendendo umaou mais sequências de CDR da invenção e exibem a atividade biológica desejada.

Os compostos de ligação ao antígeno da invenção preferen- cialmente retêm a afinidade de ligação de 109,10, 107, 108, 10º, 107º, 10

!! M ou menos como medido por ressonância de plasmon de superfície.

Em um aspecto, os anticorpos da invenção compreendem uma região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve, tal como estabelecido em sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 151-303 e SEQ ID NO: 1-150, respectivamente, como emparelhadas na Tabela 3. É ainda contemplado que os anticorpos podem compreender a totalidade ou parte dos anticorpos definidos nas sequências de aminoácidos acima.

Em uma modalidade, os anticorpos compreendem pelo menos uma de CDR1, CDR2, ou CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NOs: 151-303, ou pelo menos uma de CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NOs: 1-150, como emparelhadas na Tabela 3. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende uma se- — quênciade aminoácidos identificada como uma sequência da cadeia pesada CDR3. Essa "sequência de cadeia pesada CDR3" (HCDR3) inclui uma sequência de aminoácidos identificada como uma sequência de CDR3 de cadeia pesada estabelecida na Tabela 2 e SEQ ID: 151-303. Alternativa- mente, a sequência de HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos que contém uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação com qualquer sequência de aminoácidos de HCDR3 identificados na Tabela 2, isto é, uma substituição, inserção ou deleção. As substituições preferidas incluem uma substituição para um aminoácido na posição correspondente na outra HCDR3 da Tabela 2. Alternativamente, a sequência de HCDR3 pode compreender uma sequência de aminoácidos de consenso de HCDR3 descrita aqui.

Alternativamente, a cadeia pesada compreendendo uma se- quência de HCDR3 da invenção descrita acima pode ainda compreender uma "sequência de CDR2 de cadeia pesada" (HCDR2) da invenção, que inclui qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas como uma HCDR2 na SEQ ID NO: 151 - 303 e na Tabela 2, as sequências de ami- —noácidos que contêm uma ou mais alterações de aminoácidos em com- paração com qualquer HCDR2 identificada na SEQ ID NO: 151-303 e na Tabela 2, preferencialmente, uma substituição por um aminoácido na posição correspondente na outra HCDR2 da Tabela 2, ou uma sequência de consenso de HCDR?2 descrita aqui.

A cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDR3 de cadeia pesada da invenção descrita acima pode também compreender tanto (a) uma sequência de CDR1 de cadeia pesada da invenção descrita acima e (b) uma sequência de CDR2 de cadeia pesada da invenção descrita acima.

Um aspecto da invenção fornece um anticorpo que se liga ao antígeno alvo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo qualquer uma, duas, e/ou três das sequências de CDR de cadeia pesada da invenção descritas abaixo.

Qualquer uma das sequências de CDR de cadeia pesada acima descritas pode também incluir os aminoácidos adicionados a cada extremi- dade das CDRs. A preparação de variantes e derivados de anticorpos e compostos de ligação ao antígeno da invenção, incluindo maturação de afini- dade ou a preparação de variantes ou derivados que contêm análogos de aminoácidos, é descrita em maior detalhe aqui. Variantes exemplares in- cluem aquelas que contêm uma substituição conservativa ou não conservati- va de um aminoácido correspondente no interior da sequência de aminoá- cidos, ou uma substituição de um aminoácido com um aminoácido corres- pondente de uma sequência de anticorpo humano.

Os anticorpos compreendendo qualquer uma das cadeias pesa- das descritas acima podem ainda compreender uma cadeia leve, preferen- cialmente, uma cadeia leve que se liga ao antígeno alvo, e mais preferen- cialmente, uma cadeia leve compreendendo as sequências de CDR de cadeialeve da invenção descritas abaixo.

Outro aspecto da invenção fornece um anticorpo que se liga ao antígeno alvo compreendendo uma cadeia leve compreendendo qualquer uma, duas, e/ou três das sequências de CDR de cadeia leve da invenção descritas abaixo.

Preferencialmente, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos identificada como uma sequência de CDR3 de cadeia leve. Essa "sequência de CDR3 de cadeia leve" (LCDR3) inclui uma sequência de aminoácidos identificada como uma sequência de CDR3 de cadeia leve na Tabela 1 e dentro das SEQ ID NOs: 1-150. Alternativamente, a sequência de CDR3 de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que con- tém uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação com qualquer sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve identificada na Tabela 1, ou seja, uma substituição, inserção, ou deleção. Substituições preferidas in- cluem uma substituição para um aminoácido na posição correspondente no interior de uma outra CDR3 da cadeia leve da Tabela 1. Alternativamente, a sequência de CDR3 de cadeia leve pode compreender uma sequência de aminoácidos de consenso de CDR3 de cadeia leve mostrada na Tabela 1.

A cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR3 de ca- deia leve da invenção descrita acima pode ainda compreender uma "sequên- ciade CDRI1 de cadeia leve" da invenção, que inclui qualguer uma das sequências de aminoácidos identificadas como uma CDR1 de cadeia leve na SEQ ID NO: 1-150 ou na Tabela 1, as sequências de aminoácidos que contêm uma ou mais alterações de aminoácidos em comparação com qual- quer CDR1 de cadeia leve identificada na SEQ ID NO: 1-150 ou na Tabela 1, preferencialmente, uma substituição por um aminoácido na posição corres- pondente na outra CDR1 de cadeia leve da Tabela 1, ou uma sequência de consenso da CDR1 de cadeia leve aqui descrita.

Alternativamente, a cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR3 de cadeia leve da invenção descrita acima pode ainda compre- ender uma "sequência de CDR2 de cadeia leve" da invenção, que inclui qualquer uma das sequências de aminoácidos identificadas como uma CDR2 de cadeia leve na SEQ ID NO: 1-150 ou na Tabela 1, sequências de aminoácidos que contêm uma ou mais alterações de aminoácidos em com- paração com qualquer CDR2 de cadeia leve identificada na Tabela 1, prefe- rencialmente, uma substituição por um aminoácido na posição correspon- dente na outra CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 1 -150 ou na Tabela 1, ou uma sequência de consenso de CDR2 de cadeia leve mostrada na Tabela 1.

Em um aspecto relacionado, a invenção contempla um polipep- tídeo purificado compreendendo pelo menos uma HCDR de SEQ ID NO: 151-303 ou LCDR de SEQ ID NO: 1-150, em que as regiões de estrutura da região variável de cadeia pesada e as regiões de estrutura da região variável de cadeia leve compreendem regiões de estrutura a partir de um anticorpo humano. Em outra modalidade, as regiões de estrutura da região variável de cadeia pesada e as regiões de estrutura da região variável de cadeia leve são alteradas quimicamente por substituição de um aminoácido que é mais homóloga a uma sequência de anticorpo humano. Por exemplo, dentro de cada região de estrutura de cadeia pesada (H-FR1-4), é contemplado que, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis resíduos da região de estrutura nativa da região variável de cadeia pesada de murino foram alterados por substituição de aminoácido, e em que no interior de cada região de estrutura de cadeia leve (L-FR1-4), pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis resíduos estruturais nativos da região variável de cadeia leve de murino foram alte- rados por substituição de aminoácidos.

A cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR3 de cadeia leve da invenção descrita acima pode também compreender tanto (a) uma sequência de CDR1 de cadeia leve da invenção descrita acima e (b) uma sequência de CDR2 de cadeia leve da invenção descrita acima.

Anticorpos compreendendo qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve descritas acima podem ainda compreender uma região variável de cadeia pesada, opcionalmente emparelhada como descrito na Tabela3, preferencialmente, uma região variável de cadeia pesada que se liga ao antígeno alvo, e mais preferencialmente uma região variável de ca- deia pesada compreendendo sequências de CDR de cadeia pesada da invenção descritas acima.

Em um aspecto, o anticorpo se liga ao receptor de insulina ou um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina com uma cons- tante de dissociação de equilíbrio Ko de 10ºM ou menos, que é capaz de reforçar a afinidade de ligação entre a insulina e o receptor de insulina em cerca de 5 vezes a 200 vezes.

Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo modulador positivo, por exemplo, que reforça a afinidade de liga- ção entre a insulina e o receptor de insulina.

Em algumas modalidades, o anticorpo modulador positivo inclui, mas não está limitado a AbOO6, AbO30, AbOO4, AbO013, AbOO9, AbOO7, AbO11, ABOO1, AbO12, AbO1O, AbOO3, AbOO8, AbOO2, AbOOS5, Abo76, Abo77, AbO79, AbO8O, AbO83, AbO59, AbO78, AbO85 ou qualquer polipeptídeo compreendendo uma ou mais das CDRs correspondentes a qualquer um dos anticorpos acima, tal como estabelecido nas Tabelas 1 e 2, ou em uma região variável do anticorpo definida nas SEQ ID NOs: 76, 80, 101, 128, 132 e SEQ ID NOs: 291, 196, 239, 267, 271. Em outras modalidades, o anticorpo modulador positivo se liga ao receptor de insulina, ao complexo de receptor de insulina/insulina, ou liga- se tanto ao receptor de insulina quanto ao complexo de receptor de insuli- na/insulina.

Em uma modalidade relacionada, o anticorpo modulador positivo que se liga ao receptor de insulina ou complexo de receptor de insulina/in-

sulina, ou ambos, inclui, mas não está limitado a Ab0O6, AbOSO, AbOO4, AbO013, AbOO9, AbOO7, AbO11, ABOO1, AbO12, AbO1O, AbOO3, AbOO8, Ab002, AbOO5, AbO76, AbO77, AbO79, AbO80, AbO83 ou qualquer polipeptídeo compreendendo uma ou mais das CDRs correspondentes a qualquer um dos anticorpos acima, tal como estabelecido nas Tabelas 1 e 2, ou em uma região variável do anticorpo definida nas SEQ ID NOS: 76, 80, 101 e SEQ ID: 291, 196 e 239.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo modulador positivo se liga ao complexo de receptor de insulina/insulina, mas não de forma detec- tável ao receptor de insulina não complexado. Em uma modalidade relacio- nada, o anticorpo modulador positivo que se liga ao complexo de receptor de insulina/insulina inclui, mas não está limitado a, ADO59, AbO78, AbO85 ou qualquer polipeptídeo compreendendo uma ou mais das CDRs correspon- dentes a qualquer um dos anticorpos acima, como estabelecido nas Tabelas 1e2,ouem uma região variável do anticorpo definida nas SEQ ID NOs: 128, 132 e SEQ ID NOS: 267 e 271.

Em um aspecto relacionado, o anticorpo é um anticorpo agonis- ta. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo agonista que se liga ao receptor de insulina com uma afinidade de 10º,10, 107, 108, 10º 107º, 10 *'M ou menos, opcionalmente, que apresenta atividade agonista máxima que é de 20% -100% da atividade agonista máxima de insulina quando medida no ensaio de pAKT. Em uma modalidade adicional, o anticorpo é um anticorpo agonista alostérico que se liga ao receptor de insulina com uma afinidade de 10?,10, 107, 10º, 10º 107º, 10* M ou menos e (a) apresenta atividade agonista máxima que é de 20% -80%, da atividade agonista má- xima de insulina quando medida no ensaio de pAKT, (b) quando presente, não altera a EC50 de insulina para INSR por mais de 2 vezes, e (c) quando presente, não altera o Kp de insulina para INSR por mais de 2 vezes.

Em certas modalidades, o anticorpo agonista inclui, mas não está limitado a, Abo021, Abo29, Ab022, AbO017, Ab023, Ab024, AbO25, Ab026, AbO31, AbO35, Abo027, AbO36, AbO37, AbO28, AbO38, AbO39, AbO4O, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO44, AbO45, AbO46, AbO47, AbO18, AbO33,

AbO48, Ab0 14, AbO15, AbO49, AbO34, AbOS1, AbO53, AbOS4, AbOS6, AbOS8, AbO62, AbO64, AbO66, AbO67, AbO68, AbOSG, AbO6G9, AbO71, AbO73, AbO75, Ab082, AbO84 ou qualquer polipeptídeo compreendendo uma ou mais das CDR correspondentes a qualquer um dos anticorpos acima, tal como estabelecido nas Tabelas | e 2, ou em uma região variável do anticorpo definida nas SEQ ID NOs: 7, 113, 114, 124, 126, 130 e SEQ ID NOs: 164, 252, 253, 263, 265 e 269. Em um outro aspecto, o anticorpo se liga ao receptor de insulina ou um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina com um constante de dissociação de equilíbrio Ko de 10ºM ou menos, que é capaz de enfraquecer a afinidade de ligação entre a insulina e o receptor de insulina, pelo menos cerca de 3 vezes, opcionalmente, até 1000 vezes.

Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo modulador negativo que enfra- quece a afinidade de ligação entre a insulina e o receptor de insulina.

Em uma modalidade relacionada, o anticorpo modulador negativo inclui, mas não está limitado aos seguintes anticorpos: AbO87 e Ab019 e Ab088 e AbO89 e Ab020 e AbOSO e AbO52 e AbOSS e AbO57 e AbO61 e AbO63 e AbO65 e ABO70 e Abo072 e AbO74 e AbO81. Em um outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo que compete com qualquer um dos anticorpos descritos aqui para a ligação ao receptor de insulina ou complexo de receptor de insulina/insulina.

Em certas modalida- des, o anticorpo exibe competição parcial.

Em uma modalidade relacionada, a competição parcial é a competição de cerca de 30% a 70%, cerca de 30% a 80%, ou cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou80%.Em algumas modalidades, o anticorpo exibe competição completa.

Em uma modalidade, a competição completa é a competição de mais que 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. Os ensaios exemplificativos para medir competição de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, ensaios de carregamento de receptor e ensaios de ligação ao epítopo como descrito aquieno estado da técnica.

Em uma modalidade, o anticorpo exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos seleciona-

dos do grupo consistindo em Ab079, Abo76, AbO83, AbO8O, AbO62, AbO2O0, Ab019, Ab088, e AbO89, e, opcionalmente, exibem competição maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos seleciona- dos do grupo consistindo em Ab0O86, AbO64, AbOO1, e ADbO1I18. Em uma modalidade adicional, o anticorpo opcionalmente não compete com um ou mais de Ab062 e Ab0O86. Em certas modalidades, o anticorpo se liga ao re- ceptor ou complexo de insulina tanto humana quanto de murino.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo que compete com um anticorpo descrito aqui exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab0O40, AbO62, AbOSO, AbOO1, e AbO18, e, opcionalmente, exibem competi- ção maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em ABO37, Ab078, AbO83, ABO8O, e ABO85. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo não compete com —AbO53, AbO64, 83-7, ADO19, AbO88, e AbO89. Opcionalmente, o anticorpo se liga ao complexo ou receptor de insulina humana ou de murino.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo que compete com um anticorpo descrito aqui exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em —AbO3O0, Abo37, AbO53, AbOO1, AbO18, AbO64, AbO40 e, opcionalmente, exibem competição maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou to- dos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em AbO85 e Ab0O86. Opcionalmente, o anticorpo não exibe competição com Ab079, AbO76 e AbO088 e, opcionalmente, se liga ao complexo ou receptor de insulina huma- naedemurino.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo que compete com um anticorpo descrito aqui exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em AbO64, Ab062, AbO85, e, Ab078 e opcionalmente não exibe nenhuma com- petição com Ab077, AbOO1, AbO18, AbO3O, AbO37, AbO79, AbO76, AbOS3, AbO019, AbO88, ALDO8S9 e AbO40. Opcionalmente, o anticorpo liga-se ao complexo ou receptor tanto de insulina humana quanto de murino.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo que compete com um anticorpo descrito aqui exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab079, Ab076, AbO83, AbOSO, AbO62, AbO20, AbO019, AbO88, AbO89. Opcionalmente, o anticorpo não exibe competição com Ab062, AbO8G6, Ab0O01, AbO18, AbOSO, AbO37, AbOG6A4; e, opcionalmente, o anticorpo é reati- vo humano apenas, e não se liga a complexo ou receptor de insulina de murino. Em uma modalidade adicional, o anticorpo mostra competição maior ou igual a 30% com qualquer anticorpo. Opcionalmente, o anticorpo mostra competição maior ou igual a 30% com Ab061 e, opcionalmente, tem menos de 30% competição com Ab019 e AbO74, opcionalmente não mostra nenhuma competição com Ab088. Opcionalmente, o anticorpo liga-se ao complexo ou receptor humano e de murino. Em ainda outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 281, 278, 277, 209, 275, 223, 284, 276, e 236 e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 141, 138, 137, 35, 135, 57, 144, 136, e 98. Em ainda outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 195, 220, 303, 197, 208, 243, 245 e 251 e uma região variável de cadeia leve selecionada dentre o grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 77, 50, 90, 84, 34, 104, 106 e 112. Em ainda outra modalidade, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada dentre o grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 241, 279, 258, 155, e 228 e uma região variável de cadeia leve selecionada dentre o grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 103, 139, 119,8, e

89. Ácidos Nucleicos de Anticorpos da Invenção A presente invenção também abrange moléculas de ácido nu- cleico que codificam anticorpos específicos para alvo como descrito acima.

Em algumas modalidades, diferentes moléculas de ácido nucleico codificam uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve de um anticorpo específico para alvo. Em outras modalidades, a mesma mo- lécula de ácido nucleico codifica uma cadeia pesada e uma região variável de cadeialeve de um anticorpo específico para alvo. Em uma modalidade, o ácido nucleico codifica um anticorpo específico para alvo da invenção.

Em um aspecto, uma molécula de ácido nucleico da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácido de V, definida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-150 ou uma —porçãoda mesma. Em um aspecto relacionado, a sequência de aminoácido de V, é uma sequência de consenso. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos das CDRs da cadeia leve do dito anticorpo. Em algumas modalidades, a dita porção é uma porção contí- gua compreendendo CDR1-CDR3. Em uma modalidade, a dita porção com- preende pelo menos uma, duas ou três de uma região de CDR1, CDR2, ou CDR3 de cadeia leve.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácido de V, que é pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 97, 98 ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácido de V, estabelecida nas SEQ ID NOs: 1-150. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem ácidos nucleicos que hibridam em condições altamente rigorosas.

É ainda contemplado que uma molécula de ácido nucleico da in- venção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequên- ciade aminoácidos de V, de qualquer uma de SEQ ID NO: 151-303, ou uma porção da mesma. Em um aspecto relacionado, a sequência de aminoácidos de V"y é uma sequência de consenso. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos das CDRs de cadeia pesada do dito anticorpo. Em algumas modalidades, a dita porção é uma porção contígua compreendendo CDR1-CDR3 de cadeia pesada. Em uma modali- dade, a dita porção compreende pelo menos uma, duas ou três de uma região CDR1, CDR2, ou CDR3 de cadeia pesada.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos de Vx que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos de V" estabelecida nas SEQ ID NOs: 151-303. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem ácidos nucleicos que hibridam em condições altamente rigorosas.

É ainda contemplado que os ácidos nucleicos da invenção codifi- cam uma cadeia leve ou cadeia pesada de comprimento total de um anticor- po compreendendo uma região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada definida nas SEQ ID NOs :1-303 e, opcionalmente, emparelhada como descrito na Tabela 3, em que uma cadeia leve de comprimento completo ou cadeia pesada de comprimento completo de compreende uma região cons- tante de cadeia leve ou uma região constante de cadeia pesada, respecti- vamente.

A invenção ainda contempla ácidos nucleicos que codificam variantes de anticorpos e polipeptídeos compreendendo regiões de ligação ao antígeno da invenção como descrito acima.

Métodos de preparação e isolamento de anticorpos que codifi- cam polinucleotídeos da invenção são bem conhecidos dos versados na téc- nica. Um polinucleotídeo de acordo com a invenção pode ser unido a qualquer uma de uma variedade de outras sequências de nucleotídeos por técnicas bem estabelecidas de DNA recombinante (ver Sambrook et al., (2d Ed.; 1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Sequências de nucleotídeos úteis para unir polipeptídeos incluem uma variedade de vetores, por exemplo, plasmí- deos, cosmídeos, derivados de fago lambda, fagomídeos, e semelhantes, que são bem conhecidos na técnica. Por conseguinte, a invenção fornece também um vetor incluindo um polinucleotídeo da invenção e uma célula hospedeira contendo o polinucleotídeo. Em geral, o vetor contém uma ori- gem de replicação funcional em, pelo menos, um organismo, sítios de endo- nucleases de restrição convenientes, e um marcador selecionável para a cé- lula hospedeira. Vetores de acordo com a invenção incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sonda, vetores de sequenciamento, e vetores retrovirais. Uma célula hospedeira de acordo com a invenção pode ser uma célula procariótica ou eucariótica e pode ser um organismo unicelular ou parte de um organismo multicelular. Um grande número de vetores e promotores adequados é conhecido dos versados na técnica e estão comercialmente disponíveis para gerar os construtos recom- binantes da presente invenção. Uma variedade de sistemas de vetor de expressão / hospedeiro pode ser usada para conter e expressar a sequência de codificação. Estas incluem, mas não estão limitadas a, os micro-organismos tais como bacté- rias transformadas com vetores de expressão de DNA de bacteriófagos re- combinantes, plasmídeos, fagomídeo ou cosmídeo; leveduras transformadas com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de inseto infec- tadas com vetores de expressão virais (por exemplo, de baculovírus) siste- mas de células de plantas transfectadas com vetores de expressão de vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; Vírus do Mosaico do Tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais unifor- mes. As células de mamíferos que são úteis em produções de proteína re- combinante incluem, mas não estão limitadas a, células VERO, células HeLa, ovário de hamster chinês (CHO), COS (tais como células COS-7), WiI38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 e células HEK

293. Variantes de polinucleotídeos e fragmentos de anticorpos podem ser prontamente gerados por um trabalhador versado na técnica para codi- ficar fragmentos biologicamente ativos, variantes, ou mutantes de moléculas de anticorpos que ocorrem naturalmente que possuem a mesma atividade biológica ou semelhante ao anticorpo que ocorre naturalmente. Isto pode ser feito por meio de técnicas de PCR, corte, e digestão de DNA que codifica o anticorpo das regiões de cadeia pesada e leve, e semelhantes. Por exemplo, a mutagênese pontual, usando PCR e outras técnicas bem conhecidas na técnica, pode ser usada para identificar com particularidade quais os resí-

duos de aminoácidos são importantes em atividades particulares associadas com a atividade do anticorpo. Assim, um versado na técnica será capaz de gerar alterações de bases individuais no filamento de DNA para resultar em um códon alterado e uma mutação missense.

Fragmentos de Anticorpos Os fragmentos de anticorpos compreendem uma porção de um anticorpo intacto de comprimento completo, preferencialmente, uma região variável ou de ligação ao antígeno do anticorpo intacto. Exemplos de frag- mentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F(ab')2, e os fragmentos Fv; diacor- pos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv); fragmentos de anticorpo multiespecífico tais como biespecí- ficos, triespecíficos, anticorpos, etc. ( por exemplo, diacorpos e triacorpos e tetracorpos); minicorpo; anticorpo recombinante quelante; tricorpos ou bicor- pos; intracorpos; nanocorpos; pequenos imunofarmaceuticos modulares (SMIP), proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação; anticorpos camelizados; anticorpos contendo Vu, e outros polipeptídeos for- mados a partir de fragmentos deanticorpo. Ver, por exemplo. Holliger & Hudson (Nat. Biotech. 23(9) 1126-36 (2005)). A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação idênticos ao antígeno, chamados de fragmentos "fab", fragmentos monovalentes consistindo em domínios de V,, Vu, Cr e Cu, cada um com um sítio de ligação ao antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete a sua capacidade de cristalizar facilmente. Tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab'),, um fragmento bivalente compreendendo dois frag- — mentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça, que tem dois fragmentos de anticorpo de cadeia única "Fv" ou "scFv" compre- endem os domínios de Vy e V, de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Preferencialmente, o polipeptí- deo de Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios de VnueVWV. que permite que o Fv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno, resultando em um anticorpo de cadeia única (scFv), no qual uma região V, e Vu são emparelhadas para formar uma molécula monovalente através de um ligante sintético que lhes permite ser feita como uma cadeia de proteína única (Bird et al., Science 242:423-426, 1988, and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Para uma revisão de scFv ver Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. | 13, —Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Um fragmento Fd consiste nos domínios de V4 e Cx1. Os fragmentos de anticorpo adicionais incluem um fragmento de anticorpo de domínio (dAB) (Ward et al, Nature 341:544-546, 1989) consistindo em um domínio de Vu. Os diacorpos são anticorpos bivalentes em que os domínios de Va e Vi são expressos em uma única cadeia polipeptídica, mas usando um ligante que é muito curto para permitir o em- parelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios for- çando assim o emparelhamento com domínios complementares de outra cadeia e criam dois sítios de ligação ao antígeno (ver, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444- 6448, 1993, and Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Os diacorpos podem ser biespecíficos ou monoespecíficos. Anticorpos funcionais de cadeia pesada desprovidos de cadeias leves são de ocorrência natural em tubarões (Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995), wobbegong sharks (Nuttall et al., Mol Immunol. 38:313- 26, 2001) e Camelidae (Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8, 1993; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998), tais como camelos, dromedários, alpacas e lamas. O sítio de ligação ao antígeno é reduzido a um único domí- nio, o domínio VHH, nestes animais. Estes anticorpos formam regiões de ligação ao antígeno, usando apenas a região variável de cadeia pesada, ou seja, estes anticorpos funcionais são homodímeros de cadeias pesadas apenas com a estrutura HaL> (referidos como "anticorpos de cadeia pesada" ou "HCAbs"). Vu de Camelídeo alegadamente recombina com as regiões constantes de IgG2 e IgG3 que contêm os domínios de dobradiça, CH2 e CH3e não apresentam um domínio CH1 (Hamers-Casterman et al., Supra). Por exemplo, IgG1 de lama glama é um isotipo de anticorpo convencional (HaL2), em que se recombina V4 com uma região constante que contém domínios de dobradiça, CH1, CH2 e CH3, enquanto que a IgG2 e IgG3 de lama glama são isotipos somente de cadeia pesada que não apresentam os domínios CH1 e que não apresentam cadeias leves. Domínios VHH de camelídeos foram verificados como se ligando ao antígeno com elevada afinidade (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) e possuem uma elevada estabilidade em solução (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). Fragmentos apenas clássicos de Vu são difíceis de produzir na forma solúvel, mas a melhoria na solubilidade e ligação específica pode ser obtida quando resíduos estruturais são alterados para serem mais semelhantes a Vu (Ver, por exemplo, Reichman, et al., J Inmunol Methods 1999, 231:25-

38.). Métodos para gerar anticorpos tendo camelídeos de cadeias pesadas são descritos, por exemplo, nas Publicações de Patentes US 20050136049 e 20050037421.

O domínio variável de uma cadeia pesada de anticorpo é tem uma massa molecular de 15 kDa, e é referido como uma Nanocorpo (Cortez- Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Uma biblioteca de Nanocorpo pode ser gerada a partir de um dromedário imunizado tal como descrito em Conrath et al., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001). Ou usando métodos recombinantes, conforme descrito em Revets et al, Expert Opin. Biol. Ther. 5(1): 111-24 (2005).

A produção de Fab-scFv biespecífico ("bicorpo") e Fab-(scFv)(2) triespecífico ("tricorpo") é descrita em Schoonjans et al. (J Immunol. 165:7050-57, 2000) e Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Para bibcorpos ou tricorpos, uma molécula de —scFvé fundida a uma ou ambas as cadeias de VL-CL (L) e VH-CH, (Fd), por exemplo, para produzir um scFvs de dois tricorpos são fundidos para o C terminal de Fab enquanto em um scFv de um bicorpo é fundida ao terminal- C de Fab.

Um "minicorpo" consistindo em scFv fundido para CH3 via um ligante peptídico (sem dobradiça) ou através de uma dobradiça de IgG foi descrito em Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23.

Intracorpos são anticorpos de cadeia única que demonstram expressão intracelular e podem manipular a função da proteína intracelular (Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 101:17616-21, 2004). Intracorpos, que compreem sequências sinais de células que retêm o construto de anticorpo em regiões intracelulares, podem ser produzidas como descrito em Mhashilkar et al. EMBO J 14:1542-51, 1995) e Wheeler et al. (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Transcorpos são anti- corpos permeáveis a células em que um domínio de transdução de proteína (PTD) é fundido com anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv) Heng et al., (Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).

Ainda contemplados são os anticorpos que são SMIPs ou pro- teínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação específicas para um antígeno. Estes construtos são polipeptídeos de cadeia única compre- endendo domínios de ligação ao antígeno fundidos com domínios de imuno- globulina necessários para transportar as funções efetoras do anticorpo. Ver, por exemplo, WOO03/041600, publicação de Patente US 20030133939 e Publicação de Patente US 200301 18592.

Uma ou mais CDRs podem ser incorporadas em uma molécula quer covalentemente ou não covalentemente para torná-lo uma imunoade- sina. Um imunoadesina pode incorporar a(s) CDR (s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, pode ligar covalentemente a(s) CDR (s) para outra cadeia polipeptídica, ou podem incorporar a(s) CDR(s) não covalente- mente. As CDRs permitem que a imunoadesina se ligue especificamente a um antígeno particular de interesse.

Em ainda outra modalidade, o composto de ligação a anticorpo ou antígeno compreende uma região constante e um ou mais regiões de estrutura variáveis de cadeias pesadas e leves de uma sequência de anticor- po humano. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende uma região constante modificada ou não modificada de uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.

Alternativamente, fragmentos de anticorpo podem ser fundidos com um suporte de proteína. Bibliotecas de suportes de proteína incluem, mas não estão limitadas a, Adnectinas e Affibodies e Anticalinas e

DARPinas, inibidores tipo Kunitz projetados, tetranectinas, proteínas de do- mínio-A, lipocalinas, proteínas de repetição, tais como proteínas de repetição de anquirina, proteínas de imunidade, peptídicos a«2p8, inseto de defensina A, domínios PDZ, charybdotoxinas, dedos de PHD, TEM-1 B-lactamase, domínios de fibronectina tipo Ill, CTLA-4, receptores de células T, knottinas, neocarzinostatina, módulo 4-2 de ligação de carboidrato, proteína fluores- cente verde, tiorredoxina Gebauer & Skerra, Curr.

Opin.

Chem.

Biol. 13:245- 55 (2009); Gill & Damle, Curr.

Opin.

Biotech 17: 653-58 (2006); Hosse et al, Protein Sci. 15:14-27 (2006); Skerra, Curr.

Opin.

Biotech 18: 295-3-4 (2007)). Assim, uma variedade de composições compreendendo uma, duas, e/ou trêê CDRs de uma região variável de cadeia pesada ou de uma região variável de cadeia leve de um anticorpo pode ser gerada por técnicas conhecidas na técnica.

Anticorpos Multiespecíficos Em algumas modalidades, pode ser desejável gerar anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) da invenção tendo especifici- dades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes de moléculas iguais ou diferentes.

Exemplos de anticorpos biespecíficos podem ligar dois epítopos diferentes do antígeno.

Alternativamente, um braço de anticorpo específico para antígeno do pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula de superfície celular, tal como uma molécula de receptor de células T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRIl (CD32) e FeyRIll (CD16), de modo a focar os mecanismos de defesa celulares para o antígeno desejado.

Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos para as células que expressam ou ocupam o antígeno desejado.

Estes anti- corpos possuem um braço de ligação ao antígeno e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-60, alcalóide da vin- ca, cadeia A de ricina, hapteno de isótopo radioativo ou metotrexato). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de compri- mento completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab')2 de anti- corpos biespecíficos).

De acordo com outra abordagem para produzir anticorpos bies- pecíficos, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser projetada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recupe- rados a partir de cultura de células recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Cy3 de um domínio cons- tante de anticorpo. Neste método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácidos a partir da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofa- no). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da cadeia(s) lateral grande são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo, substituindo grandes cadeias laterais de aminoácidos com ca- deias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanis- mo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros pro- dutos finais indesejados, tais como homodímeros. Ver WO96/27011 publi- cado06 de setembro de 1996.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Os anticorpos heteroconju- gados podem ser feitos usando quaisquer métodos de reticulação conve- niente. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são divulgados na Patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmen- tos de anticorpos também têm sido descritas na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al., (Science 229:81-83, 1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de comple- xação de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e impedir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são en- tão convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então reconvertido para o Fab'-tiol por redução com mercap-

toetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico.

Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Em ainda outra modalidade, os fragmentos Fab'-SH diretamente recuperados de E. coli podem ser quimicamente acoplados in vitro para for- mar anticorpos biespecíficos. (Shalaby et al., J.

Exp.

Med. 175:217-225 (1992)). Shalaby et al., J.

Exp.

Med. 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de F(ab'), de anticorpo biespecífico completa- mente humanizado.

Cada fragmento Fab' foi segregado separadamente a partir de E. coli e submetido ao acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico.

O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor do HER2 e célu- las T humanas normais, bem como desencadear a atividade lítica de linfóci- tos citotóxicos humanos de contra antígenos de tumores da mama humana.

Várias técnicas para fazer e isolar fragmentos de anticorpo bies- pecíficos diretamente a partir de cultura de células recombinantes também têm sido descritas.

Por exemplo, os anticorpos biespecíficos foram produ- zidos através de zippers de leucina. (Kostelny et al., J.

Immunol. 148:1547- 1553, 1992). Os peptídeos de zipper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes.

Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobra- diça para monômeros e então re-xidados para formar os heterodímeros de anticorpo.

Este método também pode ser usado para a produção de homodí- meros de anticorpo.

A tecnologia do "diacorpo" descrita por Holliger et al. (Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90:6444-48, 1993) forneceu um mecanismo alternativo para a preparação de fragmentos de anticorpos biespecíficos.

Os fragmentos compreendem uma região variável de cadeia pesada (V;4) ligada a uma região variável de cadeia leve (V,) por um ligante queé muitocurto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia.

Assim, os domínios Vy e V, de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios de Vy e Vi complementares de um outro fragmento, formando deste modo dois sítios de ligação ao antígeno. Outra estratégia para a preparação de fragmentos de anticorpo biespecíficos atra- vés do uso de dímeros de Fv de cadeia única (scFv) também foi divulgada. Ver Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Alternativamente, o anticorpo biespecífico pode ser um "anticor- po linear" produzido como descrito em Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995). Anticorpos lineares compreendem um par de segmentos Fd em tandem (V4-Cu1-V4-CH1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo recombinante quelante (CRAb). Um anticorpo recombinante quelante reconhece epítopos adjacentes e não sobrepostos do antígeno, e é suficientemente flexível para se ligar a ambos os epítopos simultaneamente (Neri et al., J] Mol Biol. 246:367-73, 1995).

Os anticorpos com mais de duas valências são também contem- plados. Por exemplo, os anticorpos triespecíficos podem ser preparados. (Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).

Anticorpos Químéricos e Humanizados Devido aos anticorpos quiméricos ou humanizados serem me- nos imunogênicos em humanos do que os anticorpos monoclonais de ca- mundongos parentais, eles podem ser usados para o tratamento de huma- nos com muito menos risco de anafilaxia.

Anticorpos monoclonais quiméricos, nos quais os domínios lg variáveis de um anticorpo monoclonal de camundongo são fundidos com domínios lg constantes humanos, podem ser gerados usando procedimentos padrões conhecidos na técnica (ver Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855 (1984); e, Boulianne et al, Nature 312, 643-646, (1984))). Embora alguns anticorpos quiméricos monoclonais tenham provado ser menos imunogênicos em humanos, os domínios de lg variáveis de ca- —mundongo ainda podem levar a uma significativa resposta de anti-camun- dongo humano.

Os anticorpos humanizados podem ser alcançados por uma va-

riedade de métodos incluindo, por exemplo: (1) enxerto das regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) não humanas sobre uma estrutura humana e da região constante (um processo referido na técnica como humanização através de "enxerto de CDR ") (2) transplante de domínios va- riáveis inteiros não-humanos, mas "disfarçando" os mesmos com uma superfície do tipo humana por substituição de resíduos de superfície (um processo referido na técnica como "folheamento"), ou, alternativamente, (3) substituição de aminoácidos humanos em posições determinadas como sendo improváveis para efeitos adversos quer de ligação a antígeno ou enrolamento de proteínas, mas suscetíveis de reduzir a imunogenicidade em um ambiente humano (um processo referido na arte como HUMAN ENGINEERING”""Y). Na presente invenção, o termo anticorpos humanizados incluirá tanto anticorpos "humanizados" quanto "folheados" e "human ENGINEERED'VY", Estes métodos são divulgados, por exemplo, em Jones et al, Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlann Molec Immunol. 31:169-217 (1994); Kettleborough et al., Protein Eng. 4:773-783 (1991); Studnicka et al. patente US No. 5.766.886; Studnicka et al., (Protein Eng 7: 805-814, 1994. Cada uma das quais sendo incorporada aqui por referência.

Anticorpos Humanos de Animais Transgênicos Os anticorpos humanos para o antígeno podem também ser pro- duzidos usando animais transgênicos que não têm nenhuma produção de imunoglobulina endógena e são projetados para conter loci de imunoglobu- lina humana. Por exemplo, WO 98/24893 divulga animais transgênicos com um locus de lg humana, em que os animais não produzem imunoglobulinas endógenas funcionais devido à inativação dos loci endógenos de cadeia pesada e leve. O WO 91/00906 também divulga hospedeiros mamíferos transgênicos não primatas capazes de montar uma resposta imune a um imunogene, em que os anticorpos têm regiões constantes e/ou variáveis de primatas, e em que os loci de codificação de imunoglobulina endógena são substituídos ou inativados. O WO 96/30498 e Patente US 6.091.001 revelam o uso do sistema Cre/lox para modificar o locus da imunoglobulina em um mamífero, tais como para substituir toda ou uma porção da região constante ou variável, para formar uma molécula de anticorpo modificado. O WO 94/02602 divulga hospedeiros mamíferos não humanos tendo loci de Ig humana funcional e loci de lg endógena inativada. A Patente US 5.939.598 descreve métodos de fazer camundongos transgênicos em que os camun- dongos não possuem cadeias pesadas endógenas, e expressam um locus de imunoglobulina exógena compreendendo uma ou mais regiões constan- tes xenogênicos. Ver também, Patentes US 6.114.598 6.657.103 e

6.833.268.

Usando um animal transgênico descrito acima, uma resposta imune pode ser produzida a um antígeno selecionado, e as células produ- toras de anticorpos podem ser removidas do animal e usadas para produzir hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos. Os protocolos de imunização, adjuvantes, e semelhantes são conhecidos na técnica, e são usados na imunização de, por exemplo, um camundongo transgênico, tal como descrito no WO 96/33735. Esta publicação divulga anticorpos mono- cClonais contra uma variedade de antígenos, incluindo IL-6, IL-8, TNFa, CD4 humano, seletina L, gp39, e toxina do tétano. Os anticorpos monoclonais po- dem ser testados quanto à capacidade para inibir ou neutralizar a atividade biológica ou efeito fisiológico da proteína correspondente. O WO 96/33735 divulga que os anticorpos monoclonais contra IL-8, derivados de células imunes de camundongos transgênicos imunizados de IL-8, IL-8 bloqueado induziram funções de neutrófilos. Os anticorpos monoclonais humanos com especificidade para o antígeno usado para imunizar animais transgênicos são também divulgados no WO 96/34096 e pedido de patente nos US 20030194404; e pedido de patente US 20030031667.

Animais transgênicos adicionais úteis para fazer anticorpos —monoclonais incluem o HUMAb-MOUSEG, descrito na Patente US 5.770.429 e Fishwild, et al. (Nat. Biotechnol. 14:845-851 (1996)), que contém sequên- cias de genes a partir de genes de anticorpos humanos não rearranjados que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos humanos. A imuniza- ção de um HUMAb-MOUSEOGO permite a produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos para o antígeno. Além disso, Ishida et al. (Cloning Stem Cells. 4:91-102 (2002)) descreve o camundongo TransChromo (TCMOUSETY), que compreende segmentos de tamanho de megabase e DNA humano e que incorporam o loci de imunoglobulina humana inteira (hlg). O TOMOUSETY tem um reper- tório totalmente diverso de hlgs, incluindo todas as subclasses de IgGs (I9G1-G4). A imunização de o TOMOUSETY com vários antígenos humanos produz respostas de anticorpos compreendendo anticorpos humanos. Ver também Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); e Patente US 5.591.669, Patente US

5.589.369, Patente U. 5.545.807; e Publicação de Patente US 20020199213. A Publicação de Patente US 20030092125 descreve métodos para a pola- rização da resposta imune de um animal para o epítopo desejado. Os anti- corpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (ver Patentes US 5.567.610 e 5.229.275). Anticorpos Humanos de Tecnologia de Exibição O desenvolvimento de tecnologias para a preparação de repertó- rios de genes recombinantes de anticorpos humanos, e a exibição dos frag- mentos de anticorpo codificados na superfície do bacteriófago filamentoso, proporcionou um meio para produção de anticorpos humanos diretamente. Os anticorpos produzidos por tecnologia de fagos são produzidos como fragmentos de ligação ao antígeno-normalmente fragmentos Fv ou Fab em bactérias e, assim, não apresentam funções efetoras. As funções efetoras podem ser introduzidas por uma de duas estratégias: Os fragmentos podem ser projetados, quer em anticorpos completos para a expressão em células de mamíferos, ou em fragmentos de anticorpo biespecíficos com um segun- dosítiode ligação capaz de desencadear uma função efetora. A invenção contempla um método para a produção de anticorpo específico para antígeno ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, com-

preendendo as etapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos em fagos, rastrear a biblioteca com antígeno ou uma porção do mesmo, isolar fagos que se ligam a antígeno, e obter o anticorpo a partir do fago.

À título de exemplo, um método para a preparação da biblioteca de anticorpos parauso em técnicas de exibição em fagos compreende as etapas de imu- nização de um animal não humano, compreendendo loci de imunoglobulina humana com antígeno ou uma porção antigênica desta para criar uma res- posta imune, extração das células produtoras de anticorpos a partir do ani-

mal imunizado; isolamento do RNA a partir das células extraídas, inversão da transcrição do RNA para produzir cCDNA, amplificação do cCDNA usando um iniciador, e inserção do cDNA em um vetor de exibição de fagos tais que os anticorpos sejam expressos no fago.

Os anticorpos recombinantes espe- cíficos de antígeno da invenção podem ser obtidos desta forma.

Em um outro exemplo, as células produtoras de anticorpos podem ser extraídas a partirde animais não imunizados, RNA isolado a partir das células extraídas e transcrição inversa para produzir CDNA, que é amplificado usando um iniciador, e inserção em um vetor de exibição de fagos tais que os anticorpos são expressos no fago.

Os processos de exibição de fago mimetizam a seleção imune através da exibição de repertórios de anticorpos na superfície do bacteriófago filamentoso, e subsequente seleção de fagos por sua liga- ção a um antígeno de escolha.

Uma dessas técnicas é descrita no WO 99/10494, que descreve o isolamento de alta afinidade e anticorpos agonís-

ticos funcionais para os receptores MPL e MSK usando essa abordagem.

Os anticorpos da invenção podem ser isolados por rastreio de uma biblioteca combinatória de anticorpo recombinante, preferencialmente, uma biblioteca de exibição de fagos scFv, preparada usando cDNAs de V, e Vu humano preparados a partir de MRNA derivado de linfócitos humanos.

As metodo- logias para a preparação e rastreio de tais bibliotecas são conhecidas na técnica.

Ver, por exemplo, Patente US 5.969.108. Existem kits disponíveis comercialmente para a geração de bibliotecas de exibição de fagos (por exemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; and the Stratagene SuríZAP.TM. phage display kit, catalog no.

240612). Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usa- dos na geração e rastreio de bibliotecas de exibição de anticorpos (ver, por exemplo, Ladner et al. Patente US. 5.223.409; Kang et al. Publicação de PCT WO 92/18619; Dower et al. Publicação de PCT WO 91/17271; Winter et al Publicação de PCT WO 92/20791; Markland et al. Publicação de POT WO 92/15679; Breitling et al. Publicação de PCT WO 93/01288; McCatfferty et al. Publicação de PCT WO 92/01047; Garrard et al. Publicação de POT No. 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373- 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al.

(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.

Em uma modalidade, para isolar anticorpos humanos específi- cos para um antígeno, com as características desejadas de ligação, uma biblioteca de Vy e V. humano éo rastreada para selecionar os fragmentos de anticorpos com a especificidade desejada. As bibliotecas de anticorpos usadas neste método são, preferencialmente, bibliotecas scFv preparadas e rastreadas como descrito aqui e no estado da técnica (McCatfferty et al., Publicação de PCT No. WO 92/01047, McCafferty et al., (Nature 348:552- 554 (1990)); e Griffiths et al., (EMBO J 12:725-734 (1993)). As bibliotecas de anticorpos scFv preferencialmente são rastreadas usando o antígeno.

Alternativamente, o fragmento Fd (V4-Ch1) e a cadeia leve (V,- C.) de anticorpos são clonados separadamente por PCR e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de exibição de fagos combinatórias, que podem então ser selecionadas para a ligação a um antígeno particular. Os fragmentos Fab são expressos na superfície do fago, ou seja, fisicamente ligados aos genes que os codificam. Assim, a seleção de Fab pela ligação ao antígeno co-seleciona as sequências de codificação de Fab, que podem ser amplificadas subsequentemente. Através de várias rodadas de ligação de antígeno e reamplificação, um procedimento denominado panning, os Fab específicos para o antígeno são enriquecidos e finalmente isolados. Em 1994, uma abordagem para a humanização de anticorpos, chamada de "seleção guiada", foi descrita. Seleção guiada usa o poder da técnica de exibição de fagos para a humanização do anticorpo monoclonal de camundongo (Ver Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para isso, o fragmento Fd do anticorpo monoclonal de camundongo pode ser exibido em combinação com uma biblioteca de cadeia leve huma- na, e a biblioteca de Fab híbrido resultante pode então ser selecionada com o antígeno. O fragmento Fd de camundongo, portanto, oferece um modelo para orientar a seleção. Subsequentemente, as cadeias leves humanas selecionadas são combinadas com uma biblioteca de fragmento Fd humano. A seleção da biblioteca resultante produz Fab inteiramente humano.

Uma variedade de procedimentos foi descrito para derivar anticorpos humanos a partir de bibliotecas de exibição de fagos (Ver, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Patentes US 5.565.332 e 5.573.905; Clackson, T., e Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). Em particular, a seleção in vitro e evolução de anticorpos derivados de bibliotecas de exibição de fagos tornou-se uma ferramenta poderosa (Ver Burton, D. R., and Barbas Ill, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 4833-455 (1994); Publicação de Patente US 20020004215 e WO 92/01047; Publicação de Patente US 20030190317; e Patentes US 6.054.287 e 5.877.293.

Watkins, “Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift” Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178:187-193 (2002), e Publicação de Patente US 20030044772, publicada em 6 de Março de 2003, descrevem métodos paro rastreio de bibliotecas de anticorpos com expressão de fagos ou outras moléculas de ligação através de elevador de captura, um método que envol- ve a imobilização das moléculas de ligação candidatas sobre um suporte sólido.

Os fragmentos Fv são apresentados na superfície do fago, pela associação de uma cadeia expressa como uma proteína de fusão de fagos (por exemplo, com a gene Ill de M13) com a cadeia complementar expressa como um fragmento solúvel. É contemplado que o fago pode ser um fago filamentoso como um dos fagos de classe |: fd, M13, f1, If1, lke, ZJ/Z, Ft e um dos fagos de classe Il: Xf, Pf1 e Pf3. O fago pode ser M13, ou fd ou um derivado do mesmo.

Uma vez que os segmentos V, e Vx humanos iniciais são sele- cionados, experimentos de "mistura e correspondência", nos quais diferentes pares de segmentos de V"y e V, inicialmente selecionados são rastreados para a ligação a antígeno, podem ser realizados para selecionar combina- ções preferidas de par V./Vn. Além disso, para melhorar ainda mais a qua- lidade do anticorpo, os segmentos V, e Vu do(s) par preferido de V,/Vy pode ser aleatoriamente mutado, preferencialmente, dentro de qualquer uma das regiões de CDR1, CDR2 ou CDR3 de Vx e/ou V,, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação de afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser realizada por amplificação das regiões V, e Vn usando iniciadores de POR complementares para Va CDR1, CDR2 e CDR3, ou VW, CDR1I, CDR2 e CDR3, respectivamente, cujos iniciadores foram "dopados" com uma mistura aleatória de quatro bases de nucleotídeos em determinadas posições de tal forma que os produtos resultantes de PCR codificam segmentos de V, e V4 em que as mutações aleatórias foram intro- duzidas nas regiões de Vu e/ou V. CDR3. Estes segmentos de V, e Vu alea- toriamente mutados podem ser rastreados novamente para a ligação a antí- geno.

Após o rastreio e isolamento de um anticorpo específico para antígeno a partir de uma biblioteca de exibição de imunoglobulina recombi- nante, o ácido nucleico que codifica o anticorpo selecionado pode ser re- cuperado a partir do pacote de exibição (por exemplo, a partir do genoma do fago) e subclonado em outros vetores de expressão por técnicas padrões de DNA recombinante. Se desejado, o ácido nucleico pode ser ainda manipu-

lado para criar outras formas de anticorpos da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante, isolado por rastreio de uma biblioteca combinatória, o DNA que codifica o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em uma célulahospedeira de mamífero, tal como descrito aqui.

É contemplado que o método de exibição de fagos pode ser realizado em uma cepa mutadora de bactérias ou célula hospedeira. Uma cepa mutadora é uma célula hospedeira que tem um defeito genético que faz com que o DNA replicado dentro dele seja mutado em relação ao seu DNA de origem. Exemplos de cepas mutadoras são NR9046mutD5 and NR9046 mut T1.

É também contemplado que o método de exibição de fagos pode ser realizado usando um fago auxiliar. Este é um fago que é usado para infectar células contendo um genoma de fago defeituoso e que funciona para complementar o defeito. O genoma do fago defeituoso pode ser um fagomí- deo ou um fago com alguma função de codificação de sequências de genes removida. Exemplos de fagos auxiliares são M13K07, M13K07 gene Ill no. 3 hiperfago, e fago que exibe ou codifica uma molécula de ligação fundida com uma proteína de cápside.

Os anticorpos podem também ser gerados por meio de métodos de rastreio de exibição de fagos, usando a abordagem combinatória dupla hierárquica como descrito no documento WO 92/01047 em que uma colônia individual contendo quer um clone cadeia H ou L é usada para infectar uma biblioteca completa de clones que codifica a outra cadeia (LouH)eo membro de ligação específica de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de exibição em fagos, tais como as descritas na mesma. Esta técnica é também divulgada em Marks et al, (Bio/Technology, 10:779-783 (1992)).

Métodos para exibição de polipeptídeos na superfície de vírus, leveduras, micróbios e células de mamífero também têm sido usados para identificar os anticorpos específicos para antígenos. Ver, por exemplo, Pa- tentes US 5.348.867; 5.723.287; 6.699.658; Wittrup, Curr Op. Biotech.

12:395-99 (2001); Lee et al, Trends in Biotech. 21(1) 45-52 (2003); Surgeeva et al, Adv.

Drug Deliv.

Rev. 58: 1622-54 (2006). As bibliotecas de anticorpos podem ser ligadas a proteínas de levedura, tais como aglutinina, mimetizan- do eficazmente a superfície de exibição de células de anticorpos pelas célu- lasBnosistema imune.

Em adição aos métodos de exibição de fagos,os anticorpos po- dem ser isolados usando em métodos de exibição in vitro, incluindo exibição de ribossoma e exibição de mRNA (Amstutz et al, Curr.

Op.

Biotech. 12: 400-05 (2001)). A seleção de polipeptídeo usando exibição de ribossoma está descrito em Hanes et al., (Proc.

Natl Acad Sci USA, 94:4937-4942 (1997)) e Patentes US 5.643.768 e 5.658.754 emitidas para Kawasaki.

À exibição de ribossoma é também útil para análise mutacional rápida de gran- de escala de anticorpos.

A abordagem de mutagênese seletiva também for- nece um método de produção de anticorpos com atividades melhoradas que podem ser selecionadas usando técnicas de exibição ribossomal.

Glicosilação Alterada As variantes de anticorpo, as quais têm um padrão de glicosila- ção modificado em relação ao do anticorpo de origem, podem também ser produzidas, por exemplo, excluindo uma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adicionando um ou mais locais de glicosila- ção que não estão presentes no anticorpo.

A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O-ligada.

N-ligada refere-se à fixação da fração de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina.

As sequências tripeptídicas de asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, e as sequências de reconhecimento para fixação enzimática da fração de carboi- drato à cadeia lateral de asparagina.

A presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial.

Assim, os sítios de glicosilação N-ligados podem ser adicionados aum anticorpo, alterando a sequência de aminoácidos tal que a mesma con- tenha uma ou mais destas sequências tripeptídicas.

A glicosilação O-ligada refere-se à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais vulgarmente serina ou treonina, embo- ra 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usadas. Sítios de glicosilação O-ligados podem ser adicionados a um anticorpo através da inserção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original.

Os glicanos de Fc influenciam a ligação de IgG a receptores Fc e Cla, e são, portanto, importantes para as funções efetoras de IgG. Variantes de anticorpos com glicanos de Fc modificados e funções efetoras alteradas podem ser produzidas. Por exemplo, os anticorpos com açúcares terminais modificados, tais como ácidos siálicos, fucose de núcleo, N-ace- tilglucosamina de bisecção e os resíduos de manose podem ter a ligação alterada ao receptor FCyRiIll e a atividade de ADCC alterada. Em um exem- plo adicional, os anticorpos com resíduos terminais modificados de galactose podem ter a ligação a C1iq alterada e a atividade de CDC alterada (Raju, Curr. Opin. Immunol. 20: 471-78 (2008)). As moléculas de anticorpos com fucosilação reduzida ou ausen- te que exibem atividade de ADCC melhorada também são contempladas. Uma variedade de formas são conhecidas na técnica para essa realização. Por exemplo, a atividade efetora de ADCC é mediada pela ligação da molé- culade anticorpo para o receptor de FcyRill, que demonstrou ser dependen- te da estrutura de carboidratos para glicosilação N-ligada em Asn-297 do domínio de CH2. Os anticorpos não fucosilados ligam-se a este receptor com uma afinidade aumentada e desencadeiam funções efetoras mediadas por FcyRill mais eficientemente do que os anticorpos fucosilados, nativos. Por exemplo, a produção recombinante de anticorpos não fucosilados em células de CHO em que a enzima alfa-1,6-enzima fucosil transferase foi nocauteada resulta em anticorpo com atividade de ADCC 100 vezes maior (Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 87:614-22 (2004)). Efeitos semelhantes podem ser realizado através da diminuição da atividade desta ou de outrasenzimas da via de fucosilação, por exemplo, através de trata- mento de siRNA ou RNA anti-sense, projeto de linhagens de células para nocautear a(s) enzim (s), ou cultura com inibidores de glicosilação seletivos

(Rothman et al., Mol Immunol. 26:1113-23 (1989)). Algumas cepas de células hospedeiras, por exemplo, linhagens de células YB2/0 de hibridoma de camundongo ou Lec1i3 produzem anticorpos naturalmente com níveis mais baixos de fucosilação. (Shields et al., J Biol Chem. 277:26733-40 (2002); Shinkawa et al., J Biol Chem. 278:3466-73 (2003)). Um aumento no nível de carboidratos biseccionados, por exemplo, através de anticorpos de produção recombinantee em células que sobre-expressam enzima GnTII, também foi determinado para aumentar a atividade de ADCC (Umana et al., Nat Biotechnol. 17:176-80 (1999)). Prevê-se que a ausência de apenas um dos dois resíduos de fucose pode ser suficiente para aumentar a atividade de ADCC (Ferrara et al., Biotechno! Bioeng. 93:851-61 (2006)).

Variantes com função efetora alterada Outras modificações do anticorpo estão contempladas. Em um aspecto, pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção, com respeito à função efetora, por exemplo, para aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer (Natsume et al, Drug Design Dev't & Ther. 3: 7-16 (2009). Exemplos de funções efetoras incluem ligação de C1g; CDC; ligação ao receptor de Fc; ADCC; fagocitose; infrarregulação dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B; BCR), etc.. Un mé- todo para modificar a função efetora ensina que o(s) resíduo(s) de cisteína pode ser introduzido na região de Fc, permitindo, assim, a formação de liga- ções dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter a capacidade de internalização melhorada e/ou citotoxici- dade celular dependente de anticorpos (ADCC) e morte celular mediada pelo complemento aumentada. Ver Caron et al., (J. Exo Med. 176: 1191-1195 (1992)) and Shopes, B. (J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Os anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumor melhorada podem também ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais como descrito em Wolff et al., (Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)). Alternativamente, um anticorpo que tem regiões Fc duplas pode ser projetado e pode, assim, ter as capacidades de ADCC e lise de complement aumentadas. Ver Stevenson et al., (Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)). Além disso foi demons-

trado que as sequências dentro da CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue à Classe Il de MHC e desencadeiem uma resposta de células T auxiliadoras indesejada. Uma substituição conservativa pode permitir que o anticorpo retenha a atividade de ligação já que perde a sua capacidade para desencadear uma resposta de células T não desejada. Ver também Steplewski et al., (Proc Natl Acad Sci U S A. 85:4852-56 (1998)), que des- creve anticorpos quiméricos em que uma região variável de murino foi junta- da com regiões constantes gama 1, gama 2, gama 3, e gama 4 humana.

Em certas modalidades da invenção, pode ser desejável utilizar um fragmento de anticorpo, em vez de um anticorpo intacto, para aumentar a penetração do tumor, por exemplo. Neste caso, pode ser desejável modi- ficar o fragmento de anticorpo, a fim de aumentar a sua meia vida sérica, por exemplo, a adição de moléculas tais como PEG ou de outros polímeros solúveis em água, incluindo polímeros de polissacáridos, para fragmentos de anticorpos para aumentar a meia-vida. Isto também pode ser alcançado, por exemplo, por incorporação de um epítopo de ligação do receptor de salva- mento no fragmento de anticorpo (por exemplo, por umtação da região apro- priada no fragmento de anticorpo ou por incorporação do epítopo em um tag de peptídeo que é então fundido com o fragmento de anticorpo em ambas as extremidades ou no meio, por exemplo, por síntese de peptídeos ou DNA) (ver, por exemplo, WO96/32478).

O epítopo de ligação do receptor de salvamento preferencial- mente constitui uma região em que qualquer um ou mais resíduos de ami- noácidos de uma ou duas alças (loop) de um domínio Fc são transferidos para uma posição análoga do fragmento de anticorpo. Ainda mais pre- ferencialmente, três ou mais resíduos de uma ou duas alças do domínio de Fc são transferidos. Ainda mais preferencialmente, o epítopo é retirado do domínio CH2 da região de Fc (por exemplo, de uma IgG) e transferido para a região de CH1, CH3 ou VH, ou mais do que uma tal região do anticorpo.

Alternativamente, o epítopo é tomado do domínio CH2 da região de Fc e transferido para a região de CL ou região de VL, ou ambas, do fragmento de anticorpo. Ver também pedidos internacionais WO 97/34631 e WO

96/32478, que descrevem as variantes de Fc e à sua interação com o receptor de salvamento.

Assim, os anticorpos da invenção podem compreender uma por- ção Fc humana, uma porção Fc de consenso humana, ou uma variante des- tes que retém a capacidade de interagir com o receptor de salvamento Fc, incluindo variantes em que cisteínas envolvidas na ligação de dissulfeto são modificadas ou removidas, e/ou em que um Met é adicionado ao terminal-N e/ou um ou mais dos 20 aminoácidos N-terminais são removidos, e/ou regiões que interagem com complemento, tais como o sítio de ligação ao Clg, são removidos, e/ou o sítio de ADCC é removido [ver, por exemplo, Sarmay et al., Molec. Immunol. 29:633-9 (1992)]. Estudos anteriores mapearam o sítio de ligação em IgG humana e de murino para FcR principalmente para a região de dobradiça inferior composta por resíduos 233-239 de IgG. Outros estudos propuseram amplos segmentos adicionais, por exemplo, Gly316-Lys338 para o receptor Fc humano |, Lys274-Arg301 e Tyr407-Arg416 para receptor Ill de Fc humano, ou verificaram alguns resíduos específicos fora da dobradiça inferior, por exemplo, Asn297 e Glu318 para murino IgG2b que interage com receptor || de Fc murino. O relatório de estrutura de cristal de 3,2 À de fragmento de Fc delgG1 humana com o receptor IIIA de Fc humano delineou resíduos de IgG1 de Leu234-Ser239 e Asp265-Glu269 e Asn297-Thr299 e Ala327-lle332 como envolvidos na ligação ao receptor IIIA de Fc. Foi sugerido com base na estrutura de cristal, que além da dobradiça inferior (Leu234-Gly237), os resíduos nas alças domínio CH2 de IgG de FG (resíduos 326-330) e BC (resíduos 265-271), podem desempenhar um papel na ligação a receptor All de Fc. Ver Shields et al., (J. Biol. Chem., 276:6591-604 (2001)), incorporado aqui por referência na sua totalidade. A mutação de resíduos dentro dos sítios de ligação de receptores Fc podem resultar em função efetora alte- rada, tais como atividades de ADCC ou de CDC alteradas, ou meias vidas alteradas. Como descrito acima, as mutações potenciais incluem inserção, deleção ou substituição de um ou mais resíduos, incluindo a substituição com alanina, uma substituição conservativa, uma substituição não conser-

vativa, ou substituição por um resíduo de aminoácido correspondente na mesma posição a partir de uma subclasse de IgG diferente (por exemplo, substituindo um resíduo de IgG1 com um resíduo de IgG2 correspondente naquela posição). Shields et al. relataram que os resíduos de IgG1 envolvidos na ligação a todos os receptores de Fc humanos estão localizados no domínio CH2 proximal à dobradiça e dividem-se em duas categorias como segue: 1) posições que podem interagir diretamente com todos os FCcR incluem Leu234-Pro238, Ala327 e Pro329 (e, possivelmente, Asp265), 2) posições que influenciam a natureza ou a posição de carboidratos incluem Asp265 e Asn297. Os resíduos de IgG1 adicionais que afetam a ligação ao receptor |! de Fc são os seguintes: (mais efeito) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, e (menos efeito) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, GIn295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378 e Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A e D270A reduziram a ligação.

Além dos resíduos identificados acima para todos os FCR, resíduos de IgG1 adicionais que reduziram a ligação do receptor IIIA de Fc por 40% ou mais são como seguem: Ser239, Ser267 (Gly apenas), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, e Asp376. Variantes que melhoraram a ligação de FCRIIIA incluem T256A, K290A, S298A, E333A, K334A e A339T.

A Lys414 mostrou uma redução de 40% na ligação para FCRIIA e FCRIIB, Arg416, uma redução de 30% de para FCRIIA e FCRIIIA, GIn419, uma redução de 30% de para FCRIIA e uma redução de 40% para FcRIIB, e Lys360 mostrou uma melhoria de 23% para —FCRIINA.

Ver também Presta et al., (Biochem.

Soc.

Trans. 30:487-490, 2001), incorporada aqui por referência na sua totalidade, que descreveu vá- rias posições na região de Fc de IgG1 que foram verificadas como melho- rando a ligação apenas para receptores Fc gama (R) específicos ou simulta- neamente melhoraram a ligação para um tipo de R gama Fc e reduziram a ligação para outro tipo.

As variantes de IgG1 selecionadas com ligação melhorada para Fc gama Rillla foram então testadas em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) in vitro e mostraram uma melhoria em ADCC quando tanto as células mononucleares do sangue periférico quanto as células assassinas naturais foram usadas.

Por exemplo, a Patente US 6.194.551, incorporada aqui por referência na sua totalidade, descreve variantes com função efetora alterada contendo mutações na região Fc de IgG humana, na posição do aminoácido 329, 331 ou 322 (usando numeração de Kabat), algumas das quais exibindo ligação a Ciq e atividade de CDC reduzidas. Como outro exemplo, a Pa- tente US 6.737.056, incorporada aqui por referência na sua totalidade, des- creve variantes com mutações contendo ligação de receptor Fc-gama ou efetoras alteradas na região de Fc de IgG humana, na posição de ami- noácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416,419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439 (usando numeração de Kabat), alguns dos quais exibem perfis de ligação ao receptor associados com atividade de ADCC ou de CDC reduzida. Destes, uma mutação na posição do aminoácido 238, 265, 269, 270, 327 ou 329 é demonstrada para reduzir a ligação de FCRI, uma mutação na posição do aminoácido 238, 265, 269, 270,292,294,295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ou 439 é estabelecida para reduzir a ligação ao FcRII, e uma mutação no aminoácido da posição 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ou 437 é estabelecida para reduzira ligação ao FcCRiIII.

A Patente U.S 5.624.821, incorporada aqui por referência na sua totalidade, relata que a atividade de ligação de Ciq de um anticorpo de murino pode ser alterada através da mutação do resíduo de aminoácido 318, 320 ou 322 da cadeia pesada e que a substituição do resíduo 297 (Asn) resulta na remoção de atividade lítica.

A Publicação da Patente U.S 20040132101, incorporada aqui por referência na sua totalidade, descreve variantes com mutações nas posições de aminoácidos 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, ou 332 (usando Kabat numeração) ou posições 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 (usando numeração de Kabat), dosquaisas mutações nas posições 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ou 332 pode reduzir a atividade de ADCC ou reduzir a ligação a um receptor gamma Fc. Chappel et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 88:9036-40 (1991)), incorporada aqui por referência na sua totalidade, relata que a atividade citofílica de IIG1 é uma propriedade intrínseca de seu domínio CH2 de cadeia pesada. As mutações pontuais únicas em qualquer um dos resíduos de aminoácidos 234-237 de IgG1 reduziram ou aboliram significativamente sua atividade. A substituição de todos os resíduos de IgG1 234-237 (LLGG) em IgG2 e IgG4 foi necessária para restaurar a atividade de ligação completa. Um anticorpo de IgG2 contendo a sequência ELLGGP inteira (resíduos 233-238) foi observado como sendo mais ativo do que a I9gG1 tipo selvagem.

Isaacs et al. (J Immunol. 161:3862-9 (1998)), incorporada aqui por referência na sua totalidade, relata que as mutações no interior de um motivo crítico para ligação de Fc gama R (glutamato 233 para prolina, leucina/fenilalanina 234 para valina, e leucina 235 para alanina) evitarama completamente a depleção de células alvo. A mutação de glutamato 318 para alanina eliminou a função efetora de IgG2b de camundongo e também reduziu a potência de IIG4 humana.

Armour et al. (Mol Immunol. 40:585-93 (2003)), incorporada aqui por referência na sua totalidade, identificaram variants de IgG1 que reagem com o receptor de ativação, FegammaRila, pelo menos 10 vezes menos efi- cientemente do que a IgG1 do tipo selvagem, mas cuja ligação ao receptor inibidor, FegammaRilb, é apenas quatro vezes reduzida. As mutações foram feitas na região dos aminoácidos 233-236 e/ou nas posições de aminoácidos 327, 330 e 331. Ver também WO 99/58572, incorporado aqui por referência na sua totalidade.

Xu et al. (J Biol Chem. 269:3469-74 (1994)), incorporada aqui por referência na sua totalidade, relatam que a mutação de Pro331 de I1gG1 para Ser marcadamente diminuiu a ligação de C1q e virtualmente eliminou a atividade lítica. Em contraste, a substituição de Pro por Ser331 na IgG4 concedeu atividade lítica parcial (40%) para a variante IgG4 Pro331.

Schuurman et al. (Mol Immunol. 38:1-8 (2001)), incorporada aqui por referência na sua totalidade, relatam que a mutação de uma das dobra- diças de cisteína envolvidas na formação da ligação inter-cadeia pesada, Cys226, para serina resultou em uma ligação inter cadeia pesada mais estável. A mutação da sequência de dobradiça de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys para a sequência de dobradiça de IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys também estabiliza marcadamente a interação covalente entre as cadeias pesadas.

Angal et al. (Mol Immunol. 30:105-8 (1993)), incorporada aqui por referência na sua totalidade, relatam que a mutação de serina na posição do aminoácido 241 em IgG4 para prolina (encontrada naquela posição em IgG1 e IgG2) levou à produção de um anticorpo homogêneo, bem como estendeu a meio vida sérica e melhorou a distribuição do tecido em comparação com a IgG4 quimérica original.

Modificações Covalentes As modificações covalentes de agentes de ligação de polipeptí- deos da invenção, por exemplo, anticorpos, são também incluídas no escopo da presente invenção. Elas podem ser feitas por síntese química ou por cli- vagem enzimática ou química do agente de ligação de polipeptídeo, se apli- cável. Outros tipos de modificações covalentes do agente de ligação de polipeptídeo são introduzidas na molécula por reação de resíduos de ami- noácidos alvos do agente de ligação de polipeptídeo com um agente de deri- vatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos N- ou C- terminais.

Resíduos de cisteinil mais comumente são reagidos com a-ha- loacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou clo- roacetamida, para dar derivados de carboximetil ou carboxiamidometil. Resí-

duos de cisteinil também são derivatizados por reação com bromotrifluoroa- cetona, ácido alfa-bromo-B-(5-imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N- alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridil, dissulfeto de metil 2-piridil e, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2- oxa-1,3-diazol.

Os resíduos de histidil são derivatizados por reação com dietilpi- rocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil.

Brometo de para-bromophenacil também é útil; a reação é preferivelmente realizada em cacodilato de sódio 0,1 Ma pH 6,0. Resíduos de lisinil e de amino terminal são reagidos com ani- dridos succínicos ou outros ácidos carboxílicos.

A derivatização com estes agentes tem o efeito de inverter a carga dos resíduos de lisinil.

Outros rea- gentes adequados para derivatização de resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidreto, ácido trinitrobenzenossulfônico, O-metilisoureia, 2 ,4-pentanodiona, e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

Os resíduos de arginil são modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2- ciclohexanodiona e ninidrina.

A derivatização de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao pKa elevado do grupo funcional de guanidina.

Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina, bem como o grupo arginina epsilon-amino.

A modificação específica de resíduos de tirosil pode ser feita, com interesse particular na introdução de marcadores espectrais em resí- duos de tirosil por reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetra- nitrometano.

Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usa- dos para formar espécies de O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respecti- vamente.

Os resíduos de tirosil são iodados usando ***1 ou ***1 para preparar proteínas marcadas para uso no radioimunoensaio.

Grupos laterais de carboxila (aspartila ou glutamila) são seletiva- mente modificados por reação com carbodi-imidas (RN = C = N-R'), onde R e R' são grupos alquil diferentes, tais como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)

carbodi-imida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4- dimetilpentil) carbodi-imida. Além dis- So, os resíduos de aspartil e glutamil são convertidos em resíduos de aspa- raginil e glutaminil por reação com íons de amônio.

Os resíduos de glutaminila e asparaginila são frequentemente desamidados aos resíduos correspondentes glutamila e aspartila, respecti- vamente. Estes resíduos são desamidados em condições neutras ou bási- cas. A forma desamidada destes resíduos está dentro do escopo da pre- sente invenção.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxil de resíduos de seril ou treonil, metilação dos grupos a-amino de lisina, arginina, histidina e cadeias laterais (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxil C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente envolve acoplamento de Qglicosídeos de forma química ou enzimática para o agente de ligação de polipeptídeo. Estes procedimentos são vantajosos na medida em que não requerem a produção do agente de ligação de polipeptídeo em uma célula hospedeira que tem capacidade de glicosilação para a glicosilação N- ou O- ligada. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar (es) pode ser ligado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxil livres, (c) grupos sulfidril livres tais como os de cisteína, (d) grupos hidroxil livres, tais como os de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, tais como os de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) grupo amida da glutamina. Estes métodos são descritos no WOS87/05330 e em Aplin e Wriston, (CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)).

A remoção de quaisquer frações de carboidratos presentes no agente de ligação de polipeptídeo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer exposição do agente de ligação de polipeptídeo para o compost de ácido trifluorometanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando o agente de ligação de polipeptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin, et al., (Arch.

Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)) and by Edge et al., (Anal. Biochem. 118: 131 (1981)). A clivagem enzimática de frações de carboidrato em agentes de ligação de polipeptídeos pode ser alcançada através do uso de uma variedade de endo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura et al., (Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)).

Outro tipo de modificação covalente do agente de ligação de po- lipeptídeo compreende a ligação do agente de ligação de polipeptídeo para uma de uma variedade de frações hidrofóbicas ou polímeros não proteicos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polióis polioxietilados, sor- bitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquile- nos, ou polímeros de polissacáridos tais como dextrano. Tais métodos são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Patentes US 4.640.835; 4.496.689;

4.301.144; 4.670.417; 4.791.192, 4.179.337, 4.766.106, 4.179.337,

4.495.285, 4.609.546 ou EP 315 456.

Derivados Derivado refere-se aos agentes de ligação de polipeptídeos, incluindo anticorpos, quimicamente modificados por técnicas tais como ubi- quitinação, marcação (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), a ligação covalente de polímeros, tais como PEGuilação (derivatização com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoá- cidos, tais como ornitina. Derivados dos agentes de ligação de polipeptídeos da invenção, tais como um anticorpo, são também úteis como agentes tera- —pêuticose podem ser produzidos pelo método da invenção.

A fração de conjugado pode ser incorporada em ou fixa a um agente de ligação de polipeptídeo, quer covalentemente, ou através de ligações iônicos, de van der Waals ou de hidrogênios, por exemplo, a incor- poração de nucleotídeos radioativos, ou nucleotídeos biotinilados que são conhecidos pela estreptavadina.

O polietileno glicol (PEG) pode ser ligado aos agentes de ligação de polipeptídeos para proporcionar uma maior meia-vida in vivo. O grupo de

PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio de PEG, preferencialmente, irá variar entre cerca de 2 Quilodalton ("kD") a cerca de 100 kDa, mais preferivel- mente, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, mais preferivelmente, de cerca de5kDaa cerca de 10 kDa. Os grupos PEG serão geralmente associados aos agentes de ligação de polipeptídeos da invenção por meio de acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo projetado ou natural na fração PEG (por exemplo, um grupo de aldeído, amino, tiol, ou éster) a um grupo reativo no agente de ligação de polipeptídeo (por exemplo, um grupo de aldeído, amino, ou éster). A adição de frações de PEG para agentes de ligação de polipeptídeos pode ser realizada usando técnicas bem conhe- cidas na técnica. Ver, por exemplo, Publicação Internacional WO 96/11953 e Patente US 4.179.337.

A ligadura do agente de ligação de polipeptídeo com PEG nor- malmente ocorre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada por HPLC analítica de fase reversa. As substâncias PEGuiladas são purificadas por HPLC preparativa e caracterizadas por HPLC analítica, análise de ami- noácidos e espectrometria de massa com dessorção a laser.

Anticorpos Conjugados Um agente de ligação de polipeptídeo pode ser administrado na sua forma "nua" ou não conjugada, ou pode ser conjugado diretamente a outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico, ou pode ser conjugado indire- tamente com polímeros transportadores compreendendo tais outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico. Em algumas modalidades, o agente de liga- ção de polipeptídeo é conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um fármaco, um agente inibidor do crescimento, uma to- xina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de bactérias, fungos, plantas, ou de origem animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado). Os agentes quimioterapêuticos adequados in- — cluem:daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland et al., (1986) supra.). As toxinas adequadas incluem: toxinas bacterianas, tais como a toxina da difteria, toxinas de plantas tais como a ricina; toxinas de moléculas pequenas, tais como geldanamicina (Mandler et al J.

Natl.

Cancer Inst. 92(19):1573-81 (2000); Mandler et al., Bioorg.

Med.

Chem.

Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13.786-91 (2002)), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 93:8618- 23 (1996)), auristatins (Doronina et al., Nat.

Biotech. 21: 778-84 (2003) and calicheamicin (Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman et al, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)). Os agentes de ligação de polipeptídeo podem ser marcados de forma detectável através do uso de radioisótopos, marcações de afinidade (tais como biotina, avidina, etc.), marcações enzimáticas (tais como peroxi- dase de rábano, fosfatase alcalina, etc.) marcações fluorescentes ou lumi- nescentes ou bioluminescente (tais como FITC ou rodamina, etc.), átomos paramagnéticos, e semelhantes.

Procedimentos para a realização de tal marcação são bem conhecidos na técnica, por exemplo, ver (Sternberger, LA.etal.

J.

Histochem.

Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., Meth.

Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Inmunol. 109:129 (1972); Goding, J.W.

J.

Immunol.

Meth. 13:215 (1976)). A conjugação de frações de agente de ligação de polipeptídeo é descrita na Patente US 6.306.393. As técnicas gerais são também descritos emShihetal, Int.

J.

Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int.

J.

Cancer 46:1101-1106 (1990); e Shih et al., Patente US 5.057.313. Este método geral envolve a reação de um componente do agente de ligação de polipeptídeo que tem uma porção de carboidrato oxidada com um polímero transportador que tem pelo menos uma função amina livre e que é carregado com uma pluralidade de fármacos, toxinas, quelante, adendo de boro, ou outro agente terapêutico.

Esta reação resulta uma ligação de base de Schiff inicial (imina), que pode ser estabilizada por redução de uma amina secundária para formar o conjugado final.

O polímero transportador pode ser, por exemplo, um aminodex- trano ou polipeptídeo de pelo menos 50 resíduos de aminoácidos Várias técnicas para conjugação de um fármaco ou outro agente ao polímero trans- portador são conhecidas na técnica.

Um polipeptídeo transportador pode ser usado em vez de aminodextrano, mas o polipeptídeo transportador deve ter pelo menos 50 resíduos de aminoácidos na cadeia, preferencialmente, 100- 5000 resíduos de aminoácidos. Pelo menos alguns dos aminoácidos devem ser resíduos de lisina ou de glutamato ou resíduos de aspartato. As aminas pendentes de resíduos de lisina e carboxilatos pendentes de glutamina e aspartato são convenientes para a fixação a um fármaco, toxina, imunomo- dulador, agente quelante, adendo de boro ou outro agente terapêutico. Exemplos de transportadores de polipeptídeos adequados incluem polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, copolímeros dos mesmos, e políme- ros misturados destes aminoácidos e outros, por exemplo, serinas, para con- ferir propriedades de solubilidade desejável sobre o transportador e conjuga- do carregado resultante.

Alternativamente, os agentes de ligação depolipeptídeo conjuga- dos podem ser preparados pela conjugação de forma direta de um compo- nente do agente de ligação de polipeptídeo com um agente terapêutico. O procedimento geral é análogo ao método indireto de conjugação exceto que um agente terapêutico está diretamente ligado a um componente do agente de ligação de polipeptídeo oxidado. Por exemplo, uma fração de carboidrato de um agente de ligação de polipeptídeo pode ser ligada a polietilenoglico! paraestender a meia vida.

Alternativamente, um agente terapêutico pode ser ligado na re- gião de dobradiça de um componente de anticorpo reduzida através da formação de ligação de dissulfeto, ou usando um reticulador heterobifun- cional, tal como N-succinil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP). Yu et al., Int.

dJ.Cancer56:244 (1994). As técnicas gerais para conjugação, são bem co- nhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conju- gation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995). Uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais é conhecida na técnica, tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), imi- notiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetil adipi- midato HCL), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidil), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil) he- xanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazôniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno), e os compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).

Proteínas de Fusão de Anticorpos Métodos de produção de proteínas de fusão de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US 6.306.393. As proteínas de fusão de anticorpo compreendendo uma fração de interleucina- 2 são descritas por Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet et al. Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker et al., Proc. Nat'! Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996), and Hu et al, Cancer Res. 56:4998 (1996). Além disso, Yang et al., (Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995)), descrevem uma proteína de fusão que inclui um fragmento F(ab'), e uma fração de fator de necrose tumoral. Outros exem- plos de proteínas de fusão de anticorpo são descritos por Pastan et al, Nat.

Reviews Cancer 6: 559-65 (2006).

Métodos de preparação de proteínas de fusão de anticorpo-toxi- na em que uma molécula recombinante compreende um ou mais componen- tes de anticorpos e uma toxina ou um agente quimioterapêutico também são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, as proteínas de fusão de exotoxina A de Pseudomonas - anticorpo foram descritas por Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989), Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991), Batra et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992), Friedman et al., J. Inmunol. 150:3054 (1993), Wels et al., Int. J. Can. 60:137 (1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et al., —Biochemistry 35:2872 (1996), and Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996). Proteínas de fusão de anticorpo-toxina contendo uma fração de toxina da difteria, foram descritas por Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), and Vallera et al., Blood 88:2342 (1996). Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995), descreveram uma proteína de fusão de anticorpo-toxina tendo uma fração de RNase, enquanto Linardou et al., Cell Biophys.24-25:243 (1994), produziu uma proteína de fusão anticorpo-toxina compreendendo um componente de DNase |. Gelonina foi usada como a fração de toxina na proteína de fusão anticorpo-toxina de Wang et al., Re- sumos da 209º ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Abr. 2-6, 1995, Parte 1, BIOTOO5. Como um exemplo adicional, Dohlsten et al., Proc. Nat'! Acad. Sci. USA 91:8945 (1994), relataram uma proteína de fusão anticorpo-toxina compreendendo enterotoxina-A estafilocócica.

Ilustrativos de toxinas que são adequadamente usadas na pre- paração de tais proteínas de fusão são ricina, abrina, ribonuclease, DNase |, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral pokeweed, gelonina, toxina difterina, exotoxina Pseudomonas, e endotoxina Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47:641 (1986), and Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Outras toxinas adequadas são conheci- das dos versados na técnica.

Os anticorpos da presente invenção podem também ser usados em ADEPT conjugando o anticorpo a uma enzima de ativação de pró-fárma- co que converte um pró-fármaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico peptidil, Ver WO81/01145) para um fármaco anticâncer ativo. Ver, por exem- plo, WO88/07378 e Patente US 4.975.278.

O componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualguer enzima capaz de atuar sobre um pró-fármaco de tal maneira de modo a convertê-lo na sua forma mais ativa, citotóxica.

As enzimas que são úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a: a fosfatase alcalina; arilsulfatase; citosina desamina- se, 5-fluorouracil, proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtili- sina, carboxipeptidases e as catepsinas (tais como as catepsinas B e L); D- alanilcarboxipeptidases; enzimas de clivagem de carboidratos, tais como B- galactosidase e neuraminidase; B-lactamase e amidases de penicilina, tais como a penicilina V amidase ou penicilina G amidase; Alternativamente, os anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como abzimas, podem ser usados para converter os pró-fármacos da invenção em drogas ativas livres (Ver, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Conjugados de anticorpo- abzima podem ser preparados como des- crito aqui para a distribuição de abzima para uma população de células de tumor.

As enzimas acima ditas podem ser covalentemente ligadas aos anticorpos por técnicas bem conhecidas na técnicas, tais como o uso de reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima.

Alternativa- mente, as proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de liga- ção ao antígeno de um anticorpo da invenção ligada a pelo menos uma por- ção funcionalmente ativa de uma enzima da invenção pode ser construída usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica (Ver, eg, Neuberger et al., Nature 312:. 604-608 (1984)). Preparação de Variantes de Sequências de Aminoácidos É contemplado que as composições de polipeptídeo modificadas compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco, e/ou seis CDRs de um anticorpo ou agente de ligação de polipeptídeo são geradas, em que uma região CDR ou não CDR é alterada para fornecer uma especificidade ou afinidade aumentada para o antígeno, ou para fornecer a modulação de afi- nidade de ligação aumentada entre o alvo e o seu parceiro de sinalização.

Por exemplo, sítios dentro de CDRs de anticorpos são tipicamente modifica- dos em série, por exemplo, substituindo primeiramente com escolhas con- servativas (por exemplo, aminoácido hidrofóbico substituído por um ami- noácido hidrofóbico não idêntico) e depois com escolhas mais desiguais (por exemplo, aminoácido hidrofóbico substituído por um aminoácido com carga) e, em seguida, deleções ou inserções podem ser feitas no sítio-alvo.

É con- templado que as substituições conservativas dentro da CDR permitem que a região variável retenha a atividade biológica.

Por exemplo, usando as se- quências de estrutura conservadas em torno das CDRs, iniciadores de PCR complementares a estas sequências de consenso são gerados para ampli-

ficar a sequência de CDR específica para antígeno localizada entre as regiões de iniciadores. Técnicas para clonagem e expressão de sequências de nucleotídeos e polipeptídeo estão bem estabelecidas na arte [ver, por exemplo Sambrook et al., Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. As sequências de CDR am- plificadas estão ligadas em um plasmídeo apropriado. O plasmídeo compre- endendo uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis CDRs clonadas contém opcionalmente regiões de codificação de polipeptídeos adicionais ligadas à CDR.

Agentes de ligação de polipeptídeo compreendendo as CDRs modificadas são rastreados para a afinidade de ligação para o antígeno ori- ginal. Além disso, o anticorpo ou polipeptídeo é adicionalmente testado quanto à sua capacidade de neutralizar a atividade do seu antígeno. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser analisados, tal como estabe- lecido nos Exemplos para determinar a sua capacidade para interferir com a atividade biológica do alvo.

As modificações podem ser feitas por substituições conservati- vas ou não conservativas de aminoácidos descritas em maior detalhe abai- xo. As "inserções" ou "deleções" são, preferencialmente, na faixa de cerca de1a2?20 aminoácidos, mais preferencialmente, 1 a 10 aminoácidos. A va- riação pode ser introduzida fazendo substituições sistematicamente de ami- noácidos em uma molécula de polipeptídeo de anticorpo usando técnicas de DNA recombinante e ensaiando as variantes recombinantes resultantes para a atividade. As alterações de ácido nucleico podem ser feitas em sítios que diferem nos ácidos nucleicos provenientes de espécies diferentes (posições variáveis), ou em regiões altamente conservadas (regiões constantes). Méto- dos para alterar as sequências de anticorpos e expressar composições de polipeptídeos de anticorpos úteis na invenção são descritas em maior deta- lhe abaixo.

Inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de ter- minais carboxil e/ou amino que variam em comprimento desde um resíduo para polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequência de um ou vários resíduos de aminoácidos.

Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo N-terminal me- tionil ou anticorpo (incluindo fragmento de anticorpo) fundido com um tag de epítopo ou a um epítopo do receptor de salvamento.

Outras variantes inser- cionais da molécula de anticorpo incluem a fusão de um polipeptídeo que aumenta a meia vida sérica do anticorpo, por exemplo, no N-terminal ou C- terminal.

O termo "epítopo com tag" refere-se ao anticorpo fundido a um tag de epítopo.

O polipeptídeo de tag de epítopo tem resíduos suficientes parafornecer um epítopo contra o qual um anticorpo contra lá pode ser feito, ainda é suficientemente curto de modo que não interfere com a atividade do anticorpo.

O tag de epítopo preferencialmente é suficientemente único de modo a que o anticorpo contra não reage substancialmente de forma cru- zada com outros epítopos.

Os polipeptídeos de marcas adequadas têm geralmente pelo menos 6 resíduos de aminoácidos e, geralmente, entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácidos (preferencialmente entre cerca de 9- 30 resíduos). Exemplos incluem o polipeptídeo tag de gripe hemaglutinina (HA) e o seu anticorpo 12CAS5 ((Field et al., Mol.

Cell.

Biol. 8: 2159-2165 (1988)); o tag c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 dos mesmos (Evan et al., Mol.

Cell.

Biol. 5:8610-16 (1985)), e o tag de glicoproteína D de vírus de Herpes Simplex (gD) e o seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3:547-53 (1990)). Outros tags exemplares são uma sequência de poli-histidina, geralmente de cerca de seis resíduos de histidina, que permite o isolamento de um composto assim marcado com a quelação de níquel.

Outras marcações e tags, tais como o tag FLAGO (Eastman Kodak, Rochester, NY), bem conhecidas e usadas rotineiramente na técnica, são englobadas pela invenção.

Tal como usado aqui, o termo "epítopo de ligação do receptor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar meia vida sérica in vivo da molécula de IgG.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoá-

cidos.

Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molé- cula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar.

À mutagênese de substituição dentro de qualquer uma das regiões de CDR ou hipervariáveis ou regiões de estrutura é contemplada.

As substituições con- servativas envolvem a substituição de um aminoácido com outro membro da sua classe.

As substituições não conservativas envolvem a substituição de um membro de uma destas classes com um membro de outra classe.

Substituições conservativas de aminoácidos são feitas com base em semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofili- cidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos.

Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina (Ala, A), leucina (Leu, L), isoleucina (Ile, 1), valina (Val, V), prolina (Pro, P), fenilalanina (Phe, F ), triptofano (Trp, W), e metionina (Met, m); aminoácidos neutros polares incluem glicina (Gly, G), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), cisteína (Cys, OC), tirosina (Tyr, Y), asparagina (Asn, N), e glutamina (Gln, Q); aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina (Arg, R), lisina (Lys, K), e histidina (His, H) e aminoácidos carregados negativamente (ácido) incluem o ácido aspártico (Asp, D) e ácido glutâmico (Glu, E). Qualquer resíduo de cisteína não envolvidos na manutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substituído, geral- mente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e pre- venir a reticulação aberrante.

Inversamente, a ligação de cisteína(s) pode ser adicionada ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmen- te quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv.

Maturação por Afinidade A maturação por afinidade geralmente envolve a preparação e rastreio de variantes de anticorpos que tenham substituições dentro das CDRs de um anticorpo de origem e variantes selecionandas que tenham me- lhores propriedades biológicas, tais como afinidade de ligação mais forte em relação ao anticorpo de origem.

Uma maneira conveniente para gerar tais variantes de substituição é a maturação por afinidade usando exibição de fa-

gos.

Resumidamente, vários sítios da região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos pos- síveis em cada sítio.

As variantes de anticorpo assim geradas são exibidas de uma forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos co- mo fusões ao produto do gene Ill de M13 empacotado dentro de cada partí- cula.

As variantes de fagos exibidos são então testadas para a atividade bio- lógica (afinidade de ligação, por exemplo). Ver, por exemplo, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 e WO 93/19172. Métodos de maturação de afinidade de anticorpos atuais perten- cema duas categorias de mutagênese: estocásticos e não estocástico.

PCR propensa a erros, cepas bacterianas mutadoras (Low et al., J.

Mol.

Biol. 260, 359-68 (1996)), e mutagênese de saturação (Nishimiya et al... J.

Biol.

Chem. 275:12813-20 (2000); Chowdhury, P.

S.

Methods Mol.

Biol. 178, 269-85 (2002)) são exemplos típicos de métodos de mutagênese estocástica (Rajpal eta, Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71 (2005)). Técnicas não estocásticas costumam usar mutagênese sítio-dirigida ou de varredura de alanina para gerar coleções limitadas de variantes específicas.

Alguns méto- dos são descritos em mais detalhes abaixo.

Maturação por afinidade via de métodos de panning - À matu- ração por afinidade de anticorpos recombinantes é geralmente realizada através de várias rodadas de panning de anticorpos candidatos na presença de quantidades decrescentes de antígeno.

A diminuição da quantidade de antígeno por rodada seleciona os anticorpos com maior afinidade para o antígeno, assim, produzindo anticorpos de elevada afinidade a partir de um grande pool de material de partida.

A maturação por afinidade através de panning é bem conhecida na técnica e está descrita, por exemplo, em Huls et al. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71 (2001)). Métodos de matura- ção por afinidade usando tecnologias de exibição de fagos são descritos em outro local neste documento e conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Daughertyetal,. Proc Natl Acad Sci U S A. 97:2029-34 (2000)). Mutagênese look-through - A mutagênese look-through (LTM) (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71 (2005)) fornece um método para mapear rapidamente o sítio de ligação a anticorpo.

Para LTM, nove aminoácidos, representativos dos principais produtos químicos de ca- deia lateral fornecidos pelos 20 aminoácidos naturais, são selecionados para dissecar as contribuições de cadeia lateral funcionais para a ligação em ca- da posição em todas as seis CDRs de um anticorpo.

A LTM gera uma série de posicional de mutações individuais dentro de uma CDR onde cada resí- duo "tipo selvagem" é sistematicamente substituído por um dos nove ami- noácidos selecionados.

As CDRs mutadas são combinadas para gerar bi- bliotecas de fragmentos variáveis de cadeia única combinatória (scFv) de complexidade e tamanho crescentes sem se tornarem proibitivas para a exibição quantitativa de todas as variantes.

Após a seleção positiva, os clo- nes com forte afinidade de ligação são sequenciados, e as mutações bené- ficas são mapeadas.

PCR propensa a erros - POR propensa a erros envolve a ran- domização de ácidos nucléicos entre as diferentes rodadas de seleção.

À randomização ocorre a uma taxa baixa pela taxa de erro intrínseca da poli- merase usada, mas pode ser aumentada por PCR propensa a erros (Zaccolo et al., J.

Mol.

Biol. 285:775-783 (1999)) usando uma polimerase tendo uma taxa de erro intrínseca elevada durante a transcrição (Hawkins et al,J Mol.

Biol. 226:889-96 (1992)). Após os ciclos de mutação, os clones com mais forte afinidade de ligação para o antígeno são selecionadas usando métodos de rotina na técnica.

Embaralhamento de DNA — O embaralhamento de ácido nuclei- co é um método para recombinação homóloga in vitro ou in vivo de pools de — polinucleotídeos mais curtos ou menores para produzir polinucleotídeos va- riantes.

O embaralhamento de DNA foi descrito na Patente US 6.605.449, Patente US 6.489.145, WO 02/092.780 e Stemmer, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

EUA, 91:10747-51 (1994). Geralmente, o embaralhamento de DNA é com- posto de 3 etapas: fragmentação dos genes a serem misturados com DNase |, ahibridação aleatória de fragmentos e de remontagem ou preenchimento do gene fragmentado por PCR na presença de DNA-polimerase (PCR se- xual), e amplificação de produto remontado por PCR convencional.

O embaralhamento de DNA difere do PCR propenso a erros pelo fato de que é uma reação em cadeia inversa. Na PCR propensa a erros, o número de sítios de partida de polimerase e o número de moléculas crescem exponencialmente. Em contraste, na remontagem de ácido nucleico ou em- baralhamento de polinucleotídeos aleatórios, o número de sítios de partida e o número (mas não o tamanho) de polinucleotídeos aleatórios diminuem ao longo do tempo.

No caso de um anticorpo, o embaralhamento de DNA permite a associação combinatória livre de todas as CDR1s com todas as CDR2s com todas as CDR3s, por exemplo. É contemplado que as múltiplas famílias de sequências possam ser misturadas na mesma reação. Além disso, o emba- ralhamento geralmente conserva a ordem relativa, de modo que, por exem- plo, a CDR1 não será encontrada na posição de CDR2. Os embaralhadores (shufflants) raros irão conter um grande número das melhores CDRs (por exemplo, afinidade mais alta) e estes embaralhadores raros podem ser sele- cionados com base na sua afinidade superior.

O polinucleotídeo modelo que pode ser usado no embaralha- mento de DNA pode ser DNA ou RNA. O mesmo pode ser de vários comprimentos, dependendo do tamanho do gene ou polinucleotídeo mais curto ou menor a ser recombinado ou remontado. Preferencialmente, o polinucleotídeo modelo tem de 50 pb a 50 kb. O polinucleotídeo modelo muitas vezes deve ser de filamento duplo.

É contemplado que polinucleotídeos de filamento único ou fila- mento duplo de ácido nucleico tendo regiões de identidade ao polinucleotí- deomodeloe as regiões de heterologia para o polinucleotídeo modelo pode ser adicionado ao polinucleotídeo modelo, durante a etapa inicial de seleção de gene. Está também contemplado que dois polinucleotídeos modelos diferentes, mas relacionados podem ser misturados durante a etapa inicial.

Varredura de Alanina — A mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antígeno. Cunningham e Wells, (Science 244:1081-1085 (1989)). Um resíduo ou grupos de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativa- mente ou neutro (mais preferencialmente alanina ou polialanina) para afetar a interação de aminoácidos com o antígeno. Estas localizações de aminoáci- dos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refi- nadas pela introdução de variantes adicionais ou outras, ou para, os sítios de substituição. Modelo auxiliado por computador - Alternativamente, ou adicio- nalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar os pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno, ou para usar software de computador para modelar estes pontos de contato. Tais resíduos de contato e os resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente documento. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é sujeito a um rastreio, tal como descrito aqui e os anticorpos com proprieda- des superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Formulação de Composições Farmacêuticas Para administrar agentes de ligação de polipeptídeos da inven- çãoa mamíferos humanos ou de teste, é preferível formular o agente de |li- gação de polipeptídeo em uma composição estéril compreendendo um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis estéreis. A frase "farmaceutica- mente ou farmacologicamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas alérgicas, ou outras quando administradas usando rotas bem conhecidos na técnica, como des- crito abaixo. "Carreadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem quaisquer e todos os solventes clinicamente úteis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retarda- mento de absorção e semelhantes.

O agente de ligação de polipeptídeo é administrado por quais- quer meios adequados, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para o tratamento local, adminis-

tração intralesional.

Infusões parentéricas incluem administração intrave- nosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica ou subcutâã- nea.

Preferencialmente, a dosagem é dada por injeções, mais preferencial- mente, por injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte do fatodesea administração é breve ou crônica.

Outros métodos de adminis- tração são contemplados, incluindo tópica, particularmente transdérmica, transmucosal, por exemplo, administração retal, oral ou local através de um cateter colocado perto do local desejado.

As composições farmacêuticas da presente invenção contendo um agente de ligação de polipeptídeo da invenção como um ingrediente ati- vo podem conter carreadores ou aditivos estéreis farmaceuticamente aceitá- veis, dependendo da via de administração.

Exemplos de tais carreadores ou aditivos incluem água, um solvente orgânico farmacêutico aceitável, colá- geno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, um polímero de carboxivinila, carboximetilcelulose sódica, poliacrílico sódico, alginato sódico, dextrano solúvel em água, carboximetilamido sódico, pectina, metilcelulose, etil celu- lose, goma xantana, goma arábica, caseína, gelatina, agar, diglicerina, glice- rina, propileno glicol, polietileno glicol, vaselina, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina de soro humano (HSA), manitol, sorbitol, lactose, um surfactante farmaceuticamente aceitável e semelhantes.

Aditivos usados são escolhidos de, mas não se limitando a, os acima ou combinações dos mesmos, como apropriado, dependendo da forma de dosagem da presente invenção.

Para soluções ou emulsões, carreadores adequados incluem, por exemplo, soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspen- sões, incluindo salina e meios tamponados.

Veículos parenterais podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos.

Veículos intravenosos podem incluir vários aditivos, conservantes, ou fluidos, nutrientes ou reforçadores eletro- líticos.

Uma variedade de carreadores aquosos é adequada, por exemplo, soluções salinas tamponadas com fosfato estéreis, água bacteriostática, água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3%, e semelhan- tes, e podem incluir outras proteínas para a estabilidade intensificada, como lipoproteína, albumina, globulina, etc., submetido a modificações químicas leves ou semelhantes. As formulações terapêuticas do agente de ligação de polipeptí- deo são preparadas para armazenamento por mistura do agente de ligação de polipeptídeo tendo o grau desejado de pureza com transportadores fisio- logicamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizantes (Remington 's Pharmaceutical Sciences 16a Edição, Osol, A. Ed.. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis, não são tóxicos para os receptores nas dosa- gense concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato, succinato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido as- córbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilben- zil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de ben- zetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol, e m-cre- sol); polipeptídeos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polí- meros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glici- na, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina ou; monossacáridos, dis- sacáridos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formador de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína), e/ou surfactantes não iónicos tais como TweenTY, Pluronics"Y ou de polietileno glicol (PEG).

Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em mi- crocápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por po- limerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de gelatina ou hidroxime- tilcelulose e microcápsulas de poli- (metilmethacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, albumina, microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington 's edição Pharmaceutical Sciences 16, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações para serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é, facilmente realizadas por filtração através de membranas de filtração estéreis. As suspensões aquosas podem conter o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquo- sas. Estes excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboxi- metilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto e goma de acácia; agentes de dispersão ou umectantes podem ser um fosfatídeo de ocorrência natural, por exemplo, lecitina, ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo, estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetil-eneoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol, tals como mono-oleato de polioxietileno sorbitano, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo, mono-oleato de polietileno sor- bitano. As suspensões aquosas podem também conter um ou mais conser- vantes, por exemplo, etil, ou n-propil, p-hidroxibenzoato.

Os anticorpos da invenção podem ser liofilizados para armaze- namento e reconstituídos em um carreador adequado antes do uso. Esta técnica tem demonstrado ser eficaz com imunoglobulinas convencionais. Quaisquer técnicas de reconstituição e liofiização adequadas podem ser empregadas. Será apreciado por aqueles versados na técnica que a liofiliza- çcãoe reconstituição podem conduzir a vários graus de perda de atividade de anticorpo e que os níveis de uso podem ter que ser ajustados para compen- sar.

Pós e grânulos dispersíveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água fornecem o composto ativo em —misturacom um agente de dispersão ou umectante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensão são exemplificados por aqueles já mencionados acima.

A concentração de agente de ligação de polipeptídeo nestas formulações pode variar amplamente, por exemplo, de menos de cerca de 0,5%, normalmente a ou pelo menos cerca de 1% a tanto quanto como 15 ou 20% em peso e será selecionada primariamente com base nos volumes de fluidos, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de adminis- tração selecionado. Assim, uma composição farmacêutica típica para injeção parentérica pode ser feita de modo a conter 1 ml! de água estéril tamponada, e 50 mg de agente de ligação de polipeptídeo. Uma composição para infusão intravenosa típica pode ser feita de modo a conter 250 ml de solução de Ringer estéril, e 150 mg de agente de ligação de polipeptídeo. Os méto- dos atuais para a preparação de composições administráveis parenterica- mente serão conhecidos ou aparentes dos versados na técnica e são descri- tos em mais detalhes, por exemplo, em Science Remington 's Pharmaceu- tical, 15º ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980). Uma dosagem eficaz de agente de ligação de polipeptídeo está dentro da faixa de 0,01 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por administração.

As composições farmacêuticas podem ser sob a forma de uma suspensão aquosa injetável estéril, oleaginosa, dispersões ou pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhe- cida usando os dispersantes ou umectantes adequados e os agentes de suspensão que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butano diol. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), suas misturas adequadas, óleos vegetais, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empre- gados como um solvente ou meio de suspensão. Para este fim qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tais como o ácido oleico, encontram utilização na preparação de injetáveis.

Em todos os casos a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que fácil seringabilidade exista. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de mi- cro-organismos, como bactérias e fungos. A prevenção da ação de micro-or- ganismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifún- gicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, cloreto de açúcares ou de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio egelatina.

As composições úteis para a administração podem ser formula- das com intensificadores de absorção ou captação para aumentar a sua efi- cácia. Tais promotores incluem, por exemplo, salicilato, glicocolato/linoleato, Qglicolato, aprotinina, bacitracina, SDS, caprato e semelhantes. Ver, por exemplo, Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285 (1996)) e Oliyai e Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544 (1993)).

Ensaios Biofísicos Os eventos dos complexos biológicos podem ser estudados através de abordagens biofísicas moleculares que os consideram como sistemas de unidades de interação que podem ser entendidos em termos de mecânicas estatística, termodinâmicas e cinética química.

Em certas modalidades, os ensaios da presente invenção po- dem empregar uma fração detectável. A fração detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, diretamente ou indiretamente, um sinal mensurável, tal como um sinal radioativo, de luminescência, cromogênico, ou fluorescente, que pode ser usado para quantificar a quantidade de fração ou marcação detectável em uma amostra. Marcadores detectáveis conheci-

dos na técnica incluem radioisótopos, tais como ºH, "ºC, *º?P, *S, ou Pl, marcadores eletroquimioluminescente (tal como o catalisador baseado em ruténio (Ru) em conjunto com substratos, etc.), marcadores luminescentes ou bioluminescentes (por exemplo, európio, vanádio), compostos fluorescen- tes ou quimioluminescentes, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodami- na ou luciferina, enzimas (por exemplo, enzima, tal como fosfatase alcalina, B-galactosidase, ou peroxidase de rábano), maracadores colorimétricos tais como o ouro coloidal, vidro colorido ou esferas de plástico (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.), os átomos paramagnéticos ou agen- tesmagnéticos, reagentes elétron-densos, uma nano ou microesfera conten- do um corante fluorescente, nanocristais, um ponto quântico, uma esfera quântica, um nanotag, dendrímeros com um marcador fluorescente, um microtransponder, uma molécula de doador de elétrons ou estrutura mole- cular, ou uma partícula refletora de luz, as micropartículas podem ser nano- cristais ou pontos quânticos. Nanocristais são substâncias que absorvem os fótons de luz, em seguida, re-emitem os fótons em um comprimento de onda diferente (fluoróforos). Além disso, marcadores fluorescentes adicionais, ou anticorpos secundários podem ser conjugados com os nanocristais. Nano- cristais estão comercialmente disponíveis a partir de fontes tais como Invitro- gene Evident Technologies (Troy, NY). Outros marcadores incluem: E)-5-[2- (metoxicarbonil)etenil] citidina, que é uma molécula não fluorescente que, quando submetida à irradiação ultravioleta (UV) rende um produto, 3-beta-D- ribofuranosil-2,7- dioxopirido [2,3-d] pirimidina, que exibe um forte sinal de fluorescência. Marcadores de código de barras são descritos na publicação de Patente US 20070037195.

Uma variedade de métodos de ensaio conhecidos na técnica pode ser empregada na presente invenção, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imuno- precipitação, transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET), ressonância de plasmon de superfície de eletroimunoensaio (SPR), e técnicas derivadas de nanopartículas.

Ensaios de ligação competitiva dependem da capacidade de um padrão marcado (por exemplo, um antígeno ou um fragmento do mesmo para o qual um agente de ligação de polipeptídeo liga-se) para competir com o antígeno na amostra de teste para a ligação ao agente de ligação de polipeptídeo. A quantidade de antígeno na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligada, os anticor- pos são tipicamente insolubilizados antes ou após a competição, de modo que o antígeno ligado possa ser convenientemente separado do antígeno não ligado. Em modalidades alternativas, os ensaios de ligação competitiva medem a capacidade de um agente de ligação de polipeptídeo marcado para competir com o agente de ligação de polipeptídeo não marcado para a ligação a antígeno ou um fragmento do mesmo.

Ensaios em sanduíche envolvem tipicamente a uso de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma porção imunogênica diferente, ou epítopo, da proteína a ser detectada e/ou quantificada. Em um ensaio em sanduíche, o analito na amostra de teste é normalmente ligado por um agente de ligação de polipeptídeo que primeiro é imobilizado em uma fase sólida, e depois disso um segundo agente de ligação de polipeptídeo liga-se ao analito, formando assim um complexo insolúvel de três partes. Ver, por exemplo, Patente US 4.376.110. O segundo agente de ligação de polipeptí- deo pode por si só ser marcado com uma fração detectável (ensaios em sanduíche diretos) ou pode ser medido usando um anticorpo anti-imunoglo- bulina que está marcado com uma fração detectável (ensaios em sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio em sanduíche é um ensaio imu- —noenzimático (ELISA), caso em que a fração detectável é uma enzima. Ver, por exemplo, capítulo 18, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, New York, NY (1995). Ainda um outro exemplo de um método de ensaio envolve emis- sões de transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET). Por exemplo, um composto é marcado com uma molécula doadora FRET e o seu parceiro de ligação é marcado com uma molécula receptora FRET, ou vice-versa. Quando a ligação ocorre entre os parceiros de ligação, as molé-

culas doadoras FRET e receptoras FRET são trazidas em proximidade e emitem fluorescência a um determinado comprimento de onda. Um filtro pas- sa-banda estreito pode ser usado para bloquear todos os comprimentos de onda exceto o da marcação. Pares de moléculas FRET estão comercial- mente disponíveis na técnica (por exemplo, a partir de Invitrogen), e podem ser usados de acordo com o protocolo do fabricante. As emissões de FRET são detectadas através de técnicas de imageamento ótico, tais como uma câmara CCD.

Ainda um outro exemplo de um método de ensaio é o de trans- ferência de energia por ressonância bioluminescente (BRET), por exemplo, usando biossensores como descrito no WO/06/086883.

Outro tipo de ensaio envolve a marcação com um doador de elétrons. Uma molécula é marcada com um doador de elétrons e a molécula de interação é ligada a um contato elétrico, ou vice-versa. Quando a ligação ocorre entre os parceiros de ligação, o marcador doa elétrons para o contato elétrico. Ver, por exemplo, Ghindilis, Biochem Soe Trans. 28:84-9, (2000) e Dai et al., Cancer Detect Prev. 29:233-40 (2005), que descrevem os métodos de eletroimunoensaios. O contato de elétrons, então, seria lido por um conversor de A a D (analógico para digital) e quantificado. Quanto maior acontagem de elétrons mais interações ocorrem.

Uma modalidade de uma marcação capaz de detecção de molé- cula única é o uso de partículas plasmon-ressonantes (PRP) como repórte- res óticos, como descrito em Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:996-1001 (2000), incorporada aqui por referência. As PPRs são nanopar- tículas metálicas, por exemplo, 40-100 nm de diâmetro, que dispersam a luz devido a uma ressonância coletiva dos elétrons de condução no metal (isto é, a ressonância de plasmon de superfície). A magnitude, comprimento de onda de pico, e largura de banda espectral da ressonância de plasmon asso- ciada com uma nanopartícula são dependentes do tamanho da partícula, formae composição do material, bem como do ambiente local. Ao influenciar estes parâmetros durante a preparação, podem ser formadas PRPs que têm pico dispersando em qualquer lugar na faixa visível do espectro. Para PRPs esféricas, tanto o comprimento de onda de dispersão de pico quanto o aumento de eficiência de dispersão com raio maior, fornecendo um meio para a produção de marcações diferentemente coloridas. As populações de esferas de prata, por exemplo, podem ser preparadas de forma reprodutível paraoqualo comprimento de onda de pico de dispersão está dentro de alguns nanômetros de comprimento de onda alvo, ajustando-se o raio final das esferas durante a preparação. Devido as PRPs serem brilhantes, mas nanodimensionadas, elas são usadas como indicadores para a detecção de molécula única, isto é, a presença de uma PRP ligada em um campo de visão pode indicar um único evento de ligação. Um exemplo de um sistema detector de ressonância de plasmon de superfície é o sistema de ensaio de BlAcore. Ver, por exemplo, Malmquist, J Molec Recognition, 7:1-7 (1994).

Interações moleculares podem também ser detectadas usando técnicas derivadas dde nanopartículas. Ver, por exemplo, Ao et al., Anal Chem. 78:1104-6 (2006), que descreve extinção de nanopartículas de ouro, Tang et al., Biosens Bioelectron. 2005 Nov 30, que descreve superfícies de nanopartículas de SiO(2)/Au na detecção de anticorpos, e Lieu et al., J Immunol Methods. 307:34-40 (2005), que descreve as nanopartículas de dió- xido de silício contendo dibromofluoresceína paro uso em imunoensaio de fosforescência de substrato sólidos em temperatura ambiente (SS-RTP-IA). Um ensaio de KinExA também é útil para medir a afinidade de um anticorpo de modulação para o seu antígeno. Um ensaio de KinExA exemplar é descrito no Exemplo 20. Por exemplo, um ensaio de KinExA mede os níveis muito baixos de ligante em meios de cultura de células. Este ensaio permite que a ligação do ligante às células expressando o receptor cognato seja medida por determinação do nível de depleção de ligando dos meios de cultura de células. À medida que o ligante torna-se ligado às células, a concentração de ligante nos meios de cultura células cai. Ao usar uma titulação de células que expressam o receptor e medem o percentual de ligante livre, a afinidade da interação ligante-receptor é estimada usando software de KinExA (Sâãpidyne, Boise ID). Este ensaio é usado para medir o grau de modulação da atividade de ligação do ligante mostrada por vários anticorpos antirreceptores.

Qualquer uma das medições anteriores da afinidade de ligação ou os parâmetros de taxa de ligação podem ser efetuadas em ensaios em que um ou mais do primeiro componente, segundo componente e agente de ligação de polipeptídeo estão em solução, ou em ensaios em que um ou mais do primeiro componente, segundo componente e agente de ligação de polipeptídeo estão ligados a uma fase sólida (covalentemente ou não cova- lentemente), ou em ensaios em que um ou mais do primeiro componente, segundo componente e agente de ligação de polipeptídeo são expressos em uma superfície celular. O primeiro componente e/ou segundo podem por si só ser, cada um, complexos de vários compostos.

Administração e Dosagem Em um aspecto, os métodos da invenção incluem uma etapa de administrar uma composição farmacêutica.

Os métodos da invenção são realizados usando quaisquer meios medicamente aceitos para a introdução de uma terapêutica direta ou indiretamente a um sujeito mamífero, incluindo, mas não se limitados a administração de injeções, ingestão oral, intranasal, tópica, transdérmica, parental, por pulverização de inalação, vaginal, ou retal. O termo parenteral como aquiusado inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, e intracisternais, bem como técnicas de cateter ou de infusão. A adminis- tração por injeção intradérmica, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implante cirúrgico de um sítio particular, é contemplada também. Dispositivos de distribuição adequados podem incluir aqueles desenvolvidos para distribuição de insulina (ver, por exemplo, Owens et al. Diabetic Med. 20(11):886-898, 2003).

Em uma modalidade, a administração é realizada no sítio de um câncer ou tecido afetado com necessidade de tratamento por injeção direta no sítio ou através de um mecanismo de liberação sustentada ou distribuição sustentada, que podem distribuir a formulação internamente. Por exemplo, as microesferas ou cápsulas biodegradáveis ou outras configurações de polímero biodegradável capazes de distribuição sustentada de uma compo-

sição (por exemplo, um polipeptídeo solúvel, anticorpo, ou molécula peque- na) podem ser incluídos nas formulações da invenção implantada no sítio. As composições terapêuticas podem também ser distribuídas ao paciente em múltiplos sítios. As administrações múltiplas podem ser realiza- das simultaneamente ou podem ser administradas ao longo de um período de tempo. Em certos casos, é benéfico fornecer um fluxo contínuo da composição terapêutica. A terapia adicional pode ser administrada em uma base de períodos, por exemplo, de hora em hora, diariamente, semanal- mente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas ou mensalmente.

Também contemplada na presente invenção é a administração de vários agentes, tais como uma composição de anticorpo, conjugado com um segundo agente como aqui descrito.

As quantidades de composição de anticorpo em uma determina- da dosagem irão variar de acordo com o tamanho do indivíduo a quem a te- rapia será administrada, bem como as características do distúrbio a ser tra- tado. Nos tratamentos exemplares, pode ser necessário administrar cerca de 1 mg/dia, 5 mg/dia, 10 mg/dia, 20 mg/dia, 50 mg/dia, 75 mg/dia, 100 mg/dia, 150 mg/dia, 200 mg/dia, 250 mg/dia, 500 mg/dia ou 1000 mg/dia. Estas concentrações podem ser administradas como uma forma de dosagem única ou como doses múltiplas. Estudos padrões de dose-resposta, primeiro em modelos animais e, em seguida, em testes clínicos, revelam dosagens óti- mas para estados de doença particulares e populações de pacientes.

Terapia de Combinação É uma modalidade, um anticorpo da invenção é administrado comum segundo agente útil para o tratamento de uma doença ou distúrbio como descrito aqui. É contemplado que dois ou mais anticorpos para epíto- pos diferentes do antígeno alvo podem ser misturados tal que a combinação de anticorpos em conjunto forneça ainda a eficácia melhorada contra uma condição ou distúrbio a ser tratado associado ao alvo polipeptídeo. As composições compreendendo um ou mais anticorpos da presente invenção podem ser administradas a pessoas ou mamíferos que sofrem de, ou estão predispostos a sofrer de, uma condição ou distúrbio a ser tratado associado ao polipeptídeo alvo.

A administração simultânea de dois agentes terapêuticos não exige que os agentes sejam administrados ao mesmo tempo ou pela mesma rota, contanto que exista uma sobreposição no período de tempo durante o qualos agentes estão exercendo o seu efeito terapêutico. A administração simultânea ou sequencial é contemplada, tal como é contemplada a admi- nistração em dias ou em semanas diferentes.

Um segundo agente pode ser de outros agentes terapêuticos, tais como agentes antidiabéticos, citocinas, fatores de crescimento, outros agentes anti-inflamatórios, agentes anticoagulantes, agentes que irão dimi- nuir ou reduzir a pressão sanguínea, agentes que irão reduzir o colesterol, triglicerídeos, LDL, VLDL, ou lipoproteína(s) ou aumento de HDL, agentes que irão aumentar ou diminuir os níveis de proteínas reguladoras de coles- terol, fármacos ou moléculas antineoplásicas. Para os pacientes com um dis- túrbio hiperproliferativo, tais como câncer ou um tumor, a combinação com a segunda modalidade terapêutica, tais como a radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, ou cirurgia é também contemplada.

Exemplos de agentes anti-diabéticos incluem, mas não estão |i- mitados a, 1) sulfonilureias (por exemplo, glimepirida, glisentida, sulfo- nilureias, AY31637); 2) biguanidas (por exemplo, a metformina); 3) inibidores alfa-glicosidase (por exemplo, acarbose, miglitol); 4) tiazol-idinodionas (por exemplo, troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, glipizida, balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazona, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, PIN 223, NIP 221, MK 0767, ciglitazona, adaglitazona, CLX 0921, darglitazona, CP 92,768, BM 152.054); 5) peptí- deos tipo glucagon (GLP) e análogos de GLP ou agonistas do receptor de GLP-1 (por exemplo, exendina) ou estabilizantes do mesmo (por exemplo, inibidores DPPA, tais como sitagliptina); e 6) insulina ou análogos ou mimé- ticos dos mesmos (por exemplo, LANTUSO).

É contemplado que o anticorpo da invenção e o segundo agente podem ser administrados simultaneamente, na mesma formulação. É ainda contemplado que os agentes são administrados em uma formulação separa-

da e administrados concomitantemente, com o concomitantemente se refe- rindo a agentes administrados no prazo de 30 minutos um do outro.

Em um outro aspecto, o segundo agente é administrado antes da administração da composição de anticorpo. A administração anterior refe- re-se à administração do segundo agente dentro da faixa de uma semana antes do tratamento com o anticorpo, até 30 minutos antes da administração do anticorpo. É ainda contemplado que o segundo agente é administrado após a administração da composição de anticorpo. A administração subse- quente destina-se a descrever a administração a partir de 30 minutos após o tratamento com anticorpo até uma semana após a administração do anticorpo.

É ainda contemplado que outras terapias adjuntas podem ser administradas quando for apropriado. Por exemplo, o paciente pode também ser administrado com uma dieta diabética ou plano alimentar, terapia cirúr- gica, outerapia de radiação quando for apropriado.

Será também aparente que a dosagem pode ser modificada se as terapêuticas tradicionais são administradas em combinação com a tera- pêutica da invenção.

Métodos de Uso Indicações terapêuticas para agonistas INSR/moduladores positivos Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método para a inibição da atividade alvo através da administração de um anticorpo es- pecífico para alvo para um paciente com necessidade do mesmo. Qualquer um dos tipos de anticorpos aqui descritos pode ser usado terapeuticamente.

Em modalidades exemplares, o anticorpo específico para alvo é um anticor- po humano, quimérico ou humanizado. Em outra modalidade exemplar, o al- vo é humano e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o pa- ciente pode ser um mamífero que expressa uma proteína alvo com a qual o anticorpo específico para alvo reage de forma cruzada. O anticorpo pode ser administrado a um mamífero não humano que expressa uma proteína alvo com a qual o anticorpo reage de forma cruzada (isto é, um primata) para fins veterinários ou como um modelo animal da doença humana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos es- pecíficos para alvo da invenção.

A resistência à insulina descreve uma condição em que quanti- dades fisiológicas de insulina são inadequadas para a produção de uma resposta normal de insulina a partir de células ou tecidos.

A resistência à insulina está associada com uma série de estados e condições de doença e está presente em aproximadamente 30-40% de indivíduos não diabéticos.

Estas condições e estados de doença incluem, mas não estão limitadas a, pré-diabetes, síndrome metabólica (também referida como síndrome de re- sistência à insulina), diabetes mellitus tipo 2, doença de ovário policístico (PCOS) e doença do fígado gorduroso não-alcoólico (NAFLD) (revisto em Woods et al., End, Metab & Immune Disorder-Drugs Targets 9:187-198, 2009). Pré-diabetes é um estado de tolerância à glicose anormal carac- terizado por uma intolerância à glicose prejudicada (IGT) ou glicemia de jejum prejudicada (IFG). Pacientes com pré-diabetes são resistentes à insu- lina e estão em alto risco para a progressão futura de manifestar o diabetes tipo 2. A síndrome metabólica é um aglomerado associado de traços que incluem, mas não estão limitados a, hiperinsulinemia, tolerância à glicose anormal, obesidade, redistribuição de gordura para o compartimento do corpo abdominal ou superior, hipertensão, disfibrinolise, e uma dislipidemia caracterizada triglicerídeos elevados, baixo colesterol HDL, e pequenas partículas de LDL densas.

A resistência à insulina tem sido associada a cada um dos traços, sugerindo que a síndrome metabólica e a resistência à insulina estão intimamente relacionados entre si.

O diagnóstico da síndrome metabólica é um potente fator de risco para o desenvolvimento futuro de diabetes tipo 2, bem como aterosclerose acelerada, resultando em ataques cardíacos, acidentes vasculares cerebrais e doença vascular periférica.

Diabetes mellitus é um distúrbio metabólico em humanos com uma prevalência de aproximadamente um por cento na população geral (Foster, D.

W., Harrison's Principles of Internal Medicine, Cap. 114, pp. 661- 678, 10º Ed., McGraw-Hill, New York). A doença manifesta-se como uma série de anormalidades metabólicas induzidas pelo hormônio que, eventual- mente, levam a complicações graves, em longo prazo e debilitantes que envolvem vários sistemas orgânicos, incluindo os olhos, rins, nervos e vasos sanguíneos.

Patologicamente, a doença é caracterizada por lesões das membranas basais, demonstráveis em microscopia eletrônica.

Diabetes mellitus pode ser dividida em duas síndromes clínicas, Tipo 1 e Diabetes mellitus Tipo 2. A diabetes mellitus dependente de insulina, ou tipo 1 (IDDOM), também referida como a forma de início juvenil, é uma doença autoimune crônica caracterizada pela perda extensiva de células beta das ilhotas de Langerhans do pâncreas, que produzem insulina.

Como estas células são progressivamente destruídas, a quantidade de insulina segregada diminui, levando eventualmente à hiperglicemia (anormalmente elevado nível de glicose no sangue) quando a quantidade de insulina segregada cai abaixo dos níveis de glicose no sangue normalmente necessários.

Embora o exato desencadeamento para esta resposta imune não é conhecida, os pacientes com IDDM têm níveis elevados de anticorpos contra proteínas expressas em células beta pancreáticas.

No entanto, nem todos os pacientes com níveis elevados destes anticorpos desenvolvem IDDM.

Diabéticos tipo 1 caracte- ristcamente mostram insulina plasmática muito baixa ou imensurável com glucagon elevado.

Independentemente de qual é a etiologia exata, a maioria dos pacientes tipo 1 tem anticorpos circulantes dirigidos contra as suas próprios células pancreáticas incluindo anticorpos para a insulina, para ilho- tas de célula de citoplasma de Langerhans e para a enzima de ácido glutâ- —micodescarboxilase.

Uma resposta imune especificamente dirigida contra as células beta (células produtoras de insulina) leva a diabetes Tipo 1. O trata- mento atual para os pacientes diabéticos de Tipo 1 é a injeção de insulina, e pode também incluir modificações da dieta, a fim de minimizar a hiperglice- mia resultante da falta de insulina natural, que por sua vez, é o resultado de células beta danificadas.

A dieta também é modificada em relação à admi- nistração de insulina para compensar os efeitos hipoglicêmicos do hormônio.

A diabetes do tipo 2 (também referida como diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM), forma de início na maturidade, forma de início adulto) desenvolve-se quando as células de músculo, gordura, e fígado não respondem normalmente à insulina. Esta falta de resposta (cha- mada resistência à insulina) pode ser devido à redução do número de recep- tores de insulina sobre essas células, ou uma disfunção das vias de sinali- zação dentro das células, ou ambos. As células beta inicialmente compen- sam esta resistência à insulina, aumentando a produção de insulina. Com o tempo, essas células se tornam incapazes de produzir insulina suficiente para manter níveis normais de glicose, indicando a progressão para diabetes tipo2.A diabetes tipo 2 é causada por uma combinação de fatores de risco genéticos e adquiridos, incluindo uma dieta rica em gordura, falta de exercí- cio, e envelhecimento. Maiosdo que 90% da população diabética sofre de diabetes do Tipo 2 e a incidência continua a subir, tornando-se uma das principais causas de morbidade e mortalidade e despesas com cuidados de saúde em todo o mundo (Amos et al., Diabetic Med 14:81-85, 1997 ).

A Diabetes tipo 2 é uma doença complexa caracterizada por defeitos no metabolismo glicídico e lipídico. Normalmente existem perturba- ções em muitos parâmetros metabólicos, incluindo aumentos nos níveis de glicose plasmática em jejum, níveis de ácidos graxos e triglicerídeos livres, bem como uma diminuição na proporção de HDL/LDL. Como discutido acima, uma das causas principais de diabetes subjacentes se pensa ser um aumento na resistência à insulina em tecidos periféricos, principalmente músculo e gordura. As causas da diabetes do Tipo 2 não são bem compre- endidas. Acredita-se que tanto a resistência dos tecidos alvos para a ação da insulina quanto a secreção de insulina diminuída ("falha de célula-B") ocorrem. Os principais tecidos responsivos à insulina para a homeostase da glicose são: o fígado, em que a insulina estimula a síntese de glicogênio e inibe a gliconeogênese; músculo, em que a insulina estimula a captação de glicose e o glicogênio estimula a captação de glicose e inibe a lipólise. As- sim, como uma consequência da condição diabética, existem níveis eleva- dos de glicose no sangue, o que pode conduzir a toxicidade celular mediada por glicose e morbilidade subsequente (nefropatia, neuropatia, retinopatia,

etc.) A resistência à insulina está fortemente correlacionada com o desen-

volvimento de diabetes tipo 2. Atualmente, existem várias abordagens farmacológicas para o tratamento de diabetes tipo 2 (Scheen et al, Diabetes Care, 22(9):1568- 1577,1999; Zangeneh et al., Mayo Clin Proc 78:471-479, 2003; Mohler et al., Med.

Res.

Rev. 29(1):125-195, 2009). Eles atuam através de diferentes modos de ação: 1) sulfoniluréias (por exemplo, glimepirida, glisentida, sulfo- nilureia, AY31637) essencialmente estimulam a secreção de insulina; 2) biguanidas (por exemplo, metformina), agem promovendo o uso de glicose, reduzindo a produção de glicose hepática e diminuindo a produção de gli- cose intestinal; 3) inibidores de alfa-glicosidase (por exemplo, acarbose, miglitol) reduzem a digestão carboidrato e, consequentemente, a absorção a partir do intestino e reduzem a hiperglicemia pós-prandial, 4) tiazol-idino- dionas (por exemplo, troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, glipizida, bala- glitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazona, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, PIN 223, NIP 221, MK 0767, ciglitazona, adaglitazona, CLX 0921, darglitazona, CP 92768, BM 152054) aumentam a ação da insulina, promovendo assim o uso de glicose nos tecidos periféricos; 5) agonistas e peptídeos tipo glucagon (por exemplo, exendina) ou estabili- zantes dos mesmos (por exemplo, inibidores de DPPA4, tais como sitaglipti- na) potencializam a secreção de insulina estimulada por glicose, e 6) insulina ou análogos dos mesmos (por exemplo, LANTUSO) estimulam o uso de glicose de tecido e inibem a produção de glicose hepática.

As abordagens farmacológicas acima mencionadas podem ser usadas individualmente ou em terapia de combinação.

No entanto, cada abordagem tem suas limita- ções e efeitos adversos.

Ao longo do tempo, uma grande porcentagem de sujeitos diabéticos do Tipo 2 perde a sua resposta a estes agentes. 63% dos pacientes de diabetes tipo 2 não atingem níveis globais de HDA1c <7% como recomendado por American Diabetes Association, e são, portanto, de alto risco para desenvolver complicações.

Além disso, quase que invariavel- mente, os pacientes progridem através dos estágios de declínio da função pancreática.

O tratamento com insulina é geralmente instituído depois que a dieta, exercícios e medicação oral não conseguem controlar adequadamente a glicose no sangue. Os inconvenientes de tratamento com insulina são a necessidade de injeção de fármacos, o potencial para a hipoglicemia, e o ganho de peso. Consequentemente, existe ainda uma necessidade urgente de novos agentes antidiabéticos.

Schaffer et al. usaram a exibição de fagos para identificar uma série de peptídeos de ligação a dois pontos discretos no INSR, que mos- traram atividade agonística ou antagonística quando covalentemente ligados para formar homodímeros ou heterodímeros (Schaffer et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. EUA, 100 (8):4435-4439, 2003).

Uma abordagem farmacológico adicional para o tratamento da diabetes Tipo 2 é o uso de moléculas não peptídicas pequenas que podem ativar o INSR, ou potencializar a a tivação de INSR por insulina (Moller, Nature 414: 821-827). Tais moléculas provaram ser ilusórias para identifi- cação, mas dois grupos relataram exemplos. L783281 (DMAQ-B1, L7) e o seu derivado, o composto 2, são miméticos de insulina identificados a partir de um rastreio para pequenas moléculas que ativam a cinase da tirosina de INSR (Zhang et al., Science 284: 974-977, 1999; Qureshi et al., J. Biol. Chem. 275 (47):36590-36595, 2000). TLK16998 e TLK19780 são sensibili- zadores de insulina identificados pela sua capacidade de aumentar a autofosforilação do isolado, naturalmente expressos no INSR humano (Manchem et al., Diabetes 50:824-830, 2001; Pender et al., J. Biol Chem 277(46): 43.565-43571, 2002). Tanto L783281 quanto TLKI6998 poten- cializam a ação da insulina em células resistentes à insulina, agindo sobre a porção intracelular da subunidade-B de INSR, intensificando a autofosforila- ção da subunidade-f e sinalização a jusante subsequente (Li et al., Diabetes 50: 2323-2328, 2001). O composto 2 e TLK1I6998 mostraram reduzir os níveis de glicose no sangue em modelos de camundongo com diabetes, quando administrados continuamente em doses elevadas (Strowski et al., —Endocrinology 145(11):5259-5268, 2004; Manchem et al., Diabetes 50: 824- 830, 2001). No entanto, nenhum destes compostos parece ter entrado em testes clínicos. Espera-se que os agentes que têm como alvo o domínio de tirosina cinase de INSR tenham efeitos secundários devido à ativação não específica de domínios de tirosina cinase homólogos em outras moléculas. A porção intracelular da subunidade-B de INSR não é um alvo adequado para moléculas maiores, tais como anticorpos, que são incapazes de se se difundir para dentro da célula.

Autoanticorpos policlonais a partir dos soros de pacientes com diabetes resistente à insulina foram identificados e usados como sondas para estudar a ação da insulina. Estes anticorpos inibiram a ligação de insulina a INSR e as formas bivalentes (mas não monovalentes) produziram efeitos biológicos tipo insulina quando expostas a tecidos in vitro (Kahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 75 (9):4209-4213, 1978; Heffetz e Zick, J. Biol Chem 261 (2):889-894, 1986).

Jacobs e Cuatrecasas descreveram dois anticorpos policlonais de coelho e relataram que estes anticorpos, bem como um número de anticorpos policlonais produzidos por outros investigadores, foram capazes de mediar vários efeitos semelhantes à insulina (Jacobs e Cuatrecasas, CIBA Found Symp 90:82 - 90, 1982).

Kull et al. descreveram três anticorpos monoclonais de camun- dongo, alR-1, alR-2 e alR-3 e um anticorpo policlonal, A410, e o seu uso pa- rainvestigar a reatividade cruzada imunoquímica, e identificar as subunida- des de, receptores de insulina e somatomedina-C (IGF-1) (Kull et al., J. Biol.

Chem. 258 (10):6561-6566, 1983). Herrera et al também fizeram anticorpos (anticorpos P4 e P5 policlonal de coelho de peptídeo anti-|NSR) para estudar a relação entre o INSR humano e receptores de IGF-1 (Herrera et al., J. Biol. Chem.261(6):2489-2491, 1986).

Um anticorpo modulador positivo que aumenta a taxa de asso- ciação ou diminui a taxa de dissociação de insulina (análogo de insulina ou agonista de INSR) para o INSR poderia resultar em um tempo de residência aumentado de insulina ligada a receptor (análogo de insulina ou agonista de INSR), uma alteração na a taxa de internalização de INSR e/ou uma mudança no grau de fosforilação de proteínas de sinalização ativada ou desativada pelo INSR. Essas mudanças poderiam alterar significativamente tanto a atividade metabólica quanto mitogênica da insulina (análogo de insulina ou agonista de INSR) e o nível e a frequência da administração de insulina exógena (análogo de insulina ou agonista de INSR).

Um anticorpo modulador negativo que aumenta a taxa de asso- ciação ou diminui a taxa de dissociação de insulina (análogo de insulina ou agonista de INSR) para o receptor pode resultar em um tempo de residência diminuído da insulina ligada a receptor (análogo de insulina ou agonista de INSR), uma alteração na taxa de internalização de INSR e/ou uma alteração no grau de fosforilação de proteínas de sinalização ativado ou desativado pelo INSR. Essas alterações poderiam alterar significativamente tanto a atividade metabólica quanto mitogênica da insulina (análogo de insulina ou agonista de INSR) e o nível e a frequência de dosagem de insulina exógena (análogo de insulina ou agonista de INSR). É contemplado que os pacientes diabéticos que recebem um anticorpo modulador positivo da invenção têm melhoria nos níveis de glicose no sangue, teste de tolerância à glicose, e outras medidas de sensibilidade à insulina em comparação com pacientes que não receberam tratamento. Por exemplo, espera-se que a administração de um anticorpo modulador positivo do presente da invenção reduza os níveis de glicose no sangue para os níveis normais de glicose, que são entre cerca de 70 mg/dL e 125 mg/dL para os níveis de glicose no sangue em jejum de acordo com American Diabetes Association. Em uma modalidade, a administração de um anticorpo da invenção reduz os níveis de glicose no sangue por cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ou mais em comparação com um paciente que não recebe tratamento com anticorpo.

De acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde e de American Diabetes Association, a tolerância à glicose normal é definida como os níveis de glicose abaixo de 140 mg por dL medidos duas horas após a ingestão de 75 g de glicose por via oral. A tolerância à glicose diminuída é definida como níveis de glicose em duas horas de 140 a 199 mg por dL (7,8-11,0 mmol) após a ingestão de 75-g de glicose por via oral. Um paciente é dito ter tolerância à glicose diminuída quando o nível de glicose é elevado (em comparação com um paciente saudável normal) após 2 horas, mas menos elevado do que seria de se qualificar para o diagnóstico diabetes mellitus tipo 2. Um paciente com tolerância à glicose prejudicada ainda pode ter uma glicose de jejum que é normal ou apenas levemente elevada.

Em uma modalidade, a administração de um anticorpo da invenção reduz os níveis de glicose em duas horas (após a dose de glicose com 75 g por via oral) por cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais em comparação com um paciente que não recebe tratamento com o anticorpo.

A ADA também recomenda um nível de alvo de hemoglobina Alc de menos que 7% em adultos.

Para as crianças, a ADA recomenda níveis de alvo mais altos de Atc.

Em crianças menores de 6 anos de idade, o nível recomendado é de 7,5% para 8,5%. Em crianças de 6 a 12 anos de idade, o nível recomendado é menos que 8%. O nível recomendado para adolescentes de 13 a 19 anos, é menos que a 7,5%. Alc é uma medida de quão bem os níveis de açúcar no sangue tem permanecido dentro de uma faixa alvo ao longo dos últimos 2 a 3 meses. (American Diabetes Associa- tion, Diabetes Care, 28 (1):186-212, 2005). É contemplado que a administra- ção de um anticorpo da invenção para tratar diabetes reduz os níveis de Atc em relação aos observados em um indivíduo não diabético.

Em uma modali- dade,a administração de um anticorpo da invenção reduz os níveis de Atc em um paciente por um medição porcentagem absoluta de HbAtc de pelo menos 0,5%, 0,7%, 1,0% ou 1,5%. As células beta nas ilhotas pancreáticas de Langerhans fazem e liberam a insulina, um hormônio que controla o nível de glicose no sangue.

Háum nível de linha de base de insulina mantido pelo pâncreas, mas pode responder rapidamente a dopagens de glicose no sangue pela liberação de insulina armazenada produzindo simultaneamente mais.

O tempo de respos- ta é bastante rápido.

Na diabetes Tipo 1, a perda progressiva e extensiva de células beta resulta na diminuição dos níveis de insulina secretada, levando eventualmente à hiperglicemia (nível de glicose anormalmente elevado no sangue). Na diabetes tipo 2, as células beta inicialmente compensam a re- sistência à insulina em um sujeito, aumentando a produção de insulina, mas,

ao longo do tempo, as células se tornam incapazes de produzir insulina suficiente para manter níveis normais de glicose. Pensa-se que tanto a resis- tência de tecidos alvos para a ação da insulina quanto a diminuição da se- creção de insulina, em parte devido a uma falha das células beta, ocorrem. À administração de anticorpos ou polipeptídeos descritos aqui que melhoram a absorção de glicose e outros sintomas diabéticos é também útil para melho- rar a função das células beta em um sujeito em necessidade do mesmo. Tal melhora inclui, mas não está limitada a, conservação da viabilidade de célu- las beta ou a redução de volume de células beta, aumento da proliferação de células beta, ou intensificação de secreção de insulina. Métodos adicionais para, e resultados de, melhoria da função das células beta são divulgados no pedido internacional de copropriedade WO 2010/028273.

Em certas modalidades, o tratamento com um anticorpo de mo- dulação positiva ou anticorpos agonistas parciais resulta em uma melhoria de um, dois, três ou mais sintomas de diabetes ou na resistência à insulina selecionada do grupo consistindo em triglicerídeos elevados no plasma, colesterol não esterificado elevado no plasma, colesterol total elevado no plasma, insulina elevada no plasma (indicativo de resistência à insulina), HOMA-IR elevada, razão de colesterol não HDL/HDL elevada (ou razão de colesterol total/colesterol HDL elevada), função das células beta melhorada, e os níveis de leptina elevados no plasma (indicativo de resistência à lepti- na). Quando os níveis elevados são indicativos de diabetes, resistência à insulina ou aumento do risco de complicações cardiovasculares, uma "melhoria" se manifesta como um nível reduzido, e vice-versa. A "melhoria" como usada aqui se refere a uma normalização de um nível para o nível observado nos indivíduos saudáveis.

Embora os níveis "normais" determinados em testes variem em uma base de laboratório para laboratório, e cada laboratório tenha suas pró- prias faixas normais, em geral, os níveis de triglicérides normais são de me- nos que a 150 mg/dL em pacientes com diabetes (limítrofe alto 150 - 199 mg/dL); níveis normais de colesterol são de menos que 200 mg/dL, um razão de colesterol não HDL/HDL alvo ou normal é de aproximadamente

<3,25 (baseado em <130 mg/dL de alvo não-HDL e >41 ng/dL de HDL alvo), uma faixa alvo ou normal de insulina em jejum é de aproximadamente 5-20 microU/m, e uma faixa alvo ou normal de leptina (geralmente também asso- ciada com o índice de massa corporal (IMC) ou hiperinsulinemia) está entre 3-25 ngml, por exemplo, 3 ng/ml parece ser necessária para a função metabólica normal e 20-25 ng/ml parece estar associada com a doença. Em algumas modalidades, o tratamento normaliza qualquer um ou mais dos sintomas acima em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais.

A síndrome dos ovários policísticos (PCOS) é o distúrbio endó- crino ginecológico mais comum e está presente em aproximadamente 5-10% das mulheres em idade fértil. Apresentações clínicas incluem distúrbios menstruais, obesidade, infertilidade e hirsutismo. A resistência à insulina na PCOS resulta de um defeito de ligação pós-insulina na sinalização. A hiperfosforilação de substrato (IRS)-1 serina de receptor de insulina e INSR por uma cinase(s) não identificada contribui para este defeito. A sinalização mitogênica foi observada ser intensificada no músculo esquelético de mulhe- res com PCOS (Corbould et al., Diabetes 55: 751-59, 2006). Agonistas e/ou moduladores positivos de ligação de insulina para INSR podem, portanto, serúteis para tratar e/ou reduzir a probabilidade do aparecimento de distúr- bios e sintomas relacionados a PCOS. Agonistas e/ou moduladores positivos de ligação de insulina para INSR que não aumentam a razão de sinalização mitogênica para metabólica podem ser particularmente úteis para o trata- mento de PCOS.

A esteatohepatite não alcoólica (NASH) é parte de um espectro de patologia (conhecida como NAFLD), variando de esteatose simples (infil- tração gordurosa) para NASH, através de cirrose a carcinoma hepatocelular (Farrell e Larter, Hepatol 43., S99-112, 2006). A resistência à insulina está associada com a acumulação de gordura no fígado e este órgão é agora reconhecido como um alvo importante de lesão em pacientes com resistên- cia à insulina. Estima-se que cerca de 20% de todos os adultos têm NAFDL, e 2-3% dos adultos têm NASH. Até um terço dos pacientes com NASH irão desenvolver cirrose ao longo do acompanhamento.

A doença hepática é uma complicação significativa da diabetes Tipo 2. Indivíduos com obesidade e dislipidemia apresentam sensibilida- de à insulina mais pobre do que a encontrada na população média.

A obesi- dade é uma doença crônica que é altamente prevalente e está associada não apenas com um estigma social, mas também com a expectativa de vida diminuída e vários problemas médicos, incluindo o desenvolvimento psicoló- gico adverso, distúrbios dermatológicas, tais como infecções, varizes, intole- rância ao exercício, diabetes mellitus, resistência a insulina, hipertensão arterial, hipercolesterolemia e doença arterial coronariana (Rissanen et al., British Medical Journal, 301:835-837, 1990). A obesidade é altamente corre- lacionada com a resistência à insulina e diabetes em animais experimentais e humanos.

Com efeito, a obesidade e resistência à insulina, o último dos quais sendo geralmente acompanhada por hiperinsulinemia ou hiperglice- mia, ouambos, são características da diabetes do Tipo 2. Além disso, a dia- betes tipo 2 está associada com um risco de duas a quatro vezes de doença da artéria coronária.

Apesar de décadas de pesquisa sobre esses problemas de saúde graves, a etiologia da obesidade e resistência à insulina é desco- nhecida.

É aqui divulgado que os anticorpos moduladores positivos e anticorpos agonistas parciais podem reduzir ou retardar o ganho de peso, ou seja, normalizar o ganho de peso, observado em animais diabéticos.

É con- templado que os anticorpos têm o mesmo efeito sobre o ganho de peso em pacientes obesos.

Também tem sido demonstrado que a administração de anticorpos moduladores positivos pode retardar ou reduzir a perda de peso, ou seja, normalizar a perda de peso, em animais diabéticos, cuja população de células beta é depletada, o que frequentemente resulta em perda de peso significativa e caquexia.

Em algumas modalidades, é contemplado que a administração de anticorpos moduladores positivos ou anticorpos agonistas parciais descri- tos aqui pode reduzir ou retardar o ganho de peso em um sujeito em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% em comparação com um sujeito não tratado.

Em uma modalidade alternativa, é contemplado que a adminis- tração de anticorpos moduladores positivos ou anticorpos agonistas parciais descritos aqui pode reduzir ou retardar a perda de peso em um indivíduo, tal como um paciente diabético ou um indivíduo tendo pelo menos a depleção de células beta parciais, em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% em comparação com um sujeito não tratado.

Em algumas modalidades, é contemplado que a administração de anticorpos moduladores positivos ou anticorpos agonistas parciais des- critos aqui podem promover ou induzir a perda de peso em relação a sujeitos não tratados, por exemplo, em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% em comparação com um sujeito não tratado.

Inibidores da protease usados para o tratamento de pacientes com HIV estão associados com o desenvolvimento de um grupo de distúr- bios metabólicos, incluindo a resistência à insulina (Graham, JAIDS 25: S4- S11,2000). A resistência à insulina induzida por inibidores de HIV protease pode levar a hiperglicemia que pode evoluir para diabetes e, finalmente, cetoacidose com risco de morte. (Carr et al., Lancet 351:1881-1883, 1998). Para alguns pacientes, estes efeitos colaterais metabólicos limitam muito o uso destes fármacos de sustentação da vida. Murata et al. (J. Biol Chem 275 (27):20251-54, 2000) relataram que, pelo menos três dos fármacos inibi- doras de HIV protease comercializados também inibem o transportador de glicose a partir da localização para a membrana celular de adipócitos 3T3 LI, com a subsequente inibição da captação de glicose por estas células. Esta inibição do transporte de glicose celular em células por estes inibidores de HIV protease é consistente com a elevação da glicose e lípidos observada na clínica, para alguns pacientes tratados com estes fármacos inibidores de protease. Assim, agonistas e/ou moduladores positivos de ligação de insuli- na para INSR podem ser úteis para tratar os efeitos colaterais metabólicos dos inibidores de HIV protease.

A resistência à insulina também é uma das características pato- lógicas em pacientes com vírus da hepatite C (HCV) e desempenha um pa- pel crucial no desenvolvimento de complicações diversas e eventos associa-

dos à infecção por HCV (Kawaguchi e Sata, World J. Gastroenterol 16:1943- 52, 2010). Assim, agonistas e/ou moduladores positivos de ligação de insuli- na para INSR pode ser útil para o tratamento de complicações e eventos associados à infecção por HCV.

A sinalização de INSR pode também desempenhar um papel em outras doenças. Por exemplo, tem sido especulado que a sinalização de INSR/IGF-1R pode desempenhar um papel no metabolismo de beta-amilóide (Freude et al., Curr Alzheimer Res. 6 (3):213-23, 2009). A ativação de IR tem sido postulada como sendo um elemento essencial da neuroprotecção de fotorreceptor (Rajala et al., J. Biol. Chem. 283 (28):19781-92, 2008). À sinalização da insulina também foi sugerida como promovendo a formação óssea (Rosen e Motyl, Cell 142: 198-200). O tratamento com sensibilizado- res de insulina tem sido relatado para melhorar a função pulmonar em pa- cientes tanto com doença pulmonar obstrutiva crônica quanto com diabetes mellitus (Kim et al, Int. J. Tuberc Lung Dis 14 (3):362-67, 2010).

Alguns poucos pacientes com mutações no gene homozigótico de INSR foram descritos, os quais causam a síndrome de Donohue ou Leprechaunism. Este distúrbio autossômico recessivo resulta em um recep- tor de insulina totalmente não funcional. Esses pacientes têm orelhas muitas salientes, de inserção baixa, narinas dilatadas, lábios engrossados e grave retardamento do crescimento. Na maioria dos casos, as perspectivas para esses pacientes são extremamente pobres com a morte ocorrendo dentro do primeiro ano de vida. Outras mutações do gene INSR causam a síndrome de Rabson-Mendenhall menos grave, em que os pacientes têm dentes caracte- risticamente anormais, gengiva hipertrófica (gengivas) e aumento da glându- la pineal. Ambas as doenças apresentam-se com flutuações do nível de glicose: após uma refeição a glicose é inicialmente muito alta, e então cai rapidamente para níveis anormalmente baixos (Longo et al., Mol. Hum. Genet 11 (12):1465-1475, 2002).

Indicações Terapêuticas para Antagonistas de INSR /moduladores negativos O INSR também foi implicado no câncer. Vários estudos epide-

miológicos demonstraram que os estados de resistência à insulina, caracte- rizados por hiperinsulinemia, estão associados com um risco aumentado pa- ra uma série de doenças malignas, incluindo carcinomas da mama, próstata, cólon e do rim. O INSR, particularmente a forma INSR-A, é abundante em várias malignidades humanas. O INSR forma receptores híbridos com IGF- IR, que é também vulgarmente superexpresso no câncer. Os receptores híbridos contendo hemidímeros de INSR-A têm especificidade de ligação ampla na medida em que eles se ligam a IGF-| e também a IGF-ll e insulina. Ao ligar-se aos receptores híbridos, a insulina pode estimular vias de sinalização de IGF-IR específicas. Antagonistas e/ou moduladores negativos de ligação de insulina para INSR e/ou aos receptores de INSR/IGF-1R híbri- dos podem, portanto, ser úteis como novas terapias anticâncer (Belfiore Current Pharm Design 13(7):671-686, 2007). O INSR foi relatado como sendo essencial para a tumorigênese induzida por vírus de sarcoma de Kaposi (Rose et al., Onogene 26: 1995-2005, 2007).

A hiperinsulinemia é uma condição definida por níveis anormal- mente elevados de insulina no sangue. As causas de hiperinsulinemia in- cluem insulinoma e resistência à insulina, o que pode ser causado pela hiperinsulinemia congênita ou outras condições, tais como uma falta de atividade, obesidade, síndrome de ovário policístico ou overdose de insulina. Um insulinoma é um tumor do pâncreas, que produz quantidades excessivas de insulina. Altos níveis de insulina causam hipoglicemia, ou baixa glicose no sangue (açúcar). A hiperinsulinemia é a causa mais comum de hipoglicemia neonatal após as primeiras horas de vida. O tratamento de tal condição pode muitas vezes ser necessário para impedir o aparecimento das crises e sequelas neurológicas.

A sobredosagem de insulina pode ser causada, por exemplo, por: administração de muita insulina; administração de quantidade certa de insulina, mas o tipo errado, tal como a insulina de ação curta, em vez de insulina de ação prolongada; administração de insulina seguida por uma falha ao comer, ou pela superadministração de insulina intencional.

Em geral, a hipoglicemia pode ser leve e levar a sintomas como ansiedade e fome, mas os pacientes também estão em risco de hipoglicemia grave, que pode causar convulsões, coma e até morte. Os sintomas típicos associados com hipoglicemia que os pacientes se queixam são cansaço, fraqueza, tremedeira e fome. Muitos pacientes têm que comer com frequên- ciapara prevenir os sintomas do baixo açúcar no sangue. Alguns pacientes podem desenvolver sintomas psiquiátricos por causa do açúcar no sangue. Atualmente, os pacientes com insulinomas ou outras formas gra- ves de hiperinsulinemia são tratados por cirurgia, tais como pancreatectomia parcial ou por administração de medicamentos, tais como diazóxido ou so- —matostatina que em alguns casos reduz a produção de insulina. Em alguns Casos, a glicose deve ser infundida continuamente. Embora os antagonistas peptídicos de INSR tenham sido descritos (Schaífer et al., BBRC 376:380- 383, 2008), não há nenhum tratamento existente, que reduza os efeitos da insulina circulante. Antagonistas e/ou moduladores negativos de ligação de insulina para INSR podem ser úteis para a estabilização de pacientes com insulinomas antes da cirurgia ou como parte do arsenal terapêutico. Antago- nistas e/ou moduladores negativos são também úteis para o tratamento de sarcoma de Kaposi.

Além disso, um número significativo de pacientes (25.000-

100.000) nos EUA que se submetem a diálise apresenta hipoglicemia devido à insuficiência renal (doença renal crônica, doença renal crônica, insuficiên- cia dos rins crônica, insuficiência renal crônica, doença dos rins crônica estabelecida) e pode se beneficiar do tratamento com um antagonista ou modulador negativo de INSR descrito aqui.

Antagonistas e/ou moduladores negativos de ligação de insulina para INSR podem ser úteis para tratar e/ou reduzir a probabilidade do apa- recimento de distúrbios e sintomas relacionados com a hiperinsulinemia em um sujeito, tal como reduzir a ansiedade, fome anormal, fadiga anormal, superalimentação, sintomas psiquiátricas associados com baixo açúcar no sangue, e/ou hipoglicemia (incluindo hipoglicemia relacionada com convul- são, coma e morte). Antagonistas e/ou moduladores negativos de ligação de insulina para INSR podem, portanto, ser usados para tratar vários tipos de condições de hiperinsulinemia persistentes, tais como nesidioblastose (doença difusa de KATP-HI, doença focal de KATP-HI, ou "PHHI"), GDH-HI (Síndrome de hiperinsulinismo/hiperamoniemia (HI/HA), hipoglicemia sensí- vel à leucina, ou hipoglicemia sensível a diazóxido), síndrome de desregu- lação de células de ilhotas, hipoglicemia idiopática da infância, Hipoglicemia Hiperinsulinêmica Persistente da Infância (PHHI), Hiperinsulinismo Congêni- to, insulinoma, overdose de insulina, hipoglicemia devido à insuficiência re- nal (aguda ou crônica) e doença renal crônica, por exemplo, tipo Ill, IV ou V. Indicações de Diagnóstico para agonistas de INSR /moduladores positivos Os anticorpos específicos para o receptor de insulina têm sido usados como ferramentas para diagnosticar a diabetes. A Patente US

7.732.154 descreve anticorpos policlonais para subunidade A do receptor de insulina (IR-A) como um diagnóstico para a diabetes, e relata que os níveis elevados de IR-A livre foram detectados no soro de pacientes com diabetes e câncer. Os anticorpos de INSR divulgados aqui são úteis para medir o receptor de insulina, por exemplo, receptor-A de insulina solúvel, ou níveis de insulina em uma amostra de um paciente para determinar se os níveis de insulina ou INSR são indicativos de diabetes ou de resistência à insulina no paciente. Um sujeito com níveis alterados de insulina ou do receptor de insulina em comparação com níveis normais de aceitáveis destes fatores em um indivíduo saudável pode ter ou estar em risco de diabetes ou de resis- tência à insulina. Os anticorpos de INSR divulgados aqui são também úteis para medir o receptor de insulina, por exemplo, receptor A de insulina solú- vel ouos níveis de insulina em uma amostra de um paciente, para deter- minar se os níveis de insulina ou INSR são indicativos de câncer no pacien- te. Um sujeito com níveis alterados de insulina ou do receptor de insulina em comparação com os níveis aceitáveis de tais fatores em um indivíduo saudável pode ter ou estar em risco de câncer.

Em uma modalidade, a invenção fornece um método de diag- nóstico de resistência à insulina ou a sensibilidade à insulina usando qual- quer um dos anticorpos, tal como aqui descrito. Em uma modalidade, o mé-

todo compreende a medição dos níveis de insulina ou do receptor de insu- lina, por exemplo, receptor A de insulina solúvel, em uma amostra a partir de um sujeito, usando um anticorpo descrito aqui, em que o nível alterado de insulina ou do receptor de insulina indica que o sujeito tem ou está em risco de diabetes, resistência à insulina, sensibilidade à insulina ou câncer e, opcionalmente, administração de um terapêutico ao dito sujeito que tem ou está em risco de diabetes, resistência à insulina, sensibilidade à insulina ou câncer.

Em certas modalidades, a amostra é uma amostra biológica.

Em al- gumas modalidades, a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo em sangue, soro, plasma, urina, secreções papilares, fluido cefalorraquidia- no e biópsia do tumor.

Métodos de medição do receptor de insulina em uma amostra incluem, mas não estão limitados a, imunoensaios, ensaios de inibi- ção competitiva, ensaios de imunoprecipitação, e outros ensaios tais como descritos aqui.

Ensaios Úteis para Medir os Efeitos de Administração de Modulador Efeitos da administração de anticorpos moduladores positivos ou negativos para sujeitos são medidos in vivo e in vitro.

Em uma modalidade, é contemplado que os anticorpos que modulam positivamente atividade de receptor de insulina/insulina diminuem os níveis de HbAtc in vivo, colesterol, LDL, triglicerídeos, ou ácidos graxos não esterificados, e HDL em um sujeito.

Estes fatores são medidos usando técnicas comuns para os versados na técnica.

Os sujeitos que recebem um anticorpo modulador positivo tam- bém podem mostrar o peso reduzido ou ganho de peso reduzido em uma frequência diminuída e/ou o número de eventos hipoglicêmicos ou hipergli- cemia melhorados: razão de HDL/LDL, secreção de insulina, controle gli- cêmico (como medido por teste de tolerância à glicose (GTT)), sensibilidade à insulina, como medido por teste de tolerância à insulina (ITT)), função das células beta (como medido, por exemplo, por níveis de massa celular, secre- ção de insulina, peptídeo C), dormência de beta-célula, dislipidemia.

A resistência à insulina é medida pela expressão do gene nor- malizada de qualquer um dos seguintes no fígado, tecido adiposo e/ou mús-

culo: Pck1 (PEPCK), G6PC (G6Pase), Srebfl (SREBP-1), GCK (GK), Ppargceta (PGC- 1), ABCA1 (ABC-1), Acaca (acetil-CoA carboxilase), ILIB (IL-1beta), IL6 (IL-6), TNF (TNF-alfa), CCL2 (MCP-1), Slc2a4 (GLUTA4), |l- 1RN (lL-1ra), CD68, SAA1, SAAZ, FAS (sintase de ácido graxo), Emr1 (F4/80), IRS1,IRS2. Os acima são medidos por técnicas bem conhecidas no estado da técnica.

Ensaios in vitro também são úteis para medir os efeitos da admi- nistração de um modulador de atividade do receptor de insulina/insulina. Anticorpos moduladores positivos são esperados para resultar em transloca- ção aumentada de GLUTA4 para a superfície celular. Métodos para a medi- ção da translocação de GLUTA4 a partir de uma localização intracelular para a membrana plasmática são fornecidos, por exemplo, nos documentos US

6.632.924, US 2007/0141635, US 2003/0104490 e Liu et al., Biochem. J. 418(2), 413-20 (2009). Efeitos dos moduladores positivos podem também ser avaliados por análise de captação de glicose intensificada por células adiposas, do fígado e/ou musculares, depleção de glicose intensificada de meio de cultura de células adiposas, de fígado e/ou músculo, e medindo a razão de sinalização metabólica para INSR mitogênica aumentada ou inalterada, ativação de pAKT e ativação de PIRS-1. A inclinação de Hill relativa de interação de insulina - INSR também é mensurável. Algumas curvas de resposta à dose, no entanto, são mais íngremes ou rasas do que a curva padrão. A declividade é quantificada pela inclinação de Hill, também chamada um fator de inclinação. Uma curva de resposta à dose com uma inclinação padrão tem uma inclinação de Hill de 1,0. A curva mais íngreme tem um fator de inclinação maior e uma curva menor tem um fator de incli- nação menor. Exemplos de ensaios para analisar estes fatores são descritos nos Exemplos. Uso de anticorpos INSR como agentes de distribuição de fármacos Um anticorpo para INSR, 83-14, foi humanizado com a finalidade decriarum "cavalo de Tróia molecular" para fornecer proteínas e terapias de genes não virais em toda a barreira sangue-cérebro. A ligação 83-14 conduz à rápida internalização do INSR. Assim, anticorpos adicionais com esta pro-

priedade, ou propriedades melhoradas, podem ser úteis para a distribuição da droga para o cérebro e o sistema nervoso central (Boado et al., Biotech e Bioeng 96 (2):381-391; WO04/050016). Kits Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits compreendem um ou mais compostos ou composições empacotadas de uma maneira que facilita o seu uso para a prática de métodos da invenção. Em uma modali- dade, tal kit inclui um composto ou composição aqui descrito (por exemplo, uma composição compreendendo um receptor de insulina ou anticorpo es- pecífico para complexo de receptor insulina/insulina individualmente ou em combinação com um segundo agente), empacotado em um recipiente tal como uma garrafa ou vaso selado, com um rótulo afixado ao recipiente ou incluído no pacote que descreve o uso do composto ou composição na prá- tica do método. Preferencialmente, o composto ou composição é empaco- tado em uma forma de dosagem unitária. O kit pode ainda incluir um dis- positivo adequado para administração da composição de acordo com uma via de administração específica ou para a prática de um ensaio de rastreio. Preferencialmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso da compo- sição de anticorpo.

Os aspectos adicionais e características da invenção serão evi- dentes a partir dos exemplos seguintes, que se destinam a ser ilustrativos e não limitativos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Isolamento de Anticorpos anti-INSR de Bibliotecas de Exibição de Fagos (1)Recuo e Panning de Fago A. Biblioteca de Exibiçao de Fagos de Anticorpos Naive O receptor de insulina humana (hINSR) (R & D Systems, MN) foi biotinilado com Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Rockford, IL) usando o proto- colo do fabricante e excesso molar de 16 vezes de reagente de biotina. A biotinilação de hINSR foi confirmada por ressonância de plasmon de super-

fície (SPR).

Para a primeira rodada de panning de fago, 1,6 x10" ufc de partículas de fago de um biblioteca de exibição de fagos scFv (Biolnvent, Lund, Suécia) foram bloqueadas durante 1 h à temperatura ambiente (RT), em1mlde 5% de |leite/PBS (Teknova, Hollister, CA) com rotação suave. Os fagos bloqueados foram duas vezes deselecionados durante 30 minutos contra Dynabeads& M-280 magnéticas revestidas com Estreptavidina (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Noruega). Para formar o complexo de biotina- hINSR-hINS, 100 pmoles de hIiNSR biotinilado foram pré-incubados com excesso de insulina humana (2.100 pmoles) (hINS) (Sigma, MO) dissolvido em 5% de leite/PBS, durante 1 h à RT, com rotação suave. Para a segunda rodada de panning, 50 pmol de biotina-hiNSR foram usados com 1050 pmoles de hINS. Para a rodada final de panning, 25 pmol de biotina-hiNSR foram incubados com 525 pmoles de hINS.

A solução de biotin-hiNSR/hINS foi incubada com bloqueados Dynabeads& M-280 magnéticas revestidas com Estreptavidina (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Noruega) durante 30 minutos com rotação suave, a fim de imobilizar o complexo de biotina-hiNSR-hlNS. Os fagos deselecionados foram incubados com as esferas de biotina-estreptavidina hiNSR-hINS por 2hàRT.Afim de saturar o hIiNSR com hINS, hINS adicional (2.100 pmoles) foi adicionado à solução. As esferas foram lavadas. Para a primeira rodada de panning, as esferas foram rapidamente lavadas (isto é, esferas foram puxadas para fora da solução usando um ímã e ressuspensas em 1 ml de tampão de lavagem), três vezes com PBS-01% de TWEEN, seguido por três vezes com PBS. Para a segunda rondade de panning, as esferas foram rapidamente lavadas cinco vezes com PBS-0,1% de TWEEN, seguido por uma lavagem de 5 minutos (em 1 ml de tampão de lavagem à temperatura ambiente com rotação suave) com PBS-0,1% de Tween e, em seguida, cin- co vezes com PBS, seguido por uma lavagem de 5 minutos com PBS. Para aterceira rodada de panning, as esferas foram rapidamente lavadas quatro vezes com PBS-0,1% de TWEEN, seguido por duas lavagens de cinco minu- tos com PBS-0,1% de TWEEN e, em seguida, quatro lavagens rápidas com

PBS, seguido por duas lavagens de 5 minutos com PBS.

Os fagos ligados a hiINSR-hINS foram eluídos com 100 mM de trietilamina (TEA) (30 minutos de incubação a RT), que foi então neutrali- zada com IM de Tris-HCIl (pH 7,4). Os fagos eluídos foram usados para infectar células bacterianas TG1 (Stratagene, CA) quando atingiram um ODsçoo de - 0,5. Após a infecção, durante 30 min a 37ºC sem agitação, e durante 30 min a 37 ºC com agitação a 90 rpm, as células foram peletizadas e ressuspensas em meios 2YT suplementados com 100 ug/ml de ampicilina e glicose a 2%. As células ressuspensas foram plaqueadas em placas de ágar 2YT com 100 ug/ml de carbenicilina e de glicose a 2% e incubadas durante a noite a 30ºC.

O fago foi então resgatado com o fago auxiliar VCOSM13 (New England Biolabs, MA) a uma multiplicidade de infecção (MOI) - 10. Após a infecção fago auxiliar a um ODgoo de 0,6 a 37 ºC durante 30 min sem rotação es30minde incubação de a 37ºC a 150 rom, os peletes de células foram ressuspensos em meios 2YT suplementados com 100 ug/ml de ampicilina e 50 ug/ml de canamicina e deixados crescer durante a noite a 30ºC. Os fagos no sobrenadante foram recuperados após centrifugação rigorosa e usados para a próxima rodada de panning. A fim de monitorar o enriquecimento resultante das seleções de fagos, a quantidade de entrada e saída de fagos foi titulada para as três rodadas de panning. Geração e excisão de Gene Ill de extratos de bactérias periplásmicas Antes do rastreio dos clones scFv de saída de panning de fago para ligação a um complexo de hINSR-hINS, o gene Ill foi primeiro excisado a partirdos vetoress de fagemídeos para permitir a produção de scFv segre- gado. A fim de fazer isso, um plasmídeo midi prep (Qiagen, Valência, CA) do pool de saída da terceira rodada de panning de clones foi digerido com a enzima de restrição Eagl (New England Biolabs, MA). O produto de digestão sem o gene Ill foi então deixado auto-ligar com T4 DNA ligase (New England Biolabs, MA) e usado para transformar quimicamente células de E. coli TOP10 competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Colônias individuais trans- formadas em placas de 96 poços foram então usadas para gerar extratos bacterianos periplasmáticos acordo com métodos padrões, com uma razão de volume de 1:3 de solução PPB resíriada com gelo (Teknova, Hollister, CA) e água duplamente destilada (ddH2O) e dois comprimidos de coquetel de inibidores de protease (Roche, IN). Os sobrenadantes de lisados foram analisados por ELISA como descrito abaixo.

B.

Bibliotecas de exibição de fagos de anticorpos imunizados Uma biblioteca de exibição de fagos Omniclonal”” foi gerada a partir de camundongos hiperimunizados com complexo de hIiNSR-hIlNS de acordo com os métodos descritos no US 6.057.098. O material de imuniza- ção consistiu em aproximadamente quantidades molares iguais de insulina humana recombinante (cat t 19278, Sigma-Aldrich, Inc.

St.

Louis, MO) e INSR Humano recombinante (28-956) (cat t 1544-IR/CF, R&D Systems, MN). A concentração de proteína do complexo foi de cerca de 0,24 mg/ml.

As colônias únicas, obtidas a partir da biblioteca de Omniclonal”Y de acordo como protocolo em Patente US 6.057.098, foram rastreadas para tividade de ligação em um ensaio ELISA como descrito abaixo. (2) Rastreamento por ELISA de clones de anticorpos no complexo de hINSR/hINS Placas de ELISA MaxisorpÊwl (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) foram revestidas durante a noite a 4ºC com 3 ug/ml de hINSR em PBS.

As placas foram então bloqueadas durante 1h à RT com 400 ul/poço de leite/PBS a 5%. Para gerar poços contendo o complexo de hINSR-hINS, 50 ul/poço de hINS (2,1 uM) foram deixados se ligar ao hiNSR durante 30 min à RT.

Extratos periplasmáticos bacterianos também foram bloqueados com leite/PBS a 5% durante 1 hora e, em seguida, adicionados à placa de ELISA revestida (50 ul/poço) e deixados se ligar ao complexo hINSR-hINS ou hIlNSR sobre a placa de ELISA durante 2h à temperatura ambiente.

O mAb anti-hiNSR 83-7 de murino foi usado como um controle positivo de rastreio ELISA (Soos et al., Biochem J. 235:199-208, 1986). Fragmentos scFv ligados foram detectados com mAb anti-c-myc de murino (Roche, IN) durante 1 h à RT seguido por anti-soro conjugado com HRP de cabra anti-camundongo (Thermo Scientific, Rockford, IL). Três lavagens com

PBS-0,1% de Tween-20 (Teknova, Hollister, CA) foram realizadas seguindo cada estágio das triagens de ELISA. O mAb 83-7 de controle positivo foi detectado por HRP de cabra anti-camundongo (Thermo Scientific, Rockford, IL) após incubação durante 1 h à RT. A cor foi desenvolvida em absorvância de450nmcom 50 ul/poço de substrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidino solú- vel (TMB) (EMD Chemicals, Calbiochem, NJ) e interrompida com H2SOs1M (50 ul/poço). Resultados O rastreamento por ELISA de extratos perisplásmicos bacteria- nos identificou múltiplos ligantes de complexo de hINSR-hINS ou hINSR que se originaram a seleção de panning de fagos. Cinquenta e oito por cento (868 de 1.488) dos clones selecionados da biblioteca de naive eram capazes de se ligar ao complexo de hINSR-hIlNS ou hINSR. Quarenta e três por cento (200 de 465) dos clones selecionados a partir da biblioteca imunizada foram capazes de se ligar ao complexo de hINSR-hINS ou hINSR.

Extratos periplasmáticos dos clones selecionados foram também ensaiados por FACS (ver Exemplo 2). Os clones selecionados foram refor- matados como anticorpos de IgG1 ou IgG2. As cadeias pesada (VH) e leve (VL) variáveis dos fragmentos de scFv selecionados foram amplificadas por PCR, clonadas nos vetores de plasmídeo contendo genes constantes de anticorpos, e transfectadas em células 298E EBNA humanos usando méto- dos padrões.

EXEMPLO 2 Rastreio de ocupação do receptor para determinar a ligação do anticor- poalNSR na presença ou ausência de insulina humana Este exemplo descreve o uso de ensaios baseados em citome- tria de fluxo (FACS) para medir a ligação de anticorpo diferencial às células na ausência ou presença de insulina humana (hINS). Anticorpos de recep- tores anti-insulina (INSR) de bibliotecas de exibição de fagos foram selecio- —nados nos ensaios para identificar moduladores de ligação INS-INSR.

As células IM-9 foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas em RPMI 1640 + 10% de FBS. Antes do uso em ensaios, as células foram lavadas em RPMI 1640 livre de soro, contadas e a concentração ajustada para 2x10º células /mML em meio RPM! 1640 + 0,5% de BSA (Sigma-Aldrich). As células foram cultivadas durante a noite neste meios, e como tal, foram designadas como "privadas de soro". Estas —célulasforam lavadas uma vez e ressuspensas a 2x10º células/ml em PBS contendo 0,5% de BSA e azida de sódio a 0,01% (tampão FACS). As células expostas à insulina foram ressuspensas em tampão FACS suplementado com insulina humana 70nM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Ambas as populações de células (+ hIlNS) ou (-hINS) foram incubadas a4ºC durante 30 minutos, lavadas uma vez com tampão FACS e ressuspen- sas a 2x10º células/mL em tampão de FACS. Vinte e cinco microlitros de alíquotas de células foram plaqueados em placas de 96 poços, misturados com 25ul de anticorpo ou PPE e incubados em gelo durante 1 h. As células foram então lavadas uma vez com tampão FACS e a ligação do anticorpo foi detectada pela adição de 25ul de um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo adequado. Se a incubação inicial foi com PPE contendo um anticorpo marcado com myc, 25ul de uma diluição 1/1000 de um anticorpo anti-c-myc (Roche) foram adicionados aos poços e as células incubadas em gelo durante 30 minutos. As células foram então lavadas uma vez com tampão FACS e a ligação do anti-c-myc revelada pela adição de uma IgG anti- camundongo conjugada a ficoeritrina. Após uma incubação final de 15 min em gelo, as células foram lavadas e os péletes ressuspensos em tampão de FACS. As células foram analisadas em um FACSCAN'" (Becton-Dickinson, Milipitas, CA) e os dados analisados em —FLOWJO'"Y (Treestar, Ashland, OR) e Microsoft Excel". Este ensaio permitiu a detecção de quatro tipos de anticorpos, exemplos dos quais são mostrados na figura 1:

1. Anticorpos que se ligam apenas às células IM-9 se tiverem sido expostos à insulina humana (ligam-se exclusivamente ao complexo de —INS/INSR);

2. Anticorpos que se ligam melhor às células IM-9 se tiverem sido expostos à insulina humana (ligam-se preferencialmente ao complexo

INS/INSR);

3. Anticorpos que se ligam menos bem às células IM-9 se tive- rem sido expostos à insulina humana (ligam-se preferencialmente a INSR não complexado).

Os anticorpos foram pontuados como moduladores positivos previstos se a razão entre a ligação do anticorpo ao complexo de INS/INSR: ligação de anticorpo a INSR não complexado foi maior do que 1,3. Os antibodies foram pontuados como moduladores negativos previstos se a razão de ligação de anticorpo para complexo de INS/INSR: ligação do anticorpo a INSR não complexado foi inferior a 0,6. Os anticorpos foram pontuados como não moduladores previstos se a razão entre a ligação do anticorpo ao complexo de INS/INSR: ligação do anticorpo a INSR não complexado foi maior do que 0,9 mas menor que 1,1.

EXEMPLO 3 Rastreamento de ligante biotinilado para determinar os efeitos de anticorpos anti-INSR sobre a ligação de insulina a INSR Este exemplo descreve o uso de ensaios baseados em FACS para medir a ligação a ligante diferencial (insulina humana) para células na ausência ou presença de anticorpos anti-I|NSR. Anticorpos anti-INSR de bi- bliotecas de exibição de fagos foram rastreados nos ensaios para identificar moduladores do complexo de INS-INSR.

As células MI 9 foram obtidas a partir de American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas em RPMI 1640 + 10% de FBS. Antes do uso em ensaios, as células foram lavadas em RPMI 1640 livre de soro, contadas ea concentração ajustada para 2x10º células/ml. em meio RPMI 1640 + 0,5% de BSA (Sigma-Aldrich). As células foram cultivadas durante a noite neste meios e como tal, foram designadas como "privadas de soro" Estas células foram lavadas uma vez e ressuspensas a 2x10º células /mL em PBS contendo 0,5% de BSA (tampão de ligação).

As células privadas de soro foram pré-expostas a anticorpos de INSR à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, incubadas com várias concentrações de insulina humana biotinilada adquirida a partir de R&D Systems durante mais 30 minutos à temperatura ambiente.

A ligação da insulina biotinilada foi revelada pela adição de uma diluição 1/100 de estreptavidina-ficoeritrina a esta mistura durante mais 15 minutos à temperatura ambiente.

As células foram então lavadas uma vez com tampão de ligaçãoe ressuspensas em volumes iguais de PBS contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida de sódio e 2% de paraformaldeído.

As células foram analisadas em um FACSCAN'Y" (Becton-Dickinson, Milipitas, CA) e os dados analisados em FLOWJO"Y" (Treestar, Ashland, OR) e Microsoft Excel”. A figura 2 mostra a ligação da insulina biotinilada para células IM9 na ausência ou presença de anticorpos anti-|NSR em diferentes concentrações de insulina.

O anticorpo 83-7 intensificou a ligação de insulina biotinilada; o anticorpo MA-20 diminuiu a ligação de insulina biotinilada; o controle de IgG de camundongo não teve efeito sobre a ligação da insulina biotinilada.

EXEMPLO 4 Ensaio para determinar a capacidade de anticorpos anti-INSR para estimular a fosforilação de pIRS-1 As proteínas de substrato que são fosforiladas por INSR incluem uma proteína chamada de substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1). À fosforilação do IRS-1 para formar plRS-1 eventualmente leva a um aumento nas moléculas de transportador de glicose de alta afinidade (Glut4) na membrana externa dos tecidos responsivos à insulina e, portanto, a um au- mento na absorção de glicose do sangue para estes tecidos.

Um ensaio de pIRS-1 foi desenvolvido usando a plataforma de tecnologia Luminex6 (Lu- —minex Corp., Austin, TX). Dois modos de ensaio foram desenvolvidos: (a) titular anticorpos teste a uma concentração fixa de insulina e (b) titular a insulina a uma concentração fixa de anticorpo.

Anticorpos anti-I|NSR selecio- nados em função da sua ligação diferencial ao INSR complexado e não complexado foram testados nos ensaios para identificar moduladores do complexo de sinalização INS-INSR.

Tratamento da célula e lise Células IM-9 foram privadas dos nutrientes do soro durante 16-

20 horas por contagem, centrifugação, lavagem com PBS e ressuspensão a cerca de 2x10º células/ml! em RPMI + 0,5% Sigma Cohn V BSA (10% esto-

que em RPM, esterilizado por filtração, armazenado a 4ºC). Diluições de soluções concentradas 2X de insulina (Sigma |- 9278 (10mg/ml) 1,77mM estoque líquido armazenado a 4ºC) foram prepa- radas em RPMI +0,5% BSA.

Uma titulação de insulina padrão pode incluir diluições em série de 4 vezes de por exemplo: 6,25nM, 1,56nM, 0,39nM,

0,097nM, 0,024n0M, 0,006nM, 0,0015nM, ONM.

Tampão de Sinalização Celular Milliplex MAP e Kit de Detecção (catálogo Millipore % 48-602) e Phospho-IRS-1 MAP Mates (catálogo Millipore f 46-627) foram empregados para a detecção de níveis de plIRS-1, de acordo com as instruções do fabricante.

Brevemente, placas com fundo V contendo 50ul/poço do meio de tratamento 2X (RPMI contendo 0,5% BSA +/-teste de anticorpo) foram preparadas e 1 x 10º células privadas de soro IM-9ressuspensas em 50ul RPMI+0,5% BSA foram adicionados por poço.

O pré-tratamento do anticorpo foi realizado durante 15 minutos antes do tratamento de insulina, (a) como uma mistura de anticorpo/célula em uma única concentração de anticorpo que foi então aplicada em poços contendo diluições em série de insulina, ou (b) pela adição de células diretamente nos poços contendo diluições em série do anticorpo e inoculação em insulina a O, 1nM.

As placas foram colocadas em uma incubadora a 37ºC e centri- fugadas a 1500rpm em RT durante os últimos 3 minutos do tempo de trata- mento (total de 15 minutos). O sobrenadante foi removido por inversão e o blotting suave e péletes de células tratadas foram posteriormente lisados por trituração 3 vezes com uma pipeta de múltiplos canais com tampão de lise de 100ul preparado de acordo a Tabela 4 abaixo (os componentes instáveis, ou seja, os inibidores de protease e benzonase, foram adicionados imediata- mente antes do uso). As placas foram colocadas em um agitador em RT durante 30 minutos e centrifugadas a 3000 rpm durante 10 minutos para clarificarolisado e remover quaisquer bolhas de ar que possam ter ocorrido durante a trituração. 50ul de lisado clarificado foram removidos e diluídos 1:1 em 50uL de Tampão de ensaio-1 (AB-1) de um Kit de detecção, triturados de

2-3 vezes para misturar e 50ul foi carregado em uma membrana de placa de filtro sobre os 25ul/poço das esferas diluídas (ver abaixo). Tabela 4:Componentes do tampão de lise 10 20 25 30 40 50 60 100 Tampão de lise poços poços poços poços poços poços poços poços t1ml 2ms 25ms 3mls 4mls 5mls 6mils 10mls Tampão de lise (Millipore cat. f 43- 040) 1 2 25 3 4 5 6 10 SDS 20% estoque —/0,045 0,09 0,1125 0135 018 0225 027 045 MgCl 50mM (Invitro- gencat $ Y02016) | 0,02 0,04 0.05. 006 008 01 012 02. Inibidores de pro- tease (50X) (Millipo- re cat. 4 20-201) 002 004 005 006 008 OI 012 o2 Benzonase EMD 1,01697,0002 — QE 250ug/ml 0,004 0,008 001 0012 0016 002 0024 0,04 Membranas de placa de filtro (Catálogo Milliporett MABVN1250) foram pré-umedecidas com 25ul AB-1/poço.

O tampão de pré-umedecimento foi aspirado da placa de filtro usando um tubo de vácuo Millipore, tomando cuidado para as membranas não secarem, e qualquer líquido restante foi aplicado da parte inferior da placa de filtro. 25ul da suspensão de esferas 1X foram acrescentados por poço (esferas de plRS-1 (Catálogo Millipore * 46- 627) foram pré-preparados por diluição da concentração de 20X em tampão AB-1 e, alternadamente, vórtex e sonicação durante 5 segundos 3 vezes cada). Os poços de placa de filtro foram cobertos com um selador de placa, coberto em papel alumínio para evitar a exposição à luz e incubados em um agitador de placa (configuração de 7-8 em uma placa de agitação Labline, Bellco ou modelo similar) em RT durante 2 horas ou alternativa- mente a 4ºC durante a noite.

Detecção Luminex As placas de filtro foram aspiradas e suas partes inferiores apli- cadas. As esferas permaneceram no poço e foram lavadas com 100ul de AB-1 e colocadas no agitador durante 1-2 minutos. As placas foram aspira- das,eaetapade lavagem foi repetida.

25ul por poço de 1X de anticorpo de detecção biotinilado, diluído de um estoque 20X em um tampão AB-1, foram adicionados e as placas foram incubadas em um agitador em RT durante 1 hora. As placas foram aspiradas e suas partes inferiores aplicadas. 25ul por poço de 1X de estrep- tavidina ficoeritrina, diluídos de um estoque 25X em um tampão AB-1, foram adicionados e as placas foram incubadas em um agitador em RT durante 15 minutos. 25ul de Tampão de Amplificação (Millipore Catálogo % 48-602) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas em um agitador em temperatura ambiente por mais 15 minutos. As placas foram aspiradas e as esferas foram ressuspensas em 150uL de AB-1 e lidas no instrumento Luminex O.

Resultados A figura 3 mostra os resultados do ensaio plRS-1 das titulações de insulina na presença de concentrações fixas de anticorpos teste repre- sentativos. MFIs foram normalizados de forma que o máximo ajuste de curva foi ajustado para 100%. Alguns anticorpos (moduladores positivos) se deslo- caram da curva de titulação da insulina para a esquerda. Outros anticorpos (moduladores negativos) se deslocaram da curva de titulação da insulina para a direita. Variadas magnitudes de modulação foram observadas. Os dados da figura 3 mostram anticorpos produzindo um aumento de até 9 vezes, ou uma diminuição de até 24 vezes na sensibilidade à insulina.

A figura 4 mostra exemplos representativos das diversas classes funcionais de anticorpos com base nos dados do ensaio plRS-1. Em cada caso, são mostrados resultados dos dois modos do ensaio: (i) titular insulina a uma concentração fixa de anticorpo, e (ii) titular anticorpos teste a uma concentração fixa de insulina.

A figura 5 é uma tabela mostrando os valores EC50 de insulina do ensaio plRS-1 na presença ou ausência de concentrações fixas de diver- sos anticorpos teste. Os resultados são classificados de acordo com a rela- ção EC50 +Ab/-Ab. EXEMPLO 5 Medição dos efeitos de anticorpos anti-|NSR em fosforilação induzida por INSR de AKT e MAPK O INSR é uma tirosina quinase que sofre autofosforilação após a ligação da insulina e posteriormente catalisa a fosforilação de proteínas intracelulares, como membros da família do substrato de receptor de insulina (IRS), Shc e Gab1. Cada uma destas proteínas serve como um local de encaixe para o recrutamento de moléculas de sinalização a jusante, resul- tando na ativação de diversas vias de sinalização incluindo as vias PI(S)JK/AKT e MAP quinase (MAPK). Estas vias ainda coordenam a regula- ção do crescimento celular e diferenciação, expressão gênica, síntese de glicogênio, proteínas e lipídios e metabolismo da glicose.

Os efeitos de um anticorpo teste na sinalização através do com- plexo INS/INSR podem ser medidos pela avaliação da capacidade do anticorpo para aumentar a serina induzida por insulina ou fosforilação da tirosina de proteínas intracelulares específicas, como AKT e MAPK (ERK1/2), que são específicas para a via de sinalização de INSR. A fosforila- ção destas proteínas pode ser medida e quantificada por eletroquimiolumi- nescência, Western blotting, ELISA e outras técnicas conhecidas.

Neste ensaio de exemplo, células CHOK1, projetadas para expressar o INSR humano ou de camundongo, foram usadas. Essas células foram mantidas em Meio de Cultura contendo Meio Isento de Soro EX-CELL 32 para células CHO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 2 mM L-glutamina e 0,4 mg/mL GENETICIN & (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células CHOK1 paren- tais foram usadas como um controle e foram mantidas em Meio de Cultura sem GENETICINGO.

No dia antes do ensaio, as células foram lavadas com PBS, ressuspensas a 1 x 10º células/mlL em meio de privação de nutrientes con- tendo RPM! 1640 (Invitrogen), 2 mM L-glutamina, 0,4 mg/ml GENETICIN O e 0,5% BSA e incubadas durante 16-20 horas em uma incubadora a 37ºC, 5% CO,». As células CHOK1 parentais foram incubadas em meio de privação de nutrientes sem GENETICIN €. No dia seguinte, as células foram res- suspensas em PBS com 0,5% BSA e 1 x 10º células foram adicionadas aos — poços de uma placa de 96 poços. O anticorpo teste foi adicionado a O, 1 ou ug/ml, aproximadamente 10 minutos antes da adição da insulina. Após incubação durante 5-60 minutos em uma incubadora a 37ºC, 5% CO,, as células tratadas foram centrifugadas e lisadas em um tampão contendo 20 mM Tris-HCIl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 10 1% Triton X-100, 10 mM de NaF, Coquetéis Inibidores de Fosfatase 1 e 2 (Sigma-Aldrich) e Inibidor de Protease Complete Mini (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) durante 1 hora com agitação a 4ºC. Os lisados foram clarificados por centrifugação a 485 x g durante 3 minutos. Eletreoqui- mioluminescência usando o MesoScale Discovery Multi-spot Assay System (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) foi usada para quantificar a quan- tidade de AKT fosforilado ou MAPK presente no lisado. Dados foram anali- sados usando o software GraphPad Prism & (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) para calcular valores de EC50 de uma equação logística de 4 parâmetros.

Para análise de atividade agonista, o ensaio foi realizado como segue. No dia antes do ensaio, as células foram lavadas com PBS, ressus- pensas a | x 10º células/ml em meio de privação de nutrientes contendo RPMI 1640 (Invitrogen), 2 mM L-Glutamina, 0,4 mg/ml GENETICINÔ e 0,5% BSA e incubadas durante 16-20 horas em uma incubadora a 37 ºC, 5% CO».

Ascélulas CHOK1 parentais foram incubadas em meio de privação de nutri- entes sem GENETICIN &. No dia seguinte, as células foram ressuspensas em PBS com 0,5% BSA e 1 x 10º células foram adicionadas aos poços de uma placa de 96 poços. Após incubação com anticorpo teste durante 5-60 minutos em uma incubadora a 37ºC, 5% CO;,, as células tratadas foram centrifugadas e lisadas em um tampão contendo 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1% Triton X-100, 10 MM de NaF, Coquetéis Inibidores de Fosfatase 1 e 2 (Sigma-Aldrich) e Inibidor de Protease Complete Mini (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) durante 1 hora com agitação a 4 º C. Os lisados foram clarificados por centrifugação a 485 x g durante 3 minutos. Eletreoquimioluminescência usando o MesoScale Discovery —Multi-spotAssay System (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) foi usada para quantificar a quantidade de AKT fosforilado ou MAPK presente no lisado. Dados foram analisados usando o software GraphPad Prism & (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) para calcular valores de EC50 de uma equação logística de 4 parâmetros.

A figura 6 mostra resultados de ensaio pAKT para representan- tes de anticorpos de: (A) moduladores positivos (aumentam a transdução de sinal induzida por insulina); (B) moduladores positivos com agonismo (aumentam a transdução de sinal induzida por insulina e aumenta a transdu- ção de sinal independente de insulina) (C) não moduladores (nenhum efeito significativo na transdução de sinal induzida pela insulina); (D) agonistas (aumentam a transdução de sinal independente de insulina; podem ou não ter atividade modulatória) (E) moduladores negativos (diminuem a transdu- ção de sinal induzida por insulina). Os resultados do ensaio também indicam se os anticorpos mostram reatividade cruzada funcional, ou seja, se têm efeitos sobre a sinalização mediada por INSR em ambos humanos e camun- dongos.

EXEMPLO 6 Anticorpos anti-|NSR apresentam um espectro de agonismo O ensaio plRS-1 do Exemplo 4 e o ensaio pAKT do Exemplo 5 foram usados para medir o grau de agonismo dos anticorpos anti-|NSR sele- cionados. Em vez de usar as titulações de anticorpos ou insulina, 5 ug/ml de anticorpo de anti-|NSR foram adicionados ao ensaio na ausência de insulina. O ensaio mede o nível da ativação induzida pelo anticorpo da sinalização através de INSR na ausência de insulina (agonismo).

A figura 7 mostra resultados tabulados para ilustrar que os anticorpos selecionados apresentam um espectro de agonismo.

EXEMPLO 7

Mudança na cooperatividade de ligação da insulina ao INSR efetuada por um anticorpo INSR modulador positivo O ensaio pAKT do Exemplo 5 foi realizado em um dos anticor- pos moduladores positivos, usando diversas concentrações de anticorpos e adicionando uma diluição em série de insulina. Os resultados são mostrados na figura 8. A figura 8A mostra que há uma resposta à dose de ligação de INSR na presença de diferentes concentrações de anticorpos e insulina. A figura 8B mostra o declive de Hill relativo da interação de insulina-INSR na presença de concentrações variáveis de anticorpos.

EXEMPLOS Aumento da absorção de glicose por um anticorpo INSR modulador positivo Os efeitos de um anticorpo INSR modulador positivo na absor- ção de glicose em adipócitos 3T3-L1 foram medidos. Após tratamento com insulina, INSR é fosforilado, ativando uma via de transdução de sinal que leva a maior absorção de glicose pelo transportador de glicose 4 (GLUTA4) em adipócitos (gordura) ou miócitos (músculo). Medir a absorção de glicose fornece um ensaio de ponto final relevante para a sensibilidade à insulina. Um ensaio usando ºH-2-deoxiglicose como substrato para GLUTA4 foi empregado (Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC). Breve- mente, pré-adipócitos 3T3-L1 foram diferenciados em isoplates de 96 poços. Após a maturação, as células foram lavadas 2 vezes com tampão de ensaio e as células repousaram em tampão de análise durante 4 horas. As células foram tratadas com anticorpos anti-|NSR, ou anticorpo controle (10 u g/ml) e concentrações em série de insulina ou insulina a 0,8 nM durante 15 minutos. Depois de 15 minutos, a absorção de glicose foi iniciada pela adição de coquetel de *H-2-deoxiglicose e as células foram incubadas a 37ºC, 5% CO, durante 10 minutos. Após 10 minutos, as células foram lavadas com PBS, lisadas e misturadas com o líquido de cintilação. O CPM de cada poço foi — medido. Citocalasina B (10uM) foi usada como um controle negativo. Os resultados são mostrados na figura 9. A figura 9 mostra a melhoria na absorção de glicose dependente de insulina por um anticorpo modulador positivo. O anticorpo modulador positivo resulta em aproximada- mente um aumento de 2 vezes na absorção de ?H-2-deoxiglicose por célula 3T3-L1 na presença de anticorpo teste ADOO01 10 ug/ml em comparação à insulina sozinha.

Estes resultados sugerem que antibodes moduladores positivos são úteis para induzir a absorção de glicose in vivo e tratar os pacientes com resistência à insulina.

EXEMPLO 9 Medição dos efeitos de anticorpos anti-INSR na depleção de glicose em meio de cultura de células A depleção de glicose do meio de cultura celular pode ser usada como uma medida substituta da absorção de glicose. Efeitos de anticorpos anti-|NSR na depleção de glicose no meio é medida da maneira que segue. Para medir a depleção da glicose, um autokit de glicose Wako (Cat 439-90901, Autokit C) é usado de acordo com as instruções do fabri- cante. Brevemente, linhagens celulares CHOK1 adaptadas para aderente com DMEM +10% FBS em placas de 24 ou 96 poços são plaqueadas em uma concentração adequada. As células são privadas de soro e glicose durante a noite em 0,5% BSA DMEM (sem glicose) antes do uso. O meio de privação de nutriente é aspirado e o meio com a seguinte constituição é adicionado na presença e na ausência de anticorpo teste ou anticorpo de controle de isotipo: grupo 1, 4 partes DMEM sem glicose:1 parte DMEM alta glicose (0,9 mg/mL); grupo 2, 4 partes DMEM sem glicose:1 parte DMEM alta glicose (0,9 mg/mL) + insulina. Em cada ponto de tempo desejado, amostras de 2ul de meio de cada poço são removidas e adicionadas a 118 uL da solução de trabalho Wako. Em algumas modalidades, amostras são tomadas em O, 1, 2-5, 5, 10 e 24 horas. A absorção de glicose é avaliada com o FLEXSTATION na absorvância de 505nm e 600nM. A quantidade de glicose é determinada como segue: [Média da leitura para amostras seme- lhantes/[média de leitura para padrões]. A contagem de células é obtida antes e no final do experimento para normalizar o crescimento celular. EXEMPLO 10

Medição dos efeitos de anticorpos anti-INSR sobre o equilíbrio entre a sinalização INSR mitogênica e metabólica Sinalização INSR através de duas vias principais (1) a via PI3 quinase/PDK1/PKB que regula primariamente o metabolismo, com alguma influência sobre o crescimento e (2) a via mitogênica Ras/ERK que regula primariamente o crescimento celular.

Os efeitos dos anticorpos anti-INRS sobre o equilíbrio entre a sinalização INSR mitogênica e metabólica é medi- da conforme descrito na técnica.

Ver, e.9g., Jensen et al. (Vitam Horm. 80:51- 75, 2009), De Meyts e Shymko, (Novartis Found.

Symp. 227:46-57, 2000); e Rakatzietal. (Diabetes 52:2227-2238, 2003). EXEMPLO 11 Medição dos efeitos in vivo de anticorpos anti-|NSR Anticorpos anti-|NSR que apresentam reatividade cruzada com INSR de camundongo são medidos em um número de modelos in vivo.

No modelo DIO, camundongos machos C57BL/6J (B6) (The Jackson Labora- tory, Maine) são alimentados com uma dieta rica em gordura (HFD) durante doze semanas, tornando-se obesos, levemente a moderadamente hipergli- cêmicos e tolerância à glicose comprometida.

Este modelo é usado para avaliar a capacidade de anticorpos INSR afetarem a sensibilidade à insulina emum ajuste cenário firmemente controlado.

Este sistema também permite uma comparação direta da ação e modulação de INSR sob condições nor- mais versus doentes.

Neste experimento, camundongos DIO ou B6 com idade pareada são administrados com anticorpos INSR 24 horas antes da administração de uma dose submáxima pré-definida de insulina em um teste de tolerância a insulina (ITT). Controle com IgG ou insulina máxima servem como controles negativos e positivos, respectivamente.

A responsividade à insulina é avaliada pela medição de glicose do plasma; uma maior diminui- ção da glicose durante 60 minutos é sugestiva de uma maior resposta INSR.

Em um estudo separado, camundongos DIO ou B6 são administrados com anticorpos 24 horas antes de um teste de tolerância a glicose (GTT). Por esta medida, a diminuição da glicemia de jejum e a área sob a curva (AUC) indica sensibilidade à insulina melhorada.

Dois modelos murinos são usados para avaliar o impacto de anticorpos INSR na progressão de diabetes tipo 2. Camundongos ob/ob (The Jackson Laboratory, ME) são deficientes de leptina, tornando-se obe- Sos e apenas levemente hiperglicêmicos devido à hiperinsulinemia compen- satória.

Neste modelo, animais recebendo anticorpos INSR começando na 6º semana de idade ou rosiglitazona (agonista PPAR-gama), um agente mostrado anteriormente que demonstrou melhorar o controle glicêmico des- ses animais.

Como no estudo DIO, o controle glicêmico é avaliado por ITT e GTT, cada 2 semanas durante 6 semanas.

Além disso, a hemoglobina Atc (HbAlc), um indicador chave da glicose elevada prolongada no plasma, e um painel lipídico, são avaliados no final do estudo.

No segundo modelo, o modelo estreptozotocina (STZ)/HFD, células beta pancreáticas no camun- dongo Swiss Albino (The Jackson Laboratory, Maine) são ablacionados atra- vés de dose baixas múltiplas de estreptozotocina, enquanto a resistência à insulina é induzida através de alimentação HFD.

Neste modelo, os animais são severamente hiperglicêmicos devido à comprometida liberação de insu- lina pancreática, uma situação análoga à fase tardia T2D (Dakshinamoorty et al, J.

Pharm. and Pharmacology 60: 1167-73 (2008)). Animais STZ/HFD são tratados e avaliados de uma forma similar ao modelo ob/ob para medir o efeito de anticorpos INSR na progressão da doença.

EXEMPLO 12 Efeitos de anticorpos agonistas parciais anti-|NSR no controle glicê- mico em camundongos DIO No modelo de obesidade induzida por dieta (DIO), camundongos C57BL/6 podem tornar-se resistentes à insulina após aproximadamente 12- 14 semanas em uma dieta de alto teor de gordura (HFD). Anticorpos anti- INSR que demonstraram comportamento como agonistas parciais ou modu- ladores positivos in vitro foram avaliados neste modelo para determinar se estes anticorpos melhoram a sensibilidade à insulina e/ou controle glicêmico invivo.

Para determinar se os anticorpos anti-|NSR agonistas parciais reduzem a glicemia de jejum no sangue, camundongos DIO de 20 semanas de idade (14 semanas em HFD; n =8/grupo) foram mantidos em jejum durante 5 horas e desafiados por via intravenosa com os anticorpos agonis- tas parciais ADO3O e AbO037 ou um controle de isotipo (5 mg/kg). Em estudos de controle adicionais, camundongos DIO foram tratados com insulina (0,5 U/kg), ou camundongos com idade pareada alimentados com uma dieta normal (ND) foram administrados com controle de isotipo (5 mg/kg). À glicose no sangue foi amostrada antes da injeção (tempo = 0) e 1,2 e4 horas após a administração.

Em comparação aos controles com idade pa- reada, a glicose aumentada no sangue foi observada em camundongos DIO (alimentados com HFD/controle de isotipo) no ponto de tempo 1 hora, con- sistente com resistência à insulina nos animais alimentados com HFD (figura 10A). A administração de insulina ou qualquer um dos anticorpos agonistas parciais resultou em uma redução estatisticamente significativa (p < 0,05; teste t unicaudal) de glicose no sangue (figura 10B). Nem hipoglicemia indu- zida por anticorpo em qualquer ponto do tempo (definido como glicose no sangue < 36 mg/dL). Estes resultados sugerem que os anticorpos agonistas parciais anti-|NSR reduzem a glicemia de jejum de forma segura eficaz.

Para avaliar melhor o efeito de um anticorpo anti-|NSR agonista parcial no controle glicêmico, camundongo DIO de 18 semanas (12 semanas em HFD;n=8/grupo) foram injetados intraperitonealmente (IP) com Abo03S7 (0,1, 1,0 ou 9 mg/kg) ou controle de isotipo (1,0 mg/kg). Como controles adicionais, camundongos controle com idade pareada foram administrados com controle de isotipo (1,0 mg/kg) ou animais DIO receberam insulina (0,75 U/kg; IP). Um teste de tolerância à glicose (GTT) foi realizado 24 horas após a administração do anticorpo (30 min após insulina) mantendo os animais em jejum durante 16 horas (começando em aproximadamente 8 horas após a administração do anticorpo), injetando glicose (1,0 U/kg) e acompanhando a glicose no sangue durante 2 horas.

Neste experimento, HFD não teve um impacto significativo na glicose de jejum (figura 11B) ou pico de glicose pós- bolus (figura 11A). No entanto, em camundongos DIO, anticorpo agonista parcial significativamente reduziu a glicemia de jejum relativa ao controle de isotipo quando administrados em ou acima de 1,0 mg/kg (figura 11B) e reduziu área sob a curva (AUC) de GTT em 9,0 mg/kg (figura 11C).

Este resultado demonstra que um anticorpo agonista parcial anti- INSR pode reduzir a glicose de jejum e melhorar o controle glicêmico in vivo. EXEMPLO 13 Efeitos de moduladores positivos de anticorpos anti-INSR no controle da glicemia em camundongos DIO Para determinar se um modulador positivo do anticorpo anti- INSR melhora a sensibilidade à insulina in vivo, camundongos DIO de 18 semanas de idade (n =8/grupo) receberam injeções IP de AbOO01 (modulador positivo) (0,1, 1,0 ou 10 mg/ kg), de anticorpo agonista parcial (ADO037) (10 mg/ kg) ou controle de isotipo (1,0 mg/ kg). Camundongos da mesma idade alimentados com ND doseados com isotipo de controle (1,0 mg/kg) serviu como um controlo adicional (figura 12A). Vinte e quatro horas mais tarde, um teste de tolerância à insulina (ITT) foi realizado através da administração de insulina (0,5 U/kg) após um jejum de 5 horas e monitoramento de níveis de glicose no sangue ao longo de 2 horas. Um HFD não teve um impacto signi- ficativo sobre a glicose em jejum (figura 12B) ou AUC ITT (figura 12C) em relação à dieta regular, e nem a administração de anticorpo agonista parcial (Ab037) nem o anticorpo modulador positivo (ADOO01) resultaram em uma AUCITT estatisticamente significativa menor, em relação aos animais DIO de controle isotipo (figura 12C). Anticorpo agonista parcial AD037 reduziu significativamente a glicemia de jejum, enquanto anticorpo modulador positi- vo AbOO1 induziu uma tendência estatisticamente não significativa, dose- dependente para glicemia de jejum reduzida.

Na semana seguinte, um GTT foi realizado nos mesmos animais após uma dose adicional de anticorpo (figura 13A). Neste estudo, HFD resul- tou em um aumento não estatístico na glicose em jejum (figura 13B) e AUC GTT (figura 13C), em comparação com animais de controle alimentados. Comparado aos camundongos DIO tratados com controle isotipo, anticorpo agonista parcial e anticorpo modulador positivo significativamente reduziram a glicose em jejum em todas as doses testadas. Além disso, tanto o anticor- po agonista parcial e anticorpo modulador positivo significativamente reduzi-

ram GTT AUC a 10 mg/kg em relação ao isotipo de controle.

O efeito de AD001 e AbO37 sobre os parâmetros de lipídeos foi investigado por tratamento de camundongos DIO de 18 semanas de idade IP duas vezes por semana (BIW) com o anticorpo (10 mg/Kg, n =5grupo) durante doze semanas.

Neste experimento, a eficácia semelhante ao estudo de duas semanas (como descrito acima) foi observada em relação à glicose em jejum, GTT e ITT.

No final do estudo, o plasma foi coletado para medir lipídeos usando técnicas padrões baseadas em ELISA.

Em relação ao isoti- po de controle, tanto ADOO01 e AbO37 reduziram os triglicerídeos em jejum e os níveisde colesterol total em camundongos DIO (p <0,05; figuras 14A e 14B), sugerindo que estes anticorpos são capazes de melhorar a desregula-

ção lipídica associada com a resistência à insulina.

Dois outros moduladores positivos anticorpos anti-INSR foram avaliados quanto à melhora dos parâmetros glicêmicos in vivo usando ca- mundongos de 18 semanas de idade (n =10/grupo). Neste estudo, os anticorpos moduladores positivos ADO083 e AbO85 foram comparados contra Ab0O01 e Ab0O37 e um anticorpo de controle de isotipo.

Um grupo de idade combinada, alimentado com ND tratado com anticorpo de controle isotipo serviu como um controle adicional.

Todos os anticorpos foram doseados IP em1omg/kgBIW.

Um dia após a terceira dose de anticorpo, glicose no san- gue em jejum foi medida e uma GTT foi realizada.

O controle glicêmico foi significativamente prejudicado em camundongos DIO tratados com controle isotipo em relação aos animais alimentados com ND de idade comparável tratados de forma semelhante, como refletida por uma avaliação do curso tempo de GTT e a determinação AUC correspondente (figuras 15A e 15B). Neste experimento, Ab037 e AbO83 melhoraram AUC para níveis indistinguí- veis dos normais (p <0,05 em relação ao HFD/controle isotipo), enquanto AbOO01 não produziu melhorias significativas.

Da mesma forma, com relação à glicose de jejum, uma diferença significativa foi observada entre os camun- dongos alimentados com ND de idades comparáveis tratados com controle isotipo e ambos Ab037 e ABOO1 exerceram efeitos normalizadores estatisti- camente significativos (p <0,05; figura 15C). AD083 gerou uma pequena me-

lhora estatisticamente não significativa em glicose no sangue em jejum, enquanto Ab085 não provocou qualquer alteração neste parâmetro.

Outra medida dos efeitos de anticorpos anti-INSR sobre a fun- ção in vivo é por resistência pelo modelo de avaliacao de Homeostase de insulina (HOMA-IR). HOMA-IR é uma fórmula empírica matemática baseada na glicose plasmática em jejum e os níveis plasmáticos de insulina de jejum, que foi desenvolvido como uma medida substituta da sensibilidade à insulina in vivo: HOMA-IR = insulina plasmática em jejum (ulU/mL) x jejum plasma glicose (mmol/L)/22,5, ou, alternativamente, usando a fórmula: Insulina (ng/ml) x glicose (mM), que incorpora o fator de conversão 22.5. Exemplos de HOMA-IR são descritos em Owyang et al., Endocrinology 151:2515-27, 2010 e Matthews et al., Diabetologia. 28:412-9, 1985. Após 4 semanas de administração, a glicose plasmática, insulina e lipídeos foram avaliados.

ADO83 e Ab037 reduziram a glicose plasmática neste ponto do tempo, enquanto Ab083 e AbO85 reduziram a insulina (p <0,05; figuras16A e 16B). Estes efeitos traduziram em sensibilidade à insu- lina melhorada, neste modelo de resistência à insulina para AbO083 e AbO85, como determinado por HOMA-IR (p <0,05; figura 16C). Com relação aos lipí- dios, ADO85 melhorou significativamente somente os triglicerídeos (p <0,05; figura 16D), enquanto Ab083 e Ab0S37 reduziram significativamente o coles- terol não esterificado, total e não-HDL (p <0,05; figura 16E-G). Os dois últi- mos anticorpos também melhoraram a relação colesterol não-HDL/HDL (fi- gura 16H). AbOO1 reduziu significativamente o colesterol total e não HDL.

Surpreendentemente, todos os quatro anticorpos reduziram ga- —nhodepesoem camundongos DIO em relação ao isotipo de controle ao lon- go de 3 semanas de tratamento, sem redução do peso corporal para abaixo do valor inicial (figura 17A e 17B). Estes resultados demonstram que o anticorpo modulador positivo AD083 e anticorpo agonista Ab037 corrigem a tolerância à glicose diminuída em camundongos DIO, que os anticorpos mo- duladores ADO83 e AbO85 melhoram a sensibilidade à insulina e sugerem que todos os quatro anticorpos têm a capacidade de diminuir o ganho de pe- so resultante de HFD.

Estes resultados sugerem que agonista parcial e anticorpos mo- duladores positivos específicos para o INSR melhoram o controle glicêmico em indivíduos diabéticos.

EXEMPLO 14 Efeitos do agonista parcial e anticorpos moduladores positivos anti- insr no controle glicêmico e doença em camundongos db/db Ratos homozigóticos para o receptor de leptina desprovido de alelo Lepr”º espontâneo funcionam e se tornam progressivamente resisten- tes à insulina e obesos começando aos três a quatro semanas de idade.

Nestes camundongos, os níveis de insulina subem, até cerca de 8-10 sema- nas de idade, em cujo tempo os animais são severamente resistentes à insu- lina e hiperinsulinêmico.

Este fundo genético, no entanto, resulta em hipergli- cemia descontrolada, levando a disfunção das células beta pancreáticas após aproximadamente 10 semanas de idade e, finalmente, a falha das célu- las beta.

Anticorpos anti-|lNSR demonstraram se comportar como agonistas parciais ou moduladores positivos in vitro foram avaliados neste modelo para determinar se estes anticorpos melhoraram a sensibilidade à insulina, o con- trole glicêmico e /ou progressão da doença in vivo.

O camundongo db/db foi usado para avaliar a atividade de AbOO1 e AbO037 em um cenário de progressiva resistência à insulina e dis- função da célula beta, combinado com obesidade grave.

Nesta experiência, AbOO01 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), AbO37 (10 mg/kg) ou anticorpo de isotipo de controle (1 mg/kg ou 10 mg/kg) foram doseados IP, BIW a 5 camundongos dB/dB de 5 semanas de idade (n =10/grupo). Como um controle adicional, um grupo de idade correspondente de heterozigóticos littermates, que são geralmente fenotipicamente normais, foram doseados de forma semelhante com anticorpo de isotipo de controle 10 mg /kg . Tal como no modelo DIO, ganho de peso foi significativamente reduzido nos animais tratados com 10 mg/kg de qualquer ADOO1 ou Ab037 em relação a camundongos tratados com isotipo de controle durante as primeiras cinco semanas de tratamento (p <0,05; figura 18A e 18C). Importante, após 5 semanas de tratamento, o que corresponde a 10 semanas de idade, quando camundongos db/db geralmen-

te começam a perder peso, como um resultado da depleção de células beta do pâncreas, ambos os anticorpos reduziram a perda de peso (p <0,05; figu- ra 18B e 18D) . Depois de 10 semanas de tratamento, o tratamento com qualquer um de Ab001 ou Ab037 a 10 mg/kg melhorias significativas foram observadas em glicose no sangue em jejum em relação aos grupos tratados com controle isotipo (p <0,05; figura 19A). Além disso, neste ponto do tem- po, HbAlc foi significativamente reduzida no grupo de 1 mg/kg AbOO1, e também reduziu em um menor grau, no grupo 10 mg/kg AbOO01 (p <0,05; figura 19B).

A insulina e lipídeos plasmáticos foram avaliados após 14 dias de doseamento. Neste momento, ambos AbOO01 (10 mg/kg) e AbO03S7 aumen- taram a insulina circulante em uma idade (cerca de 20 semanas de idade) em seria de esperar que estes animais têm insuficiência pancreática das células beta (p <0,05; figura 20A), sugerindo que ambos os mAbs são capa- zes de restaurar a produção de insulina em animais insulinopênicos. Além disso, Ab001 (10 mg/kg) reduziu significativamente triglicerídeos plasmáti- cos, colesterol! total, colesterol não HDL, colesterol não esteríficado e a razão de colesterol não HDL/HDL (p <0,05; figura 20B-F). Uma redução significa- tiva nos níveis de colesterol não esterificado e uma tendência de diminuição dostriglicerídeos foi observada no plasma de animais tratados com Ab037 (p <0,05 e p = 0,08, respectivamente; figuras 20B e 20C).

Curiosamente, a redução no ganho de peso ocorreu no início, enquanto que os animais eram resistentes à insulina, mas não se espera que têm a depleção grave de células beta, como é o caso no modelo DIO.

Noentanto, nesta experiência, ADOO1 alterações induzidas no controle glicê- mico e hemoglobina glicada ocorreu apenas durante a fase tardia, quando seria de esperar que os animais têm disfunção da célula beta. Além disso, durante este período de tempo, ambos os anticorpos reduziram a perda patológica de peso. Não deve ser limitado pela teoria, este resultado sugere que os efeitos de anticorpo anti-|NSR sobre o peso e de controle glicêmico pode ocorrer em tandem, mas são separáveis. Estes dados sugerem que AbOO1 é capaz de normalizar o peso, melhorar o controlo glicêmico e par-

cialmente corrigir a dislipidemia sob condições de resistência à insulina com- binadas e depleção de células beta.

Para avaliar a atividade de anticorpos em condições severamen- te resistentes à insulina e insulinopênico, camundongos db/db de 10 sema- nasde idade, que seria de esperar que manifestassem com progressiva dis- função das células beta pancreáticas, foram tratados com AbOO01, Ab037, Ab083, AbO85 ou anticorpo de controle isotipo, em 10 mg/kg IP, BIW durante oito semanas.

A glicose no sangue em jejum foi medida semanalmente pela duração do estudo.

Neste estudo, Ab085 significativamente reduziu a glicose no sangue em jejum em relação ao isotipo de controle (p <0,05; figura 21). Isso demonstra que Ab085 melhora doença sob condições de resistência a insulina, hipoinsulinêmica.

Dois anticorpos adicionais moduladores positivos anti-I|NSR fo- ram avaliados para a melhoria da resistência à insulina em camundongos de 5 semanas de idade db/db, que seria de se esperar que manifestassem com resistência à insulina grave.

Os camundongos foram tratados com AbOO1, Ab037, AbO83, AbO8S5 ou anticorpo de controlo de isotipo, a 10 mg/kg |P, BIW durante quatro semanas para avaliar o efeito dos anticorpos sobre a resistência à insulina antes do início da disfunção de células beta.

A glicose plasmática em jejum e insulina no plasma em jejum foram medidos no final do estudo e HOMA-IR foi calculada.

Neste estudo, Ab083 e Ab085 melhora- ram a resistência à insulina significativamente em comparação com isotipo de controle (p <0,05; figura 22), demonstrando que estes anticorpos melho- ram a sensibilidade à insulina, neste modelo de diabetes.

EXEMPLO15 Efeitos de agonista parcial e anticorpos moduladores positivos anti- INSR no controle glicêmico e doença em camundongos MLDS/HFD No modelo multi-dose baixa de estreptozotocina (MLDS)/HFH, resistência à insulina é conseguida através da alimentação de camundongos de6 semanas de idade os um HFD (40% kcal de gordura) durante quatro semanas, tempo durante o qual 5 doses diárias de estreptozotocina (40 mg/kg, durante a terceira semana) são administrados IP para parcialmente ablação de função das células beta. Anticorpos anti-|NSR demonstraram se comportar como agonistas parciais ou moduladores positivos in vitro foram avaliados neste modelo para determinar se estes anticorpos melhoraram a sensibilidade à insulina, o controle glicêmico e /ou progressão da doença in vivo Para avaliar o efeito de ADOO01 e AbO0S7 em doença em um mo- delo de resistência à insulina combinado e disfunção das células beta, camundongos MLDS HFD (n =10/grupo) foram doseadas com Ab0OO01, Abo37 ou anticorpo de controlo de isotipo, a 10 mg/ kg IP, BIW durante seis sema- nas. Uma semana após a primeira dose, um aumento de três vezes em gli- cose no sangue em jejum foi observada em camundongos doentes tratados com controle de isotipo, em relação à animais normais de idade compatível, confirmando que um fenótipo diabético foi alcançada. Neste momento, uma GTT foi realizada, revelando melhorias significativas no controle glicêmico, tanto para ADOO1 e AbO37 (p <0,05; figura 23A e 23B).

Glicose no sangue em jejum também foi significativamente redu- zida no grupo de camundongos tratados com Ab037 (p <0,05), enquanto ne- nhuma mudança significativa foi provocada por Ab0O01 (figura 23C). Uma se- mana mais tarde, a alimentação de glicose foi avaliada. Semelhante à gli- cose de jejum, a doença em camundongos MLDS/HFD se manifestou ao significativamente elevar os níveis de glicose alimentados, que foi ameniza- da pela Ab037 (p <0,05; figura 24A). Consistente com essas melhorias no GTT e glicose alimentado/jejum, Ab037 reduziu a HOAtc em aproximada- mente 1,5% após seis semanas de tratamento (p <0,05; figura 24B). Fim da —análisedo estudo de plasma revelou que tratamento de Ab037 levou a uma normalização estatisticamente significativa nos níveis de insulina plasmática e menor redução na proporção de colesterol não-HDL/HDL, enquanto Ab001 significativamente melhorou os níveis plasmáticos de leptina, com um impac- to semelhante, mas menor correção na insulina plasmática (p <0,05; figura 25A-C). Este modelo não apresenta consistente mudança de peso, relacio- nada com a doença, como observado no modelo db/db, e nem AbO0O01 nem Ab037 impactaram no peso corporal neste modelo (figura 26), sugerindo que o ganho de peso reduzido observado com estes anticorpos nos outros mo- delos in vivo não foi um efeito não específico. Estes dados demonstram que Ab037 melhora múltiplas manifestações da doença em camundongos MLDS/HFD, enquanto AbO01 também corrige alguns parâmetros de controle glicêmico anormal neste modelo.

Dois moduladores positivos anticorpos anti-I|NSR adicionais fo- ram avaliados quanto à melhora dos parâmetros glicêmicos in vivo em ca- mundongos MLDS/HFD (n =10/grupo) foram doseadas com Ab001, Ab037, Ab083, AbO85 ou anticorpo de controle de isotipo, a 10 mg/ kg IP, BIW durante seis semanas. Após 3 semanas de tratamento, uma GTT foi realizada, revelando que Ab037 e Ab083 completamente normalizaram o o controle glicêmico, em relação ao isotipo de controleo (p <0,05; figura 27A e 27B). Glicose no sangue em jejum também foi significativamente reduzida nos camundongos tratados com Ab037 ou Ab083 ao longo da duração do estudode6 semanas (p <0,05), enquanto nenhuma alteração significativa foi provocada por Ab0O01 ou AbO85 (figura 28). No final do estudo, os lipídeos plasmáticos foram avaliados. ADO83 melhorou significativamente os triglice- rídeos plasmáticos, colesterol não esterificado, colesterol total, colesterol não-HDL, proporção elação colesterol não-HDL/HDL e ácidos graxos livres (p<0,05; figura 29A-F). Além disso, AbOO1 significativamente reduziu coles- terol total, HDL e não esterificado, bem como a relação colesterol não- HDL/HDL. Ab037 melhorou colesterol não-HDL, colesterol não esterificado, relação colesterol não-HDL/HDL e ácidos graxos livres. Neste experimento, AbO85 significativamente reduziu apenas ácidos graxos livres. Consistente comas melhorias observadas no GTT e glicose de jejum, Ab037 e Ab083 de HbAlc significativamente reduziram após seis semanas de tratamento (p <0,05; figura 30). Além disso, Ab001 e AbO85, que exerceu um efeito menor sobre a glicose em jejum e tolerância glicose, mas não melhorou certos pa- râmetros lipídicos, também reduziu a HDAilc. Tal como no experimento ante- rior, nenhum dos mAbs significativamente impactaram no peso corporal, neste modelo, exceto Ab085, com o ganho de peso reduzido ao longo das primeiras 3 semanas de tratamento (figura 31). Estes dados demonstram que os quatro anticorpos testados melhoraram múltiplas manifestações da doença em camundongos MLDS/HFD, sem afetar a massa corporal neste modelo de peso neutro. EXEMPLO 16 Efeitos de 24 horas de administração de agonista parcial e anticorpos positivos moduladores anti-INSR na fosforilação in vivo O aumento da fosforilação da INSR tirosina em tecidos sensíveis à insulina, como fígado e músculo por administração de curto prazo de anticorpos anti-|NSR confirma que os anticorpos são biodisponíveis e capaz de atuar de forma semelhante em INSR in vivo como observado in vitro. Nesta experiência, os anticorpos anti-INSR identificados como agonistas parciais ou moduladores positivos in vitro foram doseados durante 24 horas em camundongos C56BL/6 machos e avaliados para os seus efeitos basais sobre fosforilação de INSR em músculo e fígado induzida por insulina.

Para determinar se o agonista parcial INSR e moduladores po- sitivos aumentam a fosforilação de INSR em fígado e músculo, camundon- gos machos de 10 semanas de idade (n=3) foram administrados com anticorpos anti-I|NSR ou isotipo de controle (10 mg/kg) por 24 horas, e os efeitos na fosforilação de tirosina INSR em fígado e músculo foram determi- —nados por ELISA em camundongos administrados com insulina em bolus (1 U/kg) ou PBS por 10 minutos. As concentrações de INSR fosforilados foram normalizadas para concentrações totais de receptores de insulina e expres- sos como uma percentagem.

Insulina exógena (1 U/kg) não aumentou significativamente a fosforilação de INSR em animais de controle (embora tenha havido uma ten- dência positiva) no fígado ou músculo (figuras 32A, B). No entanto, no fíga- do, aumentos significativos na fosforilação de INSR estimulada por insulina foram observados em camundongos tratados com Ab083e Ab0S37 (p <0,05), bem como um aumento quase significativo em camundongos tratados com —AbO85 (p=0,07; figura 32A). Este resultado sugere que anticorpos agonista parcial e modulador positivo são capazes de aumentar a capacidade de res- posta à insulina in vivo. Curiosamente, no fígado, ADO083 aumentou significa-

tivamente a fosforilação de INSR mesmo no estado basal (sem insulina exó- gena), sugerindo que Ab083 é capaz de sensibilizar a resposta à insulina mesmo na presença de baixos níveis em jejum de insulina endógena.

Os efeitos mais pronunciados dos anticorpos anti-|NSR agonista parcial e moduladores positivos foram observados no músculo. Enquanto todos os três anticorpos anti-|NSR positivamente modularam a sinalização de insulina em camundongos receberam um bolus de insulina, Ab083, e pa- ra uma maior extensão, Ab085, também sintetizaram a sinalização de INSR muscular para níveis endógenos de insulina em jejum, quando comparado com animais de controle (figura 32B).

Estes resultados sugerem que anticorpos agonista parcial e po- sitivos modulador anti-|NSR melhoraram a resposta à sinalização mediada por insulina no fígado e músculo in vivo. Em relação aos efeitos da Ab037, os anticorpos Ab083 e AbO85 sensibilizaram INSR em concentrações relati- vamente baixas de insulina. EXEMPLO 17 Isolamento de anticorpos anti-INSR adicionais de bibliotecas de exibi- ção de fagos de anticorpos adicionais Outras bibliotecas de anticorpos naive foram testados para anticorpos específicos para INSR. (1) Panning e Salvamento de Fago Receptor de insuliha humana (hINSR) (R &D Systems, Minneapolis, MN) foi biotinilado como descrito no Exemplo 1 e usados para panning de bibliotecas de exibição de fagos de anticorpos naive.

A. Biblioteca scFv Bibliveca de scFv naive: Para a primeira rodada de panning fago, 4,5x10'? cfu das partículas de fago de uma biblioteca de apresentação de fato scFv lambda ou 4,12x10"?cfu de partículas de fago de uma biblioteca de apresentação de fago scFv kapa (XOMA LLC, Berkeley, CA) foram bloqueados por 1h em temperatura ambiente (RT) em 1ml de 5% leite/PBS (Teknova, Hollister, CA) com suave rotação. Isto representa dois pannings separadas, scFv-kappa e lambda-scFv. Fagos bloqueados foram desmarca-

dos duas vezes durante 30 minutos contra Dynabeads& M-280 magnéticas revestidos de estreptavidina (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Noruega). Para formar o complexo biotina-hINSR-hINS 103 pmoles de hINSR biotinilado fo- ram pré-incubados com excesso de (2,100 pmoles) de insulina humana (hINS) (Sigma, St Louis, MO) dissolvida em 5% leite/PBS, por 1h em RT com rotação suave.

Para a segunda rodada de panning, 50 pmoles de bioti- Na-hlNSR foi usado com 1050 pmoles de hINS.

Para a rodada final de panning, 25 pmoles de biotina-hINSR foi incubada com 525 pmoles de hINS.

B.

Biblioteca de Fab

Biblioteca de Fab Naive : Para a primeira rodada de phage panning, 1,2x10"º*cfu de partículas de fago ou 1,8x10"*cfu de partículas de fago de dois diferentes resgates de uma biblioteca de Fab lambda (XOMA LLC, Berkeley, CA), ou 7,2x10'?cfu de partículas de fago ou 1.8x10"ºcfu de partículas de fago de dois diferentes resgates da biblioteca Fab kapa (XOMA LLC, Berkeley, CA) foram bloqueados por 1h em temperatura ambiente (RT) em tml de 5% leite/PBS (Teknova, Hollister, CA) com rotação suave.

Isto representa quatro separados pannings.

Fago bloqueado foi de-selecionado duas vezes por 30 minutes contra Dynabeads& M-280 magnéticas reves- tidas por estreptavidina (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway). Para formar o complexo biotina-hiNSR-hIlNS, 103 pmoles de hlNSR biotinilado foi pré- incubado com excesso de (2,100 pmoles) insulina humana (hINS) (Sigma, St.

Louis, MO) dissolvida em 5% leite/PBS, por 1h em RT com rotação suave.

Para a segunda rodada de panning, 50 pmoles de biotina-hINSR foi usado com 1050 pmoles hINS.

Para a rodada final de panning, 25 pmoles de

—biotina-hiNSR foi incubada com 525 pmoles de hINS.

A solução de biotina-h!INSR/hINS foi incubada com DynabeadsO& M-280 magnéticas revestidas por estreptavidina bloqueadas (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway) por 30 minutes com rotação suave para imobilizar o complexo biotina-hINSR-hINS.

O fago desmarcado foi incubado com esfe- ras de biotina-hiNSR-hlNS estreptavidina por 2h em RT.

Para saturar o hINSR com hINS, hINS adicional (2,100 pmoles) foi adicionado à solução.

As esferas foram lavadas.

Para a primeira rodada de panning, esferas foram rapidamente lavadas (ou seja, esferas foram retiradas da solução usando um ímã e ressuspendidas em 1 ml de tampão de lavagem) três vezes com 0,5% leite-PBS-0.1% TWEEN, seguido por três lavagens com 0,5% leite- PBS seguido por uma rápida lavagem com PBS. Para a segunda rodada de panning, esferas foram rapidamente lavadas cinco vezes com 0,5% leite- PBS-0.1% TWEEN followed by one 5 minute wash (in 1 ml! wash buffer em temperatura ambiente com rotação suave) com 0,5% leite-PBS-0,1% TWEEN e em seguida cinco lavagens com 0,5% leite-PBS seguido por uma lavagem de 5 minutos com 0,5% leite-PBS e em seguida uma lavada rápida com PBS. Para a terceira rodada de panning, esferas foram rapidamente lavadas quatro vezes times com 0,5% leite-PBS-0,1% TWEEN, seguido por duas lavagens por cinco minutos com 0,5% leite-PBS-0,1% TWEEN e, em seguida, quatro lavaegens rápidas com 0,5% leite-PBS, seguido por duas lavagens de 5 minutos com 0,5% leite-PBS e, em seguida, uma lavagem rápidacom PBS.

C. Eluição e salvamento O hINSR-hINS-Estreptavidina fago ligado às esferas foram eluídas com 0,5 ml de 100 mM de trietilamina (TEA) durante 30 Minutos em RT com rotação suaves. As esferas foram separadas a partir do eluato. O eluatofoiremovido e neutralizado com 0,5 ml de 1M Tris-HCI (pH 7,4). As esferas foram neutralizadas com 1 ml de 1M Tris-HCI (pH 7,4). O fago eluído a partir de esferas ou eluato, foram usados separadamente para infectar células TG1 bacterianas (Stratagene, La Jolla, CA) quando atingiram um ODsoo de 0,5 -. Após a infecção, durante 30 min a 37ºC sem agitação, e durante 30 min a 37ºC com agitação a 90 rpm, as células foram sedimen- tadas e ressuspensas em meios 2YT suplementados com 100 ug/ml de car- benicilina e glicose a 2%. As células ressuspensas foram plaqueadas em placas de ágar 2YT com 100 ug /ml de carbenicilina e glicose a 2% e incu- badas durante a noite a 30ºC.

Fago foi então resgatado com fago auxiliar MI3KO7 (New England Biolabs, MA) a uma multiplicidade de infecção (MOI) - 20. Após a infecção de fago auxiliar de células TG1 em um ODgçoo de 0,5 a 37 ºC durante

30 min, sem agitação e 30 minutos de incubação a 37ºC a 100 rpm, os pele- tes de células foram ressuspensas em meios 2YT suplementados com 100 ug/ml de carbenicilina e 50 ug /ml de canamicina e deixadas a crescer du- rante a noite a 25ºC e 250rpm. Fagos no sobrenadante foram recuperados após centrifugação rigorosa e usados para o próximo ciclo de panning. A fim de controlar o enriquecimento resultante das seleções de fagos, a quantida- de de entrada e de saída do fago foi titulada para as três rodadas de panning.

(2) Rastreio FACS de clones de anticorpos em complexos humanos de INSR/hINS ou murino INSR/hINRS As colônias individuais foram colhidas e cultivadas em placas de 96 poços e foram então usadas para gerar extratos bacterianos periplasmá- ticas de acordo com métodos padrões, com uma razão de volume 1:3 de solução gelada PPB (Teknova, Hollister, CA) e ddH2O e inibidor de protease (Roche, Indianapolis, IN). Os sobrenadantes de lisados foram ensaiadas por FACS em hINSR/hINS ou complexo INSR/hINS murino, usando o protocolo descrito no Exemplo 2, exceto que a suspensão adaptadao de CHO-K1 transfectadas com ambos os hIiNSR ou mulNSR foram usados em vez de células IM-9, e as células expostos a insulina foram ressuspensas em tam- pãoFACS suplementado com 150nM, em vez de 70nM de insulina humana. Este ensaio permitiu a detecção de pelo menos 6 tipos de anticorpo:

1. Anticorpos que apenas se ligam a células CHO hINSR se fo- ram expostos à insulina humana (se liga exclusivamente a complexo INS /INSR de um modo específico da espécie)

2. Anticorpos que apenas se ligam a células CHO mulNSR se foram expostos à insulina humana (se liga exclusivamente a complexo INS /INSR de um modo específico da espécie)

3. Anticorpos que se ligam a ambas células hiNSR-CHO e MUINSR-CHO se eles foram expostas a insulina humana (se ligam exclusi- vamente ao complexo INS/INSR em uma maneira específica da espécie)

4. Anticorpos que apenas se ligam a células CHO-hINSR (se ligam exclusivamente a INSR de uma forma específica espécies)

5. Anticorpos que apenas se ligam a células mulNSR CHO (se ligam exclusivamente a INSR de uma forma específica espécies)

6. Anticorpos que apenas se ligam a ambas células hiNSR-CHO e mulNSR-CHO (se ligam exclusivamente a INSR de uma forma específica espécies) Anticorpos foram classificados conforme descrito no Exemplo 2. As sequências de cadeia leve e cadeia pesada dos anticorpos isolados fo- ram sequenciados e estão estabelecidos nas SEQ ID NOs: 87-147 (cadeia leve) e SEQ ID NOs: 223-284 (cadeia pesada). Resultados Rastreio FACS dos extractos bacterianos periplasmáticas identi- ficaram anticorpos múltiplos que se ligam a receptor humano ou complexo de receptor/ligante, hiNSR ou hiNSR-hINS, ou receptor de murino ou com- plexo de receptor /ligante, MulNSR ou mulNSR/hINS. Trinta e três por cento (484 de 1488) dos clones seleccionados a partir destas bibliotecas naive foram capazes de se ligar a complexos hINSR ou hINSR-hINS. Vinte e cinco por cento (370 de 1488) dos clones selecionados a partir destas bibliotecas naive foram capazes de se ligar aos complexos mulNSR ou mulNSR-hINS. Dezasseis por cento (234 de 1488) dos clones ligados a ambos hINSR ou —hINSR-hINS e complexos mulNSR ou mulNSR /hINS por FACS. Clones selecionados foram reformatados como anticorpos IgG2. As cadeias variáveis pesada (VH) e leve (VL) dos fragmentos scFv selecio- nados foram amplificados por PCR, clonados em vetores de plasmídeo con- tendo genes constantes de anticorpos, e transfectado em células EBNA 293E humanas usando métodos padrões. A ligação dos anticorpos reforma- tados para hINSR ou hiNSR-hINS ou mulNSR ou mulNSR/hINS foram ava- liados por FACS como descrito acima. Resultados são apresentados na figura 33. Os resultados mostram que certos anticorpos reformatados se ligam àlNSR humano e de camundongo. A figura 33 também mostra que os anticorpos reformatados se ligam diferencialmente a INSR na presença e ausência de insulina e são, portanto, previstos para modular a insulina de ligação para INSR.

EXEMPLO 18 Panning para Anticorpos Agonistas Alostéricos Contra INSR Seleção de anticorpos agonistas que exibem uma maior ligação ao complexo do receptor/ligante do que para o receptor livre aumenta a pro- babilidade de identificação de anticorpos que são não competitivos com o ligante e não bloqueia ou diminui a ligação do ligante para o local ortostérico do receptor.

Um anticorpo deste tipo, que se liga a um local no receptor alvo distinto do local de ligação endógena, é conhecido como um agonista alosté- rico (Kenakin et ai, Journal of Receptors and Signal Transduction, 27:247- 259, 2007;. Jahns et ai., J Am Coll Cardiol. 36:1280-87, 2000; May et al., Ann Rev Toxicol. 47: 1-51, 2007). Métodos descritos acima para o rastreio de anticorpos agonistas são também úteis para o rastreio de agonistas alostéricos.

Ligação preferen- cialdo anticorpo de teste ao complexo ligante-receptor é consistente com a atividade alostérica considerando que uma ligação preferencial do anticorpo de teste para o receptor livre é consistente com um anticorpo que compete com a insulina para o local ortostérico.

O rastreio é útil para enriquecer o conjunto de clones candidatos para agonistas alostéricos, eliminando a par- te,senão todos os agonistas competitivos.

Anticorpos alostéricos são menos susceptíveis de interferir com a afinidade de ligação e da eficácia do ligante e, portanto, são menos sus- ceptíveis de interferir com a sinalização de ligante máxima ou sensibilidade máxima para o ligante.

Anticorpos alostéricos podem exibir uma faixa de agonismo de agonistas parciais fracos aos níveis de agonismo semelhantes para ao ligante endógeno.

Um agonista parcial alostérico irá provocar uma resposta máxima de sinalização que é significativamente menor do a magni- tude de resposta máxima do ligante endógeno.

Em algumas aplicações, em que a ativação do sinal sustentada submáxima é preferida em relação a ati- vação máxima do sinal, um anticorpo agonista parcial é preferencial a um anticorpo agonista total.

As características que distinguem entre um agonista parcial alostérico e um modulador positivo (sensibilizador) são evidentes a partir de uma comparação das curvas de dose-resposta mostradas nas figuras 34 e 17, que mostram as diferentes curvas de ligação para um ago- nista parcial alostérico (figura 34) e um anticorpo positivo modulador (sensi- bilizador) (figura 35).

A figura 34A ilustra um exemplo da resposta à dose de um ago- nista parcial alostérico em comparação com a resposta à dose para o ligante endógeno e figura 34B demonstra ativação por ligante na presença ou na ausência do agonista alostérico. A figura 35A mostra a resposta à dose a partir de um anticorpo modulador alostérico positivo em comparação com a resposta à dose para o ligante endógeno enquanto 35B A figura mostra uma curva de resposta à dose de um ligante endógeno na presença e na ausên- cia de um anticorpo modulador positivo. A figura 36 fornece os parâmetros de ativação para um conjunto de agonistas parciais alostéricos relativos ao ligante endógeno. A natureza da ativação do sinal pelos agonistas parciais — alostéricos é distinta da de um modulador positivo obtido a partir da aborda- gem do próprio rastreio primário.

Um anticorpo não competitivo agonista parcial alostérico pode oferecer uma vantagem terapêutica sobre um agonista competitivo em que é benéfico ter ativação de sinal independente pelo agonista parcial e por um ligante endógeno simultaneamente. Por exemplo, e não deve ser limitado pela teoria, um agonista parcial alostérico pode ser usado para elevar a ati- vação basal de uma via de sinalização permitindo ainda a resposta das flu- tuações nos níveis de transientes de ligantes endógenos. Em certos casos, sob condições em que um agonista parcial alostérico deste tipo está pre- sente, a resposta à dose do ligante endógeno apresentará um aumento na linha de base (constitutiva ou basal) de nível de sinalização e irá alcançar a resposta máxima igual ou maior ao endógeno ligante com pouca ou ne- nhuma mudança significativa na EC50 no ligante. Por exemplo, a figura 34B mostra a resposta de dose de um ligante endógeno na presença e na ausên- ciade um agonista parcial e alostérico figura 37 mostra a ativação máxima de insulina na presença anticorpos agonistas parciais alostéricos, relativa- mente à resposta máxima para o ligante endógeno no presença de um anticorpo de controlo negativo. A figura 37 demonstra que os anticorpos ago- nistas parciais alostéricos Ab037 e Ab040 têm pouco ou nenhum impacto significativo sobre a EC50 da resposta à dose e fosforilação máximo de Akt em Ser473 pela insulina quando comparado com um anticorpo de controlo negativo no mesmo ensaio.

EXEMPLO 19 Exemplos de classes funcionais de anticorpos anti-INSR: efeitos dife- renciais sobre insulina induzida por fosforilação de Akt Os efeitos dos anticorpos de teste na sinalização através do complexo de receptor de insulinalinsulina foram medidos através da avalia- ção da capacidade dos anticorpos para sensibilizar e agonizar fosforilação de Akt induzida por insulina. Os ensaios foram realizados usando o método descrito no Exemplo 5. Em todos os dados apresentados, o percentual de valores de pAtk pSer473 são relativos e não representam necessariamente níveis de pAkt pSer473celulares absolutos.

As figuras 38-40 mostram curvas de dose-resposta de anticorpo pAkt na ausência de insulina, ou na presença de uma concentração sub- máxima de insulina para células CHO-K1 parentais, células CHO-K1 expres- sando receptor de Insulina Humana e células CHO-K1 expressando receptor deinsulinade camundongo. As titulações de anticorpos na ausência de insu- lina (símbolos abertos) forneceram uma indicação de atividade de agonismo do anticorpo. A titulação paralela de anticorpos na presença de um nível submáximo de insulina (símbolos cheio) fornece uma indicação de atividade de sensibilização em relação à atividade de agonismo. A atividade de sensi- bilização pode ser vista como um aumento nos níveis pAkt acima dos causa- dos por uma concentração de EC30 de insulina (linha a tracejada), que é maior em magnitude do que a atividade de agonismo na mesma concen- tração de anticorpo. Anticorpos Ab077 e AbO78 e AbO8S (figura 38A-C) não apresentam agonismo significativo na ausência de insulina. Anticorpos —AbOO1 e AbO79 e AbO083 são agonistas fracos (figura 39A-C) e o anticorpo AbO080 mostra um nível moderado de agonismo (figura 40). Os resultados do ensaio indicam também se os anticorpos apresentam reatividade cruzada funcional, isto é, têm efeitos sobre a sinalização mediada por INSR tanto humana quanto de camundongo. Note-se que os anticorpos AbO078 e AbO85 apenas se ligam ao receptor de insulina na presença de insulina, isto é, eles não se ligam de forma detectável ao receptor de insulina desocupado como avaliado por ligação a receptor de insulina expresso em células CHO-K1 em um ensaio baseados em FACS.

A figura 41A-C mostra ativação de pAkt induzida por insulina na presença de concentrações fixas de anticorpos sensibilizantes, em compa- ração com a insulina na presença de anticorpos anti-KLH de controle isotí- pico de lgG2 (linhas sólidas). Os níveis de ativação de pAKkt para anticorpos na ausência de insulina nas concentrações usadas nas titulações de respos- ta à dose de insulina são mostrados como linhas tracejadas. Valores de ECS50 para ativação de pAkt induzida por insulina na presença de anticorpos sensibilizadores e mudança vezes nos valores de ECB50 relativos ao controle deisotipo estão listados na Tabela 5.

Tabela 5. Valores de EC50 para ativação de pAKkt induzida por insulina na presença de anticorpos sensibilizadores. Alteração de vezes Concentração de Experimento Anticorpo EC50 (pM) | em EC50 em relação anticorpo (ug/ml) ao controle de isotipo [Laos da e | [amor o dd aos a o ds | Células — CHO- AbO79 7 Ki de INSR AbO083 humanas AbO085 207

FE PR PI PI [ancora dz Células — CHO- AbOT7 K1 de INSR de AbO78 AbO079

[amoss fo de da [aos fa dae da

FSP PR PY As figuras 42A-B mostram atividade de ativação de pAkt de anticorpos agonistas alostéricos parciais, na ausência de insulina, em com- paração com insulina isolada. Anticorpos Ab037 e AbO53 e AbO62 atuam todos como agonistas de atividade de pAKkt tendo platô de ativação máxima que são significativamente menos do que a insulina em células CHO-K1 expressando receptor de insulina humano ou de camundongo. Os resultados do ensaio indicam também se os anticorpos apresentam reatividade cruza- da, ou seja, se têm efeitos funcionais sobre a sinalização mediada pelo receptor de insulina humana e de camundongo. Os valores de EC50 de anticorpos e os níveis de ativação máxima são dados na Tabela 6. Tabela 6. Os níveis máximos de ativação e valores de CE50 para ago- nistas parciais alostéricos | | [msumanu [aposr [avoss —Jnvosz | Ativação CHOK1 de máxima 100% 79% 64% 52% INSF relativa a Ec Jows loss om [2 | Ativação CHO4K1 de máxima 100% 42% 48% 34% INSF de relativa aa Eca 1% 12 Jos [110 | A figura 43 mostra a ativação de pAkt dependente de insulina na presença de concentrações fixas de anticorpos agonistas alostéricos parciais em comparação com a insulina individualmente. A atividade agonista de anticorpos é vista como um aumento na linha de base da resposta à dose de insulina. Os anticorpos agonistas Ab037 e AbO53 têm pouco efeito sobre a sensibilidade à insulina, que se reflecte na ausência de mudança significati- vana ECB50 de insulina e coeficiente de Hill na presença destes anticorpos

(ver Tabela 7). O anticorpo AbO62 parece reduzir a sensibilidade à insulina já que a EC50 para a insulina na presença de Ab062 é 6,6 vezes mais elevada (ver Tabela 7). Tabela 7. Parâmetros de Ativação de Insulina na presença e ausência deanticorpos agonistas Pará de Insulina = Hu Insulina Hu Insulina 2 Insulina Hu Linhagem de Tão x | com 2 ugml 2 ! A de | com 2 células de | ENSAIO determi- de anticorpo com 2 ugim! | ug ugml! de nado do ajuste da de AbO3S7| AbOS3 receptor de de controle o, o, Ab062 ie -— | curva de dose (95% . del(95% de| oo insulina proje- osta (95% de intervalo de | intervalo (95% de tado no ensaio | TESPOS! intervalo de az. intervalo de sigmoidal confiança) | de confiança) confiança) confiança) Ativação — máxima o, so, relativa de pAkt na | 100% 109% 99% 106% o o) | (106% al(97% al(100% a presença de 2 ugiml | (93% a 108%) 112%) 102%) 112%) de anticorpo ECs, de insulina na CHOKIT — de|=/% 0,58 111 0,92 3,91 presença de 2 ugiml | à à a INSR Humano — | ES anticorpo (nM) (0,35a0,96) |(084a1,5) |(068a1,3) |(27a57) Coeficiênte de Hil de insuliha na/l0,74 0,79 0,98 0,71 presença de 2 ugiml | (0,48 a 1,0) (0,63 a 0,95) | (0,69 a 1,2) | (0,54 a 0,89) de anticorpo EXEMPLO 20 Anticorpo anti-INSR 83-7 não é um modulador positivo de ligação de insulina para hiNSR O anticorpo anti-|NSR 83-7 foi identificado anteriormente como específico para receptor de Insulina Humana, no entanto, o anticorpo 83-7 não demonstrou ter qualquer capacidade de modulador sobre a ligação de receptorde insulina - insulina.

Para avaliar a capacidade do anticorpo 83-7 para modular cineticamente as interações de receptor de insulina-insulina, a fosforilação de serina induzida por insulina de AKT foi medida na presença de83?7. As sequências de VH e VL que codificam o anticorpo 83-7 (McKern et al, Nature 443:218-221, 2006) foram sintetizadas e o anticorpo (I9G1, cadeia leve lambda) foi expresso transientemente em células HEK293 EBNA.

O anticorpo foi purificado usando captura de proteína A e cromato- grafiade exclusão por tamanho.

A capacidade de 83-7 para aumentar fosfo- rilação de serina induzida por insulina de AKT foi medida usando o método descrito no Exemplo 5. A figura 44 mostra os resultados do ensaio de pAKT para 83-7 e AbOO1 em células CHOK1 expressando: (A) INSR humano, ou (B) INSR de camundongo. O anticorpo 83-7 não modula positivamente a sinalização de INSR dependente de insulina, mostrando apenas atividade agonista em INSR humana, e não apresentou agonismo em INSR de ca- mundongo. Em contraste, ADO01 modulou positivamente a sinalização de INSR dependente de insulina por cerca de 10 vezes em ambos INSR huma- no e INSR de camundongo. EXEMPLO 21 Ensaio para medir a modulação da afinidade de ligação a insulina para INSR por anticorpos anti-|NSR Para determinar a capacidade dos antibodes moduladores de afetar a ligação da insulina ao receptor de insulina, a afinidade de ligação de insulina não modificada para INSR humano expresso na superfície de células CHOKI1 privadas de soro (hINSR8-CHOK1) foi medida na presença e na ausência de anticorpos monoclonais para INSR. Um ensaio de KinExA foi desenvolvido para medir os níveis muito baixos de insulina em meios de cultura de células. Este ensaio permitiu que a ligação da insulina a células que expressam INSR fosse medida por determinação do nível de depleção de insulina a partir dos meios de cultura de células. Na medida em que a insulina tornou-se ligada às células, a concentração de insulina no meio de cultura de células caiu. Ao usar uma titulação de células que expressam INSR e medir o percentual de insulina livre, a afinidade da interação INS - INSR pode ser estimada usando o software KinExA. Este ensaio foi usado paramediro grau de modulação da atividade de ligação de insulina mostra- da por vários anticorpos anti-INSR.

Células hiINSR8-CHOK1 foram privadas de soro durante a noite, em seguida, preparadas para o ensaio por granulação de células e ressus- pensas a uma concentração de 2X a concentração de ensaio final para as diluições mais elevadas (entre 3,5x107 e 2,0 x10” célula/mL no tampão de diluição do ensaio de PBS (Teknova, Hollister CA) com 500ug/mL de BSA e 0,1% de azido de sódio (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)). Uma diluição de duas vezes em série de células foi preparada criando uma série de diluições de 10-pontos e um controle sem células também foi usado.

As suspensões de células foram aliquotadas em tubos de ensaio de polipropileno em 2 mL de volume de cada.

Para estas suspensões de células, 1 mL de 40ugimL de anticorpo de teste (ou 100ugiml para Ab078) foi adicionado a cada tubo, suavemente misturado e incubado durante 30-45 minutos em gelo.

Os anticorpos usados foram testados em comparação com o anticorpo anti-KLH de IgG2 humana de controle negativo. 1 mL de insulina 200pM foi adicio- nado a cada tubo para estabelecer uma concentração de insulina final da —50pM (300pgimL) (Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO). As amostras foram incuba- das durante a noite a 4ºC durante 18 horas, em seguida, centrifugadas para peletizar as células e os sobrenadantes foram removidos para ensaios.

Análise de KinExA 3000 foi realizada usando esferas revestidas com um anticorpo monoclonal anti-insulina. 2 gramas de esferas de poliíme- tacrilato de metila) (PMMA) (Sâpidyne, Boise, ID) foram suspensos em 9 ml de tampão de ensaio PBS contendo 65 ugwvmL de anticorpo monoclonal anti- insulina de camundongo D6C4 clone (Fitzgerald Industries, Acton MA). As esferas foram centrifugadas em temperatura ambiente durante 6 horas, em seguida, deixou-se assentar.

O sobrenadante foi substituído com PBS com 50mgimL de Fração V de BSA (Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO) e centrifugado durante a noite a 4ºC.

A solução de detecção usada foi clone D3E7 anti- insulina de camundongo biotinilada (Fitzgerald Industries, Acton MA) a 0,15pgimL em tampão de diluição de ensaio com Estreptavidina-PE em 1 ugimL (Invitrogen, Carlsbad, CA). No ensaio de KinExA 3000 a amostra foi injetada a 0,25mL/minuto por 240 segundos, em seguida, rinsada por 60 se- gundos em tampão de corrida (PBS com 0,05% azido de sódio), em seguida, solução de detecção foi injetada em 240 segundos, seguido por uma lava- gem final de 90 segundos em 1 mL/minuto.

A diferença de tensão a partir de um ponto de tempo inicial precoce e um ponto de tempo perto do final da execução foimedida e usada para calcular as afinidades.

A concentração de INSR sobre as células foi estimada em 2,5x10º receptores/célula.

A afinida- de foi determinada usando o software KinExA (Sãpidyne, Boise ID) e as

EC50 foram calculadas por ajuste não-linear em Prisma (GraphPad Software, La Jolla CA.). Um certo número de anticorpos anti-INSR intensificou a afinida- de de insulina para as células.

Outros anticorpos não tiveram nenhum efeito sobre a afinidade de insulina para as células (Tabela 8). Um dos anticorpos testados diminuiu a afinidade de insulina para as células em cerca de três vezes.

A figura 45 mostra a porcentagem de insulina livre plotada contra a concentração estimada do receptor de insulina.

O nível de insulina foi fixado em 50pM e a concentração do anticorpo foi 10ug/mL (67nM) para todos os clones, exceto Ab078 que foi testado a 25ugiml. (167NM). As curvas mos- tradas são o ajuste de Prisma de regressão não linear usado para calcular a EC50. A figura 46 mostra a percentagem de insulina livre plotada contra a concentração do receptor de insulina estimada.

O nível de insulina foi fixado em 50pM e a concentração do anticorpo foi 10ug/mL (67NM) para todos os clones.

As curvas mostradas são o ajuste de Prisma de regressão não linear usado para calcular a EC50. Tabela 8 Tabela de Afinidade de insulina e IC5O0 Mudança de vezes Anticorpo | Kp (pM) EC50 (pM) Na Afinidade | 1eea-ktm [ 272 | 365. | 10 || | abosz [| 2717 | am | ao | | anoot | a4o | 1094 | +56 | | abosz | 228 |O ag pa | abos2 | 7623 | 76 | 28 | | abors | 41 | 8 | +66 | | abors [| 121 | ão | +25 || | aboso | 112 | 3 | 3243 | | abosaz | 137 | 39 | 199 | aboss | 34 | 13 | 80 | EXEMPLO 22 Ensaio para medir a proliferação de células MCF-7 medida por insulina, IGF-1 e IGF-2 na presença ou ausência de anticorpos anti-|NSR A insulina, IGF-1, IGF-2 e promovem a mitogênese em MCF-7 células de adenocarcinoma mamário humano.

Estudos anteriores demons- traram que os análogos de insulina promovem a sinalização mitogênica além da sinalização metabólica após a ligação a INSR.

Os anticorpos anti-|NSR agonistas e moduladores positivos descritos aqui foram esperados para pro- movera sinalização mitogênica mediada por INSR em paralelo a sua ativa- ção de sinalização metabólica mediada por INSR.

Os efeitos dos anticorpos moduladores sobre estímulos mitogênicos mediados por insulina foram me-

didos usando células MCF-7 que expressam os receptores.

As células MCF-7 foram cultivadas em Meio Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glicose a 4,5 g /L suplementado com 10% de FBS e 2 mM de glutamina (Invitrogen) para a manutenção normal.

Para o ensaio de proliferação, as células foram semeadas em placas de microtitula- ção opacas brancas com 96 poços a uma densidade de 1 x 10º células/poço (Costar 3917) e deixou-se voltar a se ligar durante 24 horas.

Após 24 horas, as células foram lavadas 2x com PBS pré-aquecido e incubadas em DMEM contendo glicose a 1 g/L e nenhum vermelho de fenol suplementado com 0,1% de FBS e 2 mM de glutamina (Invitrogen), que será referido como “meio privado” por outras 24 horas.

Insulina (Sigma), IGF-1 (R&D Systems), e IGF-2 (R&D Systems) foram preparadas como estoques de 10x em meio privado e derialmente diluída 5 vezes começando de 1 uM até 64 nM (6 siluições), e adicionados às células apos o período de 24 h de privação.

Para os experimentos de co-incubação, que incluem os anticorpos anti-|NSR juntamente com o fator de crescimento, um estoque de 50 ug/ml de cada anticorpo foi preparado em meio de privado e adicionado às células antes da adição de fator de crescimento para uma concentração final de 5 ug/ml.

As células foram incubadas a 37 ºC durante 48 horas e a proliferação de células foi medida usando o ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo Luminescent

Promega). Os resultados são mostrados na Tabela 9.

Tabela 9: Resultados de proliferação de MCF-7 Valores de Intervalo de Confiança a 95% e ECs, em mm [ow [o em | Sem anticorpo| 0,80 0,48-1,33 1,73 1/07-2,80 1,30 0,80-2,11 KLH*| 1,54 1,03-2,29 2,10 1,33 - 3,30 2,66 1,75-4,06 AbO37* 1,54 1,00 - 2,37 233 1,51-3,58 2,09 1,44 -3,05 AbOS3*| 1,08 0,49-2,38 0,91 0,58- 1,43 1,47 0,77-2,81 AbO8SS*| 0,48 0,28-0,81 2,11 1,38-3,21 1,84 1,30 - 2,60 * Concentração de amicorpo — (95 ug/ml Estes resultados mostram que, surpreendentemente, na presen- ça de anticorpos anti-|NSR, nenhuma mudança significativa nas respostas — mitogênicas para qualquer um dos fatores de crescimento mencionados aci- ma foi observada dentro de um intervalo de confiança de 95%. É possível que estes anticorpos possam reagir de forma cruzada e fracamente se ligar a IGF-1 e IGF-2, mas o ensaio acima demonstra que qualquer ligação reacção cruzada possível não provoca um efeito funcional, isto é, não pro- move a sinalização através do receptor.

Isto sugere os anticorpos são capa- zes de aumentar a razão de metabólico para a sinalização mediada por INSR mitogênico.

EXEMPLO 23 Os efeitos de anticorpos anti-I|NSR para reverter captação de ácidos graxos resistente insulina em adipócitos 3T3-L1 diferenciados TNFa pode inibir a captação de insulina dependente de ácido graxo.

Uma vez que o TNFa é conhecido por causar resistência à insulina através de uma desativação de intermediários da via de sinalização de insulina, tais como IRS-1 (Nguyen et al, J.

Biol.

Chem. 280(42):35361-71, 2005;Lucae Olefsky, FEBS Let. 582: 97-105, 2008) que são também parte da via de captação de glicose dependente de insulina, a reversão da inibição de TNFa da captação de ácido graxo dependente de insulina por anticorpos anti-|NSR é um indicativo da capacidade destes anticorpos para reverter a inibição mediada por TNFa de captação de glicose dependente de insulina.

Fibroblastos embrionários de camundongos 3T3-L1 podem ser induzidos a diferenciar em adipócitos, após o que eles se tornam altamente responsivos à captação de ácido graxo mediada por insulina.

A alimentação rica em gordura foi estabelecida como uma causa de resistência à insulina de tecido adiposo.

Para examinar esta condição in vitro, adipócitos 3T3-L1 foram tratados com ácidos graxos livres (FFA) que resultam na transdução de sinal mediada por receptor de insulina prejudicada e, finalmente, capta- ção de glicose estimulada por insulina diminuída.

Uma das moléculas efeto- ras a jusante induzidas por tratamento com FFA que contribui para a resis- tência à insulina é o TNFa.

O TNFa também demonstrou inibir a captação de ácido graxo mediada por insulina e fornecer um sistema in vitro bem definido para avaliar se os anticorpos anti-|NSR podem reverter o transporte de ácido graxo resistente à insulina.

As células 3T3-L1 foram cultivadas em Meio Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glicose a 4,5 g /L suplementada com 10% de soro de cabra bebê (NCS; Invitrogen) e 2 mM de glutamina (Invitrogen) para a manutenção normal.

Para diferenciar células em adipócitos em placas de microtitulação de 96 poços, o protocolo que se segue foi usado: (1) no dia -5, 2 x 10º células por poço foram semeadas em uma placa de 96 poço de fundo preto/claro (BD Falcon 353948), (2) no dia -2, as células alcançaram confluência e são deixadas por 2 dias adicionais, (3) no dia O os meios de diferenciação adicionados, (4) no dia 3, o meio é trocado para meio de cres- cimento normal contendo 0,425 uM de insulina, (5) no dia 7, o meio é troca- do para meio de crescimento normal.

Para induzir a resistência a insulina, estoques de 10x de TNFa (R&D Systems) foram preparados em meio de crescimento normal e adicionados às células no dia 9 do processo de dife- renciação.

As concentrações de trabalho de TNFa usadas estavam entre 1- 10 ng/ml.

A captação de ácidos graxos foi executada em células no dia 10. O protocolo de captação de ácido graxo usado foi como se segue.

As células foram lavadas em 2x em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS; Invi- trogen) contendo 0,2% de BSA livre de ácido graxo (FAF-BSA; Sigma) e 20 mM de HEPES (Invitrogen) e, em seguida, soro privado em HBSS durante 1- 2h a37ºC.

Anticorpos anti-|NSR ou outros controles relevantes foram adi-

cionados a partir de um estoque de 10x ou HBSS individualmente e incuba- dos a 37ºC durante 30 minutos, e insulina foi adicionada em diluições a partir de um estoque de 10x, e incubados a 37ºC durante 30 minutos.

Um volume igual de tampão de carregamento de ensaio de captação de Ácido Graxo OQBT reconstituído (Molecular Devices) foi então adicionado e incubado a 37ºC durante até 3 horas, e as placas lidas em um leitor de placas fluores- cente para medir análogos de ácidos graxos fluorescentes internalizados.

A figura 47 mostra que o TNFa induz a dessensibilização de captação de ácido graxo mediada por insulina em adipócitos 3T3-L1, na presença de anticorpo anti- INSR AbO85. A Tabela 10 mostra a EC50 relativa para os anticorpos para a captação de ácidos graxos, demonstrando que Ab085 diminui o valor de EC50 para a captação de ácidos graxos.

Na presença de anticorpo anti-|lNSR AbO85, a dessensibilização induzida por TNFa da captação de ácido graxo mediada por insulina foi completamente invertida novamente para os valores de controle não tratados.

Resultados semelhantes foram observados para Ab083. Tabela 10 Valores de Intervalo de Confiança de 95% e EC50 oca om) | Insulina apenas 0,77 0,37 - 1,60 +TNFa 2,89 1,37 - 6,08 + TNFO, + anti-KLH 3,39 1,42-8,11 + TNFO,, + ADO85 0,32 0,14 - 0,75 Concentração de TNFo. & 1,25 ng/ml Concentração de AbO85 & 50 ug/ml! Estes resultados demonstram que o anticorpo modulador positi- vo pode aumentar a captação de ácido graxo em adipócitos, o que sugere que o anticorpo é útil para tratar um distúrbio ou condição que possa bene- ficiar da captação de ácidos graxos crescente.

EXEMPLO 24 Caracterização de anticorpos anti-INSR altamente purificados pela ativação de pAkt dependente de insulina Uma certa quantidade de variação de ensaio para ensaio foi notada nos ensaios de PIRS-1 e pAKT funcionais. Determinou-se que esta variação pode ser reduzida quando os anticorpos de teste foram purificados usando uma etapa adicional a purificação de proteínas-A, por exemplo, por cromatografia de exclusão por tamanho, resultando em anticorpos que eram aproximadamente>95% puros. Esta etapa de purificação reduziu ou eliminou agregados e fatores de crescimento contaminantes pensados para interferir com o ensaio funcional.

Um número de anticorpos anti-|NSR altamente purificados foram testados no ensaio de pAKT descrito no Exemplo 5, usando células CHOK1 expressando quer INSR humano ou INSR de camundongo. Além disso, certos anticorpos anti-I|NSR foram testados quanto à atividade de uma linha- gem de células CHOK1 transfectadas com INSR de macaco Cinomolgos (CHOK1-cinoINSR-4).

Os efeitos dos anticorpos anti-lNSR moduladores positivos AbOO1 e AbO37 e AbO77 e AbO79 e ABOSO e AbO83 foram medidos no ensaiode pAKT e os resultados são mostrados na figura 48 (INSR humano) e figura 49 (camundongo INSR).

Os % pAKT relativa de anticorpos agonistas Ab037, AbO3O, Ab053 e AbO62 em INSR humana e INSR de camundongo são mostrados nas figuras 50 e 51, respectivamente.

Os % de pAKT relativos de anticorpos moduladores positivos e anticorpos agonistas foram também medidos em células CHOK1 expressan- do INSR4 de macaco Cinomolgos. A figura 52 demonstra que os anticorpos anti-|NSR Ab030 e Ab037 e AbO53 e ABOO1 e AboO79, AbO8O e AbO83 são capazes de induzir a fosforilação de AKT após a ativação de INSR de maca- co.

Além disso, o % de pAKT relativo de anticorpos moduladores negativos AbO61, AbO70 e AbO81 também foram medidos em células

CHOK1 que expressam INSR humano. Os resultados são mostrados na Tabela 11 e na figura 53. Tabela 11 o Eme E de AbO61 | de AbO70 | de AbO81 controle de isotipo Mudança de vezes em EC50 com relação ao mAb | 269 17 38 de controle de isotipo ET E es 0,09691 a 0,1496 de confiança 73,25 2,598 5,843 Estes resultados demonstram que os anticorpos moduladores — negativos aumentam a EC50 de insulina, em alguns casos por várias cen- tenas de vezes. EXEMPLO 25 Avaliação das Espécies Reatividade cruzada de anticorpos Anti-INSR Este exemplo descreve o uso de um ensaio baseado em FACS para avaliar a ligação dos anticorpos do receptor de insulina às células de espécies, tais como coelho e macaco cinomolgo que são frequentemente usadas em estudos toxicológicos. Anticorpos anti-INSR de bibliotecas de exibição de fagos foram rastreados para ligação a ambos os monócitos de sangue periférico de coelho, humano e macacos cinomolgos e para a liga- ção diferencial na presença ou ausência do ligante (insulina) para os monó- citos das espécies acima citadas.

O sangue total de macaco Cinomolgo foi obtido a partir da Cali- fórnia National Primate Research Center (Davis, CA) e o sangue total de coelho foi obtido a partir de LifeSource Biomedical, LLC (Moffett Field, CA).

—PBMCs humanas foram purificadas usando Ficoll Hypaque de revestimentos inflamatórios obtidos a partir a American Red Cross. PBMC de cinomolgo e coelho foram então purificadas usando gradientes de Ficoll Hypaque (Phar- macia). As PBMC Purificadas foram congeladas e armazenadas em nitro- gênio líquido antes de seu uso no ensaio. PBMC humano, de cinomólogo e de coelho foram descongeladas e lavadas com tampão FACS (0,5% de BSA e 0,1% de NaN3 em PBS). Uma vez que as células foram preparadas, elas foram usadas no ensaio de coloração FACS a uma concentração final de 2x10 células /ml.

Para verificar ligações diferenciais, as células foram incubadas na presença ou ausência de insulina com concentrações decrescentes de anticorpo anti-|NSR a 4ºC durante 1 hora e lavadas uma vez com tampão FACS. A ligação do anticorpo anti-|NSR foi revelada pela adição de IgG Alexa647anti-humana de cabra (Jackson ImmunoResearch) durante 30 mi- nutosa4-ºC. Depois de lavar duas vezes com tampão FACS, as células fo- ram coradas com vários marcadores para capturar a população de monóci- tos. As células humanas e de cinomolgos foram coradas com CD45 e CD14. Células de coelho foram coradas com CD11b e CD14. Os anticorpos foram então incubados durante 20 minutos, e lavados duas vezes com tampão FACS.As células foram fixas com 2% de paraformaldeído e volume igual de tampão FACS foi adicionado antes da análise da célula. As células foram analisadas em um FACScan'" (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e os dados foram analisados usando tanto FloJo'"V (Tristar, Paso Robles, CA) e GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

A ligação vista em PBMC de humano, de coelho ou macaco cinomolgo foi confirmada através da geração de linhagens de células CHO que expressaram o receptor de insulina das espécies apropriado e repetindo o ensaio de ligação descrito acima. Os dados apresentados na figura 54 mostram que muitos dos anticorpos que se ligam ao receptor de Insulina Hu- manatambém se ligaram ao receptor de insulina de coelho e do cinomolgo e que esta ligação foi modulada pela presença de insulina.

EXEMPLO 26 Medição da Afinidade de Anticorpos Anti-INSR na Presença e Ausência de Insulina Humana A afinidade de vários anticorpos anti-|NSR para INSR humano recombinante expresso na superfície de células CHOK1 privadas de soro (hINSR8-CHOK1) foi medida na presença e ausência de insulina. Um ensaio de KinExA foi desenvolvido para medir os níveis muito baixos de anticorpo em um tampão de incubação.

Este ensaio permitiu que a ligação de anticor- pos a células que expressam INSR fosse medida por determinação do nível de depleção do tampão de incubalção.

Na medida em que o anticorpo tornou-se ligado às células, a concentração de anticorpo na solução tampão caiu.

Ao usar uma titulação de células que expressam INSR e medir o per- centual de anticorpo livre, a afinidade da interação de anticorpo para INSR pode ser estimada usando o software KinExA.

Este ensaio foi usado para determinar as afinidades relativas dos clones de anticorpos testados na presença ou ausência de insulina e demonstrou modulação dependente de insulina da ligação do anticorpo às células.

As células hiNSR8-CHOK1 foram privadas soro durante a noite e, em seguida, preparadas para ensaio conforme descrito no exemplo 20. Um mL de 4 ug/mL de insulina ou tampão foi adicionado a cada tubo para render uma concentração final de anticorpo de O ou 175nM (1 ug/mL). Em seguida, 1 ml! de 40 ng /mL de anticorpo, foi adicionado a cada tubo para se obter uma concentração de anticorpo final de 10 ng /mL ou 66,6 pM.

As amostras foram incubadas durante a noite a 4ºC durante 18 horas, em se- guida, centrifugadas para peletizar as células e os sobrenadantes foram removidos para teste em KinExA.

A análise de KinExA 3000 foi realizada como descrito no Exemplo 20 usando esferas revestidas com um fragmento (Fab')2 de IgG anti- humana de cabra (H + L) (Jackson Immuno Research, West Grove PA). A solução de detecção usada foi de fragmento R-PE- (Fab')> de IgG anti- humana de cabra (H + L) (Jackson Immuno Research, West Grove PA). Para o anticorpo de murino 83-7 as esferas foram conju- gadas como acima com um anticorpo de coelho anti-camundongo F-(ab '), de (Jackson Immuno Research, West Grove PA) e a solução de detecção usada foi um fragmento R-PE-(Fab')> de IgG anti-ccamundongo de cabra (H + L) (Jackson Immuno Research). A concentração de INSR sobre as células foiestimada em 2,5 x 10º receptores /célula e a ligação do anticorpo biva-

lente para INSR foi assumida.

As afinidades de um número de anticorpos anti-|NSR na presen-

ça e ausência de insulina são mostradas na Tabela 12. Os anticorpos agonistas Ab037, AbO53, e AbO62 têm de ligação que é independente de insulina e mostraram menos que duas vezes de mudança de afinidade na presença ou ausência de insulina.

O anticorpo de camundongo 83-7 teve uma mudança de afinidade três vezes modesta na presença de insulina, onde todos os anticorpos moduladores positivos AbOO01, Ab079, AbO8O, e Ab083 apresentaram modulação de ligação positiva na presença de insulina variando de 17 vezes para AbO80 para mais de 100 vezes para AbOO01. Os moduladores positivos Ab077 e Ab078 têm uma afinidade mais fraca na ausência de insulina do que os outros clones e, como resultado, a sua “afini- dade sem insulina” estava além da faixa de ensaio, que é limitada na con- centração de receptor máxima dado o uso dascélulas como uma fonte de receptor.

Embora a ligação possa ser vista com estes clones na ausência de insulina, a mesma é substancialmente mais fraca do que na presença de insulina e modulada em ma extensão muito maior do que 83-7, mas o grau de modulação não pode ser estimado com precisão com estas condições de ensaio.

ADO85 mostrou pouca ou nenhuma evidência de ligação na ausência de insulina e a sua ligação é considerada dependente de insulina.

EXEMPLO 27 Binning de Epítopo de Anticorpos Anti-INSR Uma abordagem multifatorial foi tomada para binning de epito- pos para determinar se vários anticorpos anti-|NSR se ligam a epitopos po- tencialmente similares ou se eles demonstraram diferenciais de proprie- dades de ligação e de reconhecimento de epítopo diferente. Experimentos de ligação competitiva ou de “binning" foram realizados bem como análise de capacidade dos anticorpos para ligar a diferentes espécies de humano e murino do receptor de insulina e sua capacidade de se ligar na presença e ausência de insulina. Todos estes são fatores na determinação da seme- lhança ou diferença potencial de epítopos de ligação do anticorpo. Os ensaios de citometria de fluxo foram realizados por análise da ligação de IgG biotinailada de células hinNSR8-CHOK1 privadas de soro e células CHOK1 MINSR na presença e ausência de insulina.

Para o ensaio de ligação competitiva, as células hINSR8-CHOK1 e as células CHOK1 mINSR foram privadas de soro durante a noite, em se- guida, preparadas para o ensaio como descrito no Exemplo 20. Em algumas modalidades, é útil calcular o número de receptores na superfície da célula para realizar os ensaios de ligação de competição. Por exemplo, os níveis de expressão de receptores de hiNSR8-CHOK1 foram determinados inicial- mente por coloração de células padrão e técnicas de citometria de fluxo. Re- sumidamente, este foi realizado por coloração de células com uma concen- tração saturante de Ab monoclonal MA-20 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) e detecção com anticorpo IgG anti-ccamundongo de cabra conjugado a R-ficoeritrina (Jackson Immuno Research, West Grove PA) e, em seguida, comparando a fluorescência relativa com Esferas BD Quantibrite"" PE (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ) para fornecer uma estimativa do número de moléculas de ficoeritrina ligadas e extrapolar o nú- mero de receptores de insulina com base no número de moléculas de ficoeri- trina ligadas. Este número foi, em seguida, ainda testado e aperfeiçoado usando KinExA como descrito no Rathanaswami et al., (Analytical Biochemistry 373:52-60, 2008). Resumidamente, as experiências de KinExXA foram realizadas verificando o anticorpo e a ligação da insulina em que a concentração de ligante usado era muito maior do que a aqui descrita para a determinação de afinidades que criam uma resposta à dose limitada mais estequiometricamente. Isto foi então analisado no software KinExA (Sapidyne, Boise ID) usando um modelo de ligante desconhecido e a determinação de um parâmetro multiplicador de ligante que foi usado para confirmar a concentração do receptor do ligante. No presente ensaio, por exemplo, estima-se que as células hINSR8-CHOK1 quando privadas de soro expressam cerca de 250.000 receptores de INSR tetraméricos por célula.

Paraa afinidade do anticorpo, isto significa a estequiometria de 2 anticorpos por tetrâmero receptor e para o sítio de ligação de insulina com afinidade elevada, uma razão de tetrâmero para insulina de 1:1.

Os anticorpos a serem testados foram biotinilados usando química de amina padrão e PEG4-Biotina ativada (Thermo-Fisher, Waltham MA). Os anticorpos de camundongo 83-7 e 83-14 foram também testados. Estes anticorpos foram relatados para se ligar aos aminoácidos 233-281 do domínio CR e para o domínio FnlIll-I de INSR, respectivamente (McKern et al, 2006; Nature 443: 218-21). Depois privadas de soro, as células foram transfectadas durante a noite, e as células foram coradas com uma titulação de anticorpos biotinilados na presença de 1 ug/ml de insulina. Os anticorpos foram incubados com células a 4ºC durante cerca de 30 minutos. As amostras foram então lavadas 2x em tampão FACS e estreptavidina-ficoeri- trina (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, EUA) foi usado para detectar o anticorpo biotinilado. As concentrações de anticorpos biotinilados usadas na experiência de binning foram selecionadas com base em que elas tenham uma subsaturação, mas ainda forte sinal, para a linhagem de células humana, na presença de insulina. Uma vez que as concentrações dos anticorpos biotinilados a serem usados foram determinadas experimental- mente, o ensaio de competição foi realizado como a seguir.

As células foram privadas de soro durante a noite, em seguida, ressuspensas em tampão FACS frio com ou sem 1 ugml de Insulina Humana. As células foram então misturadas 1:1 com 60 ug/mL de anticorpo competidor frio ou não marcado e incubadas a 4ºC durante cerca de 30 minutos, estabelecendo uma concentração Ab fria de 30 ug /mL. Os anticor- pos biotinilados foram então adicionados em uma diluição de 1:2 como uma concentração de 3x e incubados a 4ºC durante cerca de 30 minutos. As célulasforam então lavadas 2x em tampão FACS e detectadas com Estrep- tavidina-ficoeritrina e ensaiadas em um analisador de FACS (Becton Dickinson, San José, CA).

MFI foi comparado entre os anticorpos biotinilados quando mis- turado com um anticorpo de controle não ligante ou com um anticorpo con- corrente. A extensão da ligação foi medida nas linhagens de celulas huma- nas e murinas e na presença ou ausência de insulina. Uma abordagem matriz foi usada onde cada anticorpo biotinilado foi testado contra cada com- petidor frio. Os anticorpos com os mesmos perfis de competição são consi- derados como estando no mesmo bin. Agrupamentos de bin exemplares, tal como apresentados na Tabela 13 são derivados a partir das células hiNSR8- CHOK1 na presença de insulina já que virtualmente todos os clones tiveram ligação mais forte sob essas condições. Os clones mostrados na Tabela 13 são marcados para refletir outras propriedades de ligação, tais como a de- pendência de insulina e reatividade de murino.

Os resultados do experimento resultaram em cerca de sete dife- rentes bins de competição entre os anticorpos anti-|NSR. Um anticorpo com nenhuma competição é definido como exibindo menos de 30% da competi- ção, a competição parcial é a competição maior do que 30% e menor que 80%, e a competição completa é maior do 80% competição usando o méto- —dodescrito acima com hiNSR8-CHOK1.

Os anticorpos que mapeiam para Bin 1, que são reativos a hu- mano e murino, não demonstraram nenhuma competição com Ab0O79, Ab076, AbO83, parcial para completar a competição com Ab085 e Ab086 e competição completa com Ab030, AbO037, AbO53, AbOO1, AbO18, AbOG6A4 e, —AbO40.

Os anticorpos de Bin 2, que são reativos a humanos e murinos, apresentaram o mesmo perfil que aqueles anticorpos em Bin 1, mas não demonstraram nenhuma competição com Ab086 e competição parcial com AbO78.

Os anticorpos em Bin 3, que se ligam a INSR humano e murino, não apresentaram nenhuma competição com Ab062 e Ab086. A competição parcial com Ab0O86, AbO64, ABOO1, AbO1I8 e competição completa com Ab079, Abo76, AbO83, AbOSO, AbO62 e AbO20, AbO 19, AbOS8, AbO89.

Anticorpos Bin 4 que se ligam a apenas a receptor humano, não exibiram nenhuma competição com Ab062, AbO86, AbOO1, AbO18, AbO3O, AbO037, AbO64 e com a competição completa Ab079, Ab076, AbO83, AbO8O, AbO62 e Ab020, AbO19, AbOS8, AbO89.

Anticorpos Bin 5 não apresentam nenhuma competição com AbO077, AbOO1, AbO 18, AbO3O, AbO37, AbO79, AbO76, AbO83, AbO19, AbOB8, AbO089, e AbO40 e mostraram a competição completa com Ab064, Ab062, AbO085, e AbO078. Estes anticorpos reagem com receptor de humano e de

15. murino.

Anticorpos Bin 6 mostraram competição completa a parcial com quase todos os clones testados. O clone Ab061 teve menos de 30% da competição com Ab019 e o clone Ab074 não mostrou nenhuma competição com Ab088. Estes anticorpos reagem com receptor de humano e de murino.

Os anticorpos agrupados em Bin 7 não mostraram nenhuma competição com Ab053, AbO64, 83-7, Ab019, AbO8S8 e AbO89, mostraram competição parcial com Ab037, AbO78, ADO8S3, AbO8O e AbO8S5, e mostraram a competição completa com Ab040, AbO62, AbOSO, AbOO1, e AbO18. Estes anticorpos reagem tanto com receptor humano quanto com de murino.

Bin 4 de competição que contém o clone 83-7 murino continha todos os clones que não apresentavam reatividade a murino. Os agrupa- mentos de anticorpos foram correlacionados com as suas propriedades fun- cionais. Todos os anticorpos agonistas humanos se agruparam em Bin 1. Os anticorpos moduladores positivos se agruparam em bins 3 e 5 com exceção de AbOO4.Os anticorpos Bin 3 ligam-se ao complexo INSR -insulina e INSR individualmente, enquanto que os anticorpos bin 5 se ligam ao complexo insulina - INSR, mas não se ligam a INSR individualmente.

Tabela 13 e liga sentnimrao FER, Rm TERRAS RATE [Aba Label asia ASADaneoo Dabura | a ams | el | ADA qem rom coco DO ão Específico humano - aa.

Pe PEER, Várias modificações e variações na invenção conforme estabele- cidonos exemplos ilustrativos acima são esperadas ocorrer aos especialis- tas na técnica.

Consequentemente apenas tais limitações como aparecem eq nas reivindicações anexas devem ser colocadas sobre a invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo que se liga a (i) receptor de insulina ou (ii) um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina ou a ambos (1) e (ii), caracterizado pelo fato de que tem com uma constante de dissociação de equilíbrio Ko) de 10ºM ou menos que é capaz de reforçar a afinidade de ligação entre insulina e receptor de insulina em cerca de 5 vezes a 200 ve- zes.

2. Anticorpo agonista alostérico que se liga ao receptor de insu- lina, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de 109,10, 107, 10º, 10º, 10”, 10º M ou menos e (a) exibe atividade agonista máxima que é 20% a 80% daquela da atividade agonista máxima de insulina quando me- IM dida em ensaio pAKT, (b) quando presente não altera a EC50 de insulina para INSR em mais de 2 vezes e (c) quando presente não altera a KW de Í insulina para INSR em mais de 2 vezes.

. 15 3. Anticorpo agonista que se liga ao receptor de insulina com uma afinidade de 10º,108, 107, 10º, 10º 107º, 10” M ou menos, carac- " terizado pelo fato de que opcionalmente exibe atividade agonista máxima que é 20% a 100% daquela da atividade agonista máxima de insulina quan- do medida em ensaio pAKT.

4. Anticorpo que se liga a (i) receptor de insulina ou (ii) um com- plexo compreendendo insulina e receptor de insulina, ou ambos (i) e (ii), caracterizado pelo fato de que tem uma constante de dissociação de equili- brio Ko de 10ºM ou menos que é capaz de enfraquecer a afinidade de ligação entre insulina e receptor de insulina em pelo menos 3 vezes, opcio- —nalmente até 1000 vezes.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que tem as seguintes propriedades de ligação de constante de dissociação de equilíbrio Kp: (1) o dito anticorpo se liga com uma constante de dissociação de equilíbrio Ko de cerca de 10ºM, 108, 107, 10º, 10º 107º, 107? M ou menos a um complexo compreendendo insulina (C1) e receptor de insulina (C2); e cerca de 5 vezes mais baixo do que qualquer um de Kac2 ou Kac1.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que qualquer um de Krcicaja, Kiaacaio1 OU Kaacijca É cerca de 5 vezes a 200 vezes mais baixo que qualquer um de Kac2 ou Kac1.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 5 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao receptor de insulina.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 5 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um complexo insulina/ receptor de insulina.

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma as reivindicações 1, GG reivindicações 5 a 6 e reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga de forma detectável ao receptor de insulina sozinho. í 10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 VW 15 e5aso, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de reforçar a afinidade de ligação entre insulina e receptor de insulina em cerca de 5 ã vezes a 25 vezes.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é qualquer uma de Ka, Kp, da razão de taxa de associação para taxa de dissociação ou a razão de taxa de dissociação para taxa de associação.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 10 a 11, caracterizado pelo fato de que ativa o receptor de insulina em pelo menos 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente em um ensaio AKT fosforilado.

13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 10 a 11, caracterizado pelo fato de que ativa o receptor de insulina em menos de 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente em um ensaio AKT fosforilado.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3 ou 5 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma — o . : o SEC

ID NOs:, 281, 278, 277, 209, 275, 223, 284, 276 e 236 e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 141, 138, 137, 35, 135, 57, 144, 136 e 98.

15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3ou5al14,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) a região variável de cadeia pesada de qualquer um de AbOO6, AbO30, AbOOA4, AbO13, ADOO9, AbOO7, AbO11, AbOO1, AbO12, AbO1O, Ab0OO03, AbOO8, AbOO2, AbOOS, AbO76, AbO77, AbO79, AbO8SO, AbO83, AbOS9, AbO78, AbO8S5 ou estabelecida em SEQ ID NO: 291, 196, 239, 267 e 271 ea região variável de cadeia leve de qualquer um de Ab0O6, Ab030, AbOOA, AbO013, ADOOS, AbOO7, AbO11, ADOO1, AbO12, AbO1O, AbOO3, AbOO8, AbOO2, o AbOO5, AbO76, AbO77, AbO79, AbOSO, AbO83, AbOS9, AbO78, AbO8SS ou estabelecida em SEQ ID NO: 76, 80, 101, 128 e 132, ou f (b) uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada de qualquer um B 15 de AbOO6, AbO3O, AbOO4, AbO13, AbOOS, AbOO7, AbO11, AbOO1, AbOÍ2, AbO10, AbOO3, AbOO8, AbOO2, AbOOS, AbO76, AbO77, AbO79, AbO8SO, AbO83, - AbO59, AbO78, AbO8S5 ou estabelecidas em SEQ ID NO: 291, 196, 239, 267 e 271 e/ou uma, duas ou três CDRs de cadeia leve de qualquer um de AbOO6, AbO30, AbOO4, AbO13, ADOOS, AbOO7, AbO11, AbOO1, AbO012, AbOÍO, —AbOO3, AbOO8, AbOOZ, AbOOS, AbO76, AbO77, AbO79, AbO8SO, AbO83, AbOSO, AbO078, AbO85 ou estabelecidas em SEQ ID NO: 76, 80, 101, 128 e 132, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer um, dois ou três de tais CDRs de cadeia pesada ou leve, por exemplo, uma substituição conservativa ou não conservativa; ou (c) todos os seis CDRs de qualquer um de Ab0OO6, AbO3O, AbOO4, Ab013, AbOO9, AbOO7, AbO11, AbOO1, AbO12, AbO1O, AbOO3, AbOO8, AbOO02, AbOOS5, AbO76, AbO77, AbO7T9, AbO8SO, AbO8S, AbOS9, AbO78, AbO8S ou SEQ ID NO: 76, 80, 101, 128, 132, 291, 196, 239, 267 e 271.

16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3e5al15, caracterizado pelo fato de que exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos e Ab020, AbO19, AbOS8 e AbOB9, e opcionalmente exibe competição maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab0O86, AbO64, AbOO1 e Ab018.

17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 e 5 a 15, caracterizado pelo fato de que exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos seleciona- dos do grupo consistindo em AbO040, Ab0O62, AbO3O, AbOO1 e ALbO1I8, e opcionalmente exibe competição maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab037, o AbO078, AbO83, AbO8O e AbO8S5.

18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações Í 1,3,5a6e8as, caracterizado pelo fato de que exibe competição maior ou : 15 igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecio- nados do grupo consistindo em AbO64, AbO62, AbO85 e AbO78. n 19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é capaz de enfraquecer a afinidade de ligação entre a dita insulina e o receptor de insulina em cerca de 3 vezes a 500 vezes.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação é qualquer uma de Ka, Kp, a razão de taxa de associação para taxa de dissociação ou a razão de taxa de dissociação para taxa de associação.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo aumenta a EC50 de atividade de sinalização de insulina em cerca de 2 vezes a 1000 vezes, opcionalmente em um ensaio pAKT.

22. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou19a221, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em SEQ selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 103, 139, 119, 8 e 89.

23. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) a região variável de cadeia pesada de qualquer um de —AbO87, AbO19, AbOS8, AbOS9, AbOZO0, AbOSO, AbOS2, AbOSS, AbOS57, ALO61, AbO63, AbO6S5, AbO70O, AbO72, AbO74, AbO81 e a região variável de cadeia leve de qualquer um de AbO87, AbO19, AbO8S8, AbO8S9, AbO20, AbOS5O, AbO052, AbOS5, AbOS57, AbO61, ADO63, AbO6S, AbO70O, AbO72, AbO74, AbO81, ou (b) uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada de qualquer um de AbO87, AbO19, ALOS8, AbOS9, AbO20, AbOSO, AbO52, AbOSS5, AbOS7, - AbO61, AbO63, AbO6S5, AbO7O, AbO72, AbO74, AbO81 e/ou uma, duas ou três CDRs de cadeia leve de qualguer um de Ab087, AbO19, AbO88, AbO8O9, Í AbO20, AbOSO, AbOS2, AbOSS, AbOS57, AbO61, AbO63, AbO6GS, AbO7O, AbO72, y 15 AbO7A4, ADbO81, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer um, dois ou três de tais CDRs de cadeia pesada ou leve, por exemplo, uma 7 substituição conservativa ou não conservativa; ou (c) todos os seis CDRs de qualquer um de AbO87, AbO19, AbO88, AbO89, AbO20, AbOS5O, AbOS52, AbOSS, AbOS57, AbO61, AbDO63, AbOG6S, —AbO7O, AbO72, AbO74, AbOB1.

24. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 e 19 a 23, caracterizado pelo fato de que exibe competição maior ou igual a 70% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab079, AbO76, Ab083, ADO8O, ADO62 e AbO20, AbO19, —AbO8S8, AbO89, opcionalmente em que o anticorpo se liga a receptor ou complexo humano e não a receptor ou complexo murino.

25. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 195, 220, 303, 197,208,243,245 e 251 e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 77, 50, 90, 84, 34, 104, 106 e 112.

zado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) a região variável de cadeia pesada de qualquer um de AbO021, Ab0O29, AbO022, AbO017, AbO23, AbO24, AbO25, Ab0O26, AbO31, AbO3S, Ab027, AbO36, AbO37, AbO28, AbOS8, AbOS9, AbO4O, AbO41, AbO42, Ab0O32, —AbO43, ADbO44, AbO45, AbO46, AbO47, AbO18, AbOSS3, AbO48, AbO14, AbOÍS, AbO49, AbO34, AbO51, AbOSS, AbOS4, AbOS6, ADOS8, AbO62, AbOGA4, AbOGS6, AbO67, ALOG8, AbOSS, AbOG9, AbO71, AbO73, AbO75, AbO82, AbO84 estabelecida em SEQ ID NOs: 252, 253, 263, 265 e 269, e a região variável de cadeia leve de qualquer um de Ab021, Ab029, Ab022, AbO017, AbO23, —Ab024,AbO025, AbOZ6, AbO31, AbO3S5, AbO27, AbO3G6, AbO37, AbO28, AbO38, AbO039, AbO40, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO44, AbO45, AbO46, AbO47, ss" Ab018, AbO33, AbO48, AbO14, AbO15, ADO49, AbOSA, ADOS1, AbO53, AbOSA, AbOS56, AbOS8, AbO62, AbO6G4, ADOGG, AbOS7, ADOSS, AbOSG, AbOG9, AbO71, i AbO073, AbO75, AbO82, AbOSA4 ou estabelecida em SEQ ID NOs: 7, 113, 114, BR 15 124,126€130,ou

(b) uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada de qualquer um í de Ab0O21, AbO29, AbO22, AbO17, AbO23, AbO24, AbO25, AbOZ6, AbO31, AbO35, AbO27, AbO36, AbO37, AbO28, AbO38, AbO39, AbO40, AbO41, AbO42, Ab032, AbO43, AbO44, AbO45, AbO46, AbO47, AbO18, Ab0O33, AbO48, AbO1A, —AbO15,AbO49, AbO3A4, AbOS1, ADOS53, AbOSA, AbOSG, AbOS8, AbO62, AbOGA, AbOG66, AbO67, AbOSS, AbOSG6, AbOS9, AbO71, AbO73, AbO75, AbO8S2, ADO8S4 ou estabelecidas em SEQ ID NOs: 252, 253, 263, 265 e 269 e/ou uma, duas ou três CDRs de cadeia leve de qualquer um de AbO21, Ab029, AbO022, Ab017, Ab023, AbO24, AbO25, AbOZ6, AbO31, AbO3S, Ab027, AbO3S6, AbO37, —AbO28,AbO38, AbO39, AbO40, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO44, AbO45, AbO46, AbO47, AbO18, AbO33, AbO48, AbO14, AbO15, AbO49, AbOSA4, AbOS1, AbO53, AbOSA4, AbOS6, AbOS8S, AbO62, AbOSA4, ADOG6, AbO67, AbO6G8, AbO8S6, AbO69, AbO71, AbO73, AbO75, AbO82, AbO8SA4 ou estabelecidos em SEQ ID NOs: 7, 113, 114, 124, 126 e 130, opcionalmente incluindo uma ou duas mutações em qualquer um, dois ou três de tais CDRs de cadeia pesada ou leve, por exemplo, uma substituição conservativa ou não conservativa; ou

Ab022, AbO0 17, AbO23, AbO24, AbO25, AbO26, AbO31, AbO35, AbO27, AbO36, AbO037, Ab028, AbO38, AbO3S9, AbO40, AbO41, AbO42, AbO32, AbO43, AbO4A, AbO45, AbO46, AbO47, AbO18, AbO33, AbO48, AbO 14, AbO1S5, AbO49, AbO3A, AbOS1, AbO53, AbOS4, ADOS6, ADOS8, AbO62, AbO64, AbOGSS, AbO67, AbO6S8, AbO8S6, ADbO69, AbO71, AbO73, AbO75, AbO82, AbO8SA4 ou estabelecidos em SEQ ID NOs: 7, 113, 114, 124, 126, 130, 252, 253, 263, 265 e 269.

27. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3,25 e 26, caracterizado pelo fato de que exibe competição maior ou igual a 70%, 75% ou 80% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab030, AbO37, AbO53, AbOO1, AbO18, AbO64, AbO40 e opcionalmente " exibe competição maior ou igual a 30% com qualquer um, dois, três ou todos os anticorpos selecionados do grupo consistindo em Ab085 e | AbOB6. " 15 28. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma CDR de f cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 estabelecida em SEQ ID NOS: 151-303.

29. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a728, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NOS: 151-303.

30. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma CDR de cadeia leve LCDR1, LCDR2 ou LCDR3 estabelecido em SEQ ID NOS: 1-

150.

31. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NOS: 1-150.

32. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a31,caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma região constan- te de cadeia pesada IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.

pelo fato de que ainda compreende uma região constante de cadeia leve humana.

34. Anticorpo que se liga especificamente a (i) receptor de insuli- na ou (ii) um complexo compreendendo insulina e receptor de insulina ou ambos (i)e (ii), caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOS: 151-303 e tem uma constante de dissociação de equilíbrio Kp de 10ºM ou menos.

35. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada de SEQ IDNOS:151-303.

36. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado Y pelo fato de que compreende pelo menos uma de LCDR1, LCDR2 ou LCDR3 de SEQ ID NOS: 1-150. í 37. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações . 15 34a36,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. Tr 38. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma, duas ou três CDRs de cadeia pesada estabelecidas em SEQ ID NOS: 151-303.

39. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 38, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma, duas ou três CDRs de cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOS: 1-150.

40. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NOS:1-150.

41. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma região cons- tante de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.

42. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a receptor de insulina. 3 Ami - EAN

34 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um complexo insulina/receptor de insulina.

44, Anticorpo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga de modo detectável ao receptor de insulina sozinho.

45. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 5a 18, e 25 a 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo reduz níveis de glicose no sangue em jejum em um sujeito tendo glicose no san- gue elevada para níveis de glicose normais.

46. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 44, caracterizado pelo fato de que ativa o receptor de insulina em pelo di menos 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente em um ensaio AKT fosforilado.

Í 47. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações ' 15 34 a 44, caracterizado pelo fato de que ativa o receptor de insulina em menos de 10% do sinal máximo de insulina, opcionalmente em um ensaio í AKT fosforilado.

48. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo —monoclonal.

49. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo humano.

50. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a49, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com uma metade hidrofóbica.

51. Método para preparar uma composição farmacêutica estéril, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar um diluente farmaceu- ticamente aceitável a um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50.

52. Composição estéril, caracterizada pelo fato de que compre- ; fin E a 50 e um diluente farmaceuticamente aceitável estéril.

53. Método para tratar um distúrbio associado com resistência à insulina, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um anticor- po como definido em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 5a 18e25a S50emuma quantidade eficaz para tratar resistência à insulina.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo consistindo em hiper- glicemia, pré-diabetes, síndrome metabólica (também denominada síndrome de resistência à insulina), 2 diabetes mellitus Tipo 2, doença de ovário policístico (PCOS), doença hepática gordurosa não alcóolica (NAFLD), esteato-hepatite não alcóolica (NASH), esteatose, obesidade, dislipidemia, E síndrome de Rabson-Mendenhall, síndrome de Donohue ou Leprecaunismo.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado Í pelo fato de que o tratamento intensifica absorção de glicose. a 15 56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pe- lo fato de que a absorção de glicose intensificada é selecionada do grupo ' consistindo em uma elevação na taxa de absorção de glicose, uma elevação na quantidade total de absorção de glicose, ou ambas.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelofatode que o tratamento desacelera ou reduz ganho de peso no sujeito em comparação com um sujeito não tratado.

58. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em uma diminuição em níveis de HbA1c em comparação com um sujeito não tratado.

59. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em um teste de tolerância a glicose melhorado ou nível de glicose de 2 horas reduzido durante um teste de tolerância a glicose.

60. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelofato de que o tratamento resulta em uma melhora de um sintoma asso- ciado com resistência à insulina selecionado do grupo consistindo em dislipi- TFT -úuemia, triglicerídeos no plasma, HOMA-IR, cotesterol não esterificado MO TT ——

plasma, colestero! total no plasma, insulina no plasma, razão de colesterol não-HDL/HDL, razão de colesterol tota/HDL, função celular beta e níveis de leptina no plasma.

61. Método para tratar uma condição associada com hiperinsuli- nemia ou excesso de sinalização de insulina, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um anticorpo das reivindicações 4 e 19 a 24 em uma quantidade eficaz para tratar hipoglicemia ou sensibilidade a insulina.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pe- lo fato de que a condição é selecionada do grupo consistindo em câncer, insulinoma, sarcoma de Kaposi, overdose de insulina, hipoglicemia, nesidio- blastose (Doença Difusa KATP-HI, Doença Focal KATP-HI ou “PHHI”), GDH- V HI (Síndrome de Hiperinsulinismo/Hiperamonemia (HI/HA), hipoglicemia sen- sível a leucina ou hipoglicemia sensível a diazóxido), síndrome de desre- gulação de ilhota, hipoglicemia idiopática da infância, Hipoglicemia Hiperin- " 15 —sulinêmica Persistente da Infância (PHHI), Hiperinsulinismo Congênito, hipo- glicemia devido a falha renal (aguda ou crônica) e hipoglicemia devido a 7 doença dos rins crônica.

63. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição para tratar um distúrbio associado com resistência à insu- lina.

64. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição para tratar uma condição associada com hiperinsulinemia —ouexcesso de sinalização de insulina.

65. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, reve- lada ou ilustrada no pedido de patente.