MXPA04010919A - Complejos e hibridos de envoltura de vih-cd4. - Google Patents

Abstract

Se describe complejos e hibridos de Env-CD4 que exponen epitopos cripticos que son importantes en la neutralizacion de virus. Tambien se proporcionan, metodos y sistemas de diagnostico, tratamiento y prevencion que utilizan los polinucleotidos y polipeptidos.

Description

COMPLEJOS E HIBRIDOS DE ENVOLTURA DE VIH-CD4 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona generalmente con polipéptidos de envoltura (Env) de VIH modificados que son útiles como agentes inmunizantes o para generar una respuesta inmunológica en un sujeto, por ejemplo una respuesta inmunológica celular o una respuesta inmunológica protectora. Más particularmente, la invención se relaciona con polipéptidos Env tales como las formas monomérica u oligomérica gpl20, gpl40 o gpl60 que forma complejos con las proteínas o miniproteínas CD4 , en donde se exponen epitopos crípticos conservados que participan en la unión de Env-CD4 y _____ receptor de quimiocina. La invención también pertenece a ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de la inmunodeficienciá humana (VIH-1, también conocido como HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV) es el agente etiológico del síndrome de inmunodeficxencia adquirida (SIDA) y desórdenes relacionados (véase, por ejemplo, Barre- Sinoussi, et al., (1983) Science 220:868-871; Gallo et al. (1984) Science 224:500-503; Levy et al., (1984) Science 5 225:840-842; Siegal et al., (1981) N. Engl . J. Med. 305:1439- Ref . :158925 1444) . Los pacientes con SIDA habitualmente tienen un período asintomático prolongado seguido por degeneración progresiva del sistema inmunológico y del sistema nervioso central. La replicación del virus está altamente regulada y la infección tanto latente como lítica y la infección tanto latente como lítica del subgrupo de linfocitos T auxiliares CD4 positivos se presenta en cultivo de tejido (Zagury et al., (1986) Science. 231:850-853). Los estudios moleculares de VIH-1 muestran que codifica para muchos genes (Ratner et al., (1985) Nature 313:277-284; Sánchez-Pescador et al., (1985) Science 227:484-492), que incluyen tres genes estructurales -gag, pol y env - que son comunes para todos los retrovirus. Las secuencias nucleotídicas de genomas virales de otros retrovirus, particularmente VIH-2 y el virus de inmunodeficieñci'a" -simio,._.. S.IV (previamente denominado como STVL-III) , también contiene - estos, ^genes ""estructuradles^ (Guyader et al., (1987) Nature 326:662-669). La proteína de envoltura de VIH-1, VIH-2 y SIV es una glucoproteína (glicoproteína) de aproximadamente 160 kd (gpl60) . Durante la infección con el virus de la célula hospedadora, gpl60 se separa por las proteasas de la célula hospedadora para formar gpl20 y la proteína de membrana integral, gp41. La porción gp41 se ancla en la membrana de bicapa del virión, mientras que el segmento gpl20 sobresale dentro del ambiente circundante. Las glucoproteínas gpl20 y gp41 se asocian de manera más covalente y gpl20 libre se puede liberar de la superficie de viriones y células infectadas . Los estudios por cristalografía del polipéptido del núcleo gpl20 indican que este polipéptido está plegado en dos dominios mayores que tienen ciertas estructuras sobresalientes. El dominio interior (interior con respecto a las partes terminales N y C) presenta un conjunto de cadena doble, de dos hélices con cinco bandas ß pequeñas interpuestas en su extremo terminal-proximal y una proyección en el extremo distal desde el cual surge el vástago V1/V2. El dominio exterior es un barril doble apilado que se encuentra a lo largo de un lado del dominio interior de manera que el barril exterior y los ejes de los haces interiores son en contacto, pero distinto del dominio interior o exterior y del dominio V1/V2. La lámina que forma un puente está constituida de cuatro estructuras de cadena ß (ß-3, ß-4, ß21, ß-20) . La región que forma un puente se empaca principalmente sobre el dominio interior, aunque algunos residuos en la superficie del dominio exterior, tales como Phe 382, llegan a la lámina que forma un puente para formar parte de su núcleo hidrofóbico. Véase también el documento WO 00/39303.

La unidad básica de la conformación de lámina ß en la región de lámina de puente es la cadena ß que existe como la hélice menos apretada helicoidalmente con 2.0 residuos por vuelta. La conformación de cadena ß es únicamente estable cuando se incorpora en lámina ß, en donde los enlaces hidrógenos con geometría cercana a la óptima se forman entre los grupos peptídicos sobre cadenas ß adyacentes; los momentos dipolo de las cadenas también se alinean favorablemente. Las cadenas laterales de los residuos adyacentes de la misma cadena sobresalen desde lados opuestos de lámina y no interactúan entre sí, sino que tienen interacciones significativas con su estructura principal y con las cadenas laterales de las cadenas vecinas. Para una descripción general de las láminas ß véase, por ejemplo, T.E. Creighton," Proteins structures and Molecular Properties ( .H. Freeman and "~Cbmpany, , 1993) ;" ""^y^A-rL .-~-.Lehni.nger, Biochemistry ( orth Publishers, Inc., 1975) . ""' - El polipéptido gpl20 es instrumental y media la entrada a la célula hospedadora. Estudios recientes han indicado que la unión de CD4 a gpl20 induce un cambio de conformación en Env que permite la unión de un correceptor (por ejemplo un receptor de quimiocina) y la entrada subsecuente del virus al interior de la célula ( yatt, R. , et al. (1998) Nature 393:705-711; Kwong, P., et al. (1998) iVature 393:648-659) . Parece que aunque CD4 se une a una depresión formada en el límite del dominio exterior, el dominio interior y la lámina que forma un puente de gpl20. También se ha estudiado la inmunogenicidad del polipéptido gpl20. Por ejemplo, individuos infectados con VIH-l habitualmente desarrollan anticuerpos que pueden neutralizar al virus en ensayos in vi tro y esta respuesta se dirige principalmente contra determinantes neutralizantes lineales en la tercer asa variable de la glucoproteína gpl20 (Javaherian, K. , et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. 86 : 6786-6772 ; Matsushita, M. , et al. (1988) J". Virol . 62:2107-2144; Putney, S., et al. (1986) Science 234:1392- 1395; Rushe, J. R., et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3198-3202) . No obstante, estos anticuerpos generalmente muestran la capacidad de neutralizar únicamente un número desarrollo de infección por VIH en humanos, aparecen anticuerpos capaces de neutralizar una gama más amplia de aislados de VIH-l y (Barre-Sinoussi , F., et al. (1983) Science 220:868-871; Robert -Guroff , M. , et al. (1985) Nature (Londres) 316:72-74; Weis, R. , et al. (1985) Nature (Londres) 316:69-72; Weis, R. , et al. (1986) Nature (Londres) 324:572- Stamatatos et al (1998) AIDS Res Hum Retroviruses 14(13) :1129-39 muestran que una supresión en la región variable del virus VIH-1SF162, la cual utiliza el correceptor CCR-5 para entrada del virus, vuelve al virus altamente susceptible a neutralización mediada por suero. Este virus carente de V2 también se neutraliza por sueros obtenidos de pacientes infectados no solo con aislados de VIH-1 revestimiento B sino también los aislados de VIH-1 con revestimiento A, C, D y F. No obstante, la supresión de la región variable 1 no tiene efecto. La supresión de las regiones variables 1 y 2 de un aislado de VIH-Ims de LAI también incrementa la susceptibilidad a la neutralización por anticuerpos monoclonales cuyos epitopos se localizan dentro la cepa LAI, la cual utiliza el correceptor CXCR4 para entrada de virus, no muestra mejoras en la capacidad de Env para incrementar los anticuerpos neutralizantes (Leu et al. (1998) AIDS Res. and Human Retroviruses. 14:151-155) . Además, un subgrupo de anticuerpos reactivos de manera general, encontrados en la mayor parte de los individuos infectados, interfieren con la unión de gpl20 y CD4 (Kang, C.-Y., et al. (1991) Proc . Nati. Acad. Sci . USA. 88:6171-6175; McDougal , J. S., et al . ¦ (1986) J. Irnmunol . 137:2937-2944) . Se considera que otros anticuerpos se unen a la región de unión de receptor de quimiocina después de que CD4 se ha unido a Env (Thali et al. (1993) J. Virol . 67:3978- 3988) . El hecho de que los anticuerpos neutralizantes generados durante el desarrollo de la infección por VIH no proporcionen efecto antiviral permanente en parte se puede deber a la generación de "escapas de neutralización", virus imitantes y a una declinación general del sistema inmunológico del hospedador asociado con la patogénesis. En contraste, la presencia de anticuerpos neutralizantes preexistentes ante la exposición inicial por VIH-1 probablemente tendrá un efecto protector. ( ontefiori and Evans (1999) AIDS Res. Hu . Ret. 15 (8) :689- 698; Bolognesi, D.P., et al. (1994) Ann. Int. Med. 8:603-611; Haynes, B . , F., et al . (1996) Science; 271: 324-328). Los anticuerpos neutralizantes, al unirse a los viriones que entran, pueden reducir o incluso impedir su infectividad por células objetivo y evitar la diseminación de una célula a otra del virus en cultivos de tejido (Hu et al . (1992) Science 255:456-459; Burton, D.,R. y Montefiori, D. (1997) AIDS 11 (suppl. A): 587-598). No obstante, como se 'ha descrito en lo anterior, los anticuerpos dirigidos contra gpl20 generalmente no muestran respuestas de anticuerpos amplias contra diferentes cepas de VIH. Actualmente, el foco de desarrollo de vacuna, desde la perspectiva de inmunidad humoral, es sobre la neutralización de aislados primarios que utilizan el correceptor de quimiocina CCR5 que se considera es importante para la entrada del virus (Zhu, T., et al. (1993) Science 261:1179-1181; Fiore, J., et al. (1994) Virology; 204:297- 303) . Estos virus generalmente son mucho más resistentes a neutralización por anticuerpos en comparación con las cepas adaptadas de la línea de linfocitos T que utilizan el correceptor CXCR , aunque ambos pueden ser neutralizados in vi tro por ciertos anticuerpos monoclonales que actúan de anticuerpos monoclonales se dirigen al sitio de unión de CD , un sitio de glucosilación y al dominio de fusión de gp41, respectivamente. No obstante, permanece el problema de que no se sabe la manera en que se inducen anticuerpos de la especificidad apropiada por vacunación. Los anticuerpos (Abs) inducidos por la glucoproteína gpl20 a partir de un aislado dado habitualmente solo son capaces de neutralizar virus relacionados estrechamente, de manera general a partir de un subtipo similar o habitualmente del mismo subtipo de VIH-1. Por lo tanto, aún existe la necesidad de antígeno Env que puedan inducir una respuesta inmunológica (por ejemplo anticuerpos neutralizantes o protectores) en un sujeto contra cepas y subtipos múltiples de VIH, por ejemplo cuando se administre como una vacuna. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención resuelve este y otros problemas al proporcionar proteínas híbridas Env-CD4 y polipéptidos Env (por ejemplo gpl20 nativa o modificada) que forman complejos con miniproteínas o imitadores (miméticos) de CD4 novedosos con el fin de exponer los epitopos dentro o cerca del sitio de unión de CD4. aminoácidos a partir de las secuencias de aminoácidos para Env y CD4 de VIH. En algunas modalidades, las secuencias polinucleotídicas que codifican para CD4 se insertan (o se incrustan) dentro de las secuencias de polinucleótidos que codifican para Env de VIH, por ejemplo se insertan en lugar de polinucleótidos que codifican para uno o más residuos aminoácidos en las regiones variables (VI -V5) de Env de VIH. De esta manera, la invención incluye un polinucleótido que comprende una primera secuencia que codifica para un polipéptido Env VIH y una segunda secuencia que codifica para una proteína CD4 , en donde la segunda secuencia se inserta dentro, y en un marco de lectura apropiado con la primera secuencia. En algunas modalidades, el polipéptido Env de VIH del híbrido es codificado por una secuencia gp!20 modificada (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5) y la segunda secuencia comprende una o más de las (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO : 1 a 4) . En algunas modalidades, el polipéptido Env de VIH se basa en la cepa SF162. En cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente, se pueden modificar una o más de las regiones variables Env de las regiones (VI-V5) (por ejemplo que contengan supresiones o sustituciones. la secuencia que codifica para CD4 (segunda secuencia) . Además, cuando cualquiera de los polinucleotidos descritos en la presente se expresan, el péptido CD4 preferiblemente está unido (o forma un complejo) con el polipéptido Env de VIH de manera que los epitopos crípticos se exponen en el polipéptido Env modificado. En otro aspecto adicional, la invención incluye polipéptidos que codifican para cualquiera de los polinucleotidos que se describen en la presente. De esta manera, en algunas modalidades, el polipeptido comprende una proteína Env-CD4 híbrida, por ejemplo un polipéptido híbrido que comprende un polipéptido Env (por ejemplo gpl60, gpl40 nativa o modificada, gpl40 oligomérica, gpl20) y una proteína CD4 (por ejemplo sCD4 , miméticos de CD4 , miniproteínas de CD4 tales como las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN N0:1 a 4, etc.) . El polipéptido Env puede incluir una o más modificaciones, por ejemplo supresiones en una o más de las regiones variables. En algunas modalidades, la proteína CD4 se inserta dentro del polipéptido Env, por ejemplo dentro de una de las supresiones. En otro aspecto adicional, la invención incluye complejos polipept ídicos que comprenden un polipéptido Env de VIH (por ejemplo gpl60 nativa o modificada, gpl40, gpl40 oligomérica, gpl20) formando un complejo con la proteína CD4 (por utilizando formaldehído) ; utilizando un fijador (por ejemplo formal ina) o pueden formar complejos de manera espontánea para formar una unión covalente bajo condiciones adecuadas. Los polinucleótidos que codifican para los componentes del complejo también se describen en la presente, por ejemplo uno o más polinucleótidos que codifiquen para los polipéptidos tanto Env como CD4 (por ejemplo CD4 soluble) que se puedan expresar y que resulten en proteína que se unan formando complejos.

En otro aspecto adicional, la invención incluye composiciones inmunogénicas que comprenden cualquiera de los polinucleótidos o polipéptidos que se describen en la presente. En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas comprenden además uno o más adyuvantes. En un aspecto adicional, la invención incluye una célula que comprende cualquiera de los polinucleótidos o polipéptidos que se describen en la presente. Las secuencias pol inucleotxdicas preferiblemente se unen operablemente a elementos de control compatibles con la expresión en la célula seleccionada. La célula puede ser, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo células BHK, VERO, ??G080, 293, RD, COS-7 y CHO) ; células de insecto (por ejemplo dendríticas, linfocitos B, linfocitos T, hemocitoblastos y células progenitoras de las mismas; una célula primaria; una célula inmortalizada; o células derivadas de tumor. En otros aspectos, la invención incluye un vector de suministro de gen para uso en un sujeto mamífero, que comprende un vector de suministro de gen adecuado para uso en el sujeto, en donde el vector comprende cualquiera de los polinucleótidos que se describen en la presente unidos operablemente a elementos de control compatibles con la expresión en el sujeto. En otro aspecto adicional, la invención incluye un método para producir anticuerpos que se unen a epitopos crípticos de Env de VIH. En algunas modalidades, los métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de los polipéptidos que se describen en la presente a un sujeto bajo condiciones que permiten la producción de anticuerpos.- En otras modalidades, se identifican los epitopos involucrados en la neutralización de VIH, por ejemplo, al identificar un epitopo (por ejemplo, determinando la secuencia del epitopo) y anticuerpos producidos al administrar uno o varios de los epitopos identificados a un sujeto bajo condiciones que permiten la producción de anticuerpos. La invención también y composiciones que se describen en la presente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos neutralizantes, anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales) . En algunas modalidades, los anticuerpos producidos en el sujeto después son aislados. En un aspecto adicional, la invención incluye un método para producir un polipéptido híbrido Env CD4 que comprende incubar cualquiera de las células que se describen en la presente, bajo condiciones adecuadas para producir el polipéptido .

En otro aspecto adicional, la invención incluye un método para inducir una respuesta inmunológica (por ejemplo una respuesta humoral tal como una respuesta de anticuerpos neutralizantes o una respuesta inmunológica celular) en un sujeto, que comprende, administrar cualquiera de los polinucleótidos , polipeptidos o composiciones inmunogénicas que se describen en la presente a un sujeto, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunológica en el sujeto. En algunas modalidades, el método comprende transfectar células ex vivo y reintroducir las células transfectadas en el sujeto. En otras modalidades, el método incluye inmunización de ADN del sujeto, por ejemplo al introducir cualquiera de los polinucleótidos o vectores de suministro de genes descritos en la presente, en el sujeto, sujeto. En otras modalidades, los métodos comprenden: (a) administrar una primera composición que comprende cualquiera de los polinucleótidos que se describen en la presente, en una etapa de cebado, y (b) administrar una segunda composición que comprende cualquiera de los polipéptidos que se describen en la presente, como un refuerzo, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunológica en el sujeto. En cualquiera de los métodos que se describen en la presente, los vectores pueden comprender vectores no virales o vectores virales tales como vectores retrovirales (por ejemplo lentivirales) . Además, los polinucleótidos o el vector se pueden introducir, por ejemplo, utilizando un portador particulado (por ejemplo recubierto en una partícula de oro o tungsteno y la partícula recubierta se suministra al sujeto utilizando una pistola de genes) o se puede encapsular en una preparación liposómica. En cualquiera de los métodos que se describen en la presente, el sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo un humano o un mamífero no humano y la introducción puede ser por vía intramuscular, intramucosa, intranasal, subcutánea, intradérmica, transdérmica, intravaginal , intrarrectal , oral o intravenosa. Estás y otras modalidades de la presente invención se le ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica en base en la descripción que aquí se presenta. . , . ^ BREVE~DESCRIPCIÓN~DE LAS FIGURAS La figura 1 (SECUENCIA DE" IDENTIFICACIÓN NO : 61 muestra la secuencia primaria de aminoácidos del precursor del polipéptido Env de la cepa VIH-1SF2 (a continuación "SF2") (Véase también GenBank. Acceso No. VCLJA2 y Sánchez-Pescador et al. (1984) Science 227:484). La figura 2 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7) muestra la alineación de secuencia de aminoácidos del asa similar a CDR2 de CD4 humano, escilatoxina de escorpión, el mimético de CD4 sometido a ingeniería (CD4M3) y los mutantes doble (CD4M8) y quintuple (CD4M9) .

Las figuras 3A y 3B, son gráficas que muestran la inmunogenicidad de los complejos de gpl20-sCD4. La figura 3A muestra respuestas de anticuerpo para gpl20 inducida por gpl20-sCD4 fijo (formalina o formaldehído) o sin fijar,, en puntos de tiempo diferentes. Las barras negras muestran complejos fijos y las barras grises muestran complejos no fijados. La figura 3B muestra las respuestas de anticuerpo a CD4 (muestras acumuladas) . Las figuras 4A y 4B muestran la caracterización de los complejos gpl20-CD4 utilizando cromatografía por extrusión de tamaño (figura 4A) y SDS-PAGE (figura 4B) . Los perfiles y tiempos de retención de gpl20, CD4 solo o como un complejo tal y como se obtienen utilizando la columna de exclusión por tamaño (figura 4A) . El análisis por SDS-PAGE de molecular . La figura 5 es una gráfica de barras que muestra las reactividades contra gpl20 y de anticuerpos purificados por afinidad CD4. La barra izquierda de cada conjunto muestra la reactividad contra gpl20 y la barra derecha de cada grupo muestra la reactividad contra CD4. La figura 6 es una gráfica de barras que muestra actividad de anticuerpo neutralizante aislado primario de las fracciones de la columna de gpl20. La barra izquierda de cada conjunto muestra la actividad a una dilución 1:10; la barra central muestra la actividad a una dilución 1:40 y la barra derecha muestra la actividad a una dilución 1:160. La figura 7 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5) muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido gpl20 de VIH codificado por una secuencia polinucleotídica que codifica para gpl20 modificado (gpl20.modSF62) . El asa VI está subrayado, el asa V2 se muestra en negrillas; el asa V3 se muestra en cursivas; el asa V4 se muestra con subrayado y sombreado ;. el asa V5 se muestra con subrayado doble. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se establezca de otra manera, métodos convencionales de química proteínica, inmunología viral, completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993) ; Nelson L.M. y Jerome H.K. HIV Protocols en Methods in Molecular Medicine, vol. 17, 1999; Sambrook, et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); F.M. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience New York; y Lipkowitz y Boyd, Reviews in Computational Chemistry, volumen 1-presente (Wiley-VCH, New York, New York, 1999) .

Debe hacerse notar que, como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias a la forma plural, a menos que el contenido claramente lo indique de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una mezcla de dos o más polipéptidos y similares. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la presente, ya sea en lo anterior o en lo que sigue, se incorporan como referencia en su totalidad en la presente. Definiciones Al describir la presente invención, se utilizarán los siguientes términos y se considera que están definidos péptidos, oligopéptidos , dameros, multímeros y similares. Tales polipéptidos se pueden derivar de fuentes naturales o se pueden sintetizar o producir de manera recombinante . Los términos también incluyen las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo glucosilación, acetilación, fosforilación, etc. Un polipéptido, como se define en la presente, generalmente está constituido de los 20 aminoácidos naturales: Ala (A), Arg (R) , Asn (N) , Asp (D) , Cys (C) , Gln (Q) , Glu (E) , Gly (G) , His (H) , He (I), Leu (L) , Lys (K) , et (M) , Phe (F) , Pro (P) , Ser (S) , Thr (T) , Trp (W) , Tyr (Y) y Val (V) y también puede incluir cualquiera de los diversos análogos de aminoácidos conocidos, tanto aquellos que se presentan de manera natural como los análogos sintetizados, tales como, pero sin limitarse a homoisoleucina, asaleucina, 2 - (metilenciclopropil ) glicina, S-metilcisteina , S-(prop-l- enil) cisteina, homoserina, ornitina, norleucina, norvalina, homoarginina, 3 - (3 -carboxifenil) alanina, ciclohexilalanina, mimosina, ácido pipecólico, ácido 4-metilglutámico, canavanina, ácido 2 , 3-diaminopropiónico y similares. Los ejemplos adicionales de agentes polipeptídicos que encontrarán uso en la presente invención se establecen a continuación. describe en la presente, la geometría se puede determinar, por ejemplo, por estudios cristalográficos o mediante la utilización de diversos programas o algoritmos que predicen la geometría en base en las interacciones entre los aminoácidos que constituyen las estructuras primaria y secundaria. Mediante el término "tipo silvestre" con referencia a un polipéptido, agente polipeptídico o medicamento polipeptídico, se quiere significar una secuencia polipeptídica que se presenta de manera natural y su estructura secundaria correspondiente. Una proteína o polipéptido "aislado" o "purificado", es una proteína que se separa y que está distante o separada de un organismo completo con el cual la proteína normalmente se asocia en la naturaleza. Es evidente que el término indica proteínas de diversos niveles de pureza. Típicamente, una composición que contiene una proteína purificada será aquella en la cual por lo menos aproximadamente 35%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 40-50%, y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 75-85% y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 90% o más de la proteína total en la composición sea la proteína en cuestión. ejemplo gpl20, preferiblemente tales como los epitopos (por ejemplo epitopos crípticos) dentro o cerca de uno o varios de los sitios de unión de CD4 o receptor de quimiotina que están expuestos. De esta manera, una miniproteína CD puede ser menos que un fragmento de longitud completa de CD4. Además, el término abarca homólogos funcionales y estructurales de fragmentos de CD4 , es decir, polipéptidos que exponen los epitopos crípiticos en una proteína Env.

Mediante el término "polipéptido Env" se quiere indicar una molécula derivada de una proteína de envoltura, preferiblemente de Env de VIH. La proteína de envoltura de VIH-1 es una glucoproteína de aproximadamente 160 kd (gpl60) . Durante la infección por virus de la célula hospedadora, gpl60 se separa por proteasas de célula hospedadora para formar gpl20 y la proteína de membrana integral, gp41. La porción gp41 se ancla (y abarca) la membrana de bicapa del virión, mientras que el segmento gpl20 sobresale dentro del ambiente circundante. Dado que no hay unión covalente entre gpl20 y gp41, gpl20 libre se libera de la superficie de los viriones y células infectadas. Los polipéptidos Env también pueden incluir a los polipéptidos gpl40. Los polipéptidos Env pueden existir como monómeros, dímeros o multímeros. deriva de Env de VIH. La secuencia de aminoácido primario de gpl20 tiene aproximadamente 511 aminoácidos, con un núcleo polipeptídico de aproximadamente 60,000 unidades Dalton. El polipéptido se modifica extensamente por glucosilación unida a N para incrementar el peso molecular aparente de la molécula a 120,000 unidades Dalton. La secuencia de aminoácidos de gpl20 contiene cinco dominios relativamente conservados interpuestos con cinco dominios hipervariables .

Las posiciones de los 18 residuos cisteína en la secuencia primaria de gpl20 de la cepa HIV-1HXB-2 (a continuación "HXB-2") y las posiciones de 13 de los aproximadamente 24 sitios de glucosilación unidos a N en la secuencia pgl20 son comunes a la mayor parte, si no la totalidad, de las secuencias gpl20. Los dominios hipervariables contienen sustituciones, inserciones y supresiones extensas de aminoácidos. Pese a esta variación, la mayor parte, si no la totalidad de las secuencias gpl2G conservan su capacidad de virus de unirse al receptor viral CD4. Un "polipéptido gpl20" incluye tanto subunidades solas como multímeros. Los polipéptidos Env (por ejemplo gpl20, gpl40 y gpl60) incluyen una "lámina que forma un puente" constituida de 4 cadenas ß antiparalelas (ß-2, ß-3, ß-20 y ß-21) que forman üna^lamina - ß ~Laextrusión de un par de las cadenas ß (ß-2 y ß-3) están dos asas, ,V1 y V2. ~La" ~lámina—·ß-2_ se presenta aproximadamente en el residuo aminoácido 119 (Cys) al residuo aminoácido 123 (Thr) mientras que ß-3 se presenta aproximadamente en el residuo aminoácido 199 (Ser) al residuo aminoácido 201 (lie), en relación con HXB-2. La "región V1/V2" se presenta aproximadamente en las posiciones de aminoácidos 126 (Cys) al residuo 196 (Cys) , en relación a HXB-2 (véase, por ejemplo, Wyatt et al. (1995) J". Virol . 69:5723-5733; Stamatatos et al. (1998) J. Virol. 72:7840-7845) . La extrusión a partir del segundo par de cadenas ß (ß- 20 y ß-21) se encuentra una estructura de "asa pequeña", también denominada en la presente como "el asa pequeña de la lámina que forma un puente". En HXB-2, ß-20 se extiende desde aproximadamente el residuo aminácido 422 (Gln) hasta el residuo aminoácido 426 (Met) mientras que ß-21 se extiende desde aproximadamente el residuo aminoácido 430 (Val) al residuo aminoácido 435 (Tyr) . En la variante SF162, Met-426 es un residuo Arg (R) . El "asa pequeña" se extiende desde aproximadamente el residuo aminácido 427 (Trp) hasta 429 (Lys) , en relación a HXB-2. La alineación de las secuencias aminoácido del polipéptido Env gpl60 de cualquier variante de VIH se puede determinar en relación a otras variantes, tales como HXB-2, como se describe, por ejemplo, en O 00/39303. Además, un "polipéptido Env" o "polipéptido gpl20", constante y contiene varios dominios variables que muestran grados relativamente elevados de variabilidad entre aislados. Es fácilmente evidente que los términos que abarcan polipéptidos Env (por ejemplo gpl20) de cualquiera de los aislados de VIH identificados, así como aislados recién identificados y subtipos de estos aislados. Las descripciones de las características estructurales se proporcionan en la presente con referencia a HXB-2. Una persona habitualmente experta en la técnica, en vista de las enseñanzas de la presente descripción y la técnica, puede determinar las regiones correspondientes en otras variantes de VIH (por ejemplo aislados VIHIIIB, VIHSF2, VIH-1SFI62/ VIHSFi70/ VIHLAV/ VIHLM, VIHMN, VIH-1CM235/ VIH-1US4, otras cepas de VIH-1 de subtipos diversos (por ejemplo subtipos A a G y 0) , cepas de VIH-2 y subtipos diversos (por ejemplo VIH-2UCi y VIH-2UC2/ y virus de inmunodeficiencia en simio (SIV) . (Véase, por ejemplo, Virology, 3a. Edición (W.K. Joklik ed. 1988) ; Fundamental Virology, 2a. Edición (B.N. Fields y D. . Knipe, eds. 1991); Virology 3a. Edición (Fields, BN, DM Knipe, PM Howley, Editores, 1996, Lippincott-Raven, Philadelphia , PA; para una descripción de este y de otros virus relacionados) , utilizando, por ejemplo, los programas de comparación de estructurales (por ejemplo un programa tal como el programa "ALB" descrito en la presente que se puede identificar regiones de lámina ß).. Las secuencias reales de aminoácidos de los polipéptidos Env modificados se pueden basar en cualquier variante de VIH. De manera adicional, el término "polipéptido Env" (por ejemplo "polipéptido gpl20") abarca proteínas que incluyen modificaciones adicionales a la secuencia nativa, tales como supresiones, adiciones y sustituciones internas adicionales. Estas modificaciones pueden ser liberadas, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, por ejemplo a través de sucesos mutacionales que se presenten de manera natural. Así, por ejemplo, si el polipéptido Env se va a utilizar en composiciones vacuna, las modificaciones deben ser tales que no se pierda la actividad inmunológica (es decir, la capacidad para inducir una respuesta de anticuerpo al polipéptido) . De manera similar, si los polipéptidos van a ser utilizados para propósitos de diagnóstico, debe retenerse tal capacidad. Por lo tanto, un "polipéptido Env modificado" es un polipéptido Env (por ejemplo gpl20, como se define en lo anterior) , el cual ha formado un complejo con la proteína CD4 cerca del sitio de unión CD4, mientras que permiten la naturalización correcta (por ejemplo, la geometría correcta) del polipéptido Env. De manera adicional, también se pueden realizar modificaciones (por ejemplo cortes) a las regiones de asa variable (VI, V2, V3, V4 y V5) . Aunque no todas las modificaciones de región variable posibles se han ejemplificado en la presente, debe entenderse que otras modificaciones de interrupción también pueden estar abarcadas por la presente invención.

El término proteína "híbrida", cuando se utiliza con referencia a proteínas híbridas Env-CD4, se refiere a polipéptidos en los cuales las secuencias de aminoácidos de CD4 (por ejemplo, minoproteínas miméticos, etc.) se insertan dentro (flanqueados por) secuencias de aminácidos Env. Los ejemplos no limitantes de híbridos Env CD4 se describen en el Ejemplo 4, en el cual se insertan varias secuencias de miniproteínas CD4 en lugar de (sustituidas por) una o más de las regiones de asa variable (V1-V5) de una proteína Env. Normalmente, los polipéptidos híbridos o modificados como se describe en la presente capaces de secreción en medio de crecimiento en el cual un organismo que expresa la proteína se cultiva. No obstante, para propósitos de la presente invención, tales polipéptidos también se técnicas de detección que incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida y similares, así como técnicas inmunológicas tales como transferencia Western y ensayos de inmunoprecipitación, como se describe, por ejemplo, en la publicación internacional No. WO 96/04301. Un polipéptido se produce " intracelularmente" cuando se encuentra dentro de la célula, ya sea asociado con componentes de la célula, tales como en asociación con reticulando plásmico (ER, por sus siglas en inglés) o el aparato de Golgi o cuando está presente en la fracción celular soluble. El Env CD4 y los polipéptidos híbridos de la presente invención también pueden ser secretados al medio de crecimiento en la medida en que permenanezcan presentes cantidades suficientes de los polipéptidos dentro de la célula de manera que puedan ser codificados de lisados celulares utilizando técnicas descritas en la presente. Una proteína " inmunogénica" es una molécula que incluye por lo menos un epitopo de manera tal que la molécula es capaz de inducir una reacción inmunológica en un individuo al cual se le administra la proteína o, en un contexto de diagnóstico, es capaz de reaccionar con anticuerpos dirigidos contra el VIH en cuestión. Mediante el término "epitopo" se quiere significar un sitio" en~-"un~-antígeno^ al^cual responden los linfocitos B o linfocitos T específicos, haciendo que la "molécula -incluya tal epitopo capaz de inducir una reacción inmunológica o capaz de reaccionar con anticuerpos contra VIH presentes en una muestra biológica. El término también se utiliza de manera intercambiable con "determinante antigénico" o sitio determinante antigénico" . Un epitopo puede comprender tres o más aminoácidos adicionales en una conformación espacial única para el epitopo. De manera general, un epitopo consiste de por lo menos 5 de tales aminoácidos y, de manera más habitual, consiste de por lo menos 8-10 de tales aminoácidos.

Los métodos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional . Además, la identificación de los epitopos en una proteína dada se lleva a cabo fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en el arte tales como mediante el uso de estudios de hidrofobicidad y mediante serología dirigida al sitio. Véase también, Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA (1984) 81:3998-4002 (método general para sintetizar rápidamente péptidos para determinar la ubicación de epitopos inmunogénicos en un antígeno dado); patente de E.U.A. No. 4,708,871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epitopos de antígenos) ; y Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 2_3: 709-715 (técnica para identificar ~peptidos- con~.alta afinidad para un anticuerpo dado) . Los anticuerpos que reconocen el mismo epitopo rse " pueden identificar en un inmunoensayo sencillo que muestre la capacidad del anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. Un "epitopo críptico" se refiere generalmente a un epitopo que se expone únicamente en ciertas conformaciones de la proteína. Una "respuesta inmunológica" o "respuesta inmune", como se utiliza en la presente, es el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunológica humoral o celular o ambas, al polipéptido Env (por ejemplo gp!20) cuando el polipéptido está presente en una composición de vacuna. Estos anticuerpos también pueden neutralizar la infectividad o mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo-complemento o de anticuerpo para proporcionar protección a un hospedador inmunizado. -La reactividad inmunológica se puede determinar por inmunoensayos estándar, por ejemplo ensayos de competición bien conocidos en la técnica. La "transferencia de genes" o "suministro de genes" se refiere a métodos o sistemas para insertar de manera confiable ADN de interés dentro de una célula hospedadora. Tales métodos pueden resultar en la expresión transitoria de ADN transferido no integrado, replicación extracromosomica y expresión de replicones (por ejemplo episomas) transferidos o integración de material genético transferido dentro del ADN genómico de células hbspedadoras-. - Los _v.e tores de expresión de suministro de genes incluyen, pero no se limitan- ectores derivados de alfavirus, pox virus y virus de vaccinia. Cuando se utilizan para inmunización, tales vectores de expresión de suministro de genes se pueden denominar como vacunas o vectores de vacuna. El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos que se obtienen tanto de preparaciones policlonales ¦ como monoclonales así como las siguientes: (i) moléculas de anticuerpo híbrido (quimérico) (véase, por ejemplo, 'Winter: et al. (Nature 349:239-299; y se sabe existen para los anticuerpos, por ejemplo, los dominios ? y ?. Los métodos para preparar dAb se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo Ward et al, Nature 341:544 (1989) . Los anticuerpos también pueden estar constituidos de los dominios VH y VL, así como otros dominios de unión a antígeno conocidos. Los ejemplos de estos tipos de anticuerpos y métodos para su preparación son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,816,467, la cual se incorpora en la presente como referencia) e incluye a los siguientes. Por ejemplo, los "anticuerpos de vertebrados" se refiere a anticuerpos que son tetrámeros o agregados de los mismos, que comprende cadenas ligera y pesada las cuales habitualmente se agregan en una configuración en~ "Y"---en la?-* cual*»pueden o no tener enlaces covalentes entre las cadenas. En los-- anticuerpos de vertebrado, las secuencias de aminoácido de las cadenas son homologas a aquellas secuencias encontradas en anticuerpos producidos en vertebrados, ya sea in situ o in vitro (por ejemplo, en hibrodomas) . Los anticuerpos de vertebrados incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales purificados y anticuerpos monoclonales , métodos para la preparación de los cuales se describen en lo anterior. Los "anticuerpos híbridos" son anticuerpos en donde las cadenas son homologas por separado con referencia a las limita a este ejemplo particular. También se incluye cualquier anticuerpo en el cual cualquiera, o ambas de la cadena pesada o ligera están compuestas de combinaciones o secuencias que imitan las secuencias en los anticuerpos de fuentes diferentes, siempre que estas fuentes sean de clases diferentes o de especies diferentes de origen, y ya sea o no que el punto de fusión se encuentre en límite variable/constante. Por lo tanto, es posible producir anticuerpos en los cuales ni la región constante ni la región variable imiten a secuencias de anticuerpos conocidas. Entonces, se vuelve posible, por ejemplo, construir anticuerpos cuya región variable tenga una afinidad específica mayor por un antígeno particular o cuya región constante pueda inducir fijación incrementada de complemento, o _ producir" ~otfásr~mej oras.-en_-las_propiedades presentadas por una región constante particular. ¿ Otro ejemplo son los "anticuerpos alterados", que se refiere a anticuerpos en los cuales se ha variado la secuencia de aminoácidos que se presentan de manera natural en un anticuerpo de vertebrado. Utilizando técnicas de ADN recombinante , los anticuerpos se pueden volver a diseñar para obtener las características deseadas. Las posibles variaciones son muchas y varían del cambio de uno o más aminoácidos al rediseño completo de una región, por ejemplo, la región constante. Los cambios en la región constante, en general, para obtener las características deseadas de procedimiento celular, por ejemplo cambios en la fijación de complemento, interacción con membranas y otras funciones efectoras. Los cambios en la región variable se pueden realizar para alterar las características de unión a antígeno. El anticuerpo también se puede someter a ingeniería para ayudar en el suministro específico de una molécula o sustancia a una célula o sitio de tejido específico. Las alteraciones deseadas se pueden realizar por técnicas conocidas en biología molecular, por ejemplo técnicas recombinantes , mutagénesis dirigida al sitio, etc. Otro ejemplo adicional son los "anticuerpos univalentes", los cuales son agregados constituidos de un dímero de cadena pesada/cadena ligera unido a la región Fe ejemplo, Glennie et al. Nature 295: 712 (1982). Se incluye también dentro de la definición de anticuerpos los fragmentos "Fab" de los anticuerpos. La región "Fab" se refiere a aquellas porciones de las cadenas pesada y ligera las cuales son generalmente equivalentes o análogas a las secuencias las cuales comprenden la porción de rama de las cadenas pesada y ligera, y las cuales se ha demostrado que presentan unión inmunológica a un antígeno especificado pero las cuales carecen de la porción Fe efectora. El término "Fab" incluye agregados de una cadena pesada y una ligera (conocida comúnmente como Fab'), así como tetrámeros que contengan las cadenas 2H y 2L (denominados como F(ab)2), los cuales son capaces de reaccionar selectivamente con un antígeno o una familia de antígenos designada. Los anticuerpos Fab se pueden dividir en subgrupos análogos a los descritos antes, es decir, "Fab de vertebrados", "Fab de híbridos", "Fab quimérico" y "Fab alterado" . Los métodos para producir fragmentos Fab de anticuerpos se conocen, dentro de la técnica e incluyen, por ejemplo, proteólisis y síntesis de técnicas recombinantes . El término "complejo antígeno-anticuerpo" se refiere al complejo formado por un anticuerpo que se une específicamente a un epitopo en un antígeno. general -el término "similitud" significa la comparación exacta de aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, en donde los aminoácidos son idénticos o poseen propiedades químicas o físicas similares tales como carga o hidro obicidad. También se denomina "similitud en por ciento" entonces se puede determinar entre las secuencias polipeptídicas comparadas. Las técnicas para determinar identidad en la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos también son bien conocidas en la técnica e incluyen determinar la secuencia nucleotídica del ARNm para dicho gen (habitualmente vía un intermediario de ADNc) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada por la misma y comparar esto con una segunda secuencia de aminoácidos . En general , el término "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas , respectivamente . Se pueden comprar dos o más secuencias polinucleotídicas al determinar su "por ciento de identidad" . Dos o más secuencias de aminoácidos de igual manera se pueden comparar al determinar su "por ciento de identidad" . El por ciento de identidad de dos secuencias, ya sean secuencias de corta y multiplicada por 100. Se proporciona una alineación aproximada para las secuencias de ácido nucleico por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo se puede extender para utilizarse con secuencias peptídicas que utilicen la matriz de calificación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed. , 5 suppl . 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EUA, y normalizada por Gribskov, Nucí.

Acids Res. 14 (6) : 6745-6763 (1986). Una implementación de este algoritmo para secuencias de ácidos nucleicos y secuencias peptídicas se proporciona por Accelrys en la aplicación de utilidad BetsFit. Los parámetros implícitos por este método se describen en los materiales del proveedor (Accelrys) . Otros programas igualmente adecuados para calcular el por ciento de identidad o similitud entre secuencias se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, el por ciento de identidad de una secuencia nucleotídica particular respecto a una secuencia de referencia se puede determinar utilizando el algoritmo de homología de Smith y aterman con una tabla de calificación implícita y un castigo por separación de seis posiciones nucleotídicas . Otro método para establecer el por ciento de identidad*' en" el'~ contexto—de. :la_presente_ invención es el uso del paquete MPSRCH de programas propiedad de -la._University of Edinburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics , Inc. (Mountain View, CA) . A partir de este grupo de paquetes, se puede utilizar el algoritmo de Smith-Waterman en donde se utilizan parámetros implícitos para la tabla de calificación (por ejemplo, un castigo de separación abierta de 12, un castigo de extensión de separación de uno y una separación de seis) . A partir de los datos generados, el valor de "coincidencia" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el por ciento de identidad o la similitud entre las secuencias se conocen generalmente en la técnica, tales como el programa de alineación BLAST, el cual también se puede utilizar con parámetros preestablecidos . Por ejemplo, se pueden utilizar BLASTN y BLASTP con los siguientes parámetros preestablecidos: código genético estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; -matriz = BLOSUM62 ; descripciones = 50 secuencias; clasificado por = CALIFICACIÓN ALTA; bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones CDS GenBank + Swiss protein + Spupdate + PI . Los detalles de estos programas se pueden encontrar en las siguientes direcciones de internet : http: //www. ncbi .nlm.gov/cgi-bin/BLAST. Una persona con habilidad en la técnica puede -determinar -—fácilmente. 1os.__parámetros __de investigación adecuados para uso para una" secuencia dada-—en los - programas anteriores. Por ejemplo, los parámetros de búsqueda pueden variar en base en el tamaño de la secuencia en cuestión. Así, por ejemplo, una modalidad representativa de la presente invención puede incluir un polinucleótido aislado o un polipéptido que tenga X nucleótidos contiguos o aminoácidos, en donde (i) son los nucleótidos contiguos X o los aminoácidos que tienen por lo menos aproximadamente 50% de identidad con los nucleótidos contiguos Y o los aminoácidos derivados de cualquiera de las secuencias descritas en la presente, (ii) X es igual a Y, y (iii) X es mayor que o igual a 6 nucleótidos y hasta 5000 nucleótidos o 3 aminoácidos a 500 aminoácidos, de manera preferible mayor que o igual a 5 8 nucleótidos y hasta 5000 nucleótidos o 15 aminoácidos a 500 aminoácidos, de manera más preferible 10 a 12 nucleótidos y hasta 5000 nucleótidos o 20 aminoácidos a 500 aminoácidos, incluyendo todos los valores enteros -que se encuentran dentro de los intervalos descritos en lo anterior. 0 Los programas de computadora también están disponibles para determinar la probabilidad de que ciertos polipéptidos formen estructuras tales como láminas ß. Uno de tales programas, que se describe en la presente, es el programa "ALB" para proteínas y cálculo de estructura 5 secundaria polipeptídica y predicción. Además, se puede estructura cristalina proteínica y la alineación con la secuencia proteínica relacionada con la estructura cristalina 0 (por ejemplo, utilizando los programas de ambiente de operación molecular (MOE, por sus siglas en inglés) disponibles de Chemical Cotnputing Group Inc., Montreal , P.Q., Ca adá) . Otros métodos para predecir estructuras secundarias se describen por ejemplo, en Garnier et al. (1996) Methods 5 Enzymol . 266:540-553; Geourj on et al. (1995) Comput. Applic .

Biosci. 11:681-684; Levin (1997) Protein Eng. 10:771-776; y Rost et al . (1993) J. Molec. Biol. 232:548-599. La homología también se puede determinar por hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que formen cadenas dobles estables entre regiones homologas, seguido por digestión con una o varias nucleases específicas de cadena única y determinación de tamaño de los fragmentos digeridos . Dos ADN o dos secuencias polipeptídicas son " sustancialmente homologas " entre sí cuando las secuencias muestran por lo menos aproximadamente 80% a 85%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 90% y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 95% a 98% de identidad de secuencia con respecto a una longitud definida de las moléculas, determinada utilizando los métodos anteriores. Como se utiliza en la presente, sustancialmente homólogo completa con el ADN o la " secuencia " pólipeptídica especificadas. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homologas se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas como se define para el sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas se encuentra dentro de la habilidad de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" paira una proteína seleccionada es una secuencia de ácido nucleico que es transcrita (en el caso de ADN) y traducida (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vi tro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por el codón de inicio en la parte 5' (amino) terminal y el codón de detención de traducción en la parte 31 (carboxi) terminal. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a ADNc de las secuencias nucleotídicas virales así como secuencias de ADN sintéticas y semisintéticas y secuencias que incluyen análogos de bases. Una secuencia de terminación de transmisión puede localizarse 3' respecto a la secuencia codificante. El término "elementos de control" se refiere colectivamente a secuencias promotoras, sitios de unión de ri-bosoma,~ **~séñal'es " de ' poliadenilación, secuencias de , terminación de transcripción, dominios reguladores hacia el extremo 5', mejoradores y similares, los cuales colectivamente se proporcionan para la transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula hospedadora . No todos estos elementos de control necesitan siempre estar presentes en la medida en que el gen deseado sea capaz de ser transcrito y traducido. Un elemento de control "dirige la transcripción"- de una secuencia codificante en una célula cuando la ARN no humanos, tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado, borregos, cerdos, chivos y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas y cobayos; aves que incluyen aves domésticas, silvestres y de caza, tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y similares. El término no indica una edad particular. Por lo tanto, se pretende que estén abarcados tanto individuos adultos como recién nacidos. Como se utiliza en la presente, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un individuo, que incluye, pero que no se limita, por ejemplo, a sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, líquido biliar, líquido espinal, fluido linfático, muestras de la piel, secreciones externas de la •:piel—-^--tracto:-=-r^s i a orÍO7-^ muestras derivadas del epitelio gástrico y mucosa gástrica, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsis y también muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro que incluyen, pero que no se limitan a medios acondicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, por ejemplo células recombinantes y componentes celulares. Los términos "etiqueta" y "etiqueta detectable", se refieren a una molécula capaz de detección que incluye, pero que no se limita a isótopos radioactivos, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes , enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, cromóforos, colorantes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo biotina o haptenos) y similares. El término "sustancia fluorescente" se refiere a una sustancia o a una porción de la misma que es capaz de mostrar fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos' particulares de etiquetas que se pueden utilizar con la invención incluyen, pero no se limitan a fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo de Texas, luminol, ésteres de acradimom, NADPH, ß-galactosidasa, peróxidasa de rábano, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina y ureasa. Genera1idades La presente invención se relaciona con un —polipéptido' ^híbrido-'' EnvrCD4~~^~"^omple"j ?e ^ de" Eñv-CD4 (y polinucleótidos que codifican para los híbrido o complejos) así como el uso de estas moléculas. Sin desear unirse a teoría particular alguna, parece que ha sido difícil generar respuestas inmunologicas contra Env debido a que el sitio de unión de CD4 (o el sitio de unión de CCR o ambos) está enterrado entre el dominio exterior, el dominio interior y los dominios VI/V2 de Env. Por lo tanto, aunque la supresión del dominio V1/V2 puede volver al virus más susceptible a neutralización por anticuerpos monoclonales dirigidos al sitio CD , la conformación de Env antes de la unión de CD4 puede evitar una respuesta de anticuerpos. Por lo tanto, la presente invención proporciona polipéptidos para Env que formen complejos con las proteínas CD4 (por ejemplo minipr.oteínas solubles o CD) , o polipéptidos híbridos Env CD4. La unión de CD4 a Env en estas moléculas causa un cambio conformacional en Env que expone uno o más epítopos (por ejemplo epítopos crípticos) en o cerca del sitio de unión de CD4 , lo que a su vez permite la generación de una respuesta inmunológica (por ejemplo, una respuesta de anticuerpo neutralizante) a Env. Se pueden combinar diversas formas de las diferentes modalidades de la invención, descritas en la presente . Polipéptidos Env envoltura, preferiblemente de Env de VIH. Como se indica en lo anterior, la proteína de envoltura de VIH-1 es una glucoproteína de aproximadamente 160 kd (gpl60) . Durante la infección por el virus de la célula huésped, se separa gpl60 por proteasas de la célula huésped para formar gpl20 y la proteína de membrana integral, gp41. La porción gp41 se ancla (y abarca) la bicapa de membrana de virión, mientras que el segmento gp!20 sobresale dentro del ambiente circundante.

Dado que no existe unión covalente entre gpl20 y gp41, gpl20 libre es liberado de la superficie de los viriones y las células infectadas. Los polipéptidos Env también pueden incluir polipéptidos gpl40. En algunas modalidades , el componente polipeptídico de Env del complejo es un monómero o un dímero. En modalidades preferidas, el componente polipeptídico de Env es un polipéptido de Env oligomérico. La secuencia primaria del precursor polipeptídico de Env de la cepa VIH-1SF2 (a continuación "SF2") se muestra en la figura 1. La secuencia de aminoácidos gpl20 (que incluye a la secuencia líder) se extiende desde los aminoácidos 1-509 de la figura 1). El polipéptido contiene aproximadamente 24 sitios de glucosilación unidos a N que son comunes a la mayor parte, si no a todas las secuencias gpl20. Como lo sugiere su nombre, ~ --los :-dominÍOS~hipérvarial51"es contienen* "sustituciones extensas de aminoácidos, inserciones y supresiones entre cepas (véase también la figura 7) . Pese a esta variación, la mayor parte, si no todas las secuencias polipeptídicas Env conservan la capacidad del virus para unirse al receptor viral CD4. Además, la alineación de las secuencias de aminoácidos del polipéptido Env de cualquier variante de VIH se pueden determinar en relación a las otras variantes tales como HXB- 2, como se describe, por ejemplo, en WO 00/39303. En otras modalidades, el polipéptido Env comprende una forma oligomérica de Env, por ejemplo, gpl40 oligomérico (o-gpl40) . El componente polipept dico de Env del complejo Env CD4 se puede derivar de cualquier aislado de VIH conocido, así como aislados recién identificados y subtipos de estos aislados. Las descripciones de las características estructurales se pueden proporcionar en la presente con referencia a SF2 o HXB-2. Una persona habitualmente experta en la técnica en vista de las enseñanzas de la presente descripción y la técnica puede determinar regiones correspondientes en otras variantes de VIH (por ejemplo aislados de VIHIIIBÍ VIH-1SFI62/ VIHSF170, VIH^y, VIH^, VIH™, VIH-1CM235 , / VIH-lus4/ otras cepas de VIH-1 de subtipos diversos (por ejemplo subtipos A a G y O) , cepas de VIH-2 y subtipos diversos (por ejemplo VIH-2uci y VIH-2uc2) , Y virus de inmunodeficiencia en simio (SIV, por sus siglas en inglés) . —(-Véase¦;- -por-*éj émp?? ~ Virology,' * 3a "Edición (W.K. Joklik ed. 1988) ; Fundamental Virology, 2a. Edición (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds . 1991); Virology 3a. Edición (Fields, BN, DM Knipe, P Howley, Editores, 1996, Lippincott -Raven, Philadelphia, PA; para una descripción de este y de otros virus relacionados) , utilizando, por ejemplo, los programas de comparación de secuencia (por ejemplo BLAST y otros descritos en la presente) o identificación y alineación de características estructurales (por ejemplo un programa tal como el programa "ALB" descrito en la presente que puede identificar regiones de lámina ß) . Las secuencias reales de aminoácidos de los polipéptidos Env modificados se pueden basar en cualquier variante de VIH. Los polipéptidos Env descritos en la presente 5 pueden incluir modificaciones adicionales a la secuencia nativa, tales como supresiones, adiciones y sustituciones internas adicionales. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo a través de mutagénesis dirigida al sitio o pueden ser accidentales, tales como sucesos de 10 mutaciones que se presentan de manera natural. Así, por ejemplo, si el polipeptido de Env se va a utilizar en composiciones de vacuna, las modificaciones deben ser tales que no se pierda la actividad inmunológica (es decir, la capacidad para inducir una respuesta de anticuerpo al 15 polipéptido) . De manera similar, si los polipéptidos van a ;utid-d:zados"para"""própósritos'" dé" diagnostico, debe retenerse tal capacidad. Los polipéptidos Env descritos en la presente pueden ser monoméricos u oligoméricos . Miniproteínas CD4 20 En la práctica de la presente invención, los polipéptidos Env forman complejos con proteínas CD con el fin de cambiar la conformación del polipéptido Env y exponer los epítopos que inducen anticuerpos neutralizantes. La secuencia de aminoácido de CD4 se conoce y los 25 estudios estructurales sobre CD4 han demostrado que esta molécula está constituida de cuatro dominios similares a inmunoglobulina extracelular (tres contienen asas enlazadas a disulfuro) . También se sabe que la unión de gpl20 a su receptor (CD4) induce cambios de conformación en la proteína 5 Env. No obstante, solo el dominio 1 (DI) de CD4 es crítico para su interacción con gpl20 (Arthos et al. (1989) Cell 57 (3) :469-81; Truneh et al. (1991) J". Biol Che 266(9) :5942- 8) . El análisis mutacional, los experimentos de competencia de anticuerpos combinados con el conocimiento de la 10 estructura tridimensional de CD4 han demostrado que una región homologa a la región 2 de determinación de complementariedad (CDR2 por sus siglas en inglés) de inmunoglobulina en DI juega un papel principal en la unión de gpl20 (Ryu et al. (1994) Structure 2(l):59-74, Sullivan et 15 al. (1998) J Virol 72 (8) : 6332-8) . En realidad, la resolución (Choe & Sodroski (1992) J Acquir Imune Defic Syndr 5(2) :204- 10, Gizachew et al. (1998) Biochemistry 37 (30) : 10616-25) . En 20 el complejo de CD4 , la cadena lateral Phe-43 tapa la entrada de una cavidad profunda en gpl20 y CD4 Arg59, justo detrás de Phe43, está involucrado en una unión H doble con Asp-368 en gpl20. El análisis de la estructura cristalográfica de 25 gpl20 en complejo con CD4 y la porción de Fab del anticuerpo monoclonal neutralizante 17b (Kwong et al . (1998) Nature 393:648-659), indica que una superficie grande (742 Á2) del dominio DI de CD4 se une a una depresión grande (800 Á2) en gpl20. El límite de CD4 está constituido por 22 residuos, que contribuyen a la unión de gpl20 con las interacciones de unión de H electrostáticas, hidrofóbicas mezcladas. El tamaño grande y la complejidad de esta interconexión vuelve la reproducción de tal epitopo funcional en una molécula pequeña un reto y explica la dificultad en el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción gpl20- CD4. Vita et al. (1998) Biopoly ers 47-93-100. No obstante, pese a la gran cantidad de residuos presentes en la superficie de interacción gpl20-CD4, los estudios en sistemas de hormona-receptor muestran que únicamente algunos residuos pueden dominar la energía de unión en el límite proteína- neutralizantes únicos también parecen estar expuestos, por ejemplo, el epitopo reconocido por el anticuerpo monoclonal CG10 (Gershoni et al. (1993) Faseb J 7 (12) : 1185-7) . En realidad, aunque la proteína gpl20 monomérica de las cepas lab es poco inmunogénica con respecto a inducir anticuerpos neutralizantes aislados primarios (Mascóla et al. (1996) J. Infect. Dis. 173:340-348), los anticuerpos monoclonales que parecen reconocer ciertos epítopos que están expuestos sobre la superficie Env una vez que se une a su receptor CD4 se ha demostrado que neutralizan diversos aislados primarios. Véase, por ejemplo, el anticuerpo designado 17b (Thali et al. (1993) J Virol 67 (7) : 3978-88) . Sin embargo, las respuestas del anticuerpo neutralizante es lado primario del revestimiento cruzado utilizando receptor/correceptor que forma complejo con Env se ha atribuido a la inmunogenicidad del dominio de fusión gp4l. Lacasse et al (1999) Science 283 :357-362. Adicionalmente , los intentos por evaluar los complejos gpl20-CD4 como candidato de vacuna potencial para inducir una elevada avidez y el aislamiento primario de los anticuerpos neutralizantes se ha impedido por la preocupación de que se pueda generar una respuesta inmunologica contra CD4 mismo, por lo que se generen problemas de autoinmunidad y ^seguridad~(3l,:Souza~~et~ lT ( X9§ñ)"j'lnféct~DS~~ ~f75 : 1056-62, "DeVico et al. (1995) Virology 211 (2) : 583 -8) . Dado que la estructura de CD4 se ha resuelto, se han hecho intentos por varios grupos de investigadores para identificar un mínimo del dominio de unión de gpl20 de CD4 que pueda retener la actividad de unión a gpl20 (118) . Por lo tanto, la presente invención hace uso de proteínas CD4 de longitud menor a la completa, o imitadores de CD4 que formen complejos con una proteína Env. Preferiblemente, las miniproteínas CD que forman complejo con Env comprenden secuencias que se derivan o que imitan funcionalmente al dominio DI de CD4. En las modalidades preferidas, las miniproteínas CD4 se derivan o muestran similitud estructural con el asa similar a CDR2 de CD4. Los ejemplos no limitantes de miniproteínas CD4 incluyen las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NO : 1 a 4 (Ejemplo 4). La similitud estructural se puede determinar como se describe en la presente. (Vita et al. (1999) Proc Nati Acad Sci EUA 96 (23) : 13091-6 y Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21:71-76) describen un ejemplo no limitante adicional de un polipéptido que tiene una secuencia o que tiene homología estructural con el asa similar a CDR2 de CD4 en su scialotoxina de toxina de escorpión (únicamente 31 residuos) que contiene un solvente expuesto a una horquilla ß. Cuando sus átomos de la estructura - rincipál"s'e"superponen"e'n él" asa similar a CDR2 de CD4 (secuencia 36-47) , se encuentra una desviación en la RMS de solo 1.1 Á. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente las secuencias de aminoácidos que muestran similitud estructural o de aminoácidos con el dominio DI de CD4 en vista de las enseñanzas de la presente. Además, cualquiera de estos homólogos (estructural o de secuencia) se puede modificar adicionalmente . Tales modificaciones pueden afectar l estructura o función. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones, adicionaes o supresiones de aminoácidos para las miniproteínas de manera que se conserve o mejore la estructura de unión a gpl20. También se pueden realizar modificaciones adicionales, por ejemplo para destruir funciones no deseadas. Por ejemplo, como se describe en Vita et al (1999) Proc Nati Acad Sci EUA 96 (23 ): 13091-6 y Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21:71-76, se genera un mimético a partir de scialotoxina de escorpión que conserva los residuos Cys estructuralmente importantes del andamio y adicionalmente , incluye las partes expuestas a solvente Gly38, Gln40 a Phe 43, Thr45 y Gly47 de CD4 en regiones estructuralmente equivalentes de la horquilla ß de scialotoxina. Para incrementar adicionalmente la imitación estructural con CD , se incluyen Arg y Lys en las posiciones 7 y 18, -topológicamenter -equivalentes' "arelas posiciones funcionales Arg59 y Lys35 de CD4 , respectivamente. Para destruir la función de unión de canal de K+ original de scialotoxina, se muta Arg6 y Argl3 en Ala y Lys, respectivamente. Finalmente, se suprimen dos residuos en las partes N y C terminales (Vita et al. (1999) Proc Nati Acad Sci EUA 96 (23 ): 13091 -6 ; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21:71-76). Cualquiera de las miniproteínas CD4 utilizada en la práctica de la invención se puede sintetizar químicamente. Preferiblemente, la síntesis se lleva a cabo bajo condiciones que permiten y que promueven la naturalización (plegado o doblado) eficiente de la miniproteína en una conformación que une gpl20 y que expone los epítopos en o cerca del sitio de unión CD4. Por ejemplo, la miniproteína se puede sintetizar 5 bajo condiciones que producen un espectro de dicroismo circular similar al de scialotoxina, pese a las mutaciones en la secuencia nativa. Proteínas híbridas Env-CD4 En algunos aspectos, las moléculas Env-CD4 son 10 proteínas híbridas. En una modalidad, los híbridos tienen por lo menos una proteína CD4 (por ejemplo una miniproteína CD4) insertada en una secuencia Env. En otras modalidades, una o varias secuencias CD4 presiden o siguen al polipéptido Env (por ejemplo en la parte N o C terminal del polipéptido Env) . 15 Además, cualquiera de los híbridos puede incluir uno o más - —^ --enlazantes ~de~ "longitud""variab"le~ (pbr"~ej emplo 3-30 aminoácidos de longitud o cualquier cantidad entera entre estas) . En algunas modalidades, los híbridos Env-CD4 son proteínas de fusión codificadas por una o más secuencias 20 polinucleotídicas . Las secuencias CD4 adecuadas para uso en híbridos Env-CD4 se describen en lo anterior. Como se ha indicado en lo anterior, las miniproteínas CD4 forman complejos con Env que comprenden secuencias que preferiblemente se derivan a 25 partir, o que imitan funcionalmente el dominio DI de CD4. En las modalidades preferidas, la miniproteína CD4 se deriva y muestra similitud estructural con el asa similar a CDR2 de CD4. Los ejemplos no limitantes de miniproteínas CD4 incluyen la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN N0:1 a 4 (Ejemplo 4) o los miméticos de CD4 (tales como aquellos descritos en Vita et al. (1999) Proc Nati Acad Sci EUA 96 (23) : 13091-6 y Martin et al. (2003) ÍVat. Biotech. 21:71-76) . La minoproteína CD4 puede tener cualquier longitud, por ejemplo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 200 aminoácidos de longitud (o cualquier cantidad entera entre las mismas) , de manera preferible entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 aminoácidos de longitud y de manera más preferible entre aproximadamente 25 y aproximadamente 85 aminoácidos de longitud (o cualquier valor entero entre las mismas) . Una persona experta en la técnica podrá determinar =con rfaci-l-idad "l"as~seeuerici¾s ' de ~ aminoacido~s que muestran similitud estructural o de aminoácidos con el dominio DI de CD4 (o con la SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NO : 1 a 4) en vista de las enseñanzas en la presente. Además, cualquiera de estos homólogos (estructurales o de secuencia) se puede modificar adicionalmente . Típicamente, el polipéptido CD4 se inserta dentro de un polipéptido Env descrito en la presente/ por ejemplo, gpl20, gpl40, o-gpl40, gpl60 o fragmentos de los mismos. Además, la secuencia Env puede contener modificaciones, por ejemplo supresiones, cortes o sustituciones. En algunas modalidades, una o más de las regiones variables (VI a V5) se suprimen o se cortan. Por ejemplo, la secuencia CD4 se puede insertar dentro de una de estas regiones variables. Es preferible, aunque no se requiere, que la secuencia CD4 sea una secuencia contigua única. En algunas modalidades, las regiones variables suprimidas se sustituyen con secuencias polipeptídicas más cortas (por ejemplo de 3 a 20 aminoácidos de secuencia o cualquier cantidad entera entre las mismas) , dado que estos polipéptidos más cortos pueden mantener la conformación total de la proteína Env o proporcionar la flexibilidad necesaria para permitir la unión de la proteína CD4 a Env (Ejemplo 4) . Como será evidente fácilmente, uno o más de los elementos de los híbridos Env CD4 pueden contener -modif-ieaciones:~~-adicionál^^ "modificaciones pueden, alterar la estructura o función. Por ejemplo, las sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos se pueden realizar para las miniproteínas de manera que se conserve o mejore la estructura de unión a gpl20. Cualquiera de las proteínas híbridas Env CD4 útil en la práctica de la invención se pueden sintetizar químicamente. Preferiblemente, la síntesis se lleva a cabo bajo condiciones que permiten y promueven la naturalización eficaz de la miniproteína en una conformación que une gpl20 y expone los epítopos dentro o cerca del sitio de unión de CD4. Además, como se describe con detalle en lo siguiente, las proteínas híbridas Env-CD4 se pueden producir de manera recombinante . Producción polipeptídica Las miniproteínas CD , los polipéptidos Env y los polipéptidos híbridos Env-CD4 de la presente invención se pueden producir en cualquiera de muchas maneras diferentes, la totalidad de las cuales son bien conocidas en la técnica. En una modalidad, los polipéptidos se generan utilizando técnicas recombinantes bien conocidas en el arte. A este respecto, se pueden diseñar sondas oligonucleotídicas en base en las secuencias conocidas del genoma polipeptídico de Env (por ejemplo gpl20) y se pueden utilizar para sondear bibliotecas genómicas o de ADNc por genes Env. El gen después 'y, por ejemplo, enzimas de restricción utilizadas para cortar el gen en porciones deseadas de la secuencia de longitud completa. De manera similar, uno o varios genes Env se pueden aislar directamente de células y tejidos que contengan los mismos, utilizando técnicas conocidas tales como extracción con fenol y la secuencia manipulada adicionalmente para producir los cortes deseados. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, para una descripción de las técnicas utilizadas para obtener un aislado de ADN.

Los genes que codifican para los polipéptido Env o CD4 modificados o híbridos (por ejemplo cortados o sustituidos) se pueden producir de manera sintética, en base en las secuencias conocidas. La secuencia nucleotídica se puede diseñar con los codones apropiados para la secuencia particular de aminoácidos que se desee. La secuencia completa generalmente se ensambla de la superposición de oligonucleótidos preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292 : 756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol . Chem. 259:6311; Stemmer et al. (1995) Gene 164:49-53. Las técnicas recombinantes se utilizan fácilmente para clonar un gen que codifica para un gen para el polipéptido de Env que después puede ser mutagenizado in 'ñoño' o Varios"" pares de bases apropiados lo que resulta en el codón para el aminoácido deseado. Tal cambio puede incluir algo tan pequeño como un par de bases, llevar a cabo el cambio en un aminoácido único o puede abarcar varios cambios en pares de bases . Alternativamente, las mutaciones se pueden llevar a cabo utilizando un cebador mal pareado que hibridice con la secuencia nucleotídica original (generalmente ADNc que corresponde a la secuencia de ARN) , a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión del dúplex mal pareado. El cebador puede volverse específico al mantener la longitud del cebador y la composición de la base dentro de límites relativamente estrechos y al mantener la base mutante localizada centralmente. Véase, por ejemplo Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller y Smith, Methods Enzymol. (1983) ¿00:468. La extensión de cebador se lleva a cabo utilizando ADN polimerasa, el producto clonado y los clones que contienen el ADN mutado, derivado ' por segregación de la cadena extendida de cebador seleccionada. La selección se puede llevar a cabo utilizando el cebador mutante como una sonda de hibridación. La técnica también es aplicable para generar mutaciones en puntos múltiples. Véase, por ejemplo, Dalbie-McFarland et al. Proc Nati Acad Sci EUA (1982) 79:6409. Una vez que se han aislado o sintetizado las CD4 , se pueden clonar en vectores adecuados de replicón para expresión. Como será evidente de las enseñanzas en la presente, una amplia variedad de vectores que codifican para polipéptidos modificados se pueden generar al crear constructos de expresión los cuales unen operablemente, en diversas combinaciones, polinucleótidos que codifican para los polipéptidos Env o CD4 que tengan supresiones o mutaciones en los mismos. De esta manera, los polinucleótidos que codifican para Env particular que tiene regiones modificadas (por ejemplo suprimidas o sustituidas) o variables (por ejemplo V1/V2) se pueden unir operablemente con polinucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen supresiones o sustituciones en la región del asa pequeña y el constructo introducido en una célula hospedadora para la expresión polipeptídica . Los ejemplos no limitantes de tales combinaciones se discuten en los ejemplos. Se conocen por los expertos en la técnica numerosos vectores de clonación, y la selección del vector de clonación apropiado es cuestión de selección. Los ejemplos de vectores de ADN recombinantes para clonación y las células huéspedes los cuales los pueden transformar incluyen al bacteriófago ? (E. coli) , pBR322 (E. coli) , pACYC177 (E. coli) , pKT230 (bacterias gramnegativas) , pGV1106 (bacterias gramnegativas) , pLAFRl (bacterias gramnegativas) , pME290 (bacterias pUC6 (Streptomyces) , YIp5 {Saccharomyces) , YCpl9 {Saccharomyces) y virus de papiloma bovino (células de mamífero) . Véase de manera general DNA Cloning: Vols. I y II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal, supra. Los sistemas de expresión en células de insecto, tales como los sistemas de baculovirus también se pueden utilizar y se conocen por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo en Summers y Srrdth, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están disponibles comercialmente en forma de equipo, por ejemplo de Invitrogen, San Diego CA (equipo "MaxBac") . Los sistemas de expresión de plantas también se pueden utilizar para producir las proteínas Env modificadas. De manera general, tales sistemas utilizan vectores basados en virus para transfectar células vegetales con genes heterólogos. Para una descripción de tales sistemas véase, por ejemplo, Porta et al., Mol . Biotech. (1996) 5:209-221; y Hackland et al., Arch. Virol. (1994) 139:1-22. Los sistemas virales tales como sistema de infección/transfección basado en vaccinia, como se. describe en Tomei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026 y Selby et uso con la presente invención. En este sistema, las células primero se transfectan in vi tro con un virus de vaccinia recombinante que codifica para la ARN polimerasa bacteriófago T7. Esta polimerasa muestra especificidad refinada en la medida en que únicamente transcribe plantillas que presenten los promotores T7. Después de la infección, las células se transfectan con el ADN de interés, impulsado por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma de virus de vaccinia recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que después se traduce en proteína por la maquinaria traduccional del huésped. El método proporciona la producción citoplasmática transitoria de alto nivel de grandes cantidades de ARN y uno o varios productos de traducción. El gen se puede colocar bajo el control de un promotor, un sitio de unión de ribosoma (para la expresión bacteriana) y opcionalmente un operador (denominado colectivamente en la presente como elementos de "control"), de manera que la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido deseado se transcribe en ARN en la célula huésped transformado por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede o no contener un péptido señal o una secuencia líder. Con la presente invención, tanto los péptidos señal que se presentan de manera natural como las secuencias heterólogas se pueden huésped en el procesamiento postraduccional . Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397. Tales secuencias se incluyen, pero no se limitan al líder TPA, así como a la secuencia de señal de melitina de miel de abeja. Otras secuencias reguladoras también pueden ser deseables las cuales permiten la regulación de expresión de las secuencias proteínicas en relación al crecimiento de la célula huésped. Tales secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la técnica y los ejemplos incluyen aquellas las cuales provocan la expresión de un gen el cual se activa o inactiva en respuesta a un estímulo quimérico o físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo, secuencias mejoradoras. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden ligar a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector. De manera alternativa, la secuencia codificante se puede clonar directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado. En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia codificante de manera que se pueda unir a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, ;para_mantener.--el.-Tnarco' de"lre15tlIra~~apropi"ado . Los imitantes . o análogos se pueden preparar por supresión de una porción de la secuencia que codifica para la proteína, por inserción de una secuencia o por sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar secuencias nucleotídicas tales como mutagénesis dirigida al sitio, son bien conocidas por los expertos en la técnica, véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization supra. El vector de expresión después se utiliza para transformar una célula huésped apropiada. Se conocen en la técnica muchas líneas de células de mamífero que incluyen las líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , tales como, pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) , células HeLa, células de riñon de hámster ;bebé (BHK, por sus siglas en inglés) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2), células Vero293, así como otras. De manera similar, los huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp. , encontrará uso en los constructos de expresión actuales . Los hospedadores de levaduras útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, por ejemplo Aedes aegypti, Autographa californica, Bo byx mori , Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni. Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, las proteínas de la presente invención se producen al hacer crecer células huéspedes transformadas por un vector de expresión descrito en lo anterior bajo condiciones ' mediante las cuales se expresa la proteína de interés. La selección de las condiciones de- crecimiento apropiadas está dentro de la habilidad de la técnica. En una modalidad, las células transformadas secretan el producto polipeptídico al medio circundante. Se pueden incluir ciertas secuencias reguladoras en el vector .para mejorar la secreción del producto proteínico, por ejemplo utilizando una secuencia líder de activador de plasminógeno tisular (TPA, por sus siglas en inglés) , una secuencia de señal de interferón (? o a) u otras secuencias peptídicas de señal a partir de proteínas secretoras conocidas. El producto polipeptídico secretado puede ser aislado por diversas técnicas descritas en la presente, por ejemplo, utilizando técnicas de purificación estándar tales como, pero sin limitarse a resinas de hidroxiapatita, "iónico, cromatografía por exclusión de tamaño, electroforesis , CLAR, técnicas inmunoadorbentes , cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y similares. De manera alternativa, las células transformadas se rompen utilizando medios químicos, físicos o mecánicos lo que lisa las células pero aún mantiene a los polipéptidos Env sustancialmente intactos. Las proteínas intracelulares también pueden estar contenidas o pueden separar componentes de la pared celular o de la membrana, por ejemplo mediante el uso de detergentes o solventes orgánicos, tales como la fuga de los polipéptidos Env que se produce. Tales métodos son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Protein Purification Applications : A Practical Approach, (E.L.V. Harris y S. Angal , Eds . , 1990). Por ejemplo, los métodos para romper células para ,uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a: sonicación o ultrasonicación; agitación; extrusión de líquidos o sólidos, tratamiento por calor; congelamiento- recalentamiento; desecación; descompresión explosiva; choque osmótico; tratamiento con enzimas líquidas que incluyen proteasas tales como tripsina, neuraminidasa y lisozima tratamiento con sustancias alcalinas y el uso de detergentes y solventes tales como sales biliares, dodecilsulfato de sodio, Tritón', NP40 y CHAPS . La técnica particular utilizada "selección y dependerá del tipo de célula en la cual se exprese el polipéptido, las condiciones de cultivo y cualquier tratamiento previo utilizado. Después de la ruptura de las células, se separan los residuos celulares, generalmente por centrifugación y los polipéptidos Env producidos intracelularmente se purifican adicionalmente utilizando técnicas de purificación estándar tales como, pero sin limitarse a cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por exclusión de tamaño, electroforésis, CLAR, técnicas inmunoadorbentes , cromatografía de afinidad, inmunoprecipitacion y similares. Por ejemplo, un método para obtener los polipéptidos Env intracelulares de la presente invención involucra purificación por afinidad, tal como cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos contra Env o por cromatografía de afinidad con lectina. Las resinas de lectina preferidas particularmente son aquellas que reconocen porciones mañosa tales como, pero sin limitarse a resinas derivadas de aglutinina de Galanthus nivalis (GNA, por sus siglas en inglés) , aglutinina de Lens culinaris (LCA por sus siglas en inglés o lectina de lentil) , aglutinina de Pisum sativum (PSA por sus siglas en inglés o lectina de chícharo) , aglutinina de Narcissus pseudonarcissus (NPA) y resina de afinidad adecuada está dentro de la habilidad en la técnica. Después de purificación por afinidad, los polipéptidos pueden ser purificados adicionalmente utilizando técnicas convencionales bien conocidas en el arte, por ejemplo mediante cualquiera de las técnicas descritas en lo anterior . Se pueden sintetizar convenientemente polipéptidos relativamente pequeños, es decir, de hasta aproximadamente 50-100 aminoácidos de longitud químicamente, por ejemplo, por cualquiera de diversas técnicas que se conocen por los expertos en la técnica de los péptidos. En general, estos métodos utilizan la adición secuencial de uno o más aminoácidos a una cadena peptídica en crecimiento. 5 Normalmente, ya sea el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido está protegido por un grupo protector adecuado. El aminoácido producido o derivatizado puede ser unido a un soporte de sólido inerte o se puede utilizar en solución al agregar a el siguiente aminoácido en la secuencia que tenga 10 el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido adecuadamente, bajo condiciones que permiten la formación de un enlace amida. El grupo protector después se separa del residuo aminoácido recién agregado y después se agrega el siguiente aminoácido (protegido adecuadamente) y así 15 sucesivamente. Después de que los aminoácidos deseados se han _____ unido- en- la--secuencia~-apropÍadá-,~ "sé~pueden "separar de manera secuencial o concurrente cualquier grupo protector remanente (y cualquier soporte sólido, si se utilizan técnicas de síntesis en fase sólida) para obtener el polipéptido final. 20 Por modificación simple de este procedimiento general, es posible agregar más de un aminoácido a la vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo por acoplamiento (bajo condiciones las cuales no racemicen centros quirales) a un tripéptido protegido con un dipéptido protegido adecuadamente para 5 formar, después de la desprotección, un pentapéptido . Véase, por ejemplo, J.M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol . 2, (Academic Press, New York, 1980), pp . 3-254, para técnicas de síntesis peptídica en fase sólida; y M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Berlín 1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds . , The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, para síntesis básica en solución. Los grupos protectores típicos incluyen terbutoxicarbonilo (Boc) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , benciloxicarbonilo (Cbz) ; paratoluensulfonilo (Tx) ; 2,4-dinitrofenilo; bencilo (Bzl) ; bifenilisopropiloxicarboxi -carbonilo, teramiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, o-bromobenciloxicarbonilo, ciclohexilo, isopropilo, acetilo, o-nitrofeni-l-sulfonrlc -y 'similares : Típicamente, los soportes sólidos son soportes poliméricos reticulados. Estos pueden incluir polímeros basados en estireno reticulados con divinilbenceno, por ejemplo copolímeros de divinilbenceno e hidroximetilestireno, copolímeros de divinilbenceno-clorometilestireno y copolímeros de divinilbenceno-benzhidrilaminopoliestireno . Los análogos polipeptídicos de la presente invención también pueden prepararse químicamente por otros métodos por ejemplo mediante el método de síntesis peptídica múltiple simultánea, véase, por ejemplo, Houghten Proc . Nati. Acad. Sci . USA (1985) 82:5131-5135; Patente de E.U.A. número 4,631,211. Complejos Env-CD4 Las proteínas Env y CD4 se pueden producir como proteínas híbridas (por ejemplo de fusión) como se describe en la presente. Además, las proteínas Env y CD4 se pueden producir por separado y pueden formar complejos entre si de diversas maneras. En algunas modalidades, las proteínas Env y CD4 forman complejos utilizando uno o más agentes de reticulación tales como formaldehído, glutaraldehído y similares. Una estrategia alternativa será enlazar la miniproteína CD4 con la envoltura mediante una unión covalente específica la cual no perturbará la superficie antigénica expuesta de la envoltura, pero aún así expondrá los epitopos conservados crípticos que normalmente no son ;accesibles7—=por'_ ejémplb~'dé~"lanera "que pueda montarse _ una . respuesta con anticuerpos. En modalidades adicionales, se utiliza un fijador tal como formalina para formar complejos de proteínas Env y CD4. Además, se pueden producir complejos adecuados mediante, por ejemplo, cotransfección de células huéspedes con constructos (plásmidos recombinantes) que codifican para las proteínas híbridas Env-CD4, Env (por ejemplo gpl20), miniproteínas CD4 u otros polipéptidos del complejo deseado. La cotransfección se puede llevar a cabo ya sea en posición trans o cis, es decir, mediante la utilización de vectores separados o mediante la utilización de un solo vector que presente tanto Env como las miniproteínas CD4. Si se realiza utilizando un vector único, ambos genes pueden ser activados por un solo grupo de elementos de control . Un grupo único de elementos de control preferiblemente se utiliza en el caso de constructos que codifican para las proteínas híbridas Env-CD4 (véase, por ejemplo, el ejemplo 4) . De manera alternativa, los genes que codifican para Env y para miniproteína CD4 pueden estar presentes en el vector en casetes de expresión individuales, impulsados por elementos de control individuales. Después de la expresión, las proteínas se pueden asociar de manera espontánea. De manera alternativa, los complejos se pueden formar al mezclar las proteínas individuales juntas, las cuales han sido producidas por separado , -- ya ~sea- en - forma"purificada o "semipurificada, o incluso al mezclar medios de cultivo en las cuales las células huéspedes expresan las proteínas que se han cultivado. Véase la publicación internacional número WO 96/04301, publicada el 15 de febrero de 1996 para una descripción de tales complejos. Anticuerpos Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, los cuales se dirigen contra los epitopos complejos de Env-miniproteína CD4 (y epitopos crípticos expuestos por unión de CD4 a Env) son particularmente útiles en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, por ejemplo aquellos anticuerpos los cuales son neutralizantes y son útiles en inmunoterapia pasiva. En particular, los anticuerpos monoclonales se pueden utilizar para generar anticuerpos contra idiotipo. Los anticuerpos contra idiotipo son inmunoglobulinas que presentan una "imagen integral" del antígeno del agente infeccioso contra el cual se desea protección. Las técnicas para generar anticuerpos contra idiotipo se conocen en el arte. Véase, por ejemplo, Grzych (1985), Nature 316:74; MacNamara et al. (1984), Science 226:1325, Uytdehaag et al (1985), J. Immunol . 134:1225. Estos anticuerpos contra idiotipo también pueden ser útiles para el tratamiento o diagnóstico de VIH. Un inmunoensayo para antígeno viral puede utilizar, por: ejemplo-, un epitopo viral, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epitopos de un polipéptido viral, anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epitopos de diferentes polipéptidos virales, anticuerpos policlonales dirigidos hacia el mismo antígeno viral, anticuerpos policlonales dirigidos hacia antígenos virales diferentes o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de inmunoensayo se pueden basar, por ejemplo, en la competencia, o reacción directa o ensayos de tipo de interposición. Los protocolos también pueden utilizar, por ejemplo, soportes sólidos o se pueden realizar por inmunoprecipitación . La mayor parte de los ensayos involucran el uso de anticuerpo o polipéptido etiquetado. Las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminis'centes , radioactivas o de colorante. Los ensayos que amplifican las señales desde la sonda también se conocen. Los ejemplos de los cuales son ensayos que utilizan biotina y avidina, e inmunoensayos etiquetados con enzima y mediados, tales como ensayos ELISA. Se puede utilizar un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) para medir ya sea las concentraciones de antígeno o de anticuerpo. Este método depende de la conjugación de una enzima ya sea a aun antígeno o un anticuerpo, y utiliza la actividad de enzima unida~-como -una-etiqueta "cüáñtfita iva . Para medir ,.el anticuerpo," el antígeno conocido está fijo a una fase sólida (por ejemplo microplaca o recipiente de plástico) , se incuba con las diluciones de suero de prueba, se lava, se incuba con anticuerpo contra inmunoglobulina etiquetado con una enzima y se lava nuevamente. Las enzimas adecuadas para etiquetado se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano. La actividad de enzima unida a la fase sólida se mide al agregar el sustrato específico y al determinar la formación de producto o la utilización de sustrato colorimétricamente .

La actividad de enzima unida es una función directa de la cantidad de anticuerpo unido. Para medir el antígeno, se fija un anticuerpo específico conocido a la fase sólida, el material de prueba que contiene el antígeno se agrega, después de incubación en fase sólida y se lava, y se agrega un segundo anticuerpo etiquetado con enzima. Después del lavado el sustrato se agrega y la actividad de enzima se calcula colorimétricamente y se relaciona con la concentración de antígeno. Se pueden producir anticuerpos policlonales al administrar la proteína de fusión a un mamífero, tal como ratón, conejo, chivo o caballo. El suero del animal inmunizado se recolecta y los anticuerpos se purifican del plasma, por ejemplo, por precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía, preferiblemente cromatografía— de _afinidad " Las "técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales se conocen en la técnica. También se pueden producir anticuerpos monoclonales dirigidos contra epitopos expuestos a CD4 o Env (por ejemplo epitopos crípticos) . Los linfocitos B normales de un mamífero tales como ratón inmunizados, por ejemplo, con un complejo Env-CD4 como se describe en la presente se puede fusionar, por ejemplo, con células de mieloma de ratón sensibles a HAT para producir hibridomas . Los anticuerpos productores de hibridoma específicos para epitopos expuestos cuando se unen miniproteínas CD4 a Env se pueden identificar utilizando RIA o ELISA y se pueden aislar por clonación en agar semisólido o por dilución limitante. Los clones que producen los anticuerpos específicos deseados se aislan por otra ronda de cribado. Los anticuerpos, monoclonales y policlonales los cuales se dirigen contra epitopos, son particularmente útiles para detectar la presencia de antígenos en una muestra, tal como una muestra de suero a partir de un humano infectado con VIH. Un inmunoensayo para un antígeno VIH pueden utilizar un anticuerpo o varios anticuerpos. Un inmunoensayo para un antígeno VIH puede utilizar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido hacia un epitopo VIH, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epitopos de un polipéptido Env o Env-CD4, anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epitopos de polipéptidos diferentes, anticuerpos -policlonales-- dirigidos ""háci"á~" el "~ mismo antígeno de VIH, anticuerpos policlonales dirigidos hacia antígenos VIH diferentes o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de inmunoensayo se pueden basar, por ejemplo, en la competencia, reacción directa o un ensayo del tipo de interposición utilizando, por ejemplo, anticuerpos etiquetados. Las etiquetas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes o radioactivas. Los anticuerpos policlonales o monoclonales pueden además ser utilizados para aislar Env o Env que forme complejo con CD4 por columnas de inmunoafinídad. Los anticuerpos se pueden fijar a un soporte sólido, por ejemplo por adsorción o por un enlace covalente de manera que en los anticuerpos retienen su actividad inmunoselectiva . Opcionalmente , se pueden incluir grupos separadores de manera que el sitio de unión a antígeno, el anticuerpo permanezca accesible. Los anticuerpos inmovilizados después se pueden utilizar para unir el objetivo a partir de una muestra biológica, tal como sangre o plasma. Las proteínas o complejos unidos se recuperan de la matriz de columna, por ejemplo, mediante un cambio en el pH. En aspectos adicionales, cualquiera de los anticuerpos generados como se describen en la presente (por ejemplo anticuerpos monoclonales) se pueden utilizar para identificar epitopos en Env que pueden estar involucrados en los-epitopos^de -neutralizacióñ~dé"virus " (por" ejemplo crípticos) . Por ejemplo, un epitopo reconocido por un anticuerpo generado como se describe en la presente se puede identificar y después se puede utilizar para generar anticuerpos adicionales (por ejemplo anticuerpos neutralizantes). Los métodos de identificación de epitopos reconocidos por los anticuerpos se conocen por los expertos en la técnica. Aplicaciones de diagnóstico, de vacuna y terapéuticas Los híbridos Env-CD4 o los complejos de la presente invención (o los polinucleótidos que codifican para las mismas) se pueden utilizar para muchos propósitos de diagnóstico y terapéuticos. Por ejemplo, las proteínas y los polinucleótidos o anticuerpos generados contra los mismos se pueden utilizar en una diversidad de ensayos, para determinar la presencia de anticuerpos reactivos o proteínas Env en una muestra biológica para ayudar en el diagnóstico de la infección por VIH o el estado de enfermedad, o como una medida de respuesta a la inmunización. Como se indica en lo anterior, la presencia de anticuerpos reactivos con los polipéptidos Env (por ejemplo gpl20) e inversamente, antígenos reactivos con anticuerpos generados para el mismo los cuales pueden ser detectados utilizando técnicas estándar electroforéticas y de inmunodiagnóstico que incluyen inmunoensayos tales como .competencia-,—-. -reacción'^ dirécta-"" " o ensayos de tipo de interposición. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a transferencia Western, pruebas de aglutinación; inmunoensayos marcados con enzima y mediados, tales como ELISA; ensayos de tipo de biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis ; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen etiquetas de revelado tales como etiquetas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o enzimáticas o moléculas de colorante, u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o los anticuerpos que reaccionan con el mismo. Los soportes sólidos se pueden utilizar en los ensayos tales como nitrocelulosa, en membrana o en forma de pozo de microtitulación cloruro de polivinilo, en hojas de pozos de microtitulación; látex de poliestireno, en esferas o placas de microtitulación; fluoruro de polivinilideno ; papel diazotado; membranas de nylon, esferas activadas y similares. Típicamente, el soporte sólido primero se hace reaccionar con la muestra biológica (o las proteínas gpl20) , se lava y después se aplican los anticuerpos (o una muestra sospechosa de contener anticuerpos) . Después del lavado para separar cualquier ligando no unido, se agrega una porción aglutinante secundaria bajo condiciones de unión adecuadas de manera tal que el aglutinante secundario es capaz de ^asociarse—selectivamente^ con"el " igando 'unido". La presencia del aglutinante secundario después se puede detectar utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Típicamente, el aglutinante secundario comprenderá un anticuerpo dirigido contra los ligandos de anticuerpo. Se conocen en la técnica muchas moléculas de anticuerpos contra inmunoglobulina (Ig) humana (por ejemplo anticuerpo de chivo contra Ig humana o anticuerpo de conejo contra Ig humana, disponibles comercialmente) . Las moléculas de Ig para uso en la presente preferiblemente serán de los tipos IgG o IgA, no obstante, en algunos casos también puede ser apropiada IgM. Las moléculas de Ig se pueden conjugar fácilmente hasta una etiqueta de enzima detectable, tal como peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, ß-galactosidasa, fosfatasa alcalina y ureasa, entre otras, utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Después se utiliza un sustrato de enzima apropiado para generar una señal detectable. De manera alternativa, se puede utilizar un ensayo de "interposición de dos anticuerpos" para detectar las proteínas de la presente invención. En esta técnica, el soporte sólido se hace reaccionar primero con uno o más de los anticuerpos dirigidos contra Env (por ejemplo gpl20) , se lavan y después se exponen a la muestra de prueba. Los anticuerpos nuevamente se agregan y la reacción se visualiza utilizando ya sea reacción de color directa o utilizando un segundo^.-_-;anti-cuerpo- etiquetado, tal como una antiinmunoglobulina etiquetada con peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o ureasa. Los ensayos también se pueden llevar a cabo en solución, de manera tal que las proteínas virales y los anticuerpos para las mismas formen complejos bajo condiciones de precipitación. Los complejos precipitados se pueden separar después de las muestras de prueba, por ejemplo por centrifugación. La mezcla de reacción se puede analizar para determinar la presencia o ausencia de complejos de anticuerpo y antígeno utilizando cualquiera de muchos métodos estándar, tales como los métodos inmunodiagnósticos descritos antes. Las moléculas Env-CD4 producidas como se describe en lo anterior o los anticuerpos para los complejos se pueden proporcionar en equipos, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios con el fin de llevar a cabo inmunoensayos como se describe en lo anterior. El equipo también puede contener, dependiendo del inmunoensayo particular utilizado, etiquetas adecuadas u otros reactivos y materiales empacados (por ejemplo amortiguadores de lavado y similares) . Los inmunoensayos estándar, tales como los descritos en lo anterior se pueden llevar a cabo utilizando estos equipos. Los complejos de Env-CD4 o los híbridos (y los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos constitutivos) también se pueden utilizar en composiciones de vacuna,.,...individualmente ~o'~eri'~cómb~inacio^ ejemplo en. vacunas profilácticas (es decir, para evitar la infección) o terapéuticas (para tratar VIH después de la infección) . Las vacunas pueden comprender mezclas de uno o más de los complejos o híbridos (o secuencias nucleotídicas que codifican para estas moléculas) , tales como las proteínas Env (por ejemplo gpl20) derivadas de más de un aislado viral. La vacuna también se puede administrar junto con otros antígenos y agentes inmunorreguladores por ejemplo inmunoglobulinas, citocinas, linfocinas y quimiocinas que incluyen, pero que no se limitan a IL-2, IL-2 modificada (cysl25-serl25) , G -CSF, IL-12, interferón a o ?, IP-10, MIP1 y RA TES . Las vacunas se pueden administrar como polipéptidos , o alternativamente, como vacunas de ácido nucleico desnudo (por ejemplo ADN) , utilizando vectores virales (por ejemplo vectores retrovirales , vectores adenovirales , vectores virales adeno-asociados, vectores OÍ virales) o vectores no virales (por ejemplo liposomas, partículas de recubiertas con ácido nucleico o proteína) . Las vacunas también pueden comprender una mezcla de proteína y ácido nucleico la cual a su vez se puede suministrar utilizando vehículos iguales o diferentes. La vacuna se puede administrar más de una vez (por ejemplo, una administración "cebadora" seguida por uno o más "refuerzos") para obtener los efectos deseados. La misma composición se puede administrar como el cebador y uno o más _refuerzos,.;-_—De ^.-manera""altérñátiva, se pueden utilizar composiciones diferentes para cebado y refuerzo. Las vacunas generalmente incluirán uno o más "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" tal como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. De manera adicional, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsuficantes , sustancias amortiguadoras de pH y similares. Un portador opcionalmente está presente, el cual es una molécula que en si misma no induce la producción de anticuerpos dañinos a la persona que recibe la composición. Los portadores adecuados típicamente son macromoléculas metabol izadas lentamente, grandes, tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipidíeos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos habitualmente expertos en la técnica. Además, el polipéptido Env se puede conjugar a un toxoide bacteriano tal como un toxoide de difteria, tétano, cólera, etc. Los adyuvantes también se pueden utilizar para mejorar la eficacia de las vacunas. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alumbre) , tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio.,;.-.-sul-fatonde 'alumiriió "7 etc ; "(2)" formulaciones de emulsión aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase abajo) o componentes de pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo: (a) F59 (publicación internacional número WO 90/14837) , que contiene escualeno 5%, Tween 80 0.5%, y Span 85 0.5% (que opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE (véase abajo), aunque no se requiere) formulado en partículas submicrométricas utilizando un raicrofluidizante tal como el microfluidizante Model HOY (Microfluidics , Newton, MA) , (b) SAF, que contiene escualano 10%, Tween 80 0.4%, polímero L121 bloqueado con Pluronic 5% y thr-MDP (véase abajo) ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a remolino para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande y (c) sistema adyuvante Ribi^ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno 2%, Tween 80 0.2% y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL, por sus siglas en inglés) , dimicolato de trehalosa (TDM, por sus siglas en inglés) , esqueleto de pared celular (C S, por sus siglas en inglés) , preferiblemente MPL + CWS (Detox" ) ; (3) adyuvantes de saponina tales como Stimulon"" (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) que se pueden utilizar o bien partículas generadas a partir del mismo tales como los ISCOM (complejos inmunoestimulantes)-; -"(4")"adyuvant¾^'complet"0 de Freund , (CFA, por sus siglas en inglés) y adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) ; (5) citocinas tales como interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), factor estimulador de colonia de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés) , factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) , etc.; 6) mutantes detoxificados de una toxina ribosilante de ADP bacteriana tal como la toxina de cólera (CT, por sus siglas en inglés) , una toxina de pertussis (PT, por sus siglas en inglés) o una toxina termolábil de E. coli (LT, por sus siglas en inglés) , particularmente LT-K63 (en donde la lisina está sustituyendo al aminoácido de tipo silvestre en la posición 63) , LT-R72 (en donde la arginina está sustituyendo al aminoácido de tipo silvestre en la posición 72), CT-S109 (en donde la serina está sustituyendo al aminoácido de tipo silvestre en la posición 109) y PT-K9/G129 (en donde la lisina está sustituyendo al aminoácido de tipo silvestre en la posición 9 y la glicina está sustituyendo a la posición- 129) (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales números WO 93/13202 y WO 92/19265) ; y (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición. Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , N-ajjetilmur^ (11 ,2 ' -dípalmitoil- -sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (MTP-PE) , etc. Las micropartículas también son útiles como adyuvantes. Estas preferiblemente se derivan de poli( -hidroxiácido) , en particular de poli (lactida) ("PIA")/ un copolímero D,L-lactida y glicolida o ácido glicólico tal como poli (D,L-lactida-co-glicolida) ("PLG" o "PLGA") o un copolímero de D,L-lactida y caprolactona. Las micropartículas se pueden derivar de cualquiera de diversos materiales iniciales poliméricos que tengan una variedad de pesos moleculares, y en el caso de los copolímeros tales como PLG, una variedad de proporciones de lactidarglicolida, cuya selección será principalmente materia de elección, dependiendo en parte del antígeno coadministrado. Las moléculas . (híbridos, complejos (o polinucleotidos que codifican para los mismos) o adyuvantes) pueden quedar atrapados dentro de las micropartículas o se pueden adsorber a las mismas. El atrapamiento con micropartículas de PLG es lo que se prefiere. Las micropartículas de PLG se discuten con mayor detalle en Morris et al., (1994), Vaccine, 12:5 - 11, en el capítulo 13 de Mucosal Vaccines, eds . Kiyono et al., Academic Press 1996 (ISBN 012410587) y en los capítulos 16 y 18 de Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) . significativamente . Típicamente, las composiciones de vacuna se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en vehículos líquidos antes de su inyección las cuales también se pueden preparar. La preparación también puede ser emulsificada o encapsulada en liposomas para mejorar el efecto adyuvante, como se discute en lo anterior.

Las vacunas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de las moléculas Env-CD4 (complejos o híbridos) o secuencias nucleotídicas que codifican para las mismas, anticuerpos dirigidos a estas moléculas y cualquier otro de los componentes mencionados antes, según se necesite. Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se quiere significar una cantidad que inducirá una respuesta inmunológica protectora en el individuo no infectado, infectado o no expuesto a quien se le administre. En general tal respuesta resultará en el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunológica celular o mediada por anticuerpo a la vacuna. Habitualmente , la respuesta incluye, pero no se limita a uno 0 más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos a partir de las clases inmunológicas , tales como las inmunoglobulinas , A, D, E, G o M; la proliferación de señales de activación, crecimiento y diferenciación a células inmunológicas; la expansión de linfocitos T cooperadores (helper) , linfocitos T supresores o linfocitos T citotóxicos . Preferiblemente, la cantidad eficaz es suficiente para llevar a cabo el tratamiento o prevención de los síntomas de enfermedad. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo del sujeto que se ha tratado, la edad y condición general del individuo que va a ser tratado; la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseado; la gravedad de la condición que sea tratada; el complejo particular Env-CD4 seleccionado y su modo de administración, entre otros factores. Una cantidad eficaz apropiada se puede determinar fácilmente por una persona habitualmente experta en la técnica. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se encontrará en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado mediante ensayos sistemáticos. Una vez formuladas, las vacunas de ácido nucleico se pueden llevar a cabo con o sin vectores virales, como se describe en lo anterior, por inyección utilizando ya sea una jeringa convencional o una pistola de genes, tal como el sistema de suministro de genes AccelMR (Powderject Technologies, Inc., Oxford, Inglaterra). El suministro de ADN al interior de las células de la epidermis se prefiere particularmente r-.-dado- —que~^ éste' modo" de administración proporciona acceso a células linfoides asociadas a la piel y proporciona una presencia transitoria de ADN en el receptor. Tanto los ácidos nucleicos o péptidos se pueden inyectar o administrar de alguna otra manera ya sea por vía subcutánea, epidérmica, intradérmica , intramucosal tal como nasal, rectal y vaginal, intraperitoneal , intravenosa, oral o intramuscular. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios, inyecciones sin agujas, aplicaciones transcutáneas y transdérmicas . El tratamiento de dosificación puede ser un protocolo de dosis única o un protocolo de dosis múltiple. La administración de ácidos nucleicos también se puede combinar con la administración de péptidos u otras sustancias. Suministro de Polinucleótidos Como se indica en lo anterior, las secuencias polinucleotídicas que codifican para las moléculas descritas en lo anterior (híbridos o complejos) se pueden obtener utilizando métodos recombinantes, tales como cribado de ADNc y bibliotecas genómicas a partir de células que expresan el gen, o al derivar el gen de un vector conocido para incluir al mismo. Además, el gen deseado se puede aislar y directamente de células y tejidos que contengan al mismo utilizando técnicas estándar, tal como extracción con fenol y PCR de ADNc o ADN genómico. Véase, por ejemplo, Sambrook et al... supra- -para—una descripción"de " las" técnicas utilizadas para obtener y aislar ADN. El gen de interés también se puede producir sintéticamente, en vez de ser clonado. La secuencia nucleotídica puede estar diseñada con los codones apropiados para la secuencia particular de aminoácidos deseada. En general, uno seleccionará los codones preferidos para el huésped propuesto en el cual se expresará la secuencia. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al . , Science (1984) 223 : 1299; Jay et al . , J. Biol . Chem. (1984) 259:6311; Stemmer, W.P.C., (1995) Gene 164:49-53. A continuación, la secuencia del gen con la codificación deseada se puede insertar en un vector. Las inserciones se pueden realizar dentro de la secuencia codificante o en cualquier extremo de la secuencia codificante. Los vectores pueden incluir elementos de control unidos operablemente a la secuencia codificante, los cuales permiten la expresión del gen in vivo en especies de sujetos. Por ejemplo, los promotores típicos para la expresión de células de mamífero incluyen el promotor temprano de SV40, un promotor de CMV tal como el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de LTR del virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP) y el 'simple, entre otros. Otros promotores no virales tales como un promotor derivado del gen murino de metanotioneina también encontrará uso para la expresión de mamíferos. Típicamente, las secuencias de terminación de transcripción y poliadenilación también estarán presentes, localizadas 3' respecto al codón de detención de traducción. Preferiblemente, también está presente una secuencia para optimización del inicio de la traducción localizada 5' respecto a la secuencia codificante. Los ejemplos de señales terminadoras de transcripción/poliadenilación incluyen aquellas derivadas de SV40, como se describe en Sambrook et al., supra así como la secuencia terminadora de la hormona del crecimiento bovina. Los elementos mej oradores también se pueden utilizar en la presente para incrementar los niveles de expresión de los constructos de mamífero. Los ejemplos incluyen el mejorador de gen temprano SV40, como se describe en Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761, el mejorador/promotor derivado de la secuencia repetida terminal larga (LT , por sus siglas en inglés) del virus de sarcoma de Rous, como se describe en Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1982b) 19: 6777 y los elementos derivados de CMV humano, como se describe en Boshart et al., Cell (1985) 41:521 tales como los elementos incluidos en la secuencia de intrón A de CMV. Los constructos pueden ser casetes unicistrónicos o _a. ;ernativamente—--casetes- l l'tfi¾stróhicos (por ejemplo., casetes bicistrónicos) que se pueden construir lo que permite la expresión de antígenos múltiples a partir de un ARNm único utilizando el EMCV IRES o similar. Una vez completados, los constructos se utilizan para inmunización de ácido nucleico utilizando protocolos de suministro de gen estándar. Los métodos para suministrar genes son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466. Los genes se pueden suministrar ya sea directamente al sujeto vertebrado, o alternativamente, se pueden suministrar ex vivo a células derivadas del sujeto y las células se reimplantan en el sujeto. Se han desarrollado muchos sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamífero. Por ejemplo, el retrovirus proporciona una plataforma conveniente para los sistemas de suministro de genes. Las secuencias seleccionadas se pueden insertar en un vector y se pueden empacar en partículas retrovirales utilizando técnicas conocidas en el arte. El virus recombinante después se puede aislar y suministrar a las células del sujeto ya sea in vivo o ex vivo. Se han descrito muchos sistemas retrovirales (patente de E.U.A. número 5,219,740; y Miller y Rosman, BioTechniques (1989) 7:980-990; Miller, A.D. , Human Gene Therapy (1990) 1:5-14, Scarpa et al., Virology (1991) 180 : 849-852 ; Burns et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EUA (1993) 90 : 8033 - 8037..;---ry--Boris- awr e^'"y""" Temin', ~ Cur. Opin . Genet. Develop. (1993) 3:102-109. Muchos de los vectores adenovirales también se han descrito. A diferencia de los retrovirus, los cuales se integran en el genoma huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente y por lo tanto minimizan los riesgos relacionados con mutagénesis insercional (Haj -Ahmad y Gragam, J. Virol. (1986)57:267-274; Bett et al., J. Virol . (1993) 67:5911-5921; Mittereder et al., Human Gene Therapy (1994) 5:717-729; Seth et al., J. Virol. (1994) 68:933-940; Barr et al., Gene Therapy (1994) 1:51-58; Berkner, K.L.; BioTecnhiques (1988) 6:616-629; y Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4:461-476) . Adicionalmente , los sistemas de vectores de virus adeno-asociados (AAV, por sus siglas en inglés) , se han desarrollado por el suministro de genes. Los vectores AAV se pueden construir fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 5,173,414 y 5,139,941; las publicaciones internacionales números WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol . (1988)8:3988-3996; Vincent et al.; Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ; Cárter, B. J. Current Opinión in Biotechnology (1992)3:533-539, Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol.^-and- Inununol .' (1992 ) 153 : 97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994)5:793-801; Shelling y Smith, Gene Therapy (1994)1:165-169; y Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179 : 1867-1875. Otro sistema de vector útil para el suministro de polinucleótidos de la presente invención son las vacunas de poxvirus recombinantes administradas por vía entérica descritas por Small, Jr. , P.A., et al. (Patente de E.U.A. número 5,676,950, expedida el 14 de octubre de 1997, incorporada en la presente como referencia) .

Los vectores virales adicionales los cuales encuentran uso para el suministro de moléculas de ácido nucleico que codifican para los antígenos de interés incluyen aquellas derivadas de la familia de virus pox, que incluyen el virus de vaccinia y el virus de poxvirus aviar. A modo de ejemplo, los recombinantes de virus de vaccinia que expresan los genes se pueden construir como sigue. El ADN primero se inserta dentro de un vector apropiado de manera que está adyacente a un promotor de vaccinia y flanqueando secuencias de ADN de vaccinia, tal como la secuencia que codifica para timidina cinasa (TK, por sus siglas en inglés) . Este vector después se utiliza para transfectar células las cuales son infectadas simultáneamente con vaccinia. La recombinación homologa sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica para las secuencias codificantes de interés en _ el^.genoma „-viralr. :..=.El- -recombiñañté " TK"resultante se puede seleccionar por cultivo de las células en presencia de 5-bromo desoxiuridina y tomar placas virales resistentes al mismo . De manera alternativa, también se pueden utilizar para suministrar los genes virus de viruela aviar tal como los virus de viruela aviar y virus de viruela de los canarios. Los virus de viruela aviar recombinantes que expresan inmunógenos de patógenos de mamífero se conocen porque confieren inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. El uso de un vector de viruela aviar es particularmente deseable en especies humanas y otras especies de mamífero dado que los miembros del género avipox (viruela aviar) únicamente se pueden replicar de manera productiva en especies aviares susceptibles y por lo tanto no son infecciosos en células de mamífero. Los métodos para producir virus de viruela aviar recombinantes se conocen en la técnica y utilizan la recombinación genética como se describe en lo anterior con respecto a la producción del virus de vaccinia. Véanse, por ejemplo los documentos O 91/12882; O 89/03429; y WO 92/03545. Los vectores de conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al., J. Biol. Chem. (1993) 268 : 6866-6869 y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA (1992) 89:6099-6103, también se pueden, utilizar -para- el-suministrcrdé"genes". Los miembros del género alfavirus, tal como, pero sin limitarse a vectores derivados de los virus de Sindbis, de Semliki Forest y de virus de encefalitos equina Venezolana, también encuentran uso como vectores virales para el suministro de polinucleótidos de la presente invención. Para una descripción de vectores derivados del virus Sindbis útiles para la práctica de los presentes métodos véanse Dubensky et al., J. Virol . (1996)70:508-519; y las publicaciones internacionales números WO 90/07995 y WO 96/17072; así como Dubensky, Jr., T. W., et al., patente de E.U.A. número 5,843,723, expedida el 1 de diciembre de 1998 y Dubensky Jr. , T.W. , patente de E.U.A. número 5,789,245, expedida el 4 de agosto de 1998, ambas incorporadas en la presente como referencia. Un sistema de infección/transfección basado en vaccinia también se puede utilizar convenientemente para proporcionar expresión transitoria e inducible de las secuencias codificantes de interés en una célula huésped. En este sistema las células primero se infectan in vitro con un virus de vaccinia recombinante que codifica para la A N polimerasa de bacteriófago T7. Esta polimerasa muestra especificidad precisa en la medida en que únicamente transcribe plantillas que presenten promotores T7. Después de la infección, las células se transfectan con el polinucleótido polimerasa que se expresa en el citoplasma del virus de vaccinia recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN, el cual después se traduce en una proteína por los organelos de traducción del huésped. El método proporciona la producción citoplásmica transitoria de alto nivel de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. Véase, por ejemplo Elroy-Stein y Moss, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA (1990)87:6743-6747; Fuerst et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986) 83 : 8122-8126.

Como una solución alternativa para la infección con recombinantes de virus de vaccinia o de viruela aviar, o para el suministro de genes que utilizan otros vectores virales, se puede utilizar un sistema de amplificación que genere expresión de alto nivel posterior a la introducción en las células huéspedes. Específicamente se puede someter a ingeniería un promotor de ARN polimerasa T7 que precede a la región de codificación para ARN polimerasa T7. La traducción de ARN derivado de esta plantilla generará ARN polimerasa T7 que a su vez transcribirá más plantillas. De manera concomitante, existirá un ADNc cuya expresión está bajo el control del promotor T7. Por lo tanto, parte de la ARN polimerasa T7 se genera a partir de la traducción de la plantilla de ARN de amplificación lo que genera la transcripción del gen deseado. Debido a que se requiere _cierta..^RN^..polámerasa'~T7"para"'"xnÍ Í^r"''Íá amplificación la AR ¦polimerasa T7 se puede introducir en las células junto con una o varias de las plantillas para cebar la reacción de transcripción. La polimerasa se puede introducir como una proteína o en un plásmido que codifica para la ARN polimerasa. Para una discusión adicional de los sistemas T7 y su uso para transformar células véase, por ejemplo, la publicación internacional número O 94/26911; Studier y offatt, J. Mol. Biol. (1986) 189 : 113-130; Deng y Wolff, Gene (1994)143:245-249; Gao et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 1994) 200 : 1201-1206; Gao y Huang, Nuc . Acids Res. (1993) 21:2867-2872; Chen et al., Nuc. Acids Res. (1994) 22^2114-2120; y la patente de E.U.A. número 5,135,855. Los polinucleótidos que codifican para híbridos o complejos como se describen en la presente también se pueden suministrar sin un vector viral. Por ejemplo, el constructo se puede empacar en liposomas antes del suministro al sujeto o a las células derivadas del mismo. La encapsulación de lípidos generalmente se lleva a cabo utilizando liposomas que son susceptibles de unirse de manera estable o atrapar y retener ácido nucleico. La proporción de ADN condensado respecto a la preparación de lípidos puede variar pero generalmente será de aproximadamente 1:1 (mg de ADN: micromoles de lípido) o más del lípido. Para una revisión del uso de los liposomas como portadores de. los ácidos nucleicos éase_,_Hug_y-Sleight-7— Biochim. 'Bi'ophys Ac a . (1991) 1097 : 1-17; Straubinger et al., en Methods of Enzymology (1983), Vol . 101, pp. 512-527. Las preparaciones liposómicas para uso en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente) , aniónicas (cargadas negativamente) y neutras, prefiriéndose particularmente los liposomas catiónicos. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos median el suministro intracelular del ADN plasmídico (Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA (1987)84:7413-7416); ARNm (Malone et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1989) 86:6011- 6081); y factores de transcripción purificados .(Debs et al., J. Biol. Chem. (1990)265:10189-10192) , en forma funcional. Los liposomas catiónicos están disponibles fácilmente. Por ejemplo, los liposomas de N[l,2,3- dioleiloxi ) propil] -N, N, N-trietilamonio (DOTMA, por sus siglas en inglés) , están disponibles bajo la marca comercial Lipofectin de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Véase también Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1987)84:7413- 7416) . Otros lípidos disponibles comercialmente incluyen (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger) . Se pueden preparar otros liposomas catiónicos a partir de materiales disponibles fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, Szoka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1978)75:4194-4198; publicación PCT número WO 90/11092 para _una descripción- de-la- síntesi:s "¾e"DOTAP' (lf2-bis (oleoiloxi) -"3- (trimetilamonio) propano) liposomas . De manera similar, los liposomas aniónicos y neutros están disponibles fácilmente tales como, de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) , o se pueden preparar fácilmente utilizando materiales disponibles fácilmente. Tales materiales incluyen fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleilfosfatidilcolina (DOPC, por sus siglas en inglés) , dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG, por sus siglas en inglés) , dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE, por sus siglas en inglés), entre otros. Estos materiales también se pueden mezclar con los materiales iniciales DOTMA y DOTAP en proporciones adecuadas. Los métodos para producir liposomas utilizando estos materiales son bien conocidos en la técnica. Los liposomas pueden comprender vesículas muítilamelares (MLV, por sus siglas en inglés) , vesículas unilamelares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) o vesículas unilamelares grandes (LUV, por sus siglas en inglés) . Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se preparan utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger et al., en METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Vol. 101, pp. 512-527; Szoka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1978)75:4194-4198; Papahadj opoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975)394:483; Wilson ' et al., Cell _(.197.9)_1 .:,.7,)-; ^Deamer-- -y-"Banghám, "Bióchim, Biophys. Acta (1976) 443 :629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Co mun (1977) 76:836; Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979) 76:3348) ;. Enoch y Strittmatter, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979)76:145); Fraley et al., J. Biol. Chem. (1980)255:10431; Szoka y Papahadjopoulos, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1978)75:145; y Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215 : 166. El ADN o una o varias de las proteínas también se pueden suministrar en composiciones lipídicas de cocleato similares a las descritas por Papahadj opoulos et al., Biochem. Biophys . Acta. (1975) 394 : 483 -491. Véase también las patentes de E.U.A. números 4,663,161 y 4,871,488. Los polinucleótidos de interés también pueden estar encapsulados , adsorbidos o asociados con portadores particulados. Tales portadores presentan copias múltiples de un antígeno seleccionado para el sistema inmunológico y promueven el atrapamiento y retención de antígenos en nodulos linfáticos locales. Las partículas pueden ser fagocitadas por macrófagos y pueden mejorar la presentación de antígeno a través de la liberación de citocina. Los ejemplos de portadores particulados incluyen aquellos derivados de polímeros de metacrilato de polimetilo, así como micrcpartículas derivadas de poli (lactidas) y poli (lactida-co-glicolidas) , conocidos como PLG. Véase, por ejemplo Jeffery et al., Phazm. Res. (1993)10:362-368; McGee JP, et al., J". Microencapsul . 14 (2) : 197-210 , 1997; O ' Hagan DT, et al., Vaccine 11 (2) : 149-.5 .,_.1993.. ,Las micropartícul'a"s'"ádé^ua"das" ~ también se . pueden fabricar en presencia de detergentes cargados, tales como detergentes aniónicos o catiónicos, para proporcionar micropartículas con una superficie que tiene una carga negativa neta o positiva neta. Por ejemplo, las micropartículas fabricadas con detergentes aniónicos, tales como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB, por sus siglas en inglés) , es decir, micropartículas de CTAB- PLG, adsorben macromoléculas cargadas negativamente tales como ADN (véase, por ejemplo, la solicitud internacional número PCT/US99/17308) .

Además, se pueden utilizar otros sistemas particulados y polímeros para el suministro in vivo o ex vivo del gen de interés. Por ejemplo, los polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina así como conjugados de estas moléculas, son útiles para transferencia de un ácido nucleico de interés. De manera similar, la transfección mediada por dextrano de DEAE, precipitación de fosfato de calcio o precipitación utilizando otras sales inorgánicas insolubles tales como fosfato de estroncio, silicatos de aluminio que incluyen bentonita y caolín, óxido crómico, silicato de magnesio, talco y similares encontrarán uso con los presentes métodos. Véase, por ejemplo, Felgner, P.L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990)5:163-187, para una revisión de los sistemas de suministro útiles para la transferencia de genes. También se puedej^utilizar^-peptoid^ R.'N.T et al., Patente de É.U.A." número 5,831,005, expedida el 3 de noviembre de 1998, incorporada en la presente como referencia) para el suministro de un constructo de la presente invención. Adicionalmente, los sistemas de suministro biolístico que utilizan portadores particulados tales como oro y tungsteno, son especialmente útiles para el suministro de polinucleótidos de la presente invención. Las partículas se recubren con uno o varios polinucleótidos que se van a suministrar y se aceleran a alta velocidad, generalmente bajo una atmósfera reducida, utilizando una descarga de polvo de pistola desde una "pistola de genes". Para una descripción de tales técnicas y aparatos útiles por lo tanto véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. números 4,945,050; 5,036,006; 5,100,792; 5,179,022; 5,371,015 y 5,478,744. También se pueden utilizar sistemas de inyección sin agujas (Davis, H.L., et al., Vaccine 12:1503-1509, 1994; Bioject, Inc., Portland, OR) . Los vectores recombinantes que presentan' polinucleótidos de la presente invención se formulan en composiciones para suministro al sujeto vertebrado. Estas composiciones pueden ser profilácticas (para impedir la infección) o terapéuticas (para tratar la enfermedad después de la inyección) . Las composiciones comprenderán una "cantidad terapéuticamente eficaz" del gen de interés de manera^ q e- se-- pueda -producir' üñ "cantidad del antígeno in vivo dé manera que se genera una respuesta inmunológica en el individuo al cual se administra. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo del sujeto que sea tratado; la edad y condición general del sujeto que sea tratado; la capacidad del sistema inmunológico del sujeto para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseado; la gravedad de la condición que sea tratada; el antígeno particular seleccionado y su modo de administración, entre otros factores. Una cantidad eficaz apropiada puede determinarse fácilmente por una persona habitualmente experta en la técnica. Por lo tanto, una "cantidad terapéuticamente eficaz1' se encontrará en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado mediante ensayos sistemáticos. Las composiciones polinucleotídicas generalmente incluirán uno o más "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" tales como agua, solución salina, glicerol, polietilenglicol , ácido hialurónico, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , sustancias amortiguadoras de pH y similares. También se pueden incluir algunos facilitadores de la captación o expresión de ácido nucleico en las composiciones o se pueden coadministrar, tal como, pero sin limitarse a bupivacaína, cardiotoxina y sacarosa. _._.„___Una~ vez ·- -formuladas " ~ l^ ^^composiciones de la "invención se pueden administrar directamente al sujeto (por ejemplo, como se describe en lo anterior), o alternativamente se pueden suministrar ex vivo a células derivadas del sujeto utilizando métodos como los descritos en lo anterior. Por ejemplo, métodos para el suministro ex vivo y la reimplantación de células transformadas en un sujeto se conocen en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, transfección mediada por lipofectamina y LT-1, fusión de protoplastos , electroporación (véase, por ejemplo, Draghia et al. (2000) Technol Cáncer Res Treat Oct; 1 (5) : 367-72 ; Heller (2002) Technol Cáncer Res Teat Oct ; 1 (5) : 317-8) , encapsulación de uno o varios polinucleótidos (con o sin el antígeno correspondiente) o liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos. El suministro directo de las composiciones que se describen en la presente in vivo generalmente se llevará a cabo con o sin vectores virales, como se describe en lo anterior, por inyección utilizando ya sea una jeringa convencional o una pistola de genes, tal como el sistema de suministro de genes AccelR (Powderject Technologies, Inc., Oxford, Inglaterra) . Los constructos se pueden inyectar por vía subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramucosa tal -oral o intramuscular. El suministro de ADN al interior de las células de la epidermis se prefiere particularmente pues este modo de administración proporciona acceso a células linfoides asociadas con la piel y proporciona la presencia transitoria de ADN en el receptor. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, inyección sin agujas, aplicaciones transcutánea y transdérmica . El tratamiento de dosificación puede ser un protocolo de dosis única o un protocolo de dosis múltiple. La administración de los ácidos nucleicos también se puede combinar con la administración de péptidos u otras sustancias. Aunque la invención se ha descrito en relación con las modalidades específicas preferidas de la misma, debe entenderse que la descripción anterior así como los ejemplos que siguen se diseñan para ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para aquellos expertos en técnica a la cual pertenece la invención. Parte Experimental A continuación se proporcionan ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la invención. Los ejemplos se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la jLn encj^oji^de-manera^algun ^ ~-~ ~ " Se han realizado esfuerzos por asegurar precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo cantidades, temperaturas, etcétera) pero por supuesto, debe permitirse cierto error experimental y desviación. EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE COMPLEJOS GP 120-CD4 SOLUBLE (gpl20-sCD4) Los complejos purificados estables de gpl20-sCD4 se preparan con y sin tratamiento con formaldehído o con formalina. Para inducir cambios conformacionales en gpl20, se incuba una concentración equimolar de gpl20 (SF2) y sCD4 juntos, a 37°C durante una hora. A nivel celular, estas interacciones son transitorias. Por lo tanto, al final de la incubación, la mitad de los complejos se fijan con formaldehído o con formalina mientras la otra mitad permanece sin tratar. Los complejos tanto tratados como sin tratar se separan en una columna Superdex-200. Las fracciones purificadas se analizan en una columna CLAR y en SDS-PAGE (figura 4A y 4B) . Los complejos purificados contienen tanto GP 120 como CD4 juntos. Además, estos complejos parecen ser homogéneos y no contienen más de 2-3% de sCD4 libre. EJEMPLO 2 DISEÑO RAZONADO DE UNA MINIPROTEINA CD4 La miniproteína CD4 , CDM3 se diseña "razonadamente" como se describe en Vita et al. (1999) Proc iVatl Acad Sci USA _9_6_(23.L:.130?l-6:, r-—ut-il-izando ~:un~ "^enfoque- "de~ relación entre estructura y función. En una primera etapa se determina por espectroscopia RMN """H la miniproteína CD4. Este análisis muestra que la miniproteína contiene el pliegue de a/ß característico del andamio de escorpión, y de manera importante, que el sitio activo putativo, transferido de CD4, está muy bien definido. Los átomos de la estructura principal de la secuencia 17-26 de CD4M3 se pueden superponer sobre los átomos correspondientes de la secuencia 37-46 de CD4 nativa con una desviación RMS de únicamente 0.61 Á. Además, las cadenas laterales de Gln20, Ser22, Phe23 y Thr25 tienen una orientación muy similar al de las cadenas laterales correspondientes en CD4. En particular, la cadena lateral Phe23 está muy definida debido a que se observan muchos contactos de alance amplio. Esta cadena lateral sobresale dentro del solvente en una conformación que es más bien rara para una porción hidrofóbica, pero es reminiscente de aquella de Phe 43 de CD , la cual, en la estructura cristalina del complejo CD4-gpl20 se observa que tapa la entrada de la "cavidad Phe 43" de gpl20 (Kwong et al. (1998) IVature 393:648-659). Las cadenas laterales de Lysl6, Arg7 y Gly27, no obstante, divergen de la estructura de las correspondientes Lys35, Arg59 y la cadena C1' de CD4. En una segunda etapa, cada cadena lateral putativamente activa de la miniproteína se sustituye por un j-esiduo^a. la^-(-"exploración-Al"a" )'. El^efecto de la sustitución de "alanina en la unión gpl20, determinada por ELISA, competitiva, indica claramente que cada residuo transferido juega un papel funcional diferente, y apunta a un residuo Phe presente en el vértice de una orquilla ß como un "punto caliente" de la superficie activa quimérica. Esto concuerda con los datos obtenidos por mutagénesis de CD4 recombinante (Arthos et al. (1989) Cell 57 (3) :469-81; Binley et al. (1997) AIDS Res Hu Reroviruses 13:1007-15). Resulta interesante que este análisis sugiere dos sustituciones, Gln20Ala y Thr25Ala.

Una vez que estas mutaciones se introdujeron en la miniproteína (CD4M8, figura 2) , se incrementa su afinidad de unión por gpl20 en más de un orden de magnitud (Vita (1999) Proc Nati Acad Sci USA 96 (23 ) : 13091- 6) . Se sugirieron tres mutaciones adicionales, Leul8Lys, Ser9Arg, y Pro28 por el análisis estructural y cuando se incorporaron estas mutaciones, la afinidad de unión se incrementó adicionalmente en diez veces, en comparación con los mutantes dobles anteriores (CD4M8) . Estas 5 mutaciones produjeron un mini-CD4 optimizado (CD4M9, Fig. 2) que mejora la unión a gpl20 con una CI50 de 400 nM. CDM33 es un imitador de 27 aminoácidos de CD4 y se describe en Martin et al. (2003) ature Biotech. 21:71-76. EJEMPLO 3 DISEÑO ADICIONAL RAZONADO DE MINIPROTEÍNAS CD4 ) Proc Nati Aca 2003) Nati. Biotech. 21:71-76, miniproteínas CD4 diseñadas de manera racional adicional se elaboraron al introducir la función fotorreactiva azido en la posición distal (para) del anillo fenilo Phe23, el cual, por analogía con sCD4 Phe43, debe bloquear la entrada de la "cavidad Phe43" hidrofóbica de gpl20. La función fotorreactiva azido se puede producir fácilmente de manera química a partir de la p-aminofenilalanina disponible comercialmente y, bajo irradiación a 250 nm, forma una porción nitreno reactiva que experimenta reacción de inserción rápida en cadenas laterales de aminoácidos ricas en electrones (por ejemplo cadenas laterales aromáticas) las cuales en realidad son numerosas en la "cavidad Phe43" hidrofóbica. De manera alternativa, un grupo haloacetamida, reactivo a los residuos metionina o histidina, se encuentra cercano a la "cavidad Phe43" se incorpora en la p-aminofenilalanina 23 o sobre otra posición en la interfase . Debido a la posición estratégica de la cadena lateral Phe23, la penetración de la "cavidad Phe43" profunda de gpl20, los resultados de fotorreacción o de la reacción química en un ambiente relativamente homogéneo y elevado proporciona un complejo covalente. EJEMPLO 4 INGENIERÍA Y EXPRESIÓN BIOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN _DE_ ENVOLTURA -DE-MINIPROTEÍNA GD4 ^" ' " " -^-"'"" Los polinucleótidos que codifican para las siguientes secuencias de miniproteína CD4 se clonan en un constructo (plásmido recombinante) de expresión que comprende una secuencia que codifica para un poüpéptido Env de VIH (por ejemplo, una secuencia que codifica para el polinucleótido que codifica para gpl20 codificado, como se describe, por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales WO 00/39302 y WO 03/020876) : gggggTCTASQQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNIRADSRRSLWDQGNFPL IIK LKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLggggg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 1 ) gggggQKKSIQFHW IJSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNIRADSRRSL DQGNFPLIIKNLK IEDSDTYICEggggg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 2) gggggNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNIRADSRRSLWDOQGNggggg (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 3) gggggGNQGSFLTKGPSKLNIRADSRRSLWDQGNggggg (SECUENCIA - DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 4) En estas secuencias, los residuos marcados por subrayado son residuos reales que están en contacto con gpl20 y los residuos que se muestran con minúsculas ("g" para glicina) son residuos enlazantes que proporcionan flexibilidad a gpl20-CD4 para producir un complejo. Cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1 a 4 se insertan en el lugar de las asas VI, V2 , V3 , ^^o^V5-.secuencias que~codi'ficañ^para* Env, por ejemplo la * secuencias que codifica para gpl20 que se muestra en la figura 7 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5) . Por lo tanto, la inserción se puede realizar dentro de cualquiera de las asas V y, además, el constructo puede tener una o más asas adicionales suprimidas. En particular, VI y V2 están relativamente cercanos al sitio de unión CD4 y se puede suprimir en la proteína de núcleo en gpl40sFi62 oligomérico, sin pérdida de estabilidad y función de unión. Kwong et al., supra. Inserciones más cortas (por ejemplo las que corresponden únicamente al asa similar a CDR2) también se pueden insertar en el lugar de una o más regiones variables. Los modelos de los híbridos Env-CD4 se producen mediante la utilización de la estructura del modelo de los CD4M9-gpl20nxB2 utilizado para optimizar la afinidad de unión de miniproteína CD4 (véase antes) y deducida de la estructura CD4 -gpl20HXB2 · Se prueban diferentes secuencias enlazantes (por ejemplo para minimizar la energía) . Los híbridos (quimeras) con las energías más bajas se analizaron adicionalmente y se compararon con las estructuras complejas, no covalentes. Las quimeras con la inserción simple de la región similar a CDR2 de CD4 se trataron de manera similar. Además, se insertó dentro de las asas VI o V2 una miniproteína CD4 de 27 aminoácidos, como se describe en Martin et al. (2003) Wat Biotechnol Jan: 21 (1) : 71-6. La estábilidad__y_eficiencia" en^-el^ legado^ del andamio mimético sugiere que, si se permite flexibilidad suficiente en los sitios de inserción de asa V, la miniproteína CD4 se plegará apropiadamente, una vez insertada dentro de la envoltura proteínica . La expresión es seguida por técnicas estándar. Además, la unión de la proteína CD4 a Env es monitoreada por la inducción de epitopos inducibles por C.D4 reconocidos por los MAb 17b y 4.8d utilizando técnicas estándar. En particular, las quimeras purificadas producidas en el fondo Env de SF162, entonces, están caracterizadas por SPR para evaluar la exposición de los epitopos CD4 mediante pruebas de unión de correceptor para evaluar sus afinidades de unión. En la prueba de ELISA competitiva, una miniproteína diseñada de manera razonada es capaz de unir específicamente gpl20 a una CI50 de 40 µ , lo cual es cuatro órdenes de magnitud mayor que la de sCD4. Véase también Devico et al. (1999) Virology 218:258-263 y Zhang et al. (1999) Biochemistry 38 (29) : 9405-16 , las cuales muestran la prueba de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) de otra miniproteína CD4 y la de las minoproteínas CD4 que son susceptibles de competir con sCD4 para unión al mismo sitio gpl20, y para inducir cambios conformacionales en la envoltura, detectados por el anticuerpo monoclonal 17b (Sullivan et al. (1998) J Virol 72 (8) : 6332 -6338) . Este ajiticuerpo_-reconocen~-un- epitopo" FocaTizado' cerca del asa V3 de gpl20 y que consiste principalmente del tallo conservado de V1/V2 , el cual probablemente esté enmascarado por las asas V1/V2 y V3 flanqueantes (Kwong et al. (1998) Nature (London) 393:648-659; Rizzuto et al. (1998) Science 280:1949-1953), pero expuesto en el gpl20 que forma complejo con CD4. El efecto de la adición de miniproteína en la tasa de incremento en la unión y asociación máxima de anticuerpo es pequeño, lo que probablemente refleja su baja afinidad de unión a gpl20, pero es específica y se puede detectar fácilmente.

En suma, estos resultados demuestran que: i) una porción significativa de la superficie de unión gpl20 de CD4 se puede reproducir en un sistema de miniproteína y ii) los híbridos que imitan a CD4 sometidos a ingeniería genética o CD4-Env contiene suficientes elementos estructurales de CD4 capaces de inducir cambios conformacionales de gpl20, similares a los expresados por sCD4. La electroporación y otros métodos descritos en la presente se utilizan para suministrar eficientemente polinucleótidos que codifican para las proteínas de fusión para primates no humanos. La estrategia de cebado con ADN/refuerzo con proteína permite el cribado de estructuras múltiples de Env en conejos y en primates no humanos con el potencial para la presentación de epitopos in si tu en el hospedador cuando se suministran como vacunas de ADN. EJEMPL0_5 - ---.^r --= - -~ ·'" ~ ": ~ PRODUCCIÓN DE ANTICUERPO NEUTRALIZANTE UTILIZANDO COMPLEJOS CD4-Env A. Complejos Env-sCD4 Los sueros de conejo se prueba en ensayos neutralizantes contra cepas de VIH-1 adaptadas a linfocitos T (TCLA) así como VIH-1 primaria. Los anticuerpos inducidos en estos conejos por los complejos gpl20-sCD4 son capaces de neutralizar tanto el aislado primario SF162 así como los aislados adaptados a linfocitos T, SF2 (cepa homologa) y RF (heterólogas ) . Para demostrar que los anticuerpos contra gpl20 son los responsables para neutralizar el virus , se utili zó una columna de afinidad gpl20 de SF2 para purif icar reacciones de anticuerpos específicos para Env a partir de estos sueros . La mayor parte de los anticuerpos específ icos contra gpl20 ( 95% ) se unieron a las columnas de af inidad gpl20 , Estas se eluyeron con 200 mom de gl icina pH 2 . 5 . Los ant icuerpos contra CD4 no se unen ef icazmente a la columna de af inidad . Los anticuerpos contra gpl20 purif icados por af inidad se evaluaron adicionalmente para determinar sus reactividades contra gpl20 y contra CD4 en prueba de ELISA así como en ensayos basados en CLAR. Utilizando esta estrategia, aproximadamente 90% de los anticuerpos contra gpl20 fueron purificados por afinidad, no obstante, la columna que eluyó con fracciones de anticuerpo específico para gpl20 estaba ligeramente contaminada con anticuerpos específicos para _.CD4 (_figura _-,5) ..:-:En^rconsecuencia7~los anticuerpos específicos contra gpl20 ~ purificados por af inidad se purif icaron adicionalmente por pasaj e sobre una columna de af inidad CD4 para absorber anticuerpos contra CD4 . Después de la absorción, los anticuerpos purificados por af inidad contra gpl20 estaban libres de cualquier anticuerpo contra CD4 detectable . Estos anticuerpos contra gpl20 puri ficados por afinidad son capaces de neutrali zar aislados de VIH- 1 primarios subtipos B y C ( figura 6 y tabla 1 , a continuación) . Los valores mostrados en la tabla 1 presentan el inverso de la mayor dilución a la cual se observa 50% de inhibición del virus en un ensayo de neutralización de virus basado en PBMC (por el doctor Cari Wild en Panics Corporation, Gaithersburg, MD) . Tabla 1 : Actividad neutralizante de las fracciones de columna gpl20 contra aislados primarios de VIH-1 subtipo B y C racionalmente Se inmunizó a cada uno de dos conejos con complejos gpl20-sCD4 fijados o no fijados (preparados como se describe en el ejemplo 1) en MF59 a las 0, 4, 12 y 24 semanas. Los suero_s __se_. recpleG-taron--cada"- dos^" semanas ' y se analizaron contra gpl20 de SF2 en una prueba de ELISA. Estos animales generaron una fuerte respuesta inmunológica contra gpl20 (figura 3A) . En general, los complejos fijados (por ejemplo fijado con formalina) fueron más inmunogénicos que los que se reflejaron por títulos de anticuerpos elevados obtenidos en este grupo en comparación con el grupo que recibió complejos no fijados. Además de las respuestas contra gpl20, estos complejos también indujeron una fuerte respuesta contra CD4, como se esperaba (figura 3B) .

Por lo tanto, la miniproteína CD4 diseñada razonadamente, unida con alta afinidad a diferentes formas de envoltura (que incluye las formas oligomérica y monomérica de SF162 con y sin supresiones de V2) , induce cambios conformacionales en estas proteínas tan eficientemente como CD4 , e induce una exposición completa de los epitopos inducibles por CD4 crípticos conservados o los sitios de unión de correceptor. Por lo tanto, la miniproteína CD4 optimizada parece representar un sustituto completamente funcional de sCD4 y además las miniproteínas CD4 adicionalmente sometidas a ingeniería pueden resultar en moléculas suplentes que pueden ser útiles en complejo con proteína de la envoltura para exponer epitopos de envoltura a anticuerpos neutralizantes y de esta manera pueden encontrar aplicación potencial en formulaciones de vacuna. ^ „.C.—Proteínas~híbridas~Eñv;rCD4 Cada uno de dos conejos fueron inmunizados con constructos que codifican para híbridos Env-CD4 a las 0, 4, 12 y 24 semanas. Los sueros se recolectaron cada dos semanas y se analizaron por ELISA. Las proteínas híbridas Env-CD4 (y polinucleótidos que codifican para estos híbridos) se espera que representen un sustituto funcional completo de sCD4 y pueden ser útiles en exponer epitopos de envoltura a anticuerpos neutralizantes y de esta manera pueden encontrar aplicación potencial en formulaciones de vacuna.

D . Monos Se inmunizaron grupos de 5 conejos con los complejos de Env-miniproteína CD4 o las proteínas híbridas Env-CD4 con adyuvante (MF59) junto con grupos control únicamente con proteína Env y únicamente con miniproteína CD4. Los complejos CD4 y los híbridos Env-CD4 se elaboran con formas monoméricas y oligoméricas de Dnv de SF162 con y sin supresiones de V2 y se compararon las respuestas de anticuerpos en conejos. Los protocolos de inmunización son a las 0, 4 y 24 semanas de inmunizaciones; cuando se garantizó, se puede incluir a las 24 semanas un refuerzo adicional. Los complejos Env-CD4 identificados por estudios en conejos después se prueban en macacos. EJEMPLO 6 DESENMASCARAMIENTO DE EPITOPOS CRIPTICOS DE LA SUBUNIDAD gp41 transformación conformacional de envolturas oligoméricas (o-gpl40) , desenmascarando epitopos crípticos, cercanos a los sitios correceptores en la subunidad gpl20 e incrementa eficazmente la afinidad de unión del correceptor en diferentes envolturas gpl20. Ya sea que esta transformación conformacional también puede exponer epitopos dentro de la subunidad gp41 de envolturas gp-140 aún no se ha probado. En consecuencia, se prueba la inducción de esta transformación conformacional por miniproteínas CD4 que se unen en diferentes estructuras Env oligoméricas, utilizando tecnología SPR y mAb 2F5 o péptidos DP178 (o congéneres) . También se examinó el efecto de adición de péptidos a partir del dominio N terminal del correceptor CCR5, el cual se ha demostrado que se une a gpl20. Si se demuestra la exposición de los epitopos gp41( los péptidos se acoplan químicamente a la miniproteína CD , para producir ligandos bifuncionales novedosos, que presentan potencia aumentada en el desenmascaramiento de epitopos gp41. Las envolturas oligoméricas quiméricas novedosas que incorpora los ligandos bifuncionales también se producen química o genéticamente - y se prueban. Las proteínas de envoltura candidatas con exposición superior de epitopos crípticos gpl20 y gp41 después se prueban en animales para la inducción de anticuerpos neutralizantes. EJEMJ?L0_J7 — PRODUCCIÓN ' DE ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE SE DIRIGEN A EPITOPOS DE Env CONSERVADOS CRÍPTICOS Los inmunógenos seleccionados de Env-CD4 se inyectan en ratas para preparar anticuerpos monoclonales , de acuerdo con procedimientos estándar. Los clones se examinarán en ELISA contra el complejo miniproteína CD4-gpl20, miniproteínas CD4-o-gpl40, gpl20 y o-gpl40, solo y también con miniproteína CD4M33. Todos los clones muestran una mayor afinidad por complejos en comparación con envolturas solas y se probarán adicionalmente en Biacore. Todos los clones que proporcionen un resultado positivo en Biacore contra los complejos CD4M33-gpl20 o CD4M33 -o-gpl40 se seleccionarán y utilizarán para producción a granel de fluidos de ascitis. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor^ método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un polinucleótido caracterizado porque codifica para un híbrido de Env de VIH-polipéptido CD4. 2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una primera secuencia que codifica para un polipéptido Env de VIH y una segunda secuencia que codifica para una proteína CD4 , en donde la segunda secuencia se inserta dentro, y en un marco de lectura apropiado con la primera secuencia. 3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido Env de VIH comprende una o más supresiones de am^oácj.do_s^.ej¾_yi--o-V2---—----- ¦ - - 4. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la segunda secuencia se inserta dentro de las supresiones. 5. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además una o más secuencias enlazantes. 6. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las secuencias enlazantes flanquean a la segunda secuencia. 7. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína CD4 está codificada por un polinucleotido que se selecciona del grupo que consiste de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 a 4. 8. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido Env de VIH comprende gpl40. 9. El polinucleotido de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los epitopos crípticos se exponen en el polipéptido Env modificado. 10. El polipéptido, caracterizado porque está codificado por el polinucleotido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido Env comprende_gpl20,..-,, — — 12. ?? polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína CD4 es codificada por un polinucleotido que se selecciona del grupo que consiste de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 a 4. 13. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína CD4 se inserta dentro de una región variable del polipéptido Env. 14. Un complejo polipeptídico, caracterizado porque comprende un polipéptido Env y CD4 soluble (sCD4) . 15. El complejo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido Env y la proteína sCD4 forman complejos utilizando un fijador. 16. El complejo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el fijador comprende formalina. 17. El complejo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido Env y la proteína sCD4 forman complejos vía un enlace covalente. 18. El complejo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido Env comprende gpl40 oligomérico. 19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido Env y la proteína CD4 soluble se reticulan utilizando formaldehído . 20. Una composición inmunogénica caracterizada porgue _comprende ^un^-polinucleót dcT de^ conformidad con las_ reivindicaciones 1 a 9. 21. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 10 a 19. 22. La composición inmunogénica de conformidad con las reivindicaciones 20 ó 21 caracterizada porque comprende un adyuvante . 23. Una célula caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, y donde la secuencia polinucleotídica está unida operablemente a elementos de control compatibles con la expresión de la célula seleccionada. 2 . La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula de mamífero. 25. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que consiste de células BHK, VERO, HT1080, 293, RD, COS-7 y CHO . 26. La célula de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la célula es una célula CHO. 27. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula de insecto. 28. La célula de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque las células son células de insecto ya_se_a_Tric opIusia^ni"-(-Tn5')—o~Sf97^""""" 29. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula bacteriana. 30. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula de levadura. 31. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula vegetal. 32. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula presentadora de antígeno. 33. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula linfoide que se selecciona del grupo que consiste de macrófagos, monocitos, células dendítricas, linfocitos B, linfocitos T, emocitoblastos y células progenitoras de la mismas. 34. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula primaria. 35. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula inmortalizada . 36. La célula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula derivada de tumor. 37. Un vector de suministro de genes para uso en un sujeto mamífero, caracterizado porque comprende: un vector de suministro de genes adecuado para uso en el_suj.eto,.—;en^donde—el- vector"^comprende ' un polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, y en donde la secuencia polinucleotídica está unida operablemente a elementos de control compatibles con la expresión en el sujeto. 38. Un método para producir anticuerpos que se unen a epitopos crípticos de Env de VIH, los métodos caracterizados porque comprenden la etapa de : administrar un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 a un sujeto bajo condiciones que permite la producción de anticuerpos en el sujeto. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende además la etapa de aislar los anticuerpos producidos en el sujeto. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, caracterizado porque los anticuerpos son anticuerpos neutralizantes . 41. El método de conformidad con las reivindicaciones 38 a 40, caracterizado porque los anticuerpos son anticuerpos monoclonales . 42. El método de conformidad con las reivindicaciones 38 a 40, caracterizado porque los anticuerpos son anticuerpos policlonales . 43. Un método para producir un polipéptido que incluye secuencias polipeptídicas de Env de VIH que forman complejos con proteínas CD4, el método está caracterizado porque comprende: .-incubar-^las-células^de' conformidad con las reivindicaciones " ~ 23 a' 36, bajo condiciones para producir el polipéptido. 44. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto caracterizado porque comprende: administrar una composición de conformidad con las reivindicaciones 20 a 22 en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunológica en el sujeto. 45. Un método de inmunización de ADN de un sujeto, caracterizado porque comprende: introducir un vector de suministro de genes de conformidad con la reivindicación 37 en un sujeto bajo condiciones que son compatibles con expresión del cásete de expresión en el sujeto. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el vector de suministro de genes es un vector no viral . 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el vector se suministra utilizando un portador particulado. 48. El' método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el vector está recubierto en una partícula de oro o tungsteno y la partícula recubierta se suministra al sujeto utilizando una pistola de genes. 49. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el vector está encapsulado en una preparación -Li osómi-ca- ^— ~^x=.-r-r-- - - 50. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el vector es un vector viral. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el vector viral es un vector retroviral. 52. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el vector viral es un vector alfaviral. 53. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el sujeto es un mamífero. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el mamífero es un humano. 55. Un método para generar una respuesta inmunológica en un sujeto, caracterizado porque comprende: transfectar células del sujeto a un vector de suministro de gen de conformidad con la reivindicación 37, bajo condiciones que permiten la expresión del polinucleotido y la producción de polipéptido, por lo que se induce una respuesta inmunológica al polipéptido. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el vector es un vector no viral. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el vector se suministra utilizando un portador particulado. 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el vector está recubierto en una pa tícula .de--oro-:o -tungsteno-y'Ta~partícula recubierta se suministra a la célula"vertebrada utilizando una pistola de genes. 59. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el vector está encapsulado en una preparación liposómica. 60. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el vector es un vector viral. 61. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el vector viral es un vector retroviral . 62 . El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el vector viral es un vector alfaviral . 63 . El método de conformidad con la reivindicación 55 , caracterizado porque el suj eto es un mamífero . 64 . El método de conformidad con la reivindicación 63 , caracterizado porque el mamífero es un humano . 65 . El método de conformidad con la reivindicación 55 , caracteri zado porque la transfeccion se reali za ex vivo y las células transí ectadas se reintroducen en el suj eto . 66 . El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la transfeccion se realiza in vivo en el sujeto. 67 . El método de conformidad con la reivindicación 55 , caracterizado porque la respuesta inmunológica es una respuesta inmunológica humoral . 68 . El método de conformidad con la reivindicación 55 ,__-caracteri zado= porque" a~~ éspuesta "inmunológica sea una respuesta inmunológica celular . 69 . El método de conformidad con la reivindicación 55 a 68, caracterizado porque el vector de suministro en gen se administra por vía intramuscular, intranucosal, intranasal, subcutánea, intradérmica, transdérmica, intravaginal, intrarrectal , oral o intravenosa. 70 . Un método para inducir una respuesta inmunológica en un suj eto , caracterizado porque comprende : (a) administrar una primera composición que comprende un pol inucleótido de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9 en una etapa de cebado, y (b) administrar una segunda composición que comprende un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 10 a 19, como un refuerzo, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunológica en el suj eto . 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la primera composición o la segunda composición comprende además un adyuvante. 72. Un anticuerpo caracterizado porque se produce por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 44. 73. Un método para identificar un epitopo involucrado en la neutralización de VIH, el método está caracterizado porque comprende la etapa de identificar un epitopo^imido¾-a^~Tan^antlrcue b, de conformidad con la reivindicación 72. 74. Un método para producir anticuerpos que se unen a epitopos crípticos de Env de VIH, el método se caracterizado porque comprende la etapa de: administrar un epitopo identificado de conformidad con el método de conformidad con la reivindicación 73, a un sujeto bajo condiciones que permiten la producción de anticuerpos en el sujeto.