KR101890210B1 - 인슐린 수용체 결합 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린 수용체 시그날 전달을 조절하는 항체를 제공한다.

Description

인슐린 수용체 결합 항체{INSULIN RECEPTOR BINDING ANTIBODIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 9월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/246,067호, 2010년 2월 19일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/306,321호 및 2010년 6월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/358,749호의 우선권을 주장하고 상기 각각의 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명은 인슐린-인슐린 수용체 시그날 전달 복합체의 신규 조절제 및/또는 효능제 및 상기 조절제 및/또는 효능제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 조절제 및/또는 효능제는 예를 들어, 2형 당뇨병, 비만, 고혈당증, 고인슐린혈증, 인슐린 과용, 만성 신장 질환, 1형 당뇨병, 인슐린 내성 및 인슐린 내성을 특징으로 하는 질환 상태 및 증상을 치료하거나, 이의 위험에 처한 피검체에서 상기 질환의 발병을 예방하기 위해 사용될 수 있다.
본원은 인슐린-인슐린 수용체 시그날 전달 복합체의 신규한 조절제 및/또는 효능제, 상기 조절제 및/또는 효능제를 스크리닝하는 방법 및 인슐린의 비정상적인 생성 및/또는 이용을 특징으로 하는 질환 상태 및 증상의 치료 또는 예방에 있어서의 상기 조절제 및/또는 효능제의 용도에 관한 것이다.
상기 펩타이드 호르몬 인슐린은 글루코스 항상성 및 세포 성장의 주요 조절제이다. 인슐린 작용의 제1 단계는 CD220 또는 HHF5로서 또한 지칭되는 통합 막 당단백질인 인슐린 수용체(INSR)에 상기 호르몬이 결합하는 것이다. INSR은 티로신 키나제 성장 인자 수용체 슈퍼패밀리에 속하고 인슐린과 결합하는 2개의 세포외 α서브유니트와 고유 티로신 키나제 활성을 갖는 2개의 막관통 β 서브유니트로 구성된다. INSR의 상기 아미노산 서열은 미국 특허 제4,761,371호에 기재되어 있고 NCBI 참조 서열 NP_000199.2로서 기재되어 있다. 상기 INSR은 2개의 이소타입, INSR-A 및 INSR-B로 발현된다. 사람 INSR의 온전한 동종이량체성 엑토도메인 단편의 3차원 구조는 X-선 결정학을 사용하여 밝혀졌다(WO07/147213). INSR 이소타입은 또한 이종이량체 INSR-A/INSR-B, 및 하이브리드 INSR/IGF-1R 수용체를 형성하고, 생리학 및 질환에서 이의 역할은 아직 완전하게 이해되고 있지 않다(문헌참조: Belfiore et al, Endocrine Rev., 30(6):586-623, 2009).
인슐린이 INSR에 결합하는 경우, 상기 수용체는 티로신 자가인산화에 의해 활성화되고 INSR 티로신 키나제는 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1)을 포함하는 다양한 이펙터 분자를 인산화시켜 호르몬 작용을 유도한다(문헌참조: Ullrich et al, Nature 313: 756-761, 1985; Goldfine et al, Endocrine Reviews 8: 235-255, 1987; White and Kahn, Journal Biol. Chem. 269: 1-4, 1994). IRS-1 결합 및 인산화는 궁극적으로 근육 세포 및 지방 조직을 포함하는 인슐린 반응성 조직의 외막상에 고친화성 글루코스 수송체(Glut4) 분자를 증가시키고 따라서 혈액으로부터 상기 조직으로의 글루코스 흡수를 증가시킨다. Glut4는 세포 소포로부터 세포 표면으로 수송되고 여기서, 이것은 글루코스의 세포로의 수송을 매개할 수 있다. INSR 시그날 전달의 감소는 세포에 의한 글루코스의 흡수를 감소시켜 고혈당증(순환계중 글루코스의 증가) 및 이로부터 비롯되는 모든 후유증을 유도한다.
글루코스 흡수의 감소는 인슐린 내성을 유발할 수 있고 이는 생리학적 인슐린의 양이 세포 또는 조직으로부터 정상적인 인슐린 반응을 생성하기에 부적절한 증상을 일컫는다. 중증 인슐린 내성은 당뇨병과 관련되고, 덜한 중증 인슐린 내성은 또한 비-당뇨병 개체의 대략 30 내지 40%에 존재하는 다수의 질환 상태 및 증상과 관련된다(문헌(참조: Woods et al, End, Metab & Immune Disorders -Drug Targets 9: 187-198, 2009)에서 검토됨).
당뇨병 및 인슐린 내성에 대한 현재 치료는 인슐린 분비를 개선시키고, 글루코스 생성을 감소시키고 인슐린 작용을 증진시키는 것이다.
현재, 2형 당뇨병을 치료하기 위한 다양한 약리학적 방법이 있다(문헌참조: Scheen et al, Diabetes Care, 22(9): 1568-1577, 1999; Zangeneh et al, Mayo Clin. Proc. 78: 471-479, 2003; Mohler et al, Med Res Rev 29(1): 125-195, 2009). 이들은 상이한 방식의 작용을 통해 작용한다: 1) 설포닐우레아(예를 들어, 글리메피리드, 글리센타이드, 설포닐우레아, AY31637)는 근본적으로 인슐린 분비를 자극하고; 2) 비구아니드(예를 들어, 메트포르민)은 글루코스 이용을 촉진시키고, 간 글루코스 생성을 감소시키고 장 글루코스 생산량을 감소시킴에 의해 작용하고; 3) 알파-글루코시다제 억제제(예를 들어, 아카보스, 미글리톨)은 탄수화물 소화를 지연시켜 결과적으로 소화관으로부터의 흡수를 지연시키고 식후 고혈당증을 감소시키며; 4) 티아졸-이디네디온(예를 들어, 트로글리타존, 피오글리타존, 로시글리타존, 글리피지드, 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, NIP 223, NIP 221, MK 0767, 시글리타존, 아다글리타존, CLX 0921, 다글리타존, CP 92768, BM 152054)은 인슐린 작용을 증진시켜 말초 조직에서 글루코스 이용을 촉진시키고; 5) 글루카곤형 펩타이드 및 효능제(예를 들어, 엑센딘) 또는 이의 안정화제(예를 들어, DPP4 억제제, 예를 들어, 시타글립틴)는 글루코스 자극된 인슐린 분비를 강화시키고; 6) 인슐린 또는 이의 유사체(예를 들어, LANTUS®)는 조직 글루코스 이용을 자극하고 간 글루코스 생산량을 억제한다. 상기 언급된 약리학적 방법은 개별적으로 또는 조합 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 방법은 이의 한계 및 부작용을 갖는다. 시간이 경과함에 따라 많은 비율의 2형 당뇨병 피검체는 이들 제제에 대한 반응성을 상실한다. 2형 당뇨병 환자중 63%는 미국 당뇨병 연합회에 의해 충고된 바와 같이 7% 미만의 전체 HbA1c 수준에 도달하는데 실패하고 따라서 합병증이 발병할 높은 위험에 처하게 된다. 더욱이, 거의 예외없이 환자는 쇠퇴된 췌장 기능의 단계들을 통해 진행한다. 인슐린 치료는 전형적으로 식후, 운동후에 개시되고 경구 약물 투여는 혈당을 적당히 조절하는데 실패했다. 인슐린 치료의 결점은 약물 주사가 필요하고 저혈당증에 대한 잠재력이 있고 체중이 증가한다는 것이다. 결과적으로 여전히 신규한 항당뇨병제가 절실히 요구되고 있다.
사람 INSR에 결합하는 항체는 문헌[참조: Soos et al, Biochem. J. 235: 199-208, 1986; Taylor et al, Biochem. J. 242: 123-129, 1987; Prigent et al, J. Biol. Chem. 265(17):9970-9977, 1990; Brindle et al, Biochem. J. 268: 615-620, 1990; Steele-Perkins and Roth, J. Biol. Chem. 265(16): 9458-9463, 1990; McKern et al, Nature 443(14): 218-221; Boado et al, Biotech and BioEng. 96(2): 381-391; WO04/050016; Roth et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7312-7316, 1982; Morgan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 328-332, 1986; Lebrun et al, J. Bl. Chem. 268(15): 11272-11277, 1993; Forsayeth et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3448-3451, 1987; Forsayeth et al, J. Biol. Chem. 262(9): 4134-4140, Goodman et al, J. Receptor Res. 14(6-8), 381-398, 1994; Ganderton et al, Biochem J. 288: 195-205, 1992; Spasov et al, Bull. of Exp. Biol. and Med. 144(1): 46-48, 2007; EP 2 036 574 A1]에 보고되었다.
발명의 요약
본 발명은 인슐린과 복합체를 형성하지 않은 INSR의 세포외 영역, 인슐린과 복합체를 형성한 INSR 또는 이들 둘다에 결합함에 의해 인슐린-INSR 시그날 전달 복합체를 조절하고/하거나 효능화시키는 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. INSR은 막 결합된 세포 표면 수용체이다.
하나의 측면에서, 본 발명 인슐린과 인슐린 수용체(INSR)간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 약 5배 내지 200배로 강화시킬 수 있는, 평형 해리 상수 KD가 10-5M 이하인, 인슐린 수용체 및/또는 인슐린 및 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 결합하는 항체를 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 약 1.5배 내지 약 100배, 또는 약 2배 내지 25배로 강화시킬 수 있다. 추가로, 상기 조절이 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배, 예를 들어, 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9베, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배, 또는 100배 이하, 또는 90배 이하, 또는 80배 이하, 또는 70배 이하, 또는 60배 이하, 또는 50배 이하, 또는 40배 이하, 또는 30배 이하, 또는 20배 이하, 또는 10배 이하인 것이 고려된다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100배 이상 또는 이들 값 중 어느 사이의 임의의 범위로 강화시킨다. 몇몇 양태에서, 결합 친화성은 KA, KD, 오프-레이트(off-rate)에 의해 나누어진 온-레이트(on-rate)의 비, 또는 온-레이트에 의해 나누어진 오프-레이트의 비 중 어느 하나이다. 특이적인 예시적 양태에서, 상기 항체는 목적하는 배수로 KA를 증가시키거나 목적하는 배수로 KD를 감소시키거나 해리율에 대한 결합율의 비를 목적하는 배수로 증가시키거나 결합율에 대한 해리율의 비를 목적하는 배수로 감소시킨다. 몇몇 양태에서, 상기 결합율(binding rate) 파라미터는 온-레이트 또는 오프-레이트이다. 특정 예시적인 양태에서, 상기 항체는 결합율을 증가시키거나 해리율을 감소시킨다. 대안으로, 결합 친화성이 검출가능하게 또는 유의적으로 변화되지 않는 몇몇 양태에서, 결합율 및 해리율을 증가시켜 시그날 전달 경로는 유사분열 촉진성 시그날 전달로부터 대사적 시그날 전달(글루코스 흡수) 쪽으로 전환될 수 있다.
하나의 양태에서, 인슐린과 INSR간의 결합 친화성을 강화시키는 항체는 양성 조절제이다.
또 다른 측면에서, 항체는 효능제이다.
관련 측면에서, 인슐린에 의존하지 않고 INSR을 활성화시키는 항체는 알로스테릭 효능제이다. 특정 양태에서, 본 발명은 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 M 이상의 친화성으로 인슐린 수용체에 결합하고 (a) pAKT 분석으로 측정시 인슐린의 최대 효능제 활성의 20% 내지 80%인 최대 효능제 활성을 나타내며, (b) 존재하는 경우 INSR에 대한 인슐린의 EC50을 2배 이상으로 변화시키지 않고, (c) 존재하는 경우 INSR에 대한 인슐린의 KD를 2배 이상으로 변화시키지 않는 알로스테릭 효능제 항체를 제공한다.
관련 양태에서, 알로스테릭 효능제는 인슐린의 최대 효능제 반응의 80% 이하, 예를 들어, 15%-80%, 20-60%, 20%-40% 또는 15%-30%를 나타낸다. 특정 양태에서, 상기 항체는 인슐린 최대 효능제 반응의 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상; 및 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이하인 최대 효능제 반응으로 INSR을 항상성으로 활성화시킨다. 이들 범위 종점 중 어느 하나의 임의의 조합이 각각의 가능한 조합을 언급할 필요 없이 고려되는 것으로 이해된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 약 1.5배 내지 100배로 약화시킬 수 있는, 10-5 M 이하의 평형 해리 상수 KD로 인슐린 수용체 및/또는 인슐린 및 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 결합하는 항체를 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 약 2 배 내지 25배 또는 1.5배 내지 25배 또는 2배 내지 50배로 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 약화시킬 수 있다. 추가로 상기 조절이 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배, 예를 들어, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 이상 또는 100배 이하 또는 90배 이하 또는 80배 이하 또는 70배 이하 또는 60배 이하 또는 50배 이하, 또는 40배 이하 또는 30배 이하 또는 20배 이하 또는 10배 이하인 것이 고려된다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100배 이상 또는 이들 범위중 어느 하나간의 임의의 범위로 약화시킨다. 몇몇 양태에서, 상기 결합 친화성은 KA, KD, 오프-레이트에 의해 나눈 온-레이트의 비 또는 온-레이트에 의해 나눈 오프-레이트의 비 중 어느 하나이다. 특정 예시적 양태에서, 상기 항체는 목적하는 배수로 KA를 감소시키거나 목적하는 배수로 KD를 증가시키거나 목적하는 배수로 오프-레이트에 대한 온-레이트의 비를 감소시키거나 목적하는 배수로 온-레이트에 대한 오프-레이트의 비를 증가시킨다. 몇몇 양태에서, 결합율 파라미터는 온-레이트 또는 오프-레이트이다. 특정 예시적 양태에서, 상기 항체는 온-레이트를 감소시키거나 오프-레이트를 증가시킨다.
하나의 양태에서, 인슐린과 INSR간의 결합 친화성을 약화시키는 항체는 음성 조절제이다. 몇몇 특정 양태에서, 인슐린과 INSR간의 결합 친화성을 약화시키는 항체는 길항제이다.
여전히, 또 다른 양태에서, 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 강화시키거나 약화시키는 항체는 서열번호 151 내지 303에 제시된 하나 이상의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)을 포함한다. 관련 양태에서, 상기 항체는 서열번호 151 내지 303의 성숙한 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 항체들중 어느 하나는 적합한 사람 또는 사람 컨센서스 또는 사람 유래 불변 영역, 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 또는 이의 하이브리드를 추가로 포함하는 것으로 이해된다
추가의 양태에서, 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 강화시키거나 약화시키는 항체는 서열번호 1 내지 150에 제시된 하나 이상의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 또는 LCDR3)를 포함한다. 여전히 또 다른 양태에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 150의 성숙한 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다. 상기 항체들중 어느 하나는 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 것으로 고려된다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 인슐린 수용체에 결합한다. 관련 양태에서, 상기 항체는 INSR의 α서브유니트에 결합한다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 INSR의 β 서브유니트에 결합한다. 또 다른 양태에서, 상기 항체는 수용체의 α 및 β 서브유니트에 결합한다. 관련 양태에서, 상기 항체는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합한다. 또 다른 양태에서, 인슐린/INSR 복합체에 결합하는 항체는 예를 들어, 인슐린의 부재하의 단독의 인슐린 수용체, 또는 단독의 인슐린에 검출가능하게 결합하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인슐린 수용체 및/또는 인슐린 및 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 10-5M이하의 평형 해리 상수 KD로 특이적으로 결합하고 서열번호 151 내지 303의 하나 이상의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)을 포함하는 항체를 제공한다. 관련 양태에서, 상기 항체는 서열번호 151 내지 303의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 항체들중 어느 하나는 적합한 사람 또는 사람 컨센서스 또는 사람 유래된 불변 영역, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 하이브리드를 추가로 포함하는 것으로 고려된다.
추가의 양태에서, 10-5M이하의 평형 해리 상수 KD로 인슐린 수용체, 및/또는 인슐린과 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하고 서열번호 1 내지 150에 제시된 하나 이상의 경쇄 CDR (LCDR1, LCDR2, 또는 LCDR3)을 포함한다. 여전히 또 다른 양태에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 150의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 항체들 중 어느 하나는 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 것으로 고려된다.
상기된 항체들 중 어느 하나가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR을 포함하는 것이 추가로 고려된다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 서열번호 151 내지 303에 제시된 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 150에 제시된 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 인슐린 수용체에 결합한다. 관련 양태에서, 상기 항체는 인슐린/INSR 복합체에 결합한다. 또 다른 양태에서, 인슐린/INSR 복합체에 결합하는 항체는 단독의 인슐린 수용체 또는 단독의 인슐린에 검출가능하게 결합하지 않는다.
인슐린과 인슐린 수용체의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 강화시키는 항체는 임의로 인산화된 APT 분석에서 인슐린 수용체를 인슐린의 최대 시그날의 10% 이상으로 활성화시키는 것으로 추가로 고려된다. 관련 양태에서, 상기 INSR은 인슐린 최대 시그날의 적어도 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%로 활성화된다. 또 다른 양태에서, 인슐린/INSR의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 강화시키는 상기 항체는 임의로 인산화된 AKT 분석에서 인슐린의 최대 시그날의 10% 미만으로 활성화시킨다. 관련 양태에서, INSR은 인슐린의 최대 시그날의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 활성화된다. 몇몇 양태에서, 상기 INSR은 항체에 의해 검출가능하게 활성화되지 않는다.
상승된 혈당, 고혈당증 또는 인슐린 내성과 관련된 장애를 갖는 피검체에서 상기 항체는 단식 혈당 수준을 혈당의 정상 범위쪽으로 감소시킨다는 것이 추가로 고려된다. 하나의 양태에서, 양성 조절 항체 또는 효능제는 피검체내에서 단식 혈당 수준을 대략적으로 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상으로 감소시킨다.
하나의 양태에서, 항체는 항체 또는 이의 단편, 또는 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 언급한다. 예시적인 항체 또는 항체 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 다중특이적 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 영역(CDR) 단편, CDR-이식된 항체, 단일쇄 항체 (scFv), 단일쇄 항체 단편, 키메라 항체, 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 소형 항체, 선형 항체; 킬레이팅 재조합 항체, 3량 항체 또는 2량항체, 내부체(intrabody), 나노체(nanobody), 소형 모듈 면역약제 (SMIP), 항원 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화된 항체, VHH 함유 항체, 또는 이의 변이체 또는 유도체, 및 폴리펩타이드에 결합하는 특이적 항원을 제공하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 관련 양태에서, 상기 항체는 사람 항체이다.
몇몇 특정 양태에서, 본 발명은 설치류 항체, 즉 설치류(예를 들어, 쥐, 래랫트) 세포의 하이브리도마에 의해 제조되는 항체를 배제한다. 상기 항체는 하이브리도마 또는 재조합적으로 제조되는지에 상관없이 설치류 골격 아미노산 서열을 가질 것이고 사람에게 투여되는 경우 면역원성이다. 몇몇 특정 양태에서, 본 발명은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 하기의 문헌들중 어느 하나에 기재된 설치류 항체를 배제한다: Soos et al, Biochem. J. 235: 199-208, 1986; Taylor et al, Biochem. J. 242: 123-129, 1987; Prigent et al, J. Biol. Chem. 265(17):9970-9977, 1990; Brindle et al, Biochem. J. 268: 615-620, 1990; Steele-Perkins and Roth, J. Biol. Chem. 265(16): 9458-9463, 1990; McKern et al, Nature 443(14): 218-221; Boado et al, Biotech and BioEng. 96(2): 381-391; WO04/050016; Roth et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7312-7316, 1982; Morgan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 328-332, 1986; Lebrun et al, J. Bl. Chem. 268(15): 11272-11277, 1993; Forsayeth et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3448-3451, 1987; Forsayeth et al, J. Biol. Chem. 262(9): 4134-4140, Goodman et al, J. Receptor Res. 14(6-8), 381-398, 1994; Ganderton et al, Biochem J. 288: 195-205, 1992; Spasov et al, Bull. of Exp. Biol. and Med. 144(1): 46-48, 2007; 유럽 공개 공보 제2 036 574 A1호. 그러나, 본 발명은 사람화된 버젼의 상기 설치류 항체, 상기 사람화된 항체를 사용한 치료 방법 및 상기 사람화된 항체를 포함하는 멸균 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 몇몇 특정 양태에서, 본 발명은 문헌[참조: Boado et al, Biotech and BioEng. 96(2): 381-391 또는 WO04/050016]에 보고된 사람화된 항체 84-14를 배제한다.
예시적 양태에서, 본 발명은 다음을 고려한다:
각각 서열번호 151 내지 303 및 서열번호 1 내지 150 중 어느 하나의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 또는 LCDR3 중 어느 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 보유하고, 임의로 상기 CDR내에 1개 또는 2개의 돌연변이, 예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환 및 임의로 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이룬 것을 포함하는 모노클로날 항체;
서열번호 151 내지 303중 어느 하나의 HCDR1 , HCDR2, HCDR3, 또는 중쇄 가변 영역 모두를 보유하고 임의로 상기 CDR중 어느 하나에 1개 또는 2개의 돌연변이를 포함하고 임의로 임의의 적합한 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 모노클로날 항체, 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, 또는 IgE 또는 이의 하이브리드;
서열 번호 1 내지 150의 어느 하나의 LCDR1, LCDR2, LCDR3, 또는 경쇄 가변 영역 모두를 보유하고, 임의로 상기 CDR중 어느 하나에 1개 또는 2개의 돌연변이를 포함하고, 임의로 임의의 적합한 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 모노클로날 항체;
서열번호 1 내지 303에 제시된 바와 같고 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이룬 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 정제된 모노클로날 항체 제제;
예를 들어, X-선 결정학 또는 기타 생물리학적 또는 생화학적 기술, 예를 들어, 중수소 교환 질량 분광측정기, 알라닌 스캐닝 및 펩타이드 단편 ELISA를 통한 측정시, 서열번호 1 내지 303에 제시된 가변 영역을 포함하는 항체로서 INSR의 동일한 선형 또는 3차원 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
약 75% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상으로 사람 INSR에 결합하기 위해, 서열번호 1 내지 303에 제시되고 임의로 표 3에서와 같이 쌍을 이룬 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 모노클로날 항체.
몇몇 양태에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 303에 제시된 가변 영역을 포함하는 항체의 모든 3개의 경쇄 CDR, 모든 3개의 중쇄 CDR, 또는 모든 6개의 CDR을 포함한다. 몇몇 예시적인 양태에서, 항체 기원의 2개의 경쇄 CDR은 상이한 항체 기원의 제3 경쇄 CDR과 조합될 수 있다. 또한, 하나의 항체 기원의 LCDR1은 특히, CDR이 고도로 상동성인 경우 상이한 항체 기원의 LCDR2 및 또 다른 항체 기원의 LCDR3과 조합될 수 있다. 유사하게, 항체 기원의 2개의 중쇄 CDR은 상기한 항체 기원의 제3 중쇄 CDR과 조합될 수 있거나 하나의 항체 기원의 HCDR1은 특히, CDR이 고도로 상동성인 경우 상이한 항체 기원의 HCDR2 및 또 다른 항체 기원이 HCDR3과 조합될 수 있다.
컨센서스 CDR이 또한 사용될 수 있다. 본원에서 유래된 컨센서스 CDR 중 어느 하나는 예를 들어, 적합한 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 형성하기 위해, 본원에 기재된 항체중 어느 하나의 동일한 쇄(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄) 기원의 2개의 다른 CDR과 조합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 변이체 또는 유도체를 제공한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 상기 항체는 본원에 기재된 바와 같이 검출가능한 잔기로 표지시킨다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 본원에 기재된 소수성 잔기에 접합시킨다.
항체의 변이체는 아미노산 삽입, 결실 또는 치환, 예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환을 포함하는, 본원에 제공된 아미노산 서열 중에 돌연변이 또는 변경된 항체를 포함한다.
몇몇 양태에서, 서열번호 151 내지 303에 제시된 중쇄 가변 영역과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖고/갖거나 서열번호 1 내지 150에 제시된 경쇄 가변 영역과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 항체가 제공되고 상기 항체는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모두를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 경쇄 가변 영역과 % 동일성을 갖는 아미노산 서열은 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역과 % 동일성을 갖는 아미노산 서열은 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 항체의 CDR 영역에서 1개 또는 2개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존성 치환을 가질 수 있는 것으로 고려된다.
관련 양태에서, 상기 골격의 잔기는 변경된다. 변경될 수 있는 중쇄 골격 영역은 중쇄 CDR 잔기를 둘러싸는 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4로 지정된 영역에 있고 변경될 수 있는 경쇄 골격 영역의 잔기는 경쇄 CDR 잔기를 둘러싸는 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4로 지정된 영역에 있다. 골격 영역내의 아미노산은 예를 들어, 사람 골격 또는 사람 컨센서스 골격에서 동정되는 임의의 적합한 아미노산으로 대체될 수 있다.
본 발명은 표 3에 제시된 중쇄/경쇄 가변 영역으로서 임의로 쌍을 이룬, 서열번호 151 내지 303의 아미노산 서열중 어느 하나에 융합된 서열번호 1 내지 150의 아미노산 서열중 어느 하나를 포함하는 정제된 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1 내지 150 및 서열번호 151 내지 303의 적어도 일부를 포함하고 임의로 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이룬 이의 단편을 제공하는 것으로 고려되고, 이때, 상기 폴리펩타이드는 인슐린 수용체, 인슐린 또는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합한다.
서열번호 1 내지 303중 어느 하나에서 항원 결합 단편의 일부 또는 모두를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 항체는 예를 들어, KD 측정시 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 M 이하 (여기서, 보다 낮은 값은 보다 높은 결합 친화성을 지적한다)로 인슐린 수용체, 인슐린 또는 인슐린/INSR의 복합체에 대해 결합 친화성(임의로 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시)을 보유한다.
이전의 양태중 일부에서, 본 발명은 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성을 약 5배 내지 500배로 강화시킬 수 있는, 10-5 M 이하의 평형 해리 상수 KD로 인슐린 수용체 및/또는 인슐린과 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 결합하는 항체를 고려한다. 몇몇 양태에서, 상기 항체는 하기의 평형 해리 상수 KD 결합 성질을 특징으로 한다: (i) 상기 항체는 약 10-5M, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M 이하의 평형 해리 상수 KD로 인슐린(C1) 및 인슐린 수용체 (C2)를 포함하는 복합체에 결합하고; (ii) K[C1C2]A, K[AC2]C1, 또는 K[ACI]C2 중 어느 하나는 KAC2 또는 KAC1 중 어느 하나 보다 약 5배 이상 낮다. 관련 양태에서, K[C1C2]A, K[AC2]C1, 또는 K[AC1]C2 중 어느 하나는 임의의 KAC2 또는 KAC1 중 어느 하나 보다 약 5배 내지 200배 낮다.
몇몇 양태에서, 상기 항체는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합한다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 비복합 형태의 단독의 인슐린 수용체에 결합한다. 관련 양태에서, 상기 항체는 예를 들어, 인슐린의 부재하에 단독의 인슐린 수용체에 검출가능하게 결합하지 않는다. 특정 양태에서, 상기 항체는 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성을 약 5배 이상으로, 임의로 약 200배로, 임의로 약 100배로 강화시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 결합 친화성은 KA, KD, 해리율에 대한 결합율의 비 또는 결합율에 대한 해리율의 비중 어느 하나로 제공된다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 항체중 어느 하나에 대해, 결합 친화성 또는 결합율 파라미터의 차이는 약 1.5배 내지 약 1000배, 또는 약 1.5배 내지 약 500배, 약 1.5배 내지 약 100배, 또는 약 2배 내지 25배, 또는 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 500배, 또는 약 5배 내지 약 200배 범위이고, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배, 또는 500배 이하, 또는 200배 이하, 또는 150배 이하, 또는 100배 이하, 또는 90배 이하, 또는 80배 이하, 또는 70배, 또는 60배 이하, 또는 50배 이하, 또는 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 또는 10배 이하, 또는 5배 이하 또는 3배 이하의 범위이다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 임의로 pAKT 분석으로 측정시 인슐린의 최대 효능제 활성의 20% 내지 100%인 최대 효능제 활성을 나타내는, 예를 들어, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9. 10-10, 10-11 M 이하의 KD의 친화성으로 인슐린 수용체에 결합하는 효능제 항체를 제공한다. 관련 측면에서, 본 발명은 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9. 10-10, 10-11 M 이하의 KD의 친화성으로 인슐린 수용체에 결합하고 (a) pAKT 분석으로 측정시 인슐린의 최대 효능제 활성의 20% 내지 80%인 최대 효능제 활성을 나타내고 (b) 존재하는 경우 INSR에 대한 인슐린의 EC50을 2배 또는 3배 이상으로 변경하지 않고 (c) 존재하는 경우 INSR에 대한 인슐린의 KD를 2배 또는 3배 이상으로 변경하지 않는 알로스테릭 효능제 항체를 제공한다. 몇몇 양태에서, 결합 친화성이 KA, KD, 오프-레이트에 대한 온-레이트의 비 또는 온-레이트에 대한 오프-레이트의 비중 어느 하나인 것이 추가로 제공된다.
특정 양태에서, 상기 항체중 어느 하나가 또한 약한 효능제 활성을 나타낼 수 있고, 예를 들어, 임의로 인산화된 AKT 분석에서 인슐린 수용체를 인슐린의 최대 시그날의 적어도 10%로 활성화킬 수 있는 것이 고려된다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 임의로 인산화된 AKT 분석에서 인슐린의 최대 시그날의 10% 미만으로 인슐린 수용체를 활성화시킨다.
몇몇 양태에서, 상기 항체는 표 3에 제시된 바와 같이 임의로 쌍을 이룬, 서열번호 281, 278, 277, 209, 275, 223, 284, 276, 및 236에 제시된 성숙한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 141, 138, 137, 35, 135, 57, 144, 136, 및 98에 제시된 성숙한 경쇄 가변 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 항체는 (a) 표 3에 제시된 바와 같이 임의로 쌍을 이룬, Ab006, Ab030, Ab004, Ab013, Ab009, Ab007, AbO11, AbOO1, Ab012, AbO1O, Ab003, Ab008, Ab002, Ab005, Ab076, Ab077, Ab079, Ab080, Ab083, Ab059, Ab078 및 Ab085 중 어느 하나 또는 서열번호 291, 196, 239, 267 및 271에 제시된 것 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 Ab006, Ab030, Ab004, Ab013, Ab009, Ab007, AbO11, AbOO1, Ab012, AbO1O, Ab003, Ab008, Ab002, Ab005, Ab076, Ab077, Ab079, Ab080, Ab083, Ab059, Ab078 및 Ab085 어느 하나 또는 서열번호 76, 80, 101, 128, 및 132에 제시된 것 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역, 및 바람직하게는 이의 성숙한 부분 또는 (b) 임의로 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이룬, Ab006, Ab030, Ab004, Ab013, Ab009, Ab007, AbO11, Ab001, Ab012, AbOlO, Ab003, Ab008, Ab002, Ab005, Ab076, Ab077, Ab079, Ab080, Ab083, Ab059, Ab078 및 Ab085 중 어느 하나 또는 서열번호 291, 196, 239, 267 및 271 중 어느 하나의 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR 및/또는 Ab006, Ab030, Ab004, Ab013, Ab009, Ab007, AbO11, Ab001, Ab012, AbOlO, Ab003, Ab008, Ab002, Ab005, Ab076, Ab077, Ab079, Ab080, Ab083, Ab059, Ab078 및 Ab085중 어느 하나 또는 서열번호 76, 80, 101, 128, 및 132 중 어느 하나의 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR(이는 임의로 상기 중쇄 또는 경쇄 CDR 중 임의의 1개, 2개 또는 3개에서 1개 또는 2개의 돌연변이, 예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환을 포함한다) 또는 (c) 임의로 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이룬, Ab006, Ab030, Ab004, Ab013, Ab009, Ab007, AbO11, Ab001, Ab012, AbOlO, Ab003, Ab008, Ab002, Ab005, Ab076, Ab077, Ab079, Ab080, Ab083, Ab059, Ab078 및 Ab085 중 어느 하나의 모든 6개의 CDR 또는 서열번호 76, 80, 101, 128, 132, 291, 196, 239, 267, 및 271에 제시된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체중 어느 하나와 예를 들어, 70%, 75%, 또는 80% 이상으로 경쟁하는 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 항체는 Ab079, Ab076, Ab083, Ab080, Ab062, Ab020, Ab019, Ab088 및 Ab089로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체들과 70% 이상의 경쟁, 예를 들어, 적어도 75% 또는 적어도 80% 경쟁을 나타내고 임의로 Ab086, Ab064, Ab001 및 Ab018로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 30% 이상의 경쟁을 나타낸다. 임의로, 상기 항체는 Ab062 및 Ab086 중 하나 이상과 경쟁하지 않고, 임의로 사람 및 쥐 인슐린 수용체 또는 복합체 둘다와 결합할 수 있다.
관련 양태에서, 상기 항체는 Ab040, Ab062, Ab030, AbOO1 및 AbO18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체들과 70% 이상의 경쟁, 예를 들어, 적어도 75% 또는 적어도 80% 경쟁을 나타내고 임의로 Ab037, Ab078, Ab083, Ab080 및 Ab085로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 30% 이상의 경쟁을 나타낸다. 관련 양태에서, 상기 항체는 Ab053, Ab064, 83-7, Ab019, Ab088 및 Ab089로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체중 어느 1개, 2개, 3개 이상의 항체와 경쟁하지 않는다. 임의로, 상기 항체는 사람 및 쥐 인슐린 수용체 또는 복합체 둘다에 결합한다. 또 다른 양태에서, 상기 항체는 Ab064, Ab062, Ab085 및 Ab078로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체들과 70% 이상의 경쟁, 예를 들어, 적어도 75% 또는 적어도 80% 경쟁을 나타낸다. 임의로, 상기 항체는 Ab077, Ab001, Ab018, Ab030, Ab037, Ab079, Ab076, Ab083, Ab019, Ab088, Ab089 및 Ab040으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 중 어느 1개, 2개, 3개 이상의 항체와 경쟁을 나타내지 않는다. 임의로, 상기 항체는 사람 및 쥐 인슐린 수용체 또는 복합체 둘다에 결합한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성을 약 3배 이상, 임의로 1000배 이하로 약화시킬 수 있는, 10-5M 이하의 평형 해리 상수 KD로 인슐린 수용체 및/또는 인슐린과 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 결합하는 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 인슐린과 인슐린 수용체간의 친화성을 약 3배 내지 500배로 약화시킨다. 몇몇 양태에서, 결합 친화성은 KA, KD, 오프-레이트에 대한 온-레이트의 비 또는 온-레이트에 대한 오프-레이트의 비중 어느 하나이다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 항체중 어느 하나에 대해, 결합 친화성 또는 결합율 파라미터의 차이는 약 1.5배 내지 약 1000배, 또는 약 1.5배 내지 약 500배, 약 l.5배 내지 약 100배, 또는 약 2배 내지 25배, 또는 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 500배, 또는 약 5배 내지 약 200배 범위이고, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배이거나, 500배 이하, 또는 200배 이하, 또는 150배 이하, 또는 100배 이하, 또는 90배 이하, 또는 80배 이하, 또는 70배 이하, 또는 60배 이하, 또는 50배 이하, 또는 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 또는 10배 이하, 또는 5배 이하 또는 3배 이하이다.
관련 양태에서, 상기 항체는 임의로 pAKT 분석에서 인슐린 시그날 전달 활성의 EC50을 약 2배 내지 1000배로 증가시킨다. 특정 양태에서, 상기 항체는 EC50을 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000배로 증가시킨다.
특정 양태에서, 상기 항체는 표 3에 제시된 바와 같이 임의로 쌍을 이루는, 서열번호 241, 279, 258, 155 및 228에 제시된 성숙한 중쇄 가변 영역 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 103, 139, 119, 8 및 89에 제시된 성숙한 경쇄 가변 영역 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 항체는 (a) Ab087, Ab019, Ab088, Ab089, Ab020, Ab050, Ab052, Ab055, Ab057, Ab061, Ab063, Ab065, Ab070, Ab072, Ab074 및 Ab081 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 Ab087, Ab019, Ab088, Ab089, Ab020, Ab050, Ab052, Ab055, Ab057, Ab061, Ab063, Ab065, Ab070, Ab072, Ab074 및 Ab081 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 이의 성숙한 부분, 또는 (b) Ab087, Ab019, Ab088, Ab089, Ab020, Ab050, Ab052, Ab055, Ab057, Ab061, Ab063, Ab065, Ab070, Ab072, Ab074 및 Ab081의 어느 것중 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR 및/또는 Ab087, Ab019, Ab088, Ab089, Ab020, Ab050, Ab052, Ab055, Ab057, Ab061, Ab063, Ab065, Ab070, Ab072, Ab074 및 Ab081의 어느 것중 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR(상기 중쇄 또는 경쇄 CDR의 어느 1개, 2개 또는 3개에 1개 또는 2개의 돌연변이, 예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환을 포함한다); 또는 (c) Ab087, Ab019, Ab088, Ab089, Ab020, Ab050, Ab052, Ab055, Ab057, Ab061, Ab063, Ab065, Ab070, Ab072, Ab074 및 Ab081의 어느 것중 모두 6개의 CDR을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 항체와 경쟁하는 항체를 제공하고, 이때, 상기 항체는 Ab079, Ab076, Ab083, Ab080, Ab062 및 Ab020, Ab019, Ab088, Ab089로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 70% 이상의 경쟁, 예를 들어, 적어도 75% 또는 적어도 80% 경쟁을 나타낸다. 임의로, 상기 항체는 Ab062, Ab086, Ab001, Ab018, Ab030, Ab037 및 Ab064로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개 또는 3개 이상의 항체와 경쟁하지 않고, 임의로 상기 항체는 단지 사람 반응성이고 쥐 인슐린 수용체 또는 복합체에 결합하지 않는다.
하나의 양태에서, 본 발명은 효능제인 항체를 제공하고, 여기서, 항체는, 표 3에 제시된 바와 같이 임의로 쌍을 이루는, 서열번호 195, 220, 303, 197, 208, 243, 245 및 251에 제시된 성숙한 중쇄 가변 영역 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 77, 50, 90, 84, 34, 104, 106 및 112에 제시된 성숙한 경쇄 가변 영역 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
관련 양태에서, 상기 항체는 (a) 표 3에 제시된 바와 같이 임의로 쌍을 이루는, 서열번호 252, 253, 263, 265 및 269에 제시된 Ab021, Ab029, Ab022, Ab017, Ab023, Ab024, Ab025, Ab026, Ab031, Ab035, Ab027, Ab036, Ab037, Ab028, Ab038, Ab039, Ab040, Ab041, Ab042, Ab032, Ab043, Ab044, Ab045, Ab046, Ab047, Ab018, Ab033, Ab048, Ab014, Ab015, Ab049, Ab034, Ab051, Ab053, Ab054, Ab056, Ab058, Ab062, Ab064, Ab066, Ab067, Ab068, Ab086, Ab069, Ab071, Ab073, Ab075, Ab082 및 Ab084 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7, 113. 114, 124, 126 및 130에 제시된 Ab021, Ab029, Ab022, Ab017, Ab023, Ab024, Ab025, Ab026, Ab031, Ab035, Ab027, Ab036, Ab037, Ab028, Ab038, Ab039, Ab040, Ab041, Ab042, Ab032, Ab043, Ab044, Ab045, Ab046, Ab047, Ab018, Ab033, Ab048, Ab014, Ab015, Ab049, Ab034, Ab051, Ab053, Ab054, Ab056, Ab058, Ab062, Ab064, Ab066, Ab067, Ab068, Ab086, Ab069, Ab071, Ab073, Ab075, Ab082 및 Ab084 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 및 바람직하게는 이의 성숙한 부분, 또는 (b) 표 3에 제시된 바와 같이 임의로 쌍을 이루는, 서열번호 252, 253, 263, 265 및 269에 제시된 Ab021, Ab029, Ab022, Ab017, Ab023, Ab024, Ab025, Ab026, Ab031, Ab035, Ab027, Ab036, Ab037, Ab028, Ab038, Ab039, Ab040, Ab041, Ab042, Ab032, Ab043, Ab044, Ab045, Ab046, Ab047, Ab018, Ab033, Ab048, Ab014, Ab015, Ab049, Ab034, Ab051, Ab053, Ab054, Ab056, Ab058, Ab062, Ab064, Ab066, Ab067, Ab068, Ab086, Ab069, Ab071, Ab073, Ab075, Ab082 및 Ab084 중 어느 것중 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR 및/또는 서열번호 7, 113, 114, 124, 126 및 130에 제시된 Ab021, Ab029, Ab022, Ab017, Ab023, Ab024, Ab025, Ab026, Ab031, Ab035, Ab027, Ab036, Ab037, Ab028, Ab038, Ab039, Ab040, Ab041, Ab042, Ab032, Ab043, Ab044, Ab045, Ab046, Ab047, Ab018, Ab033, Ab048, Ab014, Ab015, Ab049, Ab034, Ab051, Ab053, Ab054, Ab056, Ab058, Ab062, Ab064, Ab066, Ab067, Ab068, Ab086, Ab069, Ab071, Ab073, Ab075, Ab082 및 Ab084의 어느 것중 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR(여기서, 임의로 상기 중쇄 또는 경쇄 CDR중 어느 1개, 2개 또는 3개에서 1개 또는 2개 돌연변이, 예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환을 포함한다); (c) 표 3에 제시된 바와 같이 임의로 쌍을 이루는, 서열번호 7, 113, 114, 124, 126, 130, 252, 253, 263, 265 및 269에 제시된 Ab021, Ab029, Ab022, Ab017, Ab023, Ab024, Ab025, Ab026, Ab031, Ab035, Ab027, Ab036, Ab037, Ab028, Ab038, Ab039, Ab040, Ab041, Ab042, Ab032, Ab043, Ab044, Ab045, Ab046, Ab047, Ab018, Ab033, Ab048, Ab014, Ab015, Ab049, Ab034, Ab051, Ab053, Ab054, Ab056, Ab058, Ab062, Ab064, Ab066, Ab067, Ab068, Ab086, Ab069, Ab071, Ab073, Ab075, Ab082 및 Ab084 중 어느 하나의 모두 6개의 CDR을 포함한다.
관련 양태에서, 본 발명은 표적과 결합하는 것에 대해 상기 항체와 경쟁하는 항체를 제공하고, 여기서, 상기 항체는 Ab030, Ab037, Ab053, Ab001, Ab018, Ab064 및 Ab040으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 70% 이상의 경쟁, 예를 들어, 적어도 75% 또는 적어도 80% 경쟁을 나타내고, 임의로 Ab085 및 Ab086으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체들과 30% 이상의 경쟁을 나타낸다. 임의로, 상기 항체는 Ab079, Ab076 및 Ab088으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개 또는 3개 이상의 항체와 경쟁하지 않고; 임의로 사람 및 쥐의 인슐린 수용체 또는 복합체 둘다에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오타이드 및 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 적합한 조건하에서 배양 배지에서 상기 숙주 세포를 성장시키고 임의로 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 암호화된 항체 또는 폴리펩타이드를 분리함에 이어서 임의로 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 항체 또는 폴리펩타이드를 추가로 정제함을 포함하는 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 성질을 갖는 항체는 스크리닝 방법을 사용하여 분리하므로써 INSR에 결합하는지 및 인슐린/INSR 복합체를 조절하는지를 결정할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 시그날 전달 복합체의 제1 성분(C1)의 제2 성분(C2)로의 결합을 강화시키는 양성 조절 항체를 제공하고, 이때, 상기 항체는 하기의 평형 해리 상수 KD 결합 성질을 특징으로 한다: (i) 상기 항체는 약 10-5M 이하, 예를 들어, 10-6M 이하, 또는 10-7M 이하 또는 10-8M 이하의 평형 해리 상수 KD로 C1 및 C2 또는 C1 및 C2(C1C2)를 포함하는 복합체중 어느 하나에 결합하고; (ii) K[C1C2]A, K[AC2]C1, 또는 K[AC1]C2 중 어느 하나는 KAC2 또는 KAC1 중 어느 하나 보다 적어도 약 50%(1.5배) 낮다. 몇몇 양태에서, K[C1C2]A, K[AC2]C1, 또는 K[AC1]C2 중 어느 하나는 KAC2 또는 KAC1 중 어느 하나 보다 약 1.5배 내지 약 100배 낮거나; 약 2배 내지 25배 낮거나, 약 2배 내지 약 50배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 25배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 50배 낮거나, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 낮거나, 약 100배 이하, 또는 약 90배 이하, 또는 약 80배 이하 또는 약 70배 이하 또는 약 60배 이하, 또는 약 50배 이하 또는 약 40배 이하, 또는 약 30배 이하 또는 약 20배 이하, 또는 약 10배 이하 낮다. 몇몇 양태에서, K[C1C2]A, K[AC2]C1, 또는 K[AC1]C2 중 어느 하나는 KAC2 또는 KAC1 둘다 보다 적어도 약 1.5배 낮거나; 1.5배 내지 약 100배 낮거나, 약 2배 내지 25배 낮거나, 약 2배 내지 약 50배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 25배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 50배 낮거나, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 낮거나, 약 100배 이하, 또는 약 90배 이하, 또는 약 80배 이하, 또는 약 70배 이하, 또는 약 60배 이하 또는 50배 이하 또는 약 40배 이하, 또는 약 30배 이하 또는 약 20배 이하 또는 약 10배 이하 낮다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 시그날 전달 복합체의 제1 성분(C1)의 제2 성분(C2)로의 결합을 약화시키는 음성 조절 항체를 제공하고, 이때, 상기 항체는 하기의 평형 해리 상수 KD 결합 성질을 특징으로 한다: (i) 상기 항체는 약 10-5M 이하, 예를 들어, 10-6M 이하, 또는 10-7M 이하 또는 10-8M 이하의 평형 해리 상수 KD로 C1 및 C2 또는 C1 및 C2(C1C2)를 포함하는 복합체중 어느 하나에 결합하고; (ii) KAC2 또는 KAC1 중 어느 하나는 K[C1C2]A, K[AC2]C1, 또는 K[AC1]C2 중 어느 하나 보다 적어도 약 50%(1.5배) 낮다. 몇몇 양태에서, KAC2 또는 KAC1 중 어느 하나는 K[C1C2]A, K[AC2]C1, 또는 K[AC1]C2 중 어느 하나 보다 약 1.5배 내지 약 100배 낮거나; 약 2배 내지 25배 낮거나, 약 2배 내지 약 50배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 25배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 50배 낮거나, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 낮거나, 약 100배 이하, 또는 약 90배 이하, 또는 약 80배 이하 또는 약 70배 이하 또는 약 60배 이하, 또는 약 50배 이하 또는 약 40배 이하, 또는 약 30배 이하 또는 약 20배 이하, 또는 약 10배 이하 낮다. 몇몇 양태에서, KAC2 또는 KAC1 중 어느 하나는 K[CIC2]A, K[AC2]C1, 또는 K[AC1]C2의 모두 보다 적어도 약 1.5배 낮거나; 1.5배 내지 약 100배 낮거나, 약 2배 내지 25배 낮거나, 약 2배 내지 약 50배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 25배 낮거나, 약 1.5배 내지 약 50배 낮거나, 예를 들어, 적어도 약 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배 또는 20배 낮거나, 약 100배 이하, 또는 약 90배 이하, 또는 약 80배 이하, 또는 약 70배 이하, 또는 약 60배 이하 또는 50배 이하 또는 약 40배 이하, 또는 약 30배 이하 또는 약 20배 이하 또는 약 10배 이하 낮다.
특이적 양태에서, C1 및 C2는 인슐린 및 인슐린 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 멸균성 약제학적으로 허용되는 희석제를 본 발명의 항체에 첨가함을 포함하는, 멸균성 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 고려한다. 임의로, 살균제 또는 세균 억제제와 같은 소량의 보존제가 또한 조성물에 포함된다.
또한, 본 발명의 항체 및 멸균성 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 멸균성 조성물이 고려된다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 항체가 INSR과 인슐린 또는 인슐린 유사체 또는 인슐린 모사체간의 결합을 조절함을 고려한다. 본 발명의 항체는 또한 바람직하게 동물 모델에서 시험관내 또는 생체내에서 글루코스 흡수를 증진시킴을 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적하는 생물학적 성질을 나타내고 바람직하게 글루코스 흡수는 외인성 인슐린에 의해 유도된다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 항체는 글루코스 흡수율 또는 총 흡수량을 증가시킬 수 있거나 또는 상기 둘다를 증가시킬 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 인슐린 내성을 치료하기 위한 유효량의 본 발명의 양성 조절 항체 또는 효능제 항체를 이를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하는, 인슐린 내성과 관련된 장애를 치료하는 방법을 고려한다. 관련 양태에서, 상기 치료는 글루코스 흡수를 증진시킨다. 추가의 양태에서, 상기 증진된 글루코스 흡수는 글루코스 흡수율의 증가, 글루코스 흡수 총량의 증가 또는 이 둘다의 증가로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 치료가 상승된 혈당 수준, 고혈당증 또는 인슐린 내성과 관련된 장애를 갖는 피검체에서 단식 혈당 수준을 감소시켜 단식 혈당 수준이 정상 범위 쪽으로 복귀되는 것이 고려된다. 관련 양태에서, 상기 단식 혈당은 비치료된 피검체와 비교하여 대략적으로 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 이상 감소한다.
관련 측면에서, 상기 치료는 이전의 수개월 기간 동안의 상승된 글루코스 수준의 마커이고 당뇨병 징후를 나타내는 상승된 HbA1c 수준을 감소시킨다. 추가의 양태에서, 상기 치료는 손상된 글루코스 관용성을 개선시킨다. 하나의 양태에서, 글루코스 관용성은 글루코스 관용성 시험(GTT)으로 측정한다.
다른 양태에서, 상기 치료는 피검체의 체중 증가를 지연시키거나 감소시키거나 정상화시킨다. 하나의 양태에서, 상기 치료는 비치료된 피검체에 비해 체중 증가를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%로 감소시키거나 지연시킨다. 몇몇 양태에서, 상기 치료는 피검체의 체중 감소를 지연시키거나 감소시키거나 정상화시킨다. 하나의 양태에서, 상기 치료는 체중 감소를 비치료된 피검체와 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%로 감소시키거나 지연시킨다.
관련 측면에서, 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩타이드가 피검체에서 체중 감소를 촉진시키거나 유도하는 것이 고려된다. 하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조절 항체, 이의 단편 또는 폴리펩타이드를 투여함에 의해 체중 감소를 촉진시키거나 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 조절 항체는 양성 조절제 또는 부분 효능제이다. 관련 양태에서, 상기 조절 항체는 음성 조절제이다.
특정 양태에서, 상기 치료는 추가로 이상지혈증, 상승된 혈장 트리글리세라이드, 상승된 HOMA-IR, 상승된 혈장 비에스테르화된 콜레스테롤, 혈장 총 콜레스테롤 상승된 혈장 인슐린(인슐린 내성을 나타냄), 낮은 비HDL/HDL 콜레스테롤 비(또는 낮은 총 콜레스테롤/HDL 콜레스테롤 비) 및 상승된 혈장 렙틴 수준(렙틴 내성을 나타냄)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당뇨병 또는 인슐린 내성의 1개, 2개 또는 3개 이상의 증상을 개선시킨다.
치료의 효과가 또한 발명의 상세한 설명에 기재된 바와 같은 인자를 사용한 시험관내 및 생체내 분석을 사용하여 측정되는 것이 추가로 제공된다.
하나의 양태에서, 인슐린 내성과 관련된 장애는 고혈당증, 당뇨병전증, 대사적 증후군(또한 인슐린 내성 증후군으로서도 언급됨), 2형 진성 당뇨병, 다낭성 낭소 질환(PCOS), 비알콜성 지방 간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방 간염(NASH), 지방증, 비만, 이상지혈증, 랍슨-멘델할(Robson-Mendenhall) 증후군, 도노휴(Dnohue) 증후군 또는 요정증(Leprechaunism)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인슐린 과생산 및/또는 민감성을 치료하기 위한 유효량으로 본 발명의 음성 조절 항체 또는 길항제 항체를 이를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하는, 고인슐린혈증, 비정상적 생산 및/또는 과도한 인슐린 시그날 전달로서 나타나는 인슐린에 대한 민감성과 관련된 증상 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 인슐린 민감성과 관련된 장애는 암, 카포시 육종, 인슐린종, 당뇨병성 신장 질환, 저혈당증, 췌소도세포증(nesidioblastosis)(KATP-H1 확산 질환, KATP-H1 초점 질환, 또는 "PHHI"), GDH-HI (고인슐린증/고암모니아증 증후군(HI/HA), 류신-민감성 저혈당증 또는 디아족시드-민감성 저혈당증), 섬세포 이상조절 증후군, 유아 특발성 저혈당증, 유아 영구적 고인슐린혈증(PHHI), 선천성 고인슐린혈증, 인슐린 과용, 신장 부전(급성 또는 만성)으로 인한 저혈당증, 및 만성 신장 질환, 예를 들어, III형, IV형 또는 V형으로 인한 저혈당증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 기재된 장애중 어느 하나의 치료를 위한 약물을 제조하는데 있어서, 인슐린-INSR 시그날 전달 상호작용을 조절하는 이전의 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드의 용도가 또한 고려된다. 임의로 사용 지침서와 함께 이전의 항체 또는 폴리펩타이드 중 어느 하나를 포함하는 주사기, 예를 들어, 1회용 또는 미리 충전된 주사기, 멸균 밀봉된 컨테이너, 예를 들어, 바이엘, 병, 용기 및/또는 키트 또는 팩키지가 또한 고려된다.
본 발명의 이전의 항체 또는 폴리펩타이드 중 어느 하나는 보조 치료제로서 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 항당뇨병 제제와 함께 동시에 투여될 수 있다. 다른 항당뇨병 제제와 함께 본 발명의 이전의 항체 또는 폴리펩타이드 중 어느 하나를 포함하는 조성물이 또한 고려된다.
다수의 항당뇨병 제제가 당업계에 공지되어 있고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 1) 설포닐우레아(예를 들어, 글리메피리드, 글리센티드, 설포닐우레아, AY31637); 2) 비구아니드(예를 들어, 메트포르민); 3) 알파-글루코시다제 억제제(예를 들어, 아카보스, 미글리톨); 4) 티아졸-이디네디온(예를 들어, 트로글리타존, 피오글리타존, 로지글리타존, 글리피지드, 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, NIP 223, NIP 221, MK 0767, 시글리타존, 아다글리타존, CLX 0921, 다글리타존, CP 92768, BM 152054); 5) 글루카곤형 펩타이드(GLP) 및 GLP 유사체 또는 GLP-1 수용체의 효능제(예를 들어, 엑센딘) 또는 이의 안정화제(예를 들어, DPP4 억제제, 예를 들어, 시타글리프틴); 및 6) 인슐린 또는 이의 유사체 또는 모사체(예를 들어, LANTUS®).
관련 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 항체를 사용하는 인슐린 내성 또는 인슐린 민감성을 진단하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 인슐린 수용체 항체를 사용한 피검체 기원의 샘플중에서 인슐린 또는 인슐린 수용체 수준을 측정하고(여기서, 증가된 수준의 인슐린 또는 유리된 인슐린 수용체 또는 감소된 수준의 막 결합된 인슐린 수용체는 피검체가 당뇨병 또는 인슐린 내성을 갖고 있거나 이의 위험에 처해있음을 지적한다), 임의로 당뇨병 또는 인슐린 내성을 갖거나 이의 위험에 처한 피검체에게 당뇨병 치료제를 투여함을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 인슐린 수용체 항체를 사용하여 피검체 기원의 샘플 중에 인슐린 수용체 수준을 측정하고(여기서, 증가된 수준의 유리 인슐린 수용체 또는 감소된 수준의 막 결합된 인슐린 수용체는 피검체가 암을 앓고 있거나 이의 위험에 처해있음을 지적한다), 임의로 상기 피검체에게 암 치료제를 투여함을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 인슐린 수용체로의 인슐린 결합을 조절하는 항체를 동정하기 위한 방법을 제공한다.
본원에 기재된 각각의 특징, 또는 양태 또는 조합은 본 발명의 어느 측면에 대한 비제한적인 예인 것으로 이해되고 이와 같이 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 특징 또는 양태 또는 조합과 조합가능한 것으로 의미된다. 예를 들어, 특징이 "하나의 양태", "몇몇 양태", "추가의 양태", "특이적 예시적 양태" 및/또는 "또 다른 양태"와 같은 용어와 함께 기재되는 경우, 이들 양태 유형 각각은 매번 가능한 조합을 열거할 필요 없이 본원에 기재된 임의의 다른 특징 또는 특징의 조합과 조합되는 것으로 의도된 특징의 비제한적인 예이다. 상기 특징 또는 조합된 특징은 본 발명의 측면 중 어느 하나에 적용한다. 유사하게, 방법이 특정 특징으로 특성화된 항체와 같은 폴리펩타이드 결합제를 동정함을 포함하고 상기 특징으로 특성화된 폴리펩타이드 결합제는 또한 본 발명에 의해 고려된다. 범위내에 속하는 값의 예가 기재되는 경우, 이들 예중 어느 하나는 범위의 가능한 종점으로서 고려되고, 이들 종점간의 임의의 및 모든 수치가 고려되고, 상향 및 하향 종점의 임의의 및 모든 조합이 고려된다.
도 1은 인슐린의 존재 및 부재하에 INSR을 발현하는 IM-9 세포에 결합하는 시험 항체를 보여주는 INSR 수용체 차지에 따른 대표적인 결과를 도시한다.
도 2는 인슐린 수용체 결합하는 인슐린에 대한 시험 항체의 효과를 보여주는 비오티닐화된 리간드 스크린으로부터의 대표적인 결과를 보여준다.
도 3은 인슐린 의존성 pIRS-1 인산화를 조절하는 시험 항체의 능력을 측정하는 분석으로부터의 결과를 보여준다.
도 4는 상이한 기능성 부류 기원의 INSR로의 대표적인 항체의 결합을 보여주는 pIRS-1 활성 분석 기원의 결과를 도시한다. A) 양성 조절제; B) 유의적인 길항작용을 갖는 양성 조절제; C) 비조절제; D) 효능제 항체; E) 음성 조절제.
도 5는 EC50 비율 +Ab/-Ab에 따라 등급화된 pIRS-1 분석으로부터의 대표적인 항체에 대한 인슐린 EC50 값을 보여주는 표이다.
도 6은 대표적인 항체에 대한 pAKT 분석 결과를 보여준다: A) 매우 낮은 길항작용을 갖는 양성 조절제; B) 효능작용을 갖는 양성 조절제; C) 효능제 항체; D) 83-7; E) 항체의 부재하의 인슐린 및 기본 반응.
도 7은 대표적인 시험 항체의 효능 작용 및 마우스 교차 반응성 성질을 보여주는 표이다(nd = 측정되지 않음).
도 8은 4개의 상이한 농도에서 양성 조절제 INSR 항체에 의해 수행되는 인슐린 용량 반응의 공동작용성(힐슬로프) 및 민감성(EC50, EC50의 배수 변화)의 변화를 보여주는 pAKT 분석 결과를 보여준다. 도 8a는 상기 결과를 그래프로 보여주고 도 8b는 결과를 표 형태로 보여준다.
도 9는 양성 조절제 항체에 의한 인슐린 의존성 글루코스 흡수 증진을 도시한다. 3T3-L1 세포에서 3H-2-데옥시글루코스 흡수는 10 ug/ml의 시험 항체 Ab001 또는 항-KLH 이소타입 대조군의 존재하에 0.8nM 인슐린에 의해 유도되었다.
도 10은 고지방 식이가 공급되고 부분 효능제 항-INSR 항체로 처리된 20주령 DIO 마우스에서 혈당 수준을 보여준다: A. 혈당 수준의 라인 그래프. B. 부분적 효능제 항-INSR 항체의 주사 후 혈당의 통계학적으로 유의적인 감소를 보여주는 혈당 수준의 막대 차트.
도 11은 부분적 효능제 항-INSR 항체의 투여가 DIO 마우스에서 혈당 조절을 개선시킴을 도시한다: A. 글루코스 관용성 시험 시간과정; B. 단식 혈당 수준; C. 글루코스 관용성 시험; 곡선 이하 면적(AUC).
도 12는 양성 조절제 항-INSR 항체가 DIO 마우스에서 인슐린 민감성을 개선시킴을 보여준다: A. 인슐린 관용성 시험 시간과정; B. 단식 혈당 글루코스 수준; C. 인슐린 관용성 시험; 곡선 이하 면적 (AUC).
도 13은 양성 조절제 항-INSR 항체가 DIO 마우스에서 혈당 조절을 개선시킴을 보여준다: A. 글루코스 관용성 시험 시간과정; B. 단식 혈당 수준; C. 글루코스 관용성 시험; 곡선 이하 면적(AUC).
도 14는 양성 조절제 및 부분적인 효능제 항-INSR 항체가 DIO 마우스에서 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준을 개선시킴을 입증한다. 혈장 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준은 AbOO1, Ab037 또는 이소타입 대조군이 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군/HFD에 상대적인)) 30주령 DIO 마우스에서 측정하였다: A. 혈장 트리글리세라이드 수준; B. 혈장 콜레스테롤 수준.
도 15는 양성 조절제 및 부분적 효능제 항-INSR 항체의 투여 후 DIO 마우스에서 혈당 조절의 개선을 도시한다. 혈당 조절 측정은 AbOO1, Ab037, Ab083, Ab085 또는 이소타입 대조군이 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05(이소타입 대조군/HFD에 상대적인)) DIO 마우스에서 관찰하였다: A. 글루코스 관용성 시험 시간과정; B. 글루코스 내성 시험; 곡선 이하 면적(AUC); C. 단식 혈당 수준.
도 16은 4주 동안 mAb로 처리된 18주령 DIO 마우스에서 양성 조절제 및 부분적 효능제 항-INSR 항체가 혈당 파라미터, 인슐린 내성 및/또는 이상지혈증을 개선시킴을 보여준다. 4주 동안 Ab001, Ab037, Ab083, Ab085 또는 이소타입 대조군이 복강내(IP) 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군/HFD에 상대적인)) DIO 마우스 기원의 혈장 분석을 수행하였다. A. 혈장 글루코스 수준; B. 혈장 인슐린 수준; C. HOMA-IR; D. 혈장 트리글리세라이드 수준; E. 혈장 비에스테르화된 콜레스테롤 수준; F. 혈장 총 콜레스테롤 수준; G. 혈장 비-HDL 콜레스테롤 수준; H. 혈장 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비.
도 17은 항-INSR 항체에 대한 양성 조절제 및 부분적 효능제가 Ab001, Ab037, Ab083, Ab085 또는 이소타입 대조군이 3주 동안 복강내(IP) 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군/HFD에 상대적임)) 18주령 DIO 마우스에서 체중 측정에 의한 측정시 DIO 마우스의 체중 증가를 감소시킴을 입증한다: A. 투여전 체중과 상대적인 체중의 %변화; B. 투여전 체중과 상대적인 체중의 % 변화: 곡선 이하 면적.
도 18은 Ab001 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg), Ab037 (10 mg/kg) 또는 이소타입 대조군(1 mg/kg 또는 10 mg/kg)이 14주 동안 복강내(IP) 주사된 (* p < 0.05(이소타입 대조군과 상대적인)) 5주령 db/db 마우스에서 체중 측정에 의해 분석된 db/db 마우스에서 체중 증가의 양성 조절제 및 부분적 효능제 항-INSR 항체-유도된 정상화를 도시한다: A. 연구 35일때까지 투여전 체중과 상대적인 체중 % 변화; B. 연구 35일째의 체중에 상대적인 체중의 % 변화; C. 연구 35일 때까지 투여전 체중과 상대적인 체중 % 변화: 곡선 이하 면적; D. 연구 35일째의 체중에 상대적인 체중의 % 변화: 곡선 이하 면적.
도 19는 양성 조절제 항체가 Ab001 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg), Ab037 (10 mg/kg) 또는 이소타입 대조군(1 mg/kg 또는 10 mg/kg)이 14주 동안 복강내(IP)로 주사된(* p < 0.05(동일한 용량에서 이소타입 대조군과 상대적인)) 5주령 db/db 마우스에서 혈당 조절 측정을 사용한 평가시 db/db 마우스에서 단식 혈당 및 HbAlc를 감소시킴을 보여준다: A. 단식 혈당 수준; B. % HbAlc 수준.
도 20은 db/db 마우스에서 양성 조절제 항체의 투여가 이상지질혈증을 개선시킴을 도시한다. Ab001 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg), Ab037 (10 mg/kg) 또는 이소타입 대조군(1 mg/kg 또는 10 mg/kg)이 14주 동안 복강내(IP)로 주사된(* p < 0.05 (동일한 용량에서 이소타입 대조군과 상대적인)) 5주령 db/db 마우스 기원의 혈장 분석을 수행하였다. A. 혈장 인슐린 수준; B. 혈장 트리글리세라이드 수준; C. 혈장 비에스테르화된 콜레스테롤 수준; D. 혈장 총 콜레스테롤 수준; E. 혈장 비-HDL 콜레스테롤 수준; F. 혈장 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비.
도 21은 양성 조절제 항체의 투여가 db/db 마우스에서 단식 혈당을 감소시킴을 보여준다. AbOO1 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg), Ab037 (10 mg/kg) 또는 이소타입 대조군(1 mg/kg 또는 10 mg/kg)이 14주 동안 복강내(IP)로 주사된(* Ab085에 대해 p < 0.05 (동일한 용량에서 이소타입 대조군과 상대적인)) 5주령 db/db 마우스의 주간 단식 혈당 평가.
도 22는 양성 조절제 항체가 AbOO1, Ab037, Ab083, Ab085 또는 이소타입 대조군이 4주 동안 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (동일한 용량에서 이소타입 대조군과 상대적인)) 5주령 db/db 마우스의 분석에 의한 평가시 db/db 마우스에서 인슐린 내성을 개선시킴을 설명하고, 투여 4주 후 인슐린 내성(HOMA-IR)에 대한 항상성 모델 평가를 보여준다.
도 23은 양성 조절제 및 부분적 효능제 항-INSR 항체가 MLDS/HFD 마우스에서 혈당 조절을 개선시킴을 도시한다. 혈당 조절 측정은 AbOO1, Ab037 또는 이소타입 대조군이 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군에 대해 상대적인)) 10주령 MLDS/HFD 마우스로부터 취하였다: A. 글루코스 관용성 시험 시간과정; B. 글루코스 관용성 시험; 곡선 이하 면적(AUC); C. 단식 혈당 수준.
도 24는 부분적 효능제 항체의 투여가 MLDS/HFD 마우스에서 공급된 혈당 및 HbAlc를 감소시킴을 보여준다. 혈당 조절 측정은 AbOO1, Ab037 또는 이소타입 대조군이 6주 동안 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군에 상대적인)) 10주령 MLDS/HFD 마우스에서 취하였다: A. 공급된 혈당 수준; B. % HbAlc 수준.
도 25는 양성 조절제 및/또는 부분적 효능제 항-INSR 항체가 MLDS/HFD 마우스에서 부분적으로 정상의 인슐린, 렙틴 및 비-HDL/HDL 콜레스테롤 수준을 보정함을 보여준다. 혈장 콜레스테롤, 인슐린 및 렙틴 수준은 AbOO1, Ab037 또는 이소타입 대조군이 6주 동안 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군에 상대적인)) 10주령 MLDS/HFD 마우스에서 측정하였다: A. 혈장 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비; B. 혈장 인슐린 수준; C. 혈장 렙틴 수준.
도 26은 양성 조절제 및 부분 효능제 항-INSR 항체가 MLDS/HFD 마우스에서 체중에 영향을 주지 않음을 도시한다. 체중 측정은 AbOO1, Ab037 또는 이소타입 대조군(10 mg/kg;)이 6주 동안 복강내(IP)로 주사된 10주령 MLDS/HFD 마우스에서 취하였고 상기 결과는 투여전 체중과 상대적인 체중의 % 변화로서 표현하였다.
도 27은 양성 조절제 및 부분 효능제 항-INSR 항체가 MLDS/HFD 마우스에서 혈당 조절을 개선시킴을 도시한다. 글루코스 관용성 시험(GTT)은 AbOO1, Ab083, Ab085, Ab037 또는 이소타입 대조군이 3주 동안 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군에 상대적인)) 10주령 MLDS/HFD 마우스에서 수행하였다. A. 글루코스 관용성 시험 시간과정 B. 글루코스 관용성 시험; 곡선 이하 면적 (AUC).
도 28은 양성 조절제 및 부분 효능제 항-INSR 항체가, AbOO1, Ab083, Ab085, Ab037 또는 이소타입 대조군이 6주 동안 복강내(IP)로 주사된(Ab083 및 Ab037에 대해 10 mg/kg; * p < 0.05(이소타입 대조군에 상대적인)) 10주령 MLDS/HFD 마우스의 주간 단식 혈당 평가에 의한 측정시 MLDS/HFD 마우스에서 혈당 조절을 개선시킴을 보여준다.
도 29는 양성 조절제 및 부분 효능제 항-INSR 항체가 MLDS/HFD 마우스에서 이상지질혈증을 개선시킴을 도시한다. AbOO1, Ab083, Ab085, Ab037 또는 이소타입 대조군이 6주 동안 복강내(IP)로 주사된(10 mg/kg; * p < 0.05 (이소타입 대조군에 상대적인)) 10주령 MLDS/HFD 마우스 기원의 혈장 분석을 수행하였다. A. 혈장 트리글리세라이드 수준; B. 혈장 유리 지방산 수준; C. 혈장 비에스테르화된 콜레스테롤 수준; D. 혈장 총 콜레스테롤 수준; E. 혈장 비-HDL 콜레스테롤 수준; F. 혈장 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비.
도 30은 양성 조절제 및 부분적 효능제 항-INSR 항체가, AbOO1, Ab083, Ab085, Ab037 또는 이소타입 대조군이 6주 동안 복강내(IP)로 주사된 (Ab083 및 Ab037에 대해 10 mg/kg; * p < 0.05(이소타입 대조군에 상대적인)) 10주령 MLDS/HFD 마우스에서 혈액 HbAlc 평가에 의한 측정시 MLDS/HFD 마우스에서 혈당 조절(HbAlc)을 개선시킴을 보여준다.
도 31은 양성 조절제 및 부분 효능제 항-INSR 항체가, 일반적으로 AbOO1, Ab083, Ab085, Ab037 또는 이소타입 대조군(10 mg/kg)이 6주 동안 복강내(IP)로 주사된 10주령 MLDS/HFD 마우스에서 체중 측정을 사용한 측정시 MLSD/HFD 마우스에서 체중에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
도 32는 양성 조절제 및 부분 효능제 항-INSR 항체가 생체내 인슐린 시그날 전달을 증폭시킴을 보여준다. 10주령 C56BL/6 수컷 마우스에 Ab083, Ab085, Ab037 또는 이소타입 대조군(10 mg/kg)을 24시간 동안 주사하였고 간(A) 및 근육(B) INSR 티로신 인산화에 대한 효과는 인슐린 1회분 주사 후 ELISA로 측정하였다.
도 33은 IgG2 불변 영역으로 재포맷된 INSR-특이적 항체에 특징인 결합을 보여주는 표이다.
도 34는 내인성 리간드(A)에 대한 용량 반응 또는 알로스테릭 효능제 항체(B)의 존재 또는 부재하에 리간드에 의한 활성화와 비교되는 부분 알로스테릭 효능제 항-INSR 항체로부터의 용량 반응을 도시한다.
도 35는 내인성 리간드 (A)에 대한 용량 반응 또는 양성 조절제 항체(B)의 존재 및 부재하에 내인성 리간드의 용량 반응과 비교되는 양성 조절제 항체로부터의 용량 반응을 보여준다.
도 36은 내인성 리간드 인슐린과 상대적인 단독의 부분 알로스테릭 효능제 세트에 대한 활성화 파라미터를 도시한다. 데이타는 Ser473에서 % Akt 인산화 측정으로부터 수득하였다.
도 37은 음성 대조군 항체의 존재하에 내인성 리간드에 대한 최대 반응에 상대적인 10ug/ml 부분 알로스테릭 효능제 항체의 존재하에 인슐린의 활성화 성질을 도시한다. 데이타는 Ser473에서의 % Akt 인산화의 측정으로부터 수득하였다.
도 38 내지 40은 모 CHO-K1 세포에 대한 인슐린의 준최적 농도의 존재하에 또는 인슐린의 부재하에 항체에 의한 pAkt 활성화를 도시하고, CHO-K1 세포는 사람 인슐린 수용체를 발현하고 CHO-K1 세포는 마우스 안슐린 수용체를 발현한다. 도 38A 내지 C는 pAkt 활성이 거의 없거나 효능 작용이 없는 감작화제 Abs의 효과를 보여준다((인슐린 부재하에 50ug/ml의 항체를 사용한 <10% pAkt 활성화). 도 39A 내지 C는 pAkt 활성의 약하거나 적당한 효능작용을 갖는 감작화제 Abs(Ab001, Ab079, Ab083)의 효과를 보여준다(인슐린의 부재하에 50ug/ml 항체를 사용한 10-20% pAkt 활성화). 도 40은 pAkt 활성의 적당한 효능 작용을 갖는 감작화제 Ab(Ab080)의 효과를 도시한다(인슐린의 부재하에 50ug/ml의 항체를 사용한 >20% pAkt 활성화).
도 41은 감작화 항-INSR 항체의 고정 농도의 존재하에 사람(A 및 C) 또는 마우스 INSR(B)를 발현하는 CHO 세포에서 인슐린 의존성 pAkt 활성화를 보여준다.
도 42는 단독의 인슐린과 비교하여 인슐린 부재하의 부분 알로스테릭 효능제 항체에 의한 사람 (A) 또는 마우스 INSR(B)를 발현하는 CHO 세포에서의 pAkt 활성화를 입증한다.
도 43은 부분 알로스테릭 효능제 항체의 고정 농도의 존재하에 사람 INSR을 발현하는 CHO 세포에서 인슐린 의존성 pAkt 활성화의 결과를 도시한다.
도 44는 (A) 사람 INSR 또는 (B) 마우스 INSR을 발현하는 CHOK1 세포에 대한 항체 83-7 및 Ab001에 대한 pAKT 분석 결과를 보여준다.
도 45는 평가된 인슐린 수용체 농도에 대해 플롯팅된 유리 인슐린 %를 보여준다. 상기 인슐린 수준은 50pM에 고정시키고 항체 농도는 모든 클론에 대한 항체 농도는 lOug/mL (67nM)이고, 단, fAb078은 25ug/mL (167nM)에서 시험하였다. 나타난 곡선은 EC50을 계산하기 위해 사용되는 비-선형 회귀 프리즘 피트이다.
도 46은 평가된 인슐린 수용체 농도에 대해 플롯팅된 유리 인슐린 %를 보여준다. 상기 인슐린 수준은 50pM로 고정시켰고 모든 클론에 대한 항체는 lOug/mL (67nM)이었다. 나타낸 곡선은 EC50을 계산하기 위해 사용되는 비-선형 회귀 프리즘 피트이다.
도 47은 TNFα가 항-INSR 항체 Ab085의 존재하에 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 매개된 지방산 흡수의 탈감작화를 유도함을 보여준다.
도 48 및 도 49는 pAKT 분석에서 측정된 바와 같이 사람 INSR(도 48) 및 마우스 INSR(도 49)에 대한 정제된 양성 조절제 항-INSR 항체 AbOO1, Ab037, Ab077, Ab079, AB080 및 Ab083의 효과를 도시한다.
도 50 및 51은 사람 INSR(도 50) 및 마우스 INSR(도 51)에 대한 정제된 효능제 항체 Ab037, Ab030, Ab053 및 Ab062의 상대적 % pAKT를 입증한다.
도 52는 정제된 항-INSR 항체 Ab030, Ab037, Ab053, Ab001, Ab079, AB080 및 Ab083이 몽키 INSR의 활성화 후 AKT 인산화(상대적 % pAKT)를 유도할 수 있음을 입증한다.
도 53은 사람 INSR을 발현하는 CHOK1 세포에서 측정된 음성 조절제 항체 Ab061, Ab070 및 Ab081의 상대적 % pAKT를 보여준다.
도 54는 인슐린 수용체 항체의 교차 반응을 보여주는 표이고, 사람 인슐린 수용체에 결합하는 특정 항체가 또한 토끼 및 시노몰거스 인슐린 수용체에 결합하고 상기 결합이 인슐린 존재에 의해 조절됨을 도시한다.
본 발명은 인슐린 수용체(INSR) 또는 인슐린 수용체-인슐린 복합체에 특이적인 항체, 및 비정상적인 글루코스 수준, 예를 들어, 고혈당증 또는 저혈당증, 비정상적인 인슐린 수준 또는 비정상적인 인슐린 민감성과 관련된 장애, 예를 들어, 인슐린 내성의 장애 또는 인슐린 민감성의 장애의 치료에서 이의 용도를 제공한다. 이들 항체는 INSR-INS 시그날 전달 복합체 성분의 어셈블리 및 해리에 대한 역학적 속도 상수를 변경시킴에 의해 또는 시그날 전달 복합체의 구조적 상태를 변경함을 포함하는 다른 기작, 예를 들어, 전이 상태에 결합하고 시그날 전달의 활성화를 가속화시킴에 의해 INSR에서 세포 반응에 대한 양성 또는 음성 효과를 유도할 수 있다.
시그날 전달 복합체의 조절은 시그날 입수에 대한 민감성을 증가시키거나 감소시키고 동시에 시그날 도입을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 조절제 항체의 투여는 세포 경로의 민감성 및/또는 세포 반응의 절대 수준을 증가시키거나 감소시킨다. 이들의 성질에 따라 본 발명의 조절제는 조절제, 강화제, 조정자, 이펙터 또는 감작화제로서 기능할 수 있다.
많은 항체 약물은 세포 표면 수용체 또는 이의 동족 리간드에 결합하고 수용체에 결합하고 활성화시키는 리간드의 능력을 제거함에 의해 시그날 전달 경로를 차단시키는 작용을 한다. 상기 차단 약물은 화학양론적으로 수용체-리간드 복합체의 형성을 방해함에 의해 이들의 효과를 매개한다.
몇몇 질환의 성공적인 치료는 허용되는 부작용 프로필을 갖는 정상적인 생리학적 상태를 복구시키기 위해서는 시그날 전달 경로의 완전한 억제보다는 약화시킬 필요가 있을 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 항체는 상기 잇점을 제공할 것으로 예상된다.
기타 치료학적 약물은 세포 표면 수용체에 결합하고 상기 수용체의 활성을 변화시킴에 의해 세포 시그날 전달 경로에 영향을 미친다. 상기 직접적인 효능제 약물은 리간드의 천연 활성을 모방함에 의해 이들의 효과를 매개할 수 있고 따라서 고유 활성을 가질 수 있다. 즉, 이들은 이들의 효과를 매개하기 위한 리간드의 존재를 필요로 하지 않는다. 추가의 치료학적 약물은 리간드에 결합함에 의해 세포 시그날 전달 경로에 영향을 미친다. 상기 간접적인 효능제 약물은 리간드 안정성 또는 결합가를 변화시킴에 의해 이들의 효과를 매개할 수 있다.
생물학적 과정은 일반적으로 이분 방식 보다는 연속식으로 조절되고 따라서, 많은 경우에 경로 활성의 조절이 완전한 경로 차단 또는 자극보다 적당한 치료학적 전략일 수 있다. 완전한 경로 차단 또는 자극을 위한 것보다 경로 활성의 조절을 위한 기능적 세포 기반 스크리닝을 수행하는 것은 힘든일이고 고처리량 방식으로 용이하게 수행될 수 없는데, 그 이유는 상기 스크리닝이 일반적으로 공지된 농도의 시험 화합물을 필요로 하고 시험 화합물 제제에서 임의의 불순물에 민감할 수 있기 때문이다. 특히, 경로 활성의 조절을 위한 고처리량의 기능성 세포 기반 스크리닝을 수행하는 능력은 세포내 환경에 진입할 수 없는 세포 불투과성 분자 및 특히 사용되는 생산 시스템에서 상이한 발현 수준, 순도 및 안정성을 가질 수 있는 재조합 생물학적 분자에 대해서는 제한된다. 또한, 일부 결합 상호작용은 기능적 스크리닝에서 측정할만한 시그날 전달을 생성하지 못하여(예를 들어, 유인용(decoy) 수용체, 유인용 기질 또는 불활성 형태의 표적물의 경우) 이들 상호작용을 방해하는 제제의 동정을 어렵게 한다.
본 발명은 상기 단점을 극복하고 고처리량 방식으로 INSR 활성의 양성 및 음성 조절제 및 약물의 목적하는 효능을 동정하기 위한 수단을 제공한다. 본 발명은 또한 목적하는 범위의 조절 활성을 갖는, INSR 활성의 양성 및 음성 조절제를 제공하고, 이들 조절제가 글루코스 흡수를 변화시키는, 목적하는 생물학적 효과를 나타냄을 보여주는 데이터를 제공한다.
정의
용어 "화합물"은 제한없이, 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드, 소분자, 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA), 탄수화물, 지질, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 펩티도모사체, 폴리케타이드 및 유도체, 이의 구조적 유사체 또는 조합체를 포함하는, 유기 또는 무기 내인성 또는 외인성의 임의의 화학적 화합물을 언급한다. "내인성"은 포유동물에 천연적으로 존재하는 것을 의미하고 "외인성"은 포유동물에 천연적으로 존재하지 않는, 예를 들어, 투여된 외래 화합물을 의미한다.
상기 용어 "폴리펩타이드 결합제"는 항원, 예를 들어, 표적물 또는 이의 시그날 전달 파트너에 특이적으로 결합할 수 있거나, 측정 가능한 결합 친화성으로 항원에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 언급한다. 폴리펩타이드 결합제의 예는 임의로 다른 펩타이드 잔기 또는 비펩타이드 잔기에 접합된, 항체, 펩티바디, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드 결합제가 결합할 수 있는 항원은 항체 반응을 유발할 수 있거나 비특이적 결합보다 큰 검출가능한 결합 친화성으로 폴리펩타이드 결합제에 결합할 수 있는 임의의 단백질성 또는 비단백질성 분자를 포함함할 수 있다. 조절 폴리펩타이드 결합제가 할 수 있는 항원은 표적물, 표적물의 시그날 전달 파트너 및/또는 표적물을 포함하는 복합체 및 이의 시그날 전달 파트너를 포함할 수 있다.
상기 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고 완전히 어셈블리된 항체, 사량체성 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다특이적 항체(예를 들어, 이특이적 항체), 항원과 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일쇄 항체, 이중체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이전의 것들을 포함하는 재조합 펩타이드를 포함한다. "면역글로불린" 또는 "사량체성 항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 사량체성 당단백질이고 상기 각각의 쇄는 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 항원 결합부는 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편 또는 항원 결합부는 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체(dAb), 상보성 결정 영역(CDR) 단편, CDR-이식 항체, 단일쇄 항체(scFv), 단일쇄 항체 단편, 키메라 항체, 이중체, 삼중체, 사중체, 소형체, 선형 항체; 킬레이팅 재조합 항체, 삼중체 또는 이원체, 내부체(intrabody), 나노체, 소형 모듈 면역약제(SMIP), 항원 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화된 항체, VHH 함유 항체, 또는 항체가 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 한, 이의 변이체 또는 유도체, 및 특정 항원이 폴리펩타이드에 결합하도록 하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 CDR 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다.
"모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 언급하고, 즉 집단에 포함되는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는, 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 변이체"는 천연 항체 가변 영역 도메인의 가변 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 항체 폴리펩타이드 서열을 언급한다. 변이체는 비변형된 항체와 실질적으로 상동성이거나 실질적으로 동일할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 항체"는 전형적으로 상이한 종으로부터 기원하는 2개의 상이한 항체로부터 유래된 서열을 함유하는 항체를 언급한다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호). 대부분 전형적으로, 키메라 항체는 사람 및 설치류 항체 단편, 일반적으로 사람 불변 및 마우스 가변 영역을 포함한다.
"중화 항체"는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 기능을 제거하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 항체 분자이다. 따라서, "중화" 항체는 효소 활성, 리간드 결합 또는 세포내 시그날 전달과 같은 생물학적 기능을 제거하거나 실질적으로 감소시킬 수 있다.
또한 "분리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고 회수된 항체이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단학적 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이고 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 항체는 (1) 로우리 방법에 의한 측정시 95중량% 초과의 항체 및 가장 바람직하게는 99중량% 초과의 항체로 정제되거나 (2) 회전 컵 배열장치의 사용시 15개 이상 잔기의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균일하게 정제될 수 있다. 분리된 항체는 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포내에 동일계 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 분리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "중쇄 가변 영역"은 상기 항체 중쇄 가변 도메인의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 분자 영역을 언급한다. 상기 중쇄 가변 영역은 상기 항체 중쇄의 1개, 2개 또는 3개이 CDR을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "경쇄 가변 영역"은 상기 항체 경쇄 가변 도메인의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 항체 분자 영역을 언급한다. 상기 경쇄 가변 영역은 항체에 따라 카파 또는 람다 경쇄일 수 있는 상기 항체 경쇄의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합하는", "항원 특이적", 항원 표적물에 "특이적", 또는 항원에 "면역반응성"인 항체는 유사 서열의 다른 항원보다 더 큰 친화성으로 항원에 결합하는, 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드 결합제를 언급한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드 결합제 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 다른, 즉 비사람 종의 유사 항원에 비해 사람 항원에 보다 큰 친화성으로 결합하지만 표적물의 동족체를 인지하고 이에 결합하는 폴리펩타이드 결합제는 본 발명의 범위내에 있다.
예를 들어, 동족 항원에 대해 "특이적"인 항체 또는 이의 단편인 폴리펩타이드 결합제는 항체의 가변 영역이 검출가능하게 우선적으로 목적하는 항원을 인지하고 결합함을 지적한다(예를 들어, 여기서, 상기 목적하는 항원이 폴리펩타이드인 경우, 항체의 가변 영역은 계열 구성원간의 국소적 서열 동일성, 상동성 또는 유사성이 존재할 수 있다하더라도 측정 가능한 결합 친화성의 차이 때문에 항원 폴리펩타이드를 동일 계열의 다른 공지된 폴리페타이드와 구분할 수 있다). 특이적 항체는 또한 항체의 가변 영역 이외의 서열 및 특히 분자의 불변 영역에서의 서열과의 상호작용을 통해 다른 단백질(예를 들어, ELISA 기술에서 에스. 아우레우스 단백질 A 또는 다른 항체)과 상호작용할 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 항체의 결합 특이성을 결정하기 위한 스크리닝 분석은 당업계에 널리 공지되어 있고 통상적으로 수행된다. 상기 분석에 대한 자세한 논의를 위해 문헌[Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6]을 참조한다. 본 발명에 사용하기 위한 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 영역의 하나 이상에서 선택적 결합제에 의해 인지될 수 있거나 결합될 수 있는 임의의 분자 부분을 언급한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹 집단으로 이루어지고, 특이적 하전 특성 뿐만 아니라 특이적 3차원 구조적 특성을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 에피토프는 연속성이거나 비연속성일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 결합제 및 폴리펩타이드와 연계하여 사용되는 경우 용어 "유도체"는 유비퀴틴화, 치료학적 또는 진단학적 제제로의 접합, 표지화(예를 들어, 방사선뉴클리드 또는 다양한 효소), 공유 중합체 부착, 예를 들어 페길화(폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도체화) 및 사람 단백질에 천연적으로 존재하지 않는 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 언급한다. 유도체는 본 발명의 비유도체화된 분자의 결합 성질을 보유한다.
"검출가능한 잔기" 또는 "표지"는 분광학적, 광화학적, 생물학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 언급한다. 예를 들어, 유용한 표지는 32P, 35S, 형광성 염료, 고전자 밀도 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 통상적으로 사용되는 바와 같은), 비오틴-스트렙타바딘, 디옥시게닌, 합텐 및 이의 항혈청 또는 모노클로날 항체가 가용한 단백질 또는 또 다른 표지된 핵산 분자와 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 상기 검출가능한 잔기는 흔히 샘플중에 결합된 검출가능한 양의 잔기를 정량하기 위해 사용될 수 있는 방사능활성, 발색성 또는 형광성 시그날과 같은 검출가능한 시그날을 생성한다.
"펩타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"는 전형적으로 길이가 3개 내지 100개 아미노산 잔기인 짧은 아미노산 서열이고 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기 및 단독으로 또는 천연 아미노산 잔기와 조합하여 사용되어 펩타이드에게 특정 형태적 특이성 또는 특정 생물학적 활성(예를 들어, 단백질용해에 대한 내성)을 부여할 수 있는 비천연 유사체 잔기를 포함한다. 펩타이드는 펩타이드 서열 반복체를 포함하고 헤드-투-테일 또는 헤드-투-헤드로 배열된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 복사물의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 펩타이드는 비-펩타이드성 잔기에 접합, 예를 들어, [확장] 될 수 있다. 펩타이드는 이량체, 삼량체 또는 고도의 다량체(예를 들어, PEG와 같은 다른 중합체성 또는 비중합체성 잔기로의 접합을 통해 형성된다)를 포함한다.
"폴리펩타이드"는 보다 긴 아미노산 서열, 전형적으로 길이가 100개 이상인 아미노산 잔기들이고, 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기, 및 단독으로 또는 천연 아미노산 잔기와 조합하여 사용되어 폴리펩타이드에게 특정 형태적 특이성 또는 특정 생물학적 활성(예를 들어, 단백질용해에 대한 내성)을 부여할 수 있는 비천연 유사체 잔기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "펩티바디"는 면역글로불린(Ig) 불변 영역의 전부 또는 일부에 융합된 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드이다[문헌참조: 미국 특허 제6,660,843호]. 상기 펩타이는 항원과 결합하는 천연 또는 재조합적으로 제조되거나 화학적으로 합성된 펩타이드 일 수 있다. 상기 펩타이드는 반복될 수 있고 헤드-투-테일 또는 헤드-투-헤드로 배열된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상 복사물의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Ig 불변 영역의 일부는 하나 이상의 불변 영역 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3, 및/또는 CH4), 다중 도메인(예를 들어, CH3와 CH2), 다중 복사물의 도메인(예를 들어, CH2-CH2), 목적하는 활성을 보유하는 불변 도메인의 임의의 단편, 예를 들어, 순환계에서 면역글로불린의 반감기를 연장시키는데 관여하는 구제(salvage) 수용체 에피토프, 또는 이의 임의의 조합체를 포함할 수 있다.
"소형" 분자 또는 "소형" 유기 분자는 본원에서 분자량이 약 1000 돌턴 이하인 비중합체성 유기 화학적 화합물로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, "시그날 전달 복합체"는 세포 시그날의 도입을 매개하는 단백질 및/또는 내인성 또는 외인성 화합물의 어셈블리이다. 시그날 전달 복합체의 예는 막 결합된 수용체에 결합하는 리간드, 기질, 또는 시그날 연쇄 반응에 관여하는 생화학적 반응들을 전달하는 것과 관련된 임의의 세포 분자들에 결합하는 효소를 포함할 수 있다. 시그날 전달 복합체는 또한 코어수용체, 조인자, 스캐폴드 단백질, 알로스테릭 조절제 및 다수의 다른 유형의 단백질 및 세포 시그날 전달에 관여하는 분자를 포함할 수 있다. 시그날 전달 복합체는 일시적으로 형성될 수 있거나 장기간 지속적일 수 있다. 시그날 전달 복합체의 상기 분자 구성 또는 성분들은 시간 경과에 따라 다양할 수 있고 각각의 성분의 활성화 상태 및 세포 환경에 따라 다양할 수 있다. 시그날 전달 복합체는 화학적 변형 및 조절을 진행할 수 있고 이는 전달 활성, 완전한 불활성화 및 항상성 활성화 또는 양성 및 음성 조절에서 민감한 변화를 포함하는, 복합체에 다양한 효과를 유도할 수 있다.
용어 "치료학적 유효량"은 본원에서 시그날 전달 복합체의 비정상적인(예를 들어, 비정상적으로 높거나 낮은) 시그날 전달과 관련된 질환의 증상 또는 징후를 완화시키거나 감소시키는데 효과적인 본 발명의 표적 특이적 조성물의 양을 지적한다.
본원에 사용된 바와 같이 "결합"은 수소 결합, 반데르 발스, 이온 쌍극자 및 소수성 작용 및 강한 이온 결합을 포함하는 하나 이상의 약한 힘으로 이루어진 특정 네트워크의 비공유 상호작용으로부터 비롯되는 2개 이상의 별도의 분자 실체간의 물리적 결합이다. 결합 수준 또는 정도는 친화성 측면에서 측정될 수 있다. 친화성은 평형 결합 상수 또는 역학적 결합율 파라미터에 의해 정의될 수 있는 2개 이상의 별도의 분자 실체간의 결합 상호작용 강도의 측정이다. 적합한 상수 또는 파라미터 및 이들의 측정 단위의 예는 당업계에 널리 공지되어 있고 평형 결합 상수(KA), 예를 들어, 약 105M-1 이상, 약 106M-1 이상, 약 107M-1 이상, 약 108M-1 이상, 약 109M-1 이상, 약 1010M-1 이상, 약 1011M-1 이상 또는 약 1012M-1 이상; 평형 해리 상수(KD), 예를 들어, 약 10-5M 이하, 또는 약 10-6M 이하, 또는 약 10-7M 이하, 또는 약 10-8M 이하, 또는 약 10-9M 이하, 또는 약 10-10M 이하, 또는 약 10-11M 이하, 또는 약 10-12M 이하; 결합율 (예를 들어, sec-1, mol-1) 및 해리율 (예를 들어, sec-1))을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. KA의 경우에, 보다 높은 값은 "보다 강한" 또는 "강력해진" 결합 친화성을 의미하고, KD의 경우에 보다 낮은 값은 "보다 강한" 또는 "강력해진" 결합 친화성을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "강력해진" 결합율 파라미터는 증가된 잔류 시간, 보다 강한 결합 또는 보다 약한 해리를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약해진" 결합율 파라미터는 감소된 잔류 시간, 보다 약한 결합 또는 보다 강한 해리를 의미한다. 결합율의 경우에, 보다 높은 값은 보다 신속하거나 보다 빈번한 결합을 의미하고, 따라서 일반적으로 강력해진 결합 친화성을 유도한다. 해리율의 경우에, 보다 낮은 값은 일반적으로 보다 느린 해리를 의미하고, 따라서 일반적으로 보다 강한 결합 친화성을 유도한다. 그러나, 이후에 추가로 상세히 설명되는 바와 같이, 결합율과 해리율의 비는 결합 친화성을 나타낸다.
2개의 화합물간의 친화성, 예를 들어,항체와 항원간의 친화성, 또는 시그날 전달 복합체의 제1 및 제2 성분간의 친화성은 직간접적으로 측정될 수 있다. 친화성의 간접적인 측정은 친화성을 나타내고/나타내거나 이에 비례하는 대리 성질을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 대리 성질은 시그날 전달 복합체의 제1 화합물의 제2 화합물로의 결합 양 또는 수준, 또는 제2 성분에 대한 제1 성분의 겉보기 결합 친화성을 예측하고/하거나 관련되는 제1 성분 또는 제2 성분을 특징으로 하는 생물리적 특징을 포함한다. 특정 예는 제1 또는 제2 성분 중 하나의 준포화 농도에서 제1 성분의 제2 성분으로의 결합 양 또는 수준을 측정함을 포함한다. 측정될 수 있는 다른 생물리적 특징은 총 분자 전하, 회전 활성, 확산율, 용융 온도, 대전 스티어링, 또는 제1 성분 및 제2 성분 중 하나 또는 둘다의 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 측정될 수 있는 또 다른 생물리적 특징은 다양한 온도, pH, 또는 이온 강도의 영향에 대한 결합 상호작용의 안정성을 측정함을 포함한다.
측정된 친화성은 많은 다른 인자들중에서 결합 성분의 농도, 분석 셋업, 결합 성분의 원자가, 완충 조성, pH, 이온 강도 및 온도를 포함하는 측정을 위해 사용되는 정확한 조건 및 결합 반응에 첨가되는 추가 성분들, 예를 들어, 알로스테릭 조절제 및 조정자들에 따라 다양하다. 정량 및 정성 방법을 사용하여 결합 상호작용의 절대 및 상대적 강도 둘다를 측정할 수 있다.
겉보기 친화성은 친화성이 알로스테릭 조절제, 억제제, 결합 성분 원자가 등과 같은 결합 반응중에서 조건 또는 성분들에 의해 변화는 조건하에 2개 이상의 별도의 분자 실체간의 결합 상호작용에 대해 측정된 강도이다.
본원에 사용된 바와 같은 "준포화 농도"는 결합 반응중에서 다른 성분들의 결합 부위 모두를 차지하기 위해 요구되는 것보다 낮은 한 성분의 농도 및/또는 결합 친화성 KD보다 훨씬 미만인 결합 반응중에서의 하나 이상의 성분의 농도이다. 준포화 조건하에서, 결합 반응에서 결합 성분들 중 하나의 상당한 %는 가용한 결합 부위를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "생물리적 분석"은 절대 또는 상대적 양상으로 2개 이상의 화합물간의 결합, 연합, 해리, 결합 친화성, 결합 수준 또는 결합율 파라미터를 측정하는 임의의 방법이다. 일반적으로 생물리적 분석은 시험관내에서 수행되고, 정제되고 세포 결합된 성분들의 조합 뿐만 아니라 정제된 결합 성분, 정제되지 않은 성분들, 세포 결합된 성분들을 사용하여 수행될 수 있다.
"효능제"는 수용체에 결합하고 이의 시그날 전달을 활성화시키는 유형의 리간드 또는 약물을 기재하기 위해 사용되는 용어이다. 수용체의 활성을 변화시키는 능력은 또한 효능제의 효능으로서 공지되어 있고 이는 수용체에 결합하지만 수용체의 시그날 전달을 활성화시키지 않는 유형의 수용체 리간드인 길항제와 구별되는 성질이다. 효능제의 효능은 수용체의 활성을 증가시키는 양성이거나 수용체의 활성을 감소시키는 음성일 수 있다. 완전한 효능제는 수용체에 결합하고 이를 활성화시켜 당해 수용체에 완전한 효능을 나타낸다. 부분적 효능제는 또한 소정의 수용체에 결합하고 이를 활성화시키지만, 완전한 효능제와 상대적으로 수용체에 단지 부분적 효능을 갖는다. 역 효능제는 상기 수용체에 대해 효능제로서 동일한 수용체 결합 부위에 결합하고 수용체의 항상성 활성을 역전시키는 제제이다. 역 효능제는 수용체 효능제와는 반대의 약리학적 효과를 나타낸다. 공-효능제는 다른 공-효능제와 협력하여 목적하는 효과를 함께 생성시킨다.
경쟁 또는 오르토스테릭 효능제는 리간드와 동일한 결합 부위(활성 부위)에서 수용체와 가역적으로 결합하므로써 수용체상의 동일한 결합 부위에 대해 리간드와 경쟁한다.
상이한 측면에서, 본원에 기재된 항체는 알로스테릭 효능제로서 작용한다. 이들은 활성 결합 부위와는 구분되는 INSR의 일부에 결합하고 인슐린 및 INSR의 결합 친화성을 2배 이상으로 감지할만하게 변화시키지 않는다. 이들은 또한 INSR에 대한 인슐린 상호작용의 EC50에 감지할만하게 영향을 주지 못하고 예를 들어, EC50을 2배 미만으로 변화시킨다. 상기 항체는 인슐린의 최대 효능제 반응의 80% 이하, 예를 들어, 15%-80%, 20-60%, 20%-40% 또는 15%-30%인 최대 효능제 반응으로 INSR을 항상성으로 활성화시킨다. 특정 양태에서, 항체는 인슐린의 최대 효능제 반응의 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%; 및 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이하인 최대 효능제 반응으로 INSR을 항상성으로 활성화시킨다. 이들 범위중 어느 하나의 임의의 조합은 각각의 가능한 조합을 언급할 필요 없이 고려된다. 몇몇 양태에서, 최대 효능제 반응은 Akt 분석으로 측정한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M 이하의 친화성으로 인슐린 수용체에 결합하는 알로스테릭 효능제 항체를 제공한다. 본 발명의 이론에 얽매이지 않고, 알로스테릭 효능제의 약한 효능제 활성은 천연 기본 인슐린 분비 수준의 효과를 모방하는 작용을 하고 외인성으로 투여된 인슐린이 이의 정상적인 글루코스 저하 효과를 나타내게 한다. 특정 양태에서, 알로스테릭 효능제는 부분적 알로스테릭 효능제이다. 길항제는 효능제에 의해 수용체가 활성화되는 것을 차단한다. 선택적 효능제는 하나의 특정 유형의 수용체에 대해 선택적이다. 이것은 추가로 상기 언급된 유형중 어느 하나일 수 있다.
길항제의 효능은 일반적으로 이의 EC50 값의 역으로 정의된다. 이것은 효능제의 최대 생물학적 반응의 절반을 유발시키는데 필요한 효능제의 농도를 측정함에 의해 소정의 효능제에 대해 계산될 수 있다. EC50값이 낮을 수록 효능제의 효능은 보다 크다.
수용체 "길항제"는 수용체 결합시 그 자체로 생물학적 반응을 유발하지 않지만 효능제 매개된 반응을 차단하거나 감소시키는 수용체 리간드 또는 약물의 유형이다. 길항제는 친화성을 가질 수있지만 이의 동족 수용체에 대해 효능을 갖지 않고 결합은 상호작용을 붕괴시키고 수용체에서 효능제 또는 역 효능제의 기능을 억제한다. 길항제는 수용체상의 활성 부위 또는 알로스테릭 부위에 결합함에 의해 이들의 효과를 매개하거나, 이들은 정상적으로 수용체 활성의 생물학적 조절에 관여하지 않는 고유 결합 부위에서 상호작용할 수 있다. 길항제 활성은 길항제-수용체 복합체의 수명(이는, 이어서 길항제 수용체 결합 특성에 의존한다)에 따라 가역적이거나 비가역적일 수 있다. 대다수의 길항제는 수용체상의 구조적으로 한정된 결합 부위에서 내인성 리간드 또는 기질과 경쟁함에 의해 이들의 효능을 성취한다.
길항제는 이들이 결합하는 수용체를 활성화시키는 효능을 나타내지 않는다. 그러나, 일단 결합하면 길항제는 효능제, 역 효능제 및 부분 효능제의 기능을 억제할 수 있다. 기능적 길항제 분석에서, 용량 반응 곡선은 효능제의 활성을 역전시키는 농도 범위의 길항제의 능력에 대한 효과를 측정한다. 길항제의 효능은 일반적으로 이의 IC50값으로 정의된다. 이것은 효능제의 최대 생물학적 반응의 절반의 억제을 유발하는데 요구되는 길항제의 농도를 결정함에 의해 소정의 길항제에 대해 계산될 수 있다. IC50이 낮을 수록 길항제의 효능은 크다.
경쟁 또는 오르토스테릭 길항제는 수용체를 활성화시키는 것 없이 리간드 또는 효능제와 동일한 결합 부위(활성 부위)에 가역적으로 결합하므로써 수용체상의 동일한 결합 부위에 대해 효능제와 경쟁한다. 비경쟁 또는 알로스테릭 길항제는 효능제와는 별도의 결합 부위에 결합하여 상기 별도의 결합 부위를 통해 상기 수용체에 대해 이들의 작용을 발휘한다. 따라서, 이들은 결합에 대해 효능제와 경쟁하지 않는다. 경쟁하지 않는 길항제는 이들이 알로스테릭 결합 부위에 결합할 수 있기 전에 효능제에 의한 수용체 활성화를 요구한다는 점에서 비경쟁 길항제와는 상이하다.
"인슐린 내성"은 생리학적 양의 인슐린이 세포 또는 조직 기원의 정상적인 인슐린 반응을 나타내는데 부적당한 조건을 기재한다.
"인슐린 감작화제"는 인슐린에 대한 세포 또는 조직 민감성을 증가시켜 소정의 준포화 농도의 인슐린에 대한 글루코스 흡수 수준을 보다 크게 증가시키는 화합물 또는 약물이다.
잇점
본 발명은 INSR의 세포외 영역에 결합함에 의해 인슐린-INSR 시그날 전달 복합체를 조절하는 치료학적 제제를 개발할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 신규 선택 및 스크리닝 방법을 사용하여 예를 들어, INSR의 세포외 영역을 표적화하여 인슐린 작용을 강화시키는 인슐린 감작화제를 동정한다. 특히, 본원에서 동정된 항체의 일부는 INSR의 세포외 영역에 결합하고 인슐린-INSR 시그날 전달 복합체를 양성으로 또는 음성으로 조절하는 비효능성 항체이다.
본 발명은 기존의 치료제보다 특유의 잇점을 제공하는 인슐린-INSR 시그날 전달 복합체 조절제를 포함한다. 이들은 전체 범위의 인슐린 작용의 유도를 허용하면서 목적하지 않는 부작용을 최소화하는 INSR의 수준에서 작용한다. INSR 효능작용의 회피는 기능성 저혈당증의 위험을 감소시켜야만 한다. 추가로, 보다 정확한 글루코스 수준의 조절이 성취될 수 있다. 따라서, 혈당 수준이 증가하는 경우 인슐린 수준의 상승을 유도하여 상기 조절제는 보다 큰 효과를 갖는다. INSR의 세포외 영역을 표적화하므로써 내인성 또는 외인성 인슐린, 인슐린 유사체 또는 인슐린 모사체의 효과를 조절하는 인슐린-INSR 시그날 전달 복합체 조절체로서의 생물학적 분자의 사용을 가능하게 하고; 이들은 개선된 반감기, 감소된 용량 또는 투여 횟수, 감소된 독성 및 보다 큰 제조의 용이성과 같은 잇점을 가질 수 있다. 본 발명은 말초 인슐린 내성을 감소시키고 혈당 조절을 개선시킬 것으로 예상되는 인슐린-INSR 시그날 전달 복합체 조절제를 포함한다. 조절제의 감작화 효과는 인슐린 수준이 외인성 인슐린 치료의 부재에서 적절한 글루코스 흡수를 자극시킬 정도로 충분히 높지 않은 환자에서 말초 조직에 의한 글루코스 흡수의 수준을 개선시켜야만 한다. 따라서, 본 발명의 항체의 투여는 다른 약물에 대신 또는 다른 항당뇨병 제제에 대한 보조 치료제로서 인슐린 내성의 조기 단계에 사용될 수 있다. 다른 항당뇨병 제제에 대한 보조 치료제로서 투여되는 경우, 본 발명의 항체는 혈당 수준을 정상 범위로 유지시키는데 요구되는 항당뇨병 제제의 총 하루 양을 감소시킬 수 있거나, 항당뇨병 제제의 투여 횟수를 감소시킬 수 있거나, 동일한 용량 및/또는 횟수로, 예를 들어, 보다 적은 고혈당증 에피소드 또는 감소된 수준의 최대 고혈당증(최고 비정상적 글루코스 수준의 감소가 관찰됨)과 함께 개선된 혈당 조절을 성취할 수 있다.
인슐린 수용체(INSR)
INSR은 자포동물 및 곤충과 같은 원시 유기체내에서 발견되는 티로신 키나제 수용체이다. 고등 유기체에서, 이것은 글루코스 항상성을 위해 필수적이다. 마우스 녹아웃 연구는 또한 INSR이 지방조직 생성, 혈관 신생, 간 글루코스 합성의 조절 및 글루코스 유도된 췌장 인슐린 분비에 중요함을 보여주었다(문헌참조: Kitamura et al, Ann. Rev. Physiol., 65: 313-332 2003). INSR 시그날 전달은 또한 뇌에서 중요하고 상기 뇌에서 이것은 음식 섭취, 말초 지방 침적 및 생식 내분비 축의 조절 및 학습 및 기억에 관여한다(문헌참조: Wada et al, J. Pharmacol. Sci. 99: 128-143, 2005). 기능부전의 INSR 시그날 전달은 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병, 치매 및 암을 포함하는 질환에 연루되어 왔다.
밀접하게 관련된 인슐린형 성장 인자 수용체(IGFR-1)의 도메인은 INSR과 높은(47 내지 67%) 아미노산 동일성을 나타낸다. 구조에서 유사하지만 IGF-IR 및 INSR은 상이한 생리학적 기능을 나타낸다. IGF-IR은 IGF-I 생산의 그 자체가 주요 부위인 간을 제외하고는 거의 모든 정상적인 성인 조적에서 발현된다. INSR은 주로 대사적 기능에 관여하는 반면, IGF-IR은 성장 및 분화를 매개한다(문헌참조: Adams et al, Cell. Mol. Life Sci. 57: 1050-1093, 2000).
INSR은 2개의 스플라이스 변이체 이소타입 INSR-A 및 INSR-B로서 존재하고 이의 각각은 엑손 11에 의해 암호화된 12개 아미노산이 부재이거나 이를 함유한다. 보다 긴 변이체 INSR-B가 대사적 반응의 시그날 전달에 관여하는 이소타입이다. 대조적으로, 주로 유사분열성 반응에 대한 시그날을 전달하는 INSR-A가 수개의 암에서 우선적으로 발현되는 이소타입이고(문헌참조: Denley et al., Horm. Metab. Res. 35: 778-785, 2003) 높은 친화성으로 인슐린형 성장 인자 2(IGF-II)에 결합할 수 있다(문헌참조: Denley et al, Mol. Endocrinol. 18: 2502-2512, 2004).
성숙한 사람 INSR은 2개의 α서브유니트 및 2개의 β 서브유니트(쇄)를 포함하는 동종이량체이다. α 및 β 쇄는 단일 유전자에 의해 암호화되어 있고 잔기 720번 내지 723번에 위치된 퓨린 절단 부위에서 1370개 아미노산 전구체의 해독후 절단으로부터 생성된다. α-쇄, 및 β-쇄의 194개 잔기는 INSR의 세포외 부분을 포함한다. 단일 막관통 서열 및 403개 잔기의 세포질 도메인 함유 티로신 키나제가 있다. 각각의 엑토도메인 단량체의 N-말단 절반은 시스테인 풍부 영역(CR), 또한 크기가 대략 150개인 아미노산에 의해 분리되어 있는 대략 150개 아미노산의 2개의 동족 류신 풍부 반복체 도메인(L1 및 L2)로 이루어진다. 각각의 엑토도메인 단량체의 C-말단 절반은 3개의 피브로넥틴 III형 도메인(FnIII-1, FnIII-2 및 FnIII-3)으로 이루어진다. FnIII-2 도메인은 대략 120개 잔기의 삽입 도메인(ID)을 함유하고 상기 도메인내에 성숙한 수용체의 α 및 β쇄를 생성하는 퓨린 절단 부위가 있다. 세포내적으로, 각각의 단량체는 시그날 전달 분자에 대해 포스포 티로신 결합 부위를 함유하는 2개의 조절 영역(막근접 영역 및 C-꼬리)에 의해 플랭킹된 티로신 키나제 촉매 도메인을 함유한다(문헌참조: Ward et al, Acta Physiol. 192: 3-9, 2008).
인슐린 결합에 대한 현 모델은, 기본 상태에서 INSR 동종 이량체가 각각의 단량체상에 2개의 동일한 쌍의 결합 부위(부위 1 및 부위 2로 언급됨)를 함유하고 있음을 제안한다(문헌참조: De Meyts, Bioessays, 26: 1351-1362, 2004). 1개의 α-서브유니트상에 낮은 친화성 부위(부위 1)로 인슐린이 결합함에 이어서 결합된 인슐린과 제2 INSR α서브유니트의 상이한 영역(부위 2)간의 제2 결합 반응이 발생한다. 2개의 α-서브유니트간의 상기 리간드 매개된 브릿지 형성은 높은 친화성 상태를 생성하여 시그날 전달을 유도한다. 대조적으로, C 말단에서 구속되지 않은 가용성 INSR 엑토도메인은 높은 친화성의 수용체-리간드 복합체를 생성할 수 없다. 이것은 이의 2개의 부위 1에서 단지 낮은 친화성으로 2개 분자의 인슐린에 동시에 결합할 수 있다(문헌참조: Adams et al, Cell. Mol. Life Sci. 57: 1050-1093, 2000). 부위 1은 L1 도메인의 중앙 β 쉬트 및 α쇄의 마지막 16개 잔기(CT 펩타이드로서 언급됨) 기원의 요소들로 구성되는 것으로 사료된다. 부위 2가 FnIII-1 및 FnIII-2의 접합부에서 루프를 포함하고 있을 가능성이 가장 높다. 인슐린 결합이 인슐린 및 이의 수용체중에서의 구조적 변화에 관여하는 것으로 사료된다(문헌참조: Ward and Lawrence, BioEssays 31: 422-434, 2009).
인슐린 분자가 수용체상으로 도킹하고 이의 작용이 수행되는 경우, 이것은 다시 세포외 환경으로 방출될 수 있거나 세포에 의해 분해될 수 있다. 분해는 정상적으로 인슐린-INSR 복합체의 새포내이입(endocytosis)에 이어서 인슐린 분해 효소의 작용에 관여한다. 대부분의 분자는 간 세포에 의해 분해된다. 전형적인 인슐린 분자는 순환계로 이의 초기 방출 약 71분 후에 최종적으로 분해되는 겻으로 평가되었다(문헌참조: Duckworth et al, Endocr. Rev. 19(5): 608-24, 1998).
인슐린 시그날 전달
인슐린은 INSR로부터 대사 및 성장에 관여하는 이펙터 단백질로 정보를 운반하는 분자들의 시그날 전달 네트워크를 유도한다. INSR에 결합하는 인슐린은 형태적 변화를 유도하여 고유 티로신 키나제 활성의 활성화를 촉진시켜 INSR β-서브유니트의 자가인산화를 유도한다. 인슐린 수용체 기질(IRS) 단백질은 인산화된 INSR과의 상호작용을 통해 세포질 막으로 징집되고 이들은 또한 티로신 잔기상에서 인산화되어 추가의 시그날 전달 단백질의 상기 복합체로의 징접을 촉진시켜 2개의 주요 경로, (1) 성장에 대해 약간의 영향을 갖는 주로 대사를 조절하는 PI3 키나제/PDK1/PKB 경로 및 (2) 주로 세포 성장을 조절하는 Ras/ERK 유사분열 경로를 통한 시그날 전달을 유도한다.
특정 시판되는 인슐린 유사체는 배양된 암 세포에서 IGF-1형 유사분열 및 항아폽토시스 활성을 나타내는 것으로 보고되었고 이는 사람에서 이들의 장기 안전성에 대한 의문을 제기한다(문헌참조: Weinstein et al, Diabetes Metab Res Rev 25: 41-49, 2009). 따라서, 대사적 대 유사분열 INSR 시그날 전달에서의 균형을 변형시키지 않고 유사분열성 INSR 시그날 전달보다 우선적으로 대사적 시그날 전달을 촉진시키는 INSR 효능제를 수득하는 것이 바람직할 것이다.
조절제인 항체를 동정하는 방법
본 발명은 시그날 전달 복합체의 제1 및 제2 성분(예를 들어, 인슐린 수용체와 같은 수용체 및 이의 리간드 인슐린)간의 결합을 조절하는 후보 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 항체를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이론에 얽매이는 것 없이, 본 발명은 조절제(M)와 시그날 전달 복합체의 2개의 성분(제1 성분, C1 및 제2 성분, C2)간의 상호작용에 대하 역학적 방해는 다음과 같이 수학적으로 기재될 수 있음을 제공한다:
Figure 112012032772323-pct00001

상기식에서, 성분들간의 결합 평형 상수(K'C1C2)의 변화는 성분들(KC1C2)간의 평형 상수, 조절제 농도(M), 복합체 (K[C1C2]M)에 대한 조절제 친화성 및 제1 성분 (KMC1) 또는 제2 성분(KMC2)중 어느 하나에 대한 조절제 친화성의 함수이다.
시그날 전달 복합체가 수용체 리간드 복합체이고 상기 조절제가 항체인 경우, 항체와 수용체-리간드 상호작용의 역학적 방해는 다음과 같이 수학적으로 기재될 수 있다:
Figure 112012032772323-pct00002
상기식에서,
수용체 리간드의 결합 평형 상수(K'RL)의 변화는 수용체 리간드 평형 상수(KRL), 항체 농도 (A), 복합체(K[RL]A)에 대한 항체 친화성 및 수용체 (KAR) 또는 리간드 (KAL) 중 어느 하나에 대한 항체 친화성의 함수이다.
조절제는 표적의 시그날 전달 파트너에 대한 표적의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터가 약해지거나 강력해지도록 표적, 또는 이의 시그날 전달 파트너 또는 표적 및 시그날 전달 파트너의 복합체에 결합한다. 예를 들어, 표적이 수용체 또는 리간드인 경우, 수용체에 대한 리간드의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 조절제의 존재하에 약해지거나 강력해진다. 완전한 차단 활성을 갖는 조절제는, K[C1C2]M이 충분히 높은 경우, K'C1C2는 무한대에 도달하기 때문에 상기 분석에서 경계 조건을 나타낸다. 상기 모델의 한가지 결과는 시그날 전달 조절의 정도는 조절제의 농도([M])가 조절제/항원 상호작용에 대한 평형 해리 상수(KD)보다 충분히 높아 결합 리간드에 대해 포화인 경우 조절제의 농도와는 무관하다는 것이다. 따라서, 상호작용의 조절은 복합체 대 성분에 대한 친화성의 비율과 관련된다(여기서, 조절제 및 이의 항원에 대해 [M] > KD이다).
본 발명은 표적 및/또는 이의 시그날 전달 파트너와의 조절제의 상호작용의 생물리적 성질이 표적 시그날 전달 경로에 대한 조절제의 기능적 효과를 예측하기 위해 사용될 수 있음을 제공한다. 따라서, 시그날 전달 경로를 변형시키는 조절제는 복합체화된 및 비복합체화된 형태로 표적(및/또는 이의 시그날 전달 파트너)에 대한 이들의 상대적 친화성을 기초로 동정될 수 있다. 본 발명은 시그날 전달 복합체와 조절제(M)의 2개의 성분(제1 성분, C1 및 제2 성분 C2)간의 상호작용의 역학적 방해가 하기의 방식으로 예측될 수 있음을 고려한다:
K[C1C2]M 또는 K[MC2]C1 또는 K[MC1]C2 < KMC2 또는 KMC1은 양성 조절을 유도한다
K[C1C2]M 또는 K[MC2]C1 또는 K[MC1]C2 = KMC2 또는 KMC1은 어떠한 조절도 하지 않는다
K[C1C2]M 또는 K[MC2]C1 또는 K[MC1]C2 > KMC2 또는 KMC1은 음성 조절을 유도한다
시그날 전달 복합체가 수용체 (R)- 리간드 (L) 복합체이고, 역학적 조절제가 항체(A) 인 경우, 역학적 방해는 하기의 방식으로 예측될 수 있다:
K[RL]A 또는 K[AL]R 또는 K[AR]L < KAL 또는 KAR은 양성 역학적 조절을 유도한다
K[ RL ]A 또는 K[ AL ]R 또는 K[ AR ]L = KAL 또는 KAR은 어떠한 역학적 조절을 하지 않는다
K[ RL ]A 또는 K[ AL ]R 또는 K[ AR ]L > KAL 또는 KAR은 음성 역학적 조절을 유도한다.
몇몇 양태에서, 항체(A)와 같은 조절제는 제1 또는 제2 성분의 소정의 준포화 농도(예를 들어, 리간드 (L) 농도) 에서 수용체 (R)-리간드 (L) 상호작용과 같은 결합 상호작용을 변화시키는 이의능력에 의해 결정될 수 있다. 조절제 항체 또는 폴리펩타이드는 도시된 바와 같이 수용체 리간드 상호작용의 친화성 및 상응하는 용량 반응을 500pM 상호작용으로부터 10pM (양성 조절제) 또는 10nM (음성 조절제)로 효과적으로 전환시킬수 있다. 몇몇 양태에서, 조절제는 소정의 리간드 농도에서 보다 높은 수준의 R-L 결합을 생성시켜 분석 곡선을 좌측(양성 조절)으로 전환시킨다. 다른 양태에서, 상기 조절제는 소정의 리간드 농도에서 보다 낮은 수준의 R-L 결합을 생성시켜 분석 곡선을 우측(음성 조절)으로 전환시킨다. 몇몇 양태에서, 상기 전환은 균일하다. 다른 양태에서, 상기 전환은 불균일하고 이는 복잡한 수용체 내재화등에서 다른 인자, 예를 들어, 악세서리 단백질이 관여함을 반영한다.
조절제와 표적, 이의 시그날 전달 파트너 및/또는 표적 및 이의 시그날 전달 파트너를 포함하는 복합체간의 상호작용의 결합 성질은 일반적으로 표적 시그날 전달 경로에 대한 역학적 조절제의 기능적 효과를 예측한다. 연구된 표적에 따라, 특정 다른 인자가 고려될 필요가 있을 수 있다. 이들은 다음을 포함한다: (1) 역학적 조절제의 농도, 표적의 농도 및/또는 이의 시그날 전달 파트너의 농도(예를 들어, 예측은 조절제 농도([M])가 조절제와 이의 항원간의 결합 KD를 상당히 초과하는 경우 최적화된다, (2) 사용되는 조절제의 구조적 형태, 예를 들어, 1가 대 2가, (3) 상호/내부 표적 가교결합(이것은 표적의 형태를 제한하고/하거나 표적 활성화를 유발할 수 있다), (4) 어셈블리 또는 도킹을 변화시키거나 스테릭 또는 알로스테릭 기작에 의한 시그날 전달 복합체의 추가의 성분을 변화시키는 조절제의 능력, (5) "병목"을 도입하는 질환으로 인해 시그날 경로에서의 변화와 같은 시그날 전달 경로 특이적 성질, (6) 시그날 전달 경로의 음성/양성 피드백 조절, (7) 시그날 전달 복합체의 성분의 제거/내재화율의 변화, (8) 리간드 결합 및 활성화를 커플링시키지 않거나 차등적으로 변화시키는 표적에서의 변화(예를 들어, 조절제는 리간드 결합을 증진시키지만 탈감작화된 상태로 이의 수용체를 결박하거나 조절제는 리간드 결합을 약화시키지만 이의 수용체내 형태적 변화를 유도하여 활성화시킨다.
몇몇 측면에서 본 발명은 시험 폴리펩타이드 제제의 존재 또는 부재하에 시그날 전달 복합체의 제2 성분에 대한, 시그날 전달 복합체의 제1 성분의 차등적 결합을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이들 측면에서, 차등적 결합은 바람직하게 제1 또는 제2 성분이 준포화 농도로 존재하는 경우 관찰된다. 몇몇 바람직한 양태에서, 제1 또는 제2 성분의 농도는 준포화 조건을 제공하기 위해 감소될 수 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 복합체화되고 비복합체화된 형태로서 시험 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 항체의 표적 및/또는 이의 시그날 전달 파트너의 차등적 결합을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이들 측면에서, 차등적 결합은 바람직하게 시험 폴리펩타이드 결합제가 준포화 농도인 경우에 관찰된다. 몇몇 바람직한양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제의 농도는 준포화 조건을 제공하기 위해 감소될 수 있다.
몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 제제의 부재하의 시험은 바람직하게는 시험 폴리펩타이드 제제와 유사한 구조적 부류에 속하는 화합물이지만 시험되는 시그날 전달 복합체에 어떠한 효과를 갖지 않는 상이한 항원에 결합하는 대조군 화합물을 사용하여 수행한다. 예를 들어, 시험 항체에 대한 대조군은 비관련 항원, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 결합하는 이소타입 일치된 항체일 수 있다.
양성 조절제에 대해, C1의 소정의 준포화 농도에서, 보다 높은 C1 친화성은 양성 조절제의 존재하에 C2에 결합하는 C1에 대해 보다 시그날로 반영된다. 조절제의 우선적인 결합은 단독의 C1 또는 단독의 C2에 대한 시그날과 비교하여 C1 및 C2를 포함하는 복합체에 대해 보다 높은 시그날로 반영된다. 몇몇 측면에서, 조절제는 C1 및 C2의 복합체에 결합할 수 있지만, 단독의 C1 또는 단독의 C2에는 어떠한 측정가능한 결합을 하지 않는다.
음성 조절제에 대해, C1의 소정의 준포화 농도에서, 보다 낮은 C1 친화성은 조절제의 존재하에 C2에 결합하는 C1에 대한 보다 낮은 시그날로 반영된다. 상기 조절제의 우선적인 결합은 C1 및 C2의 복합체에 대한 조절제의 결합을 위한 시그날과 비교하여 단독의 C1 또는 단독의 C2로의 조절제의 결합에 대한 보다 높은 시그날로 반영된다.
본 발명은 시그날 전달 복합체의 제1 및 제2 성분간의 결합을 조절하는 후보 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 항체를 동정하는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 제1 및 제2 성분들은 폴리펩타이드이다. 예시적인 특정 양태에서, 제1 및 제2 성분들은 내인성이다.
하나의 측면에서, 항체를 조절하는 후보물을 동정하기 위한 방법은 (a) 시험 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 항체의 존재하에 제2 성분에 대한 제1 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정하는 단계, (b) 상기 시험 폴리펩타이드 결합제의 부재하에 제2 성분에 대한 제1 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정하는 단계, 및 (c) 상기 시험 폴리펩타이드 결합제가 단계 (a) 및 (b)에서 측정된 결합 친화성 또는 결합율 파라미터에서 1.5배 이상의 차이를 나타내는 경우 상기 시험 폴리펩타이드 결합제를 후보 조절 약물로서 동정하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태에서, 결합 친화성 또는 결합율 파라미터의 차이는 약 1.5배 (즉, 50%) 내지 약 1000배, 또는 약 1.5배 내지 약 100배, 또는 약 2배 내지 25배, 또는 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배 범위이다.
몇몇 양태에서, 상기 시험 폴리펩타이드 결합제는 시험 폴리펩타이드 제제가 상기 제1 성분과 제2 성분간의 결합 친화성 또는 결합율 파리미터를 강화시키는 경우 후보 양성 조절제로서 동정된다. 다른 양태에서, 시험 폴리펩타이드 제제는 시험 폴리펩타이드 제제가 상기 제1 성분과 상기 제2 성분간의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 약화시키는 경우 후보 음성 조절제로서 동정된다.
특정 결합 친화성 값 또는 결합율 파라미터 값에서의 변화(증가 또는 감소)가 "강력해진"(또는 보다 강한) 또는 "약화된" (보다 약한) 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 나타내는지의 여부는 파라미터 값 및 이의 단위에 의존하고 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 파라미터 KA의 경우에, 보다 높은 값은 "강력해진" 결합 친화성을 의미하고 예를 들어, 약 106M-1의 KA는 약 105M-1의 KA보다 강하다. 또 다른 예로서, 파라미터 KD의 경우에, 보다 낮은 값은 "강력해진" 결합 친화성을 의미하고 예를 들어, 약 10-6M의 KD는 약 10-5M의 KD보다 강하다. 역으로, KA의 경우에, 보다 낮은 값은 "약해진" 결합 친화성을 의미하고, 예를 들어, 약 105 M-1의KA는 약 106M-1의 KA와 비교하여 약해진 결합 친화성이다. 또 다른 예로서, KD의 경우에, 보다 높은 값은 "약해진" 결합 친화성을 의미하고, 예를 들어, 약 10-5M의 KD는 약 10-6M의 KD와 비교하여 약해진 결합 친화성이다.
본원에 사용된 바와 같이, "강력해진" 결합율 파라미터는 증가된 잔류 시간, 보다 강한 결합 또는 보다 약한 해리를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약해진" 결합율 파라미터는 감소된 잔류 시간, 보다 약한 결합 또는 보다 강한 해리를 의미한다.
결합 친화성은 또한 온-레이트 및 오프-레이트 결합율 파라미터의 비를 통해 결정할 수 있다. 일반적으로, 온-레이트의 경우에, 보다 높은 값은 보다 신속하거나 보다 강한 결합 또는 증가된 체류 시간을 의미하고 전형적으로 보다 강한 결합 친화성을 유도한다. 역으로, 온-레이트에 대해 보다 낮은 값은 보다 느리거나 약한 결합 또는 감소된 체류 시간을 의미하고 전형적으로 보다 약한 결합 친화성을 유도한다. 일반적으로, 오프-레이트의 경우에, 보다 높은 값은 보다 신속한 해리 또는 감소된 잔류 시간을 의미하고 전형적으로 약화된 결합 친화성을 유도한다. 역으로, 오프-레이트에 대해 보다 낮은 값은 보다 느린 해리 또는 증가된 잔류 시간을 의미하고 전형적으로 보다 강한 결합 친화성을 유도한다. 이것은 온-레이트에 대한 오프-레이트의 비 또는 오프-레이트에 대한 온-레이트의 비는 하기 방정식에 나타낸 바와 같은 결합 친화성을 지적하기때문이다.
Figure 112012032772323-pct00003

여기서,
Figure 112012032772323-pct00004

그러나 결합 친화성이 검출가능하지 않거나 유의적으로 변화되지 않는다고 해도 잔류 시간의 변화, 즉 증가된 온-레이트 또는 감소된 오프-레이트을 통한 증가된 잔류 시간 또는 감소된 온-레이트 또는 증가된 오프-레이트를 통한 감소된 잔류 시간은 여전히 시그날 전달 경로의 차등적 활성화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 수용체가 2개의 상이한 경로를 활성화시킬 수 있는 몇몇 경우에, 상기 경로는 완전한 효과를 위해 요구되는 수용체 활성화 정도에서 차이가 있다. 하나의 시그날 전달 경로는 낮은 수준의 수용체 활성화 또는 잔류 시간에서 완전히 활성화될 수 있고 제2 경로의 완전한 활성화는 보다 높은 수준의 수용체 활성화 또는 잔류 시간을 요구한다.
기능적 효과에 대한 결합 특성의 예측되는 상호관련성은 하기 표에 나타낸다.
표적 결합 특징 KD 비율 기능적 효과 (pAKT 분석 전환)
R L R-L
- - + K[RL]A < KR, KL 양성 조절
- + + K[AL]R < KL 양성 조절
+ - + K[AR]L < KR 양성 조절
- + + K[AL]R > KL 음성 조절
+ - + K[AR]L > KR 음성 조절
항-INSR 항체의 기능적 효과가 이들의 결합 특성과 서로 관련이 있음을 보여주는 데이타의 예시는 하기의 표에 나타낸다.
Ab 표적 결합 특징 KD 비율 기능적 효과 (pAKT 분석, 이소타입 대조군 Ab와 비교되는 인슐린 EC 50 의 배수 감소) #
R L R-L
예측된 - - + K[RL]A < KR, KL 양성 조절
Ab078 범위를 벗어남 * 3.4e-10 3.3
Ab085 비결합 2e-10 8.9
예측된 + - + K[AR]L < KR 양성 조절
Ab001 1.2e-8 1.16e-10 103.4 9.7
Ab079 9.6e-9 4.96e-10 19.4 6.7
Ab080 1.2e-8 6.8e-10 17.6 8.4
Ab083 7.6e-9 3.76e-10 20.2 8.5
예측된 + - + K[AR]L = KR 비-조절제
Ab037 1.08e-10 8e-11 1.4 변화 없음
Ab053 1.48e-10 9.6e-11 1.5 변화 없음
Ab062 1.24e-10 1.08e-10 1.1 변화 없음
따라서, 조절제와 표적, 이의 시그날 전달 파트너 및/또는 표적 및 이의 시그날 전달 파트너를 포함하는 복합체간의 상호작용의 결합 성질은 일반적으로 표적 시그날 전달 경로에 대한 조절제 폴리펩타이드의 기능적 효과를 예측한다.
또 다른 측면에서, 후보 조절 항체를 동정하는 방법은 (a) (i) 제2 성분의 존재하에 제1 성분에 대한 시험 폴리펩타디드 결합제, 예를 들어 항체의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정하는 단계 또는 (ii) 제1 성분의 존재하에 제2 성분에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정하는 단계; 및 (b) (i) 상기 제2 성분의 부재하에 상기 제1 성분에 대한 상기 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정하는 단계, 또는 (ii) 상기 제1 성분의 부재하에 상기 제2 성분에 대한 상기 시험 폴리페타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)에서 측정된 결합 친화성 또는 결합율 파라미터에서 상기 시험 폴리펩타이드 결합제가 1.5배(즉, 50%) 이상의 차이를 나타내는 경우 상기 시험 폴리펩타이드 결합제를 후보 역학적 조절 약물로서 동정하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 시험 폴리펩타이드 결합제는 단계(a)에서 측정된 결합 친화성 또는 결합율 파라미터가 단계 (b)에서 측정된 결합 친화성 또는 결합율 파라미터 보다 1.5배(즉 50%) 이상 강한 경우 후보 양성 조절제로서 동정된다. 특이적 양태에서, 단계 (b)에서 측정된 것과 비교하여 단계(a)에서 측정된 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 단계 (a) 대 단계(b)에 대해 약 1.5배(즉 50%) 내지 약 1000배 강하거나 약 1.5배 내지 약 100배, 또는 약 2배 내지 25배, 또는 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배 강하고, 예를 들어, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 11배 이상, 12배 이상, 13배 이상, 14배 이상, 15배 이상, 16배 이상, 17배 이상, 18배 이상, 19배 이상 또는 20배 이상, 또는 500배 이하, 또는 200배 이하, 또는 150배 이하, 또는 100배 이하, 또는 90배 이하, 또는 80배 이하, 또는 70배 이하, 또는 60배 이하, 또는 50배 이하, 또는 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 또는 10배 이하 강하다.
다른 양태에서, 상기 시험 폴리펩타이드 결합제는 단계(b)에서 측정되는 결합 친화성 또는 결합율 파라미터가 단계(a)에서 측정되는 결합 친화성 또는 결합율 파라미터 보다 1.51배(즉, 50%) 이상 강한 경우 후보 음성 조절제로서 동정된다. 특이적 양태에서, 단계(a)에서 측정된 것과 비교하여 단계(b)에서 측정된 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 단계(b) 대 단계(a)에 대해 약 1.5배 (즉, 50%) 내지 약 1000배 강하거나, 약 1.5배 내지 약 100배, 또는 약 2배 내지 25배, 또는 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배 강하고, 예를 들어, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 11배 이상, 12배 이상, 13배 이상, 14배 이상, 15배 이상, 16배 이상, 17배 이상, 18배 이상, 19배 이상 또는 20배 이상, 또는 500배 이하, 또는 200배 이하, 또는 150배 이하, 또는 100배 이하, 또는 90배 이하, 또는 80배 이하, 또는 70배 이하, 또는 60배 이하, 또는 50배 이하, 또는 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 또는 10배 이하 강하다.
몇몇 양태에서, 단독의 제1 성분에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정한다. 몇몇 양태에서, 단독의 제2 성분에 대한 시험 폴리펩타이드 결합 제제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 측정한다.
몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제는, (A) 제1 및 제2 성분을 포함하는 복합체에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 K[C1C2]M, (B) 폴리펩타이드 결합제 및 제2 성분을 포함하는 복합체에 대한 제1 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 K[MC2]C1, 또는 (C) 폴리펩타이드 결합제 및 제1 성분을 포함하는 복합체에 대한 제2 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 K[MC1]C2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터가 (1) 단독의 제2 성분에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 KMC2 또는 (2) 단독의 제1 성분에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 KMC1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터 보다 약 1.5배 이상 강한 경우 후보 양성 조절제로서 동정된다. 몇몇 양태에서, (A), (B) 또는 (C) 중 어느 하나 이상의 특이적 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 (1) 또는 (2) 중 어느 하나 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 약 1.5배(즉, 50%) 내지 약 1000배 강하거나; 대안으로, 약 1.5배 내지 약 100배 강하거나, 약 2배 내지 25배, 또는 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배, 예를 들어, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 11배 이상, 12배 이상, 13배 이상, 14배 이상, 15배 이상, 16배 이상, 17배 이상, 18배 이상, 19배 이상 또는 20배 이상, 또는 500배 이하, 또는 200배 이하, 또는 150배 이하, 또는 100배 이하, 또는 90배 이하, 또는 80배 이하, 또는 70배 이하, 또는 60배 이하, 또는 50배 이하, 또는 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 또는 10배 이하 강하다. 예를 들어, 몇몇 양태에서, (A), (B) 또는 (C)중 어느 하나 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 (1) 및 (2) 둘다의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 강하다. 몇몇 양태에서, (1)의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 (2)의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 강하다. 다른 양태에서, (2)의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 (1)의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 강하다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 예를 들어, 오프-레이트 및 온-레이트, 또는 KA 및 KD 또는 이의 임의의 조합을 측정하고 비교한다.
측정되는 결합 친화성이 평형 해리 상수 KD인 특이적 양태에서, K[C1C2]M, K[MC2]C1, 또는 K[MC1]C2 중 어느 하나는 KMC2 또는 KMC1 중 어느 하나 보다 낮고, 예를 들어, 약 1.5 내지 1000배 낮다 . 유사하게, 측정되는 결합 친화성이 오프-레이트인 경우, (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 오프-레이트중 어느 하나는 (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1 간의 오프-레이트 중 어느 하나 보다 낮고, 예를 들어, 약 1.5 내지 1000배 낮다. 하나의 예시적 양태에서, K[C1C2]M은 약 KMC2보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC2]C1은 KMC2보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC1]C2은 KMC2보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[C1C2]M은 KMC1보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC2]C1은 KMC1보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC1]C2은 KMC1보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 유사한 예는 (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1간의 오프-레이트 각각과 비교하여 (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 오프-레이트 각각에 대해 고려될 수 있다.
역으로, 측정되는 결합 친화성이 평형 해리 상수 KA인 경우, K[C1C2]M, K[MC2]C1, 또는 K[MC1]C2 중 어느 하나는 KMC2 또는 KMC1 중 어느 하나 보다 예를 들어, 약 1.5 내지 1000배 높다 . 유사하게, 측정되는 결합 친화성이 온-레이트인 경우, (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 오프-레이트중 어느 하나는 (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1 간의 오프-레이트 중 어느 하나 보다 높고, 예를 들어, 약 1.5 내지 1000배 높다. 하나의 예시적 양태에서, K[C1C2]M은 약 KMC2보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC2]C1은 KMC2보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC1]C2은 KMC2보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[C1C2]M은 KMC1보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC2]C1은 KMC1보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, K[MC1]C2는 KMC1보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 유사한 예는 (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1간의 온-레이트 각각과 비교하여 (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 온-레이트 각각에 대해 고려될 수 있다.
몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제는, (1) 단독의 제2 성분에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 KMC2 또는 (2) 단독의 제1 성분에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 KMC1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터가 (A) 제1 및 제2 성분을 포함하는 복합체에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 K[C1C2]M, (B) 폴리펩타이드 결합제 및 제2 성분을 포함하는 복합체에 대한 제1 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 K[MC2]C1, 또는 (C) 폴리펩타이드 결합제 및 제1 성분을 포함하는 복합체에 대한 제2 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 임의로 K[MC1]C2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 약 1.5배 이상 강한 경우 후보 양성 조절제로서 동정된다. 몇몇 양태에서, (1) 또는 (2) 중 어느 하나 이상의 (A), (B) 또는 (C) 중 어느 하나 이상의 특이적 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 약 1.5배(즉, 50%) 내지 약 1000배 강하거나; 대안으로, 약 1.5배 내지 약 100배 강하거나, 약 2배 내지 25배, 또는 약 2배 내지 약 50배, 또는 약 1.5배 내지 약 25배, 또는 약 1.5배 내지 약 50배, 예를 들어, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 11배 이상, 12배 이상, 13배 이상, 14배 이상, 15배 이상, 16배 이상, 17배 이상, 18배 이상, 19배 이상 또는 20배 이상, 또는 500배 이하, 또는 200배 이하, 또는 150배 이하, 또는 100배 이하, 또는 90배 이하, 또는 80배 이하, 또는 70배 이하, 또는 60배 이하, 또는 50배 이하, 또는 40배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 또는 10배 이하 강하다. 예를 들어, 몇몇 양태에서, (1) 또는 (2) 중 어느 하나의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 (A), (B) 및 (C) 전부의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 강하다. 몇몇 양태에서, (1)의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터는 (2)의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 강하다. 다른 양태에서, (2)의 결합 친화성 또는 결합 파라미터는 (1)의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터보다 강하다. 몇몇 양태에서, 2개 이상의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터, 예를 들어, 오프-레이트 및 온-레이트, 또는 KA 및 KD 또는 이의 임의의 조합을 측정하고 비교한다.
측정되는 결합 친화성이 평형 해리 상수 KD인 특이적 양태에서, KMC2 또는 KMC1 중 어느 하나는 K[C1C2]M, K[MC2]C1, 또는 K[MC1]C2 중 어느 하나보다 낮고, 약 1.5 내지 1000배 낮다. 유사하게, 측정되는 결합 친화성이 오프-레이트인 경우, (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1 간의 오프-레이트 중 어느 하나는 (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 오프-레이트중 어느 하나보다 낮고, 예를 들어, 약 1.5 내지 1000배 낮다. 하나의 예시적 양태에서, KMC2는 K[C1C2]M보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC2는 K[MC2]C1보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC2은 K[MC1]C2보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC1는 K[C1C2]M보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC1는 K[MC2]C1보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC1는 K[MC1]C2보다 약 1.5배 내지 1000배 낮다. 유사한 예는 (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 오프-레이트 각각과 비교하여 (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1간의 오프-레이트 각각에 대해 고려될 수 있다.
역으로, 결합 친화성이 평형 해리 상수 KA인 경우, KMC2 또는 KMC1 중 어느 하나는 K[C1C2]M, K[MC2]C1, 또는 K[MC1]C2 중 어느 하나보다 높고, 약 1.5 내지 1000배 높다. 유사하게, 측정되는 결합 친화성이 온-레이트인 경우, (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1 간의 오프-레이트 중 어느 하나는 (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 온-레이트중 어느 하나보다 높고, 예를 들어, 약 1.5 내지 1000배 높다. 하나의 예시적 양태에서, KMC2는 K[C1C2]M보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC2는 K[MC2]C1보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC2는 K[MC1]C2보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC1는 K[C1C2]M보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC1는 K[MC2]C1보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 또 다른 예시적인 양태에서, KMC1는 K[MC1]C2보다 약 1.5배 내지 1000배 높다. 유사한 예는 (A) [C1C2] 및 M, 또는 (B) [MC2] 및 C1, 또는 (C) [MC1] 및 C2간의 온-레이트 각각과 비교하여 (1) M 및 C2 또는 (2) M 및 C1간의 온-레이트 각각에 대해 고려될 수 있다.
특정 양태에서, 조절제는 항체이고 및 C1 및 C2는 인슐린 및 인슐린 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
이들 양태중 어느 하나에서, 상기 시험 폴리펩타이드 결합제 및 제2 성분은 다수의 상이한 농도의 상기 제1 성분과 접촉시킬 수 있다. 이들 양태중 어느 하나에서, 시험 폴리펩타이드 결합제를 상기 제1 성분은 다수의 상이한 농도의 상기 제2 성분과 접촉시킬 수 있다. 이들 양태중 어느 하나에서, 다수의 상이한 농도의 시험 폴리펩타이드 결합제는 상기 제1 성분 및 상기 제2 성분과 접촉시킬 수 있다.
제1 성분과 제2 성분간의 결합 상호작용에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 효과가 결정되는 경우, 몇몇 특이적 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제에 대한 항원이 제1 성분, 예를 들어 리간드인 경우, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제1 성분의 농도에 비하여 포화 농도에 있다. 대안으로, 시험 폴리펩타이드 결합제에 대한 항원이 제2 성분, 예를 들어 수용체인 경우, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제2 성분의 농도에 비하여 포화 농도에 있다. 몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제의 농도가 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 복합체에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 KD 이상이다. 추가의 양태에서, 제2 성분의 농도는 제1 성분, 예를 들어, 리간드에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 KD 미만이다. 추가의 양태에서, 제1 성분, 예를 들어, 리간드의 농도는 제2 성분, 예를 들어, 수용체로의 제1 성분의 결합에 대해 준포화 농도에 있다. 몇몇 양태에서, 제1 성분, 예를 들어, 리간드의 농도는 제1 성분과 제2 성분의 상호 작용에 대해 약 EC20 내지 EC80 범위내에 있다. 몇몇 양태에서, 하나 이상의 농도의 시험 폴리펩타이드 결합제는 하나 이상의 농도의 제2 성분, 예를 들어, 수용체의 존재하에 다수의 상이한 농도의 제1 성분, 예를 들어, 리간드와 접촉시킨다, 몇몇 양태에서, 하나 이상의 농도의 시험 폴리펩타이드 결합제는 하나 이상의 농도의 제1 성분, 예를 들어, 리간드의 존재하에 다수의 상이한 농도의 제2 성분, 예를 들어, 수용체와 접촉시킨다.
복합체화된 표적 대 비복합체화된 표적 및/또는 시그날 전달 파트너로의 시험 폴리펩타이드 결합제의 차등 결합이 양성 조절제를 동정하기 위해 측정되는 경우, 몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 복합체에 대해 포화 농도로 있다. 몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제의 농도는 제1 성분, 예를 들어 리간드 및 제2 성분, 예를 들어 수용체를 포함하는 복합체에 대한 시험 폴리펩타이드 결합제의 KD 이상이다. 추가의 양태에서, 제2 성분, 예를 들어, 수용체의 농도는 제1 성분, 예를 들어, 리간드에 대한 제2 성분, 예를 들어 수용체의 KD를 초과한다. 추가의 양태에서, 제1 성분, 예를 들어, 리간드의 농도는 제2 성분, 예를 들어, 수용체에 대해 포화 농도이다. 추가의 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 복합체에 대해 준포화 농도로 있다. 몇몇 양태에서, 폴리펩타이드 결합제의 농도는 제1 성분과 제2 성분의 상호작용에 대해 약 EC20 내지 EC80 범위내에 있다. 몇몇 양태에서, 제2 성분, 예를 들어, 수용체의 농도는 제1 성분, 예를 들어, 리간드에 대한 제2 성분, 예를 들어, 수용체의 KD를 초과한다. 몇몇 양태에서, 제1 성분, 예를 들어, 리간드의 농도는 제2 성분, 예를 들어, 수용체 대해 포화 농도이다.
복합체화된 표적 대 비복합체화된 표적 및/또는 시그날 전달 파트너로의 시험 폴리펩타이드 결합제의 차등 결합이 음성 조절제를 동정하기 위해 측정되는 경우, 몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제가 결합하는 항원이 제1 성분, 예를 들어, 리간드인 경우, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제1 성분에 대해 준포화 농도로 있다. 시험 폴리펩타이드 결합제가 결합하는 항원이 제2 성분, 예를 들어, 수용체인 경우, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제2 성분에 대해 준포화 농도로 있다. 추가의 양태에서, 폴리펩타이드 결합제의 농도는 제1 성분과 제2 성분의 상호작용에 대해 약 EC20 내지 EC80 범위내에 있다. 추가의 양태에서, 제2 성분, 예를 들어, 수용체의 농도는 제1 성분, 예를 들어, 리간드에 대한 제2 성분, 예를 들어, 수용체의 KD를 초과한다. 추가의 양태에서, 제1 성분, 예를 들어, 리간드의 농도는 제2 성분, 예를 들어, 수용체에 대해 포화 농도이다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 (a) 제1 성분, (b) 제2 성분, 또는 (c) 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 복합체중 어느 하나에 대한 결합 친화성에 대해 다수의 시험 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어, 항체를 분석함을 추가로 포함한다. 몇몇 특정 양태에서, 폴리펩타이드 결합제는 예를 들어, 평형 해리 상수 KD가 약 10-5M 이하 또는 약 10-6M 이하 또는 약 10-7 M 이하 또는 약 10-8M 이하임을 특징으로 하는 결합 친화성을 갖고, 이때 보다 낮은 KD는 보다 강한 결합 친화성을 의미한다. 몇몇 양태에서, 스크리닝된 다수의 시험 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드 결합제로 하나 이상의 상이한 돌연변이를 도입함에 의해 제조된 모 폴리펩타이드 결합제의 변이체이다.
추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드 결합제는 유인 수용체, 제거 수용체 또는 또 다른 시그날 경로 성분과 같은 상이한 결합 파트너와 대비되는 제1 또는 제2 성분에 대한 효과의 선별을 위해 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은 상이한 결합 파트너에 대한 제1 또는 제2 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 유의적으로 변화시키지 않는 폴리펩타이드 결합제를 동정하는 것을 포함할 수 있고, 상기 결합 파트너는 제1 또는 제2 성분이 아니다. 몇몇 양태에서, 폴리펩타이드 결합제의 존재는 상이한 결합 파트너에 대한 제1 또는 제2 성분의 결합 친화성 또는 결합율 파라미터를 5배 이하 또는 10배 이하 또는 20배 이하 또는 30배 이하 또는 40배 이하 또는 50배 이하로 변화시킨다.
이전의 방법 중 어느 하나는 시험 폴리펩타이드 결합제의 존재 및 부재하에 시그날 전달 복합체에 의해 매개되는 시그날 전달 수준을 측정하고 시험 폴리펩타이드 결합제가 추가로, 효능제, 부분 효능제, 길항제 또는 부분 길항제인지를 결정함을 포함할 수 있다. 길항작용 또는 효능작용은 당업계에 공지된 생체내 분석 중 어느 하나로 측정될 수 있고 인산화 분석, 이온 유입 분석, 분자 수소 분석 또는 유전자 발현 분석에서의 시그날 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제1 성분, 예를 들어, 리간드와 제2 성분, 예를 들어 수용체의 상호작용의 용량 반응 곡선을 전환(양성으로 또는 음성으로)시킨다. 상기 전환은 적어도 약 1.5배, 예를 들어, 약 1.5배 내지 약 100배로 증가되거나 감소된 EC50으로서 나타낼 수 있다. 몇몇 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제는 시그날 전달 복합체의 제1 및 제2 성분의 상호작용에 의해 제조되는 시그날의 최대 효능제 반응을 유의적으로 변화시키지 않는다. 다른 양태에서, 시험 폴리펩타이드 결합제 자체는 길항제(예를 들어, 상기 시그날 전달 복합체에 의해 생성되는 시그날 전달의 최대 효능제 반응을 감소시킨다) 또는 효능제(상기 시그날 전달 복합체에 의해 생성되는 시그날 전달의 최대 효능제 반응을 증가시킨다)로서 작용한다.
시험 폴리펩타이드 결합제가 길항제 또는 부분 길항제로서 작용하는 경우, 상기 최대 효능제 반응은 예를 들어, 약 1.5배 내지 약 100배, 또는 약 2배 내지 약 25배 또는 약 1.5배 내지 약 50배로 감소될 수 있거나, 약 10%, 25%, 50% (1.5배), 75%, 2배, 3배, 또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10배로 감소될 수 있다. 대안으로, 시험 폴리펩타이드 결합제가 효능제 또는 부분 효능제로서 작용하는 경우, 최대 효능제 반응은 예를 들어, 적어도 약 10%, 25%, 50% (1.5배), 75%, 2배, 3배, 또는 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가될 수 있다. 더욱이, 시험 폴리펩타이드 결합제가 길항제 또는 부분 길항제로서 작용하는 경우, IC50은 1 x lO-5 이하일 수 있다. 상기 시험 폴리펩타이드 결합제는 추가의 목적하는 특성을 나타낼 수 있고, 예를 들어, 상기 시험 폴리펩타이드 결합제는 상기 제1 성분 또는 상기 제2 성분, 또는 제1 성분 및 제2 성분을 포함하는 상기 시그날 전달 복합체의 제거를 유의적으로 감소시키지 않는다.
조절제, 예를 들어, 역학적 조절제를 동정하는 방법은 공계류중인 2000년 9월 25일자로 출원된 미국 특허원 제61/246,079호, 2010년 2월 19일자의 미국 특허원 61/306,324호 및 2010년 2월 24일자로 출원된 국제 특허 출원(도켓 번호 27129/41726)에서 추가로 상세히 기재되어 있다.
상기 시험 폴리펩타이드 결합제는 추가의 목적하는 특성을 나타낼 수 있고, 예를 들어, 시험 폴리펩타이드 결합제는 제1 성분, 또는 제2 성분 또는 제1 및 제2 성분을 포함하는 시그날 전달 복합체의 제거를 유의적으로 감소시키지 않는다
관련 측면에서, 본 발명은 인슐린/인슐린 수용체 시그날 전달 복합체 및 항체의 조절제 또는 상기되거나 본원의 기타 문단에 언급된 방법 중 어느 하나에 의해 동정된 기타 조절제를 동정하는 방법을 제공한다.
항체의 유형 및 공급원
본 발명은 인슐린, 인슐린 수용체 또는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합하는 표적 특이적 항체를 포함한다. 예시적인 양태에서, 본 발명의 표적 특이적 항체는 사람 카파 (κ) 또는 사람 람다 (λ) 경쇄 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열 또는 이로부터 유래된 사람 중쇄 또는 서열, 또는 단일쇄, 이량체, 삼량체 또는 기타 형태로 중쇄 및 경쇄 둘다를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 표적 특이적 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 분자와는 상이하다. 다른 양태에서, 동일한 아미노산 분자는 표적 특이적 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되고 완전히 어셈블리된 항체, 사량체성 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이특이적 항체), 사람 및 사람화된 항체, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예를 들어, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일쇄 항체, 이중항체), 및 이들이 목적하는 생물학적 활성을 갖는 한 이전의 것들을 포함하는 재조합 펩타이드를 포함한다. "면역글로불린" 또는 "사량체성 항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 사량체성 당단백질이고 각각은 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편 또는 항원 결합 부분은 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체(dAb), 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(scFv), 단일쇄 항체 단편, 키메라 항체, 이중항체, 삼중항체, 사중항체, 소형항체, 선형 항체; 킬레이팅 재조합 항체, 삼중항체 또는 이중항체, 내부체, 나노체, 소형 모듈 면역약제(SMIP), 항원 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화된 항체, VHH 함유 항체 또는 이의 변이체 또는 유도체 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 한 폴리펩타이드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다.
천연 면역글로불린에서, 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성되고 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인지에 관여하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시 말단 부분은 주로 이펙터 기능에 관여하는 불변 영역을 한정한다. 사람 경쇄는 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤 (μ), 델타 (Δ), 감마 (γ), 알파 (α), 및 엡실론 (ε)으로 분류되고 항체의 이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 정의된다. 경쇄 및 중쇄내에서 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (모든 목적을 위해 이의 전문이 인용된다)]을 참조한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성하여 온전한 면역글로불린은 2개의 결합 부위를 갖는다.
각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)에 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL) 및 이의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고 경쇄가변 영역은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 접지면을 형성하는 것으로 사료된다(문헌참조: Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987).
면역글로불린 가변 도메인은 3개의 초가변 영역 또는 CDR에 의해 연결된 상대적으로 보존된 골격 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. N 말단에서 C 말단까지 경쇄 및 중쇄 둘다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인으로의 아미노산 할당은 면역학적 관심 대상 단백질의 Kabat 서열의 정의(문헌참조: National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 초티아 및 레스크(Chothia & Lesk)(문헌참조: J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987); 초티아 등(문헌참조: Nature 342:878-883, 1989)의 정의에 따른 것이다.
항체의 초가변 영역은 항원 결합에 관여하는 항체의 CDR 아미노산 잔기를 언급한다. 상기 초가변 영역은 CDR 기원의 아미노산 잔기[즉, 문헌(참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에 기재된 바와 같이 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)] 및/또는 초가변 루프 기원의 상기 잔기(즉, 문헌[참조: Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)]에 기재된 바와 같이 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (LI), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3))을 포함한다. 그러나, 당업자는 CDR 잔기의 실제 위치가, 특정 항체의 서열이 동정되는 경우 상기 돌출된 잔기로부터 다양할 수 있음을 이해한다.
골격 또는 FR 잔기는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기들이다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 할당될 수 있고, 이것은 추가로 아부류 또는 이소타입, 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다. 상이한 이소타입은 상이한 이펙터 기능을 갖고, 예를 들어, IgG1 및 IgG3 이소타입은 ADCC 활성을 갖는다. 본 발명의 항체가 불변 도메인을 포함하는 경우 상기 아부류 도는 이소타입 중 어느 하나일 수 있다.
예시적인 양태에서, 본 발명의 항체는 사람 카파 (κ) 또는 사람 람다 (λ) 경쇄 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열 또는 사람 중쇄 또는 이로부터 유래된 서열 또는 단일쇄중에 함께 중쇄 및 경쇄 둘다, 이량체, 사량체 또는 기타 형태를 포함할 수 있다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급한다. 모노클로날 항체는 일반적으로 고도로 특이적이고, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체들을 포함하는 통상적인(폴리클로날) 항체 제제와는 반대로 단일 항원 부위에 대해 지시될 수 있다. 이들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체는 이들이 균질 배양에 의해 합성되어 상이한 특이성 및 특성을 갖는 다른 면역글로불린으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., (Nature, 256:495-7, 1975)]에 의해 최초 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다. 상기 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌[참조: Clackson et al., (Nature 352:624-628, 1991)] 및 문헌[참조: Marks et al., (J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
상기 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적당한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터 또는 마카부에 몽키는 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위해 면역화시킨다(문헌참조: Harlow & Lane; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1988).
항체의 재조합 생산
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상이한 핵산 분자는 항원 특이적 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 다른 양태에서, 동일한 핵산 분자는 항원 특이적 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
본 발명의 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정(예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의해)을 사용하여 항체를 분비하는 하이브리도마 세포로부터 분리되고 서열분석될 수 있다. 서열 결정은 일반적으로 목적하는 유전자 또는 cDNA의 적어도 일부를 분리해야만 한다. 일반적으로, 이것은 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA 또는 바람직하게는 mRNA(즉 cDNA)의 클로닝을 요구한다. 클로닝은 표준 기술을 사용하여 수행한다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, 본원에 참조로서 인용됨). 예를 들어, cDNA 라이브러리는 폴리A + mRNA, 바람직하게는 막 결합된 mRNA의 역전사 및 사람 면역글로불린 폴리펩타이드 유전자 서열에 대해 특이적인 프로브를 사용하여 스크리닝된 라이브러리에 의해 작제될 수 있다. 뉴클레오타이드 프로브 반응 및 다른 뉴클레오타이드 하이브리드화 반응은 특정 조건하에서 서로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 동정을 가능하게 하는 조건에서 수행한다. 상기 하이브리드화 조건은 문헌[참조: Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51]에 기재된 바와 같이 계산할 수 있다
바람직한 양태에서, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 목적하는 면역글로불린 유전자 분절(예를 들어, 경쇄 가변 분절)을 암호화하는 cDNA(또는 전장 cDNA의 부분)을 증폭시킨다. 증폭된 서열은 임의의 적합한 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 소형유전자 벡터 또는 파아지 디스플레이 벡터내로 용이하게 클로닝될 수 있다. 사용되는 클로닝의 특정 방법은 이것이 목적하는 면역글로불린 폴리펩타이드의 일부의 서열을 결정할 수 있는 한 중요하지 않음을 인지할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "분리된" 핵산 분자 또는 "분리된" 핵산 서열은 (1) 이것이 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 연합되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정되고 분리되거나 (2) 기본 핵산으로부터 클로닝되거나, 증폭되거나, 태그되거나 달리 구별되어 목적하는 핵산의 서열이 결정될 수 있는 핵산 분자이고 이는 분리된 것으로 고려된다. 분리된 핵산 분자는 이것이 천연에 발견되는 형태 또는 세팅과는 다르다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 이것이 천연 세포에 존재하므로 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 분리된 핵산 분자는 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포의 것과는 상이한 염색체 위치에 있는 경우 통상적으로 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
클로닝 및 서열분석을 위해 사용되는 RNA에 대한 한가지 공급원은 유전자전이 마우스로부터 B 세포를 수득하고 B 세포를 불멸의 세포에 융합시켜 제조된 하이브리도마이다. 대안으로, RNA는 면역화된 동물의 B 세포(또는 전체 비장)으로부터 분리될 수 있다. 하이브리도마 이외의 공급원이 사용되는 경우, 특이적 결합 특성을 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 대해 스크리닝하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 스크리닝을 위한 한가지 방법은 파아지 디스플레이 기술의 사용이다. 파아지 디스플레이는 본원에서 추가로 기재되고 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 문헌[참조: 예를 들어, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, and Caton and Koprowski, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-54 (1990)]을 참조하고 상기 문헌 각각은 본원에 참조로서 인용된다. 하나의 양태에서, 면역화된 유전자전이 마우스 기원의 cDNA(예를 들어, 총 비장 cDNA)가 분리되고 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 면역글로불린 폴리펩타이드의 일부를 암호화하는 cDNA 서열, 예를 들어, CDR 영역을 증폭시키고 증폭된 서열을 파아지 벡터에 삽입한다. 목적하는 펩타이드, 예를 들어, 목적하는 결합 특성을 갖는 가변 영역 펩타이드를 암호화하는 cDNA는 패닝(panning)과 같은 표준 파아지 디스플레이 기술에 의해 동정한다.
증폭되거나 클로닝된 핵산 서열을 이어서 결정한다. 전형적으로 면역글로불린 폴리펩타이드의 전체 가변 영역을 암호화하는 서열이 결정되지만 흔히 가변 영역, 예를 들어, CDR 암호화 부분을 서열분석하는 것이 적당할 것이다. 전형적으로 상기 서열분석된 부분은 길이가 30개 이상의 염기이고 보다 흔히 가변 영역 길이의 적어도 약 3분의 1 또는 적어도 약 절반을 암호화하는 염기가 서열분석된다.
서열 분석은 cDNA 라이브러리로부터 분리된 클론에 대해 수행될 수 있거나, PCR이 사용되는 경우, 증폭된 서열을 서브클로닝한 후 또는 증폭된 증폭된 분절의 직접적인 PCR 서열분석에 의해 수행될 수 있다. 서열 분석은 표준 기술을 사용하여 수행한다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, and Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 이는 본원에 참조로서 인용된다). 클로닝된 핵산 서열을 사람 면역글로불린 유전자 및 cDNA의 공개된 서열과 비교하여 당업자는 서열 분석된 영역에 따라 (i) 하이브리도마 면역글로불린 폴리펩타이드(중쇄의 이소타입을 포함하는)의 생식선 분절 용도 및 (ii) N-영역 삽입 및 체세포 돌연변이의 과정으로부터 비롯된 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 용이하게 측정할 수 있다. 면역글로불린 유전자 서열 정보의 한가지 공급원은 기관[the National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md]이다.
일단 분리되면, 상기 DNA는 이. 콜리 세포, 시미안 COS 세포, 사람 배아 신장 293 세포(예를 들어, 293E 세포), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 면역글로불린을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포를 형질감염시키는 발현 벡터에 위치시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득할 수 있다. 항체의 재조합 생산은 당업계에 널리 공지되어 있다.
발현 조절 서열은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 언급한다. 원핵 세포에 적합한 상기 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
또 다른 양태에서, 목적하는 면역글로불린의 아미노산 서열은 직접적인 단백질 서열분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 암호화 뉴클레오타이드 서열은 범용 코돈 표에 따라 디자인할 수 있다.
목적하는 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오타이드 변화를 암호화 DNA에 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변이체는 예를 들어, 항체의 아미노산 서열내 잔기들의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환을 임의로 조합하여 최종 작제물이 목적하는 특성을 소유하는 경우 최종 작제물이 된다. 상기 아미노산 변화는 또한 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 항체의 해독후 과정을 변형시킬 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 이들 방법은 천연 공급원으로부터의 분리(천연 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리규클레오타이드 매개된(또는 부위 지시된) 돌연변이 유발에 의한 제조, PCR 돌연변이 유발 및 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 항체의 카세트 돌연변이 유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 숙주 세포에 의해 인지되는 조절 서열에 임의로 작동적으로연결된 본 발명의 항체를 암호화하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고 임의로 숙주 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 항체를 회수함을 포함할 수 있는, 항체의 제조를 위한 재조합 기술을 제공한다. 항체의 제조를 위한 다양한 시스템 및 방법은 문헌[참조: Birch & Racher (Adv. Drug Deliv. Rev. 671-685 (2006)]에서 검토하였다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 암호화하는 핵산은 분리되고 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 사용함에 의해)을 사용하여 용이하게 분리되고 서열분석된다. 많은 벡터가 가용하다. 상기 벡터 성분은 일반적으로 하기중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 선택적 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현하기 위해 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적을 위해 적합한 원핵세포는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 진정 세균, 예를 들어, 엔테로박테리아세애, 예를 들어, 에스켈기치아(Escherichia), 예를 들어, 이. 콜리(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710의 제41면에 기재된 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜리 클로닝 숙주는 이. 콜리 294 (ATCC 31,446)이지만 이. 콜리 비, 이. 콜리 X1776((ATCC 31,537), 및 이. 콜리 W3110 (ATCC 27,325)과 같은 다른 균주가 적합할 수 있다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시하는 것이다.
원핵 세포에 추가로, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵세포 미생물이 항체 암호화 벡터를 위해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 제빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주가 일반적으로 가용하고 본원에 유용하며, 예를 들어, 스키조사카로마이세스 폼베( Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 윅케라미(K. wickeramii (ATCC 24,178), 케이 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨루란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토르스(Pichia pastors) (EP 183,070); 캔디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어, 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스( Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균류, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어, 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 나이거(A. niger)가 있다.
당화된 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래한다. 무척추 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바쿨로바이러스주 및 변이체 및 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보피크투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주 기원)이 동정되었다. 형질감염용의 다양한 바이러스주가 가용하고, 예를 들어, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5주가 있고 상기 바이러스는 본원에서, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 담배, 렘나와 같은 식물 세포 배양물 및 다른 식물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 CHOKl 세포(ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, 및 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980))을 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 세포; SV40에 의해 형질전환되는 몽키 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장주(현탁 배양물에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포(Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, (Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); 몽키 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리칸 그린 몽키 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 포유동물 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암종주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시키고, 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적당히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다. 추가로, 신규 벡터, 및 선택적 마커에 의해 분리되는 다중 복사물의 전사 단위로 형질감염된 세포주가 특히 유용하고 목적하는 항원에 결합하는 항체의 발현을 위해 바람직하다.
목적하는 항체 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어, Ham's F10 (Sigma), 소형 필수 배지((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 듈베코 변형 이글 배지((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하기 위해 적합하다. 추가로, 문헌[참조: Ham et al., (Meth. Enz. 58: 44, 1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO90103430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제30,985]에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 임의의 배지는 필요한 만큼 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제(예를 들어, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, (GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소(마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 균등 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 상기 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고 당업자에게 자명할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 상기 항체는 세포내, 세포질막 주변 공간에서 생성될 수 있거나, 미생물 배양물로부터를 포함하는 직접 배지로 분비될 수 있다. 항체가 제1 단계로서 세포내 생성되는 경우, 과립 분쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어, 원심분리 또는 초원심분리에 의해 제거한다. 문헌[참조: Better et al. (Science 240:1041-43, 1988; ICSU Short Reports 10:105 (1990); and Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:457-461 (1993)]은 이 콜리의 세포질막 주변 공간으로 분비되는 항체를 분리하기 위한 과정을 기재하고 있다[문헌참조: Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)].
미생물 또는 포유동물 세포로부터 제조되는 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 다양하다. 단백질 A를 사용하여 사람 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다(문헌참조: Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13, 1983). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 사람 γ3을 위해 추천된다(문헌참조: Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게 아가로스이지만 다른 매트릭스가 가용하다. 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐) 벤젠과 같은 물리적으로 안정한 매트릭스는 보다 신속한 유속을 가능하게 하고 아가로스로 성취될 수 있는 것보다 프로세싱 시간을 단축시킨다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™수지(문헌참조: J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제를 위해 유용하다. 이온교환 칼럼상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지상의 크로마토그래피(예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술이 또한 회수될 항체에 따라 가용하다.
본 발명의 항체
본 발명은 인슐린, 인슐린 수용체 및/또는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합하고 바람직하게 인슐린 수용체의 시그날 전달 및/또는 글루코스 수준 및 글루코스 흡수에 대한 이의 효과를 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)시키는 표적 특이적 항체를 포함한다. 예시적인 양태에서, 본 발명의 표적 특이적 항체는 사람 카파(κ) 또는 사람 람다 (λ) 경쇄 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 사람 중쇄 또는 이로부터 유래된 서열, 단일쇄에 함께 중쇄 및 경쇄 둘다, 이량체, 사량체 또는 기타 형태를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 표적 특이적 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄는 상이한 아미노산 분자이다. 다른 양태에서, 동일한 아미노산 분자는 표적 특이적 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 함유한다.
몇몇 양태에서, 항-표적 항체의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 150 중에서 항체의 성숙한(즉, 시그날 서열 부재) 경쇄 가변 영역(VL)의 아미노산 서열의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 VL은 이전의 항체들중 어느 하나의 경쇄의 CDR1의 처음에서 CDR3의 말단까지의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 표적 특이적 항체는 경쇄 CDRl, CDR2 또는 CDR3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3)을 포함하고, 이의 각각은 독립적으로 서열번호 1 내지 150에 제시된 VL 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역으로부터 선택된다. 하나의 측면에서, 초티아 넘버링에 따라 경쇄 CDR1은 잔기 24-36내에 있고, CDR2는 잔기 50-56내에 있고 CDR3은 잔기 89-101내에 있다. 표적 특이적 항체의 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 150으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 VL 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 표적 특이적 항체는 서열번호 151 내지 303에 제시된 항체의 성숙한 (즉, 시그날 서열 부재) 중쇄 가변 영역(VH) 또는 이의 변이체의 아미노산 서열의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 몇몇 양태에서, VH는 이전의 항체들의 중쇄중 어느 하나의 CDR1의 처음부터 CDR3의 말단까지의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, 표적 특이적 항체는 중쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3)을 포함하고, 이의 각각은 서열번호 151 내지 303에 제시된 VH 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역으로부터 독립적으로 선택된다. 표적 특이적 항체는 중쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 포함하고 이의 각각이 서열번호 151 내지 303에 제시된 VH 영역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역으로부터 독립적으로 선택되는 것이 추가로 고려된다. 하나의 측면에서, 중쇄 CDR은 초티아 넘버링에 따라 위치하고: CDR1은 잔기 26-35내에 있고, CDR2는 잔기 50-58내에 있고 CDR3은 잔기 95-111 또는 97-118 내에 있다. 표적 특이적 항체의 폴리펩타이드는 서열번호 151 내지 303으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 VH 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
표 1 및 표 2 및 서열번호 1 내지 303의 CDR은 IMGT 시스템[문헌참조: LeFranc et al EVIGT, the INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM®, Nucl. Ac. Res. 33 D593-597 (2005)]에 따라 결정하였다.
또 다른 양태에서, 상기 항체는 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이루는 상기된 바와 같은 성숙한 경쇄 가변 영역 및 상기된 바와 같은 성숙한 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 303에 제시된 바와 같고 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이루는 임의의 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체의 정제된 제제를 고려한다.
예시적인 양태에서, 본 발명은 다음을 고려한다:
각각 임의로 CDR중 어느 하나에 1개 또는 2개 돌연변이, 예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환을 포함하고 임의로 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이루는 서열번호 151 내지 303 및 서열번호 1 내지 150중 어느 하나의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 또는 LCDR3중 어느 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 보유하는 모노클로날 항체;
임의로 CDR 중 어느 하나에 1개 또는 2개의 돌연변이를 포함하고, 임의로 임의의 적합한 중쇄 불변 영역, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 또는 IgE, 이의 사람 서열 또는 이의 하이브리드 또는 사람 컨센서스를 추가로 포함하는, HCDR1, HCDR2, HCDR3, 또는 서열번호 151 내지 303 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 모두를 보유하는 모노클로날 항체;
임의로 CDR중 어느 하나에 1개 또는 2개의 돌연변이를 포함하고, 임의로 임의의 적합한 경쇄 불변 영역에, 예를 들어, 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 이의 사람 서열 또는 하이브리드 또는 이의 사람 컨센서스를 추가로 포함하는, LCDR1, LCDR2, LCDR3, 또는 서열번호 1 내지 150 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역 모두를 보유하는 모노클로날 항체;
예를 들어, X-선 결정학 또는 듀테륨 교환 질량 분광측정기와 같은 다른 생물리학적 또는 생화학적 기술, 알라닌 스캐닝 및 펩타이드 단편 ESISA를 통한 결정시 서열번호 1 내지 303에 제시된 가변 영역을 포함하는 항체로서 INSR의 동일한 선형 또는 3차원 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체;
사람 INSR에 결합하는 것에 대해 서열번호 1 내지 303에 제시된 가변 영역을 포함하는 항체와 약 75% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상으로 경쟁하는 모노클로날 항체.
몇몇 양태에서, 상기 항체는 표 3에 제시된 바와 같이 쌍을 이루는 경쇄 및 중쇄의 모든 3개의 경쇄 CDR, 모든 3개의 중쇄 CDR 또는 모든 6개의 CDR을 포함한다. 몇몇 예시적인 양태에서, 항체 기원의 2개의 경쇄 CDR은 상이한 항체 기원의 제3 경쇄 CDR과 조합될 수 있다. 대안으로, 하나의 항체 기원의 LCDR1은 상이한 항체 기원의 LCDR2 및 또 다른 항체 기원의 LCDR3과 조합될 수 있고 특히 여기서, CDR은 고도로 상동성이다. 유사하게, 항체 기원의 2개의 중쇄 CDR은 상이한 항체 기원의 제3 중쇄 CDR과 조합될 수 있거나; 하나의 항체 기원의 HCDR1은 상이한 항체 기원의 HCDR2 및 또 다른 항체 기원의 HCDR3과 조합될 수 있고 특히 여기서 상기 CDR은 고도로 상동성이다.
컨센서스 CDR이 또한 사용될 수 있다. 본원에서 유래된 컨센서스 CDR중 어느 하나는 항체중 어느 하나의 동일한 쇄(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄) 기원의 2개의 다른 CDR과 조합되어, 적합한 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 형성할 수 있다.
몇몇 양태에서, 서열번호 148 내지 284에 제시된 중쇄 가변 영역과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열 및/또는 서열번호 1 내지 150에 제시된 경쇄 가변 영역과 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 추가로 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모두를 포함하는 항체가 제공된다. 몇몇 양태에서, 경쇄 가변 영역과 % 동일성을 갖는 아미노산 서열은 경쇄 CDR 1개, 2개 또는 3개를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역과 % 동일성을 갖는 아미노산 서열은 중쇄 CDR 1개, 2개 또는 3개를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 항체의 CDR 영역에 1개 또는 2개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 비보존성 치환 또는 보존성 치환을 가질 수 있다.
관련 양태에서, 골격 잔기는 변화된다. 변화될 수 있는 중쇄 골격 영역은 중쇄 CDR 잔기를 둘러싸는 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4로 지정된 영역에 있고, 변화될 수 있는 경쇄 골격 영역의 잔기는 경쇄 CDR 잔기를 둘러싸는 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4로 지정된 영역에 있다. 상기 골격 영역내 아미노산은 예를 들어, 사람 골격 또는 사람 보존성 골격내에서 동정되는 임의의 적합한 아미노산으로 대체될 수 있다.
추가로, 본 발명은 임의로 표 3에 제시된 중쇄/경쇄 가변 영역으로서 쌍을 이루는 서열번호 151 내지 303의 아미노산 서열중 어느 하나에 융합된 서열번호 1 내지 150의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 정제된 폴리펩타이드 또는 임의로 표 3에서 제시된 바와 같이 쌍을 이루는 서열번호 1 내지 150 및 서열번호 151 내지 303의 적어도 일부를 포함하는 이의 단편을 포함하는 정제된 폴리펩타이드를 제공하는 것이 고려되고, 여기서, 상기 폴리펩타이드는 인슐린 수용체, 인슐린 또는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 포함하는 정제된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 1 내지 150에 제시된 LCDR 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 150에 제시된 LCDR중 어느 하나와 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 포함하는 정제된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 151 내지 303에 제시된 HCDR 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 151 내지 303에 제시된 HCDR중 어느 하나와 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
추가로, 항체 중쇄 및 경쇄의 CDR이 예를 들어, 친화성 성숙을 통해 유래되고 항체 결합 친화성을 개선시킬 수 있는 변이체 아미노산 서열을 포함하는 것이 고려된다. 하나의 측면에서, 본 발명의 항체는 서열번호 151 내지 303에 제시된 모 항체 서열의 HCDR2와 약 35% 동일성을 갖는 중쇄 HCDR2 서열을 포함하는 것이 고려된다. 관련 측면에서, 본 발명의 항체가 서열번호 151 내지 303에 제시된 모 항체 서열의 HCDR3과 약 50% 동일성을 갖는 중쇄 HCDR3 서열을 포함하는 것이 고려된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 150 및 151 내지 303 중 어느 하나에 제시된 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 기능성 단편을 포함하는 항원 결합 화합물을 제공한다. 관련 양태에서, 상기 언급된 항원 결합 화합물은 완전히 어셈블리된 사량체 항체, 폴리클로날 항체, HUMAN ENGINEERED™ 항체를 포함하는 모노클로날 항체; 사람화된 항체; 사람 항체; 키메라 항체; 다중특이적 항체, 항체 단편, Fab, F(ab')2; Fv; scFv 또는 단일쇄 항체 단편; 이중항체; 삼중항체, 사중항체, 소형항체, 선형 항체; 킬레이팅 재조합 항체, 3가 항체 또는 2가 항체, 내부체, 나노체, 소형 모듈 면역약제 (SMIP), 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타화된 항체, VHH 함유 항체, 또는 본 발명의 하나 이상의 CDR 서열을 포함하고 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체중 어느 하나의 변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 항원 결합 화합물은 바람직하게 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M 이하의 결합 친화성을 보유한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항체는 각각 표 3에서와 같이 쌍을 이루는, 아미노산 서열번호 151 내지 303 및 서열번호 1 내지 150에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 항체는 상기 아미노산 서열에 제시된 항체 전부 또는 일부를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 표 3에서 쌍을 이루는 것과 같은, 서열번호 151 내지 303의 중쇄의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3중 하나 이상, 또는 서열번호 1 내지 150의 경쇄의 CDRl, CDR2 또는 CDR3중 하나 이상을 포함한다.
하나의 양태에서, 중쇄는 중쇄 CDR3 서열로서 동정된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 "중쇄 CDR3 서열" (HCDR3)은 표 2 및 서열번호 151 내지 303에 제시된 중쇄 CDR3 서열로서 동정된 아미노산 서열을 포함한다. 대안으로, HCDR3 서열은 표 2에서 동정된 임의의 HCDR3 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화, 즉, 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직할 수 있는 치환은 표 2의 또 다른 HCDR3 내에 상응하는 위치에서 아미노산에 대한 치환을 포함한다. 대안으로, HCDR3 서열은 본원에 기재된 HCDR3의 컨센서스 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
대안으로, 상기된 바와 같은 본 발명의 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄는 추가로 서열번호 151 내지 303 및 표 2에서 HCDR2로서 동정된 아미노산 서열, 서열번호 151 내지 303 및 표 2에서 동정된 임의의 HCDR2와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화, 바람직하게는 표 2의 또 다른 HCDR2 내에 상응하는 위치에서 아미노산 서열에 대한 치환을 함유하는 아미노산 서열 또는 본원에 기재된 HCDR2의 컨센서스 서열을 함유하는, 본 발명의 "중쇄 CDR2 서열"(HCDR2)를 포함할 수 있다.
상기된 본 발명의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 상기 중쇄는 또한 (a) 상기된 본 발명의 중쇄 CDR1 서열 및 (b) 상기된 본 발명의 중쇄 CDR2 서열 둘다를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면은 하기된 본 발명의 중쇄 CDR 서열 중 어느 1개, 2개 및/또는 3개를 포함하는 중쇄를 포함하는, 표적 항원에 결합하는 항체를 제공한다.
상기된 중쇄 CDR 서열중 어느 하나는 또한 CDR중 어느 하나의 말단에 첨가된 아미노산을 포함할 수 있다. 친화성 성숙화 또는 아미노산 유사체를 함유하는 변이체 또는 유도체의 제조를 포함하는 본 발명의 항체 및 항원 결합 화합물의 제조는 본원에서 추가로 상세하게 기재된다. 예시적인 변이체는 아미노산 서열 내에 상응하는 아미노산의 보존성 또는 비보존성 치환 또는 아미노산의 사람 항체 서열의 상응하는 아미노산으로의 대체를 함유하는 것들을 포함한다.
상기된 중쇄의 어느 하나를 포함하는 항체는 추가로, 경쇄, 바람직하게는 표적 항원에 결합하는 경쇄 및 가장 바람직하게는 하기된 본 발명의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기된 본 발명의 경쇄 CDR 서열중 어느 1개, 2개, 및/또는 3개를 포함하는 경쇄를 포함하는 표적 항원에 결합하는 항체를 제공한다.
바람직하게, 경쇄는 경쇄 CDR3 서열로서 동정된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 "경쇄 CDR3 서열" (LCDR3)은 표 1에서 및 서열번호 1 내지 150의 경쇄 CDR3 서열로서 동정된 아미노산 서열을 포함한다. 대안으로, 표 1에서 동정된 임의의 경쇄 CDR3 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화, 즉 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직할 수 있는 치환은 표 1의 또 다른 경쇄 CDR3 내 상응하는 위치에서 아미노산에 대한 치환을 포함한다. 대안으로, 경쇄 CDR3 서열은 표 1에 나타낸 경쇄 CDR3의 컨센서스 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기된 본 발명의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 경쇄는 추가로 서열번호 1 내지 150 또는 표 1에서 경쇄 CDR1로서 동정된 아미노산 서열, 서열번호 1 내지 150 또는 표 1에 동정된 임의의 경쇄 CDR1과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화, 바람직하게는 표 1의 또 다른 경쇄 CDR1내에 상응하는 위치에서 아미노산에 대한 치환을 포함하는 아미노산 서열 또는 본원에 기재된 경쇄 CDR1의 컨센서스 서열 중 어느 하나를 포함하는, 본 발명의 "경쇄 CDR1 서열"을 포함할 수 있다.
대안으로, 상기된 본 발명의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 경쇄는 추가로 서열번호 1 내지 150 또는 표 1에서 경쇄 CDR2로서 동정된 아미노산 서열, 표 1에 동정된 임의의 경쇄 CDR2와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변화, 바람직하게는 서열번호 1 내지 150 또는 표 1의 또 다른 경쇄 CDR2내에 상응하는 위치에서 아미노산에 대한 치환을 포함하는 아미노산 서열 또는 표 1에 나타낸 경쇄 CDR2의 컨센서스 서열중 어느 하나를 포함하는 본 발명의 "경쇄 CDR2 서열"을 포함할 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 서열번호 151 내지 303의 하나 이상의 HCDR 또는 서열번호 1 내지 150의 LCDR을 포함하는 정제된 폴리펩타이드를 고려하고 여기서, 중쇄 가변 영역의 골격 영역 및 경쇄 가변 영역의 골격 영역은 사람 항체 기원의 골격 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 중쇄 가변 영역의 골격 영역 및 경쇄 가변 영역의 골격 영역은 사람 항체 서열과 보다 상동성인 아미노산 치환에 의해 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 각각의 중쇄 골격 영역(H-FR1-4)내에, 쥐 중쇄 가변 영역의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 고유 골격 영역 잔기는 아미노산 치환에 의해 변형된 것이 고려되고 여기서 각각의 경쇄 골격 영역(L-FR1-4)내에 쥐 경쇄 가변 영역의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 고유 골격 잔기는 아미노산 치환에 의해 변형되었다.
하기된 본 발명의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 경쇄는 또한 (a) 상기된 발명의 경쇄 CDR1 서열 및 (b) 상기된 본 발명의 경쇄 CDR2 서열 둘다를 포함할 수 있다.
상기된 경쇄 가변 영역중 어느 하나를 포함하는 항체는 추가로 임의로 표 3에 기재된 바와 같이 쌍을 이루는, 중쇄 가변 영역, 바람직하게는 표적 항원에 결합하는 중쇄 가변 영역 및 가장 바람직하게는 상기된 본 발명의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 상기 항체는 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성을 약 5배 내지 200배로 강화시킬 수 있는 평형 해리 상수 KD가 10-5M 이하인, 인슐린 수용체 또는 인슐린 및 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 결합한다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 양성 조절제 항체이고 예를 들어, 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성을 강화시킨다. 몇몇 양태에서, 양성 조절제 항체는 Ab006, Ab030, Ab004, Ab013, Ab009, Ab007, AbO11, Ab001, Ab012, AbOlO, Ab003, Ab008, Ab002, Ab005, Ab076, Ab077, Ab079, Ab080, Ab083, Ab059, Ab078, Ab085 또는 표 1 및 2에서 제시되거나 서열번호 76, 80, 101, 128, 132 및 서열번호 291, 196, 239, 267, 271에 제시된 항체 가변 영역에서, 상기 항체 중 어느 하나에 상응하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다 .
추가의 양태에서, 양성 조절제 항체는 인슐린 수용체, 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합하거나 인슐린 수용체 및 인슐린/인슐린 수용체 복합체 둘다에 결합한다. 관련 양태에서, 인슐린 수용체 또는 인슐린/인슐린 수용체 복합체 또는 이 둘다에 결합하는 양성 조절제 항체는 Ab006, Ab030, Ab004, Ab013, Ab009, Ab007, AbO11, Ab001, Ab012, AbOlO, Ab003, Ab008, Ab002, Ab005, Ab076, Ab077, Ab079, Ab080, Ab083 또는 표 1 및 2에 제시되거나, 서열번호 76, 80, 101 및 서열번호 291, 196 및 239에 제시된 항체 가변 영역에서, 상기 항체중 어느 하나에 상응하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 양태에서, 양성 조절제 항체는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합하지만 비복합체화된 인슐린 수용체에 검출가능하게 결합하지 않는다. 관련 양태에서, 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합하는 양성 조절제 항체는 Ab059, Ab078, Ab085 또는 표 1 및 2에 제시되거나 서열번호 128, 132 및 서열번호 267 및 271에 제시된 항체 가변 영역에서 상기 항체의 어느 하나에 상응하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
관련 측면에서, 상기 항체는 효능제 항체이다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 인슐린 수용체에 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M 이하의 친화성으로 결합하고 임의로 pAKT 분석으로 측정시 인슐린의 최대 효능제 활성의 20% 내지 100%인 최대 효능제 활성을 나타내는 효능제 항체이다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 인슐린 수용체에 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M 이하의 친화성으로 결합하고 (a) pAKT 분석으로 측정시 인슐린의 최대 효능제 활성의 20% 내지 80%인 최대 효능제 활성을 나타내고, (b) 존재하는 경우 INSR에 대한 인슐린의 EC50을 2배 이상으로 변화시키지 않고 (c) 존재하는 경우 INSR에 대한 인슐린의 KD를 2배 이상으로 변화시키지 않는 알로스테릭 효능제 항체이다.
특정 양태에서, 상기 효능제 항체는 Ab021, Ab029, Ab022, Ab017, Ab023, Ab024, Ab025, Ab026, Ab031, Ab035, Ab027, Ab036, Ab037, Ab028, Ab038, Ab039, Ab040, Ab041, Ab042, Ab032, Ab043, Ab044, Ab045, Ab046, Ab047, Ab018, Ab033, Ab048, Ab014, Ab015, Ab049, Ab034, Ab051, Ab053, Ab054, Ab056, Ab058, Ab062, Ab064, Ab066, Ab067, Ab068, Ab086, Ab069, Ab071, Ab073, Ab075, Ab082, Ab084 또는 표 1 및 2에 제시되거나 서열번호 7, 113, 114, 124, 126, 130 및 서열번호 164, 252, 253, 263, 265 및 269에 제시된 항체 가변 영역에서 상기 항체중 어느 하나에 상응하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 측면에서, 상기 항체는 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성을 약 3배 이상, 임의로 1000배 이하로 약화시킬 수 있는 10-5M 이하의 평형 해리 상수 KD로 인슐린 수용체, 또는 인슐린 및 인슐린 수용체를 포함하는 복합체에 결합한다. 하나의 양태에서, 상기 항체는 인슐린과 인슐린 수용체간의 결합 친화성을 약화시키는 음성 조절제 항체이다. 관련 양태에서, 음성 조절제 항체는 하기의 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: Ab087, Ab019, Ab088, Ab089, Ab020, Ab050, Ab052, Ab055, Ab057, Ab061, Ab063, Ab065, Ab070, Ab072, Ab074 및 Ab081.
추가의 측면에서, 상기 항체는 인슐린 수용체 또는 인슐린/인슐린 수용체 복합체에 결합하는 것에 대해 본원에 기재된 항체중 어느 하나와 경쟁하는 항체이다. 특정 양태에서, 상기 항체는 부분적 경쟁을 나타낸다. 관련 양태에서, 부분적 경쟁은 약 30% 내지 70%, 약 30% 내지 80%, 또는 약 30%, 35%, 40%,45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 경쟁이다. 몇몇 양태에서, 상기 항체는 완전한 경쟁을 나타낸다. 하나의 양태에서, 완전한 경쟁은 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 초과의 경쟁이다. 항체 경쟁을 측정하기 위한 예시적인 분석은 본원 및 당업계에 기재된 바와 같은 수용체 로딩 분석 및 에피토프 비닝(binning) 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 상기 항체는 Ab079, Ab076, Ab083, Ab080, Ab062, Ab020, Ab019, Ab088, 및 Ab089로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 70% 이상의 경쟁을 나타내고, 임의로 Ab086, Ab064, AbOO1, 및 Ab018로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 30% 이상의 경쟁을 나타낸다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 임의로 하나 이상의 Ab062 및 Ab086과 경쟁하지 않는다. 특정 양태에서, 상기 항체는 사람 및 쥐 둘다의 수용체 또는 복합체에 결합한다.
추가의 양태에서, 본원에 기재된 항체와 경쟁하는 항체는 Ab040, Ab062, Ab030, Ab001 및 Ab018로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 70% 이상의 경쟁을 나타내고 임의로 AB037, Ab078, AB083, AB080, 및 AB085로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 30% 이상의 경쟁을 나타낸다. 관련 양태에서, 상기 항체는 Ab053, Ab064, 83-7, Ab019, Ab088, 및 Ab089와 경쟁하지 않는다. 임의로, 상기 항체는 사람 및 쥐 인슐린 수용체 또는 복합체에 결합한다.
추가의 양태에서, Ab030, Ab037, Ab053, Ab001, Ab018, Ab064 및 Ab040으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 70% 이상의 경쟁을 나타내고 임의로, Ab085 및 Ab086로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 30% 이상의 경쟁을 나타낸다. 임의로, 상기 항체는 Ab079, Ab076 및 Ab088과 어떠한 경쟁을 나타내지 않고 임의로, 사람 및 쥐 둘다의 인슐린 수용체 또는 복합체에 결합한다.
추가의 양태에서, 본원에 기재된 항체와 경쟁하는 항체는 Ab064, Ab062, Ab085, 및 Ab078로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 70% 이상의 경쟁을 나타내고, 임의로 Ab077, Ab001, Ab018, Ab030, Ab037, Ab079, Ab076, Ab083, Ab019, Ab088, Ab089, 및 Ab040과 어떠한 경쟁을 나타내지 않는다. 임의로, 상기 항체는 사람 및 쥐 둘다의 인슐린 수용체 또는 복합체에 결합하다.
추가의 양태에서, 본원에 기재된 항체와 경쟁하는 항체는 Ab079, Ab076, Ab083, Ab080, Ab062, Ab020, Ab019, Ab088 및 Ab089로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 1개, 2개, 3개 또는 모든 항체와 70% 이상의 경쟁을 나타낸다. 임의로, 상기 항체는 Ab062, Ab086, Ab001, Ab018, Ab030, Ab037 및 Ab064와 경쟁하지 않고; 임의로 상기 항체는 단지 사람 반응성이고 쥐 인슐린 수용체 또는 복합체에는 결합하지 않는다.
추가의 양태에서, 상기 항체는 임의의 항체와 30% 이상의 경쟁을 나타낸다. 임의로, 상기 항체는 Ab061과 30% 이상의 경쟁을 나타내고, 임의로 Ab019 및 Ab074와 30% 미만의 경쟁을 갖고, 임의로 Ab088과 어떠한 경쟁을 나타내지 않는다. 임의로, 상기 항체는 사람 및 쥐 둘다의 수용체 또는 복합체에 결합한다.
또 다른 양태에서, 상기 항체는 서열번호 281, 278, 277, 209, 275, 223, 284, 276, 및 236으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 141, 138, 137, 35, 135, 57, 144, 136, 및 98로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 항체는 서열번호 195, 220, 303, 197, 208, 243, 245 및 251로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 77, 50, 90, 84, 34, 104, 106 및 112로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 항체는 서열번호 241, 279, 258, 155, 및 228로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 103, 139, 119, 8, 및 89로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 항체 핵산
본 발명은 또한 상기된 바와 같은 표적 특이적 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상이한 핵산 분자는 표적 특이적 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 다른 양태에서, 동일한 핵산 분자는 표적 특이적 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 하나의 양태에서, 상기 핵산은 본 발명의 표적 특이적 항체를 암호화한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 1 내지 150 또는 이의 일부에 제시된 VL 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 관련 측면에서, 상기 VL 아미노산 서열은 컨센서스 서열이다. 몇몇 양태에서, 상기 핵산은 상기 항체의 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 암호화한다. 몇몇 양태에서, 상기 일부는 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 연속 부분이다. 하나의 양태에서, 상기 부분은 1개, 2개 또는 3개 이상의 경쇄 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 영역을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 핵산은 서열번호 1 내지 150에 제시된 VL 아미노산 서열과 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 97, 98 또는 99% 이상 동일한 VL 아미노산 서열을 암호화한다. 본 발명의 핵산 분자는 고도의 엄중 조건하에서 하이브리드화하는 핵산을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 서열번호 151 내지 303 중 어느 하나의 VH 아미노산 서열 또는 이의 일부을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 고려된다. 관련 측면에서, VH 아미노산 서열은 컨센서스 서열이다. 몇몇 양태에서, 상기 핵산은 상기 항체의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 암호화한다. 몇몇 양태에서, 상기 부분은 중쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 연속 부분이다. 하나의 양태에서, 상기 부분은 1개, 2개 또는 3개 이상의 중쇄 CDR1. CDR2 또는 CDR3 영역을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 151 내지 303에 제시된 VH 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 VH 아미노산 서열을 암호화한다. 본 발명의 핵산 분자는 고도의 엄중 조건하에서 하이브리드화하는 핵산을 포함한다.
본 발명의 핵산은 서열번호 1 내지 303에 제시되고 임의로 표 3에 기재된 바와 같이 쌍을 이루는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 전장 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 것으로 고려되고, 여기서, 전장 경쇄 또는 전장 중쇄는 각각 경쇄 불변 영역 또는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명은 추가로 상기된 바와 같은 본 발명의 항원 결합 영역을 포함하는 항체 변이체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 고려한다.
본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하고 분리하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 널리 확립된 재조합 DNA 기술에 의해 임의의 다양한 다른 뉴클레오타이드 서열과 연결될 수 있다(문헌참조: Sambrook et al., (2d Ed.; 1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 폴리뉴클레오타이드에 연결하기 위해 유용한 뉴클레오타이드 서열은 당업자에게 널리 공지된 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 람다 파아지 유도체, 파지미드 등을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 일반적으로, 상기 벡터는 하나 이상의 유기체에서 기능하는 복제 오리진, 간편한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 숙주 세포에 대해 선별가능한 마커를 함유한다. 본 발명에 따른 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 서열분석 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있고 단세포 유기체 또는 다세포 유기체의 일부일 수 있다. 대다수의 적합한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되어 있고 본 발명의 재조합 작제물을 생성시키기 위해 가용하다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 암호화 서열을 함유하고 발현하도록 사용될 수 있다. 이들은 재조합 박테리오파아지, 플라스미드, 파지미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균과 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 타바코 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염되거나 세균 발현 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질감염된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 재조합 단백질 제조에 유용한 포유동물 세포는 VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포(예를 들어 COS-7), WI38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 및 HEK 293 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
천연 항체와 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 천연 항체 분자의 생물학적 활성 단편, 변이체 또는 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 변이체 및 항체 단편은 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 이것은 PCR 기술, 항체 중쇄 및 경쇄 영역 등을 암호화하는 DNA의 절단 및 분해에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 PCR 및 다른 기술을 사용하는 점 돌연변이를 사용하여 항체 활성과 관련된 특정 활성에서 중요한 아미노산 잔기를 세부적으로 동정할 수 있다. 따라서, 당업자는 DNA 가닥에서 단일 염기를 변화를 생성하여 변화된 코돈 및 미스센스 돌연변이를 유발할 수 있다.
항체 단편
항체 단편은 온전한 전장 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 이중항체; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 다중특이적 항체 단편, 예를 들어, 이특이적, 삼특이적 항체와 같은 단편(예를 들어, 이중항체, 삼중항체, 사중항체); 소형 항체; 킬레이팅 재조합 항체; 삼중항체 또는 이중항체; 내부항체; 나노체; 소형 모듈 면역약제(SMIP), 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질; 낙타화된 항체; VHH 함유 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다른 폴리펩타이드를 포함한다[문헌참조: 예를 들어, Holliger & Hudson (Nat. Biotech. 23(9) 1126-36 (2005))
항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원 결합부를 갖는 VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 "Fab" 단편으로 호칭되는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 명칭이 용이하게 결정화하는 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편을 생성시킨다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편을 생성시키고 이것은 항체의 VH 및 VL 도메인(이들 모메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에 존재한다)을 포함하는 2개의 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편을 갖는다. 바람직하게, Fv 폴리펩타이드는 Fv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성시킬 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하여 단일쇄 항체(scFv)를 생성하고, 여기서, VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 합성 링커를 통해 1가 분자를 형성하고 상기 링커는 이들이 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 한다(문헌참조: Bird et al., Science 242:423-426, 1988, and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). scFv의 검토를 위해 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 이루어진다.
추가의 항체 단편은 VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체 (dAb) 단편(문헌참조: Ward et al., Nature 341:544-546, 1989)을 포함한다. 이중항체는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄상에서 발현되지만 동일한 쇄상에서 2개의 도메인간의 상을 이루도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 생성하도록 된 2가 항체이다(문헌참조: 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, and Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994). 이중항체는 2특이적이거나 1특이적일 수 있다.
경쇄가 없는 기능성 중쇄 항체가 수염 상어(문헌참조: Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995), 워베공 상어(wobbegong shark) (Nuttall et al., Mol Immunol. 38:313-26, 2001) 및 낙타, 단봉 낙타, 알파카스 및 라마스와 같은 카멜리대(Camelidae) (문헌참조: Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-8, 1993; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998)에서 천연적으로 존재한다. 항원 결합 부위는 상기 동물에서 단일 도메인인 VHH 도메인으로 감소된다. 이들 항체는 단지 중쇄 가변 영역을 사용하는 항원 결합 영역을 형성하고, 즉 이들 기능성 항체는 단지 구조물 H2L2를 갖는 중쇄의 동종이량체(("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로 언급됨))이다. 카멜리드 VHH는 보고에 따르면 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 함유하고 CH1 도메인이 없는 IgG2 및 IgG3 불변 영역과 재조합한다(문헌참조: Hamers-Casterman et al). 예를 들어, 라마 IgG1은 VH가 힌지, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 불변영역과 재조합된 통상적인 (H2L2) 항체 이소타입인 반면 라마 IgG2 및 IgG3은 CH1 도메인이 부재이고 경쇄를 함유하지 않는 중쇄만을 갖는 이소타입이다. 카멜리드 VHH 도메인은 고친화성으로 항원과 결합하고(문헌참조: Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) 용액 중에 높은 안정성을 갖고 있는(문헌참조: Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002) 것으로 밝혀졌다. 전형적인 VH만을 갖는 단편은 가용성 형태로 제조하기가 어렵지만 용해도 및 특이적 결합은 골격 잔기가 보다 VHH형이 되도록 변형된 경우에는 개선될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Reichman, et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38). 카멜리드 중쇄를 갖는 항체를 제조하기 위한 방법은 예를 들어, 미국 특허 공개번호 제20050136049호 및 제20050037421호에 기재되어 있다.
분자량이 15kDa인 항체 중쇄의 가변 도메인은 나노체로서 언급된다(문헌참조: Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). 나노체 라이브러리는 문헌[참조: Conrath et al., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001)에 기재된 바와 같이 면역화된 단봉낙타로부터 또는 문헌[참조: Revets et al, Expert Opin. Biol. Ther. 5(1): 111-24 (2005)]에 기재된 바와 같은 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
이특이적 Fab-scFv("2가 항체") 및 3특이적 Fab(scFv)(2)("3가 항체")의 제조는 문헌[참조: Schoonjans et al. (J Immunol. 165:7050-57, 2000) and Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003)]에 기재되어 있다. 2가 항체 또는 3가 항체를 위해, scFv 분자는 VL-CL (L) 및 VH-CH1 (Fd) 쇄 중 하나 또는 둘다에 융합시켜, 예를 들어, 2개의 scFv가 Fab의 C-말단에 융합된 3가 항체를 제조하고, 하나의 scFv가 Fab의 C 말단에 융합된 2가 항체를 제조한다.
펩타이드 링커(힌지 부재)를 통해 또는 IgG 힌지를 통해 CH3에 융합된 scFv로 이루어진 "소형체(minibody)"는 문헌[참조: Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23]에 기재되어 있다.
내부체(intrabody)는 세포내 발현을 입증하고 세포내 단백질을 조작할 수 있는 단일쇄 항체이다(문헌참조: Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci U SA. 101:17616-21, 2004). 세포내 영역에서 항체 구조를 보유하는 세포 시그날 서열을 포함하는 내부 항체는 문헌[참조: Mhashilkar et al (EMBO J 14:1542-51, 1995) 및 Wheeler et al. (FASEB J. 17:1733-5. 2003)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 트랜스바디는 단백질 형질도입 도메인(PTD)가 단일쇄 가변 단편(scFv) 항체와 융합된 세포 침투성 항체이다[문헌참조: Heng et al., (Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).
항원에 특이적인 SMIP 또는 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체가 추가로 고려된다. 이들 구조물은 항체 이펙터 기능을 수행하는데 필요한 면역글로불린 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩타이드이다[문헌참조: 예를 들어, WO03/041600, 미국 특허 공개공보 제20030133939호 및 미국 특허 공개공보 제20030118592호].
하나 이상의 CDR은 공유적으로 또는 비공유적으로 분자에 혼입하여 이것이 면역접착제가 될 수 있도록 할 수 있다. 면역접착체는 대형 폴리펩타이드 쇄의 일부로서 CDR을 내포할 수 있거나 CDR을 또 다른 폴리펩타이드 쇄에 공유적으로 연결할 수 있거나 비공유적으로 CDR을 내포할 수 있다. 상기 CDR은 면역접착제가 목적하는 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있게 한다.
또 다른 양태에서, 항체 또는 항원 결합 화합물은 사람 항체 서열의 불변 영역 및 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변 골격 영역을 포함한다. 관련 양태에서, 항체는 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 변형되거나 비변형된 불변 영역을 포함한다.
대안으로, 항체 단편을 단백질 스캐폴드에 융합시킬 수 있다. 단백질 스캐폴드의 라이브러리는 아드넥틴(Adnectin), 아피바디(Affibody), 안티칼린(Anticalin), DARPins, 가공된 쿠니츠형 억제제(Kunitz-type inhibitor), 테트라넥틴(tetranectin), A-도메인 단백질, 리포칼린(lipocalin), 반복 단백질, 예를 들어, 안키린 반복 단백질, 면역 단백질, α2p8 펩타이드, 곤충 데펜신(insect defensin) A, PDZ 도메인, 카리브도톡신(charybdotoxin), PHD 핑거(finger), TEM-1 β-락타마제, 피브로넥틴 III형 도메인, CTLA-4, T-세포 수용체, 크노틴(knottin), 네오카지노스타틴(neocarzinostatin), 탄수화물 결합 모듈 4-2, 녹색 형광 단백질, 티오레독신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌참조: Gebauer & Skerra, Curr. Opin. Chem. Biol. 13:245-55 (2009); Gill & Damle, Curr. Opin. Biotech 17: 653-58 (2006); Hosse et al, Protein Sci. 15:14-27 (2006); Skerra, Curr. Opin. Biotech 18: 295-3-4 (2007)).
따라서, 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 1개, 2개 및/또는 3개의 CDR을 포함하는 다양한 조성물은 당업계에 공지된 기술로 제조할 수 있다.
다중특이적 항체
몇몇 양태에서, 동일하거나 상이한 분자의 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 다중특이적(예를 들어, 이특이적) 항체를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 이특이적 항체는 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안으로, 항원 특이적 항체는 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 같은 세포 표면 분자에 결합하는 암(arm)과 조합하여 세포 방어 기작이 목적하는 항원에 집중되도록 할 수 있다. 이특이적 항체를 또한 사용하여 목적하는 항원 발현하거나 흡수한 세포로 세포독성제를 이동시킬 수 있다. 이들 항체는 항원 결합 암 및 세포독성제와 결합하는 암(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-60, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사능활성 동위원소 합텐)을 갖는다. 이특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이특이적 항체를 제조하기 위한 또 다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자간의 접지면을 가공하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 %를 최대화할 수 있다. 상기 바람직한 접지면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 접지면으로부터의 하나 이상의 소형 아미노산 쇄는 대형 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공극"은 대형 아미노산 측쇄를 소형 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하여 제2 항체 분자의 접지면상에 생성된다. 이것은 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어, 동종이량체보다 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 기작을 제공한다[문헌참조: WO96/27011 published Sep. 6, 1996].
이특이적 항체는 가교결합되거나 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체에서 항체중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이종접합 항체는 임의의 통상적인 가교 결합 방법에 의해 제조할 수 있다. 적합한 가교 결합 제제가 당업계에 널리 공지되어 있고 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
항체 단편으로부터 이특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. 문헌[참조: Brennan et al., (Science 229:81-83, 1985)]은 온전한 항체가 단백질용해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성시키는 과정을 기재한다. 이들 단편은 디티올 착화제 아비산 나트륨의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 차단한다. 제조된 Fab' 단편은 이어서 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에탄올아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이특이적 항체를 형성한다. 제조된 이특이적 항체는 효소의 선택적 고정화용 제제로서 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, 이. 콜리로부터 직접적으로 회수된 Fab'-SH 단편은 시험관내에서 화학적으로 커플링시켜 이특이적 항체를 형성할 수 있다(Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).
문헌[참조: Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]은 완전히 사람화된 이특이적 항체 F(ab')2 분자의 제조를 기재하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜리로부터 별도로 분비시키고 시험관내에서 지향적 화학적 커플링에 적용하여 이특이적 항체를 생성한다. 따라서, 형성된 이특이적 항체는 사람 유방 종양 항원에 대해 사람 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 뿐만 아니라 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 사람 T 세포에 결합할 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이특이적 항체 단편을 제조하고 분리하는 다양한 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 이특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 제조하였다(문헌참조: Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의한 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 상기 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고 이어서 재산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 문헌[참조: "diabody" technology described by Holliger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993)에 기재된 "이중항체" 기술은 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기작을 제공하였다.
상기 단편은 동일한 쇄상에서 2개의 도메인간의 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된 중쇄 가변 영역(VH)를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단일쇄 Fv(scFv) 이량체를 사용함에 의해 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다[문헌참조: Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994)].
대안으로, 이특이적 항체는 문헌[참조: Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)]에 기재된 바와 같이 제조된 "선형 항체"일 수 있다. 선형 항체는 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 반복 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이특이적이거나 1특이적일 수 있다.
추가의 양태에서, 이특이적 항체는 킬레이팅 재조합 항체(CRAb)일 수 있다. 킬레이팅 재조합 항체는 항원의 인접하고 비중첩된 에피토프를 인지하고 충분히 유연성이어서 에피토프 둘다에 동시에 결합한다(문헌참조: Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).
2가 이상의 항체가 또한 고려된다. 예를 들어, 3특이적 항체가 제조될 수 있다(문헌참조: Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).
키메라 및 사람화된 항체
키메라 또는 사람화된 항체는 모 마우스 모노클로날 항체보다는 사람에서 덜 면역원성이기 때문에, 이들은 과민증 위험이 훨씬 적게 사람을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
마우스 모노클로날 항체의 가변 Ig 도메인이 사람 불변 Ig 도메인에 융합된 키메라 모노클로날 항체가 당업계에 공지된 표준 과정을 사용하여 제조될 수 있다(문헌참조: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855 (1984); and, Boulianne et al, Nature 312, 643-646, (1984)). 몇몇 키메라 모노클로날 항체는 사람에서 면역원성이 덜하다는 것이 입증되었지만, 마우스 가변 Ig 도메인은 여전히 유의적인 사람 항-마우스 반응을 유발할 수 있다.
사람화된 항체는 예를 들어, 다음을 포함하는 다양한 방법에 의해 성취할 수 있다: (1) 비-사람 상보성 결정 영역(CDR)을 사람 골격 및 불변 영역상으로 이식시키는 것(당업계에서 "CDR 이식"을 통한 사람화로서 언급되는 과정), (2) 전체 비사람 가변 도메인을 이식시키지만 이들의 표면 잔기를 사람형 표면 잔기로 대체하여 사람형 표면을 갖도록 "클로킹"하는 것(당업계에서는 "베니어링"으로서 언급되는 과정), 또는, 대안으로, (3) 항원 결합 또는 단백질 폴딩에 역효과를 미칠 가능성은 없지만 사람 환경에서 면역원성을 감소시킬 가능성이 있는 것으로 결정된 위치에서 사람 아미노산을 대체하는 것(당업계에서 HUMAN ENGINEERING™으로서 언급되는 과정). 본 발명에서, 사람화된 항체는 "사람화된", "베니어링된" 및 "HUMAN ENGINEERED™" 항체 모두를 포함할 것이다. 이들 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31:169-217 (1994); Kettleborough et al., Protein Eng. 4:773-783 (1991); Studnicka et al. U.S. Patent No. 5,766,886; Studnicka et al., (Protein Eng 7: 805-814, 1994), 상기 각각의 문헌은 본원에 참조로서 인용됨]에 기재되어 있다.
유전자전이 동물 기원의 사람 항체
항원에 대한 사람 항체는 또한 어떠한 내인성 면역글로불린 생성을 갖지 않고 사람 면역글로불린 유전자좌를 함유하도록 가공된 유전자전이 동물을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, WO 98/24893은 사람 Ig 유전자좌를 갖는 유전자전이 동물을 기재하고 있고, 여기서, 상기 동물은 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 불활성화로 인해 기능적 내인성 면역글로불린을 생성하지 못함을 기재하고 있다. WO 91/00906은 또한 면역원에 대한 면역반응을 증대시킬 수 있는 유전자전이 비영장류 포유동물 숙주를 기재하고 있고, 여기서, 상기 항체는 영장류 불변 영역 및/또는 가변 영역을 갖고, 내인성 면역글로불린 암호화 유전자좌는 대체되거나 불활성화된다. WO 96/30498 및 미국 특허 제6,091,001호는 변형된 항체 분자를 형성하기 위해 불변 또는 가변 영역의 전부 또는 일부를 대체하는 것과 같은, 포유동물에서 면역글로불린 유전자좌를 변형시키기 위한 Cre/Lox 시스템의 용도를 기재하고 있다. WO 94/02602는 불활성화된 내인성 Ig 유전자좌 및 기능성 사람 Ig 유전자좌를 갖는 비사람 포유동물 숙주를 기재하고 있다. 미국 특허 제5,939,598호는 내인성 중쇄가 부재이고 하나 이상의 이종 불변 영역을 포함하는 외인성 면역글로불린 유전자좌를 발현하는 유전자전이 마우스를 제조하는 방법을 기재하고 있다[문헌참조: 미국 특허 제6,114,598호, 제6,657,103호 및 제6,833,268호].
상기된 유전자전이 동물을 사용하여, 선택된 항원에 대한 면역 반응이 생성될 수 있고 항체 생산 세포는 동물로부터 분리하고 사람 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 면역화 프로토콜, 보조제 등은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, WO 96/33735에 기재된 바와 같은 유전자전이 마우스의 면역화에 사용된다. 상기 공보는 IL-6, IL-8, TNFα, 사람 CD4, L 셀렉틴, gp39, 및 파상풍 독소를 포함하는 다양한 항원에 대한 모노클로날 항체를 기재하고 있다. 상기 모노클로날 항체는 상응하는 단백질의 생물학적 활성 또는 생리학적 효과를 억제하거나 중화시키는 능력에 대해 시험될 수 있다. WO 96/33735는 IL-8로 면역화된 유전자전이 마우스의 면역 세포로부터 유래된 IL-8에 대한 모노클로날 항체가 호중구의 IL-8 유도된 기능을 차단하였음을 기재하고 있다. 유전자전이 동물을 면역화시키는데 사용되는 항원에 대한 특이성을 갖는 사람 모노클로날 항체는 또한 WO 96/34096 및 미국 특허 출원 번호 제20030194404호; 및 미국 특허 출원 번호 제20030031667호에 기재되어 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해 유용한 추가의 유전자전이 동물은 Medarex HuMAb-MOUSE®(미국 특허 제5,770,429호 및 Fishwild, et al. (Nat. Biotechnol. 14:845-851 (1996))을 포함하고, 이는 사람 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 재배열되지 않은 사람 항체 유전자 기원의 유전자 서열을 함유한다. HuMAb-MOUSE®의 면역화는 항원에 대한 완전한 사람 모노클로날 항체를 제조할 수 있게 한다.
또한, 문헌[참조: Ishida et al. (Cloning Stem Cells. 4:91-102 (2002)]은 메가염기 크기의 사람 DNA의 절편을 포함하고 전체 사람 면역글로불린(hIg) 유전자좌가 혼입된 전이염색체 마우스(TransChromo Mouse) (TCMOUSE™)를 기재하고 있다. TCMOUSE™은 IgG(IgG1-G4)의 모든 아부류를 포함하는, hIg의 완전 다양한 레퍼토리를 갖는다. 다양한 사람 항원을 사용한 TCMOUSE™의 면역화는 사람 항체를 포함하는 항체 반응을 생성시킨다.
또한 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); 및 미국 특허 제5,591,669호, 미국 특허 제5,589,369호, 미국 특허 제5,545,807호; 및 미국 특허 공개공보 제20020199213호]을 참조한다. 미국 특허 공개공보 제20030092125호는 동물의 면역 반응을 목적하는 에피토프로 편중시키기 위한 방법을 기재하고 있다. 사람 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 제조할 수 있다(문헌참조: 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호).
디스플레이 기술로부터의 사람 항체
재조합 사람 항체 유전자의 레퍼토리를 제조하기 위한 기술의 개발, 및 필라멘트성 박테리오파아지의 표면상에 암호화된 항체 단편들의 디스플레이는 직접적으로 사람 항체를 제조하기 위한 수단을 제공하였다. 파아지 기술에 의해 제조된 항체는 세균에서 항원 결합 단편-일반적으로 Fv 또는 Fab 단편으로서 제조되고 따라서 이펙터 기능이 부재이다. 이펙터 기능은 2개의 전략중 하나에 의해 도입될 수 있다: 상기 단편은 포유동물 세포에서 발현을 위해 완전한 항체로 또는 이펙터 기능을 유발할 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이특이적 항체 단편으로 가공될 수 있다.
본 발명은 파아지상의 사람 항체 라이브러리를 합성하는 단계, 항원 또는 이의 일부를 사용하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 항원에 결합하는 파아지를 분리하는 단계 및 파아지로부터 항체를 수득하는 단계를 포함하는 항원 특이적 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하기 위한 방법을 고려한다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 기술에 사용하기 위한 항체의 라이브러리를 제조하기 위한 한가지 방법은 사람 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-사람 동물을 항원 또는 이의 항원 결합부로 면역화시켜 면역 반응을 생성시키고, 면역화된 동물로부터 항체 생성 세포를 추출하는 단계; 추출된 세포로부터 RNA를 분리하고 이를 역전사시켜 cDNA를 제조하고 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시키고 cDNA를 파아지 디스플레이 벡터내로 삽입하여 파아지상에 항체를 발현시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 재조합 항원 특이적 항체는 상기 방식으로 수득할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체 생산 세포는 비-면역화된 동물로부터 추출될 수 있고 RNA는 추출된 세포로부터 분리하여 역전사시키므로써 cDNA를 제조하고 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시키고 파아지 디스플레이내로 벡터에 삽입하여 상기 항체가 파아지상에 발현되도록 할 수 있다. 파아지 디스플레이는 필라멘트성 박테리오파아지의 표면상에 항체 레퍼토리를 디스플레이하고 후속적으로 선택된 항원에 결합시킴에 의한 파아지의 선별을 통해 모방 면역 선택을 진행한다. 한가지 상기 기술은 WO 99/10494에 기재되어 있고 이것은 상기 방법을 사용하여 MPL 및 msk 수용체에 대한 고친화성 및 기능적 효능성 항체의 분리를 기재하고 있다. 본 발명의 항체는 사람 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조된 사람 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조된, 재조합 항체 라이브러리, 바람직하게는 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝으로 분할 수 있다. 상기 라이브러리를 제조하고 스크리닝하기 위한 방법은 문헌[참조: 미국 특허 제5,969,108호]에 공지되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위해 시판되는 키트(예를 들어, 제조원: the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 the Stratagene SurfZAP.TM. 파아지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612)가 있다. 또한 항체 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는데 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약이 있다(문헌참조: 예를 들어, Ladner et al. 미국 특허 제5,223,409호; Kang et al. PCT 공개공보 WO 92/18619; Dower et al. PCT 공개공보 WO 91/17271; Winter et al. PCT 공개공보 WO 92/20791; Markland et al. PCT 공개공보 WO 92/15679; Breitling et al. PCT 공개공보 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 공개공보 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 공개공보 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370- 1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982].
하나의 양태에서, 목적하는 결합 특성을 갖는 항원에 특이적인 사람 항체를 분리하기 위해, 사람 VH 및 VL 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 특이성을 갖는 항체 단편을 선택한다. 본 방법에 사용되는 항체 라이브러리는 바람직하게 본원 및 문헌(참조: McCafferty et al., PCT 공개번호 WO 92/01047, McCafferty et al., (Nature 348:552-554 (1990)); and Griffiths et al., (EMBO J 12:725-734 (1993))에 기재된 바와 같이 제조되고 스크리닝된 scFv 라이브러리이다. 상기 scFv 항체 라이브러리는 바람직하게 상기 항원을 사용하여 스크리닝한다.
대안으로, 항체의 Fd 단편(VH-CH1) 및 경쇄(VL-CL)는 PCR에 의해 별도로 클로닝하고 조합적 파아지 디스플레이 라이브러리에서 무작위로 조합하고 이어서 특정 항원에 대해 결합하는 것을 선별할 수 있다. 상기 Fab 단편은 즉, 이들을 암호화하는 유전자에 물리적으로 연결된 파아지 표면상에서 발현시킨다. 따라서, 항원 결합에 의한 Fab의 선별은 후속적으로 증폭될 수 있는 Fab 암호화 서열을 동시에 선별한다. 수회의 항원 결합 및 재증폭을 통해(패닝으로 언급되는 과정), 항원에 특이적인 Fab를 집적시키고 최종적으로 분리한다.
1994년에, "유도된 선별"로 호칭되는 항체의 사람화를 위한 방법이 보고되었다. 유도된 선별은 마우스 모노클로날 항체의 사람화를 위한 파아지 디스플레이 기술력을 사용한다(문헌참조: Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). 이를 위해, 마우스 모노클로날 항체의 Fd 단편은 사람 경쇄 라이브러리와 조합하여 디스플레이될 수 있고 수득한 하이브리드 Fab 라이브러리는 이어서 항원으로 선별될 수 있다. 이로써 마우스 Fd 단편은 선별을 유도하기 위한 주형을 제공한다. 후속적으로, 상기 선별된 사람 경쇄는 사람 Fd 단편 라이브러리와 조합시킨다. 수득한 라이브러리의 선별은 완전한 사람 Fab를 생성시킨다.
다양한 과정들이 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 사람 항체를 유도하기 위해 보고되었다(문헌참조: 예를 들어, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호; Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). 특히, 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 항체의 시험관내 선별 및 전개는 강력한 도구가 되었다(문헌참조: Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); 미국 특허 공개공보 제20020004215호 및 WO 92/01047; 미국 특허 공개공보 제20030190317호; 및 미국 특허 제6,054,287호 및 제5,877,293호).
문헌[참조: Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178:187-193 (2002), 및 2003년 3월 6일자로 공개된 미국 특허 공개공보 제20030044772호]은 포획 리프트에 의한 파아지 발현된 항체 라이브러리 또는 기타 결합 분자를 스크리닝하기 위한 방법을 기재하고 있고 상기 방법은 고형 지지체상에 후보 결합 분자를 고정화시킴을 포함한다.
Fv 단편은 가용성 단편으로서 발현된 상보적 쇄와의 파아지 단백질 융합체로서 (예를 들어, M13 유전자 III과 함께) 발현된 하나의 쇄의 연합에 의해 파아지의 표면상에 디스플레이된다. 상기 파아지는 부류 I 파아지중 하나와 같은 필라멘트성 파아지일 수 있는 것으로 고려된다: fd, M13, fl, Ifl, Ike, ZJ/Z, Ff 및 부류 II 파아지 Xf, Pfl 및 Pf3 중 하나. 상기 파아지는 M13, 또는 fd 또는 이의 유도체일 수 있다.
초기 사람 VL 및 VH 절편이 선택되면, "믹스 및 매치" 실험(여기서, 처음에 선택된 VL 및 VH 절편의 상이한 쌍들이 항원 결합에 대해 스크리닝된다)을 수행하여 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택할 수 있다. 추가로, 항체의 질을 추가로 개선시키기 위해, 바람직한 VL/VH 쌍의 VL 및 VH 절편은 바람직하게 천연 면역 반응 동안에 항체의 친화성 성숙화에 관여하는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 방식으로 VH 및/또는 VL의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역 중 어느 하나에 무작위로 돌연변이시킬 수 있다. 이러한 시험관내 친화성 성숙화는 각각 VH CDRl, CDR2, 및 CDR3, 또는 VL CDRl, CDR2, 및 CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VL 및 VH 영역을 증폭시켜 성취할 수 있고, 상기 프라이머는 특정 위치에서 4개의 뉴클레오타이드 염기의 무작위 혼합물과 함께 "스파이킹"되어 있어 수득한 PCR 생성물은 무작위 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 영역으로 도입된 VL 및 VH 절편을 암호화한다. 이들 무작위로 돌연변이된 VL 및 VH 절편은 항원에 결합하는 것에 대해 재스크리딩할 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 항원 특이적 항체의 스크리닝 및 분리 후, 선택된 항체를 암호화하는 핵산은 디스플레이 팩키지(예를 들어, 파아지 게놈으로부터)로부터 회수될 수 있고 표준 재조합 DNA 기술에 의해 다른 발현 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 경우에 따라, 상기 핵산은 하기된 바와 같이 본 발명의 다른 항체 형태를 생성하도록 추가로 조작될 수 있다. 조합적 라이브러리의 스크리닝에 의해 분리된 재조합 사람 항체를 발현하기 위해, 항체를 암호화하는 DNA를 재조합 발현 벡터에 클로닝하고 본원에 기재된 바와 같은 포유동물 숙주 세포에 도입한다.
파아지 디스플레이 방법은 세균 또는 숙주 세포의 돌연변이유발 균주에서 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 돌연변이유발 균주는 여기에 복제되는 DNA가 이의 모 DNA와 관련하여 돌연변이되도록 하는 유전자 결함을 갖는 숙주 세포이다. 돌연변이유발 균주의 예는 NR9046mutD5 및 NR9046 mut T1이다.
또한, 파아지 디스플레이 방법은 헬퍼 파아지를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 이것은 결함 파이지 게놈을 함유하는 세포를 감염시키 위해 사용되고 결함을 보충하는 작용을 하는 파아지이다. 상기 결함 파아지 게놈은 제거된 유전자 서열을 암호화하는 몇몇 기능을 갖는 파아지미드 또는 파아지일 수 있다. 헬퍼 파아지의 예는 M13K07, M13K07 유전자 III 3번, 하이퍼파아지, 및 캡시드 단백질에 융합된 결합 분자를 디스플레이하거나 암호화하는 파아지이다.
또한, 항체는 H 또는 L 쇄 클론을 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 쇄(L 또는 H)를 암호화하는 완전한 라이브러리의 클론을 감염시키는데 사용되는 WO92/01047에 기재된 바와 같은 등급화된 이원 조합 방법을 사용하는 파아지 디스플레이 스크리닝 방법을 통해 제조될 수 있고 수득한 2개의 쇄 특이적 결합 구성원은 본원에 기재된 것들과 같은 파아지 디스플레이 기술에 따라 선택된다. 이러한 기술은 또한 문헌(참조: Marks et al, (Bio/Technology, 10:779-783 (1992))에 기재되어 있다.
바이러스, 효모, 미토콘드리아 및 포유동물 세포의 표면상에 폴리펩타이드를 디스플레이하는 방법을 또한 사용하여 항원 특이적 항체를 동정하였다[문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,348,867호; 제5,723,287호; 제6,699,658호; Wittrup, Curr Op. Biotech. 12:395-99 (2001); Lee et al, Trends in Biotech. 21(1) 45-52 (2003); Surgeeva et al, Adv. Drug Deliv. Rev. 58: 1622-54 (2006)]. 항체 라이브러리는 아글루티닌과 같은 효모 단백질에 부착시킬 수 있고 면역계내 B 세포에 의한 항체의 세포 표면 디스플레이를 효과적으로 모방할 수 있다.
파아지 디스플레이 방법에 추가로, 항체는 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이를 포함하는 시험관내 방법을 사용하여 분리할 수 있다(문헌참조: Amstutz et al, Curr. Op. Biotech. 12: 400-05 (2001)). 리보솜 디스플레이를 사용하는 폴리펩타이드의 선별은 문헌[참조: Hanes et al., (Proc. Natl Acad Sci USA, 94:4937-4942 (1997))] 및 미국 특허 제5,643,768호 및 제5,658,754호(가와사키(Kawasaki)에게 허여됨)에 기재되어 있다. 리보솜 디스플레이는 또한 항체의 신속한 대규모 돌연변이 분석을 위해 유용하다. 선택적 돌연변이 유발 방법은 또한 리보솜 디스플레이 기술을 사용하여 선택될 수 있는 개선된 활성을 갖는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
변화된 당화
모 항체에 비해 변형된 당화 패턴을 갖는 항체 변이체는 또한 예를 들어, 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고/시키거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 부가하여 제조할 수 있다.
항체의 당화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된이란, 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 탄수화물 잔기의 접착을 언급한다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 잔기의 효소적 접착을 위한 인지 서열이다. 폴리펩타이드내 이들 트리펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성시킨다. 따라서, N-연결된 당화 부위는 아미노산 서열을 변형시켜 이것이 이들 트리펩타이드 서열중 하나 이상을 함유하도록 함에 의해 항체에 부가될 수 있다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스중 하나를 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌으로 접착시킴을 언급하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다. O-연결된 당화 부위는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 항체의 서열에 삽입하거나 대체시킴에 의해 항체에 부가될 수 있다.
Fc 글리칸은 IgG의 Fc 수용체 및 C1q로의 결합에 영향을 주고 따라서 IgG 이펙터 기능에 중요하다. 변형된 Fc 글리칸 및 변화된 이펙터 기능을 갖는 항체 변이체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 시알산, 코어 푸코스, 이등분 N-아세틸글루코사민 및 만노스 잔기와 같은 변형된 말단 당을 갖는 항체는 FcγRIIIa 수용체 및 변화된 ADCC 활성에 결합하도록 변형시킬 수 있다. 추가의 예에서, 변형된 말단 갈락토스를 갖는 항체는 C1q에 대해 변화된 결합 및 변화된 CDC 활성을 가질 수 있다(문헌참조: Raju, Curr. Opin. Immunol. 20: 471-78 (2008)).
또한, 푸코실화가 부재이거나 감소되어 개선된 ADCC 활성을 나타내는 항체 분자가 고려된다. 이를 성취하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, ADCC 이펙터 활성은 FcγRIII 수용체로의 항체 분자의 결합에 의해 매개되고 이것은 CH2 도메인의 Asn-297에서 N-연결된 당화의 탄수화물 구조에 의존하는 것으로 나타났다. 비-푸코실화된 항체는 증가된 친화성으로 상기 수용체에 결합하고 천연 푸코실화된 항체보다 효율적으로 FcγRIII 매개된 이펙터 기능을 유발한다. 예를 들어, CHO 세포(여기서, 알파-1,6-푸코실 트랜스퍼라제 효소는 녹아웃 되어 있다)에서 비-푸코실화된 항체의 재조합 생성으로 100배 증가된 ADCC 활성을 갖는 항체가 수득된다(문헌참조:Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 87:614-22 (2004)). 유사한 효과는 푸코실화 경로에서 상기 또는 다른 효소의 활성을 감소시킴을 통해, 예를 들어, siRNA 또는 안티센스 RNA 처리, 상기 효소를 녹아웃 시키기 위해 세포주를 가공하는 것 또는 선택적 당화 억제제와 함께 배양함을 통해 성취할 수 있다(문헌참조: Rothman et al., Mol Immunol. 26:1113-23 (1989)). 일부 숙주 세포주, 예를 들어, Lec13 또는 랫트 하이브리도마 YB2/0 세포주는 천연적으로 보다 낮은 푸코실화 수준을 갖는 항체를 생성한다(문헌참조: Shields et al., J Biol Chem. 277:26733-40 (2002); Shinkawa et al., J Biol Chem. 278:3466-73 (2003)). 예를 들어, GnTIII 효소를 과발현하는 세포에서 항체를 재조합적으로 생성함을 통해 이등분된 탄수화물 수준의 증가는 또한 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 측정되었다(문헌참조: Umana et al., Nat Biotechnol. 17:176-80 (1999)). 2개의 푸코스 잔기들 중 하나라도 부재이면 ADCC 활성을 증가시키기에 충분할 수 있을 것으로 예측되었다(문헌참조: Ferrara et al., Biotechnol Bioeng. 93:851-61 (2006)).
변화된 이펙터 기능을 갖는 변이체
항체의 또 다른 변형이 고려된다. 하나의 측면에서, 이펙터 기능과 관련하여, 예를 들어, 암을 치료하는데 있어서 항체의 효과를 증진시키기 위해 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다(문헌참조: Natsume et al, Drug Design Dev't & Ther. 3: 7-16 (2009). 예시적인 이펙터 기능은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR) 등을 포함한다. 이펙터 기능을 변형시키기 위한 한가지 방법은 시스테인 잔기가 Fc 영역에 도입됨으로써 상기 영역에서 쇄 상호간 디설파이드 결합 형성을 가능하게 할 수 있음을 교시한다. 따라서 제조된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포 독성(ADCC)을 가질 수 있다(문헌참조: Caron et al., (J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)) and Shopes, B. (J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)). 증진된 항종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 문헌(참조: Wolff et al., (Cancer Research 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 바와 같은 이종이기능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수 있다. 대안으로, 항체는 이원 Fc 영역을 가짐으로써 증진된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있도록 가공될 수 있다[문헌참조: Stevenson et al., (Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)). 추가로, CDR내 서열은 항체가 MHC 부류 II에 결합할 수 있도록 하여 원치않는 헬퍼 T-세포 반응을 유발하는 것으로 나타났다. 보존성 치환은 항체가 결합 활성을 보유하고 있지만 원치않는 T 세포 반응을 유발하는 능력을 상실시킬 수 있고, 쥐 가변 영역이 사람 감마 1, 감마 2, 감마 3 및 감마 4 불변 영역과 연결되어 있는 키메라 항체를 기재하고 있는 문헌( Steplewski et al., (Proc Natl Acad Sci U S A. 85:4852-56 (1998))을 참조한다.
본 발명의 특정 양태에서, 예를 들어, 종양 침투를 증가시키기 위해 온전한 항체 보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우에, 예를 들어, PEG 또는 다른 수용성 중합체(폴리사카라이드 중합체를 포함하는)와 같은 분자를 항체 단편에 부가하여 반감기를 증가시킴에 의해 이의 혈청 반감기가 증가되도록 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 또한 예를 들어, 구제 수용체 결합 에피토프를 항체 단편에 혼입하여(예를 들어, 항체 단편내 적당한 영역의 돌연변이에 의해 또는 에피토프를 펩타이드 태그에 혼입시키고 이어서 어느 한 말단에 또는 중간에서 항체 단편과 융합되도록 함에 의해, 예를 들어, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해) 성취될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, W096/32478).
상기 구제 수용체 결합 에피토프는 바람직하게 Fc 도메인의 1개 또는 2개 루프로부터 어느 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 단편의 유사한 위치로 이동한 영역을 구성한다. 보다 더 바람직하게, Fc 도메인의 1개 또는 2개 루프로부터 3개 이상의 잔기가 이동한다. 여전히 보다 바람직한 것은 상기 에피토프가 Fc 영역(예를 들어, IgG의)의 CH2 도메인으로부터 취하여 항체의 CH1, CH3 또는 VH 영역 또는 하나 이상의 상기 영역으로 이동시키는 것이다. 대안으로, 상기 에피토프는 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 취하여 항체 단편의 CL 영역 또는 VL 영역 또는 이 둘다로 이동시키는 것이다. Fc 변이체 및 이의 구제 수용체와의 상호작용을 기재하고 있는 문헌[국제 출원 WO 97/34631 및 WO 96/32478]을 참조한다.
따라서, 본 발명의 항체는 사람 Fc 부분, 사람 컨센서스 Fc 부분, 또는 디설파이드 결합에 관여하는 시스테인이 변형되거나 제거되고/되거나 met가 N-말단에 부가되고/되거나 N-말단의 20개 아미노산 중 하나 이상이 제거되고/되거나 C1q 결합부와 같은 보체와 상호작용하는 능력이 제거되고/되거나 ADCC 부위가 제거된 변이체를 포함하는, 수용체와 상호작용하는 능력을 보유하는 이의 변이체를 포함할 수 있다[문헌참조: Sarmay et al., Molec. Immunol. 29:633-9 (1992)].
이전의 연구는 주로 IgG 잔기 233 내지 239로 구성된 하부 힌지 영역으로 FcR에 대한 사람 및 쥐 IgG상의 결합 부위를 맵핑하였다. 다른 연구는 추가의 광범위한 절편, 예를 들어, 사람 Fc 수용체 I에 대해 Gly316-Lys338, 사람 Fc 수용체 III에 대해 Lys274-Arg301 및 Tyr407-Arg416, 또는 하부 힌지 외부에서 발견되는 몇개의 특이적 잔기, 예를 들어, 쥐의 Fc 수용체 II와 상호작용하는 쥐 IgG2b에 대한 Asn297 및 Glu318을 제안하였다. 사람 Fc 수용체 IIIA와 함께 사람 IgG1 Fc 단편의 3.2-A 결정 구조물의 보고는 Fc 수용체 IIIA에 결합하는데 관여하는 것으로서 IgG1 잔기 Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, 및 Ala327-Ile332를 기재하였다. 이것은 결정 구조를 기초로 하부 힌지 (Leu234-Gly237) 뿐만 아니라 IgG CH2 도메인 루프 FG (잔기 326-330) 및 BC (잔기 265-271)의 잔기들이 Fc 수용체 IIA에 결합하는데 역할을 수행할 수 있음을 시사하는 것이다[문헌참조: Shields et al., (J. Biol. Chem., 276:6591-604 (2001) 이의 전문이 본원에 참조로서 인용됨). Fc 수용체 결합 부위내 잔기의 돌연변이로 변화된 ADCC 또는 CDC 활성 또는 변화된 반감기와 같은 변화된 이펙터 기능을 수득할 수 있다. 상기된 바와 같이, 잠재적인 돌연변이는 알라닌으로의 치환, 보존성 치환, 비-보존성 치환 또는 상이한 IgG 아부류 기원의 동일한 위치에서 상응하는 아미노산 잔기로의 대체(예를 들어, IgG1 잔기를 상기 위치에서 상응하는 IgG2 잔기로 대체하는 것)를 포함하는, 하나 이상의 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
문헌[참조: Shields et al]은 모든 사람 Fc 수용체에 결합하는데 관여하는 IgG1 잔기들은 힌지 영역에 인접한 CH2 도메인에 위치하고 하기와 같이 2개의 카테고리에 속함을 보고하였다: 1) 모든 FcR과 직접적으로 작용할 수 있는 위치는 Leu234-Pro238, Ala327, 및 Pro329 (및 가능하게는 Asp265)를 포함하고; 2) 탄수화물 성질 또는 위치에 영향을 주는 위치는 Asp265 및 Asn297을 포함한다. Fc 수용체 II로의 결합에 영향을 주는 추가의 IgG1 잔기는 다음과 같다: (가장 큰 효과) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, 및 (보다 적은 효과) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378, 및 Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A 및 D270A는 결합을 감소시켰다. 모든 FcR에 대한 상기 동정된 잔기들 이외에, Fc 수용체 IIIA로의 결합을 40% 이상으로 감소시키는 추가의 IgG1 잔기들은 다음과 같다: Ser239, Ser267 (Gly 유일), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, 및 Asp376. FcRIIIA로의 결합을 개선시키는 변이체는 T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, 및 A339T를 포함한다. Lys414는 FcRIIA 및 FcRIIB에 대한 결합에서 40% 감소를 보여주고, Arg416은 FcRIIA 및 FcRIIIA에 대해 30% 감소를 부여주고, Gln419는 FcRIIA에 대해 30% 감소 및 FcRIIB에 대해 40% 감소를 보여주고, Lys360은 FcRIIIA에 대해 23% 개선시켰다[문헌참조: Presta et al., (Biochem. Soc. Trans. 30:487-490, 2001), 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되고, 이는 특이적 Fc 감마 (R)로만의 결합을 개선시키거나 하나의 유형의 Fc 감마 R로만으로의 결합을 동시에 개선시키고 또 다른 유형으로의 결합을 감소시키는 것으로 밝혀진 IgG1 Fc 영역에서 여러 위치들을 기재하고 있다]. 이어서 Fc 감마 RIIIa로의 개선된 결합을 갖는 선택된 IgG1 변이체는 시험관내 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 분석에서 시험하였고 말초 혈액 단핵 세포 또는 천연 킬러 세포가 사용되는 경우 ADCC를 증진시킴을 보여주었다.
예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,194,551호는 아미노산 위치 329, 331 또는 322 (캐뱃 넘버링을 사용하여)에서 사람 IgG Fc 영역에 돌연변이를 함유하는 변화된 이펙터 기능을 갖는 변이체를 기재하고 있고 이의 일부는 감소된 C1q 결합 또는 CDC 활성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,737,056호는, 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 (캐뱃 넘버링을 사용하여)에서, 사람 IgG Fc 영역에서 돌연변이를 함유하는 변화된 이펙터 또는 Fc-감마-수용체 결합을 갖는 변이체를 기재하고 이의 일부는 감소된 ADCC 또는 CDC 활성과 관련된 수용체 결합 프로필을 나타낸다. 물론, 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 327 또는 329에서 돌연변이는 FcRI로의 결합을 감소시키고 아미노산 위치 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 또는 439에서의 돌연변이는 FcRII로의 결합을 감소시키고 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 또는 437에서의 돌연변이는 FcRIII로의 결합을 감소시키는 것으로 기재되어 있다.
이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,624,821호는 쥐 항체의 C1q 결합 활성이 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320 또는 322번을 돌연변이시킴에 의해 변화될 수 있고 잔기 297(Asn)의 대체가 용해 활성을 제거하는 것으로 보고하고 있다.
이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 공개공보 제20040132101호는 아미노산 위치 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, 또는 332 (캐뱃 넘버링을 사용하여) 또는 위치 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, 또는 332 (캐뱃 넘버링을 사용하여)에서의 돌연변이를 갖는 변이체를 기재하고 있고, 이중에서 위치 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, 또는 332에서의 돌연변이가 ADCC 활성을 감소시킬 수 있거나 Fc 감마 수용체로의 결합을 감소시킬 수 있음을 기재하고 있다.
이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 문헌(참조: Chappel et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 88:9036-40 (1991))은 IgG1의 세포친화성 활성이 이의 중쇄 CH2 도메인의 고유 성질임을 보고한다. IgG1의 아미노산 잔기 234 내지 237중 어느 하나에서의 단일 점 돌연변이는 이의 활성을 상당히 감소시키거나 제거하였다. IgG1 잔기 234 내지 237(LLGG) 모두를 IgG2 및 IgG4로의 치환은 완전한 결합 활성을 복구시키는데 요구되었다. 전체 ELLGGP 서열(잔기 233-238)을 함유하는 IgG2 항체는 야생형 IgG1보다 활성인 것으로 관찰되었다.
이의 전문이 참조로서 인용되는 문헌(참조: Isaacs et al. (J Immunol. 161:3862-9 (1998))은 Fc 감마 R 결합에 중요한 모티프내 돌연변이(글루타메이트 233이 프롤린으로, 류신/페닐알라닌 234가 발린으로 및 류신 235가 알라닌으로)는 표적 세포의 고갈을 완전히 차단하였음을 보고한다. 글루타메이트 318의 알라닌으로의 돌연변이는 마우스 IgG2b의 이펙터 기능을 제거하였고 또한 사람 IgG4의 효능을 감소시켰다.
이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 문헌(참조: Armour et al. (Mol Immunol. 40:585-93 (2003))은 야생형 IgG1보다 적어도 10배 미만으로 활성화 수용체, Fc 감마RIIa와 반응하지만 억제 수용체 Fc감마RIIb로의 결합이 단지 4배 감소되는 IgG1 변이체를 동정하였다. 돌연변이는 아미노산 233 내지 236의 범위 및/또는 아미노산 위치 327, 330 및 331에 생성시켰다[문헌참조: 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 WO 99/58572].
이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 문헌(참조: Xu et al. (J Biol Chem. 269:3469-74 (1994))은 IgG1 Pro331의 Ser로의 돌연변이가 C1q 결합을 현저시 감소시키고 실질적으로 용해 활성을 제거했음을 보고한다. 반대로, IgG4에서 Ser331의 Pro로의 대체는 IgG4 Pro331 변이체에게 부분적 용해 활성(40%)을 부여하였다.
이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 문헌(참조: Schuurman et al. (Mol Immunol. 38:1-8 (2001))은 중쇄간 결합 형성에 관여하는 힌지 시스테인중 하나 Cys226의 세린으로의 돌연변이가 보다 안정한 중쇄간 연결을 유도하였음을 보고한다. IgG4 힌지 서열 Cys-Pro-Ser-Cys의 IgG1 힌지 서열 Cys-Pro-Pro-Cys로의 돌연변이는 또한 중쇄간의 공유 상호작용을 현저히 안정화시킨다.
이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 문헌(참조: Angal et al. (Mol Immunol. 30:105-8 (1993))은 IgG4의 아미노산 위치 241에서 세린의 프롤린으로의 돌연변이(IgG1 및 IgG2의 상기 위치에서 발견됨)가 본래의 키메라 IgG4와 비교하여 반감기를 연장시키고 조직 분포를 개선시킬 뿐만 아니라 균일한 항체의 제조를 유도함을 보고한다.
공유 변형
본 발명의 폴리펩타이드 결합제, 예를 들어 항체의 공유적 변형은 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 이들은 경우에 따라 화학적 합성 또는 폴리펩타이드 결합제의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩타이드 결합제의 다른 유형의 공유적 변형은 폴리펩타이드 결합제의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴에 의해 상기 분자에 도입한다.
시스테이닐 잔기는 가장 일반적으로 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트(및 상응하는 아민)와 반응시켜 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 수득한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, 알파-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시켜 유도체화한다.
히스티딜 잔기는 상기 제제가 히스티딜 측쇄에 비교적 특이적이기 때문에 pH 5.5 내지 7.0에서 디에틸피로카보네이트와 반응시켜 유도체화한다. 파라-브로모펜아실 브로마이드가 또한 유용하고; 상기 반응은 바람직하게 pH 6.0에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트중에서 수행한다.
라이시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응시킨다. 이들 제제를 사용한 유도체화는 라이시닐 잔기의 변화를 역전시키는 효과를 갖는다. 알파-아미노-함유 잔기를 유도체화하기 위한 다른 적합한 시약은 이미도에스테르, 예를 들어, 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로벤젠설폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트를 사용한 트랜스아미나제 촉매된 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 이들 중에서 하나 또는 수개의 통상적인 시약, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온 및 닌하이드린과 반응시켜 변형시킨다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 반응이, 구아니딘 기능성 그룹의 높은 pKa 때문에 알칼린 조건하에서 수행할 필요가 있다. 추가로, 이들 시약은 아르기닌 엡실론 아미노 그룹 뿐만 아니라 라이신 그룹과 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적 변형은, 특히 흥미롭게도 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 스펙트럼 표지를 티로실 잔기에 도입하기 위해 수행할 수 있다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성한다. 티로실 잔기는 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화시켜 방사선면역분석에 사용하기 위해 표지된 단백질을 제조한다.
카복실 측쇄 그룹(아스파르틸 또는 글루타밀)은 카보디이미드(R-N=C=N-R')(여기서, R 및 R'는 상이한 알킬 그룹, 예를 들어, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드이다)와 반응시켜 선택적으로 변형시킨다. 추가로, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과 반응시켜 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환시킨다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 각각 흔히 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화시킨다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건하에 탈아미드화시킨다. 이들 잔기의 탈아미드화된 형태는 본 발명의 범위내에 포함된다.
다른 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 그룹의 메틸화(문헌참조: T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실 그룹의 아미드화를 포함한다.
또 다른 유형의 공유적 변형은 글리코사이드를 폴리펩타이드 결합제와 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시킴을 포함한다. 이들 과정들은 이들이 N- 또는 O- 연결된 당화에 대한 당화 능력을 갖는 숙주 세포에서 폴리펩타이드 결합제의 생산을 필요로 하지 않는다는 점에 유리하다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실 그룹, (c) 유리 설프하이드릴 그룹(예를 들어, 시스테인의 것들), (d) 유리 하이드록실 그룹(예를 들어, 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 것들), (e) 방향족 잔기(예를 들어, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것들) 또는 (f) 글루타민의 아미드 그룹에 부착될 수 있다. 이들 방법은 문헌[참조: WO87/05330 및 Aplin and Wriston, (CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981))]에 기재되어 있다.
폴리펩타이드 결합제상에 존재하는 임의의 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 성취될 수 있다. 화학적 탈당화는 폴리펩타이드 결합제가 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 등가 화합물에 노출되는 것을 요구한다. 이러한 처리는 연결된 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분 또는 모든 당의 절단을 유도하고 폴리펩타이드 결합제를 온전하게 잔류시킨다. 화학적 탈당화는 문헌[참조: Hakimuddin, et al., (Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987)) 및 Edge et al., (Anal. Biochem. 118: 131 (1981))]에 기재되어 있다. 폴리펩타이드 결합제상의 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 문헌[참조: Thotakura et al., (Meth. Enzymol. 138: 350 (1987))]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 성취할 수 있다.
폴리펩타이드 결합제의 또 다른 유형의 공유적 변형은 다양한 소수성 잔기 또는 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리옥시에틸화된 소르비톨, 폴리옥시에틸화된 글루코스, 폴리옥시에틸화된 글리세롤, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리사카라이드 중합체(예를 들어, 덱스트란) 중 하나로 폴리펩타이드 결합제를 연결시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 문헌에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호, 제4,179,337호, 제4,766,106호, 제4,179,337호, 제4,495,285호, 제4,609,546호 또는 EP 제315 456호]을 참조한다.
유도체
유도체는 유비퀴틴화, 표지화(예를 들어, 방사능핵종 또는 다양한 효소를 사용한), 페길화(폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도체화)와 같은 공유 중합체 접착 및 오르니틴과 같은 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기술에 의해 화학적으로 변형된 항체를 포함하는 폴리펩타이드 결합제를 언급한다. 항체와 같은 본 발명의 폴리펩타이드 결합제의 유도체는 또한 치료학적 제제로서 사용될 수 있고 본 발명의 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 접합된 잔기는 공유적으로 또는 이온, 반데르 발스 또는 수소 결합을 통해, 예를 들어, 방사능활성 뉴클레오타이드 또는 스트렙타바딘에 의해 인지되는 비오티닐화된 뉴클레오타이드의 혼입과 같이 폴리펩타이드 결합제에 혼입되거나 부착될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 폴리펩타이드 결합제에 부착시켜 보다 긴 생체내 반감기를 제공할 수 있다. PEG 그룹은 임의의 간편한 분자량일 수 있고 직쇄 또는 측쇄일 수 있다. PEG의 평균 분자량은 바람직하게 2 킬로돌턴("kD") 내지 약 100 kDa, 보다 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 가장 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa의 범위이다. PEG 그룹은 일반적으로 PEG 잔기상의 천연 또는 가공된 반응성 그룹(예를 들어, 알데하이드, 아미노, 티올 또는 에스테르 그룹)을 통한 폴리펩타이드 결합제상의 반응성 그룹(예를 들어, 알데하이드, 아미노, 또는 에스테르 그룹)에 대한 아실화 또는 환원 알킬화를 통해 본 발명의 폴리펩타이드 결합제에 부착된다. 폴리펩타이드 결합제로의 PEG 잔기의 부가는 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 문헌[예를 들어, 국제공개공보 WO 96/11953 및 미국 특허 제 4,179,337호]을 참조한다.
PEG와 폴리펩타이드 결합제의 연결은 수성상에서 수행하고 역상 분석 HPLC에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다. 페길화된 물질은 정제용 HPLC로 정제하고 분석 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저 탈착 질량 분광측정기에 의해 특성 분석한다.
항체 접합체
폴리펩타이드 결합제는 이의 "나출된" 또는 비접합된 형태로 투여될 수 있거나, 다른 치료제 또는 진단제에 직접 접합될 수 있거나, 다른 치료제 또는 진단제를 포함하는 캐리어 중합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 폴리펩타이드 결합은 화학치료제, 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편), 또는 방사능 동위원소(즉, 방사능접합체)와 같은 세포독성제에 접합된다. 적합한 화학치료제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신(문헌참조: Rowland et al., (1986) supra)을 포함한다. 적합한 독소는 세균 독소(예를 들어, 디프테리아 독소); 식물 독소(예를 들어, 리신); 소분자 독소(예를 들어, 겔다나마이신(문헌참조: Mandler et al J. Natl. Cancer Inst. 92(19):1573-81 (2000); Mandler et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13.786-91 (2002)), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-23 (1996))), 아우리스타틴(문헌참조: Doronina et al., Nat. Biotech. 21: 778-84 (2003) 및 칼리케아미신(Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993))을 포함한다.
폴리펩타이드 결합제는 방사능동위원소, 친화성 표지(예를 들어, 비오틴, 아비딘 등), 효소적 표지(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 등), 형광성 또는 발광성 또는 생발광성 표지 (예를 들어, FITC 또는 로다민 등), 상자성체 원자 등의 사용을 통해 검출가능하게 표지될 수 있다. 상기 표지화를 성취하기 위한 과정은 당업계에 널리 공지되어 있고; 예를 들어, 문헌[(Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976))]을 참조한다.
폴리펩타이드 결합제 잔기의 접합은 문헌[참조: 미국 특허 제6,306,393호]에 기재되어 있다. 일반적 기술은 또한 문헌[참조: Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); 및 Shih et al., 미국 특허 제5,057,313호]에 기재되어 있다. 이러한 일반적인 방법은 하나 이상의 유리 아민 관능기를 갖고 다수의 약물, 독소, 킬레이터, 붕소 애드엔드(addend) 또는 기타 치료제가 로딩되는 캐리어 중합체와 산화된 탄수화물 부분을 갖는 폴리펩타이드 결합제 성분을 반응시킴을 포함한다. 상기 반응은 2급 아민으로 환원시켜 안정화되어 최종 접합체를 형성할 수 있는 초기 쉬프 염기(이민) 연결을 생성시킨다.
캐리어 중합체는 예를 들어, 50개 이상의 아미노산 잔기의 아미노덱스트란 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 약물 또는 기타 제제를 캐리어 중합체에 접합시키기 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 폴리펩타이드 캐리어가 아미노덱스트란 대신 사용될 수 있지만 상기 폴리펩타이드 캐리어는 쇄에 50개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 100개 내지 5000개의 아미노산 잔기를 가져야만 한다. 아미노산의 적어도 일부는 라이신 잔기 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기이어야만 한다. 라이신 잔기의 펜던트 아민 및 글루타민 및 아스파르테이트의 펜던트 카복실레이트는 약물, 독소, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 애드엔드 또는 다른 치료학적 제제를 부착시키기에 편하다. 적합한 폴리펩타이드 캐리어의 예는 폴리라이신, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 이의 공중합체 및 이들 아미노산 및 기타, 예를 들어, 세린의 혼합 중합체를 포함하고 이는 수득한 로딩된 캐리어 및 접합체상에 목적하는 가용성 성질을 부여한다.
대안으로, 접합된 폴리펩타이드 결합제는 치료제와 폴리펩타이드 결합제 성분을 직접 접합시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 일반적인 과정은 치료제가 산화된 폴리펩타이드 결합제 성분에 직접 부착되는 것을 제외하고는 접합의 간접적 방법과 유사하다. 예를 들어, 폴리펩타이드 결합제의 탄수화물 잔기는 폴리에틸렌글리콜에 부착되어 반감기를 연장시킬 수 있다.
대안으로, 치료제는 디설파이드 결합 형성을 통해 또는 이종이기능성 가교결합제, 예를 들어, N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)를 사용하여 환원된 항체 성분의 힌지 영역에서 부착시킬 수 있다[문헌참조: Yu et al., Int. J. Cancer56:244 (1994)]. 당해 접합을 위한 일반적인 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 문헌[예를 들어, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)]을 참조한다. 다양한 이기능성 단백질 커플링제가 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타렐데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)이 있다.
항체 융합 단백질
항체 융합 단백질을 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다[문헌참조: 예를 들어 미국 특허 제6,306,393호]. 인터류킨-2 잔기를 포함하는 항체 융합 단백질은 문헌[참조: Boleti et al., Ann. Oncol. 6:945 (1995), Nicolet et al., Cancer Gene Ther. 2:161 (1995), Becker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank et al., Clin. Cancer Res. 2:1951 (1996), and Hu et al., Cancer Res. 56:4998 (1996)]에 기재되어 있다. 또한 문헌[참조: Yang et al., (Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995))]은, F(ab')2 단편 및 종양 괴사 인자 알파 잔기를 포함하는 융합 단백질을 기재하고 있다. 항체 융합 단백질의 추가의 예는 문헌[참조: Pastan et al, Nat. Reviews Cancer 6: 559-65 (2006)]에 기재되어 있다.
재조합 분자가 하나 이상의 항체 성분 및 독소 또는 화학치료제를 포함하는 항체-독소 융합 단백질의 제조 방법은 또한 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 항체-슈도모나스 외독소 A 융합 단백질은 문헌[참조: Chaudhary et al., Nature 339:394 (1989), Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991), Batra et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992), Friedman et al., J. Immunol. 150:3054 (1993), Wels et al., Int. J. Can. 60:137(1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan et al., Biochemistry 35:2872(1996), and Schmidt et al., Int. J. Can. 65:538 (1996)]에 기재되어 있다. 디프테리아 독소 잔기를 함유하는 항체-독소 융합 단백질은 문헌[참조: Kreitman et al., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson et al., J. Biol. Chem. 270:28037 (1995), and Vallera et al., Blood 88:2342 (1996)]에 기재되어 있다. 문헌[참조: Deonarain et al., Tumor Targeting 1:177 (1995)]은 RNase 잔기를 갖는 항체-독소 융합 단백질을 기재하고 있고 문헌[참조: Linardou et al., Cell Biophys. 24-25:243 (1994)]은 DNase I 성분을 포함하는 항체-독소 융합 단백질을 제조하였다. 겔로닌은 문헌[참조: Wang et al., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. 2-6, 1995, Part 1, BIOT005]의 항체-독소 융합 단백질에서 독소 잔기로서 사용되었다. 추가의 예로서, 문헌[참조: Dohlsten et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994)]은 스타필로코칼 엔테로독소-A를 포함하는 항체-독소 융합 단백질을 보고하였다.
상기 융합 단백질의 제조에 적합하게 사용되는 독소의 예는 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, DNase I, 스타필로코칼 엔테로독소-A, 미국자리공 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소이다[문헌참조: 예를 들어, Pastan et al., Cell 47:641 (1986), and Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994)]. 다른 적합한 독소는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 항체는 또한 항체를, 프로드럭(예를 들어, 펩티딜 화학치료제, 예를 들어, WO81/01145)을 활성 항암 약물로 전환시키는 프로드럭-활성화 효소에 접합시킴에 의해 ADEPT에서 사용될 수 있다[문헌참조: 예를 들어, WO88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호].
ADEPT를 위해 유용한 면역접합체의 효소 성분은 이를 보다 활성 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 프로드럭상에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
본 발명에 유용한 효소는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
알칼린 포스파타제; 아릴설파타제; 시토신 데아미나제, 5-플루오로우라실; 프로테아제, 예를 들어, 세라티아 프로테아제, 써모라이신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카뎁신(예를 들어, 카뎁신 B 및 L); D-알라닐카복시펩티다제; 탄수화물 절단 효소, 예를 들어, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락타마제; 및 페니실린 아미다제, 예를 들어, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제. 대안으로, 또한 당업계에 공지된 효소 활성을 갖는 항체를 사용하여 본 발명의 프로드럭을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). 항체-아브자임 접합체는 종양 세포 집단으로 아브자임의 전달용으로 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
상기 효소는 상기 논의된 이종이기능성 가교결합 시약의 사용과 같은 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 항체에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 대안으로, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성부에 연결된 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제할 수 있다(문헌참조: Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).
아미노산 서열 변이체의 제조
항체 또는 폴리펩타이드 결합제의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및/또는 6개 CDR을 포함하는 변형된 폴리펩타이드를 제조하는 것이 고려되고, 여기서 CDR 또는 비-CDR 영역을 변형시켜 항원에 대한 증가된 특이성 또는 친화성을 제공하거나 표적과 이의 시그날 파트너간의 결합 친화성의 증가된 조절을 제공한다. 예를 들어, 항체 CDR내 부위는 전형적으로 연속적으로 예를 들어, 처음에 보존성 선택(예를 들어, 비-동일한 소수성 아미노산의 소수성 아미노산으로의 대체)에 이어서 보다 유사하지 않은 선택(예를 들어, 하전된 아미노산의 소수성 아미노산으로의 대체)으로 대체함에 의해 변형시키고 이어서 결실 또는 삽입은 표적화된 부위에서 수행될 수 있다. CDR내 보존성 치환은 가변 영역이 생물학적 활성을 보유하도록 하는 것으로 고려된다. 예를 들어, CDR 주변의 보존된 골격 서열을 사용하여, 프라이머 영역 사이에 위치된 항원 특이적 CDR 서열을 증폭시키기 위해 이들 컨센서스 서열에 상보적인 PCR 프라이머를 제조한다. 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 클로닝하고 발현시키기 위한 기술은 당업계에 널리 확립되어 있다[문헌참조: 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. 증폭된 CDR 서열은 적당한 플라스미드에 연결한다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및/또는 6개 클로닝된 CDR을 포함하는 플라스미드는 CDR에 연결된 추가의 폴리펩타이드 암호화 영역을 임의로 함유한다.
변형된 CDR을 포함하는 폴리펩타이드 결합제는 본래의 항원에 대한 결합 친화성에 대해 스크리닝한다. 추가로, 항체 또는 폴리펩타이드는 이의 항원의 활성을 중화시키는 이의 능력에 대해 추가로 시험한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 실시예에 제시된 바와 같이 표적의 생물학적 활성을 방해는 이들의 능력을 결정하기 위해 분석될 수 있다.
변형은 하기에서 상세히 기재된 바와 같은 보존성 또는 비보존성 아미노산 치환에 의해 수행할 수 있다. "삽입" 또는 "결실"은 바람직하게 약 1 내지 20개 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 아미노산 범위이다. 상기 변형은 재조합 DNA 기술을 사용하는 항체 폴리펩타이드 분자내 아미노산을 시스템적으로 치환하고 활성에 대해 수득한 재조합 변이체를 분석함에 의해 도입할 수 있다. 핵산은 상이한 종 기원의 핵산과는 상이한 부위(가변 위치) 또는 고도로 보존된 영역(불변 영역)에서 변화시킬 수 있다. 항체 서열을 변화시키고 본 발명에 유용한 항체 폴리펩타이드 조성물을 발현시키기 위한 방법은 하기에서 보다 상세히 기재한다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 내부 서열 삽입 뿐만 아니라 길이가 1개 내지 100개 이상의 범위인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에서 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그 또는 구제 수용체 에피토프에 융합된 항체(항체 단편을 포함함)를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이는 예를 들어, N-말단 또는 C-말단에서 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드로의 융합을 포함한다.
상기 용어 "에피토프 태그된"은 에피토프 태그에 융합된 언급한다. 상기 에피토프 태그 폴리펩타이드는 이에 대해 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분하지만 이것이 항체의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧은 잔기를 갖는다. 상기 에피토프 태그는 바람직하게 이에 대한 항체가 실질적으로 다른 에피토프와는 교차반응하지 않는 충분히 고유한 것이다. 적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기 및 일반적으로는 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기(바람직하게는 약 9개 내지 30개 잔기)를 갖는다. 이의 예는 flu 헤마글루티닌(HA) 태그 폴리펩타이드 및 이의 항체 12CA5 (문헌참조: Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(문헌참조: Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5:3610-16 (1985)); 및 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이의 항체(문헌참조: Paborsky et al., Protein Engineering 3:547-53 (1990))를 포함한다. 다른 예시적인 태그는 폴리-히스티딘 서열, 일반적으로 약 6개의 히스티딘 잔기이고 이는 니켈 킬레이트화를 사용하여 표지된 화합물이 분리될 수 있도록 한다. 당업계에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 다른 표지 및 태그, 예를 들어FLAG® 태그 (Eastman Kodak, Rochester, NY)는 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 관여하는 IgG 분자[예를 들어, IgG1, IgG2; IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 언급한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 이의 위치에 삽입된 것이다. 초가변 또는 CDR 영역 또는 골격 영역중 어느 하나내에 치환적 돌연변이유발이 고려된다. 보존성 치환은 아미노산을 이의 부류의 다른 구성원으로 대체하는 것을 포함한다. 비-보존성 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 대체하는 것을 포함한다.
보존성 아미노산 치환은 포함된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성을 기초로 수행한다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌(Ala, A), 류신(Leu, L), 이소류신(He, I), 발린(Val, V), 프롤린(Pro, P), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 및 메티오닌(Met, M)을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 시스테인 (Cys, C), 티로신(Tyr, Y), 아스파라긴(Asn, N), 및 글루타민(Gin, Q)을 포함하고; 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K), 및 히스티딘 (His, H)을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산(Asp, D) 및 글루탐산(Glu, E)을 포함한다.
항체의 적당한 형태를 유지시키는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환될 수 있고 이는 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교결합을 차단한다. 역으로, 시스테인 결합이 항체에 부가될 수 있고 이는 이의 안정성을 개선시킨다(특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
친화성 성숙화
친화성 성숙화는 일반적으로 모 항체의 CDR내에 치환을 갖는 항체 변이체를 제조하고 스크리닝하며 모 항체에 비해 보다 강한 결합 친화성과 같은 개선된 생물학적 성질을 갖는 변이체를 선별하는 것을 포함한다. 이러한 치환 변이체를 제조하기 위한 간편한 방법은 파아지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙화이다. 간략하게, 수개의 초가변 영역 부위(예를 들어, 6-7개 부위)는 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이시킨다. 따라서 생성된 항체 변이체는 각각의 입자내에 팩키징된 M13의 유전자 III 생성물과의 융합체로서 필라멘터스 파아지 입자 기원의 1가 양상으로 디스플레이된다. 이어서 상기 파아지-디스플레이된 변이체는 이들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다[문헌참조: WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 및 WO 93/19172].
현재 항체 친화성 성숙화 방법은 2개의 돌연변이 유발 카테고리: 스토캐스틱(stochastic) 및 비스토캐스틱(nonstochastic)에 속한다. 오류 경향 PCR, 돌연변이유발 세균 균주(문헌참조: Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359-68 (1996)), 및 포화 돌연변이유발(문헌참조: Nishimiya et al., J. Biol. Chem. 275:12813-20 (2000); Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85 (2002))은 스토캐스틱 돌연변이 유발 방법의 전형적인 예이다(문헌참조: Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71 (2005)). 비스토캐스틱 기술은 흔히 제한된 부류의 특이적 변이체를 생성하기 위해 알라닌-스캐닝 또는 부위 지시된 돌연변이유발을 사용한다. 몇몇 방법은 하기에서 추가로 상세하게 기재한다.
패닝 방법을 통한 친화성 성숙화 - 재조합 항체의 친화성 성숙화는 통상적으로 감소하는 양의 항원의 존재하에 수회의 후보 항체의 패닝을 통해 수행한다. 각 라운드 마다 항원의 양을 감소시키는 것은 항원에 대한 최고의 친화성을 갖는 항체를 선별하고 이로써 대형 풀의 출발 물질로부터 높은 친화성을 갖는 항체를 생성한다. 패닝을 통한 친화성 성숙화는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조; Huls et al. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71 (2001))]에 기재되어 있다. 파아지 디스플레이 기술을 사용한 친화성 성숙화의 방법은 본원에 다른 부분에 기재되어 있고 당업계에 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Daugherty et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97:2029-34 (2000)).
투영 돌연변이유발 - 투영 돌연변이유발(LTM) (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:8466-71 (2005))은 항체 결합 부위를 신속하게 맵핑하는 방법을 제공한다. LTM을 위해, 20개 천연 아미노산에 의해 제공되는 주요 측쇄 화학물질을 대표하는 9개의 아미노산을 선별하여 항체의 모든 6개의 CDR에서 각 위치에 결합하는 것에 대한 기능적 측쇄 기여도를 나눈다. LTM은 CDR내 일련의 위치들의 단일 돌연변이를 생성시키고 여기서, 각각의 "야생형" 잔기는 시스템적으로 9개의 선별된 아미노산중 하나에 의해 치환된다. 돌연변이된 CDR을 조합하여 모든 변이체의 정량적 디스플레이를 억제하는 것 없이 복잡성 및 크기를 증가시키는 조합적 단일쇄 가변 단편(scFv) 라이브러리를 제조한다. 양성 선별 후, 보다 강한 결합 친화성을 갖는 클론은 서열 분석하고 이로운 돌연변이를 맵핑한다.
오류 경향 PCR - 오류 경향 PCR은 상이한 선별 라운간의 핵산의 무작위화를 포함한다. 상기 무작위화는 사용되는 폴리머라제의 고유 오류 비율에 따른 낮은 비율로 발생하지만 전사 동안에 높은 고유 오류 비율을 갖는 폴리머라제(문헌참조: Hawkins et al., J Mol Biol. 226:889-96 (1992))를 사용하여 오류 경향 PCR(문헌참조: Zaccolo et al., J. Mol. Biol. 285:775-783 (1999))에 의해 증진될 수 있다. 돌연변이 사이클 후, 항원에 대해 보다 강한 결합 친화성을 갖는 클론이 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 선별된다.
DNA 셔플링 - 핵산 셔플링은 변이 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위한 보다 짧거나 보다 소형인 폴리펩타이드 풀의 시험관내 또는 생체내 상동성 재조합을 위한 방법이다. DNA 셔플링은 문헌[참조: 미국 특허 제6,605,449호, 미국 특허 제6,489,145호, WO 02/092780 및 Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-51 (1994)]에 기재되어 있다. 일반적으로, DNA 셔플링은 3개의 단계로 이루어진다: DNase I을 사용하여 셔플링된 유전자의 단편화, 단편의 무작위 하이브리드화 및 DNA 폴리머라제(성별 PCR)의 존재하에 PCR에 의한 단편화된 유전자의 재어셈블리 및 충전, 및 통상의 PCR에 의한 재어셈블리된 생성물의 증폭.
DNA 셔플링은 이것이 역 연쇄 반응이라는 점에서 오류 경향 PCR과는 상이하다. 오류 경향 PCR에서, 폴리머라제 출발 부위의 수 및 분자의 수는 대수적으로 성장한다. 반대로, 핵산 어셈블리 또는 무작위 폴리뉴클레오타이드의 셔플링에서, 출발 부위 수 및 무작위 폴리뉴클레오타이드의 수(그러나 크기는 아님)는 시간 경과에 따라 감소한다.
항체의 경우에, DNA 셔플링은 예를 들어, 모든 CDR1과, 모든 CDR2와, 모든 CDR3의 자유 조합적 연합을 가능하게한다. 다중 계열의 서열은 동일한 반응에서 셔플링될 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, 셔플링은 일반적으로 상대적인 순서를 유지하고 있어 예를 들어, CDR1은 CDR2 위치에서 발견되지 않는다. 희귀 셔플란트는 다수의 최상(예를 들어 최고의 친화성)의 CDR을 함유하고 이들 희귀 셔플란트는 이들의 우수한 친화성을 기초로 선별될 수 있다.
DNA 셔플링에 사용될 수 있는 주형 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이것은 재조합되거나 재어셈블리될 유전자 또는 보다 짧거나 보다 작은 폴리뉴클레오타이드의 크기에 따라 다양한 길이를 가질 수 있다. 바람직하게, 주형 폴리뉴클레오타이드는 50 bp 내지 50 kb이다. 흔히 주형 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥이어야만 한다.
주형 폴리뉴클레오타이드에 대해 동일성 영역을 갖고 주형 폴리뉴클레오타이드에 대해 이종성 영역을 갖는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 폴리뉴클레오타이드는 유전자 선별의 초기 단계 동안에 주형 폴리뉴클레오타이드에 부가될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 2개의 상이하지만 관련된 폴리뉴클레오타이드 주형은 초기 단계 동안에 혼합될 수 있는 것으로 고려된다.
알라닌 스캐닝 - 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정하기 위해 수행할 수 있다[문헌참조: Cunningham and Wells, (Science 244:1081-1085 (1989)). 잔기 또는 표적화된 잔기들 그룹이 동정되고(예를 들어, 하전된 잔기, 예를 들어 arg, asp, his, lys, 및 glu) 천연 또는 음전하 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 준다. 이어서 치환에 대해 기능적 민감성을 입증하는 상기 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 이에 대해서 추가의 또는 다른 변이체를 도입하여 다시 확인한다.
컴퓨터 보조 디자인 - 대안으로, 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉 지점을 동정하거나 상기 접촉 지점을 모델링하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 상기 접촉 잔기들 및 이웃하는 잔기들은 본원에 열거된 기술에 따른 치환을 위한 후보물이다. 일단 상기 변이체가 생성된 경우, 변이체 패널을 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝에 적용하고 하나 이상의 관련 분석에서 우월한 성질을 갖는 항체가 추가의 개발을 위해 선별될 수 있다.
약제학적 조성물의 제형화
사람 또는 시험 포유동물에게 본 발명의 폴리펩타이드 결합제를 투여하기 위해, 하나 이상의 멸균 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균 조성물중에 폴리펩타이드 결합제를 제형화하는 것이 바람직할 수 있다. 용어 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 하기된 바와 같이 당업계에 널리 공지된 경로를 사용하여 투여되는 경우 알레르기 또는 다른 부작용을 나타내지 않는 분자 실체 및 조성물을 언급한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 피복물, 항세균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
폴리펩타이드 결합제는 임의의 적합한 수단에 의해 투여되고, 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내, 및 경우에 따라 국소 치료가 요망되는 경우 병변내 투여를 포함한다. 비경구 주입은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 표피내 또는 피하 투여를 포함한다. 바람직하게는 투여는 주사이고, 가장 바람직하게는 투여가 단기적이거나 장기적인지의 여부에 부분적으로 의존하여 정맥내 또는 피하 주사이다. 다른 투여 방법은 국소, 특히 경피, 경점막, 직장, 구강 또는 예를 들어, 목적하는 부위에 인접하게 위치한 카테터를 통한 국소 투여를 포함한다.
활성 성분으로서 본 발명의 폴리펩타이드 결합제를 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 투여 경로에 따라 멸균 약제학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 담체 및 부가제의 예는 물, 약제학적으로 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카복시비닐 중합체, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴릭 나트륨, 나트륨 알기네이트, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 크산탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 겔라틴, 한천, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 사람 혈청 알부민 (HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토스, 약제학적으로 허용되는 계면활성제 등을 포함한다. 사용되는 부가제는 적절하게는 본 발명의 투여 형태에 따라 상기 또는 이의 조합으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다. 용제 또는 에멀젼을 위해, 적합한 담체는 예를 들어 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁제(식염수 및 완충 매질을 포함)를 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 비휘발성유를 포함한다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 보존제 또는 유제, 영양물 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체가 적합한데 예를 들어, 멸균 인산 완충 식염수 용액, 멸균수, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등이 있고 증진된 안정성을 위한 다른 단백질, 예를 들어, 약한 화학적 변형 등에 적용되는, 알부민, 지단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 결합제의 치료학적 제형은 목적하는 순도를 갖는 폴리펩타이드 결합제를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와, 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 혼합하여 저장용으로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린 함유 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 짝이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
상기 활성 성분은 또한 예를 들어, 상분리 기술 또는 접지면 중합체화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트)마이크로캡슐에, 또는 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼 중에 포집될 수 있다. 상기 기술은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취된다.
수성 현탁제는 수성 현탁제의 제조를 위해 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 함유할 수 있다. 상기 부형제는 현탁제, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 고무 및 아카시아 고무이고; 분산제 또는 습윤화제는 천연 포스파티드, 예를 들어, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 지방산 및 헥시톨 유래의 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 상기 수성 현탁제는 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 에틸 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 저장을 위해 동결건조될 수 있고 사용전에 적합한 담체에 재구성될 수 있다. 상기 기술은 통상적인 면역글로불린과 함께 효과적인 것으로 나타났다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있다. 당업자는 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 상실을 유도할 수 있고 사용 수준이 보상을 위해 조정될 필요가 있음을 인지할 것이다.
물을 첨가함에 의한 수성 현탁제의 제조를 위해 적합한 분산가능한 산제 및 입제는 현탁제 또는 습윤화제, 현탁제와 하나 이상의 보존제와 혼합된 활성 화합물을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤화제 및 현탁제는 상기 언급된 것들에 의해 예시된다.
상기 제형중에 폴리펩타이드 결합제의 농도는 매우 다양할 수 있고, 예를 들어, 약 0.5% 미만으로부터, 일반적으로 적어도 약 1중량% 내지 많게는 15 또는 20중량%이고 주로 유체 용적, 점도 등을 기준으로 선택된 특정 투여 방식에 따라 선택된다. 따라서, 비경구 주사용의 전형적인 약제학적 조성물은 1ml의 멸균 완충수 및 50mg의 폴리펩타이드 결합제를 함유하도록 구성될 수 있다. 정맥내 주입을 위한 전형적인 조성물은 250ml의 멸균 링거액 및 150mg의 폴리펩타이드 결합제를 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 자명하고 예를 들어, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)]에 보다 상세히 기재되어 있다. 폴리펩타이드 결합제의 유효량은 투여 당 체중 kg당 0.01 mg 내지 1000 mg 범위이다.
약제학적 조성물은 멸균 주사가능한 용제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 주사가능한 수성, 유성 현탁제, 분산제 또는 멸균 산제 형태로 존재할 수 있다. 현탁제는 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤화제 및 현탁제를 사용하여 선행 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비독성 비경구 허용가능한 희석제 또는 용매중의 멸균 주사가능한 용제 또는 현탁제일 수 있고, 예를 들어, 1,3-부탄 디올 중의 용제일 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이의 혼합물, 식물성유, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 추가로, 멸균 비휘발성유는 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 비휘발성유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제제중에 사용된다.
모든 경우에, 상기 형태는 멸균성이어만 하고 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유체이어야만 한다. 적당한 유동성은 예를 들어 렉시틴과 같은 피복을 사용하고 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시키고 계면활성제를 사용함에 의해 유지될 수 있다. 이것은 제조 및 저장 조건하에서 안정해야만 하고 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야만 한다. 미생물의 작용은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티머로살 등에 의해 예방될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수 지연제 조성물, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴중에서 사용하여 수행될 수 있다.
투여를 위해 유용한 조성물은 이들의 효능을 증가시키기 위해 취득 또는 흡수 증진제를 사용하여 제형화할 수 있다. 상기 증진제는 예를 들어 살리실레이트, 글리코콜레이트/리놀레에이트, 글리콜레이트, 아프로티닌, 바시트라신, SDS, 카프레이트 등을 포함한다[문헌참조: 예를 들어, Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285 (1996)) and Oliyai and Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544 (1993)).
생물리적 분석
복잡한 생물학적 반응은 이들을 통계학적 물리적, 열역학적 및 화학 역학적 측면에서 이해될 수 있는 상호작용 단위들의 시스템으로서 고려하는 분자 생물리적 방법을 통해 연구될 수 있다
특정 양태에서, 본 발명의 분석은 검출가능한 잔기를 사용할 수 있다. 검출가능한 잔기는 직간접적으로 측정가능한 시그날을 생성할 수 있는 임의의 하나 일 수 있고 예를 들어, 방사능활성, 발색성, 발광성 또는 형광성 시그날이고 이를 사용하여 샘플중에 결합된 검출가능한 잔기 또는 표지의 양을 정량하기 위해 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 검출가능한 표지는 방사능 동위원소, 예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I, 전기화학발광 표지(예를 들어, 기질 등과 접합된 루테늄(Ru)-기본 촉매), 발광 또는 생발광 표지(예를 들어, 유로퓸, 바나듐), 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어, 형광 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린, 효소(예를 들어, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소), 발색측정 표지, 예를 들어, 콜로이드성 골드, 발색 유리 또는 플라스틱 비드(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등), 상자성 원자 또는 자기 제제, 전자-밀집 시약, 형광 염료를 함유하는 나노 또는 마이크로 비드, 나노결정, 퀀텀 도트, 퀀텀 비드, 나노태그, 형광 표지를 갖는 덴드리머, 마이크로-응답기, 전자 공여 분자 또는 분자 구조물 또는 광 반사 입자를 포함한다. 마이크로입자는 나노결정 또는 퀀텀 도트일 수 있다. 나노결정은 광자를 흡수하고 이어서 광자를 상이한 파장으로 재방출하는 물질(형광단)이다. 또한, 추가의 형광성 표지 또는 2차 항체는 나노입자에 접합될 수 있다. 나노입자는 공급원(Invitrogen and Evident Technologies (Troy, N.Y.))으로부터 시판되고 있다. 다른 표지는 E)-5-[2-(메톡시카보닐)에테닐]시티딘을 포함하고 이는 비형광성 분자이나 자외선(UV) 조사되었을때 강한 형광성 시그날을 나타내는 생성물인 3-.베타.-D-리보푸라노실-2,7-디옥소피리도[2,3-d]피리미딘을 생성시킨다. 바 코드 표지는 미국 특허 공보 제US20070037195호에 기재되어 있다.
당업계에 공지된 다양한 분석 방법이 본 발명에 사용될 수 있고 예를 들어, 경쟁 결합 분석, 직간접적 샌드위치 분석, 면역침전 분석, 형광성 공명 에너지 전달(FRET), 전기면역분석 표면 플라스몬 공명(SPR), 및 나노입자 유래 기술이 있다.
경쟁 결합 분석은 폴리펩타이드 결합제에 결합하는 것에 대해 시험 샘플중의 항원과 경쟁하는 표지된 표준물(예를 들어, 폴리펩타이드 결합제가 결합하는 항원 또는 이의 단편)의 능력에 의존한다. 시험 샘플 중의 항원 양은 항체에 결합된 표준물의 양에 반비례한다. 결합된 표준물 양의 결정을 용이하게 하기 위해, 상기 항체는 경쟁 전후 불용성화되어 결합된 항원이 비결합된 항원으로부터 간편하게 분리될 수 있도록 한다. 대안적인 양태에서, 경쟁 결합 분석은 항원 또는 이의 단편에 결합하는 것에 대해 비표지된 폴리펩타이드 결합제와 경쟁하는 표지된 폴리펩타이드 결합제의 능력을 측정한다.
샌드위치 분석은 전형적으로 2개의 항체의 사용을 포함하고 항체 각각은 검출되고/되거나 정량될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 중의 분석물은 통상적으로 고형상에 고정화된 제1 폴리펩타이드 결합제에 결합되어 있고 이후 제2 폴리펩타이드 결합제는 분석물에 결합하여 불용성 3부 복합체를 형성한다[문헌참조: 미국 특허 제4,376,110호]. 제2 폴리펩타이드 결합제는 그 자체가 검출가능한 잔기(직접적인 샌드위치 분석)로 표지될 수 있거나 검출가능한 잔기로 표지된 항면역글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다(간접적 샌드위치 분석). 예를 들어, 1개 유형의 샌드위치 분석은 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)이고, 이 경우에, 검출가능한 잔기는 효소이다[문헌참조: 예를 들어, chapter 18, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, New York, NY (1995)].
분석 방법의 또 다른 예는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 방출을 포함한다. 예를 들어, 하나의 화합물은 FRET 공여 분자로 표지시키고 이의 결합 파트너는 FRET 수용체 분자로 표지시키거나 이의 반대일 수 있다. 결합이 결합 파트너간에 존재하는 경우, FRET 공여자 및 FRET 수용자 분자는 근접하게 되고 특정 파장에서 형광을 방출한다. 좁은 밴드 통과 필터를 사용하여 표지의 파장을 제외하고는 모든 파장을 차단시킬 수 있다. FRET 분자쌍은 당업계에서(예를 들어, 제조원(Invitrogen) 가용하고 제조업자의 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. FRET 방출은 CCD 카메라와 같은 광학 이미지화 기술을 사용하여 검출한다.
분석 방법의 또 다른 예는 예를 들어, WO/06/086883에 기재된 바와 같은 바이오센서를 사용하는 생발광 공명 에너지 전달(BRET)이다.
또 다른 유형의 분석은 전자 공여자를 사용한 표지화를 포함한다. 1개의 분자는 전가 공여자로 표지시키고 상호작용 분자는 전자 접촉물에 결합시키거나 그 반대이다. 결합이 결팝 파트너간에 존재하는 경우, 상기 표지는 전자를 전자 접촉물에 공여한다[문헌참조: 예를 들어, Ghindilis, Biochem Soc Trans. 28:84-9, (2000) and Dai et al., Cancer Detect Prev. 29:233-40 (2005)(이는 전자 면역분석을 위한 방법을 기재함). 이어서 전자 접촉물은 A 대 D(아날로그 대 디지탈) 변환기로 판독하고 정량한다. 전자 계수가 높을 수록 더 많은 상호작용이 발생한 것이다.
단일 분자를 검출할 수 있는 표지의 한 양태는 문헌[참조: Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:996-1001 (2000), 본원에 참조로서 인용됨]에 기재된 바와 같이 광학 리포터로서 플라스몬-공명 입자(PRP)의 사용이다. PRP는 금속에서 전도 전자의 총체적 공명(즉, 표면 플라스몬 공명)때문에 광을 산란시키는, 예를 들어, 직경이 40 내지 100nm인 금속성 나노입자이다. 나노입자와 관련된 플라스몬 공명의 진폭, 피크 파장 및 스펙트럼 밴드 폭은 국소 환경 뿐만 아니라 입자의 크기, 형태, 및 물질 조성에 따라 다양하다. 제조 동안에 이들 파라미터에 영향을 줌에 의해, 스펙트럼의 가시적 범위의 임의의 위치에서 산란 피크를 갖는 PRP가 형성될 수 있다. 구형 PRP에 대해, 피크 산란 파장 및 산란 효율 둘다는 반경 증가와 함께 증가하여 다르게 발색된 표지를 제조하기 위한 수단을 제공한다. 은 구형물 집단들은 예를 들어, 제조 동안에 구형물의 최종 반경을 조정함에 의해, 재생적으로 제조될 수 있고, 이에 대해 피크 산란 파장은 표적화된 파장의 몇 나노미터 이내에 있다. PRP는 아직 나노크기가 아닌 밝기 때문에 이들은 단일 분자 검출을 위한 지시제로서 사용되고, 즉, 가시적 범위에서 결합된 PRP의 존재는 단일 결합 반응을 지적할 수 있다. 표면 플라스몬 공명 검출기 시스템의 한 예는 BIAcore 분석 시스템이다[문헌참조: 예를 들어, Malmquist, J Molec Recognition, 7:1-7 (1994)].
분자 상호작용은 또한 나노입자 유래 기술을 사용하여 검출할 수 있다[문헌참조: 예를 들어, Ao et al., Anal Chem. 78:1104-6 (2006)(이는 골드 나노입자 켄칭을 기재하고 있음), Tang et al., Biosens Bioelectron. 2005 Nov 30(이는 항체 검출에서 SiO(2)/Au 나노입자 표면을 기재하고 있음), 및 Lieu et al., J Immunol Methods. 307:34-40 (2005)(이것은 고형 기질-실온 인광 면역분석(SS-RTP-IA)에 사용하기 위한 디브로모플루오레세인을 함유하는 이산화규소 나노입자를 기재하고 있음)].
KinExA 분석은 또한 이의 항원에 대한 조절 항체의 친화성을 측정하는데 유용하다. 하나의 예시적인 KinExA 분석은 실시예 20에 기재되어 있다. 예를 들어, KinExA 분석은 세포 배양 매질에서 매우 낮은 수준의 리간드를 측정한다. 이러한 분석은 동족 수용체를 발현하는 세포에 대한 리간드가 세포 배양 배지로부터 리간드 고갈 수준을 결정함에 의해 측정가능하도록 한다. 리간드가 세포에 결합됨에 따라, 세포 배양 배지의 리간드의 농도는 저하된다. 수용체를 발현하는 세포의 적정을 사용하고 % 유리된 리간드를 측정함에 의해, 리간드 수용체 상호작용의 친화성은 KinExA 소프트웨어(Sapidyne, Boise ID)를 사용하여 평가된다. 상기 분석을 사용하여 다양한 항-수용체 항체에 의해 나타난 리간드 결합 활성의 조절 정도를 측정한다.
결합 친화성 또는 결합율 파라미터의 이전의 측정중 어느 하나는 제1 성분, 제2 성분 및 폴리펩타이드 결합제 중 하나 이상이 용액 중에 존재하는 분석에서 또는 제1 성분, 제2 성분 및 폴리펩타이드 결합제중 하나 이상이 고형상에 연결되어 있는(공유적으로 또는 비공유적으로) 분석에서 또는 제1 성분, 제2 성분 및 폴리펩타이드 결합제 중 하나 이상이 세포 표면상에 발현되는 분석에서 수행할 수 있다. 제1 및/또는 제2성분은 각 성분 자체가 다중 성분의 복합체일 수 있다.
투여 및 용량
하나의 측면에서, 본 발명의 방법은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 치료제를 직간접적으로 포유동물 피검체에 도입하기 위한 임의의 의학적으로 허용되는 수단을 사용하여 수행하고 이는 주사, 경구 섭취, 비강내, 국소, 경피, 비경구, 흡입 분무, 질내 또는 직장 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 비경구는 카테터 또는 주입 기술 뿐만 아니라 피하, 정맥내, 근육내, 및 낭내 주사를 포함한다. 경피내, 유선내, 복강내, 지주막하내, 교후부, 폐내 주사에 의한 투여 및 특정 부위에서의 수술 이식이 또한 고려된다. 적합한 전달 장치는 인슐린 전달을 위해 개발된 것들을 포함할 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Owens et al Diabetic Med. 20(11):886-898, 2003).
하나의 양태에서, 투여는 제형을 부위로의 직접적인 주사 또는 내부적으로 전달할 수 있는 서방성 전달 또는 서방성 방출 기작을 통해 치료를 필요로 하는 암 부위 또는 환부 조직 부위에서 수행된다. 예를 들어, 조성물(예를 들어, 가용성 폴리펩타이드, 항체 또는 소분자)을 서방성으로 전달할 수 있는 생분해가능한 미소구 또는 캅셀제 또는 기타 생분해가능한 중합체 형태가 부위에 이식된 본 발명의 제형에 포함될 수 있다.
치료학적 조성물은 또한 다중 부위에서 환자에게 전달될 수 있다. 다중 투여는 동시에 투여되거나 시간 경과에 따라 투여될 수 있다. 특정 경우에 치료학적 조성물을 연속적인 흐름으로 제공하는 것이 이로울 수 있다. 추가의 치료제는 치료 기간을 기준으로, 예를 들어, 1시간마다, 매일, 주간, 2주마다, 3주마다 또는 1개월 마다 투여될 수 있다.
또한 본 발명에서 본원에 기재된 바와 같은 제2 제제와 접합된 항체 조성물과 같은 다중 제제의 투여가 고려된다.
소정의 용량중에 항체 조성물의 양은 치료될 장애의 특성 뿐만아니라 치료를 받을 개체의 크기에 따라 다양할 것이다. 예시적인 치료에서, 약 1 mg/일, 5 mg/일, 10 mg/일, 20 mg/일, 50 mg/일, 75 mg/일, 100 mg/일, 150 mg/일, 200 mg/일, 250 mg/일, 500 mg/일 또는 1000 mg/일을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 이들 농도는 단일 용량 형태로서 또는 다중 용량으로서 투여될 수 있다. 먼저 동물 모델에서 및 이어서 임상적 시험에서 표준 용량 반응 연구는, 특정 질환 상태 및 환자 집단에 대한 최적의 용량을 밝힌다.
배합 치료
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 유용한 제2 제제와 함께 투여된다. 표적 항원의 상이한 에피토프에 대한 2개 이상의 항체는 항체의 배합으로 표적 폴리펩타이드와 관련된 치료될 증상 또는 장애에 대해 여전히 개선된 효능을 제공하도록 혼합될 수 있음이 고려된다. 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 조성물은 표적 폴리펩타이드와 관련된 치료될 증상 또는 장애를 앓고 있거나 이들이 발병할 경향이 있는 사람 또는 포유동물에게 투여될 수 있다.
2개의 치료학적 제제의 동시 투여는 제제들이 이들의 치료학적 효과를 발휘하는 기간 동안에 중첩되는 한 동시에 또는 동일한 경로로 제제가 투여될 필요는 없다. 동시 또는 연속 투여가 상이한 날 또는 상이한 주에 투여되는 것이 고려된다.
제2 제제는 항당뇨병제, 사이토킨, 성장 인자, 다른 소염제, 항응고제, 혈압을 저하시키거나 감소시키는 제제, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, LDL, VLDL 또는 지질단백질을 감소시키거나 HDL을 증가시키는 제제, 콜레스테롤-조절 단백질, 항신생물 약물 또는 분자의 수준을 증가시키거나 감소시키는 제제와 같은 다른 치료제일 수 있다. 암 또는 종양과 같은 과증식성 장애를 앓는 환자에 대해 방사선치료, 화학치료, 광역학적 치료 또는 수술과 같은 제2 치료 방식과의 조합이 또한 고려된다.
예시적인 항당뇨병제는 1) 설포닐우레아(예를 들어, 글리메피리드, 글리센티드, 설포닐우레아, AY31637); 2) 비구아니드(예를 들어, 메트포르민); 3) 알파-글루코시다제 억제제(예를 들어, 아카보스, 미글리톨); 4) 티아졸-이디네디온 (예를 들어, 트로글리타존, 피오글리타존, 로시글리타존, 글리피지드, 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, NIP 223, NIP 221, MK 0767, 시글리타존, 아다글리타존, CLX 0921, 다글리타존, CP 92768, BM 152054); 5) 글루카곤형 펩타이드 (GLP) 및 GLP 유사체 또는 GLP-1 수용체의 효능제(예를 들어, 엑센딘) 또는 이의 안정화제(예를 들어, DPP4 억제제, 예를 들어, 시타글립틴); 및 6) 인슐린 또는 이의 유사체 또는 모사체(예를 들어, LANTUS®)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 및 제2 제제는 동일한 제형으로 동시에 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 추가로 상기 제제는 별도의 제형으로 투여되고 동시에 투여되는 것으로 고려되고, 동시란 의미는 제제가 서로 30분 이내의 간격으로 투여됨을 언급한다.
또 다른 측면에서, 제2 제제는 항체 조성물의 투여 전에 투여된다. 사전 투여는 항체를 사용한 치료 1주전에서 항체 투여 30분전까지 범위내에서 제2 제제의 투여를 언급한다. 제2 제제는 항체 조성물의 투여에 후속적으로 투여되는 것이 고려된다. 후속적 투여는 항체 치료 후 30분에서 항체 투여 후 1주까지의 투여를 기재하는 것으로 의미된다.
경우에 따라 다른 보조 치료제가 투여될 수 있는 것이 추가로 고려된다. 예를 들어, 상기 환자는 또한 경우에 따라 당뇨병 음식물 또는 식단 계획, 수술적 치료 또는 방사선 치료로 투여될 수 있다.
통상적인 치료제가 본 발명의 치료제와 배합하여 투여되는 경우 용량이 변형될 수 있음은 자명할 것이다.
사용 방법
INSR 효능제/양성 조절제에 대한 치료학적 징후
또 다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에게 표적 특이적 항체를 투여함에 의해 표적 활성을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 기재된 임의의 유형의 항체는 치료학적으로 사용될 수 있다. 예시적인 양태에서, 표적 특이적 항체는 사람, 키메라 또는 사람화된 항체이다. 또 다른 예시적인 양태에서, 상기 표적은 사람이고 환자는 사람 환자이다. 대안으로, 상기 환자는 표적 특이적 항체가 교차 반응하는 표적 단백질을 발현하는 포유동물일 수 있다. 상기 항체는 항체가 수의학적 목적으로 또는 사람 질환의 동물 모델로서 교차반응하는 표적 단백질을 발현하는 비-사람 포유동물(즉, 영장류)에게 투여될 수 있다. 상기 동물 모델은 본 발명의 표적 특이적 항체의 치료학적 효능을 평가하기 위해 유용할 수 있다.
인슐린 내성은 인슐린의 생리학적 양이 세포 또는 조직으로부터 정상적인 인슐린 반응을 제조하는데 부적당한 조건을 기재한다. 인슐린 내성은 다수의 질환 상태 및 증상과 관련되고 비당뇨병성 개체의 약 30 내지 40% 중에 존재한다. 이들 질환 상태 및 조건은 전당뇨병, 대사적 증후군(또한 인슐린 내성 증후군으로 언급됨), 2형 진성 당뇨병, 다낭성 난소 질환(PCOS) 및 비알콜성 지방 간 질환(NAFLD)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌참조: Woods et al, End, Metab & Immune Disorders -Drug Targets 9: 187-198, 2009).
전당뇨병은 손상된 글루코스 내성(IGT) 또는 손상된 단식 글루코스(IFG)를 특징으로 하는 비정상적인 글루코스 내성 상태이다. 전당뇨병을 갖는 환자는 인슐린 내성이고 향후 2형 당뇨병으로 전환될 높은 위험에 처해 있다. 대사적 증후군은 고인슐린형증, 비정상적인 글루코스 내성, 비만, 비상적이거나 상부 체 구획으로 지방의 재분포, 고혈압, 섬유용해부전 및 높은 트리글리세라이드, 낮은 HDL-콜레스테를 및 작은 밀집 LDL 입자를 특징으로 하는 이상지질혈증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 관련된 형질 무리이다. 인슐린 내성은 형질 각각과 연관되어 있고 이는 대사적 증후군 및 인슐린 내성이 서로 밀접한 관련이 있음을 시사한다. 대사적 증후군의 진단은 심장 발작, 졸중 및 말초 혈관 질환을 유도하는 가속화된 아테롬성동맥경화증 뿐만 아니라 2형 당뇨병의 향후 발병에 대한 강력한 위험 인자이다.
진성 당뇨병은 일반적인 집단에서 대략 1%로 만연된 사람에서의 대사적 장애이다(문헌참조: Foster, D. W., Harrison's Principles of Internal Medicine, Chap. 114, pp. 661-678, 10th Ed., McGraw-Hill, New York). 상기 질환 자체는 눈, 신장, 신경 및 혈관을 포함하는 여러 기관 시스템을 포함하는 심각한 장기 및 악화된 합병증을 궁극적으로 유도하는 일련의 호르몬-유도된 대사적 비정상으로서 나타난다. 병리학적으로, 상기 질환은 전자현미경하에 입증가능한 기저막 병변을 특징으로 한다. 진성 당뇨병은 2개의 임상적 증후군, 1형 및 2형 진성당뇨병으로 나눌 수 있다.
유아기 개시 형태로서도 언급되는 1형 또는 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)은 인슐린을 생산하는 랑게르한스 췌장 섬에서 베타 세포의 광범위한 상실을 특징으로 하는 만성 자가면역 질환이다. 이들 세포가 점진적으로 파괴됨에 따라, 분비된 인슐린의 양은 감소하고 분비되는 인슐린의 양이 정상적으로 요구되는 혈당 수준 미만으로 저하되는 경우 궁극적으로 고혈당증(비정상적으로 높은 혈중 글루코스 수준)을 유발한다. 상기 면역 반응에 대한 정확한 원인이 아직 공지되어 있지 않지만 IDDM을 갖는 환자는 췌장 베타 세포에서 발현되는 단백질에 대해 높은 수준의 항체를 갖는다. 그러나, 고수준의 이들 항체를 갖는 모든 환자가 IDDM을 발병하는 것은 아니다. 1형 당뇨병은 특징적으로 매우 낮거나 측정불가능한 혈장 인슐린을 나타내고 글루카곤은 상승한다. 정확한 병인학이 무엇이든지 상관 없이, 대부분의 1형 환자는 인슐린, 랑게르한스 세포 세포실 섬 및 효소 글루탐산 데카복실라제에 대한 항체를 포함하는 이들 자신의 췌장 세포에 대해 지시된 순환 항체를 갖고 있다. 베타 세포(인슐린 생산 세포)에 대해 특이적으로 지시딘 면역 반응은 1형 당뇨병을 유발한다. 1형 당뇨병 환자에 대한 현재 치료는 인슐린의 주사이고 또한 손상된 베타 세포 결과인 천연 인슐린의 부재로부터 비롯되는 고혈당증을 최소화하기 위해 식이에 대한 변형을 포함할 수 있다. 식이는 또한 호르몬의 저혈당 효과에 대응하기 위해 인슐린 투여와 관련하여 변형시킨다.
2형 당뇨병(또한 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM), 성숙 발병 형태, 성인 발병 형태로 언급됨)은 근육, 지방 및 간 세포가 인슐린에 정상적으로 응답하는데 실패하는 경우 발병한다. 상기 응답 실패(인슐린 내성으로 불리움)는 이들 세포상의 감소된 인슐린 수용체 수 또는 세포내의 시그날 전달 경로의 기능부전 또는 이둘다로 인한 것일 수 있다. 처음에 베타 세포는 인슐린 생산을 증가시킴에 의해 이러한 인슐린 내성을 보충한다. 시간이 경과함에 따라, 이들 세포는 정상적인 글루코스 수준을 유지시키기에 충분한 인슐린을 생산할 수 없게 되고 이는 2형 당뇨병으로 진행됨을 암시한다. 2형 당뇨병은 고지방 식이, 운동 부족 및 노화를 포함하는 유전적 및 후천적 위험 인자의 조합으로 유발된다. 당뇨병 인구의 90% 초과는 2형 당뇨병을 앓는 것이고 이의 발병율은 계속 증가하고 있고 전세계적으로 이는 치사율, 사망율 및 건강관리 지출의 주요 원인이 되었다(Amos et al., Diabetic Med. 14:S1-85, 1997).
2형 당뇨병은 글루코스 및 지질 대사의 결함을 특징으로 하는 복합 질환이다. 전형적으로 단식 혈장 글루코스 수준, 유리 지방산 수준 및 트리글리세라이드 수준의 증가 및 HDL/LDL의 비율의 감소를 포함하는 많은 대사적 파라미터가 교란된다. 상기된 바와 같이, 당뇨병의 근원적인 원인들 중 하나는 말초 조직, 원칙적으로 근육 및 지방에서 인슐린 내성의 증가인 것으로 사료된다. 2형 당뇨병의 원인은 아직 잘 이해되고 있지 않다. 인슐린 작용에 대한 표적 조직의 내성과 감소된 인슐린 분비 ("β-세포 부전증") 둘 다가 일어나는 것으로 사료된다. 글루코스 항상성에 대한 주요 인슐린-반응성 조직은 간(여기서 인슐린은 글리코겐 합성을 자극하고 글루코스신생합성을 억제한다); 및 근육(여기서, 인슐린은 글루코스 흡수를 자극하고 글리코겐은 글루코스 흡수를 자극하고 지질용해를 억제한다)이다. 따라서, 당뇨병 증상의 결과로서 혈중 글루코스 수준이 상승되고 이는 글루코스-매개된 세포 독성 및 후속적 사망(신장병증, 신경병증, 망막병증 등)을 유도할 수 있다. 인슐린 내성은 2형 당뇨병의 발병과 강하게 관련되어 있다.
현재, 2형 당뇨병을 치료하기 위한 다양한 생리학적 방법이 있다(문헌참조: Scheen et al, Diabetes Care, 22(9): 1568-1577, 1999; Zangeneh et al, Mayo Clin. Proc. 78: 471-479, 2003; Mohler et al, Med Res Rev 29(1): 125-195, 2009). 이들은 상이한 작용 방식을 통해 작용한다: 1) 설포닐우레아(예를 들어, 글리메피리드, 글리센티드, 설포닐우레아, AY31637)는 필수적으로 인슐린 분비를 자극하고; 2) 비구아니드(예를 들어, 메트포르민)는 글루코스 활용을 증가시키고 간 글루코스 생성을 감소시키고 장 글루코스 생성을 감소시킴에 의해 작용한다; 3) 알파-글루코시다제 억제제(예를 들어, 아카보스, 미글리톨)는 탄수화물 소화를 지연시키고 결과적으로 장으로부터 흡수를 지연시키며 식후 고혈당증을 감소시키고; 4) 티아졸-이디네디온(예를 들어, 트로글리타존, 피오글리타존, 로지글리타존, 글리피지드, 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존, AD 5075, T 174, YM 268, R 102380, NC 2100, NIP 223, NIP 221, MK 0767, 시글리타존, 아다글리타존, CLX 0921, 다글리타존, CP 92768, BM 152054)은 인슐린 작용을 증진시킴에 다라서 말초 조직에서 글루코스 활용을 촉진시키고; 5) 글루카곤형 펩타이드 및 효능제 (예를 들어, 엑센딘) 또는 이의 안정화제(예를 들어, DPP4 억제제, 예를 들어, 시타글립틴)는 글루코스-자극된 인슐린 분비를 강화시키고; 6) 인슐린 또는 이의 유사체(예를 들어, LANTUS®)는 조직 글루코스 활용을 자극하고 간 글루코스 생성을 억제한다. 상기 언급된 약리학적 방법은 개별적인 치료 또는 조합적인 치료로 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 방법은 이의 한계 및 부작용을 갖는다. 시간 경과에 따라, 2형 당뇨병 피검체의 대부분은 이들 제제에 대한 이들의 반응을 상실한다. 2형 당뇨병의 63%는 미국 당뇨병 학회에 의해 충고된 바와 같이 전체 HbA1c 수준을 7% 미만으로 유지시키는데 실패하고 따라서 합병증을 발병할 높은 위험에 처해있다. 더욱이, 거의 영구적으로 환자들은 쇠퇴하는 췌장 기능 단계를 통해 진행한다. 인슐린 치료는 전형적으로 식후, 운동후 수행되고 경구 약물은 적당히 혈당을 조절하는데 실패하였다. 인슐린 치료의 단점은 약물을 주사할 필요성, 저혈당증의 잠재성 및 체중 증가이다. 결과적으로 여전히 신규한 항당뇨병 제제가 절실히 요구되고 있다.
샤퍼 등(Schaffer et al)은 파아지 디스플레이를 사용하여 동종이량체 또는 이종이량체를 형성하도록 공유적으로 연결되는 경우 효능 활성 또는 길항 활성을 나타내는 INSR에 대한 2개의 구분된 핫스팟에 결합하는 일련의 펩타이드를 동정하였다(문헌참조: Schaffer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(8):4435-4439, 2003).
2형 당뇨병의 치료를 위한 추가의 생리학적 방법은 인슐린에 의해 INSR을 활성화시킬 수 있거나 INSR 활성화를 강화시킬 수 있는 비펩타이드 소형 분자의 사용이다(문헌참조: Moller, Nature 414: 821-827). 소형 분자는 동정을 회피하는 것으로 입증되었지만 2개의 그룹의 예가 보고되었다. L783281 (DMAQ-B1, L7) 및 이의 유도체 화합물 2는 INSR 티로신 키나제를 활성화시키는 소분자에 대한 스크리닝으로부터 동정된 인슐린 모사체이다(문헌참조: Zhang et al, Science 284: 974-977, 1999; Qureshi et al, J. Biol. Chem. 275(47): 36590-36595, 2000). TLK16998 및 TLK19780은 분리되고 천연적으로 발현된 사람 INSR의 자가인산화를 증가시키는 이들의 능력에 의해 동정된 인슐린 감작화제이다(문헌참조: Manchem et al, Diabetes 50: 824-830, 2001; Pender et al, J. Biol. Chem. 277(46): 43565-43571, 2002). L783281 및 TLK16998 둘다는 INSR β-서브유니트의 세포내 부분에 대해 작용하여 β-서브유니트 자가인산화 및 후속적인 다운스트림 시그날 전달을 증진시킴에 의해 인슐린 내성 세포에서 인슐린 작용을 강화시킨다(문헌참조: Li et al, Diabetes 50: 2323-2328, 2001). 화합물 2 및 TLK16998은 고용량으로 연속으로 투여되는 경우 당뇨병의 마우스 모델에서 혈당 수준을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌참조: Strowski et al, Endocrinology 145(11):5259-5268, 2004; Manchem et al, Diabetes 50: 824-830, 2001). 그러나, 이들 화합물 중 어떠한 것도 임상적 시험에 진입하지 못한 것으로 나타난다. INSR 티로신 키나제 도메인을 표적화하는 제제는 다른 분자내 비특이적 활성화 상동성 티로신 키나제 도메인으로 인해 부작용을 가질 것으로 예상된다. INSR β-서브유니트의 세포내 부분은 세포로 확산할 수 없는 항체와 같은 대형 분자에 대한 적합한 표적이 아니다.
인슐린 내성 당뇨병을 갖는 혈청 환자 기원의 폴리클로날 자가항체는 인슐린 작용을 연구하기 위한 프로브로서 동정되고 사용되었다. 이들 자가항체는 INSR로의 인슐린 결합을 억제하였고 2가(1가가 아닌) 형태는 시험관내에 조직에 노출되는 경우 인슐린형 생물학적 효과를 나타냈다(문헌참조: Kahn et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(9): 4209-4213, 1978; Heffetz and Zick, J. Biol. Chem. 261(2): 889-894, 1986).
쟈콥 및 쿠아트레카사스(Jacobs and Cuatrecasas)는 2개의 토끼 폴리클로날 항체를 보고하였고 다른 연구자에 의해 제조된 다수의 폴리클로날 항체 뿐만 아니라 이들 항체는 또한 다양한 인슐린형 효과를 매개할 수 있는 것으로 보고되었다(문헌참조: Jacobs and Cuatrecasas, CIBA Found. Symp. 90: 82-90, 1982).
쿨 등(Kull et al)은 인슐린과 소마토메딘-C(IGF-1) 수용체의 서브유니트를 동정하고 이의 면역화학적 교차 반응성을 조사하기 위해 3개의 마우스 모노클로날 항체 αIR-1, αIR-2 및 αIR-3 및 폴리클로날, A410, 및 이의 용도를 보고하였다 (문헌참조: Kull et al, J. Biol. Chem. 258(10): 6561-6566, 1983). 헤레라 등(Herrera et al)은 또한 사람 INSR과 IGS-1 수용체간의 관계를 연구하기 위한 항체(토끼 폴리클로날 항-INSR 펩타이드 항체 P4 및 P5)를 제조하였다(문헌참조: Herrera et al, J. Biol. Chem. 261(6): 2489-2491, 1986).
INSR에 대한 인슐린의 온-레이트를 증가시키고 오프 레이트를 감소키는 양성 조절제 항체(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)는 수용체 결합된 인슐린(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)의 체류 시간을 증가시키고 INSR 내재화율을 변화시키고/시키거나 INSR에 의해 활성화되거나 불활성화된 시그날 전달 단백질의 인산화 정도를 변화시킨다. 이들 변화는 인슐린(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)의 대사적 및 유사분열 활성 둘다 및 외인성 인슐린(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)의 투여 수준 및 횟수를 변화시킬 수 있다.
수용체 대한 인슐린의 온-레이트를 증가시키거나 오프-레이트를 감소시키는 음성 조절 항체(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)는 수용체 결합된 인슐린(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)의 체류 시간을 감소시키고, INSR 내재화율을 변화시키고/시키거나 INSR에 의해 활성화되거나 불성화된 시그날전달 단백질의 인산화 정도를 변화시킨다. 이들 변화는 인슐린(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)의 대사적 및 유사분열 활성 둘다 및 외인성 인슐린(인슐린 유사체 또는 INSR 효능제)의 투여 횟수를 상당히 변화시킬 수 있다.
본 발명의 양성 조절 항체를 투여받은 당뇨병 환자는 치료를 받지 않은 환자에 비해 혈당 수준, 글루코스 내성 시험 및 인슐린 민감성에 다른 측정이 개선된 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 양성 조절제 항체의 투여는 상승된 혈당 수준을 정상적인 글루코스 수준 쪽으로 감소시킬 것으로 예상되고 이것은 미국 당뇨병 학회에 다른 단식 혈당 수준에 대해 대략 70 mg/dL 내지 125 mg/dL이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체의 투여는 항체 치료를 받지 않은 환자와 비교하여 대략 혈당 수준을 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 이상으로 감소시킨다.
세계 보건 기구 및 미국 당뇨병 학회의 기준에 따르면, 정상적인 글루코스 내성은 75g의 경구 글루코스 섭취 2시간 후 측정시 dL 당 140mg 미만의 글루코스 수준으로서 정의된다. 손상된 글루코스 내성은 75g 경구 글루코스 섭취 2시간 후 글루코스 수준은 dL당 140 내지 199 mg(7.8 내지 11.0 mmol)로서 정의된다. 환자는 2시간 후 글루코스 수준이 (정상의 건강한 환자와 비교하여) 상승하는 경우 손상된 글루코스 내성을 갖는 것으로 정의되지만, 이 보다 덜 상승한 경우에는 2형 진성 당뇨병인 것으로 진단된다. 손상된 글루코스 내성을 갖는 환자는 여전히 정상적이거나 단지 약간 상승한 단식 글루코스를 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체의 투여는 2시간 글루코스 수준(75g 경구 글루코스 투여 후)을 항체 치료를 받지 않은 환자에 비해 대략 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상으로 감소시킨다.
ADA는 또한 성인에서 7% 미만의 헤모글로빈 A1c 표적 수준을 추천한다. 어린이에 대해, ADA는 A1c에 대해 보다 높은 표적 수준을 추천한다. 6세 미만의 어린이에서, 상기 추천 수준은 7.5% 내지 8.5%이다. 6 내지 12세 어린이에서, 추천된 수준은 8% 미만이고 13세 내지 19세에 대한 추천된 수준은 7.5% 미만이다. A1c는 얼마나 잘 혈당 수준이 이전의 2 내지 3개월 표적 범위내에 어떻게 잘 유지되는지에 대한 척도이다(문헌참조: American Diabetes Association, Diabetes Care, 28(1): 186-212, 2005.) 당뇨병을 치료하기 위한 본 발명의 항체의 투여가 비당뇨병성 개체에서 관찰된 수준 쪽으로 A1c 수준을 감소시키는 것으로 고려된다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체의 투여는 절대 HbA1c % 측정시 적어도 0.5%, 0.7%, 1.0% 또는 1.5%로 환자내 A1c 수준을 감소시킨다.
랑게르한스 췌장 섬내 베타 세포는 혈당 수준을 조절하는 호르몬인 인슐린을 제조하고 분비한다. 췌장에 의해 유지되는 인슐린의 기본 수준이 있지만 이것은 혈당의 스파이크에 신속히 응답하여 저장된 인슐린을 방출하고 이와 동시에 보다 많이 생성된다. 상기 반응 시간은 매우 신속하다. 1형 당뇨병에서, 베타 세포의 점차적 및 광범위한 상실은 분비된 인슐린의 수준을 감소시키고 궁극적으로 고혈당증(비정상적으로 높은 혈중 글루코스 수준)을 유발한다. 2형 당뇨병에서, 베타 세포는 처음에 피검체내에서 인슐린 생성을 증가시킴에 의해 인슐린 내성에 대해 보충하지만 시간이 경과하면서 상기 세포는 정상적인 글루코스 수준을 유지하기에 충분히 인슐린을 생성할 수 없다. 인슐린 작용에 대한 표적 조직의 내성 및 감소된 인슐린 분비 둘다는 부분적으로 베타 세포 기능부전으로 인해 발생하는 것으로 사료된다. 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩타이드의 투여는 글루코스 흡수를 개선시키고 다른 당뇨병 증상은 또한 이를 필요로 하는 피검체에서 베타 세포 기능을 개선시키기 위해 유용하다. 상기 개선은 베타 세포 생존성의 보존 또는 베타 세포 턴오버의 감소, 증가된 베타 세포 증식 또는 증진된 인슐린 분비를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 베타 세포 기능의 개선을 위한 추가의 방법 및 결과는 공동 출원 WO 2010/028273에 기재되어 있다.
특정 예에서, 양성 조절 항체 또는 부분 효능제 항체를 사용한 치료는 당뇨병 또는 상승된 혈장 트리글리세라이드, 상승된 혈장 비에스테르화된 콜레스테롤, 상승된 혈장 총 콜레스테롤, 상승된 혈장 인슐린(인슐린 내성을 나타냄), 상승된 HOMA-IR, 높은 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비율(또는 높은 총 콜레스테롤/HDL 콜레스테롤 비율), 개선된 베타 세포 기능 및 상승된 혈장 렙틴 수준(렙틴 내성을 지적함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인슐린 내성의 1개, 2개, 3개 이상의 증상을 개선시킨다. 상승된 수준이 당뇨병을 지시하는 경우, 인슐린 내성 또는 심혈관 합병증에 대한 증가된 위험성을 나타내는 경우 "개선"은 감소된 수준으로서 나타나거나 그 반대이다. 본원에 기재된 바와 같은 "개선"은 건강한 피검체내에서 나타나는 수준 쪽으로의 수준 정상화를 언급한다.
시험 즉시 결정된 "정상" 수준이 연구 마다의 기준에 따라 다양하고 각 연구는 이의 자신의 정상 범위를 갖고 있지만, 일반적으로 정상적인 트리글리세라이드 수준은 당뇨병에서 150 mg/dl 미만(기준선 높은 150 - 199 mg/dL)이고; 정상적인 콜레스테롤 수준은 200 mg/dL 미만이고, 정상적인 또는 표적 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비율은 대략 <3.25이고( < 130 mg/dL 비-HDL 표적 및 >41 ng/dL 표적 HDL을 기준으로), 단식 인슐린에 대한 정상 또는 표적 범위는 대략 5-20 microU/m이고 렙틴에 대한 정상 또는 표적 범위(일반적으로 또한 체질량 지수(BMI) 또는 고인슐린혈증과 관련됨)는 3-25 ng/ml이고 예를 들어, 3 ng/mL는 정상적인 대사적 기능을 위해 요구되는 것으로 나타나고 20-25 ng/mL는 질환과 관련된 것으로 나타난다. 몇몇 양태에서, 치료는 상기 증상중 어느 하나 이상을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상으로 정상화시킨다.
다낭성 난소 증후군(PCOS)은 가장 흔한 부인과 내분비 장애이고 대략 임신령의 여자의 대략 5 내지 10%에서 존재한다. 임상적 증상은 월경 장애, 비만, 불임 및 다모증을 포함한다. PCOS에서 인슐린 내성은 시그날 전달에서 인슐린후 결합 결함으로부터 비롯된다. 동정되지 않은 키나제에 의한 INSR 및 인슐린 수용체 기질 (IRS)-1 세린 고인산화가 상기 결함에 기여한다. 유사분열 시그날 전달은 PCOS를 갖는 여성으로부터의 골격근에서 증진되는 것으로 관찰되었다(문헌참조: Corbould et al, Diabetes 55: 751-59, 2006). INSR에 결합하는 인슐린의 효능제 및/또는 양성 조절제는 따라서 PCOS와 관련된 장애 및 증상을 치료하고/하거나 이의 발병 가능성을 감소시키는데 유용하다. 대사적 시그날 전달에 대한 유사분열의 비율을 증가시키지 않는 INSR에 결합하는 인슐린의 효능제 및/또는 양성 조절제는 특히 PCOS를 치료하기 위해 유용할 수 있다.
비알콜성 지방간염(NASH)은 단순한 지방증(지방 침윤성)에서 NASH, 및 이를 통한 간경병증 및 간세포암종의 범위에 이르는 광범위한 병리학(NAFLD로서 공지됨)의 일부이다(문헌참조: Farrell and Larter, Hepatol. 43, S99-112, 2006). 인슐린 내성은 간에서 지방 축적과 관련되고 이러한 기관은 현재 인슐린 내성을 갖는 환자에서 손상의 주요 표적으로서 인지되고 있다. 모든 성인의 약 20%가 NAFLD를 갖고 성인의 2 내지 3%가 NASH를 갖고 있는 것으로 평가된다. NASH를 갖는 환자의 3분의 1 이하가 보다 긴 시간 후 간경변증을 발병할 것이다. 간 질환은 2형 당뇨병의 유의적인 합병증이다.
비만 및 이상지혈증을 갖는 개체는 평균 집단에서 발견되는 것보다 보다 불량한 인슐린 민감성을 나타낸다. 비만은 고도로 만연되어 있고 사회적 오명 뿐만 아니라 감소된 수명 및 부작용의 생리학적 발병, 피부 장애, 예를 들어, 감염, 하지정맥류, 운동 내성, 진성 당뇨병, 인슐린 내성, 고혈압, 고콜레스테롤혈증 및 관상 심장 질환을 포함하는 다수의 의학적 문제와 관련되는 만성 질환이다(문헌참조: Rissanen et al., British Medical Journal, 301: 835-837, 1990). 비만은 실험 동물 및 사람에서 인슐린 내성과 당뇨병과 고도로 관련되어 있다. 실제로 비만 및 인슐린 내성(이후 후자는 일반적으로 고인슐린혈증 또는 고혈당증 또는 둘다를 수반한다)은 2형 당뇨병의 징후이다. 추가로, 2형 당뇨병은 관상 동맥 질환의 2배 내지 4배 위험과 관련된다. 이들 심각한 건강상의 문제점에 대한 수십년간의 연구에도 불구하고, 비만 및 인슐린 내성의 병인은 공지되어 있지 않다. 본원에서 양성 조절제 항체 및 부분 효능제 항체가 체중 증가를 감소시킬 수 있거나 지연시킬 수 있는, 즉 당뇨병 동물에서 관찰되는 바와 같이 체중을 정상화시키는 것으로 기재되어 있다. 항체가 비만 환자에서 체중 증가에 대해 동일한 효과를 갖는 것으로 고려된다. 또한, 양성 조절제 항체의 투여가 체중 감소를 지연시키거나 감소시킬 수 있는, 즉 당뇨병 동물(이의 베타 세포 집단은 고갈되고 흔히 유의적인 체중 감소 및 소모증을 유도한다)에서 체중 감소를 정상화시키는 것으로 입증되었다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 양성 조절제 항체 또는 부분 효능제 항체의 투여는 피검체에서 체중 증가를 치료되지 않은 피검체에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%로 감소시키거나 지연시킬 수 있는 것으로 고려된다.
대안적인 양태에서, 본원에 기재된 양성 조절제 항체 또는 부분적 효능제 항체의 투여가 당뇨병 환자와 같은 개체 또는 적어도 부분적 베타 세포 고갈을 갖는 개체에서 체중 감소를 치료되지 않은 피검체에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%로 감소시키거나 지연시킬 수 있는 것으로 고려된다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 양성 모듈 항체 또는 부분 효능제 항체의 투여는 치료되지 않은 피검체에 비해 체중 감소를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%로 촉진시킬 수 있거나 유도할 수 있는 것으로 고려된다.
HIV 환자의 치료를 위해 사용되는 프로테아제 억제제는 인슐린 내성을 포함하는, 대사적 장애 그룹의 발병과 관련된다(문헌참조: Graham, JAIDS 25: S4-S11, 2000). HIV 프로테아제 억제제-유도된 인슐린 내성은 고인슐린혈증을 유도할 수 있고 이는 당뇨병으로 진행하여 궁극적으로 생명을 위협하는 케토산증을 유도할 수 있다(문헌참조: Carr et al, Lancet 351:1881-1883, 1998). 몇몇 환자에 대해, 이들 대사적 부작용은 이들 수명 연장 약물의 용도를 크게 제한한다. 무라타 등(Murata et al)(문헌참조: J. Biol. Chem. 275(27): 20251-54, 2000)은 시판중인 HIV 프로테아제 억제제 약물 중 3개 이상이 또한 글루코스 수송체가 3T3 L1 지방 세포의 세포막으로 이동하는 것을 억제하여 후속적으로 상기 세포에 의한 글루코스 흡수를 억제시키는 것으로 보고하였다. 이들 HIV 프로테아제 억제제에 의한 세포 글루코스의 세포로의 수송 억제는 이들 프로테아제 억제제 약물로 치료된 몇몇 환자에 대한 임상에서 관찰되는 글루코스 및 지질의 상승과 일관된다. 따라서, INSR에 결합하는 인슐린의 효능제 및/또는 양성 조절제는 HIV 프로테아제 억제제의 대사적 부작용을 치료하기 위해 유용할 수 있다.
인슐린 내성은 또한 간염 C 바이러스(HCV) 감염을 갖는 환자에서 병리학적 특징 중 하나이고 HCV 감염과 관련된 다양한 합병증 및 증상들의 발병에 중요한 역할을 한다(문헌참조: Kawaguchi and Sata, World J. Gastroenterol. 16: 1943-52, 2010). 따라서 INSR에 결합하는 인슐린의 효능제 및/또는 양성 조절제는 HCV 감염과 관련된 합병증 및 증상들을 치료하기 위해 유용할 수 있다.
INSR 시그날 전달은 또한 다른 질환에 중요한 역할을 할 수 있다. 예를 들어, INSR/IGF-1R 시그날 전달이 아밀로이드-베타 대사에 작용하는 것으로 고려된다(문헌참조: Freude et al, Curr. Alzheimer Res. 6(3): 213-23, 2009). IR의 활성화는 광수용체 신경보호의 필수 요소인 것으로 추정되었다(문헌참조: Rajala et al, J. Biol. Chem. 283(28):19781-92, 2008). 인슐린 시그날 전달은 또한 골 형성을 촉진시키는 것으로 제안되었다(문헌참조: Rosen and Motyl, Cell 142: 198-200). 인슐린 감작화제를 사용한 치료는 만성 폐색성 폐 질환 및 진성 당뇨병 둘다를 갖는 환자에서 폐 기능을 개선시키는 것으로 보고되었다(문헌참조: Kim et al, Int. J. Tuberc. Lung Dis. 14(3): 362-67, 2010).
도노휴(Donohue) 증후군 또는 레프레카우니즘(Leprechaunism)을 유발하는, INSR 유전자에서 동종접합성 돌연변이를 갖는 몇몇 환자들이 보고되었다. 상기 상염색체 우성 질환은 전체적으로 비-기능성인 인슐린 수용체를 유도한다. 이들 환자들은 낮은 세트, 흔히 융기된 귀, 벌렁코, 두툼한 입술 및 심한 성장 지연을 갖는다. 대부분의 경우에, 이들 환자들에 대한 전망은 극히 불량하고 처음 1년 이내에 사망하게 된다. INSR 유전자의 다른 돌연변이는 덜 심각한 랍슨-멘델 증후군을 유발하고, 여기서 환자는 특징적으로 비정상적인 치아, 비대 잇몸(치은) 및 송과선의 비대를 갖는다. 질환 둘다는 식후 글루코스 수준이 변동하고: 글루코스는 처음에 매우 높고 이어서 비정상적으로 매우 낮은 수준으로 급격히 저하된다(문헌참조: Longo et al, Hum. Mol. Genet. 11(12): 1465-75, 2002).
INSR 길항제/음성 조절제에 대한 치료학적 징후
INSR은 또한 암과 관련된다. 여러 상피학적 연구는 고인슐린혈증을 특징으로 하는 인슐린 내성 형태가 유방, 전립선, 결장 및 신장의 암종을 포함하는, 다수의 악성에 대해 증가된 위험성과 관련됨을 보여주었다. INSR, 특히 INSR-A 형태는 여러 사람 악성종양에서 과발현한다. INSR은 또한 암에서 통상적으로 과발현되는 IGF-IR과 함께 하이브리드 수용체를 형성한다. INSR-A 반이량체를 함유하는 하이브리드 수용체는 이들이 IGF-I 및 IGF-II 및 인슐린과 결합하므로써 광범위한 결합 특이성을 갖는다. 하이브리드 수용체에 결합함에 의해, 인슐린은 특이적 IGF-IR 시그날 전달 경로를 자극할 수 있다. 따라서, INSR 및/또는 하이브리드 INSR/IGF-IR 수용체에 결합하는 인슐린의 길항제 및/또는 음성 조절제는 신규 항암 치료제로서 유용할 수 있다(문헌참조: Belfiore Current Pharm. Design 13 (7): 671-686, 2007). INSR은 카포시 육종의 바이러스-유도된 종양발생에 필수적인 것으로 보고되었다(문헌참조: Rose et al, Onogene 26: 1995-2005, 2007).
고인슐린혈증은 혈액중에 비정상적으로 높은 수준의 인슐린에 의해 정의되는 병태이다. 고인슐린혈증의 원인은 인슐린종 및 인슐린 내성을 포함하고 이들은 선천적 고인슐린혈증 또는 기타 병태, 예를 들어, 활성 부재, 비만, 다낭성 난소 증후군 또는 인슐린 과용에 의해 유발될 수 있다. 인슐린종은 과량의 인슐린을 생성하는 췌장의 종양이다. 고인슐린 수준은 저혈당증 또는 저혈당(당)을 유발한다. 고인슐린혈증은 생후 처음 몇시간 후 신생아 저혈당증의 가장 흔한 원인이다. 상기 병태의 치료는 흔히 발작 및 신경학적 후유증의 발병을 예방할 필요가 있을 수 있다.
인슐린 과용은 예를 들어, 너무 많은 인슐린의 투여에 의해; 올바른 양의 인슐린이지만, 잘못된 유형의 투여, 예를 들어, 장기 지속적 작용의 인슐린 대신 단기 지속적 인슐린의 투여; 인슐린 투여 후 식사를 못하는 경우; 또는 의도적 인슐린 과투여에 의해 유발될 수 있다.
일반적으로, 저혈당증은 경미하지만 불안 및 공복과 같은 증상을 유도할 수 있으나 환자들은 또한 심한 저혈당증 위험에 처하고 상기 저혈당증은 발작, 혼수 및 심지어 사망을 유발할 수 있다. 환자가 불평하는 저혈당증과 관련된 전형적인 증상은 피로, 쇠약증, 약간 떠는 증상 및 공복을 포함한다. 많은 환자들은 낮은 혈당 기원의 증상을 예방하기 위해 자주 식사를 해야 한다. 일부 환자들은 낮은 혈당 때문에 정신적 증상을 나타낼 수 있다.
현재, 인슐린종 또는 다른 심각한 형태의 고인슐린혈증을 갖는 환자들은 부분적 췌장 절제 또는 일부 경우에 인슐린 생성을 감소시키는 디아족시드 또는 소마토스타틴과 같은 약물의 투여에 의해 치료된다. 몇몇 경우에 글루코스는 연속적으로 주입되어야만 한다. 펩타이드 INSR 길항제가 보고되었지만(문헌참조: Schaffer et al, BBRC 376: 380-383, 2008), 순환계 인슐린의 효과를 감소시키는 기존의 치료는 없다. 길항제 및/또는 INSR에 결합하는 인슐린의 음성 조절제는 수술전 또는 치료학적 준비의 일부로서 인슐린종을 갖는 환자를 안정화시키기 위해 유용할 수 있다. 길항제 및/또는 음성 조절제는 또한 카포시 육종을 치료하기 위해 유용하다.
추가로, 미국에서 투석을 받은 상당수의 환자들(25,000 내지 100,000)은 신부전증(만성 콩팥 질환, 만성 신장 질환, 만성 콩팥 부전증, 만성 신부전증, 확립된 만성 콩팥 질환)으로 인해 저혈당증을 나타내고 본원에 기재된 INSR의 길항제 또는 음성 조절제를 사용한 치료가 이득이 될 수 있다.
INSR에 결합하는 인슐린의 길항제 및/또는 음성 조절제는 피검체내에서 고인슐린혈증과 관련된 장애 및 증상을 치료하고/하거나 이의 발병 가능성을 감소시키기 위해, 예를 들어, 저혈당과 관련된 불안, 비정상적인 공복, 비정상적인 피곤, 과식, 정신적 증상 및/또는 저혈당증(저혈당증 관련 발작, 혼수 및 사망을 포함함)을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 따라서, INSR에 결합하는 인슐린의 길항제 및/또는 음성 조절제를 사용하여 다양한 유형의 지속적인 고인슐린혈증 병태, 예를 들어, 인슐린생상세포증(nesidioblastosis) (KATP-H1 확산 질환, KATP-H1 초점 질환, 또는 "PHHI"), GDH-H1 (고인슐린증/고인슐린혈증 증후군(HI/HA), 류신-민감성 저혈당증 또는 디아족사이드-민감성 저혈당증), 섬 세포 이상조절 증후군, 유아의 특발성 저혈당증, 유아의 지속적인 고인슐린혈증성 저혈당증(PHHI), 선천성 고인슐린증, 인슐린종, 인슐린 과용, 신부전증으로 인한 저혈당증(급성 또는 만성) 및 만성 콩팥 질환, 예를 들어, III형, IV형 또는 V형을 치료할 수 있다.
INSR 효능제/양성 조절제에 대한 진단학적 징후
인슐린 수용체에 특이적 항체는 당뇨병을 진단하기 위한 도구로서 사용되었다. 미국 특허 제7,732,154호는 당뇨병에 대한 진단으로 인슐린 수용체 서브유니트 A(IR-A)에 대한 폴리클로날 항체를 기재하고 있고, 상승된 수준의 유리된 IR-A가 당뇨병 및 암 환자의 혈청에서 검출되었다. 본원에 기재된 INSR 항체는 INSR 또는 인슐린의 수준이 환자에서 당뇨병 또는 인슐린 내성을 나타내는지를 결정하기 위해 환자로부터의 샘플에서 인슐린 수용체, 예를 들어, 수용성 인슐린 수용체 A 또는 인슐린 수준을 측정하기 위해 유용하다. 다른 건강한 개체에서 이들 인자의 정상적인 허용가능한 수준과 비교하여 인슐린 또는 인슐린 수용체의 변화된 수준을 갖는 피검체는 당뇨병 또는 인슐린 내성을 갖거나 이의 위험에 처할 수 있다. 본원에 기재된 INSR 항체는 또한 INSR 또는 인슐린의 수준이 환자에서 암을 나타내는지를 결정하기 위해 환자로부터의 샘플에서 인슐린 수용체, 예를 들어, 가용성 인슐린 수용체 A 또는 인슐린 수준을 측정하기 위해 유용하다. 다른 건강한 개체에서 이들 인자의 정상적인 허용되는 수준과 비교하여 인슐린 또는 인슐린 수용체의 변화된 수준을 갖는 피검체는 암을 갖거나 이의 위험에 처할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 중 어느 하나를 사용하여 인슐린 내성 또는 인슐린 민감성을 진단하는 방법을 제공한다. 하나의 앙태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 항체를 사용하여 피검체로부터 샘플에서 인슐린 또는 인슐린 수용체, 예를 들어, 가용성 인슐린 수용체-A의 수준을 측정하고(이때 인슐린 또는 인슐린 수용체의 변형된 수준은 당뇨병, 인슐린 내성, 인슐린 민감성 또는 암을 갖거나 이의 위험에 처해있다), 임의로 당뇨병, 인슐린 내성, 인슐린 민감성 또는 암을 갖거나 이의 위험에 처해있는 상기 피검체에게 치료제를 투여함을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 샘플은 생물학적 샘플이다. 몇몇 양태에서, 상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 뇨, 유두 분비물, 뇌척수액 및 종양 생검으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 샘플중에 인슐린 수용체를 측정하는 방법은 면역분석, 경쟁 억제 분석, 면역침전 분석 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
조절제 투여 효과를 측정하는데 유용한 분석
피검체에 양성 또는 음성 조절제 항체의 투여 효과는 생체내 및 시험관내에 측정한다. 하나의 양태에서, 인슐린/인슐린 수용체 활성을 양성으로 조절하는 항체는 피검체에서 HbA1c, 콜레스테롤, LDL, 트리글리세라이드, 또는 비-에스테르화된 지방산 및 HDL의 생체내 수준을 감소시키는 것으로 고려된다. 이들 인자는 당업자에게 통상적인 기술을 사용하여 측정한다.
양성 조절제 항체를 투여받은 피검체는 또한 감소된 체중 또는 감소된 체중 증가, 저혈당증 또는 고혈당증의 감소된 빈도수 및/또는 횟수 및 개선된 HDL/LDL 비율, 인슐린 분비, 혈당 조절 (글루코스 내성 시험 GTT에 의한 측정시), 인슐린 민감성(인슐린 내성 시험(ITT)에 의한 측정시), 베타-세포 기능(예를 들어, 세포 질량, 인슐린 분비, C-펩타이드 수준에 의한 측정시), 베타-세포 휴면, 이상지질혈증을 보여줄 수 있다.
개선된 인슐린 내성은 간, 지방 조직 및/또는 근육에서 하기 중 어느 하나의 정상화된 유전자 발현에 의해 측정한다: Pck1 (PEPCK), G6pc (G6Pase), Srebf1 (SREBP-1), Gck (GK), Ppargc1a (PGC-1), Abca1 (ABC-1), Acaca (아세틸-CoA 카복실라제), IL1b (IL-1beta), IL6 (IL-6), Tnf (TNF-알파), Ccl2 (MCP-1), Slc2a4 (GLUT4), Il-1rn (IL-1ra), CD68, SAA1, SAA2, FAS (지방산 신타제), Emr1 (F4/80), Irs1, Irs2. 상기는 당업계에 널리 공지된 기술로 측정한다.
시험관내 분석은 또한 인슐린/인슐린 수용체 활성의 조절제의 투여 효과를 측정하기 위해 유용하다. 양성 조절제 항체는 세포 표면으로 GLUT4의 이동을 증가시키는 것으로 예상된다. 세포내 위치에서 세포질막으로의 GLUT4의 위치이동을 측정하는 방법은 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제 6,632,924호, US 2007/0141635, US 2003/0104490 및 Liu et al, Biochem. J. 418(2), 413-20 (2009)]에 제공되어 있다. 양성 조절제의 효과는 또한 간, 지방 및/또는 근육 세포에 의한 증진된 글루코스 흡수, 간, 지방 및/또는 근육 세포 배양 배지로부터 글루코스의 증진된 고갈을 분석하고, 증가되거나 변화되지 않은 유사분열성 INSR 시그날 전달에 대한 대사적 시그날 전달의 비율, pAKT 활성화, 및 pIRS-1 활성화를 측정함에 의해 평가할 수 있다. 인슐린-INSR 상호작용의 상대적 힐(Hill) 기울기는 또한 측정 가능하다. 그러나 , 몇몇 용량 반응 곡선은 표준 곡선보다 가파르거나 얕다. 상기 가파름은 또한 기울기 인자로 불리우는 힐 기울기로 정량한다. 표준 기울기를 갖는 용량 반응 곡선은 1.0의 힐 기울기를 갖는다. 보다 가파른 곡선은 보다 높은기울기 인자를 가지며, 보다 얕은 곡선은 보다 낮은 기울기 인자를 갖는다. 이들 인자를 분석하기 위한 분석의 예는 실시예에 기재되어 있다.
약제 전달 제제로서 INSR 항체의 사용
INSR, 83-14에 대한 항체는 혈뇌 장벽을 거쳐 단백질 및 비-바이러스 유전자 치료제를 전달하기 위해 "분자 트로이안 말"(molecular Trojan horse)을 생성시킬 목적으로 사람화시켰다. 83-14 결합은 INSR의 신속한 내재화를 구동시킨다. 따라서, 상기 성질 또는 개선된 성질을 갖는 추가의 항체는 뇌 및 중추신경계로 약물 전달을 위해 유용할 수 있다 (문헌참조: Boado et al, Biotech and BioEng. 96(2): 381-391; WO04/050016).
키트
추가의 측면으로서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위해 이들의 사용을 촉진시키는 방식으로 팩키징된 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 키트는 밀봉된 병 또는 용기와 같은 컨테이너에 팩키징되고 방법을 수행하는데 있어서 화합물 또는 조성물의 용도를 기재하고 있는 팩키지에 포함되거나 컨테이너에 부착된 표지와 함께 본원에 기재된 화합물 또는 조성물(예를 들어, 단독으로 또는 제2 제제와 배합된 인슐린 수용체 또는 인슐린/인슐린 수용체 복합체-특이적 항체를 포함하는 조성물)을 포함한다. 바람직하게, 상기 화합물 또는 조성물은 단위 용량 형태로 팩키징된다. 상기 키트는 특정 투여 경로에 따라 조성물을 투여하거나 스크리닝 분석을 수행하기 위해 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 키트는 항체 조성물의 용도를 기재하는 표지를 함유한다.
추가의 측면 및 본 발명의 상세한 기재는 하기의 실시예로부터 자명할 것이고 이는 제한적이기 보다는 설명을 위한 것이다.
실시예
실시예 1
항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 항-INSR 항체의 분리
(1) 파아지 패닝 및 구제
A. 천연 항체 파아지 디스플레이 라이브러리
사람 인슐린 수용체 (hINSR) (R&D Systems, MN)는 제조업자의 프로토콜을 사용하여 설포-NHS-LC-비오틴 (Pierce, Rockford, IL) 및 16배 몰 과량의 비오틴 시약으로 비오티닐화시켰다. hINSR의 비오티닐화는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 확인하였다.
파아지 패닝의 1라운드를 위해, scFv 파아지 디스플레이 라이브러리 (BioInvent, Lund, Sweden) 기원의 1.6x1011 cfu의 파아지 입자는 약하게 회전시키면서 1ml의 5% 밀크/PBS (Teknova, Hollister, CA) 중에서 실온(RT)에서 1시간 동안 차단시켰다. 차단된 파아지는 스트렙타비딘 피복된 자기 Dynabeads® M-280 (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)에 대해 30분 동안 2회 탈선별하였다. 비오틴-hINSR-hINS 복합체를 형성하기 위해, 100 p몰의 비오티닐화된 hINSR은 약하게 회전시키면서 RT에서 1시간 동안 5% 밀크/PBS 중에 용해된 과량(2,100p몰) 사람 인슐린(hINS)(Sigma, MO)과 예비 항온처리하였다. 제2 라운드의 패닝을 위해, 50 p몰의 비오틴-hINSR은 1050 p몰의 hINS와 함께 사용하였다. 최종 라운드의 패닝을 위해, 25 p몰의 비오틴-hINSR은 525 p몰의 hINS로 항온처리하였다.
상기 비오틴-hINSR/hINS 용액은 약하게 회전시키면서 30분 동안 차단된 스트렙타비딘 피복된 자기 Dynabeads® M-280 (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)으로 항온처리하여 비오틴-hINSR-hINS 복합체를 고정화시켰다. 탈선별된 파아지는 RT에서 2시간 동안 비오틴-hINSR-hINS 스트렙타비딘과 항온처리하였다. hINSR을 hINS로 포화시키기 위해, 추가의 hINS (2,100 p몰)를 상기 용액에 첨가하였다. 상기 비드를 세척하였다. 제1 라운드의 패닝을 위해, 비드를 신속하게 3회 PBS-0.1% TWEEN으로 세척하고(즉, 비드를 자기를 사용하여 용액으로부터 인출하고 1ml의 세척 완충액 중에 재현탁시켰다) 이어서 PBS로 3회 세척하였다. 제2 라운드의 패닝을 위해, 비드를 PBS-0.1% TWEEN으로 5회 신속하게 세척함에 이어서 PBS-0.1% TWEEN로 1회 5분 동안 (실온에서 약한 회전과 함께 1ml의 세척 완충액 중에서) 세척하고 이어서 5회 PBS로 세척함에 이어서 PBS로 1회 5분 동안 세척하였다. 제3 라운드의 패닝을 위해, 비드를 PBS-0.1% TWEEN으로 4회 신속하게 세척하고, 이어서 PBS-0.1% TWEEN으로 5분 동안 2회 세척하고 이어서 PBS로 4회 신속히 세척하고 이어서 PBS로 2회 5분 동안 세척하였다.
hINSR-hINS-결합된 파아지는 100mM 트리에틸아민(TEA)으로 용출시키고(RT에서 30분 항온처리) 이어서 1M 트리스-HCl(pH 7.4)로 중화시켰다. 상기 용출된 파아지를 사용하여 이들이 ~0.5의 OD600 도달한 경우 TG1 세균 세포(Stratagene, CA)에 감염시켰다. 진탕 없이 37℃에서 30분 동안 및 90rpm으로 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 감염시킨 후, 세포를 펠렛화하고 100 ug/ml 암피실린 및 2% 글루코스가 보충된 2YT 배지에서 재현탁시켰다. 상기 재현탁된 세포는 100 ug/ml 카베니실린 및 2% 글루코스를 갖는 2YT 한천 플레이트상에 분주하고 30℃에서 밤새 배양하였다.
이어서 파아지는 감염 다중도 (MOI) ~ 10에서 헬퍼 파아지 VCSM13 (New England Biolabs, MA)로 구제하였다. 회전시키는 것 없이 30분 동안 37℃에서 및 150rpm에서 37℃에서 30분 항온처리로 헬퍼 파아지 감염 후, 세포 펠렛을 100 ug/ml 암피실린 및 50 ug/ml의 가나마이신이 보충된 2YT 배지에 재현탁시켜 30℃에서 밤새 성장시켰다. 상등액 중 파아지는 왕성한 원심분리 후 회수하고, 다음 라운드의 패닝을 위해 사용하였다. 파아지 선별로부터 비롯된 집적을 모니터링하기 위해, 투입 및 생성 파아지의 양은 제3 라운드의 패닝을 위해 적정하였다.
유전자 III 절개 및 세균 세포막주변공간 추출물의 제조
hINSR-hINS 복합체로의 결합에 대한 파아지 패닝 생성 scFv 클론을 스크리닝하기 전에, 유전자 III를 먼저 파아지미드 벡터로부터 절개하여 분비된 scFv가 생성될 수 있도록 하였다. 이를 수행하기 위해, 제3 패닝 라운드 생산 풀의 클론의 플라스미드 소형 프렙(Qiagen, Valencia, CA)을 제한효소 EagI (New England Biolabs, MA)로 분해시켰다. 이어서 , 유전자 III가 없는 분해 생성물을 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, MA)에 자가연결하고 이를 사용하여 화학적 컴피턴트 TOP10 E. coli 세포를 형질전환시켰다 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 이어서, 96웰 플레이트에서 개별 형질전환된 콜로니를 사용하여 빙냉 PPB 용액(Teknova, Hollister, CA) 및 2차 증류수(ddH2O)의 1:3 용적비, 및 2개의 프로테아제 칵테일 정제(Roche, IN)를 사용하는 표준 방법에 따라 세균 세포막주변공간 추출물을 제조하였다. 용해물 상등액은 하기된 바와 같이 ELISA로 분석하였다.
B.면역화된 항체 파아지 디스플레이 라이브러리
OmniclonalTM 파아지 디스플레이 라이브러리는 미국 특허 제6,507,098호에 기재된 방법에 따라 hINSR-hINS 복합체로 초면역화된 마우스로부터 제조하였다. 상기 면역화 물질은 적당히 동량 몰량의 재조합 사람 인슐린 (cat # I9278, Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, MO) 및 재조합 사람 INSR (28-956) (cat # 1544-IR/CF, R&D Systems, MN)로 이루어져 있다. 상기 복합체의 단백질 농도는 약 0.24 mg/ml이었다. 미국 특허 제6,057,098호의 프로토콜에 따라 OmniclonalTM 라이브러리로부터 수득된 단일 콜로니를 하기된 바와 같은 ELISA 분석으로 결합 활성에 대해 스크리닝하였다.
(2) hINSR / hINS 복합체상에서 항체 클론의 ELISA 스크리닝
ELISA Maxisorp® 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY)를 PBS 중의 3 ug/ml의 hINSR을 사용하여 4℃에서 밤새 피복시켰다. 이어서 플레이트를 1시간 동안 RT에서 400 ul/웰 5% 밀크/PBS로 차단시켰다. hINSR-hINS 복합체를 함유하는 웰을 생성하기 위해, 50 ul/웰의 hINS (2.1 uM)를 RT에서 30분 동안 hINSR에 결합시켰다. 세균 세포막주변 공간 추출물을 또한 5% 밀크/PBS로 1시간 동안 차단시키고 이어서 피복된 ELISA 플레이트 (50 ul/well)에 첨가하고 RT에서 2시간 동안 ELISA 플레이트상에서 hINSR 또는 hINSR-hINS 복합체 중 어느 하나에 결합되도록 하였다. 쥐 83-7 항-hINSR mAb를 양성 ELISA 스크리닝 대조군 (문헌참조: Soos et al, Biochem. J. 235: 199-208, 1986)으로서 사용하였다. 결합된 scFv 단편을 RT에서 1시간 동안 쥐 항-c-myc mAb (Roche, IN)에 이어서 염소 항-마우스 HRP-접합된 항혈청 (Thermo Scientific, Rockford, IL)으로 검출하였다. ELISA 스크리닝의 매 단계 후 PBS-0.1% TWEEN-20 (Teknova, Hollister, CA)으로 3회 세척을 수행하였다. 양성 대조군 83-7 mAb는 RT에서 1시간 동안 항온처리한 후 염소 항-마우스 HRP (Thermo Scientific, Rockford, IL)로 검출하였다. 450nm 흡광도에서 50 ul/웰의 가용성 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (EMD chemicals, Calbiochem, NJ)을 사용하여 발색시키고 1M H2SO4 (50 ul/웰)로 중지시켰다.
결과
세균 세포막주변공간 추출물의 ELISA 스크리닝으로 파아지 패닝 선별로부터 기원하는 다중 hINSR 또는 hINSR-hINS 복합체 결합제를 동정하였다. 무자극 라이브러리로부터 선택된 58% (1,488개 중 868개)의 클론은 hINSR 또는 hINSR-hINS 복합체에 결합할 수 있었다. 면역화된 라이브러리로부터 선택된 53%(465개중 200개)의 클론은 hINSR 또는 hINSR-hINS 복합체에 결합할 수 있었다. 선택된 클론으로부터의 세포막주변공간 추출물을 또한 FACS로 분석하였다 (실시예 2 참조). 선택된 클론은 IgG1 또는 IgG2 항체로서 재포맷팅하였다. 선택된 scFv 단편의 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)는 PCR 증폭시키고 항체 불변 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터에 클로닝하고, 표준 방법을 사용하여 293E EBNA 사람 세포에 형질감염시켰다.
실시예 2
사람 인슐린 존재 또는 부재하에 INSR에 결합하는 항체를 결정하기 위한 수용체 점령 스크리닝
본 실시예는 사람 인슐린(hINS)의 존재 및 부재하에 세포에 결합하는 차등 항체를 측정하기 위한 유동 세포측정기(FACS) 기반 분석의 용도를 기재하고 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리 기원의 항-인슐린 수용체 (INSR) 항체는 INS-INSR 결합의 조절제를 동정하기 위한 분석에서 스크리닝하였다.
IM-9 세포는 기탁기관(American Type Culture Collection (ATCC))으로부터 수득하였고 RPMI 1640+10% FBS중에 유지시켰다. 분석에 사용하기 전에 세포를 무혈청 RPMI 1640에서 세척하고, 계수하고 농도를 RPMI 1640+0.5% BSA (Sigma-Aldrich) 중에서 2x106 세포/ml로 조정하였다. 상기 세포는 상기 배지에서 밤새 배양하고 "혈청-고갈된"으로서 지정하였다. 이들 세포는 1회 세척하고 0.5% BSA 및 0.01% 아지드화나트륨 (FACS 완충액)을 함유하는 PBS 중에서 2x106 세포/ml로 재현탁시켰다.
인슐린에 노출된 세포는 70nM 사람 인슐린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이 보충된 FACS 완충액 중에서 재현탁시켰다. 양 세포 집단 (+hINS) 또는 (-hINS)는 30분 동안 4℃에서 항온처리하고, FACS 완충액으로 1회 세척하고 FACS 완충액에서 2x106 세포/ml로 재현탁시켰다. 25 마이크로리터 세포 적정액을 96 웰 플레이트에 분주하고 25ul의 항체 또는 PPE와 혼합하고 1시간 동안 빙상에서 항온처리하였다.
이어서, 상기 세포를 1회 FACS 완충액으로 세척하고 항체의 결합은 적당한 형광발색단 접합된 2차 항체 25 ul를 부가하여 검출하였다. 초기 항온처리가 myc-태그된 항체를 함유하는 PPE로 수행되는 경우, 25ul의 1/1000으로 희석된 항-c-myc 항체 (Roche)는 웰에 부가하였고 상기 세포는 30분 동안 빙상에서 항온처리하였다. 이어서, 상기 세포는 FACS 완충액으로 1회 세척하고 항-c-myc의 결합은 피코에리트린-접합된 항-마우스 IgG를 부가하여 밝혔다. 빙상에서 최종 15분 항온처리한 후 세포를 세척하고 펠렛을 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. 상기 세포는 FACSCANTM (Becton-Dickinson, Milipitas, CA)상에서 분석하고 데이터는 FLOWJOTM (Treestar, Ashland, OR) 및 Microsoft ExcelTM을 사용하여 분석하였다.
상기 분석은 4개 유형의 항체의 검출을 가능하게 하였고 이의 예는 도 1에 나타낸다:
1. 항체가 사람 인슐린에 노출되어 전적으로 INS/INSR 복합체에 결합하는 경우에 IM-9 세포에만 결합하는 항체
2. 항체가 사람 인슐린에 노출되어 INS/INSR 복합체에 우선적으로 결합하는 경우 IM-9 세포에 보다 잘 결합하는 항체
3. 항체가 사람 인슐린에 노출되어 비복합체화된 INSR에 우선적으로 결합하는 경우 IM-9 세포에 덜 결합하는 항체.
INS/INSR 복합체에 결합하는 항체:비복합체화된 INSR에 결합하는 항체의 비가 1.3을 초과하는 경우 항체를 예측된 바와 같이 양성 조절제인 것으로 평가하였다 . INS/INSR 복합체에 결합하는 항체:비복합체화된 INSR에 결합하는 항체의 비가 0.6 미만인 경우 항체를 예측된 바와 같이 음성 조절제인 것으로 평가하였다. INS/INSR 복합체에 결합하는 항체:비복합체화된 INSR에 결합하는 항체의 비가 0.9초과 내지 1.1 미만인 경우 항체를 예측된 바와 같이 비-조절제인 것으로 평가하였다.
실시예 3
INSR에 결합하는 인슐린에 대한 항-INSR 항체의 효과를 결정하기 위한 비오티닐화된 리간드 스크리닝
본 실시예는 항-INSR 항체의 존재 또는 부재하에 세포에 결합하는 차등 리간드(사람 인슐린)를 측정하기 위한 FACS 기반 분석의 용도를 기재하고 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리 기원의 항-INSR 항체는 INS-INSR 복합체의 조절제를 동정하기 위한 분석에서 스크리닝하였다.
IM 9 세포는 기탁기관(American Type Culture Collection (ATCC) )으로부터 수득하였고 RPMI 1640+10% FBS 중에 유지시켰다. 분석에 사용하기 전에 세포를 무혈청 RPMI 1640중에서 세척하고 계수하고 농도를 RPMI 1640+0.5% BSA (Sigma-Aldrich) 중에서 2x106 세포/ml로 조정하였다. 상기 세포를 배지에서 밤새 항온처리하고 "혈청-고갈된"으로서 지정하였다. 이들 세포를 1회 세척하고 0.5% BSA (결합 완충액)를 함유하는 PBS 중에서 2x106 세포/ml로 재현탁하였다.
혈청 고갈 세포를 실온에서 15분 동안 INSR 항체에 사전 노출시키고 이어서 실온에서 추가의 30분 동안 제조원(R&D Systems)으로부터 구입한 다양한 농도의 비오티닐화된 사람 인슐린으로 항온처리하였다. 비오티닐화된 인슐린의 결합은 실온에서 추가의 15분 동안 상기 혼합물에 1/100 희석된 스트렙타비딘-피코에리트린을 부가하여 밝혀졌다. 이어서, 상기 세포를 결합 완충액으로 1회 세척하고 0.5% BSA, 0.1% 아지드화나트륨 및 2% 파라포름알데하이드를 함유하는 동일 용적의 PBS 중에 재현탁시켰다. 상기 세포를 FACSCANTM (Becton-Dickinson, Milipitas, CA)상에서 분석하고 상기 데이터는 FLOWJOTM (Treestar, Ashland, OR) 및 Microsoft ExcelTM 둘다로 분석하였다.
도 2는 상이한 인슐린 농도에서 항-INSR 항체의 존재 또는 부재하에 IM9 세포로의 비오티닐화된 인슐린의 결합을 보여준다. 항체 83-7은 비오티닐화된 인슐린의 결합을 증진시켰고; 항체 MA-20은 비오티닐화된 인슐린의 결합을 감소시켰고; 대조군 마우스 IgG는 비오티닐화된 인슐린의 결합에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다.
실시예 4
pIRS-1 인산화를 자극하는 항-INSR 항체의 능력을 결정하기 위한 분석
INSR에 의해 인산화된 기질 단백질은 인슐린 수용체 기질 1(IRS-1)로 불리우는 단백질을 포함한다. pIRS-1로부터의 IRS-1 인산화는 궁극적으로 인슐린 반응성 조직의 외막에 대한 고친화성 글루코스 수송체(Glut4) 분자의 증가를 유도하고 따라서 혈액으로부터 이들 조직으로의 글루코스 흡수를 증가시킨다. pIRS-1 분석은 Luminex® 기술 플랫폼 (Luminex Corp., Austin, TX)을 사용하여 개발하였다. 2개의 분석 방식이 개발되었다: (a) 고정된 인슐린 농도에서 시험 항체의 적정, 및 (b) 고정된 항체 농도에서 인슐린의 적정. 복합체화되고 비복합체화된 INSR에 차등적으로 결합하는 기준으로 선택된 항-INSR 항체는 INS-INSR 복합체 시그날 전달의 조절제를 동정하기 위한 분석에서 시험하였다.
세포 처리 및 용해
IM-9 세포는 계수하고, 원심분리하고 PBS로 1회 세척하고 약 2x106 세포/ml로 RPMI + 0.5% Sigma Cohn V BSA (RPMI 중의 10% 스톡, 여과 멸균, 4℃ 저장)중에서 재현탁시켜 16 내지 20시간 동안 혈청 고갈시켰다.
인슐린의 2X 농축된 용액 (Sigma I-9278 (10mg/ml) 4C에서 보관된 1.77mM 액체 스톡) 희석액을 RPMI +0.5% BSA 중에서 제조하였다. 표준 인슐린 적정액은 예를 들어, 6.25nM, 1.56nM, 0.39nM, 0.097nM, 0.024nM, 0.006nM, 0.0015nM, 0nM의 4배 연속 희석을 포함할 수 있다.
밀리플렉스(Milliplex) MAP 세포 시그날 전달 완충액 및 검출 키트 (Millipore catalog # 48-602) 및 포스포-IRS-1 MAP 메이트 (Millipore catalog # 46-627)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 pIRS-1 수준을 검출하였다. 간략하게, 50ul/웰의 2X 처리 배지 (0.5% BSA +/- 시험 항체를 함유하는 RPMI )를 함유하는 V-기저 플레이트를 제조하고 50ul RPMI+0.5% BSA 중에 재현탁된 1 x 106 세포 혈청 고갈된 IM-9 세포를 웰당 첨가하였다. (a) 연속 희석된 인슐린을 함유하는 웰에 적용된 단일 항체 농도에서 벌크 항체/세포 혼합물로서 또는 (b) 세포를 연속 희석 항체를 함유하고 0.1nM로 인슐린으로 스파이킹된 웰에 직접 첨가함에 의해 항체 전처리를 인슐린 처리 전에 15분 동안 수행하였다. 플레이트는 37℃ 항온처리기에 넣고 처리시간의 마지막 3분 동안(총 15분) RT에서 1500rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 기울이고 약하게 블롯팅하여 제거하고 처리된 세포 펠렛을 하기 표 4에 따라 제조된 100ul 용해 완충액으로 다중 채널 피펫을 사용하여 3회 적정함에 의해 용해시켰다 (불안정한 성분, 즉 프로테아제 억제제 및 벤조나제는 사용 직전에 첨가하여다. 플레이트는 30분 동안 RT에서 진탕기상에 위치시키고 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하여 용해물을 세정하고 적정 동안에 발생할 수 있는 모든 기포를 제거하였다. 50ul의 세정된 용해물을 제거하고 검출 키트로부터의 50uL 분석 완충액-1(AB-1) 중에서 1:1로 희석하고 혼합하기 위해 2 내지 3회 적정하고 50ul를 25 ul/ml 웰의 희석된 비드의 상부상에 여과기 플레이트 막상으로 로딩하였다 (하기참조).
용해 완충액 성분
용해 완충액 10 웰 20 웰 25 웰 30 웰 40 웰 50 웰 60 웰 100 웰
　 1 ml 2 ml 2.5 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 10 ml
용해 완충액 (Millipore cat. # 43-040) 1 2 2.5 3 4 5 6 10
SDS 20% 스톡 0.045 0.09 0.1125 0.135 0.18 0.225 0.27 0.45
MgCl 50mM (Invitrogen cat. # Y02016) 0.02 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 0.12 0.2
프로테아제 억제제 (50X) (Millipore cat. # 20-201) 0.02 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 0.12 0.2
벤조나제 EMD 1.01697.0002 @ 250ug/ml 0.004 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 0.024 0.04
여과기 플레이트 막 (Millipore Catalog# MABVN1250)을 25ul AB-1/웰로 미리 습윤화시켰다. 사전 습윤화 완충액은 막을 건조시키지 않도록 주의하면서 밀리포어 진공 매니폴드를 사용하여 여과기 플레이트로부터 흡인제거하고 모든 잔류 액체를 여과기 플레이트의 기저로부터 블롯팅하였다. 25ul의 1X 비드 현탁액을 웰당 첨가하였다(pIRS-1 비드 (Millipore catalog # 46-627)는 20X 농축물을 AB-1 완충액으로 희석하고 또한 와동시키고 각각 5초 3회 동안 초음파 처리하여 미리 제조하였다.
여과기 플레이트 웰은 플레이트 밀봉제로 덮고 알루미늄 호일에 감싸서 광 노출을 차단하고 플레이트 진탕기상에서 실온에서 2시간 동안 또는 대안으로 4℃에서 밤새 항온처리하였다.
루미넥스 검출
상기 여과기 플레이트를 흡인하고 이들의 기저를 블롯팅하였다. 비드를 웰에 잔류시키고 100ul의 AB-1로 세척하고 1 내지 2분 동안 진탕기상에 위치시켰다. 플레이트를 흡인하고 세척 단계를 반복하였다.
20X 스톡으로부터 AB-1 완충액으로 희석된 웰당 25ul의 1X 비오티닐화된 검출 항체를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 RT에서 항온처리하였다. 플레이트를 흡인하고 이들의 기저를 블롯팅하였다. 25X 스톡으로부터 AB-1 완충액으로 희석된 웰당 25ul의 1X 스트렙타비딘 피코에리트린을 첨가하고 플레이트를 RT에서 15분 동안 진탕기상에서 항온처리하였다. 25ul의 증폭 완충액 (Millipore catalog # 48-602)을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 추가로 15분 동안 RT에서 진탕기상에서 항온처리하였다. 상기 플레이트를 흡인하고 비드를 150uL AB-1 중에 재현탁시키고 Luminex® 장치상에서 판독하였다.
결과
도 3은 고정된 농도의 대표적인 시험 항체의 존재하에 인슐린 적정으로부터의 pIRS-1 분석 결과를 보여준다. MFI는 곡선 피트 최대값이 100%로 조정되도록 표준화시켰다. 몇몇 항체(양성 조절제)는 인슐린 적정 곡선을 좌측으로 이동시켰다. 다른 항체(음성 조절제)는 인슐린 적정 곡선을 우측으로 이동시켰다. 다양한 조절 정도가 관찰되었다. 도 3에서의 데이터는 항체가 인슐린 민감성에서 9배까지 증가하거나 24배까지 감소함을 보여준다.
도 4는 pIRS-1 분석 데이터를 기준으로 다양한 기능성 부류의 항체의 대표적인 예를 보여준다. 각각의 경우에 2개의 분석 방식으로부터의 결과가 나타난다: (i) 고정된 농도의 항체에서 인슐린의 적정, 및 (ii) 고정된 농도의 인슐린에서 시험 항체의 적정.
도 5는 고정된 농도의 다양한 시험 항체의 존재 또는 부재하에 pIRS-1 분석으로부터의 인슐린 EC50 값을 보여주는 표이다. 상기 결과는 EC50 비율 +Ab/-Ab에 따라 등급화하였다.
실시예 5
AKT 및 MAPK의 INSR 유도된 인산화에 대한 항-INSR 항체의 효과 측정
INSR은 인슐린 결합 후 자가인산화를 진행시키는 티로신 키나제이고 후속적으로 인슐린 수용체 기질(IRS) 계열 구성원 Shc 및 Gab1과 같은 세포내 단백질의 인산화를 촉매한다. 이들 각각의 단백질은 PI(3)K/AKT 및 MAP 키나제 (MAPK) 경로를 포함하는 다양한 시그날 전달 경로를 활성화시키는 다운스트림 시그날 전달 분자의 징집을 위한 도킹 부위로서 작용한다. 이들 경로는 궁극적으로 협력하여 세포 성장 및 분화, 유전자 발현, 글리코겐, 단백질 및 지질 합성 및 글루코스 대사를 조절한다.
INS/INSR 복합체를 통한 시그날 전달에 대한 시험 항체의 효과는 INSR 시그날 전달에 특이적인 특이적 세포내 단백질, 예를 들어, AKT 및 MAPK(ERK1/2)의 인슐린 유도된 세린 또는 티로인 인산화를 증강시키는 항체의 능력을 평가함에 의해 측정할 수 있다. 이들 단백질의 인산화는 전기화학발광, 웨스턴 블롯팅, ELISA 및 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 측정하고 정량할 수 있다.
본 실시예의 분석에서, 사람 또는 마우스 INSR을 발현하도록 유전자가공된CHOK1 세포를 사용하였다. 이들 세포는 CHO 세포를 위한 EX-CELL 302 무혈청 배지 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 2 mM L-글루타민, 및 0.4 mg/mL의 GENETICIN®(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 함유하는 성장 배지에 유지시켰다. 모 CHOK1 세포는 대조군으로서 사용하고 GENETICIN® 없이 성장 배지에 유지시켰다.
분석 전날에, 세포는 PBS로 세척하고 RPMI 1640 (Invitrogen), 2 mM L-글루타민, 0.4 mg/mL GENETICIN® 및 0.5% BSA를 함유하는 고갈 배지에 1 x 106 세포/mL로 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2 항온처리기에서 16 내지 20시간 동안 항온처리하였다. 모 CHOK1 세포는 GENETICIN® 없이 고갈 배지에서 항온처리하였다. 다음날에 세포는 0.5% BSA를 갖는 PBS 중에 재현탁시키고 1 x 105 세포를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 상기 시험 항체는 대략 인슐린 첨가 10분 전에 0, 1, 또는 10 ug/ml으로 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 항온처리기에서 5 내지 60분 동안 항온처리한 후, 처리된 세포를 원심분리하고 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 포스파타제 억제제 칵테일 1 및 2 (Sigma-Aldrich), 및 완전한 소형 프로테아제 억제제 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)를 함유하는 완충액 중에서 1시간 동안 4℃에서 진탕시켜 용해시켰다. 상기 용해물은 3분 동안 485 x g에서 원심분리하여 세정하였다. 메소스케일 디스커버리 멀티-스팟 분석 시스템(MesoScale Discovery Multi-spot Assay System)(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)을 사용하는 전기화학발광을 사용하여 용해물 내에 존재하는 인산화된 AKT 또는 MAPK의 양을 정량하였다. 데이터는 GraphPad Prism®(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) 소프트웨어를 사용하여 분석하므로써 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 EC50 값을 계산하였다.
효능제 활성의 분석을 위해, 상기 분석은 다음과 같이 수행하였다. 분석 전날에, 세포는 PBS로 세척하고 RPMI 1640 (Invitrogen), 2 mM L-글루타민, 0.4 mg/mL GENETICIN® 및 0.5% BSA를 함유하는 고갈 배지에 1 x 106 세포/mL로 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2 항온처리기에서 16 내지 20시간 동안 항온처리하였다. 모 CHOK1 세포는 GENETICIN® 없이 고갈 배지에서 항온처리하였다. 다음날에 세포는 0.5% BSA를 갖는 PBS 중에 재현탁시키고 1 x 105 세포를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 항온처리기에서 5 내지 60분 동안 시험 항체를 항온처리한 후, 처리된 세포를 원심분리하고 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 포스파타제 억제제 칵테일 1 및 2 (Sigma-Aldrich), 및 완전한 소형 프로테아제 억제제 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)를 함유하는 완충액 중에서 1시간 동안 4℃에서 진탕시켜 용해시켰다. 상기 용해물은 3분 동안 485 x g에서 원심분리하여 세정하였다. 메소스케일 디스커버리 멀티-스팟 분석 시스템(MesoScale Discovery Multi-spot Assay System)(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)을 사용하는 전기화학발광을 사용하여 용해물 내에 존재하는 인산화된 AKT 또는 MAPK의 양을 정량하였다. 데이터는 GraphPad Prism®(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) 소프트웨어를 사용하여 분석하므로써 4-파라미터 로지스틱 방정식으로부터 EC50 값을 계산하였다.
도 6은 (A) 양성 조절제(인슐린 유도된 시그날 전달을 증가시키는); (B) 효능작용을 갖는 양성 조절제(인슐린 유도된 시그날 전달을 증가시키고 인슐린 무관한 시그날 전달을 증가시키는); (C) 비-조절제(인슐린 유도된 시그날 전달상에 어떠한 유의적인 효과를 갖지 않음); (D) 효능제(인슐린과 무관하게 시그날 전달을 증가시키고 ; 조절 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있다); (E) 음성 조절제(인슐린 유도된 시그날 전달을 감소키는)를 나타내는 항체에 대한 pAKT 분석 결과를 보여준다. 분석 결과는 또한 항체가 기능적 교차 반응성을 보여주는지, 즉 사람 및 마우스 둘다의 INSR 매개된 시스날 전달에 대해 효과를 갖는지를 지적한다.
실시예 6
항-INSR 항체는 광범위한 효능작용을 나타낸다
실시예 4의 pIRS-1 분석 및 실시예 5의 pAKT 분석을 사용하여 선별된 항-INSR 항체의 효능작용 정도를 측정하였다. 항체 또는 인슐린의 적정을 사용하기 보다는 5 ug/ml의 항-INSR 항체를 인슐린의 부재하의 분석에 첨가하였다. 상기 분석으로 인슐린 부재(효능작용)하에 INSR을 통한 시그날 전달의 항체 유도된 활성화 수준을 측정하였다.
도 7은 선별된 항체가 광범위한 효능작용을 나타내는 지를 설명하기 위해 표로 만든 결과를 보여준다.
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실시예 7
양성 조절제 INSR 항체에 의해 수행되는 INSR에 결합하는 인슐린 협력성의 변화
실시예 5의 pAKT 분석은 다양한 항체 농도를 사용하고 연속 희석된 인슐린을 첨가하는 양성 조절제 항체 중 하나에 대해 수행하였다. 상기 결과는 도 8에 나타낸다. 도 8A는 상이한 농도의 항체 및 인슐린의 존재하에 INSR 결합의 용량 반응이다. 도 8B는 다양한 농도의 항체의 존재하에 인슐린-INSR 상호작용의 상대적 힐 기울기를 보여준다.
실시예 8
양성 조절제 INSR 항체에 의한 글루코스 흡수의 증진
3T3-L1 지방세포에서 글루코스 흡수에 대한 양성 조절제 INSR 항체의 효과를 측정하였다. 인슐린 처리 즉시, INSR은 인산화되고 시그날 전달 경로를 활성화시켜 지방세포(지방) 또는 단핵구(근육)에서 글루코스 수송체 4(GLUT4)에 의한 글루코스 흡수를 증가시킨다. 글루코스 흡수를 측정하는 것은 인슐린 민감성에 대한 적절한 종점 분석을 제공한다.
GLUT4에 대한 기질로서 3H-2-데옥시글루코스를 사용하는 분석을 사용하였다 (문헌참조: Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC). 간략하게, 3T3-L1 전구지방세포는 96웰 이소플레이트에서 분화시켰다. 성숙화 후, 상기 세포는 분석 완충액으로 2회 세척하고 세포는 4시간 동안 분석 완충액 중에 방치시켰다. 상기 세포는 15분 동안 0.8 nM에서 항-INSR 항체 또는 대조군 항체 (10 ug/ml) 및 일련의 농도의 인슐린, 또는 인슐린으로 처리하였다. 15분 후 글루코스 흡수는 3H-2-데옥시글루코스 칵테일을 부가하여 개시하였고 상기 세포는 10분 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 10분 후, 상기 세포는 PBS로 세척하고 용해시키고 섬광 유체와 혼합하였다. 각각의 웰의 CPM을 측정하였다. 사이토할라신 B (10μM)을 음성 대조군으로서 사용하였다.
결과는 도 9에 나타낸다. 도 9는 양성 조절제 항체에 의한 인슐린 의존성 글루코스 흡수의 증진을 보여준다. 양성 조절제 항체는 단독의 인슐린과 비교하여 10 ug/ml 시험 항체 Ab001의 존재하에 3T3-L1 세포에 의한 3H-2-데옥시글루코스 흡수를 대략 2배 증가시킨다.
이들 결과는 양성 조절제 항체가 생체내 글루코스 흡수를 유도하기 위해 유용하고 인슐린 내성을 나타내는 환자를 치료하기 위해 유용함을 시사한다.
실시예 9
세포 배양 배지에서 글루코스 고갈에 대한 항-INSR 항체의 효과 측정
세포 배양 배지로부터 글루코스의 고갈은 글루코스 흡수의 대용 측정으로 사용될 수 있다. 글루코스의 배지 고갈에 대한 항-INSR 항체의 효과는 다음과 같이 측정한다.
글루코스 고갈을 측정하기 위해, Wako 자동키트 글루코스 (Cat# 439-90901, Autokit C)를 제조업자의 지침에 따라 사용한다. 간략하게, 24 또는 96웰 플레이트에서 DMEM +10% FBS에 부차되도록 적응된 CHOK1 세포주는 적당한 농도로 분주하였다. 상기 세포는 사용전에 0.5% BSA DMEM (글루코스 부재)에서 밤새 글루코스 및 혈청이 고갈된다. 고갈 항체는 흡인하고 하기로 이루어진 배지를 시험 항체 또는 이소타입 대조군 항체의 존재 또는 부재하에 첨가한다: 그룹 1, 4부 DMEM 글루코스 부재:1 부 DMEM 높은 글루코스 (0.9 mg/mL); 그룹 2, 4부 DMEM 글루코스 부재: 1 부 DMEM 높은 글루코스 (0.9 mg/mL) + 인슐린. 각각의 목적하는 시점에서, 각각의 웰 기원의 2uL 샘플의 배지를 제거하고 118 uL의 Wako 작동 용액에 첨가하였다. 몇몇 양태에서, 샘플은 0, 1, 2-5, 5, 10, 및 24시간에 채취하였다. 글루코스 흡수는 505nm 흡광도 및 600nM에서 FLEXSTATION으로 평가하였다. 글루코스의 양은 다음과 같은 결정하였다: [유사한 샘플에 대한 평균 판독값]/[표준물에 대한 평균 판독값]. 세포 계수는 세포 성장에 대해 정상화시키는 실험 종료 전 및 종료시에 수득한다.
실시예 10
유사분열촉진 및 대사적 INSR 시그날 전달간의 균형에 대한 항-INSR 항체의 효과 측정
INSR은 2가지 주요 경로 (1) 일부 성장에 영향을 미치면서 대사를 주로 조절하는 PI3 키나제/PDK1/PKB 경로 및 (2) 세포 성장을 주로 조절하는 Ras/ERK 유사분열촉진 경로를 통해 시그날 전달한다. 유사분열촉진 및 대사적 INSR 시그날 전달간의 균형에 대한 항-INSR 항체의 효과는 문헌[참조: 예를 들어, Jensen et al. (Vitam Horm. 80:51-75, 2009), De Meyts and Shymko, (Novartis Found. Symp. 227:46-47, 2000); and Rakatzi et al. (Diabetes 52:2227-2238, 2003)]에 기재된 바와 같이 측정한다.
실시예 11
항-INSR 항체의 생체내 효과의 측정
마우스 INSR과 교차 반응하는 것으로 밝혀진 항-INSR 항체는 다수의 생체내 모델에서 측정한다. DIO 모델에서, C57BL/6J (B6) 수컷 마우스(The Jackson Laboratory, Maine)에게 12주 동안 고지방 음식물(HFD)을 공급하여 비만, 약간 내지 중간 정도의 고혈당성 및 글루코스 내성에 대해 손상되도록 하였다. 상기 모델은 세밀하게 조절되는 세팅에서 인슐린 민감성에 영향을 주는 INSR 항체의 능력을 평가하기 위해 사용한다. 상기 시스템은 또한 정상 조건 대 환부 조건하에서 INSR 활성 및 조절의 직접적인 비교를 가능하게 한다. 상기 실험에서, DIO 또는 나이 일치된 B6 마우스에 인슐린 내성 시험(ITT)에서 인슐린의 사전 정의된 준최대 용량의 인슐린을 투여하기 24시간 전에 INSR 항체를 투여한다. 대조군 IgG 또는 최대 인슐린은 각각 음성 및 양성 대조군으로서 작용한다. 인슐린에 대한 응답은 혈장 글루코스를 측정함에 평가하고; 60분 이상동안 글루코스의 과도한 감소는 INSR 반응이 증가하였음을 시사한다. 별도의 연구에서, DIO 또는 B6 마우스에는 글루코스 내성 시험(GTT) 24시간 전에 항체를 투여한다. 상기 측정에 의해, 저하된 단식 글루코스 및 곡선 이하 면적(AUC)은 개선된 인슐린 민감성을 나타낸다.
2마리 쥐 모델을 사용하여 2형 당뇨병 진행에 대한 INSR 항체의 효과를 평가한다. ob/ob 마우스 (The Jackson Laboratory, ME)는 렙틴 결핍이고 비만이되고 보상적 고혈당증으로 인해 단지 약간 고혈당성이 된다. 상기 모델에서, 동물에게 6주령에서 시작하여 INSR 항체, 또는 로지글리타존(PPAR-감마 효능제)(이전에 이들 동물에서 혈당 조절을 개선시키는 것으로 나타난 제제)을 투여한다. DIO 연구에서와 같이, 혈당 조절은 ITT 및 GTT로 6주 동안 2주 마다 평가한다. 추가로, 지연된 상승된 혈당 및 지질 패널의 주요 지표인 헤모글로빈 A1c(hbA1c)는 연구 말기에 평가한다. 제2 모델에서, 스트렙토조토신 (STZ)/HFD 모델, 스위스 알비노 마우스(The Jackson Laboratory, Maine) 에서 체장 베타 세포를 다중 낮은 용량의 스트렙토조토신을 통해 제거하고 인슐린 내성은 HFD 공급을 통해 유도한다. 상기 모델에서, 동물은 췌장 인슐린 생성의 손상으로 인해 심하게 고혈당성이고 이것은 후기 단계 T2D와 유사한 상황이다 (문헌참조: Dakshinamoorty et al, J. Pharm. and Pharmacology 60: 1167-73 (2008)). STZ/HFD 동물은 질환 진행에 대한 INSR 항체의 효과를 측정하기 위한 ob/ob 모델과 유사한 방식으로 치료하고 평가한다.
실시예 12
DIO 마우스에서 혈당 조절에 대한 부분적 효능제 항-INSR 항체의 효과
음식물 유도된 비만(DIO) 모델에서, C57BL/6 마우스는 고지방 음식물(HFD)상에서 대략 12 내지 14주 후 인슐린 내성이 될 수 있다. 시험관내에서 부분적 효능제 또는 양성 조절제로서 작용하는 것으로 입증된 항-INSR 항체는 상기 모델에서 평가하여 상기 항체가 생체내에서 인슐린 민감성 및/또는 혈당 조절을 개선시켰는지의 여부를 결정한다.
부분적 효능제 항-INSR 항체가 단식 혈당을 감소시켰는지의 여부를 결정하기 위해, 20주령 DIO 마우스(HFD상에서 14주; n = 8/그룹)를 5시간 동안 단식시키고 정맥내로 부분 효능제 항체 Ab030 및 Ab037, 또는 이소타입 대조군 (5 mg/kg)을 투여하였다. 추가의 대조군 연구에서, DIO 마우스는 인슐린(0.5 U/kg)으로 처리하거나, 정상적인 음식물(ND)이 공급된 나이 일치된 마우스에 이소타입 대조군 (5 mg/kg)을 투여하였다. 혈당은 주사 전(시점 = 0) 및 투여 후 1시간, 2시간 및 4시간째에 샘플을 채취하였다. 나이 일치된 대조군과 비교하여, 증가된 혈당은 1시간 시점에서 DIO 마우스(HFD-공급된/이소타입 대조군)에서 관찰하였고, 이는 HFD 공급된 동물에서의 인슐린 내성과 일치하였다(도 10A). 인슐린 또는 부분 효능제 항체중 하나의 투여는 혈당의 통계학적 유의적인 감소를 유도하였다 (p < 0.05; 원-테일드 t-시험)(도 10B). 항체 중 어느 것도 임의의 시점에서 저혈당(혈당 < 36 mg/dL로서 정의된 바와 같이)을 유도하지 않았다. 이들 결과는 항-INSR 부분 효능제 항체가 안전하고 효과적으로 단식 혈당을 감소시킴을 시사한다.
혈당 대조군에 대한 부분 효능제 항-INSR 항체의 효과를 추가로 평가하기 위해, 18주령 DIO 마우스 (HFD상에서 12주; n =8/그룹)에 복강내(IP)로 Ab037 (0.1, 1.0 또는 9 mg/kg) 또는 이소타입 대조군 (1.0 mg/kg)을 주사하였다. 추가의 대조군으로서, 나이 일치된 대조군 마우스에 이소타입 대조군 (1.0 mg/kg)을 투여하거나 DIO 동물에 인슐린 (0.75 U/kg; IP)을 투여하였다. 글루코스 내성 시험(GTT)은 16시간 동안 동물을 단식(항체 투여 후 대략 8시간째에 시작하여)시키고 글루코스(1.0 U/kg)를 주사하고 2시간 동안 혈당에 의해 항체 투여 (인슐린 후 30분) 후 24시간째에 수행하였다. 상기 실험에서, HFD는 단식 글루코스(도 11B) 또는 1회분 투여 후 피크 글루코스(도 11A)에 대해 상당한 영향을 갖지 않았다. 그럼에도 불구하고, DIO 마우스에서, 부분적 효능제 항체는 1.0 mg/kg 이상으로 투여되는 경우 이소타입 대조군에 대해 단식 혈당을 상당히 감소시켰고(도 11B), 9.0mg/kg에서 GTT 곡선 이하 면적을 감소시켰다(도 11C).
이러한 결과는 항-INSR 부분 효능제 항체가 단식 글루코스를 감소시키고 생체내 혈당 조절을 개선시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 13
DIO 마우스에서 혈당 조절에 대한 양성 조절제 항-INSR 항체의 효과
양성 조절제 항-INSR 항체가 생체내에서 인슐린 민감성을 개선시키는지의 여부를 결정하기 위해, 18주령 DIO 마우스(n=8/그룹)에 Ab001(양성 조절제)(0.1, 1.0 또는 10 mg/kg), 부분적 효능제 항체 (Ab037) (10 mg/kg) 또는 이소타입 대조군(1.0 mg/kg)을 IP 주사하였다. 이소타입 대조군(1.0mg/kg)이 투여된 ND 공급된 나이 일치된 마우스는 추가의 대조군으로서 작용하였다(도 12A). 24시간 후, 인슐린 내성 시험(ITT)은 5시간 단식 후 인슐린(0.5 U/kg)을 투여하고 2시간 이상동안 혈당 수준을 모니터링함에 의해 수행하였다. HFD는 정규식에 비하여 단식 글루코스(도 12B) 또는 ITT AUC(도 12C)에 대해 유의적인 영향를 갖지 않았고 부분적 효능제 항체(Ab037) 또는 양성 조절제 항체(Ab001) 투여는 이소타입 대조군 처리된 DIO 동물에 비해 AUC ITT를 통계학적으로 상당히 저하시키지 않았다(도 12C). 부분적 효능제 항체 Ab037은 단식 글루코스를 상당히 감소시키고 양성 조절제 항체 Ab001은 감소된 단식 글루코스에 대해 비통계학적으로 유의적인 용량 의존적 경향을 유도하였다.
이어지는 주간에, GTT는 항체의 추가 투여 후 동일한 동물에 대해서 수행하였다(도 13A). 본 연구에서, HFD는 대조군 공급된 동물에 비해 단식 글루코스(도 13B) 및 GTT AUC(도 13C)를 비통계학적으로 증가시켰다. 이소타입 대조군 처리된 DIO 마우스와 비교하여, 부분적 효능제 항체 및 양성 조절제 항체는 모든 시험된 용량에서 단식 글루코스를 상당히 감소시켰다. 추가로, 부분적 효능제 항체 및 양성 조절제 항체 둘다는 이소타입 대조군에 비해 10mg/kg에서 GTT AUC를 상당히 감소시켰다.
지질 파라미터에 대한 Ab001 및 Ab037의 효과는 1주 2회 IP로 18주령 DIO 마우스에 12주 동안 항체(10 mg/kg; n =5/그룹)로 처리하여 조사하였다. 상기 실험에서, 2주 연구에 대한 유사한 효능(상기된 바와 같이)이 단식 글루코스 GTT 및 ITT와 관련하여 관찰되었다. 연구 말기에, 표준 ELISA 기반 기술을 사용하여 지질을 측정하기 위해 혈장을 수거하였다. 이소타입 대조군에 비해, Ab001 및 Ab037 둘다는 DIO 마우스에서 단식 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤 수준을 감소시켰고(p < 0.05; 도 14A 및 14B), 이는 이들 항체가 인슐린 내성과 관련된 지질 조절이상을 개선시킬 수 있음을 시사한다.
2개의 추가의 양성 조절제 항-INSR 항체는 18주령 DIO 마우스(n = 10/그룹)를 사용하여 생체내 혈당 파라미터를 개선시키는지에 대해 평가하였다. 본 연구에서, 양성 조절제 항체 Ab083 및 Ab085는 Ab001 및 Ab037 및 이소타입 대조군 항체와 비교하였다. 이소타입 대조군 항체로 처리된 ND 공급된 나이 일치된 그룹은 추가의 대조군으로서 사용하였다. 모든 항체는 IP로 10mg/kg BIW로 투여하였다. 항체를 3번째 투여한 후에 단식 혈당을 측정하고 GTT를 수행하였다. 혈당 대조군은 유사하게 처리된 나이 일치된 ND 공급된 동물에 비해 이소타입 대조군 처리된 DIO 마우스에서 상당히 손상되었고 이는 GTT 시간 경과에 따른 평가 및 상응하는 AUC 결정에 의해 반영된 바와 같다(도 15A 및 15B). 상기 실험에서, Ab037 및 Ab083은 AUC를 정상적인 것과 구별할 수 없는 수준으로 개선시켰고(HFD/이소타입 대조군에 대해 p < 0.05), 반면 AbOO1은 유의적인 개선을 나타내지 않았다. 유사하게 단식 글루코스와 관련하여 이소타입 대조군 처리된 DIO 및 나이 일치된 ND 공급된 마우스간에 상당한 차이가 관찰되었고 Ab037 및 Ab001 둘다는 통계학적으로 유의적인 정상화 효과를 나타내었다(p < 0.05; 도 15C). Ab083은 단식 혈당에서, 작은 비-통계학적으로 유의적인 개선을 나타낸 반면, Ab085는 상기 파라미터에 어떠한 변화를 유발하지 않았다.
생체내 기능에 대한 항-INSR 항체의 효과에 대한 또 다른 측정은 항상성 모델 평가-인슐린 내성(HOMA-IR)에 의해 수행한다. HOMA-IR은 생체내 인슐린 민감성의 대용 측정으로서 개발된 단식 혈장 글루코스 및 단식 혈장 인슐린 수준을 기초로 하는 경험적 수학식이다: HOMA-IR = 단식 혈장 인슐린(μIU/mL) x 단식 혈장 글루코스(mmol/L)/22.5, 또는 대안으로 상기 수학식을 사용하여; 인슐린 (ng/mL) x 글루코스(mM)이고, 이것은 22.5 전환 인자를 도입한다. HOMA-IR의 예는 문헌[참조: Owyang et al., Endocrinology 151:2515-27, 2010 and Matthews et al., Diabetologia. 28:412-9, 1985]에 기재되어 있다.
4주 투여 후, 혈장 글루코스, 인슐린 및 지질을 평가하였다. Ab083 및 Ab037은 이 시점에서 혈장 글루코스를 감소시켰지만 Ab083 및 Ab085는 인슐린을 감소시켰다(p < 0.05; 도 16A 및 16B). 이들 효과는 HOMA-IR에 의해 측정된 바와 같이 Ab083 및 Ab085에 대한 인슐린 내성의 상기 모델에서 개선된 인슐린 민감성으로 해석되었다(p < 0.05; 도 16C). 지질과 관련하여, Ab085는 트리글리세라이드만을 상당히 개선시켰고(p < 0.05; 도 16D) Ab083 및 Ab037은 비에스테르화된 총 및 비-HDL 콜레스테롤을 상당히 감소시켰다(p < 0.05; 도 16E-G). 후자의 2개의 항체는 또한 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비율을 개선시켰다(도 16H). Ab001은 총 및 비-HDL 콜레스테롤 둘다를 상당히 감소시켰다.
놀랍게도, 모든 4개의 항체는 기준선 미만으로 체중을 감소시키는 것 없이 3주 치료 동안에 이소타입 대조군에 비해 DIO 마우스에서 체중 증가를 감소시켰다(도 17A 및 17B). 이들 결과는 양성 조절제 항체 Ab083 및 효능제 항체 Ab037이 DIO 마우스에서 손상된 글루코스 내성을 수정하고 조절제 항체 Ab083 및 Ab085는 인슐린 민감성을 개선시켰음을 입증하였고 이는 모든 4개의 항체가 HFD로부터 비롯된 체중 증가를 감소시키는 능력을 갖고 있음을 시사한다.
이들 결과는 INSR에 특이적인 부분적 효능제 및 양성 조절제 항체가 당뇨병 피검체에서 혈당 조절을 개선시킴을 시사한다.
실시예 14
db/db 마우스에서 혈당 조절 및 질환에 대한 부분적 효능제 및 양성 조절제 항-INSR 항체의 효과
자발적 Leprdb 대립형질에 대해 동종접합성인 마우스는 렙틴 수용체 기능이 결핍되어 있고 점진적으로 인슐린 내성이 되고 비만은 3주령 내지 4주령에서 개시한다. 이들 마우스에서, 인슐린 수준은 약 8주 내지 10주령까지 상응하고 이 시점에서 동물은 심하게 인슐린 내성이고 고인슐린혈증이다. 그럼에도 불구하고 상기 유전학적 배경은 비조절된 고혈당증을 유발하고 대략 10주령 후에는 췌장 베타 세포가 기능부전을 유발하고 궁극적으로 베타 세포 기능상실을 유도한다. 시험관내 부분적 효능제 또는 양성 조절제로서 작용하는 것으로 입증된 항-INSR 항체는 이들 항체가 생체내 인슐린 민감성, 혈당 조절 및/또는 질환 진행을 개선시키는지의 여부를 결정하기 위해 상기 모델에서 평가하였다.
db/db 마우스를 사용하여, 중증 비만과 조합된, 점진적 인슐린 내성 및 베타 세포 기능부전의 세팅에서 Ab001 및 Ab037의 활성을 평가하였다. 상기 실험에서, Ab001 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg), Ab037 (10 mg/kg) 또는 이소타입 대조군 항체 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg)는 5주령 db/db 마우스(n=10/그룹)에게 IP, BIW 투여하였다. 추가의 대조군으로서, 일반적으로 표현형적으로 정상인 나이 일치된 이종접합성 한배새끼 그룹에게 유사하게 10 mg/kg 이소타입 대조군 항체를 투여하였다. DIO 모델에서와 같이 체중 증가는, 이소타입 대조군 처리된 마우스와 비교하여 치료의 처음 5주에 걸쳐 10mg/kg의 Ab001 또는 Ab037 중 어느 하나로 처리된 동물에서 상당히 감소하였다(p < 0.05; 도 18A 및 18C). 중요하게, db/db 마우스가 일반적으로 췌장 베타 세포 고갈의 결과로서 체중 감소를 시작했을 때 10주령에 상응하는 처리 5주 후에 2개의 항체는 체중 감소를 감소시킨다(p < 0.05; 도 18B 및 18D). 10주 처리 후, 10mg/kg에서 Ab001 또는 Ab037을 사용한 처리는 상응하는 이소타입 대조군 처리된 그룹에 비해 단식 혈당을 유의적으로 개선시키는 것으로 관찰되었다(p < 0.05; 도 19A). 추가로, 이 시점에서, HbA1c는 1 mg/kg Ab001 그룹에서 상당히 감소하였고, 또한 10mg/kg Ab001 그룹에서 보다 드문 정도로 감소시켰다(p < 0.05; 도 19B).
혈장 인슐린 및 지질은 14주 투여 후 평가하였다. 이 시점에서, AbOO1 (10 mg/kg) 및 Ab037 둘다는 이들 동물이 췌장 베타 세포 상실을 가질 것으로 예상되는 나이(대략 20주령)에서 순환계 인슐린을 증가시켰고(p < 0.05; 도 20A), 이는 2개의 mAb가 인슐린 결핍 동물에서 인슐린 생산을 복구시킬 수 있음을 시사한다. 추가로, AbOO1 (10 mg/kg)은 혈장 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 비-HDL 콜레스테롤 및 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비를 상당히 감소시켰다(p < 0.05; 도 20B-F). 비에스테르화된 콜레스테롤의 유의적인 감소 및 보다 낮은 트리글리세라이드 쪽으로 경향이 Ab037 처리된 동물 기원의 혈장에서 관찰되었다(각각 p < 0.05 및 p = 0.08; 도 20B 및 20C).
흥미롭게도, 체중 증가의 감소는 처음에 발생하고 상기 동물은 인슐린 내성이지만 DIO 모델에서의 경우에서와 같이 심한 베타 세포 고갈을 가질 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 상기 실험에서, 혈당 대조군 및 당화된 헤모글로빈에서 AbOO1-유도된 변화는 동물이 베타 세포 기능부전을 가질 것으로 예상될때, 단지 후기 단계 동안에만 발생하였다. 더욱이, 이 기간 동안에, 2개의 항체는 병리학적 체중 감소를 감소시켰다. 이론에 국한되는 것 없이 상기 결과는 체중 및 혈당 조절에 대한 항-INSR 항체 효과가 반복적으로 발생할 수 있지만 분리될 수 있음을 시사한다. 이들 데이터는 Ab001이 조합된 인슐린 내성 및 베타 세포 고갈의 조건하에 체중을 정상화하고 혈당 조절을 개선시키고 이상지질혈증을 부분적으로 보정할 수 있음을 시사한다.
중증 인슐린 내성 및 인슐린결핍 조건하에서 항체의 활성을 평가하기 위해, 점진적 췌장 베타 세포 기능부전을 나타낼 것으로 예상되는 10주령 db/db 마우스를 8주 동안 10mg/kg IP, BrW로, AbOO1, Ab037, Ab083, Ab085 또는 이소타입 대조군 항체를 사용하여 처리하였다. 단식 혈당은 연구 기간 동안 매주 측정하였다. 본 연구에서, Ab085는 이소타입 대조군에 비해 단식 혈당을 상당히 감소시켰다(p < 0.05; 도 21). 이것은 Ab085가 인슐린 내성의 저인슐린혈증 조건하의 질환을 개선시킴을 입증한다.
2개의 추가 양성 조절제 항-INSR 항체는 중증 인슐린 내성을 나타낼 것으로 예상되는 5주령 db/db 마우스에서 인슐린 내성의 개선에 대해 평가하였다. 마우스를 4주 동안 10 mg/kg IP, BrW로 Ab001, Ab037, Ab083, Ab085 또는 이소타입 대조군을 사용하여 처리하여 베타 세포 기능부전의 개시 전 인슐린 내성에 대한 항체의 효과를 평가하였다. 단식 혈당 및 단식 혈장 인슐린은 연구 말기에 측정하고 HOMA-IR을 계산하였다. 본 연구에서, Ab083 및 Ab085는 이소타입 대조군에 비해 인슐린 내성을 상당히 개선시켰고(p < 0.05; 도 22), 이는 이들 항체가 이러한 당뇨병 모델에서 인슐린 민감성을 개선시킴을 입증한다.
실시예 15
MLDS/HFD 마우스에서 혈당 조절 및 질환에 대한 부분적 효능제 및 양성 조절제 항-INSR 항체의 효과
다중 저용량 스트렙토조토신 (MLDS)/HFD 모델에서 인슐린 내성은 6주령 ICR 마우스에게 4주 동안 HFD(40kcal% 지방)를 공급하여 성취하였고, 상기 기간 동안에 스트렙토조토신은 매일 5회 용량(3주 동안에 40mg/kg)을 IP로 투여하여 베타 세포 기능을 부분적으로 제거한다. 시험관내에서 부분적 효능제 또는 양성 조절제로 작용하는 것으로 입증된 항-INSR 항체는 상기 모델에서 평가하여 상기 항체가 생체내에서 인슐린 민감성, 혈당 조절 및/또는 질환 진행을 개선시키는지의 여부를 결정하였다.
조합된 인슐린 내성 및 베타 세포 기능부전의 모델에서 질환에 대한 AbOO1 및 Ab037의 효과를 평가하기 위해, MLDS/HFD 마우스 (n =10/그룹)에 6주 동안 10 mg/kg IP, BIW로 Ab001, Ab037 또는 이소타입 대조군 항체를 투여하였다. 첫번째 투여 후 1주째에 단식 혈당이 나이 일치된 정상 동물에 비해 이소타입 대조군 처리된 질환 마우스에서 3배 증가하는 것으로 관찰되었고 이는 당뇨병 표현형이 성취됨을 확인시켜준다. 이 시점에서, GTT를 수행하여 Ab001 및 Ab037 둘다에 대한 혈당 조절에서의 유의적 개선을 밝힌다(p < 0.05; 도 23A 및 23B). 단식 혈당은 또한 Ab037로 처리된 마우스 그룹에서 상당히 감소한 반면(p < 0.05), AbOO1에 의한 어떠한 유의적인 변화가 유발되지 않았다(도 23C). 1주 후, 공급된 글루코스를 평가하였다. 단식 글루코스와 유사하게 MLDS/HFD 마우스에서의 질환은 유의적으로 상승된 공급된 글루코스 수준을 나타내고 이는 Ab037에 의해 완화되었다(p < 0.05; 도 24A). GTT 및 공급된/단식 글루코스에서 이들 개선과 일관되게, Ab037은 투여 6주 후 대략 1.5%로 HbA1c를 감소시켰다(p < 0.05; 도 24B). 연구 말기에 혈장 분석은 Ab037 처리가 혈장 인슐린을 통계학적으로 유의적으로 감소시키고 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비를 보다 적게 감소시킨 반면 AbOO1은 유사하지만 혈장 인슐린에 대해 보다 작은 완화 효과와 함께 혈장 렙틴 수준을 상당히 감소시킴을 밝혔다(p < 0.05; 도 25A-C). 상기 모델은 db/db 모델에서 관찰된 바와 같은 일관된 질환 관련 체중 변화를 나타내지 않고 Ab001과 Ab037 어느 것도 상기 모델에서 체중에 영향을 미치지 않았고(도 26), 이것은 다른 생체내 모델에서 상기 항체로 관찰된 감소된 체중 증가가 비특이적 효과가 아님을 시사한다. 상기 데이타는 Ab037이 MLDS/HFD 마우스에서 질환의 다중 발병을 개선시키고 AbOO1은 또한 상기 모델에서 손상된 혈당 조절의 일부 파라미터를 보정한다.
2개의 추가의 양성 조절제 항-INSR 항체는 생체내 혈당 파라미터의 개선에 대해 평가하였다. MLDS/HFD 마우스(n =10/그룹)에 6주 동안 10 mg/kg IP, BIW로 Ab001, Ab037, Ab083, Ab085 또는 이소타입 대조군 항체를 투여하였다. 처리 3주 후, GTT를 수행하여 Ab037 및 Ab083이 이소타입 대조군과 비교하여 혈당 조절을 완전히 정상화시킴을 밝힌다(p < 0.05; 도 27A 및 27B). 단식 혈당은 또한 6주 연구 지속 기간 동안에 Ab037 또는 Ab083으로 처리된 마우스에 상당히 감소하였지만(p < 0.05), Ab001 또는 Ab085에 의해 어떠한 유의적인 변화가 유발되지 않았다(도 28). 연구 말기에, 혈장 지질을 평가하였다. Ab083은 혈장 트리글리세라이드, 비에스테르화된 콜레스테롤, 총 콜레스테롤, 비-HDL 콜레스테롤, 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비 및 유리된 지방산을 상당히 개선시켰다(p < 0.05; 도 29A-F). 추가로, AbOO1은 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비 뿐만 아니라 총 비-HDL 및 비에스테르화된 콜레스테롤을 상당히 감소시켰다. Ab037은 비-HDL 콜레스테롤, 비에스테르화된 콜레스테롤, 비-HDL/HDL 콜레스테롤 비 및 유리된 지방산을 개선시켰다. 상기 실험에서, Ab085는 유리된 지방산만을 상당히 감소시켰다. GTT 및 단식 글루코스에서 관찰된 개선과 일치하여, Ab037 및 Ab083은 투여 6주 후 HbA1c를 상당히 감소시켰다(p < 0.05; 도 30). 추가로, 단식 글루코스 및 글루코스 내성에 대한 효과를 거의 나타내지 않지만 특정 지질 파라미터를 개선시키는 AbOO1 및 Ab085는 또한 HbA1c를 감소시켰다. 이전의 실험에서와 같이, 처음 투여 3주에 걸쳐 감소된 체중 증가를 나타내는 Ab085를 제외하고는 상기 모델에서 체중에 유의적인 영향을 주지않았다(도 31). 상기 데이타는 모든 4개의 시험된 항체가 상기 체중 중화 모델에서 체질량에 영향을 미치지 않으면서 MLDS/HFD 마우스에서 질환의 다중 발병을 개선시킴을 입증한다.
실시예 16
생체내 INSR 인산화에 대한 부분 효능제 및 양성 조절제 항-INSR 항체의 24시간 투여 효과
항-INSR 항체의 단기 투여에 의한 간 및 근육과 같은 인슐린 민감성 조직에서 INSR 티로신 인산화의 증가는 상기 항체가 가용하고 시험관내에서 관찰된 바와 같이 생체내에서 INSR에 대해 유사하게 작용함을 확인시켜준다. 상기 실험에서, 시험관내에서 부분적 효능제 또는 양성 조절제로서 동정된 항-INSR 항체는 C56BL/6마리 수컷 마우스에서 24시간 동안 투여하고 기본 및 인슐린 유도된 간 및 근육 INSR 인산화에 대한 이들의 효과에 대해 평가하였다.
INSR 부분적 효능제 및 양성 조절제가 간 및 근육에서 INSR 인산화를 증가시키는지의 여부를 결정하기 위해, 10주령 C56BL/6 수컷 마우스(n=3)에 24시간 동안 항-INSR 또는 이소타입 대조군 항체(10mg/kg)를 제공하고 간 및 근육 INSR 티로신 인산화에 대한 효과는 10분 동안 인슐린 1회분(1U/kg) 또는 PBS가 투여된 마우스에서 ELISA로 결정하였다. 인산화된 INSR 농도는 총 인슐린 수용체 농도로 정상화하고 %로 나타냈다.
외인성 인슐린(1U/kg)은 간 또는 근육에서 대조군 동물의 INSR 인산화를 상당히 증가시키지 않았다(여기에서 양성 경향이 있긴해도)(도 32A, B). 그러나, 간에서 인슐린 자극된 INSR 인산화의 상당한 증가가 Ab083- 및 Ab037-처리된 마우스에서 관찰되었을 뿐만 아니라(p < 0.05), Ab085-처리된 마우스에서도 거의 상당히 증가하였다(p = 0.07; 도 32A). 상기 결과는 부분적 효능제 및 양성 조절제 항체가 생체내 인슐린에 대한 응답을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, 간에서, Ab083은 기본 상태(외인성 인슐린 부재)에서도 INSR 인산화를 상당히 증가시켰고 이것은 Ab083이 낮은 단식 수준의 내인성 인슐린의 존재에서도 인슐린에 대한 응답을 감작화시킬 수 있음을 시사한다.
항-INSR 부분 효능제 및 양성 조절제 항체로부터의 가장 현저한 효과는 근육에서 나타났다. 모든 3개의 항-INSR 항체는 인슐린 1회분을 투여받은 마우스에서 인슐린 시그날 전달을 양성으로 조절하였고 또한 Ab083 및 보다 큰 정도로 Ab085는 대조군 동물에 비해 인슐린의 내인성 단식 수준에 대한 근육 INSR 시그날 전달을 감작화시켰다 (도 32B).
이들 결과는 부분적 효능제 및 양성 조절제 항-INSR 항체가 생체내 간 및 근육에서 인슐린 매개된 시그날 전달에 대한 응답을 개선시킴을 시사한다. Ab037의 효과에 상대적으로, 항체 Ab083 및 Ab085는 비교적 낮은 인슐린 농도에서 INSR을 감작화시킨다.
실시예 17
추가의 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 항-INSR 항체의 분리
추가의 순수 항체 라이브러리는 INSR에 특이적인 항체에 대해 스크리닝하였다.
(1) 파아지 패닝 및 구제
사람 인슐린 수용체(hINSR) (R&D Systems, Minneapolis, MN)는 실시예 1에 기재된 바와 같이 비오티닐화하고 추가의 순수 항체 파아지 디스플레이 라이브러리의 패닝을 위해 사용하였다.
A. scFv 라이브러리
scFv 순수 라이브러리: 제1 라운드의 파아지 패닝을 위해, scFv 람다 파아지 디스플레이 라이브러리 기원의 4.5 x l012 cfu 의 파아지 입자 또는 scFv 카파 파아지 디스플레이 라이브러리 기원의 4.12 x l012cfu의 파아지 입자(XOMA LLC, Berkeley, CA)를 약하게 회전시키면서 1ml의 5% 밀크/PBS 중에서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다(Teknova, Hollister, CA). 이것은 2개의 별도의 패닝, scFv-카파 및 scFv-람다를 나타낸다. 차단된 파아지는 스트렙타비딘 피복된 자기 Dynabeads® M-280 (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)에 대해 30분 동안 2회 탈선별하였다. 비오틴-hINSR-hINS 복합체를 형성시키기 위해 103 p몰의 비오티닐화된 hINSR은 약하게 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 5% 밀크/PBS에 용해된 과량(2,100p몰)의 사람 인슐린(hINS)(Sigma, St Louis, MO)과 예비항온처리하였다. 제2 라운드의 패닝을 위해, 50 p몰의 비오틴-hINSR은 1050 p몰의 hINS와 함께 사용하였다. 최종 라운드의 패닝을 위해, 25 p몰의 비오틴-hINSR은 525 p몰의 hINS와 항온처리하였다.
B. Fab 라이브러리
Fab 순수 라이브러리: 제1 라운드의 파아지 패닝을 위해, Fab 람다 라이브러리의 2개의 상이한 구제로부터 1.2 x l013cfu의 파아지 입자 또는 1.8 x l013cfu의 파아지 입자(XOMA LLC, Berkeley, CA), 또는 Fab 카파 라이브러리의 2개의 상이한 구제로부터 7.2 x l012cfu의 파아지 입자 또는 1.8 x l013cfu의 파아지 입자(XOMA LLC, Berkeley, CA)는 약하게 회전시키면서 1ml의 5% 밀크/PBS(Teknova, Hollister, CA)에서 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이것은 4개의 별도의 패닝을 나타낸다. 차단된 파아지는 스트렙타비딘-피복된 자기 Dynabeads® M-280 (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)에 대해 30분 동안 2회 탈선별하였다. 비오틴-hINSR-hINS 복합체를 형성하기 위해, 103 p몰의 비오티닐화된 hINSR은 약하게 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 5% 밀크/PBS 중에 용해된 과량 (2,100 p몰)의 사람 인슐린(hINS)과 예비 항온처리하였다. 제2 라운드의 패닝을 위해, 50 p몰의 비오틴-hINSR은 1050p몰의 hINS와 함께 사용하였다. 최종 라운드의 패닝을 위해, 25 p몰의 비오틴-hINSR은 525 p몰의 hINS와 항온처리하였다.
비오틴-hINSR/hINS 용액을 약하게 회전시키면서 30분 동안 차단된 스트렙타비딘 피복된 자기 Dynabeads® M-280 (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)과 항온처리하여 비오틴-hINSR-hINS 복합체를 고정화시켰다. 탈선별된 파아지는 실온에서 2시간 동안 비오틴-hINSR-hINS 스트렙타비딘 비드와 항온처리하였다. hINSR을 hINS로 피복시키기 위해, 추가의 hINS (2,100 p몰)를 상기 용액에 첨가하였다. 상기 비드를 세척하였다. 제1 라운드의 패닝을 위해, 비드를 0.5% 밀크-PBS-0.1% TWEEN으로 3회 신속하게 세척(즉, 비드를 자기를 사용하여 용액으로부터 수거하고 1ml의 세척 완충액 중에 재현시켰다)하고, 0.5% 밀크-PBS로 3회 세척함에 이어서 PBS로 1회 신속히 세척하였다. 제2 라운드의 패닝을 위해, 비드는 0.5% 밀크-PBS-0.1% TWEEN으로 5회 신속하게 세척함에 이어서 0.5% 밀크-PBS-0.1% TWEEN으로 1회 5분 세척(약하게 회전시키면서 실온에서 1ml의 세척 완충액 중에)함에 이어서 0.5% 밀크-PBS로 5회 세척함에 이어서 0.5% 밀크-PBS로 1회 5분 세척함에 이어서 PBS로 1회 신속히 세척한다. 제3 라운드의 패닝을 위해, 비드는 0.5% 밀크-PBS-0.1% TWEEN으로 4회 신속히 세척함에 이어서 0.5% 밀크-PBS-0.1% TWEEN으로 5분 동안 2회 세척함에 이어서 0.5% 밀크-PBS로 4회 신속히 세척함에 이어서, 0.5% 밀크-PBS로 2회 5분 세척함에 이어서 PBS로 1회 신속하게 세척한다.
C. 용출 및 구제
hINSR-hINS-스트렙타비딘 비드 결합된 파아지를 약하게 회전시키면서 RT에서 30분 동안 0.5ml의 100mM 트리에틸아민(TEA)으로 용출시켰다. 상기 비드는 용출물로부터 분리하였다. 상기 용출물을 제거하고 0.5ml 1M Tris-HCl로 중화시켰다(pH 7.4). 상기 비드를 1ml 1M Tris-HCl로 중화시킨다(pH 7.4). 비드 또는 용출물로부터 용출된 파아지를 별도로 사용하여 세균 세포가 약 0.5의 OD600에 도달하였을 때 TG1 세균 세포를 감염시켰다(Stratagene, La Jolla, CA). 진탕 없이 37℃에서 30분 동안 및 90rpm으로 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 감염시킨 후, 세포를 펠렛화하고 100 ug/ml 카베니실린 및 2% 글루코스가 보충된 2YT 배지에 재현탁시켰다. 상기 재현탁된 세포는 100 ug/ml 카베니실린 및 2% 글루코스와 함께 2YT 한천 플레이트상에 분주하고 30℃에서 밤새 항온처리하였다.
이어서 파아지는 다중 감염도(MOI) 약 20으로 헬퍼 파아지 M13K07(New England Biolabs, MA)을 사용하여 구제하였다. 진탕 없이 30분 동안 37℃에서 0.5의 OD600에서 TG1 세포의 헬퍼 파아지 감염시키고 100rpm에서 37℃에서 30분 항온처리한 후, 세포 펠렛을 100 ug/ml 카베니실린 및 50 ug/ml 가나마이신이 보충된 2YT 배지에 재현탁시키고 25℃에서 및 250rpm에서 밤새 성장시켰다. 상등액중의 파아지는 왕성한 원심분리 후 회수하고 다음 라운드의 패닝을 위해 사용하였다. 파아지 선별로부터 비롯된 집적(enrichment)을 모니터링하기 위해, 투입 및 생성 파아지의 양은 3라운드의 패닝을 위해 적정하였다.
(2) 사람 INSR/hINS 또는 쥐 INSR/hINS 복합체에 대한 항체 클론의 FACS 스크리닝
개별 콜로니를 집어내어 96웰 플레이트에서 성장시키고 이어서 빙냉 PPB 용액 (Teknova, Hollister, CA)과 ddH20의 1:3 용적비 및 프로테아제 억제제를 사용한 표준 방법에 따라 세균 세포막주변공간 추출물을 생성하기 위해 사용하였다(Roche, Indianapolis, IN). 상기 용해물 상등액은, hINSR 또는 muINSR로 형질감염된 현탁액 적응된 CHO-K1이 IM-9 세포 대신 사용되고 인슐린에 노출된 세포가 70nM 사람 인슐린 보다는 150nM이 보충된 FACS 완충액 중에 재현탁시킴을 제외하고는 실시예 2에 기재된 프로토콜을 사용하는 hINSR/hINS 또는 쥐 INSR/hINS 복합체에 대해 FACS로 분석하였다. 상기 분석은 6가지 이상 유형의 항체의 검출을 가능하게 하였다:
1. hINSR-CHO 세포가 사람 인슐린에 노출되는 경우 hINSR-CHO 세포에만 결합하는 항체(전적으로 종 특이적 방식으로 INS/INSR 복합체에 결합함)
2. muINSR-CHO 세포가 사람 인슐린에 노출되는 경우 muINSR-CHO 세포에만 결합하는 항체(종 특이적 방식으로 전적으로 INS/INSR 복합체에 결합함)
3. hINSR-CHO 및 muINSR-CHO 세포가 사람 인슐린에 노출되는 경우 hINSR-CHO 및 muINSR-CHO 세포 둘다에 결합하는 항체(종 교차 반응 방식으로 INS/INSR 복합체에 전적으로 결합함)
4. hINSR-CHO 세포에만 결합하는 항체(종 특이적 방식으로 전적으로 INSR에 결합함)
5. muINSR-CHO 세포에만 결합하는 항체(종 특이적 방식으로 전적으로 INSR에 결합함)
6. hINSR-CHO 및 muINSR-CHO 세포 둘다에 결합하는 항체(종 교차 반응성 방식으로 전적으로 INSR에 결합함)
항체는 실시예 2에 기재된 바와 같이 점수를 매겼다. 분리된 항체의 경쇄 및 중쇄 서열을 서열 분석하고 서열번호 87 내지 147(경쇄) 및 서열번호 223 내지 284(중쇄)로 제시한다.
결과
세균 세포막주변공간 추출물의 FACS 스크리닝으로 사람 수용체 또는 수용체/리간드 복합체, hINS 또는 hINSR-hINS, 또는 쥐 수용체 또는 수용체/리간드 복합체, muINSR 또는 muINSR/hINS에 결합하는 다중 항체를 동정하였다. 이들 순수 라이브러리로부터 선택된 클론의 33%(1,488개중 484개)는 hINSR 또는 hINSR-hINS 복합체에 결합할 수 있었다. 상기 순수 라이브러리로부터 선택된 상기 클론의 25% (1488개 중 370개)는 muINSR 또는 muINSR-hINS 복합체에 결합할 수 있었다. 클론의 16%(1488개 중 234개)는 FACS에 의한 hINSR 또는 hINSR-hINS 및 muINSR 또는 muINSR/hINS 복합체 둘다에 결합하였다.
선택된 클론은 IgG2 항체로 재포맷팅하였다. 선택된 scFv 단편의 가변 중쇄(VH) 및 경쇄 (VL)는 PCR 증폭시키고 항체 불변 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터에 클로닝하고 표준 방법을 사용하여 293E EBNA 사람 세포에 형질감염시켰다. 재포맷팅된 항체의 hINSR 또는 hINSR-hINS 또는 muINSR 또는 muINSR/hINS로의 결합은 상기된 바와 같이 FACS로 평가하였다. 상기 결과는 도 33에 제시한다.
상기 결과는 특정 재포맷팅된 항체가 마우스 및 사람 INSR 둘다에 결합함을 보여준다. 도 33은 또한 특정 재포맷팅된 항체는 인슐린의 존재 및 부재하에 INSR에 차등적으로 결합하고 따라서 인슐린의 INSR로의 결합을 조절하는 것으로 예측된다.
실시예 18
INSR에 대한 알로스테릭 효능제 항체에 대한 패닝
유리된 수용체에 대한 것 보다는 수용체/리간드의 복합체에 보다 크게 결합하는 것으로 나타난 효능제 항체의 선별은 상기 리간드와 경쟁하지 않고 리간드의 상기 수용체의 오르토스테릭 부위로의 결합을 차단하거나 감소시키지 않는 항체를 동정할 가능성을 증진시킨다. 내인성 결합 부위와는 구별되는, 표적 수용체상의 부위에 결합하는 상기 유형의 항체는 알로스테릭 효능제로서 공지되어 있다(문헌참조: Kenakin et al., Journal of Receptors and Signal Transduction, 27:247-259, 2007; Jahns et al., J Am Coll Cardiol. 36:1280-87, 2000; May et al., Ann Rev Toxicol. 47: 1-51, 2007).
효능제 항체를 스크리닝하기 위한 상기된 방법은 또한 알로스테릭 효능제를 스크리닝하기 위해 유용하다. 수용체 리간 복합체로의 시험 항체의 우선적 결합은 알로스테릭 활성에 일치하지만 유리된 수용체로의 시험 항체의 우선적 결합은 오르토스테릭 부위에 대해 인슐린과 경쟁하는 항체와 일치한다. 상기 스크리닝은 모든 경쟁 효능제는 아닐지라도 일부를 제거함에 의해 알로스테릭 효능제에 대한 후보 클론의 풀을 집적시키기 위해 유용하다.
알로스테릭 항체는 리간드의 결합 친화성 및 효능을 간섭할 가능성이 적고 따라서 리간드에 대한 최대 리간드 시그날 전달 또는 최대 민감성을 간섭할 가능성이 적다. 알로스테릭 항체는 약한 부분 효능제로부터 내인성 리간드와 유사한 효능작용 수준까지 범위의 효능작용을 나타낼 수 있다. 부분적 알로스테릭 효능제는 내인성 리간드의 최대 반응 정도 보다 매우 낮은 최대 시그날 전달 반응을 유발한다. 일부 응용에서, 지연된 준최대 시그날 활성화가 최대 시그날 활성화 보다 바람직한 경우, 부분적 효능제 항체는 완전한 효능제 항체 보다 바람직할 수 있다. 부분 알로스테릭 효능제와 양성 조절제(감작화제)간의 독특한 특성은, 부분 알로스테릭 효능제(도 34) 및 양성 조절제(감작화제) 항체(도 35)에 대한 상이한 결합 곡선을 나타내는 도 34 및 17에 나타낸 용량 반응 곡선의 비교로부터 명백하다.
도 34A는 내인성 리간드에 대한 용량 반응과 대비되는 부분적 알로스테릭 효능제로부터의 용량 반응의 예를 도시하고 도 34B는 알로스테릭 효능제의 존재 또는 부재하에 리간드에 의한 활성화를 입증한다. 도 35A는 내인성 리간드에 대한 용량 반응과 대비되는 양성 알로스테릭 조절제 항체로부터의 용량 반응을 나타내고 도 35B는 양성 조절제 항체의 존재 및 부재하에 내인성 리간드의 용량 반응 곡선을 보여준다. 도 36은 내인성 리간드와 비교하여 부분적 알로스테릭 효능제 세트에 대한 활성화 파라미터를 제공한다. 부분적 알로스테릭 효능제에 의한 시그날 활성화의 특성은 동일한 1차 스크리닝 방법으로부터 수득한 양성 조절제의 특성과는 구분된다.
비-경쟁 부분적 알로스테릭 효능제 항체는 이것이 부분적 효능제 및 내인성 리간드 둘다에 의한 독립적 시그날 활성화를 동시에 갖고 있는 것이 이로운 경우 경쟁 효능제 보다 치료학적 잇점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 특정 이론에 얽매이는 것 없이 부분적 알로스테릭 효능제를 사용하여 내인성 리간드 수준에서의 일시적 변화로부터의 반응을 여전히 허용하면서 시그날 전달 경로의 기본 활성화를 상승시킬 수 있다. 특정 경우에, 상기 종류의 부분적 알로스테릭 효능제가 존재하는 조건하에서, 내인성 리간드 용량 반응은 기준선(항상성 또는 기본) 시그날 전달 수준의 증가를 나타내고 리간드 EC50에 거의 변화 없이 내인성 리간드와 동일하거나 보다 큰 최대 반응을 성취할 것이다. 예를 들어, 도 34B는 부분적 알로스테릭 효능제의 존재 및 부재하에 내인성 리간드의 용량 반응을 보여주고 도 37은 음성 대조군 항체의 존재하에 내인성 리간드에 대한 최대 반응과 상대적으로 부분적 알로스테릭 효능제 항체의 존재하에 인슐린의 최대 활성화를 보여준다. 도 37은 부분적 알로스테릭 효능제 항체 Ab037 및 Ab040이 동일한 분석내에서 음성 대조군 항체와 비교하는 경우 인슐린에 의한 Ser473에서 Akt의 용량 반응 및 최대 인산화의 EC50에 대해 거의 상당한 영향을 주지않는다.
실시예 19
기능적 부류의 항-INSR 항체의 예: Akt의 인슐린 유도된 인산화에 대한 차등적 효과
인슐린/인슐린 수용체 복합체를 통한 시그날 전달에 대한 시험 항체의 효과는 Akt의 인슐린 유도된 인산화를 감작화시키고 효능화시키기 위한 항체의 능력을 평가함에 의해 측정하였다. 상기 분석은 실시예 5에 기재된 방법을 사용하여 수행하였다. 나타낸 모든 데이타에서, pAtk pSer473의 % 값은 상대적인 것이고 반드시 절대 세포 pAkt pSer473 수준을 나타내는 것은 아니다.
도 38-40은 모 CHO-K1 세포에 대해 인슐린의 부재 또는 인슐린의 준최대 농도의 존재하에 pAkt 항체 용량 반응 곡선을 나타내고, CHO-K1 세포는 사람 인슐린 수용체를 발현하고 CHO-K1 세포는 마우스 인슐린 수용체를 발현한다. 인슐린의 부재하에 항체의 적정(개방 기호)은 항체 효능작용 활성에 대한 징후를 제공한다. 인슐린의 준최적 수준의 존재하에 항체의 병행 적정(폐쇄된 기호)은 효능작용 활성에 상대적인 감작화 활성의 징후를 제공한다. 상기 현탁화 활성은 동일한 항체 농도에서 효능작용 활성 보다 정도가 보다 큰 인슐린의 EC30 농도(점선)에 의해 유발되는 상기 pAkt 수준의 증가로서 나타낼 수 있다. 항체 Ab077, Ab078 및 Ab 085 (도 38A-C)는 인슐린의 부재하에 유의적인 효능작용을 나타내지 않는다. 항체 AbOO1, Ab079 및 Ab083은 약한 효능제(도 39A-C)이고 항체 Ab080은 적당 수준의 효능작용을 나타낸다(도 40). 상기 분석은 또한 항체가 기능성 교차 반응을 나타내는지, 즉 사람 및 쥐 INSR 매개된 시그날 전달 둘다에 대해 효과를 갖는지의 여부를 지적한다. 항체 Ab078 및 Ab085는 단지 인슐린의 존재하에 인슐린 수용체에만 결합하고, 즉 이들은 FACS 기본 분석에서 CHO-K1 세포에서 발현되는 인슐린 수용체에 결합함에 의해 평가된 바와 같이 차지되지 않은 인슐린 수용체에 검출가능하게 결합하지 않는다.
도 41A-C는 인슐린이 IgG2 이소타입 대조군 항체 항-KLH (실선)의 존재하의 인슐린과 비교하여 감작화 항체의 고정된 농도의 존재하에 pAkt 활성화를 유도함을 보여준다. 인슐린 용량 반응 적정에 사용되는 농도에서 인슐린의 부재하에 항체에 대한 pAkt 활성화 수준은 점선으로 나타낸다. 인슐린의 EC50 값은 감작화 항체의 존재하에 pAkt 활성화를 유도하였고 EC50 값의 배수 변화는 표 5에 나타낸다.
감작화제 항체의 존재하에 pAkt의 인슐린 유도된 활성화에 대한 EC50 값
실험 항체 항체 농도 ( ug / ml ) EC50 ( pM ) 이소타입 대조군과 비교한 EC50 에서의 배수 변화
사람 INSR CHO-K1 세포 Ab001 2 59 12
Ab077 10 81 9
Ab078 20 221 3
Ab079 10 100 7
Ab083 2 68 11
Ab085 1 207 3
Ab085 10 81 9
항 - KLH . G2 10 724 　
마우스 INSR CHO-K1 세포 Ab001 2 354 7
Ab077 20 301 8
Ab078 20 990 2
Ab079 20 300 8
Ab083 10 276 9
Ab085 20 312 8
항 - KLH . G2 10 2414 　
도 42A-B는 단독의 인슐린과 비교하여 인슐린의 부재하에 부분적 알로스테릭 효능제의 pAkt 활성화 활성을 보여준다. 항체 Ab037, Ab053 및 Ab062 모두는 사람 또는 마우스 인슐린 수용체를 발현하는 CHO-K1 세포에서의 인슐린 보다 상당히 적은 최대 활성화 정체기를 갖는 pAkt 활성의 효능제로서 작용한다. 상기 분석 결과는 또한 항체가 기능적 교차 반응성을 보여주는지, 즉 사람 및 마우스 인슐린 수용체 매개된 시그날 전달 둘다에 대해 효과를 갖는지를 보여준다. 항체 EC50 값 및 최대 활성화 수준은 표 6에 나타낸다.
부분적 알로스테릭 효능제에 대한 최대 활성화 수준 및 EC50 값
　 　 Hu 인슐린 Ab037 Ab053 Ab062
사람 INSR CHO-K1 상대적 최대 활성화 100% 79% 64% 52%
EC 50 (nM) 0.15 0.65 0.42 2.43
마우스 INSR CHO-K1 상대적 최대 활성화 100% 42% 48% 34%
EC 50 (nM) 1.70 1.42 0.69 1.10
도 43은 단독의 인슐린과 비교하여 부분적 알로스테릭 효능제 항체의 고정된 농도의 존재하에 인슐린 의존성 pAkt 활성화를 부여준다. 항체의 효능제 활성은 인슐린 용량 반응의 기준선의 증가로서 나타난다. 상기 효능제 항체 Ab037 및 Ab053은 이들 항체의 존재하에 인슐린 EC50 및 힐 계수의 상당한 변화 부재로서 반영되는 인슐린 민감성에 대해 거의 효과를 나타내지 않는다(표 7 참조). 항체 Ab062는 Ab062의 존재하에 인슐린에 대한 EC50이 6.6배 증가함으로써 인슐린 민감성을 감소시키는 것으로 나타난다(표 7 참조).
효능제 항체의 존재 및 부재하에 인슐린 활성화 파라미터
분석에 사용되는 가공된 인슐린 수용체 세포주 S자형 용량 반응 곡선 피트로부터 결정된 분석 파라미터 2 ug/ml대조군 항체와 함께 Hu 인슐린
(95% 신뢰 구간) 		2 ug/ml Ab037과 함께 Hu 인슐린
(95% 신뢰 구간) 		2 ug/ml Ab053과 함께 Hu 인슐린
(95% 신뢰 구간) 		2 ug/ml Ab062과 함께 Hu 인슐린
(95% 신뢰 구간)
사람 INSR CHO-K1 2 ug/ml 항체의 존재하에 pAkt의 상대적 최대 활성화 100%
(93% 내지 108%)		 109%
(106% 내지 112%)		 99%
(97% 내지 102%)		 106%
(100% 내지 112%)
2 ug/ml 항체 (nM)의 존재하에 인슐린 EC50 0.58
(0.35 내지 0.96)		 1.11
(0.84 내지 1.5)		 0.92
(0.68 내지 1.3)		 3.91
(2.7 내지 5.7)
2 ug/ml 항체의 존재하에 인슐린의 힐(Hill) 계수 0.74
(0.48 내지 1.0)		 0.79
(0.63 내지 0.95)		 0.93
(0.69 내지 1.2)		 0.71
(0.54 내지 0.89)
실시예 20
항-INSR 항체 83-7은 hINSR에 결합하는 인슐린의 양성 조절제가 아니다.
항-INSR 항체 83-7은 이전에 사람 인슐린 수용체에 대해 특이적인 것으로서 동정되었지만, 상기 83-7 항체는 인슐린-인슐린 수용체 결합에 대해 임의의 조절 능력을 갖는 것으로 입증되지 않았었다. 역학적으로 인슐린-인슐린 수용체 상호작용을 조절하는 상기 83-7 항체의 능력을 평가하기 위해, AKT의 인슐린-유도된 세린 인산화는 83-7의 존재하에 측정하였다.
항체 83-7을 암호화하는 VH 및 VL 서열(문헌참조: McKern et al., Nature 443: 218-221, 2006)을 합성하였고 항체(IgG1, 람다 경쇄)는 HEK293 EBNA 세포에서 일시적으로 발현되었다. 상기 항체는 단백질 A 포획 및 크기 배척 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. AKT의 인슐린 유도된 세린 인산화를 증가시키는 83-7의 능력은 실시예 5에 기재된 방법을 사용하여 측정하였다. 도 44는 (A) 사람 INSR 또는 (B) 마우스 INSR을 발현하는 CHOK1 세포에 대한 83-7 및 Ab001에 대한 pAKT 분석 결과를 보여준다. 항체 83-7은 인슐린 의존성 INSR 시그날 전달을 양성으로 조절하지 않았고 이는 사람 INSR에 대해서만 효능제 활성을 보여주고 마우스 INSR에 대한 효능작용은 나타나지 않았다. 대조적으로, AbOO1은 사람 INSR 및 마우스 INSR 둘다에 대해 인슐린 의존성 INSR 시그날 전달을 약 10배로 양성으로 조절하였다.
실시예 21
항-INSR 항체에 의한 INSR에 대한 인슐린 결합 친화성의 조절을 측정하기 위한 분석
인슐린 수용체로의 인슐린 결합에 영향을 주는 조절 항체의 능력을 결정하기 위해, 혈청 고갈된 CHOK1 세포(hINSR5-CHOK1)의 표면상에 발현된 사람 INSR에 결합하는 비변형된 인슐린의 친화성은 INSR에 대한 모노클로날 항체의 존재 및 부재하에 측정하였다. KinExA 분석은 세포 배양 배지에서 매우 낮은 수준의 인슐린을 증정하기 위해 개발하였다. 상기 분석은 INSR 발현 세포로의 인슐린의 결합이 세포 배양 배지로부터 인슐린 고갈 수준을 결정함에 의해 측정될 수 있도록 한다. 인슐린이 세포에 결합됨에 따라 세포 배양 배지에서 인슐린의 농도는 저하되었다. INSR을 발현하는 세포의 적정을 사용하고 % 유리된 인슐린을 측정함에 의해. INS-INSR 상호작용의 친화성은 KinExA 소프트웨어를 사용하여 평가할 수 있다. 상기 분석을 사용하여 다양한 항-INSR 항체에 의해 나타난 인슐린 결합 활성의 조절 정도를 측정하였다.
hINSR8-CHOK1 세포는 밤새 혈청 고갈시켰고 이어서 세포를 펠렛화하고 2X 농도로 최고의 희석을 위한 최종 분석 농도(500μg/mL BSA 및 0.1% 아지드화나트륨 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 함께 PBS의 분석 희석 완충액(Teknova, Hollister CA) 중 3.5 x 107 내지 2.0 x 107 세포/mL)로 재현탁시킴에 의한 분석을 위해 제조하였다. 세포의 2배 연속 희석물을 제조하여 10점 연속 희석물을 제조하고 무세포 대조군을 또한 사용하였다. 세포 현탁액은 각각 2ml 용적으로 폴리프로필렌 분석 튜브에 적가하였다. 이들 세포 현탁액에 lmL의 40ug/mL 시험 항체(또는 Ab078에 대해 100ug/mL)는 각각의 튜브에 첨가하고 약하게 혼합하고 빙상에서 30 내지 45분 동안 항온처리하였다. 사용되는 상기 항체는 음성 대조군 사람 IgG2 항-KLH 항체와 대비하여 시험하였다. 1mL의 200pM 인슐린은 각각의 튜브에 첨가하여 50pM(300pg/ml)의 최종 인슐린 농도를 확립하였다(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 샘플은 18시간 동안 4℃에서 밤새 항온처리하고 이어서 원심분리하여 세포를 펠렛화고 상등액을 시험을 위해 제거하였다.
KinExA 3000 분석은 항-인슐린 모노클로날 항체로 피복된 비드를 사용하여 수행하였다. 2g의 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA) 비드(Sapidyne, Boise, ID)는 65 ug/mL의 클론 D6C4 마우스 항-인슐린 모노클로날 항체(Fitzgerald Industries, Acton MA)를 함유하는 9ml의 분석 완충액 PBS 중에 현탁시켰다. 비드는 실온에서 6시간 동안 회전시키고 이어서 침강하도록 방치하였다. 상등액은 50mg/mL BSA 분획 V를 갖는 PBS (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)로 대체하고 4℃에서 밤새 회전시켰다. 사용되는 검출 용액은 스트렙타비딘-PE를 1 ug/mL를 갖는 분석 희석 완충액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)중에서 0.15μg/mL의 비오티닐화된 마우스 항-인슐린 클론 D3E7(Fitzgerald Industries, Acton MA)이다. KinExA 3000 상에서, 상기 샘플은 240초 동안 분당 0.25ml로 주사하고 이어서 전개 완충액(0.05% 아지드화나트륨을 갖는 PBS)중에 60초 동안 세정함에 이어서 240초의 검출 완충액을 주사하고 이어서 최종으로 분당 1ml로 최종 90초 세척하였다. 초기 시점과 전개 말기 근처의 시점간의 전압 차이를 측정하고 이를 사용하여 친화성을 계산하였다. 세포에 대한 INSR 농도는 2.5 x l05 수용체/세포로 평가하였다. 친화성은 KinExA 소프트웨어(Sapidyne, Boise ID)를 사용하여 결정하였고 EC50은 프리즘(GraphPad Software, La Jolla CA.)내 비선형 피트에 의해 계산하였다.
다수의 항-INSR 항체는 세포에 대한 인슐린의 친화성을 증진시켰다. 다른 항체는 세포에 대한 인슐린 친화성에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다(표 8). 시험된 항체중 하나는 세포에 대한 인슐린의 친화성을 대략 3배 감소시켰다. 도 45는 평가된 인슐린 수용체 농도에 대해 플롯팅된 유리된 인슐린 %를 보여준다. 상기 인슐린 수준은 50pM로 고정시키고 항체 농도는 25ug/mL (167nM)에서 시험된 Ab078을 제외하고는 모든 클론에 대해 lOug/mL (67nM)이었다. 나타낸 곡선은 EC50을 계산하기 위해 사용되는 비선형 회귀 프리즘 피트이다.
도 46은 평가된 인슐린 수용체 농도에 대해 플롯팅된 유리된 인슐린 %를 보여준다. 상기 인슐린 수준은 50pM로 고정시켰고 항체 농도는 모든 클론에 대해 lOug/mL (67nM)이었다. 나타낸 곡선은 EC50을 계산하기 위해 사용되는 비선형 회귀 프리즘 피트이다.
Figure 112012032772323-pct00005
실시예 22
항-INSR 항체의 존재 또는 부재하에 MCF-7 세포의 인슐린, IGF-1 및 IGF-2 매개된 증식을 측정하기 위한 분석
인슐린, IGF-1, 및 IGF-2는 MCF-7 사람 포유동물 선암종 세포에서 유사분열을 촉진시킨다. 이전의 연구는 인슐린 유사체가 INSR에 결합한 후 대사적 시그날 전달외에도 유사분열 시그날 전달을 촉진시킴을 보여준다. 본원에 기재된 양성 조절제 및 효능제 항-INSR 항체는 INSR 매개된 대사적 시그날 전달의 활성화와 병행하여 INSR 매개된 유사분열 시그날 전달을 촉진시키는 것으로 예상되었다. 인슐린 매개된 유사분열 자극에 대한 조절 항체의 효과는 수용체를 발현하는 MCF-7 세포를 사용하여 측정하였다.
MCF-7 세포는 정상적인 유지를 위해 10% FBS 및 2mM 글루타민(Invitrogen)이 보충된 4.5g/L의 글루코스를 함유하는 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. 증식 분석을 위해, 세포를 1 x 104 세포/웰(Costar 3917)의 밀도로 96웰 백색 불투명 미세역가 플레이트에 씨딩하고 24시간 동안 재부착하도록 방치하였다. 24시간 후, 세포는 미리 가온된 PBS로 2x 세척하고 0.1% FBS 및 2mM 글루타민이 보충된, 1g/L의 글루코스 및 비페놀 레드를 함유하는 DMEM(Invitrogen)(이는 "고갈 배지"로서 언급됨)중에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 인슐린 (Sigma), IGF-1 (R&D Systems), 및 IGF-2 (R&D Systems)는 고갈 배지에서 10 x 스톡으로서 제조하고 1uM로부터 시작하여 64nM 이하로 연속으로 5배 희석시키고(6개 희석물) 24시간 고갈 기간 후 세포에 첨가하였다. 성장 인자와 함께 항-INSR 항체를 포함하는 동시 항온처리 실험을 위해, 50 ug/ml의 각각의 항체 스톡을 고갈 배지에 제조하고 5ug/ml의 최종 농도로 성장 인자를 첨가하기 전에 세포에 첨가하였다. 상기 세포를 48시간 동안 37℃에서 항온처리하고 세포 증식은 세포역가-G1o 발광 세포 생존 분석(Promega)을 사용하여 측정하였다. 상기 결과는 표 9에 나타낸다.
Figure 112012032772323-pct00006
이들 결과는 놀랍게도 항-INSR 항체의 존재하에 상기 언급된 성장 인자중 어느 하나에 대한 유사분열 반응에서 어떠한 유의적 변화가 95% 신뢰구간 범위내에서 관찰되지 않았다. 이들 항체는 교차반응하고 약하게 IGF-1 및 IGF-2에 결합할 수 있지만 상기 분석은 임의의 가능한 교차반응성 결합이 기능성 효과를 유발하지 못함을, 즉 수용체를 통해 시그날 전달을 촉진키지 않음을 입증한다. 이것은 항체가 유사분열 INSR 매개된 시그날 전달에 대한 대사 비율을 증가시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 23
분화된 3T3-L1 지방세포에서 인슐린 내성 지방산 흡수를 역전시키는 항-INSR 항체의 효과
TNFα는 인슐린 의존성 지방산 흡수를 억제할 수 있다. TNFα는 IRS-1과 같은 인슐린 시그날 전달 경로 중간체의 불활성화에 의해 인슐린 내성을 유발시키는 것으로 공지되어 있고(문헌참조: Nguyen et al, J. Biol. Chem. 280(42): 35361-71, 2005; Luca and Olefsky, FEBS Let. 582: 97-105, 2008) 이는 또한 인슐린 의존성 글루코스 흡수 경로의 일부이고, 항-INSR 항체에 의한 인슐린 의존성 지방산 흡수의 TNFα 억제 역전은 인슐린 의존성 글루코스 흡수의 TNFα 매개된 억제를 역전시키는 상기 항체의 능력을 암시한다.
3T3-L1 마우스 배아 섬유아세포는 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있고 이후 이들은 인슐린 매개된 지방산 흡수에 대해 고도의 반응성이 된다. 고지방 영양공급물은 지방 조직 인슐린 내성의 원인으로서 설정되었다. 시험관내 상기 조건을 조사하기 위해, 3T3-L1 지방세포를 유리된 지방산(FFA)으로 처리하였고 이는 인슐린 수용체 매개된 시그날 전달을 손상시키고 궁극적으로 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 감소시켰다. 인슐린 내성에 기여하는 FFA 처리에 의해 유도되는 다운스트림 이펙터 분자중 하나는 TNFα이다. TNFα는 또한 인슐린 매개된 지방산 흡수를 억제하는 것으로 나타났고 이는 항-INSR 항체가 인슐린 내성 지방산 수송을 역전시킬 수 있는지의 여부를 평가하기 위한 잘 한정된 시험관내 시스템을 제공한다.
3T3-L1 세포는 정상적인 유지를 위해 10% 신생 태아 혈청(NCS; Invitrogen) 및 2mM 글루타민(Invitrogen)이 보충된, 4.5g/L의 글루코스를 함유하는 듈베코 변형 이글스 배지(DMEM) 중에서 배양하였다. 96웰 미세역가 플레이트에서 세포를 지방세포로 분화시키기 위해, 하기의 프로토콜을 사용하였다: (1) -5일에, 웰당 2 x 103 세포를 검정/투명한 기저 96웰 플레이트에 씨딩하고(BD Falcon 353948), (2) -2일에, 세포가 컨플루언시에 도달하고 추가로 2일 동안 잔류시키고, (3) 0일째에, 분화 배지를 첨가하고, (4) 3일째에 배지는 0.425uM 인슐린을 함유하는 정상적인 성장 배지로 갈아주고, (5) 7일째에 배지를 정상적인 성장 배지로 갈아준다. 인슐린 내성을 유도하기 위해, lOx 스톡의 TNFα (R&D Systems)는 정상적인 성장 배지중에서 제조하고 분화 과정 9일째에 세포에 첨가하였다. 사용되는 TNFα의 작동 농도는 1 내지 10 ng/ml이었다. 지방산 흡수는 10일째 세포상에서 수행하였다. 사용되는 지방산 흡수 프로토콜은 다음과 같다. 세포는 0.2% 지방산-유리된 BSA (FAF-BSA; Sigma) 및 20 mM HEPES (Invitrogen)을 함유하는 행크 균염 용액(HBSS; Invitrogen)중에서 2회 세척함에 이어서 37℃에서 1 내지 2시간 동안 HBSS 중에서 혈청을 고갈시켰다. 항-INSR 항체 또는 다른 관련 대조군은 단독의 10 x 스톡 또는 HBSS로부터 첨가하고 30분 동안 37℃에서 항온처리하고 인슐린은 10x 스톡으로부터 희석물에 첨가하고 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 동등 용적의 재구성된 QBT 지방산 흡수 분석(Molecular Devices) 로딩 완충액을 이어서 첨가하고 3시간 이하동안 37℃에서 항온처리하고 상기 플레이트는 내부화된 형광 지방산 유사체를 측정하기 위해 형광 플레이트 판독기상에서 판독한다.
도 47은 TNFα가 항-INSR 항체 Ab085의 존재하에 3T3-L1 지방세포내 인슐린 매개된 지방산 흡수의 탈감작을 유도함을 보여준다. 표 10은 지방산 흡수에 대한 항체의 상대적 EC50을 보여주고 이는 Ab085가 지방산 흡수에 대해 EC50을 감소시킴을 입증한다. 항-INSR 항체 Ab085의 존재하에, 인슐린 매개된 지방산 흡수의 TNFα-유도된 탈감작은 비처리된 대조군 값으로 완전히 역전시켰다. 유사한 결과는 Ab083에 대해 관찰하였다.
Figure 112012032772323-pct00007
이들 결과는 양성 조절제 항체가 지방세포에서 지방산 흡수를 증가시킬 수 있음을 입증하고 이는 항체가 지방산 흡수를 증가시키는 것으로부터 이득이 되는 장애 또는 증상을 치료하기 위해 유용함을 시사한다.
실시예 24
인슐린 의존성 pAkt 활성화 에 의한 고도로 정제된 항-INSR 항체의 특성 분석
특정 양의 분석 대 분석 변화가 기능성 pIRS-1 및 pAKT 분석에서 나타났다. 이것은 상기 변화가, 시험 항체가 단백질 A 정제, 예를 들어, 크기 배척 크로마토그래피(대략 95% 초과로 순수한 항체를 수득한다) 이외의 추가의 단계를 사용하여 정제되는 경우 감소될 수 있는 것으로 결정되었다. 상기 정제 단계는 응집물을 감소시키거나 제거하고 오염 성장 인자는 기능성 분석을 방해하는 것으로 사료된다.
다수의 고도로 정제된 항-INSR 항체는 사람 INSR 또는 마우스 INSR을 발현하는 CHOK1 세포를 사용하여, 실시예 5에 기재된 pAKT 분석에서 시험하였다. 추가로, 특정 항-INSR 항체는 시노몰구스 몽키 INSR로 형질감염된 CHOK1 세포주(CHOK-cynoINSR-4)에 대한 활성에 대해 시험하였다.
양성 조절제 항-INSR 항체 AbOO1, Ab037, Ab077, Ab079, AB080 및 Ab083의 효과는 pAKT 분석에서 측정하고 결과는 도 48(사람 INSR) 및 도 49(마우스 INSR)에 나타낸다.
사람 INSR 및 마우스 INSR에 대한 효능제 항체 Ab037, Ab030, Ab053 및 Ab062의 상대적 % pAKT는 각각 도 50 및 51에 나타낸다.
양성 조절제 항체 및 효능제 항체의 상대적 % pAKT는 또한 시노몰로구스 몽키 INSR4를 발현하는 CHOK1 세포에서 측정하였다. 도 52는 항-INSR 항체 Ab030, Ab037, Ab053, Ab001, Ab079, AB080 및 Ab083이 몽키 INSR의 활성화 후 AKT 인산화를 포함할 수 있음을 입증한다.
추가로, 음성 조절제 항체 Ab061, Ab070 및 Ab081의 상대적 % pAKT는 또한 사람 INSR을 발현하는 CHOK1 세포에서 측정하였다. 상기 결과는 표 11 및 도 53에 나타낸다.
10ug/mL Ab061 20ug/mL Ab070 20ug/mL Ab081 20ug/mL 이소타입 대조군 mAb
인슐린 EC50 32.43 2.09 4.53 0.12
이소타입 대조군 mAb에 관한 EC50에서의 배수 변화 269 17 38 　
EC50 95% 신뢰 구간 14.36 내지 73.25 1.686 내지 2.598 3.503 내지 5.843 0.09691 내지 0.1496
이들 결과는 음성 조절제 항체가 인슐린의 EC50을 몇몇 경우 수백배로 증가시킴을 입증한다.
실시예 25
항-INSR 항체의 종 교차 반응성의 평가
상기 실시예는 흔히 독성학적 연구에 사용되는 토끼 및 시노몰구스 몽키와 같은 종의 세포에 대한 인슐린 수용체 항체의 결합을 평가하기 위한 FACS 기반 분석의 용도를 기재한다. 파아지 디스플레이 라이브러리 기원의 항-INSR 항체는 사람, 토끼 및 시노몰구스 몽키의 말초 혈액 단핵구로의 결합 및 상기 지칭된 종의 단핵구에 대한 리간드(인슐린)의 존재 또는 부재하에 차등적 결합 둘다에 대해 스크리닝하였다.
시노몰구스 몽키 전혈은 기관[California National Primate Research Center (Davis, CA)]으로부터 입수하였고 토끼 전혈은 기관[LifeSource Biomedical, LLC (Moffett Field, CA)]으로부터 입수하였다. 사람 PBMC는 기관[American Red Cross]으로부터 수득된 버피 코트로부터 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque)를 사용하여 정제하였다. 시노몰구스 및 토끼 PBMC는 이어서 피콜 하이파크 농도 구배(Pharmacia)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PBMC는 동결시키고 분석에 사용하기 전에 액체 질소중에 저장하였다. 사람, 시노몰구스 및 토끼 PBMC를 해동시키고 FACS 완충액(PBS 중의 0.5% BSA 및 0.1% NaN3)으로 세척하였다. 일단 세포가 제조된 경우, 이들은 최종 농도 2 x l06 세포/ml로 FACS 염색 분석에 사용하였다.
차등적 결합을 조사하기 위해, 세포를 1시간 동안 4℃에서 항-INSR 항체의 감소하는 농도와 함께 인슐린의 존재 또는 부재하에 항온처리하고 FACS 완충액으로 세척하였다. 항-INSR 항체의 결합은 4℃에서 30분 동안 염소 항-사람 IgG Alexa647 (Jackson ImmunoResearch)을 첨가하여 밝혔다. FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 다양한 마커로 염색하여 단핵구 집단을 포획하였다. 사람 및 시노몰구스 세포는 CD45 및 CD14로 염색하였다. 토끼 세포는 CD11b 및 CD14로 염색하였다. 항체는 이어서 20분 동안 항온처리하고 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서 세포는 2% 파라포름알데하이드로 고정시키고 동등한 용적의 FACS 완충액을 세포 분석전에 첨가하였다. 상기 세포는 FACScan™ (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)상에서 분석하고 데이타는 FloJo™ (Tristar, Paso Robles, CA) 및 GraphPad 프리즘 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA) 둘다를 사용하여 분석하였다.
사람, 토끼 또는 시노몰구스 몽키 PBMC상에 나타난 결합은 적당한 종의 인슐린 수용체를 발현하는 CHO 세포주를 생성하고 상기된 바와 같이 결합 분석을 반복하여 확인하였다. 도 54에 나타낸 데이타는 사람 인슐린 수용체에 결합된 많은 항체가 또한 토끼 및 시노몰구스 인슐린 수용체에 결합하고 이러한 결합은 인슐린의 존재하에 조절됨을 보여준다.
실시예 26
사람 인슐린의 존재 및 부재하에 항-INSR 항체의 친화성 측정
혈청 고갈된 CHOK1 세포(hINSR8-CHOK1)의 표면상에 발현된 재조합 사람 INSR에 대한 다양한 항-INSR 항체의 친화성은 인슐린의 존재 및 부재하에 측정하였다. KinExA 분석은 항온처리 완충액 중에 매우 낮은 수준의 항체를 측정하기 위해 개발되었다. 상기 분석은 INSR을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합이 항온처리 완충액으로부터 항체 고갈 수준을 결정함에 의해 측정될 수 있게 한다. 항체가 세포에 결합됨에 따라 완충액 용액 중의 항체 농도는 저하된다. INSR을 발현하는 세포의 적정을 사용하고 % 유리된 항체를 측정하여 INSR 상호작용에 대한 항체의 친화성은 KinExA 소프트웨어를 사용하여 평가할 수 있다. 상기 분석을 사용하여 인슐린의 존재 또는 부재하의 시험된 항체 클론의 상대적 친화성을 결정하여 세포에 결합하는 항체의 인슐린 의존적 조절을 입증하였다.
hINSR8-CHOK1 세포는 밤새 혈청 고갈시키고 이어서 실시예 20에 기재된 바와 같은 분석을 위해 제조하였다. 1 mL의 4 ug/mL 인슐린 또는 완충액을 세포의 각각의 튜브에 첨가하여 최종 인슐린 농도 0 내지 175nM(1ug/ml)를 확립하였다. 이어서 1 mL의 40 ng/mL 항체를 각각의 튜브에 첨가하여 10 ng/mL 또는 66.6 pM의 최종 항체 농도를 수득하였다. 샘플은 18시간 동안 4℃에서 밤새 항온처리함에 이어서 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상등액을 KinExA에 대한 시험을 위해 제거하였다. KinExA 3000 분석은 (Fab')2 단편 염소 항-사람 IgG (H+L) (Jackson Immuno Research, West Grove PA)로 피복된 비드를 사용하여 실시예 20에 기재된 바와 같이 수행하였다. 사용되는 검출 용액은 R-PE-(Fab')2 단편 염소 항-사람 IgG(H+L)(Jackson Immuno Research, West Grove PA)이다. 상기 83-7 쥐 항체를 위해 상기 비드는 상기한 바와 같이 토끼 항-마우스 F(ab')2 항체(Jackson Immuno Research, West Grove PA)와 접합시키고 사용되는 검출 용액은 R-PE-(Fab')2 단편 염소 항-마우스IgG(H+L) (Jackson Immuno Research)이다. 세포에 대한 INSR 농도는 2.5 x 105 수용체/세포로 평가되었고 INSR에 결합하는 2가 항체를 추정하였다.
인슐린의 존재 및 부재하에 다수의 항-INSR 항체의 친화성은 표 12에 나타낸다. 상기 효능제 항체 Ab037, Ab053, 및 Ab062은 인슐린과 무관한 결합을 갖고 인슐린의 존재 또는 부재하에 2배 미만의 친화성을 보여주었다. 상기 83-7 마우스 항체는 인슐린의 존재하에 온건한 3배 친화성을 가졌고 여기서, 양성 조절제 항체 Ab001, Ab079, Ab080, 및 Ab083으로서 이 모두는 Ab080에 대한 17배에서부터 Ab001에 대한 100배 이상 범위의 인슐린의 존재하에 양성 결합 조절을 보여주었다. 양성 조절제 Ab077 및 Ab078은 인슐린 부재하에 다른 클론 보다 약한 친화성을 갖고 결과로서 이들의 "인슐린 부재" 친화성은 수용체 공급원으로부터 세포의 사용에 주어진 최대 수용체 농도로 제한되는 분석 범위를 벗어났다. 결합이 인슐린의 부재하에 이들 클론에 대해 나타날 수 있지만, 이것은 실질적으로 인슐린의 존재하에서 보다는 약하고 83-7 보다 큰 정도로 조절되지만 조절 정도는 이들 분석 조건으로는 정확하게 평가될 수 없다. Ab085는 인슐린의 부재하에 거의 어떠한 결합에 대한 증거를 보여주지 않았고 이의 결합은 인슐린 의존성인 것으로 사료된다.
Figure 112012032772323-pct00008
실시예 27
항-INSR 항체의 에피토프 결합
다원적 방법을 에피토프 비닝(binning)에 적용하여 다양한 항-INSR 항체가 잠재적으로 유사한 에피토프에 결합하는지 또는 이들이 차등적 결합 성질 및 상이한 에피토프 인지를 입증하는지의 여부를 결정하였다. 인슐린 수용체의 상이한 사람 및 쥐 종에 대한 항체의 능력 및 인슐린의 존재 및 부재하에 결합하는 이들의 능력의 분석 뿐만 아니라 경쟁 결합 또는 "비닝" 실험을 수행하였다. 모든 이들은 항체 결합 에피토프의 잠재적 유사성 또는 차이를 결정하기 위한 인자들이다. 유동 세포측정 분석은 인슐린의 존재 및 부재하에 비오티닐화된 IgG의 혈청 고갈된 hINSR8-CHOK1 세포 및 mINSR-CHOK1 세포로의 비오티닐화된 IgG의 결합을 분석함에 의해 수행하였다.
경쟁 결합 분석을 위해, hINSR8-CHOK1 세포 및 mINSR-CHOK1 세포는 밤새 혈청 고갈시키고 이어서 실시예 20에 기재된 바와 같은 분석을 위해 제조하였다. 몇몇 양태에서, 이것은 경쟁 결합 분석을 수행하기 위해 세포 표면상의 다수의 수용체를 계산하기 위해 유용하다. 예를 들어, hINSR8-CHOK1 수용체 발현 수준은 처음에 표준 세포 염색 및 유동 세포측정 기술로 결정하였다. 간략하게 이것은 세포를 포화 농도의 MA-20 모노클로날 Ab (ThermoFisher Scientific, Waltham MA)로 염색시키고 R-피코에리트린 접합된 염소 항-마우스 IgG 항체(Jackson Immuno Research, West Grove PA)로 검출하고 이어서 BD Quantibrite™ PE 비드 (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)와 상대적 형광성을 비교하여 결합된 피코에리트린 분자의 수의 평가를 제공하고 결합된 피코에리트린 분자의 수를 기준으로 인슐린 수용체의 수를 외삽하여 수행하였다. 상기 수를 이어서 추가로 시험하고 문헌[참조: Rathanaswami et al, (Analytical Biochemistry 373:52-60, 2008)]에 기재된 바와 같이 KinExA를 사용하여 개선시킨다. 간략하게, 항체 및 인슐린 결합 둘다를 조사하기 위해 KinExA 실험을 수행하였고, 여기서 사용되는 리간드 농도는 보다 화학양론적으로 제한된 용량 반응을 나타내는 친화성의 결정을 위해 본원에 기재된 것 보다 매우 높다. 이어서 이것은 미공지된 리간드 모델 및 결합 수용체 농도를 확인하기 위해 사용되는 리간드 다중 파라미터의 결정을 사용하여 KinExA 소프트웨어(Sapidyne, Boise ID)에서 분석하였다. 본 분석에서, 예를 들어, 혈청 고갈된 경우 hINSR8-CHOK1 세포가 세포당 대략 250,000 사량체 INSR 수용체를 발현하는 것으로 평가된다. 항체 친화성을 위해, 이것은 수용체 사량체당 2개의 항체의 화학양론을 의미하고 고친화성을 위해 인슐린 결합 부위는 1:1 사량체 대 인슐린 비율이다.
시험될 항체는 표준 아민 화학 및 활성화된 PEG4-비오틴(Thermo-Fisher, Waltham MA)을 사용하여 비오티닐화시켰다. 마우스 항체 83-7 및 83-14를 또한 시험하였다. 이들 항체는 각각 INSR의 CR 도메인의 아미노산 233 내지 281 및 INSR의 FnIII-I 도메인에 결합하는 것으로 보고되었다(McKern et al, 2006; Nature 443: 218-21). 형질감염된 세포를 밤새 혈청 고갈시킨 후, 상기 세포는 1ug/ml의 인슐린의 존재하에 적정한 비오티닐화된 항체로 염색시켰다. 항체는 대략 30분 동안 4℃에서 세포에 대해 항온처리하였다. 이어서 샘플은 FACS 완충액 중에서 2회 세척하고 스트렙타비딘-피코에리트린(Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, USA)을 사용하여 비오티닐화된 항체를 검출하였다. 비닝 실험에 사용되는 비오티닐화된 항체의 농도는 준포화이지만 인슐린의 존재하에 사람 세포주에 대해 여전히 강한 시그날을 기준으로 선택하였다. 사용될 비오티닐화된 항체의 농도가 실험적으로 결정되면 경쟁 분석은 하기와 같이 수행하였다.
상기 세포를 밤새 혈청 고갈시키고 이어서 1ug/ml의 사람 인슐린의 존재 또는 부재하에 냉각 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. 이어서, 상기 세포를 1:1로 60ug/ml의 냉각 또는 비표지된 경쟁 항체와 혼합하고 대략 30분 동안 4℃에서 항온처리하여 30ug/ml의 냉각 Ab 농도를 확립한다. 상기 비오티닐화된 항체를 이어서 3 x 농축물로서 1:2 희석으로 첨가하고 대략 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 이어서, 상기 세포는 FACS 완충액 중에서 2회 세척하고 스트렙타비딘-피코에리트린으로 검출하고 FACS 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)상에서 분석하였다.
MFI는 비결합 대조군 항체 또는 경쟁인자 항체와 혼합되는 경우 비오티닐화된 항체간에 비교하였다. 결합 정도는 사람 및 쥐 세포주에 대해서 및 인슐린의 존재 또는 부재하에 측정하였다. 매트릭스 방법을 사용하고 여기서, 각각의 비오티닐화된 항체는 각각의 냉각 경쟁인자에 대해 시험하였다. 동일한 경쟁 프로필을 갖는 항체는 동일한 빈(bin)에 있는 것으로 고려된다. 표 13에 제공된 바와 같은 예시적인 빈 그룹 분류는 실제로 모든 클론이 이들 조건하에서 최강의 결합을 가짐으로써 인슐린의 존재하에 hINSR8-CHOK1 세포로부터 기원하는 것이다. 표 13에 나타낸 클론은 인슐린 의존성 및 쥐 반응성과 같은 다른 결합 성질을 반영하도록 표지시킨다.
실험 결과는 항-INSR 항체 중에서 대략 7개의 상이한 경쟁 빈을 유도하였다. 어떠한 경쟁을 갖지 않는 항체는 30% 미만의 경쟁을 나타내는 것으로서 정의되고 부분적 경쟁은 30% 초과 및 80% 미만의 경쟁이고 완전한 경쟁은 80% 초과의 경쟁이고 이는 hINSR8-CHOK1과 함께 상기된 바와 같은 방법을 사용한다.
빈 1로 지정된 항체는 사람 및 쥐 반응성이고 AB079, AB076, AB083과 어떠한 경쟁을 나타내지 않고, AB085 및 Ab086과 부분적 내지 완전한 경쟁을 나타내고 AB030, AB037, AB053, AB001, AB018, 및 AB064, AB040과는 완전한 경쟁을 나타낸다.
빈 2의 항체는 사람 및 쥐 반응성이고 빈 1의 항체와 동일한 프로필을 나타내지만 Ab086과 어떠한 경쟁을 나타내지 않고 Ab078과는 부분적 경쟁을 나타낸다.
빈 3의 항체는 사람 및 쥐 INSR 둘다에 결합하고 Ab062 및 Ab086과는 어떠한 경쟁을 나타내지 않고, Ab086, Ab064, AbOO1 및 Ab018과는 부분적 경쟁을 나타내고 Ab079, Ab076, Ab083, Ab080, Ab062, 및 Ab020, Ab019, Ab088, Ab089와는 완전한 경쟁을 나타낸다.
빈 4 항체는 사람 수용체에만 결합하고 Ab062, Ab086, Ab001, Ab018, Ab030, Ab037 및 Ab064와는 어떠한 경쟁을 나타내지 않고 Ab079, Ab076, Ab083, Ab080, Ab062, 및 Ab020, Ab019, Ab088 및 Ab089와는 완전한 경쟁을 나타낸다.
빈 5 항체는 AB077, AB001, AB018, AB030, AB037, AB079, AB076, AB083, AB019, AB088, AB089, 및 AB040과는 어떠한 경쟁을 나타내지 않고 AB064, AB062, AB085, 및 AB078과는 완전한 경쟁을 나타낸다. 이들 항체는 사람 및 쥐 수용체 둘다와 반응한다.
빈 6 항체는 시험된 거의 모든 클론과 완전한 경쟁 내지 부분적 경쟁을 나타낸다. 클론 Ab061은 Ab019와 30% 미만의 경쟁을 나타내고 클론 Ab074는 Ab088과 어떠한 경쟁을 나타내지 않았다. 이들 항체는 사람 및 쥐 수용체 둘다와 반응한다.
빈 7의 그룹으로 분류된 항체는 Ab053, Ab064, 83-7, Ab019, Ab088, 및 Ab089와는 어떠한 경쟁도 나타내지 않고 Ab037, Ab078, Ab083, Ab080, 및 Ab085와는 부분적 경쟁을 나타내고 Ab040, Ab062, Ab030, Ab001, 및 Ab018과는 완전한 경쟁을 나타낸다. 이들 항체는 사람 및 쥐 수용체 둘다에 반응한다.
쥐 83-7 클론을 함유하는 경쟁 빈 4는 쥐 반응성이 결여된 클론 모두를 포함했다. 상기 상체 그룹 분류는 이들의 기능성 성질과 관련된다. 사람 효능제 항체 모두는 빈 1로 그룹 분류된다. Ab004를 제외하고 양성 조절제 항체는 빈 3 및 5로 그룹 분류된다. 상기 빈 3 항체는 INSR-인슐린 복합체 및 단독의 INSR 둘다에 결합하지만 상기 빈 5 항체는 INSR-인슐린 복합체에는 결합하지만 단독의 INSR에는 결합하지 않는다.
Figure 112012032772323-pct00009
상기 예시에 제시된 바와 같은 본 발명에서의 수많은 변형 및 변화는 당업자가 인지하는 것으로 예상된다. 따라서, 첨부된 청구항에 기재한 제한만이 본 발명으로 부과되어야만 한다.
<110> XOMA TECHNOLOGY LTD. <120> Novel Modulators <130> 27129/44972 <150> 61/246,067 <151> 2009-09-25 <150> 61/306,321 <151> 2010-02-19 <150> 61/358,749 <151> 2010-06-25 <160> 303 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.015.175 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(36) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(56) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(98) <223> L-CDR3 <400> 1 Asp Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg 85 90 95 Glu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 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chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(36) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(56) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(98) <223> L-CDR3 <400> 12 Asp Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Asn Arg 85 90 95 Glu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.015.188 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(95) <223> L-CDR3 <400> 13 Asp Val Gln Ile Thr Gln 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(95) <223> L-CDR3 <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.015.173 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(94) <223> L-CDR3 <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Thr 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PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.093 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(100) <223> L-CDR3 <400> 21 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ile Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Pro His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 22 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> XPA.15.096 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> 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35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Pro His Val 100 <210> 24 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.106 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 24 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Trp <210> 25 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.105 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(97) <223> L-CDR3 <400> 25 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ile Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Thr Trp Asp Ser Asn Thr 85 90 95 Gln <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.100 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(100) <223> L-CDR3 <400> 26 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ser Asn Leu Gly Met His 20 25 30 Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Pro Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.124 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> L-CDR3 <400> 27 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.121 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(100) <223> L-CDR3 <400> 28 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 29 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.122 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 29 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.127 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(100) <223> L-CDR3 <400> 30 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly His Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.125 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 31 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Arg 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn 85 90 95 Asn Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 32 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.133 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 32 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Phe Ser Asn Ile Gly Gly Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Tyr Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Val Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.135 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 33 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Thr Asp Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Arg Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.139 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 34 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.138 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MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> L-CDR3 <400> 50 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser 85 90 95 His Leu His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 51 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.047 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(100) <223> L-CDR3 <400> 51 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser 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MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 60 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Thr Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 61 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.115 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> 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sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.144 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> L-CDR3 <400> 65 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Gly Asn 85 90 95 Asn Gln Phe Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 66 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.154 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 66 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Pro 85 90 95 Arg Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 67 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.158 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(100) <223> L-CDR3 <400> 67 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Cys Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Ser Asp Gln Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ile Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 68 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.155 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 68 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Pro 85 90 95 Arg Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 69 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.165 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 69 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 70 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.023 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 70 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Thr Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 71 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.022 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 71 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Leu Gly Ser His 20 25 30 Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 72 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.019 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 72 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Val Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 73 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.021 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 73 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 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<220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.026 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 75 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 76 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.043 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(99) <223> L-CDR3 <400> 76 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Lys Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 77 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.048 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(97) <223> L-CDR3 <400> 77 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Ser 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln 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Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 79 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.059 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 79 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 80 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.064 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 80 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Arg 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 81 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.068 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 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Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Asp Thr Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 83 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.065 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 83 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 84 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.077 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 84 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 85 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.086 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 85 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Pro Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 86 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.088 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(100) <223> L-CDR3 <400> 86 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ser Asn Leu Gly Met His 20 25 30 Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Pro Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 87 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.193 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(99) <223> LCDR3 <400> 87 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Ser Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr 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Asn Arg Asn His 85 90 95 Leu Leu Phe Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 89 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.195 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(104) <223> LCDR3 <400> 89 Gln Ala Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Val Ala 20 25 30 Tyr Asn Ile Tyr Trp Tyr Arg Gln Lys Ser Gly Ser Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Val Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Ser Glu Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Leu Ile Trp His Asn Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Thr Val Leu 115 <210> 90 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.196 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(99) <223> LCDR3 <400> 90 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Phe Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile His Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Val Gly 85 90 95 Thr Ile Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 91 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.197 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(99) <223> LCDR3 <400> 91 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Phe Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile His Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Val Gly 85 90 95 Thr Ile Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 92 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.198 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR2 <400> 92 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Leu Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Asn Lys Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Thr Arg Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn Glu 85 90 95 Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 93 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.199 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> LCDR3 <400> 93 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Ile Gly Thr Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 94 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.200 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(99) <223> LCDR3 <400> 94 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Thr Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Tyr Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met 35 40 45 Leu Val His Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Tyr Met Gly Gly 85 90 95 Gly Ile Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 95 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.201 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(105) <223> LCDR2 <400> 95 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Pro Ser Asp Ile Asn Val Arg Tyr 20 25 30 His Asn Ile Tyr Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Tyr 35 40 45 Leu Leu Tyr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ser Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ser Thr Asn Thr Gly Ile 65 70 75 80 Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Thr Trp Ser Ser Asn Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln 100 105 110 Leu Thr Val Leu 115 <210> 96 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.202 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> LCDR3 <400> 96 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ala Asp 20 25 30 His Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 97 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.203 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(99) <223> LCDR3 <400> 97 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Asn Ser Ala Ser Val Ser Thr Tyr 20 25 30 Ser Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Tyr Met Gly Ser 85 90 95 Gly Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 98 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.204 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(104) <223> LCDR3 <400> 98 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Asp Ile Ser Val Gly Val 20 25 30 Tyr Arg Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45 Leu Leu Ser Tyr Asn Ser Asp Ser Asn Asn His Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Ile Trp His Ile Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Thr Val Leu 115 <210> 99 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.205 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> LCDR3 <400> 99 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ile Gly Ser Arg Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr 20 25 30 Ala Val His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Asp Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Val Thr 85 90 95 Gly Lys Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 100 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.206 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(102) <223> LCDR3 <400> 100 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Tyr Ala His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Pro Asn Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val 100 105 110 Leu <210> 101 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.207 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(105) <223> LCDR3 <400> 101 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Pro Ser Asp Ile Asn Val Arg Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Tyr 35 40 45 Leu Leu Tyr Tyr Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ser Thr Asn Thr Gly Ile 65 70 75 80 Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Thr Trp Ser Ser Asn Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln 100 105 110 Leu Thr Val Leu 115 <210> 102 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.208 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(58) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(105) <223> LCDR3 <400> 102 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Pro Ser Asp Ile Asn Val Arg Tyr 20 25 30 His Asn Ile Tyr Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Tyr 35 40 45 Leu Leu Tyr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ser Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Val Ser Thr Asn Thr Gly Ile 65 70 75 80 Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Thr Trp Ser Ser Asn Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110 Leu Thr Val Leu 115 <210> 103 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.209 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(99) <223> LCDR3 <400> 103 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Gly 20 25 30 Tyr Ser Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Val Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Tyr Met Gly Ser 85 90 95 Gly Thr Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 104 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.211 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(101) <223> LCDR3 <400> 104 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 105 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.212 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR3 <400> 105 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Ala Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Val Arg Pro Ser Asp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Ala Asn Thr Ala Thr Leu Thr Leu Thr Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Gly Glu Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Val Arg Ser Asp His 85 90 95 Pro Phe Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 106 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.213 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> LCDR3 <400> 106 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly 85 90 95 Ala Gln Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 107 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.214 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> LCDR3 <400> 107 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asp Asn Asn Ile Val Gly Asp Gln 20 25 30 Gly Ala Ala Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ser Phe Arg Asn Asn Ser Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser 50 55 60 Ala Ser Arg Ser Arg Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Arg Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Ser Phe Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.215 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR3 <400> 108 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Val Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Lys Asn Phe Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Phe 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Thr Gly Ala Gln Ala Asp 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Pro Asp Ser Ser Asn Lys Leu 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 109 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.216 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(97) <223> LCDR3 <400> 109 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 110 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.217 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(37) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(100) <223> LCDR3 <400> 110 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Phe Ser Asp Val Ser Ser Arg Phe Phe Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Met Tyr Leu Pro Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 111 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.218 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR3 <400> 111 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95 Leu Met Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 112 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.219 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> LCDR3 <400> 112 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Leu Tyr 20 25 30 Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 113 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.220 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR3 <400> 113 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Met Tyr 35 40 45 Asp Arg Asn Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 114 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.221 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR3 <400> 114 Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Thr Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Arg Ser Ser Glu His 85 90 95 His Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 115 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.222 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) 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(26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR3 <400> 119 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Thr 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Phe 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Tyr 85 90 95 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 120 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.227 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(31) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(51) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(97) <223> LCDR3 <400> 120 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr 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Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 127 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.234 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(96) <223> LCDR3 <400> 127 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Ala Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 128 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.235 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(37) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(98) <223> LCDR3 <400> 128 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 129 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.236 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(105) <223> LCDR3 <400> 129 Glu Ile Val 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chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(104) <223> LCDR3 <400> 133 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Thr Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Glu Ile Ser 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 134 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.242 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(104) <223> LCDR3 <400> 134 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Ser Asn Pro Ser 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 135 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.243 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(105) <223> LCDR3 <400> 135 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.244 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(105) <223> LCDR3 <400> 136 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys His Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Asp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 137 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.245 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(105) <223> LCDR3 <400> 137 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 138 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.246 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(106) <223> LCDR3 <400> 138 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Gly Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Leu Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Gln 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 139 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.247 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(37) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(57) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(100) <223> LCDR3 <400> 139 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val Tyr Gly 20 25 30 Asp Glu Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Leu Tyr Lys Val Ser Asp Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 140 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.248 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(105) <223> LCDR3 <400> 140 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Val Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Lys Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Ser Ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 141 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.249 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(105) <223> LCDR3 <400> 141 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ala Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 142 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.250 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(32) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(52) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(105) <223> LCDR3 <400> 142 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.272 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> LCDR3 <400> 143 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Leu Gly Thr Ile Asn Asp Val Gly Leu Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Asn Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 144 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.275 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(99) <223> LCDR3 <400> 144 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Thr Ser Gly Ser Val Ser Thr Arg 20 25 30 Asn Phe Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Thr Leu Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Tyr Met Thr Gly 85 90 95 Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 145 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.282 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(98) <223> LCDR3 <400> 145 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Ala Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 146 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.284 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(98) <223> LCDR3 <400> 146 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Ala Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Tyr Gln His Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 147 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.293 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(38) <223> LCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(58) <223> LCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(101) <223> LCDR3 <400> 147 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Met Tyr Ser Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 148 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.110 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(101) <223> L-CDR3 <400> 148 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg Asn 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly <210> 149 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.120 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(53) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(99) <223> L-CDR3 <400> 149 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 150 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.163 light chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> L-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(54) <223> L-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(100) <223> L-CDR3 <400> 150 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Leu 1 5 10 15 Arg Val Ile Ile Ser Cys Ala Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr His Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Gln Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Thr Gly Asn 85 90 95 Asn Gln Phe Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 151 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.015.172 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> H-CDR3 <400> 151 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Ser Gly Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 152 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.015.189 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> H-CDR3 <400> 152 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Ser Gly Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 153 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.015.176 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> H-CDR3 <400> 153 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Ser Gly Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 154 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.015.178 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> H-CDR3 <400> 154 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 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heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(102) <223> H-CDR3 <400> 170 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Ser Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala <210> 171 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.023 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(109) <223> H-CDR3 <400> 171 Glu 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XPA.15.163 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(118) <223> H-CDR3 <400> 189 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Gly Ser Trp Asp Thr Thr Gly Tyr Tyr Asn Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 190 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.120 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> H-CDR3 <400> 190 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Val Gly Gly Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 191 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.059 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> H-CDR3 <400> 191 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser 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Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.048 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> H-CDR3 <400> 195 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Arg Tyr Ala Asp Val Ala Asn Ser Val 50 55 60 Val Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Glu Trp Leu Asp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 196 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.064 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) 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Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Val Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 206 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.133 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(109) <223> H-CDR3 <400> 206 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Leu Gly Ile Gly Ser 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<223> Clone XPA.15.139 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> H-CDR3 <400> 208 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Gly Trp Leu Val Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 209 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.138 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(110) <223> H-CDR3 <400> 209 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Arg Trp Tyr Lys Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 210 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.143 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> H-CDR3 <400> 210 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 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Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.169 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(56) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(109) <223> H-CDR3 <400> 214 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Glu Val Glu Tyr Ser Ser Ser Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 215 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.020 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE 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(26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(110) <223> H-CDR3 <400> 221 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Trp Ser Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 222 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.074 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> H-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> H-CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> H-CDR3 <400> 222 Glu Val 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XPA.15.194 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(110) <223> HCDR3 <400> 227 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Lys Leu Tyr Ser Arg Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 228 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.195 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> HCDR3 <400> 228 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr His His Ala Ser Gly Arg Gly Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 229 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.196 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(113) <223> HCDR3 <400> 229 Gln Val Gln Val Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 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PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.200 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(111) <223> HCDR3 <400> 233 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Tyr Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Pro Leu Ala Val Ala Gly Met Ala Leu Gly Asp Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 234 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.202 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(57) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(111) <223> HCDR3 <400> 234 Gln Leu Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Ser Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Ser His Thr Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Thr Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ala Pro Lys Gly Gly Ser Gly Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 235 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.203 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(115) <223> HCDR3 <400> 235 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 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XPA.15.208 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(116) <223> HCDR3 <400> 240 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Lys Gly Ser Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 241 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.209 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(111) <223> HCDR3 <400> 241 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Gly Tyr Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Pro Leu Ala Val Ala Gly Met Ala Leu Gly Asp Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 242 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.210 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(122) <223> HCDR3 <400> 242 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val 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<222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(111) <223> HCDR3 <400> 247 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Ser Tyr Gly Gly Asn Ser Glu Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 248 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.216 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(117) <223> HCDR3 <400> 248 Glu 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XPA.15.228 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> HCDR3 <400> 260 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Val Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Ile Ser Thr Pro Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 261 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.229 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> HCDR3 <400> 261 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ala Ala Ala Ala Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 262 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.230 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(105) <223> HCDR3 <400> 262 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser 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heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(106) <223> HCDR3 <400> 266 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Val Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 267 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.235 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> HCDR3 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<223> Clone XPA.15.240 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(57) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(114) <223> HCDR3 <400> 272 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gly 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ser Phe Tyr Phe Glu Ser Ser Arg Ser Trp Asn Asp Leu Phe 100 105 110 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 273 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.241 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> 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<221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(110) <223> HCDR3 <400> 285 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Asp Tyr Ser Asn Tyr Gly Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 286 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.284 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(34) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(108) <223> HCDR3 <400> 286 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ala Ala Ala Ala Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 287 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.293 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(115) <223> HCDR3 <400> 287 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Glu 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Ser Phe Tyr Phe Glu Ser Ser Arg Ser Trp Asn Asp Leu Phe 100 105 110 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 288 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.006 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(109) <223> HCDR3 <400> 288 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Thr Gly Ile Gly Gly Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gln 115 120 <210> 289 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.009 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(109) <223> HCDR3 <400> 289 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Asn Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Arg Phe Leu Glu Trp Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gln 115 120 <210> 290 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.019 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(57) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(106) <223> HCDR3 <400> 290 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Ser Arg Trp Leu Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Gln 115 <210> 291 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.043 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(112) <223> HCDR3 <400> 291 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Ile Pro Gly Arg Trp Leu Gln Leu Gly Gly Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Arg Leu 115 120 <210> 292 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.062 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(109) <223> HCDR3 <400> 292 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Leu Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 293 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.085 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> HCDR3 <400> 293 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Lys Gly Leu Gln Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Phe 115 <210> 294 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.099 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> HCDR3 <400> 294 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Lys Gly Leu Gln Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Gln 115 <210> 295 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.141 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(106) <223> HCDR3 <400> 295 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Tyr Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ser Pro Leu Lys Asp Gly Phe Asp Ile Trp Gly Leu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Thr Gln 115 <210> 296 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.142 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(112) <223> HCDR3 <400> 296 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Phe 20 25 30 Ala Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Val Glu Gly Gly Tyr Phe His Asn Ser Gly Pro Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 297 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.144 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(118) <223> HCDR3 <400> 297 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Gly Ser Trp Asp Thr Thr Gly Tyr Tyr Asn Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 298 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.146 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(57) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(107) <223> HCDR2 <400> 298 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Val Ser Ala Thr Gly Pro His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Val Gly Gly Gly Pro Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 299 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.154 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(109) <223> HCDR3 <400> 299 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 300 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.155 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(109) <223> HCDR3 <400> 300 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 301 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.158 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(110) <223> HCDR3 <400> 301 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Pro Thr Val Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 302 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.165 heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(56) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(107) <223> HCDR3 <400> 302 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Leu Asp Trp Ser Ser Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 303 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Clone XPA.15.196 heavy chain revised <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> HCDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(58) <223> HCDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(113) <223> HCDR3 <400> 303 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly His 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Ser Ser Ser Trp Pro Val Tyr Phe Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (62)

  1. 단일클론 항체로서,
    인슐린 수용체의 알로스테릭 길항제 (allosteric antagonist)이며,
    (i) 인슐린 수용체, (ii) 인슐린 및 인슐린 수용체를 포함하는 복합체, 또는 (i)과 (ii) 둘 다에, 10-5M 이하의 평형 해리 상수 KD로 결합하며,
    인슐린과 인슐린 수용체 간의 결합 친화성을 3배 이상 약화시킬 수 있는, 단일클론 항체로서,
    상기 항체는
    (a) Ab081 (서열번호 279, 139), Ab061 (서열번호 241, 103), Ab070 (서열번호 258, 119), Ab020 (서열번호 155, 8), Ab052 (서열번호 228, 89), Ab087 (서열번호 169, 18), Ab019 (서열번호 160, 1), Ab088 (서열번호 153, 2), Ab089 (서열번호 154, 4), Ab050 (서열번호 226, 87), Ab055 (서열번호 231, 92), Ab057 (서열번호 233, 94), Ab063 (서열번호 244, 105), Ab065 (서열번호 246, 107), Ab072 (서열번호 260, 121) 및 Ab074 (서열번호 262, 123) 중 어느 하나에서의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역; 또는
    (b) Ab081 (서열번호 279, 139), Ab061 (서열번호241, 103), Ab070 (서열번호 258, 119), Ab020 (서열번호 155, 8), Ab052 (서열번호 228, 89), Ab087 (서열번호 169, 18), Ab019 (서열번호 160, 1), Ab088 (서열번호 153, 2), Ab089 (서열번호 154, 4), Ab050 (서열번호 226, 87), Ab055 (서열번호 231, 92), Ab057 (서열번호 233, 94), Ab063 (서열번호 244, 105), Ab065 (서열번호 246, 107), Ab072 (서열번호 260, 121) 및 Ab074 (서열번호 262, 123) 중 어느 하나에서의 CDR 6개
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 10-5M 이하의 평형 해리 상수 KD를 가지며, 인슐린과 인슐린 수용체 간의 결합 친화성을 1000배까지 약화시킬 수 있는, 단일클론 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 상기 인슐린과 인슐린 수용체 간의 결합 친화성을 3배 내지 500배 약화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 결합 친화성은 KA, KD, 해리율 (off rate)에 대한 결합율 (on rate)의 비 또는 결합율에 대한 해리율의 비 중 하나인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인슐린 시그날 전달 활성의 EC50을 2배 내지 1000배 증가시키는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 pAKT 분석에서 인슐린 시그날 전달 활성의 EC50을 2배 내지 1000배 증가시키는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 279의 중쇄 가변영역 및 서열번호 139의 경쇄 가변영역, 서열번호 241의 중쇄 가변영역 및 서열번호 103의 경쇄 가변영역, 서열번호 258의 중쇄 가변영역 및 서열번호 119의 경쇄 가변영역, 서열번호 155의 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 경쇄 가변영역, 또는 서열번호 228의 중쇄 가변영역 및 서열번호 89의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 인간 수용체 또는 복합체에 결합하며, 뮤라인(murine) 수용체 또는 복합체에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  9. 제1항에 있어서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  10. 제9항에 있어서, 인간 경쇄 불변 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  11. 제1항에 있어서,
    서열번호 279로 제시된 중쇄 CDR 3개와 서열번호 139로 제시된 경쇄 CDR 3개, 서열번호 258 로 제시된 중쇄 CDR 3개와 서열번호 119 로 제시된 경쇄 CDR 3개, 또는 서열번호 241로 제시된 중쇄 CDR 3개와 서열번호 103으로 제시된 경쇄 CDR 3개를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 279의 중쇄 가변영역 및 서열번호 139의 경쇄 가변영역, 서열번호 258의 중쇄 가변영역 및 서열번호 119의 경쇄 가변영역, 또는 서열번호 241의 중쇄 가변영역 및 서열번호 103의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  13. 제11항에 있어서,
    서열번호 279로 제시된 중쇄 CDR 3개와
    서열번호 139로 제시된 경쇄 CDR 3개를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 중쇄의 가변영역은 서열번호 279로 제시되고,
    상기 경쇄의 가변영역은 서열번호 139로 제시되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 항체는 소수성 모이어티에 접합되는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체에 멸균된 약제학적으로 허용되는 희석제를 첨가하는 것을 포함하는, 멸균된 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 멸균된 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는,
    고인슐린혈증 또는 과도한 인슐린 시그날 전달과 관련된 증상을 치료하기 위한 멸균성 조성물로서,
    상기 증상이 암, 인슐린종, 카포시 육종, 인슐린 과용, 저혈당증, 이췌소도세포증, KATP-H1 확산 질환, KATP-H1 집중 질환, GDH-H1 고인슐린혈증/고암모니아혈증 증후군, 류신-민감성 저혈당증, 디아족사이드-민감성 저혈당증, 섬 세포 이상조절 증후군, 유아의 특발성 저혈당증, 유아의 영구적 고인슐린성 저혈당증, 선천성 고인슐린혈증, 신장 부전으로 인한 급성 또는 만성 저혈당증, 및 만성 신장 질환으로 인한 저혈당증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    멸균용 조성물.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는,
    고인슐린혈증 또는 과도한 인슐린 시그날 전달과 관련된 증상을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서.
    상기 증상이 암, 인슐린종, 카포시 육종, 인슐린 과용, 저혈당증, 이췌소도세포증, KATP-H1 확산 질환, KATP-H1 집중 질환, GDH-H1 고인슐린혈증/고암모니아혈증 증후군, 류신-민감성 저혈당증, 디아족사이드-민감성 저혈당증, 섬 세포 이상조절 증후군, 유아의 특발성 저혈당증, 유아의 영구적 고인슐린성 저혈당증, 선천성 고인슐린혈증, 신장 부전으로 인한 급성 또는 만성 저혈당증, 및 만성 신장 질환으로 인한 저혈당증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    약제학적 조성물.
  20. 알로스테릭 효능제 항체로서,
    인슐린 수용체에 10-8, 10-9, 10-10 또는 10-11 M 이하의 친화성으로 결합하며;
    (i) pAKT 분석으로 측정시, 최대 효능제 활성이, 인슐린의 최대 효능제 활성의 20% 내지 80%이며;
    (ii) 존재하는 경우, INSR에 대한 인슐린 EC50을 2배 이상으로 변화시키지 않으며;
    (iii) 존재하는 경우, INSR에 대한 인슐린의 KD를 2배 이상으로 변화시키지 않는 것을 특징으로 하는 알로스테릭 효능제 항체로서,
    상기 항체는
    (a) Ab030 (서열번호 50, 220), Ab037 (서열번호 77, 195), Ab040 (서열번호 84, 197), Ab018 (서열번호 34, 208), Ab051 (서열번호 88, 227), Ab053 (서열번호 90, 229), Ab054 (서열번호 91, 230), Ab056 (서열번호 93, 232), Ab058 (서열번호 96, 234), Ab062 (서열번호 104, 243), Ab064 (서열번호 106, 245), Ab066 (서열번호 108, 247), Ab067 (서열번호 109, 248), Ab068 (서열번호 110, 249), Ab086 (서열번호 112, 251), Ab069 (서열번호 115, 254), Ab071 (서열번호 120, 259), Ab073 (서열번호 122, 261), Ab075 (서열번호 125, 264), Ab082 (서열번호 140, 280), 및 Ab084 (서열번호 142, 282) 중 어느 하나에서의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역; 또는
    (b) Ab030 (서열번호 50, 220), Ab037 (서열번호 77, 195), Ab040 (서열번호 84, 197), Ab018 (서열번호 34, 208), Ab051 (서열번호 88, 227), Ab053 (서열번호 90, 229), Ab054 (서열번호 91, 230), Ab056 (서열번호 93, 232), Ab058 (서열번호 96, 234), Ab062 (서열번호 104, 243), Ab064 (서열번호 106, 245), Ab066 (서열번호 108, 247), Ab067 (서열번호 109, 248), Ab068 (서열번호 110, 249), Ab086 (서열번호 112, 251), Ab069 (서열번호 115, 254), Ab071 (서열번호 120, 259), Ab073 (서열번호 122, 261), Ab075 (서열번호 125, 264), Ab082 (서열번호 140, 280), 및 Ab084 (서열번호 142, 282) 중 어느 하나에서의 CDR 6개
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스테릭 효능제 항체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체는 혈당이 상승된 피검체에서 공복 혈당을 정상 혈당으로 낮추는 것을 특징으로 하는 항체.
  22. 제20항에 따른 항체를 포함하는,
    인슐린 내성과 관련된 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 장애가 고혈당증, 당뇨병 전증, 대사적 증후군, 2형 진성 당뇨병, 다낭성 난소 질환(PCOS), 비알콜성 지방간 질환(NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease), 비알콜성 지방간염(NASH: non-alcoholic steatohepatitis), 지방증, 비만, 이상지질혈증, 랍슨-멘덴할 증후군(Rabson-Mendenhall syndrome), 도노휴 증후군(Donohue syndrome) 또는 요정증 (Leprechaunism)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
    약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 항체는 혈당이 상승된 피검체에서 공복 혈당을 정상 혈당으로 낮추는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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