CN101426937A - 包含cd4最小组件的融合蛋白及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了包含CD4最小组件的融合蛋白，所述CD4最小组件结合于非CD4主链中的HIV Env多肽。本发明还描述了这些融合蛋白与Env形成的复合物，并且还提供了采用所述多核苷酸和多肽进行诊断、治疗和预防的方法。

Description

包含CD4最小组件的融合蛋白及其使用方法

相关申请

本申请要求美国临时申请60/578,151(提交于2004年6月8日)和美国临时申请60/578,211(提交于2004年6月8日)的优先权。上述的申请以其全文纳入本文作为参考。

技术领域

本发明总体上涉及包含人CD4 Env结合区的至少一部分的蛋白质。本文所述的蛋白质结合于HIV Env蛋白(例如单体或低聚的gp120、gp140或gp160)，并引起Env蛋白中的构象变化，从而暴露出参与Env-CD4与趋化因子受体结合的保守隐藏表位。本发明还涉及采用这些分子来引发对众多HIV亚型的免疫应答的方法。

关于政府支持的声明

本申请是在美国NIAID-NIH HIVRAD的第5P01 AI48225-03号奖助金的支持下完成的。因此，美国政府对本发明享有一定的权利。

发明背景

人免疫缺陷病毒(HIV-1，也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV)是一种获得性免疫缺陷综合征(AIDS)及相关病症的病原。(参见例如Barre-Sinoussi等，(1983)Science 220：868-871；Gallo等，(1984)Science 224：500-503；Levy等，(1984)Science 225：840-842；Siegal等，(1981)N.Engl.J.Med.305：1439-1444；Guyader等，(1987)Nature 326：662-669)。

HIV-1、HIV-2和SIV包膜蛋白是一种约160kd的糖蛋白(gp160)。在宿主细胞受到病毒感染期间，gp160经宿主细胞蛋白酶切割形成gp120和整合膜蛋白gp41。gp41部分锚定在病毒体的双层膜中，而gp120片段则突出于周围环境中。gp120和gp41更为共价地连接，可从病毒体和受感染细胞的表面释放出游离的gp120。此外，一旦结合到Env多肽的受体(即CD4)上，Env多肽发生明显的结构重排。在该构象变化之后，暴露出CCR5复合受体(co-receptor)。然后由CCR5结合位点的暴露介导病毒进入宿主细胞。参见例如Wyatt，R.等(1998)Nature 393：705-711；Kwong，P.等(1998)Nature 393：648-659。

Env似乎是诱导对HIV的体液免疫应答的主要靶标。然而，已知抗gp120的抗体通常不具有广泛的抗不同HIV株的抗体应答，且不会诱导中和抗体的产生。参见例如Javaherian，K.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86：6786-6772；Matsushita，M.等(1988)J.Virol.62：2107-2144；Putney，S.等(1986)Science234：1392-1395；Rushe，J.R.等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：3198-3202；Matthews，T。(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83：9709-9713；Nara，P.L.等(1988)J.Virol.62：2622-2628；Palker，T.J.等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：1932-1936)。

并且，虽然中和抗体通常是在人体中发生HIV感染的情况下产生，这些抗体不能提供持久的抗病毒效果，其部分原因可能在于＂中和逃避＂病毒突变体的产生以及与致病相关的宿主免疫系统总体上的降低。参见例如Barre-Sinoussi，F.等(1983)Science 220：868-871；Robert-Guroff，M.等(1985)Nature(伦敦)316：72-74；Weis，R.等(1985)Nature(伦敦)316：69-72；Weis，R.等(1986)Nature(伦敦)324：572-575。虽然如此，仍然广为支持初期HIV-1暴露后存在的预先存在的中和抗体可能具有保护作用，例如通过与侵入的病毒体接触和降低或防止它们对靶细胞的感染性并防止组织培养物中病毒从细胞到细胞的传播。参见例如Hu等，(1992)Science 255：456-459；Burton，D.，R.和Montefiori，D.(1997)AIDS11(增刊A)：587-598；Montefiori和Evans(1999)AIDS Res.Hum.Ret.15(8)：689-698；Bolognesi，D.P.等(1994)Ann.Int.Med.8：603-611；Haynes，B.，F.等(1996)Science；271：324-328。

已鉴别了多类可能有效的中和抗体。例如，从大部分受感染的个体中鉴别出了干扰gp120和CD4结合的众多活性抗体的亚型。参见例如Kang，C.-Y.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA。88：6171-6175；McDougal，J.S.等(1986)J.Immunol.137：2937-2944。单克隆抗体，例如IgG1b12、2G12(Mo等，(1997)J.Virol71：6869-6874)、PA14(Trkola等，(2001)J Virol.75(2)：579-88)以及2F5均具有中和效果。还可参见，Trkola等，(1995)J.Virol.69：6609-6617；D’Sousa等(1997)J.Infect.Dis.175：1062-1075。确信在CD4结合于Env之后，其它抗体也可结合于趋化因子受体结合区。参见例如Thali等，(1993)J.Virol.67：3978-3988)。此外，为了产生针对仅在结合CD4后暴露的CD4结合位点区的抗体，多个研究组已尝试通过给予Env与CD4结合的复合物(例如可溶性CD4，称为＂sCD4＂)或Env与CD4模拟物结合的复合物(例如CD4M33)来产生中和抗体。参见例如Martin等，(2003)Nat Biotechnol.21(1)：71-76。

此外，WO 04/037847中描述了可用于产生免疫应答的Env-CD4复合物。可推测，通过靶向结合于CD4后暴露在Env蛋白中的构象表位，Env-CD4(sCD4)复合物能够诱导众多的中和抗体。然而，如果将sCD4与佐剂一起给予的话，需要认真考虑发生自身免疫应答的可能性。此外，WO 04/037847中描述了杂交Env-CD4多肽。

除了上述的进展以外，仍然需要例如在作为疫苗给药时，能够在对象中引发针对多种HIV株和亚型的免疫应答的其它分子(例如中和和/或保护性抗体)。本发明通过提供与新型的、包含CD4小蛋白或同效物(模拟物)的融合蛋白复合的修饰Env多肽(例如gp120)以暴露CD4结合位点中或附近的表位来解决这些和其它问题。

发明概述

本发明通过提供在非CD4骨架(主链)中包含CD4 Env结合区(CD4最小组件)的融合蛋白来解决这些和其它问题。该融合蛋白的总体结构模拟了天然CD4的构象，因此具有以已知结合于Env的形式存在的CD4最小组件。CD4与Env的结合导致了Env的构象变化，该变化看起来暴露出最易产生中和抗体的表位。因此，通过采用非CD4骨架中的CD4最小组件，本文所述的融合分子可使得用于抗CD4-Env的有用抗体得以产生(包括中和抗体和其它免疫应答)，同时降低或避免不为所需的对CD4的非Env结合区的免疫应答。还提供了Env与本文所述融合蛋白的复合物，以及抗这些融合蛋白的抗体。

因此，在一个方面中，本发明包括含有CD4最小组件和一种或多种异源多肽序列的融合蛋白。在某些实施方式中，所述一种或多种异源多肽序列在结构上类似于CD4的一个或多个区域(例如获自假结核耶尔森氏菌Yesiniapseudotuberculosis的透明质酸酶多肽的一个或多个区域)。所述CD4最小组件优选为人CD4序列。在某些实施方式中，该融合蛋白还包含一种或多种其它多肽，例如免疫调制多肽(细胞因子等等)，和/或一种或多种Env多肽。

在另一方面，本发明包括本文所述的融合蛋白与HIV Env多肽的复合物。优选地，形成所述复合物以使得隐藏表位在Env多肽中暴露。可通过以下方式使得HIV Env多肽和CD4蛋白复合：交联(例如使用甲醛)；使用固定剂(例如福尔马林)；和/或在适宜的条件下自发地复合。

在另一方面，本发明包括编码任何包含本文所述融合蛋白的CD4小蛋白的多核苷酸。在某些实施方式中，所述CD4编码多核苷酸序列是插入(或嵌入)编码异源(例如透明质酸酶)多肽的序列中的，例如从而使得所述融合蛋白的总体结构类似于天然CD4。任选地，可在本文所述的融合蛋白中包含其它序列。另外，当本文所述的任何多核苷酸表达时，所述融合蛋白优选与HIV Env多肽复合，从而使得隐藏表位暴露于Env多肽中。

在还有另一方面，本发明包括含有任何本文所述的多核苷酸和/或多肽的免疫原性组合物。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含一种或多种佐剂。

在还有的另一方面中，本发明包括含有任何本文所述的多核苷酸和/或多肽的细胞。所述多核苷酸序列优选操作性连接于与在所选细胞中表达相容的控制元件。所述细胞可为例如：哺乳动物细胞(例如PERC.6、BHK、VERO、HT1080、293、RD、COS-7和CHO细胞)；禽类细胞(例如

细胞)；昆虫细胞(例如粉纹夜蛾Trichoplusia ni(Tn5)或Sf9细胞)；细菌细胞；酵母细胞；植物细胞；抗原递呈细胞；选自以下的淋巴细胞：巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、干细胞或其祖细胞；原代细胞；无限增殖细胞；和/或肿瘤衍生的细胞。

在另一方面，本发明包括用于哺乳动物对象中的基因递送载体，包括用于所述对象的适宜的基因递送载体，其中所述载体包含操作性连接于与对象中表达相容的控制元件的任何本文所述的多核苷酸。

在还有另一方面，本发明包括一种产生结合于HIV Env隐藏表位的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：在允许对象中产生抗体(例如中和抗体、单克隆抗体、多克隆抗体)的条件下，将本文所述的任何多肽给予对象。在某些实施方式中，随后对所述对象中产生的抗体进行分离。

在还有的另一方面中，本发明包括一种产生任何本文所述的融合蛋白的方法，所述方法包括：在适于产生所述融合蛋白的条件下，孵育任何本文所述的细胞。

在还有的另一方面中，本发明包括一种产生本文所述的任一种融合蛋白与HIV Env的复合物的方法，所述方法包括：在适于产生融合蛋白与HIV Env的复合物的条件下，孵育本文所述的融合蛋白(或编码所述融合蛋白的多核苷酸)。

在还有另一方面，本发明包括一种在对象中诱导免疫应答(例如体液应答例如中和抗体应答和/或细胞免疫应答)的方法，所述方法包括：给予对象其量足以在所述对象中诱导免疫应答的任一本文所述的多核苷酸、多肽和/或免疫原性组合物。在某些实施方式中，所述方法包括：离体转染细胞并将该转染细胞重新导入所述对象中。在另一实施方式中，所述方法包括，例如，在与所述表达盒在所述对象中的表达和多肽在所述对象中的产生相容的条件下，通过将任一本文所述的多核苷酸和/或基因递送载体递送入所述对象进行DNA免疫。在另一实施方式中，所述方法包括：(a)在初免步骤中给予包含任一本文所述的多核苷酸的第一组合物；(b)以足以在对象中诱导免疫应答的量给予包含任一本文所述的多肽的第二组合物，作为增强剂。在本文所述的任一方法中，所述载体可包含非病毒载体或病毒载体。示例性的病毒载体包括但不限于：α病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。另外，可采用例如微粒运载体(例如包被在金或钨微粒上，并可使用基因枪将所述包被的颗粒递送入所述对象)或包封在脂质体制剂中来导入所述多核苷酸和/或载体。在本文所述的任何方法中，所述对象可为哺乳动物，例如人或非人哺乳动物，所述导入可通过如下方式进行：肌内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服和/或静脉内方式。

本发明中包括了以下的实施方式：

1.一种融合蛋白，其包含与HIV Env结合的CD4最小组件以及一种或多种异源多肽序列，其中所述融合蛋白的三级结构与天然的CD4具有结构相似性。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD4最小组件包含CD4的15-85位残基。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述一种或多种异源多肽获自肺结核耶尔森氏菌的透明质酸酶。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其具有图7或图8所示的序列。

5.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其还包含其它的异源多肽。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述其它的异源多肽选自：病毒多肽、免疫调制多肽或细菌多肽。

7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述其它的异源多肽是病毒多肽，且所述病毒是HIV。

8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽是HIV Env多肽。

9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述HIV Env多肽包括gp140或gp120。

10.一种编码权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。

11.一种多肽复合物，其包含与权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白复合的HIV Env多肽。

12.如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和CD4蛋白是采用固定剂或通过交联复合的。

13.如权利要求12所述的多肽，其特征在于，所述固定剂包括福尔马林。

14.如权利要求12所述的多肽，其特征在于，所述固定剂包括福尔马林。

15.如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和CD4蛋白是自发复合的。

16.如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽包括低聚的gp140。

17.如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽包括gp120。

18.如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述融合蛋白如图7所示。

19.如权利要求11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和所述融合蛋白是采用甲醛交联的。

20.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-9中所述的融合蛋白。

21.一种免疫原性组合物，其包含权利要求11-19中所述的多肽复合物。

22.如权利要求20或21所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

23.一种细胞，其包含权利要求10所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸序列操作性连接于与所选细胞中表达相容的控制元件。

24.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。

25.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自：BHK、VERO、HT1080、293、RD、COS-7或CHO细胞。

26.如权利要求25所述的细胞，其特征在于，所述细胞是CHO细胞。

27.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是昆虫细胞。

28.如权利要求27所述的细胞，其特征在于，所述细胞是粉纹夜蛾(Tn5)或Sf9昆虫细胞。

29.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是细菌细胞。

30.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是酵母细胞。

31.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是植物细胞。

32.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是抗原递呈细胞。

33.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是选自下组的淋巴细胞：巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、或其干细胞或祖细胞。

34.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是原代细胞。

35.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是无限增殖细胞。

36.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是肿瘤衍生的细胞。

37.一种用于哺乳动物对象中的基因递送载体，其包含：

一种适用于所述对象的基因递送载体，其中所述载体包含权利要求10所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸序列是操作性连接于与在所述对象中的表达相容的控制元件。

38.一种产生结合于HIV Env隐藏表位的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

在允许在对象中产生抗体的条件下，将权利要求21或22所述的多肽给予对象。

39.如权利要求38所述的方法，其还包括分离在所述对象中产生的抗体的步骤。

40.如权利要求38或39所述的方法，其特征在于，所述抗体是中和抗体。

41.如权利要求38-40所述的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。

42.如权利要求38-40所述的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。

43.一种产生包含与CD4蛋白复合的HIV Env的多肽的方法，所述方法包括：

在用于产生所述多肽的条件下，孵育权利要求23-36中细胞。

44.一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：给予足以在所述对象中诱导免疫应答的量的权利要求20-22所述的组合物。

45.一种对对象进行DNA免疫的方法，所述方法包括：

在与所述表达盒在所述对象中的表达相容的条件下，将权利要求37所述的基因递送载体导入所述对象。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述基因递送载体是非病毒载体。

47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，采用微粒运载体递送所述载体。

48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述载体包被在金或钨颗粒上，且将所述颗粒采用基因枪递送给所述对象。

49.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述载体包封在脂质体制剂中。

50.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒载体。

52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体。

53.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

55.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括：

在允许所述多核苷酸表达和产生所述多肽的条件下，用权利要求45所述的转染所述对象的细胞，从而引发对所述多肽的免疫应答。

56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述载体是非病毒载体。

57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述载体是采用微粒运载体递送的。

58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述载体是包被在金或钨颗粒上的，且所述包被的颗粒是采用基因枪递送到所述脊椎动物细胞的。

59.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述载体是包封在脂质体制剂中的。

60.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。

61.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒载体。

62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体。

63.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

65.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述转染是离体进行的，且所述转染细胞被重新导入所述对象。

66.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述转染是在所述对象的体内进行的。

67.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是体液免疫应答。

68.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是细胞免疫应答。

69.如权利要求55-68所述的方法，其特征在于，所述基因递送载体是通过肌内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内给予的。

70.一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)在初免步骤中给予包含权利要求10所述的多核苷酸的第一组合物；

(b)以足以在所述对象中诱导免疫应答的量给予包含权利要求1-9所述的多肽的第二组合物，作为增强剂。

71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述第一组合物或第二组合物还包含佐剂。

72.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述第一组合物还包含编码HIV Gag多肽的序列。

73.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述第二组合物还包含HIVGag多肽。

通过本文的揭示，本发明的这些和其它实施方式对于本领域的技术人员而言将会是很容易理解的。

附图简述

图1A(SEQ ID NO：1)描述了人CD4蛋白的基本氨基酸序列(GenBank登录号：NP_000607)。

图1B(SEQ ID NO：4)描述了人CD最小组件的基本氨基酸序列。

图2A(SEQ ID NO：2)描述了获自肺结核耶尔森氏菌(Yersiniatuberculosis)的透明质酸酶蛋白的基本氨基酸序列(GenBank登录号：AAA27632和A29646)。

图2B(SEQ ID NO：5)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第737-751号残基)的基本氨基酸序列。

图2C(SEQ ID NO：6)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第584-595号残基)的基本氨基酸序列。

图2D(SEQ ID NO：7)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第503-595号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO：7也称为透明质酸酶的结构域1(D1)。

图2E(SEQ ID NO：8)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第596-694号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO：8也称为透明质酸酶的结构域2(D2)。

图2F(SEQ ID NO：9)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第695-795号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO：9也称为透明质酸酶的结构域3(D3)。

图2G(SEQ ID NO：10)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第796-888号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO：10也称为透明质酸酶的结构域4(D4)。

图2H(SEQ ID NO：11)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第503-694号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO：11包含D1(SEQ ID NO：7)和D2(SEQ ID NO：8)。

图2I(SEQ ID NO：12)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第503-795号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO：12包括D1(SEQ ID NO：7)；D2(SEQID NO：8)和D3(SEQ ID NO：9)。

图2J(SEQ ID NO：13)描述了图2A所示透明质酸酶蛋白的片段(第503-888号残基)的基本氨基酸序列。SEQ ID NO：13包括D1(SEQ ID NO：7)；D2(SEQID NO：8)；D3(SEQ ID NO：9)和D4(SEQ ID NO：10)。

图3(SEQ ID NO：3)描述了编码透明质酸酶的多核苷酸(GenBank登录号：M17448)。

图4是描述涉及gp120结合的CD4小蛋白的示意图。所示CD4最小组件(深灰色)对应于SEQ ID NO：1的第15-85号残基，其通过Cys16和Cys84间存在的二硫键获得结构稳定化。

图5是比较CD4的三级结构(顶部)与透明质酸酶(底部)的示意图。CD4最小组件以深灰色表示。

图6A和6B是描述CD4的各区域与透明质酸酶的结构相似性的示意图。图A显示了CD4第1-14号残基(右侧)和透明质酸酶第737-751残基(左侧)之间的结构相似性。图B显示了CD4的第78-109号残基(左侧)和透明质酸酶第576-603号残基(右侧)之间的结构相似性。

图7是描述本文所述的示例性融合蛋白的示意图，所述融合蛋白包括在含透明质酸酶片段的单一蛋白质中的CD4最小组件(深灰色)。

图8A-D是描述本文所述的其它示例性融合蛋白的示意图，所述融合蛋白包括CD4最小组件(深灰色)，该CD4最小组件的侧翼为透明质酸酶多肽片段。透明质酸酶的第737-751号残基用条纹表示。第584-595号残基以带点的条状表示，而其它透明质酸酶片段(第503-888号残基或其片段)为浅灰色。

详细描述

除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员熟知的蛋白质化学、病毒免疫生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术在文献中有全面的说明。参见例如T.E.Creighton，＂蛋白质：结构和分子特性”，Protein： Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；NelsonL.M.和Jerome H.K.＂分子药物方法中HIV策略”，HIV Protocols in Methods inMolecular Medicine，第17卷，1999；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1989)；F.M.Ausubel等，＂分子生物学现有方法”，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates & Wiley Interscience New York；和Lipkowitz和Boyd，＂计算化学综述”，Reviews in Computational Chemistry，第1卷-现刊(Wiley-VCH，New York，New York，1999)。

必须注意的是：在本说明书和所附的权利要求书中所用的单数形式＂一个＂、＂一种＂和＂所述＂包括所涉及对象的复数，除非该内容清楚地另有说明。因此，例如作为参考＂一个多肽＂包括两个或多个多肽的混合物等。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请，不论在上文中或下文中，均以其全文作为参考纳入本文。

定义

在本发明的描述中使用了以下术语，这些术语将具有如下所述的定义。

术语＂多肽＂和＂蛋白质＂在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的任意聚合物。该术语包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。这些多肽可衍生自天然来源或可为合成或重组产生的。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。

本文所定义的多肽通常由20种天然氨基酸组成：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)，也可包括任何多种已知氨基酸类似物，不论是天然存在的或是合成的类似物，例如但不限于：高异亮氨酸、氮亮氨酸(asaleucine)、2-(亚甲基环丙基)甘氨酸、S-半胱氨酸甲酯、S-(丙烯-1-基)半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、正赖氨酸、正缬氨酸、高精氨酸、3-(3-羧基苯基)丙氨酸、环己基丙氨酸、含羞草氨酸、六氢哌啶羧酸、4-甲基谷氨酸、刀豆氨酸、2，3-二氨基丙酸等。在下文中对可用于本发明的多肽因子的其它例子进行说明。

术语＂肽＂还包括含有非天然存在的肽样分子的蛋白质，包括但不限于类肽。类肽是一类易于合成的肽模拟寡聚物，其在结构上高度不同，而对酶解和化学降解是稳定的(Miller，S.M.等＂同源肽和N-取代的甘氨酸类肽寡聚物的蛋白水解研究”，Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted GlycinePeptoid Oligomers.Bioorg.Med.Chem.Lett.(1994)，4，2657-2662)。类肽结构中可掺入数百种不同的侧链，包括极性、活性甚至是杂环官能度[Zuckermann，R.N.，Kerr，J.M.，Kent，S.B.H.& Moos，W.H.＂通过亚单体固相合成制备类肽[寡(N-取代的甘氨酸)]的有效方法”，Efficient Method for the Preparation ofpeptoid[Oligo(N-substituted glycines)]by Submonomer Solid Phase Synthesis.J.Am.Chem.Soc.(1992)，114，10646-10647；Figliozzi，G.M.，Goldsmith，R.，Ng，S.，Banville，S.C.& Zuckermann，R.N.，＂N-取代的甘氨酸类肽文库的合成”，Synthesis of N-(substituted)Glycine Peptoid Libraries.Methods Enzymol.(1996)，267，437-447；Burkoth，T.S.，Fafarman，A.T.，Charych，D.H.，Connolly，M.D.& Zuckermann，R.N.＂通过固相亚单体合成将未保护的杂环侧链掺入类肽寡聚物中”，Incorporation of Unprotected Heterocyclic Side Chains into PeptoidOligomers via Solid-Phase Submonomer Synthesis.J.Am.Chem.Soc.(2003)，125，8841-8845；Uno，T.，Beausoleil，E.，Goldsmith，R。A.，Levine，B.H.& Zuckermann，R.N.＂用于聚N-取代的甘氨酸(类肽)的新亚单体”，NewSubmonomers for Poly N-Substituted glycines(Peptoids).Tetrahedron Lett.(1999)，40，1475-1478]。可有效掺入众多种类的结构特征的能力使得生物类似寡聚物得以迅速合成，同时还具有比天然肽好很多的化学多样性。因此，本发明的肽(例如CD4最小组件、透明质酸酶衍生的多肽、其融合物)可包括一种或多种类肽。

多肽或蛋白质的＂几何形状＂、＂结构＂或＂三级结构＂是指该蛋白质的整体三维结构。如本文所述，可通过例如以下的方法来确定所述几何形状：晶体学研究、或者采用基于构成一级结构和二级结构的氨基酸间相互作用来预测几何形状的各种程序或算法。

＂野生型＂或＂天然＂多肽、多肽试剂或多肽药物是指天然存在的多肽序列，及其相应的二级结构。＂分离的＂或＂纯化的＂蛋白质或多肽是一种从整个有机体中分离和分立出来的蛋白质，在该有机体中所述蛋白质本质上是正常地结合的。显而易见，该术语表示了各种纯度水平的蛋白质。典型的含纯化蛋白的组合物应是所述组合物中全部蛋白质中的至少约35％，优选至少约40-50％，更优选至少约75-85％，最优选至少约90％或更多是所讨论的蛋白质。

术语＂CD4小蛋自＂、＂CD4最小组件＂和＂小CD4蛋白＂可互换使用，表示与env相互反应的任何多肽，优选由此暴露出CD4和/或一个或多个趋化因子受体结合位点中或附近的功能性表位(例如隐藏表位)。因此，CD小蛋白可小于CD4片段的全长，包括了截短和缺失。此外，该术语包括了CD4片段的功能和结构同源物，即暴露Env蛋白上的隐藏表位的多肽。将Maddon等，(1985)细胞42:93；和Littman等，(1988)细胞55:541)中的人CD4的氨基酸序列纳入本文，并示于图1中(SEQ ID NO：1)。此外，该术语包括了包括了CD4片段的功能和结构同源物，即暴露Env蛋白上的隐藏表位的模拟物和/或多肽。参见例如Martin等，(2003)Nat.Biotech.21(1)：71-76；Vita等，(1998)Biopolymers 47(1)：93-100；Vita等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(23)：13091-13096。如上文所述，本文所述的CD4蛋白质可包含一种或多种＂类肽＂分子，例如CD4结合残基(例如Phe43和Arg59)的类肽同效物和/或通过结合入β转角诱导氨基酸(例如9-芴甲氧羰基-3-氨基-1-羧甲基己内酯)来进一步模拟CD4的β转角基序的类肽。

＂Env多肽＂是指衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIV Env的分子。HIV-1的包膜蛋白是一种约160kd(gp160)的糖蛋白。在宿主细胞受到病毒感染期间，gp160经宿主细胞蛋白酶切割形成gp120和整合膜蛋白gp41。gp41部分锚定于(和跨越)病毒体的双层膜，而gp120片段则突出于周围环境中。由于gp120和gp41间没有共价连接，可从病毒体和受感染细胞的表面释放出游离的gp120。Env多肽还可包括gp140多肽。Env多肽可作为单体、二聚体或多聚体存在。

＂gp120多肽＂是指衍生自Env多肽的gp120区的分子。所述gp120多肽优选衍生自HIV Env。gp120的基本氨基酸序列具有约511个氨基酸，其多肽核心约为60,000道尔顿。通过N连接糖基化对所述多肽进行大幅的修饰，以将其表观分子量提高到120,000道尔顿。gp120的氨基酸序列包含由5个超变区隔开的5个相对保守区。HIV-1_HXB-2(以下称＂HXB-2＂)株gp120基本序列中的18个半胱氨酸残基和gp120序列中约24个N连接糖基化位点中的13个在大多数gp120序列(即便不是在所有gp120序列)中的位置是相同的。超变区含有广泛的氨基酸取代、插入和缺失。除了这一变异，大多数(即便不是所有)gp120序列保持了病毒的结合于病毒受体CD4的能力。＂gp120多肽＂包括单个亚单元和/或多聚体。

Env多肽(例如gp120、gp140和gp160)包括由4个反向平行β-链(strand)(β-2、β-3、β-20和β-21)构成的＂桥接片层＂，形成β片层。由β链中的一对(β-2和β-3)推挤出两个环：V1和V2。相对于HXB-2，β-2片层大致存在于第119号氨基酸残基(Cys)到第123号氨基酸残基(Thr)，而β-3在大致存在于第199号氨基酸残基(Ser)到第201号氨基酸残基201(Ile)。相对于HXB-2，＂V1/V2区＂大致存在于第126位氨基酸残基(Cys)到第196号氨基酸残基(Cys)。(参见例如Wyatt等，(1995)J.Virol.69：5723-5733；Stamatatos等，(1998)J.Virol.72：7840-7845)。由第二对β链(β-20和β-21)推挤出的是＂小环＂结构，在本文中也称为＂桥接片层小环＂。在HXB-2中，β-20从约第422号氨基酸残基(Gln)延伸到第426号氨基酸残基(Met)，而β-21则从约第430号氨基酸残基(Val)延伸到第435号氨基酸残基(Tyr)。在变体SF162，Met-426是Arg(R)残基。相对于HXB-2，所述＂小环＂从约第427号氨基酸残基(Trp)延伸到第429号氨基酸残基(Lys)。可相对于其它变体(例如HXB-2)，按例如WO 00/39303中所述，测定任何HIV变体的Env多肽gp160氨基酸序列的比对。

此外，本文所定义的＂Env多肽＂或＂gp120多肽＂不限于具有本文所述的确切序列的多肽。事实上，HIV基因组处于一种持续变化的状态中，并包含在各种隔离群间具有相对较高程度的变异性的多种可变区。很容易明白该术语包括了获自任何已鉴别的HIV隔离群中的Env(例如gp120)多肽、新鉴别的隔离群以及这些隔离群的亚型。本文中参考HXB-2对结构特征进行描述。本领域普通技术人员通过本文公开的内容和现有技术，采用例如序列比对程序(例如BLAST和本文中所述的其它程序)或对结构特征进行的鉴别和比对(例如本文所述的可用于鉴别β片层区的程序如＂ALB＂)能确定其它HIV变体的相应区域(例如隔离群HIV_IIIb、HIV_SF2、HIV-1_SF162、HIV-1_SF170、HIV_LAV、HIV_LAI、HI_VMN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4，获自不同亚型(例如亚型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亚型(例如HIV-2_UC1和HIV-2_UC2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV)〕。(参见例如以下文献中对这些和其它相关病毒的描述：Virology，第三版(W.K.Joklik编，1988)；Fundamental Virology，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)；Virology，第三版(Fields，BN，DM Knipe，PM Howley编，1996，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA)。修饰Env多肽的实际氨基酸序列可基于任何HIV变体。

另外，术语＂Env多肽＂(例如＂gp120多肽＂)包括了含有对天然序列的其它修饰的蛋白质，例如其它内部缺失、插入和取代。这些修饰可经仔细考虑，如通过定点诱变，或可为偶然的，例如通过自然发生的突变事件。因此，例如如果要将Env多肽用于疫苗组合物中时，所述修饰必须不会导致免疫活性(即，引发对所述多肽的抗体应答的能力)的丧失。类似地，如果要将所述多肽用于诊断目的时，必须保留这一能力。

因此，＂修饰的Env多肽＂是一种已与含有本文所述CD4最小组件的融合蛋白复合的Env多肽(例如如上所述的gp120)。该Env多肽可为单体或寡聚物。通常，复合Env(例如gp120)多肽使得CD4结合位点中或附近的表位暴露出来，并使得Env多肽得以正确折叠(例如形成正确的几何形状)。此外，还可对V1和V2环区进行修饰(例如截短)。虽然本文中没有穷举所用可能的V1/V2修饰，应理解的是本发明中也包括了其它断裂修饰。

术语＂融合分子＂是指其中具有通常为共价或非共价连接的两种或多种亚单位的分子。所述亚单位分子可为相同化学类型的分子，或可为不同化学类型的分子。因此，如本文中所用，该术语是指包含CD4最小组件和至少一种异源非CD4多肽的任何分子。融合分子包括但不限于：融合多肽(例如，CD4多肽和非CD4多肽间的融合体)以及融合核酸(例如，编码融合多肽的核酸)。当用于指代含有一个或多个CD4最小组件的蛋白质时，术语＂融合蛋白＂或＂融合多肽＂是指其中所含CD4氨基酸序列(例如Env结合序列)和一种或多种异源(非CD4)多肽是在单一蛋白中表达的多肽。所述一种或多种CD4多肽可在一侧或双侧与所述一种或多种异源多肽侧接。可用于构建具有本文所述CD4最小组件的融合分子的异源(非CD4)氨基酸序列的非限制性的例子包括：具有与天然的CD4相似的三级结构的蛋白质或其片段或衍生物。例如，具有相容三级结构的适宜的异源蛋白包括：肺结核耶尔森氏菌蛋白透明质酸酶的片段。野生型透明质酸酶氨基酸序列示于图2中(SEQ ID NO：2)。也可参见，Isberg等，(1987)Cell50(5)：769-778；GenBank登录号：AAA27632和A29646。用于构建本文所述的融合蛋白的透明质酸酶片段的非限制性例子包括：从约第506号氨基酸残基延伸到约第599号氨基酸残基的区域；从约第737号氨基酸残基延伸到约第751号氨基酸残基的区域；从约第576号氨基酸残基延伸到约第603号氨基酸残基的区域；和/或从约第584号氨基酸残基延伸到约第595号氨基酸残基的区域。很明显的是可例如通过缺失、添加或取代，相对于野生型改变一个或多个残基。另外，可用非天然存在的残基(例如类肽)来取代一种或多种天然存在的氨基酸残基。

＂结合＂是指融合分子的一种能力，该能力是融合分子与Env多肽发生特异性相互作用，从而由该相互作用导致所述Env多肽发生构象变化，而该构象变化则使得可使中和抗体更易产生的Env表位暴露出来。

正常情况下，融合蛋白能分泌入培养有表达该蛋白质的生物体的生长培养基中。然而，出于本发明的目的，也可在胞内回收这些多肽。可采用多种检测技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳等)和免疫技术(例如免疫印迹法和免疫沉淀分析法，如国际申请WO 96/04301中所述)很容易地测定分泌入生长培养基的分泌物。

在细胞中发现与所述细胞中的成分结合(例如与内质网(ER)或高尔基体结合)的多肽(例如gp120或其它Env多肽)时，或所述多肽存在于可溶性细胞成分中时，认为该多肽是＂胞内”产生的。本发明的多肽还可分泌入生长培养基，只要细胞内还保留了足量的所述多肽，从而可采用本文所述的技术将其从细胞裂解物中纯化出。

＂免疫原性分子＂或＂免疫原性组合物＂是指包含至少一个表位的分子，从而使得该分子能在被给予该蛋白的个体中引发免疫反应，或者在诊断的情况下，该分子能与抗所讨论的HIV的抗体反应。

＂表位＂是指特异性B细胞和/或T细胞能对其发生应答的抗原位点，使得包含这一表位的分子能引发免疫反应或能与生物样品中存在的HIV抗体反应。该术语还可与＂抗原决定簇＂或＂抗原决定簇位点＂互换使用。表位可包含以该表位独有的空间构象存在的3个或更多个氨基酸。通常，表位由至少5个此类氨基酸构成，更常见的是由至少8-10此类氨基酸构成。测定氨基酸空间构象的方法是本领域已知的，包括例如：X射线衍射晶体分析法和二维核磁共振。此外，可采用本领域熟知的技术很容易地完成给定蛋白质中表位的鉴别，例如通过采用疏水性研究和通过定点血清学研究。也可参见，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：3998-4002(快速合成肽以测定给定抗原中免疫原性表位的常规方法)；美国专利4,708,871(用于鉴别和化学合成抗原表位的方法)；以及Geysen等，Molecular Immunology(1986)23：709-715(鉴别对给定抗体具有高亲和力的肽的技术)。可在显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的单个免疫分析中鉴别识别相同表位的抗体。＂隐藏表位＂通常是指仅在蛋白质的某些构象中暴露出来的表位。

＂功能性表位＂是指可诱导防止或限制HIV感染的抗体产生的表位。在一个具体实施方式中，所述抗体是中和抗体。在另一实施方式中，所述抗体可例如引发ADCC应答。

本文所用的＂免疫学应答＂或＂免疫应答＂可包括当疫苗组合物中存在Env(例如gp120)多肽时，在对象中发生对该多肽产生的体液和/或细胞免疫应答。在免疫应答中产生的抗体还可中和传染性和/或介导抗体-补体或抗体依赖性细胞毒作用，从而为受免疫的宿主提供保护。可采用本领域熟知的标准免疫分析法测定免疫学反应性，例如通过竞争分析法。

本文所用术语＂抗体＂包括获自多克隆和单克隆制剂以及下述物质的抗体：(i)杂交(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等，(1991)Nature 349：293-299；和美国专利4,816,567)；(ii)F(ab’)2和F(ab)片段；(iii)Fv分子(非共价异源二聚体，参见例如，Inbar等，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2659-2662；和Ehrlich等，(1980)Biochem 19：4091-4096)；(iv)单链Fv分子(sFv)(参见例如，Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)；(v)二聚和三聚抗体片段构建物；(vi)人化抗体分子(参见例如，Riechmann等，(1988)Nature332：323-327；Verhoeyan等，(1988)Science 239：1534-1536；和公开于1994年9月21日的英国专利申请GB 2,276,169)；(vii)小-抗体或小抗体(即在其C端包含寡聚区的sFv多肽链，所述寡聚区通过绞链区与所述sFv分隔；参见例如Pack等，(1992)Biochem 31：1579-1584；Cumber等，(1992)J.Immunology149B：120-126)；(vii)人抗体分子；以及(viii)获自此类分子的任何功能性片段，其中该片段保留了对亲本抗体分子特异性结合的特性。

因此，术语＂抗体＂是指含有至少一个抗原结合位点的多肽或多肽组。＂抗原结合位点＂是由一个或多个抗体分子的可变区折叠形成，形成具内表面形状和电荷分布与抗原表位的特性互补的三维结合位点，其使得特异性结合得以发生以形成抗体-抗原复合物。可由重链和/或轻链结构域(分别为VH和VL)形成抗原结合位点，其形成了对抗原结合有作用的超变环。术语＂抗体＂包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、改变的抗体、单价抗体、Fab蛋白和单结构域抗体。在很多情况下，抗体与抗原结合的现象与其它配体/抗配体结合是等价的。

如果需要得到多克隆抗体，用带有所选一个或多个表位的免疫原性多肽免疫所选哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)。收集获自受免疫动物的血清，并根据已知方法进行处理。如果含有对HCV表位多克隆抗体的血清包含对其它抗原的抗体，可通过免疫亲和色谱纯化所述多克隆抗体。产生和处理多克隆抗血清的技术在本领域中是已知的，参见例如，Mayer和Walker编(1987)《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》，IMMUNOCHEMICAL METHODS INCELL AND MOLECULAR BIOLOGY(Academic Press，伦敦)。

本领域技术人员还可很容易的生产抗HCV表位的单克隆抗体。通过杂交瘤制备单克隆抗体的常规方法是熟知的。可通过细胞融合以及其它技术例如用癌基因DNA直接转化B淋巴细胞或用埃-巴二氏病毒进行转染而产生无限增殖抗体产生细胞系。参见例如M.Schreier等，(1980)＂杂交瘤技术”HYBRIDOMATECHNIQUES；Hammerling等，(1981)，＂单克隆抗体和T细胞杂交瘤”，MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS；Kennett等，(1980)＂单克隆抗体”，MONOCLONAL ANTIBODIES；还可参见，美国专利4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。可根据所产生的抗HCV表位的单克隆抗体组的各种特性进行筛选；即根据同种型、表位亲和力等进行筛选。如本文所用＂单结构域抗体＂(dAb)是包含与指定抗原特异性结合的HL区的抗体。dAb不含VL区，但可含有已知各种抗体中存在的其它抗原结合区，例如κ和λ区。制备dab的方法在本领域中是已知的。参见例如，Ward等，Nature 341：544(1989)。

抗体也可包含VH和VL区，以及其它已知的抗原结合区。这些类型的抗体和用于其制备的方法的例子在本领域中是已知的(参见例如美国专利4,816,467)，并包括以下抗体和方法。例如，＂脊椎动物抗体＂是指脊椎动物的四聚或聚集抗体，其包含通常聚集为＂Y”形且可在链间具有或不具有共价的轻链和重链。在脊椎动物抗体中，所述链的氨基酸序列与脊椎动物中产生的那些抗体序列是同源的，不论是原位或体外产生(例如，在杂交瘤中产生)。脊椎动物抗体包括例如：纯化的多克隆抗体和单克隆抗体，它们的制备方法在下文中有所描述。

＂杂交抗体＂是其中的链分别与哺乳动物链同源并代表了它们的新组合的抗体，从而使得两种不同的抗原通过四聚体或聚合物得以沉淀。在杂交抗体中，一对重链和轻链与抗第一抗原而产生的抗体中存在的重链和轻链是同源的，而第二对链则与抗第二抗体而产生的抗体中存在的重链和轻链是同源的。这就产生了＂二价”特性，即同时结合两种抗原的能力。还可用下文所述的嵌合链来形成这些杂交体。

＂嵌合抗体＂是指其中的重链和/或轻链是融合蛋白的抗体。通常，该链氨基酸序列的一部分与衍生自具体物种或具体种类的抗体中对应的序列是同源的，而链的其余片段则与衍生自另一物种和/或种类中的序列同源。通常，轻链和重链的可变区模拟衍生自脊椎动物某一物种的可变区或抗体，而恒定部分则与衍生自另一脊椎动物物种的抗体中的序列同源。然而，该定义并不限于这一具体例子。还包括的是其中重链和轻链中的一条或两条由模拟不同来源的抗体中的序列的序列组合构成，不论这些来源是来自不同种类或不同起源物种，以及该融合点是否在可变区/恒定区界限。因此，可能产生其中的恒定区和可变区都不模拟已知抗体序列的抗体。因而使得例如构建下述的抗体成为可能：其可变区对特定抗原具有较高亲和力的抗体，或其恒定区可引发增强的补体结合的抗体，或使得具体恒定区具有的特性具有其它改进的抗体。

另一例子是＂改变的抗体＂，它是指其中在脊椎动物抗体中天然存在的氨基酸序列已被改变的抗体。采用重组DNA技术，可对抗体进行重新设计以获得所需的特性。可发生的变化是很多的，从改变一个或多个氨基酸到整个区域(例如恒定区)的重新设计。恒定区中的改变通常是为了获得所需的细胞过程特性，例如改变补体结合、与膜相互作用以及其它效应子的功能。可对可变区进行改变以改变抗原结合特性。抗体也可经工程化改造以有助于将分子或物质特异性递送到特异性的细胞或组织位点。可通过分子生物学中已知的技术进行所需的改变，例如通过重组技术、定点诱变等。

另一例子是＂单价抗体＂，它是指含有结合于第二重链的Fc(即，干)区的重链/轻链二聚体的聚合物。这类抗体可逃避抗原性调整。参见例如Glennie等，Nature 295：712(1982)。抗体定义中还包括抗体的＂Fab＂片段。＂Fab＂区是指与含有重链和轻链分枝部分的序列大致相同的那些重链和轻链部分或类似物，已显示其可免疫结合于特定的抗原，但缺乏效应子Fc部分。＂Fab＂包括一条重链和轻链(通常称为Fab′)的聚合物，以及含有2H和2L链(称为F(ab)2)的四聚体，它们能够选择性地与指定的抗原或抗原家族反应。可将Fab抗体划分为上述的亚型类似物，即＂脊椎动物Fab＂、＂杂交Fab＂、＂嵌合Fab＂和＂改变的Fab＂。产生抗体Fab片段的方法在本领域中是已知的，这些方法包括例如：蛋白质水解和通过重组技术的合成。

＂抗原-抗体复合物＂是指由特异性结合于抗原表位的抗体形成的复合物。

测定氨基酸序列＂相似性＂的技术在本领域中是熟知的。一般而言，＂相似性＂是指对两条或多条多肽的适当位置进行精确的氨基酸与氨基酸的比较，所述的适当位置中氨基酸是相同的或具有类似的化学和/或物理性质，例如电荷或疏水性。然后可测定比对多肽序列间的所称的＂百分比相似性＂。用于测定核酸和氨基酸序列的相同性的技术在本领域中也是熟知的，包括测定基因的mRNA的核苷酸序列(通常通过cDNA中间体)以及测定由其编码的氨基酸序列，并将此与第二条氨基酸序列相比较。一般而言，＂相同性＂是指两条多核苷酸或多肽序列各自精确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸对应关系。

可通过测定两条或多条多核苷酸序列的＂百分比相同性”来对它们进行比较。同样，可通过测定两条或多条氨基酸序列的＂百分比相同性”来对它们进行比较。两条序列间的百分比相同性(不论是核酸或肽序列)通常描述为两条比对序列间的精确配合数除以较短序列的长度，然后乘以100。可通过Smith和Waterman，＂应用数学进展”，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)中的局部同源性算法来提供对核酸序列的大致比对。可使用Dayhoff(＂蛋白质序列和结构图谱”，Atlas of Protain Sequences and Structure，M.O.Dayhoff编，5增刊3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA)开发的评分矩阵，并通过Gribskov(Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986))所述进行标准化，将该算法延伸到用于肽序列。用于核酸和肽序列的该算法的执行方法由Genetics Computer Group(Madison，WI)在它们的BestFit应用程序中提供。用于该方法的默认参数在Wisconsin序列分析打包程序指南第8版(1995)中有所描述(可购自Genetics Computer Group，Madison，WI)。用于计算序列间百分比相同性或相似性的其它同样使用的程序在本领域中是广为所知的。

例如，可采用Smith和Waterman的同源性算法，以默认评分表和六核苷酸位点的缺口罚分来测定具体核苷酸序列与参考序列的百分比相同性。在本发明上下文中建立百分比相同性的另一种方法是使用MPSRCH程序包，其版权属于爱丁堡大学(University of Edinburgh)，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)经销。在这套程序包中，可采用Smith-Waterman算法，其中将默认参数用于评分表(例如，缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为1，一个缺口为6)。从产生的数据中，＂匹配＂值反映了＂序列相同性＂。用于计算序列间百分比相同性或相似性的其它适宜程序在本领域中是广为所知的，例如比对程序BLAST，其也可使用默认参数。例如，可可在BLASTN和BLASTP中使用以下的默认参数：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝两条；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明＝50个序列；分类依据＝HIGH SCORE；数据库＝非冗长，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译物+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。可在下述因特网址上找到这些程序的详细描述：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。

本领域的技术人员能很容易地确定适当的搜索参数以用于上述程序中的给定序列。例如，可根据所讨论序列的大小改变搜索参数。因此，例如本发明的代表性实施方式中包括具有X个邻接核苷酸的分离的多核苷酸，其中(i)所述X个邻接核苷酸与衍生自本文所述任一序列的Y个邻接核苷酸具有至少约50％的相同性，(ii)X等于Y；以及(iii)X大于或等于6个、上限为5000个核苷酸，优选10-12个氨基酸，上限为5000个核苷酸，更优选15-20个核苷酸，上限为本文所述的全长序列中存在的核苷酸数量(例如参见序列表和权利要求书)，包括所有落于上述范围内的整数值。

通常而言，当把本发明的序列用作查询序列时，本发明的多肽和/或多核苷酸能或可包括与本文所述的分子(例如与本发明要求保护的序列或其它序列)具有约80％-100％，大于80-85％，优选大于90-92％，更优选大于95％，最优选大于98％的序列(包括落于这些所述范围内的整数值)相同性的相关序列。

也存在测定特定多肽形成某种结构(例如β片层)的可能性的计算机程序。本文中所述的一个此类程序是用于蛋白质和多肽二级结构计算和预测的＂ALB＂程序。此外，可从基本氨基酸序列预测出蛋白质二级结构，例如采用蛋白质晶体结构和比对涉及晶体结构的蛋白质序列(例如采用可购自ChemicalComputing Group Inc.，Montreal，P.Q.，Canada的分子操作环境(MOE)程序)。在以下文献中描述了预测二级结构的其它方法，例如：Garnier等，(1996)Methods Enzymol.266：540-553；Geourjon等，(1995)Comput.Applic.Biosci.11：681-684；Levin(1997)Protein Eng.10：771-776；以及Rost等，(1993)J.Molec.Biol.232：584-599。

还可通过如下方法测定同源性：在可使同源区之间形成稳定双链的条件下，使多核苷酸杂交，然后用一种或多种单链特异性核酸酶消化，测定消化片段的大小。当通过上述的方法测定出两条DNA或两条多肽序列对于确定的分子长度具有至少约80％-85％，优选至少约90％，最优性至少约95％-98％的序列相同性，则这两条DNA或两条多肽序列是＂基本上同源的”。如本文所用，基本上同源还指对特定的DNA或多肽序列具有完全相同性的序列。可在例如对具体体系确定的严格条件下，在Southern杂交实验中鉴别基本上同源的DNA序列。确定适宜的杂交条件是本领域中的技术。参见例如Sambrook等，同上；＂DNA克隆”(DNA Cloning)，如前所述；＂核酸杂交”(Neucleic Hybridization)，如前所述。

＂编码序列＂或＂编码＂所选蛋白质的序列是置于适宜的调控序列的控制下时，可在体外或体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序列。所述编码序列边界是通过位于5′(氨基)端的起始密码子和位于3′(羧基)端的翻译终止密码子确定的。编码序列可包括但不限于：病毒核苷酸序列的cDNA，以及合成和半合成的DNA序列和包含碱基类似物的序列。转录终止序列可位于所述编码序列的3′处。

＂控制元件＂是启动子序列、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控区、增强子等的总称，其在总体上规定了宿主细胞中编码序列的转录和翻译。所有这些控制元件并不是都总需存在，只要所需基因能转录和翻译即可。

当RNA聚合酶能结合启动子序列和将所述编码序列转录为mRNA，并随后将所述mRNA翻译为由编码序列编码的多肽时，控制元件在细胞中＂引导编码序列的转录”。

＂操作性连接＂是指一种元件的排列方式，其中对所述元件进行配置以执行它们的常规功能。因此，操作性连接于编码序列的控制元件在RNA聚合酶的存在下能影响该编码序列的表达。所述控制元件无需与该编码序列邻接，只要控制元件起到指导编码序列表达的功能即可。因此，例如插入的未翻译但已转录的序列可存在于例如启动子序列和编码序列之间，而该启动子序列仍可被认为＂操作性连接＂于该编码序列。

＂重组体＂在本文中用于描述核酸分子时是指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，按照其来源或生产方法分为：(1)不与其天然结合的多核苷酸的全部或部分结合；和/或(2)与其天然连接以外的多核苷酸连接。术语＂重组体＂用于描述蛋白质或多肽时是指由重组多核苷酸表达而产生的多肽。＂重组宿主细胞＂、＂宿主细胞＂、＂细胞＂、＂细胞系＂、＂细胞培养物＂及用于原核微生物或真核细胞系培养物作为单细胞单元的其它此类术语可互换使用，是指能够或已经用作重组载体或其它转化DNA的受体的细胞，也包括已被转染的原代细胞的后代。应理解单个亲本细胞的后代在形态学上或基因组中可不必完全相同，或可不必与原始亲本的总DNA完全互补，这是由随机突变或刻意进行的突变造成的。通过有关特性(例如编码所需肽的核苷酸序列的存在)辨别出的与亲本足够类似的亲本细胞的后代包含在本定义所预期的后代中，并由上述的定义所覆盖。

＂脊椎动物对象＂是指脊索动物亚门中的任何成员，包括但不限于：人和其它灵长类，包括非人灵长类，例如黑猩猩和其它猿和猴的种类；畜牧动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养鸟类、野生鸟类和猎鸟，例如鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟类、鸭、鹅等。该术语不限定具体的年龄。因此，同时覆盖了成体和新生个体。

如本文所述＂生物样品＂是指从个体中分离的组织或液体样品，包括但不限于例如：血液、血浆、血清、粪便、尿、骨髓、胆汁、穿刺液、淋巴液、皮肤样品、皮肤外部分泌物、呼吸、肠内和生殖泌尿道样品、获自胃上皮和胃粘膜的样品、泪液、唾液、乳汁、血细胞、器官、活组织，以及体外细胞培养成分，包括但不限于：由培养基中细胞和组织的生长得到的条件培养基质，例如重组细胞和细胞组分。

术语＂标记＂和＂可检测标记＂是指能检测的分子，包括但不限于：放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶的底物、酶的辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素或半抗原)等。术语＂荧光剂＂是指在可检测范围中可显示荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体例子包括但不限于：荧光素、罗丹明、丹酰、伞形花内酯、得克萨斯红、鲁米诺、acradimum酯、NADPH、β-半乳糖苷酶、马辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶。

概述

本发明涉及包含CD4小蛋白的融合蛋白、这些融合蛋白与HIV Env多肽的复合物，以及制备和使用这些融合蛋白和复合物的方法。在不受限于具体的理论的条件下，由于CD4结合位点(和/或CCR结合位点)埋藏在Env的外部结构域、内部结构域和V1/V2结构域之间，因此产生针对Env的免疫应答似乎曾经很困难。因此，虽然使得V1/V2结构域缺失可使病毒更易被针对CD4位点的单克隆抗体中和，与CD4结合前Env的构象可阻止抗体应答。此外，将全长或近全长CD4(例如可溶性CD4或sCD4)用于诱导Env中的构象变化时，免疫系统还建立了针对CD4非结合部分的应答。

因此，本发明提供了融合蛋白，其中结合于HIV Env多肽的CD4片段包含在融合蛋白中。所述融合蛋白的整体结构优选类似于天然CD4的构象，但不包含可引起不为所需的免疫应答的非CD4结合表位。因此，根据其与天然CD4的结构相似性和/或它们用作免疫原和/或免疫调制因子的能力对所述非CD4异源区进行筛选。因此，这些融合蛋白在Env中引起了暴露出CD4结合位点中或附近的一个或多个表位(例如隐藏表位)的构象变化，然后使得针对Env的免疫应答(例如中和抗体应答)得以发生，而不发生对CD4的不为所需的免疫应答。

可将本文所述的多种形式的不同实施方式结合起来。

CD4最小组件

在本发明的实践中，使Env多肽与包含CD4最小组件的融合蛋白复合，以改变该Env多肽的构象以及暴露引发中和抗体的表位。

CD4的氨基酸序列是已知的(图1)，对CD4的结构研究显示该分子由4个胞外免疫球蛋白样结构域(三个结构域含有二硫键连接的环)组成。也已知gp120与其受体(CD4)的结合诱导了Env蛋白中的构象变化。然而，对于与gp120的相互作用而言，只有CD4的结构域1(D1)才是决定性的(Arthos等，(1989)细胞57(3)：469-481；Truneh等，(1991)J Biol Chem 266(9)：5942-5948)。突变分析、抗体竞争实验结合CD4三维结构信息已显示：与D1中免疫球蛋白的互补决定区2(CDR2)同源的区域在结合gp120中起到重要的作用(Ryu等，(1994)Structure2(1)：59-74，Sullivan等，(1998)J Virol 72(8)：6332-6338)。事实上，gp120：CD4复合物的结构分析证实了CD4的CDR2样环在CD4-gp120相互作用中是很关键的(Choe & Sodroski(1992)J Acquir Immune Defic Syndr 5(2)：204-210，Gizachew等，(1998)Biochemistry 37(30)：10616-10625)。

对与CD4和中和单克隆抗体17b的Fab部分复合的gp120的结晶学结构分析(Kwong等，(1998)Nature 393：648-659)表明CD4结构域D1的大表面(742 

2)与gp120上大的凹陷(800 

2)相结合。CD4界面由22个残基组成，通过混合的疏水性、静电、氢键相互作用对结合gp120发挥作用。该界面的大尺寸和复杂性使得在小分子中再现该功能性表位成为一种挑战，并解释了开发gp120-CD4相互作用的小分子抑制剂的难度。Vita等，(1998)Biopolymers 47：93-100。然而，即使在gp120-CD4相互作用表面上存在着众多的残基，对激素-受体系统的研究显示蛋白质-蛋白质界面处的结合能可能仅由少数残基主导。Clackson和Wells(1995)Science 267(5196)：383-386。

当gp120结合于CD4时，似乎也暴露出了独特的中和表位，例如由单克隆抗体CG10识别的表位(Gershoni等，(1993)Faseb J 7(12)：1185-1187)。事实上，虽然获自实验株的单体gp120蛋白引发初级隔离群中和抗体的免疫原性很差(Mascola等，(1996)J.Infect.Dis.173：340-348)，一旦结合于其CD4受体，似乎可识别暴露在Env表面的某些表位的单克隆抗体已显示出可中和不同初级隔离群。参见例如命名为17b的抗体(Thali等，(1993)J Virol 67(7)：3978-3988)。然而，采用与受体/复合受体复合的Env进行的交叉分化(cross-clade)初级隔离群中和抗体应答已对gp41融合结构域的免疫原性起到作用。Lacasse等(1999)Science 283：357-362。

此外，对评估gp120-CD4复合物作为用于诱导高亲合力和初级隔离群中和抗体的潜在疫苗候选物的尝试已受到了以下关切的阻碍：即可能会针对CD4自身产生免疫应答，并由此产生自身免疫和安全性问题。(D’Souza等，(1997)JInfect Dis.175：1056-1062，DeVico等，(1995)Virology 211(2)：583-588)。

因此，本发明采用了包含于融合蛋白中的小于全长的CD4蛋白或其衍生物，所述融合蛋白包含非CD4蛋白质或多肽。所述融合蛋白优选通过所述CD4最小组件结合于或复合于Env蛋白。在某些实施方式中，该融合蛋白的所述CD4最小组件部分包含SEQ ID NO：1的第15-85号氨基酸残基或与CD4最小组件具有结构相似性的分子(例如在Martin等，(2003)Nat.Biotech.21(1)：71-76中所述的CD4同效物)。可根据本文所述测定结构相似性。如图4所示，包含SEQ ID NO：1第15-85号氨基酸残基的CD4小蛋白几乎完全埋藏在gp120结合袋中。此外，该CD最小组件是通过存在于Cys16和Cys84间的二硫桥来稳定的。

通过本说明书，本领域的技术人员能很容易地测定与本文所述CD4最小组件具有结构和/或氨基酸相似性的氨基酸序列。此外，可对这些同系物(结构或序列)中的任何一种进行进一步的修饰。该修饰可影响结构和/或功能。例如，可对小蛋白进行氨基酸取代、添加和/或缺失，从而保护或增强gp120结合结构。

可化学合成用于本发明实施中的任一CD4分子。优选地，该合成是在允许和促进该小蛋白有效折叠为结合gp120和暴露CD4结合位点中或附近的表位的条件下进行的。例如，可在产生类似于CD4的圆二色谱的条件下合成该小蛋白，而不考虑天然序列中的突变。

异源(非CD4)多肽

为了提高本文所述CD4最小组件的稳定性，将最小组件作为异源序列中的融合蛋白表达，该异源序列具有与天然CD4相容的三级结构。通过这一方法，促进了CD4最小组件与Env的结合，同时降低了对CD4非Env结合区的不为所需的免疫应答。如本文所述，通过对结构数据库进行搜索来鉴别与野生型CD4具有结构相似性的蛋白质。

为使发生不为所需的自身免疫的风险降到最低，优选所述异源序列获自非人或非灵长类的蛋白质。另外，最好不要使用与人蛋白质在氨基酸水平上具有高度同源性的蛋白质。

图5显示了在一个或多个区域中的全部三级结构与CD4类似的示例性的蛋白。具体而言，获自假结核耶尔森氏菌的透明质酸酶(图2，SEQ ID NO：2)具有类似于CD4的Ig样结构。假结核耶尔森氏菌具有N端跨膜结构域，在该结构域之后是5个胞外结构域(D1-D5)。前4个结构域(D1-D4)主要由β链组成，并具有Ig样构象。第五个结构域具有与C型凝集素样结构域相关的α螺旋和β链交替区域。

除了构象特征以外，可根据其它特性(例如免疫原性、佐剂性和/或免疫调制特性)筛选该融合蛋白的一个或多个非CD4部分。例如，已知透明质酸酶可激发细胞免疫应答。参见例如Fortineau等，(1994)Clin Diagn Lab Immunol.1(2)：235-237；Ennis等，(1993)J Exp Med.177(1)：207-212。透明质酸酶的免疫原性性质还可用于协助针对暴露的Env表位的抗体应答。

透明质酸酶片段的非限制性例子示于图2B-2J，其中包括了可用于取代天然CD4第1-14号残基的SEQ ID NO：2的第737-751号残基(示于图2B，SEQ IDNO：5)。SEQ ID NO：2的第584-595号残基(示于图2C，SEQ ID NO：6)可用于取代天然CD4第86-98号残基。可使用的透明质酸酶其它片段包括结构域1(D1，SEQ ID NO：2的第503-595号残基，示于图2D中，SEQ ID NO：7)、结构域2(D2，SEQ ID NO：2的第596-694号残基，示于图2E中，SEQ ID NO：8)、结构域3(D3，SEQ ID NO：2的第695-795号残基，示于图2F中，SEQ ID NO：9)以及结构域4(D4，SEQ ID NO：2的第796-888号残基，示于图2G中，SEQID NO：10)。图2H、2I和2J(分别为SEQ ID NO：11、12和13)显示了含有透明质酸酶片段的多肽组合，包括D1和D2(图2H，SEQ ID NO：11)；D1、D2和D3(图2I，SEQ ID NO：12)；以及D1、D2、D3和D4(图2J，SEQ ID NO：13)。很明显可使用其它片段，此外所用片段的顺序可与它们在天然透明质酸酶中的顺序不同(例如D1可侧接D2、D3和/或D4)。所使用的片段还可包含其它残基，例如接头等。另外，该片段可包括一个或多个相对于野生型的添加、缺失和/或取代(例如类肽取代)，只要整体三级结构保持不变即可。

因此，设计了在由各种透明质酸酶片段组成的骨架中包含CD4最小组件的融合分子。图7和8显示了本文所述的示例性融合蛋白。也可参见实施例1。图7中所示的蛋白质包括从N端到C端排列的以下多肽：透明质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基)；CD4的第15-85号残基(CD4最小组件)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98号残基)；以及透明质酸酶的第506-986号残基(取代CD4的第99-433号残基)。

图8A显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽：透明质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的第15-85号残基(深灰色)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-595号残基(浅灰色)。

图8B显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽：透明质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的第15-85号残基(深灰色)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-694号残基(浅灰色)。

图8C显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽：透明质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的第15-85号残基(深灰色)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-795号残基(浅灰色)。

图8D显示了另一示例性的蛋白质，其从N端到C端包括以下多肽：透明质酸酶的第737-751号残基(取代CD4的第1-14号残基，以条纹表示)；CD4的第15-85号残基(深灰色)；透明质酸酶的第584-595号残基(取代CD4的第86-98号残基，以带斑点的条带表示)；以及透明质酸酶的第503-888号残基(浅灰色)。

如上所述，很显然可用具有类似结构特性的其它多肽取代一条或多条透明质酸酶片段。

本文所述的融合蛋白还可进一步包括其它非CD4多肽，包括但不限于：获自一种或多种病原体(例如病毒，如HIV、HBC、HCV、HAV、RSV、流感病毒等，或细菌))的抗原多肽、免疫调制多肽(例如细胞因子、趋化因子等)。例如，所述融合蛋白可包含CD4最小组件能与之结合的Env多肽。通过这种方式，单一的融合蛋白可发挥Env-CD4最小组件复合物的功能，以暴露出因CD4结合而显现的表位。融合蛋白中还可包含其它HIV多肽，例如一种或多种Gag、Pol、Prot、Nef、Rev、Tat、Vpu、Vpr、Vif或其免疫原片段。

Env多肽

本文所述复合物的Env多肽部分可衍生自包膜蛋白，优选衍生自HIV Env。如上所述，HIV-1的包膜蛋白是约160kd(gp160)的糖蛋白。在宿主细胞受到病毒感染期间，gp160经宿主细胞蛋白酶切割形成gp120和整合膜蛋白gp41。gp41部分锚定于(并跨越)病毒体的双层膜中，而gp120片段则突出于周围环境中。由于gp120和gp41间没有共价连接，可从病毒体和受感染细胞的表面释放出游离的gp120。Env多肽还可包括gp140多肽。

在某些实施方式中，复合物中的Env多肽组分是单体或二聚体。在优选的实施方式中，所述Env多肽组分是低聚的Env多肽。HIV-1_SF2株(以下称为＂SF2＂)的Env多肽前体的基本序列是已知的。参见例如国际申请WO04/037847的图1。gp120氨基酸序列(包括前导序列)约从第1号氨基酸延伸到第509号氨基酸。所述多肽含有约24个N连接的糖基化位点，这些位点在大部分(即使不是所有)的gp120序列中是相同的。正如它们的名称所表示，不同株之间的超变区含有众多氨基酸取代、插入和缺失。除了这一变异以外，大部分(即便不是所有)Env多肽序列保持了病毒的结合病毒受体CD4的能力。此外，可相对于其它变体(例如HXB-2)对任一HIV变体的Env多肽氨基酸序列的比对进行测定，如WO00/39303中所述。在另一实施方式中，所述Env多肽包含低聚形式的Env，例如低聚的gp140(o-gp140)。

结合或复合于本文所述融合蛋白的Env多肽可衍生任何已知的HIV隔离群，以及新鉴别的隔离群及其亚型。在本文中参考SF2或HXB-2来描述结构特征。采用例如，序列比对程序(例如BLAST和本文中所述的其它程序)或对结构特征进行鉴别和比对(例如本文所述的可鉴别β片层区的程序如＂ALB＂)，本领域普通技术人员通过本文公开的内容和现有技术能确定其它HIV变体〔例如隔离群HIV_IIIb、HIV-1_SF162、HIV-1_SF170、HIV_LAV、HIV_LAI、HI_VMN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4，获自不同亚型(例如亚型A-G和O)的其它HIV-1株，HIV-2株和不同亚型(例如HIV-2_UC1和HIV-2_UC2)以及猿免疫缺陷病毒(SIV)〕中的相应区域。(参见例如以下文献中对这些和其它相关病毒的描述：《病毒学》，Virology，第三版(W.K.Joklik编，1988)；《基础病毒学》，Fundamental Virology，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)；《病毒学》，Virology，第三版(Fields，BN，DM Knipe，PM Howley编，1996，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA)。Env多肽的实际氨基酸序列可基于任何HIV变体。

对于融合蛋白而言，与本文所述的融合蛋白结合和/或与本文所述的融合蛋白复合的所述Env多肽可包括对天然序列的其它修饰，例如其它内部缺失、插入和取代。这些修饰可经仔细考虑，如通过定点诱变，或可为偶然的，例如通过自然发生的突变事件。因此，例如如果要将Env多肽用于疫苗组合物中时，所述修饰必须不会导致免疫活性(即，引发针对所述多肽的抗体应答的能力)的丧失。类似地，如果要将所述多肽用于诊断目的时，必须保留这一能力。本文所述的Env多肽可为单体或寡聚物。

多肽的产生

可采用各种方法来产生本发明的CD4分子(例如CD4小蛋白)、非CD4异源蛋白和多肽、Env多肽以及融合分子，这些方法都是本领域熟知的。

在一个实施方式中，采用本领域中熟知的重组技术来产生所述多肽。从这一角度而言，可在感兴趣多肽的已知序列的基础上设计寡核苷酸探针，并用于探测基因组或cDNA文库中编码所述多肽的基因。然后，可采用标准技术对该基因进行进一步的分离，例如在全长序列的所需部分用限制性内切酶截短该基因。类似地，可采用已知的技术从含有该基因的细胞和组织中直接分离出该基因，例如苯酚抽提并对序列进行进一步的操作以产生所需的截短物。参见例如Sambrook等(如前所述)中关于用于获得和分离DNA的技术的描述。

可基于已知的序列，通过合成法产生编码所述融合蛋白和/或Env多肽的组分的基因。可将该核苷酸序列设计为具有用于所需具体氨基酸序列的合适密码子。通常使以标准方法制备的寡核苷酸的重叠来组装完整的序列，并组装成完整的编码序列。参见例如Edge(1981)Nature 292：756；Nambair等，(1984)Science223：1299；Jay等，(1984)J.Biol.Chem.259：6311；Stemmer等，(1995)Gene164：49-53。

可很容易地采用重组技术来克隆编码所选多肽的基因。然后可通过置换适宜的碱基，在体外对基因进行诱变，以获得所需氨基酸的密码子。该变化可包括小至造成单个氨基酸变化的一个碱基对的改变，或可包括多个碱基对的变化。或者，可用与亲本核苷酸序列(通常为对应于RNA序列的cDNA)杂交的错配引物，在低于错配双链解链温度的条件下，引起该突变。可通过将引物长度和碱基组合保持在相对较窄的范围内，以及将突变碱基保持在中心位置来使得该引物具有特异性。参见例如Innis等，(1990)，＂PCR应用：用于功能性基因组的方法”，PCR Applications：Protocols for Functional Genomics；Zoller andSmith，Methods Enzymol。(1983)100：468。可用DNA聚合酶来实现引物延伸，克隆出产物，并选出通过引物延伸链的分离而得到的含有突变DNA的克隆。可采用突变引物作为杂交探针来完成筛选。也可将该技术应用于产生多位点突变。参见例如Dalbie-McFarland等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1982)79：6409。

一旦所需多肽的编码序列被分离或合成，就可将它们克隆到用于表达的任何适合载体或复制子中。通过本文的教导将很明确的是：可通过构建以各种组合操作性连接编码CD4小蛋白和异源序列的多核苷酸的表达构建物来产生编码多肽和/或融合蛋白的多种载体。这些组合的非限制性例子在实施例中有所讨论。

本领域技术人员已知多种克隆载体，对于适当克隆载体的筛选只是选择的问题。用于克隆的重组DNA载体以及它们可转化的宿主细胞的例子包括：λ噬菌体(大肠杆菌，E.coli)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性菌)、pGV1106(革兰氏阴性菌)、pLAFR1(革兰氏阴性菌)、pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草杆菌Bacillus subtilis)、pBD9(杆菌Bacillus)、pIJ61(链霉菌Streptomyces)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母菌)，YCp19(酵母菌Saccharomyces)和牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。总体上可参见，《DNA克隆》(DNA Cloning)：卷I & II，如前所述；Sambrook等，如前所述；B.Perbal，如前所述。

昆虫细胞表达系统(例如杆状病毒系统)为本领域技术人员所知，并在例如Summers和Smith，＂得克萨斯农业试验公报”，Texas Agricultural Experiment StationBulletin No.1555(1987)中有所描述。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可从诸如Invitrogen，San Diego CA以试剂盒形式购得。

禽类细胞表达系统也为本领域技术人员所知，并在例如美国专利5,340,740；5,656,479；5,830,510；6,114,168；和6,500,668；欧洲专利EP 0787180B；欧洲专利申请EP03291813.8；WO 03/043415；和WO 03/076601有所描述。

类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统在本领域中也是已知的，并在例如《酵母基因工程学》(Yeast Genetic Engineering)(Barr等编，1989)Butterworths，伦敦中有述。

也可用本文所述的植物表达系统产生所述蛋白质。通常而言，这类系统采用以病毒为基础的载体用异源基因转染植物细胞。关于这类系统的描述可参见例如Porta等，Mol.Biotech.(1996)5：209-221；和Hackland等，Arch.Virol.(1994)139：1-22。

病毒系统(例如Tomei等，J.Virol.(1993)67：4017-4026和Selby等，J.Gen.Virol.(1993)74：1103-1113中描述的基于牛痘的感染/转染系统)也可用于本发明。在该系统中，首先在体外用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的牛痘病毒重组体转染细胞。该聚合酶显示出精密的特异性：其仅转录带有T7启动子的模板。感染后，用感兴趣的由T7启动子驱动的DNA转染细胞。通过牛痘病毒重组体在胞质中表达的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后由宿主的翻译机制将该RNA翻译成蛋白质。该方法提供了高水平的由细胞质瞬时产生的大量的RNA及其翻译产物。

可将该基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵基因(本文将这些元件总称为＂控制”元件)的控制下，从而使得编码所需多肽的DNA序列在用含该表达构建物的转染宿主细胞中转录成RNA。所述编码序列可含有或不含信号肽或前导序列。在本发明中，可使用天然存在的信号肽或异源序列。可由宿主在翻译后加工过程中去除所述前导序列。参见例如美国专利4,431,739；4,425,437；4,338,397。该序列包括但不限于：TPA引导部分以及蜜蜂二甲双胍信号序列。

能调控与宿主细胞宿主的生长相关的蛋白质序列表达的其它调控序列也是需要的。这些调控序列是本领域技术人员所知，其例子包括响应化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)时，能使基因表达起始或停止的那些调控序列。载体中也可存在其它类型的调控元件，例如增强子序列。

可在插入载体前，将控制序列和其它调控序列与所述编码序列连接。或者，可将该编码序列直接克隆入已含有控制序列和适当的限制性位点的表达载体中。

在某些情况下，可能需要对编码序列进行修饰，从而使其能以适宜的方向与控制序列结合；即，保持适当的阅读框。可通过使编码该蛋白质的序列部分缺失、插入序列和/或取代该序列中的一个或多个核苷酸来制备突变体或类似物。用于修饰核苷酸序列的技术(例如定点诱变)为本领域技术人员熟知。参见例如Sambrook等，如前所述；DNA Cloning，卷I和II，如前所述；＂核酸杂交”，Neucleic Hybridization，如前所述。

然后用表达载体转化适宜的宿主细胞。多种适用于上述系统的宿主细胞也是已知的。例如，哺乳动物细胞系是本领域中已知的，包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的无限繁殖细胞系，例如但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(例如Hep G2)、马-达氏牛肾(＂MDBK＂)细胞及其它。哺乳动物来源的细胞包括但不限于：人或非人灵长类(例如PERC.6细胞，其在例如WO 01/38362和WO 02/40665中有所描述，并在ECACC以96022940的保藏号保藏)、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、胎恒河猴肺细胞(ATCC CL-160)、人胚胎肾细胞(293细胞，通常由经剪切的腺病毒5型DNA转化)、VERO细胞(获自猴肾)、马、牛(例如MDBK细胞)、绵羊、狗(例如获自狗肾的MDCK细胞，ATCC CCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016，WO 97/37001中所述的保藏号为DSM ACC 2219)、猫和啮齿动物(例如仓鼠细胞，如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并可获自多种发育阶段，包括例如，成体、新生、胎儿和胚胎。

禽类来源的细胞包括但不限于：鸡细胞(例如鸡胚胎干细胞(例如细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎肝细胞))。类似地，可将细菌宿主(例如大肠杆菌、枯草杆菌和链球菌Streptococcus spp.)用于本表达构建物中。可用于本发明中的酵母宿主除其它外特别包括：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽聚糖念珠菌(Candida maltosa)、多态汉逊酵母(Hansenualpolymorpha)、脆性克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳糖克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、吉利蒙德氏毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、甲醇毕赤酵母(Pichia pastoris)、裂殖稷酒酵母(Schizo Saccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。使用杆状病毒表达载体的昆虫细胞除其它外特别包括：埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿尺蠖(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾。

根据所选的表达系统和宿主，可通过在可使得感兴趣的蛋白质表达的条件下培养经上文所述的表达载体转化的宿主细胞来生产本发明的蛋白质。对适宜培养条件的选择在本领域技术范围内。

在一个实施方式中，例如为了产生Env多肽，转化细胞将多肽产物分泌到周围的培养基中。所述载体中可包含某些调控序列以促进所述蛋白产物的分泌，例如采用组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)前导序列，干扰素(γ-或α-)信号序列或获自已知分泌蛋白的其它信号肽序列。然后可采用本文所述的各种技术分离该分泌的多肽产物，例如采用标准纯化技术，例如(但不限于)：羟磷灰石树脂、柱层析、离子交换色谱、分子排阻色谱、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和层析、免疫沉淀法等。

在另一实施方式中，采用可裂解细胞但能保持所述多肽(例如Env)基本上完整的化学、物理或机械方法来破裂转化细胞。还可采用例如去污剂或有机溶剂去除细胞壁或膜的成分以发生多肽渗漏来获得胞内蛋白。这些方法是本领域技术人员已知的并在例如＂蛋白质纯化应用：实践进展”，Protein PurificationApplications：A Practical Approach，(E.L.V.Harris和S.Angal编，1990)。

例如，用于本发明的细胞破裂方法包括但不限于：声裂法或超声波破裂法；搅动法；液相或固相萃取、热处理；冻融法；干燥法；爆发性减压法；渗透休克法；用包括蛋白酶(例如胰蛋白酶、神经氨酸苷酶和溶菌酶)在内的裂解酶处理；碱处理；以及使用去污剂和溶剂，例如胆汁盐、十二烷基磺酸钠、Triton、NP40和CHAPS。用于破裂细胞的具体方法只是一个选择的问题，其取决于其中有多肽表达的细胞的类型、培养条件和任何所用的预处理。

细胞破碎后，通常通过离心去除细胞碎片，采用标准的纯化技术对胞内产生的多肽进行进一步纯化，所述技术包括但不限于：柱色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱、电泳、HPLC、免疫吸附技术、亲和层析、免疫沉淀法等。

例如，获得本发明的胞内Env多肽的一种方法涉及亲和纯化，例如采用抗Env特异性抗体进行的免疫亲和层析，或通过凝集素亲和层析。尤为优选的凝集素树脂是识别甘露糖部分的那些树脂，例如但不限于源自以下物质的凝集素：雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素(GNA)、兵豆(Lens culinaris)凝集素(LCA或小扁豆凝集素)、豌豆(Pisum sativum)凝集素(PSA或豌豆凝集素)、黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)凝集素(NPA)和熊葱(Allium ursinum)凝集素(AUA)。适宜的亲和树脂的选择在本领域的技术范围内。亲和纯化后，可采用本领域熟知的常规技术(例如上述的任何技术)对多肽进行进一步的纯化。

很容易化学合成相对较小的多肽(即长度最大约为50个氨基酸)，例如通过肽领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来合成。一般而言，这些方法将一个或多个氨基酸顺序添加到正在增长的肽链。通常，用适宜的保护基团保护第一个氨基酸的氨基或羧基。然后可在适于形成酰胺键的条件下，通过加入具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中下一个氨基酸，将受保护或衍生的氨基酸附着于惰性固相载体或用于溶液中。然后从新添加的氨基酸残基上去除保护基团，然后加入下一个氨基酸(适当保护的)，依此类推。在所需的氨基酸已以适当的顺序连接后，依次去除或同时去除剩余的保护基团(如果采用了固相合成技术的话，去除任何固相载体)，以得到最终的多肽。通过对该通用步骤做出简单改变，可一次性将多个氨基酸加入生长链，例如通过将受保护的三胎与适当的受保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的条件下)，以在脱保护之后形成五肽。关于固相肽合成技术可参见例如J.M.Stewart和J.D.Young，＂固相肽合成”，Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL 1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，＂肽：分析、合成、生物学”，The Peptide：Analysis，Synthesis，Biology，编，E.Gross和J.Meienhofer，卷2，(Academic Press，New York，1980)，第3-254页；关于经典溶液合成可参见例如M.Bodansky，＂肽合成策略”，Principles of Peptide Synthesis，(Springer-Verlag，Berlin 1984)和E.Gross和J.Meienhofer编，＂肽：分析、合成、生物学”，The Peptide：Analysis，Synthesis，Biology，卷1。

典型的保护基团包括叔丁氧羰基(Boc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)；对-甲苯磺酰基(Tx)；2，4-二硝基苄基；苄基(Bzl)；联苯异丙氧基羧基-羰基、叔-戊氧基羰基、异冰片基羰基、o-溴苯氧基羰基、环已基、异丙基、乙酰基、o-硝基苯磺酰基等。

典型的固相载体是交联聚合载体。其可包括二乙烯基苯交联的苯乙烯基聚合物，例如：二乙烯基苯-羟甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。

也可通过其它方法化学制备本发明多肽的类似物，例如通过同时多重肽合成方法。参见例如Houghten Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：5131-5135；美国专利4,631,211。

Env-融合蛋白复合物

可通过多种方式使Env与本文所述的含CD4最小组件的分子复合。在某些实施方式中，采用一种或多种交联剂或固定剂复合Env和融合分子，例如甲醛、福尔马林、戊二醛(glutyraldehyde)等。在另一实施方式中，通过特异性共价键将含CD4小蛋白的融合蛋白与包膜连接，所述共价键不会干扰包膜暴露的抗原表面，却能暴露出通常不可接近的隐藏保守表位，例如从而可产生抗体应答。出于免疫目的，将含CD4最小组件的分子与Env交联以保持暴露Env蛋白中CD4可诱导表位，以靶向疫苗应用中的功能性表位。

此外，还可通过用编码本文所述融合蛋白和/或一种或多种Env多肽的构建物共转染宿主细胞来产生适宜的复合物。在某些实施方式中，所述Env多肽是融合蛋白的一部分。因此，可顺式或反式完成共转染，即通过使用独立的载体或使用同时带有Env和含CD4小蛋白的融合蛋白的单一载体来完成共转染。如果使用单一载体完成的话，两种基因可由单套控制元件驱动。在另一实施方式中，Env-和融合蛋白-编码序列可存在于独立的表达盒中的载体上，由独立的控制元件驱动。表达后，蛋白质可自发结合。在另一实施方式中，可通过将不论是纯化形式或半纯化形式的分别形成的独立蛋白质混合在一起来形成复合物，甚至可通过将其中培养过表达所述蛋白质的宿主细胞的培养基混合来形成该复合物。参见国际申请WO 96/04301中对此类复合物的描述。

抗体

单克隆和多克隆的抗Env-融合分子复合物表位(因CD4结合于Env而暴露的隐藏表位)的抗体，在诊断和治疗应用中尤为有用，例如中和抗体可用于被动免疫治疗。单克隆抗体尤可用于产生抗个体基因型抗体。

抗个体基因型抗体是载有需要对其提供保护的感染剂的抗原的＂内部图像”的免疫球蛋白。产生抗个体基因型抗体的技术在本领域中是已知的。参见例如Grzych(1985)，Nature 316：74；MacNamara等，(1984)，Science 226：1325，Uytdehaag等(1985)，J.Immunol.134：1225。这些抗个体基因型抗体也可用于HIV的治疗和/或诊断。

对病毒抗原的免疫分析可采用例如：针对病毒表位的单克隆抗体、针对一种病毒多肽表位的单克隆抗体的组合、针对不同病毒多肽表位的单克隆抗体、针对相同病毒抗原的多克隆抗体、针对不同病毒抗原的多克隆抗体、或单克隆和多克隆抗体的组合。

免疫分析实验方法可基于例如竞争或直接反应或夹心型分析。实验方法也可例如，使用固相载体或可通过免疫沉淀而进行。大部分分析涉及使用标记的抗体或多肽。该标记可为例如：荧光、化学发光、放射性或染料分子。扩增探针的信号的分析法也是已知的。其中的例子是使用生物素和抗生物素蛋白、酶标记和介导的免疫分析(例如ELISA分析法)的分析法。

可将酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于测定抗原或抗体浓度。该方法取决于酶与抗原或抗体的结合，并采用所结合酶的活力作为定量标记。为了测定抗体，将已知的抗原固定于固相(例如微量培养板或塑料杯)，与测试血清稀释液一起孵育，洗涤，与用酶标记的抗免疫球蛋白一起孵育，再次洗涤。适于标记的酶在本领域中是已知的，包括例如：马辣根过氧化物酶。通过加入特定的底物来测定结合于固相的酶活力，并通过比色法测定产物的形成或底物的消耗。结合的酶的活力与结合的抗体的量是直接的函数关系。

为了测定抗原，将已知的特异性抗体固定于固相，加入含抗原的测试材料，孵育后洗涤固相，加入酶标记的二抗。洗涤后，加入底物，比色分析酶活力，并与抗原浓度相联系。

可通过将融合蛋白给予哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊或马)来产生多克隆抗体。收集获自受免疫的动物的血清，采用例如用硫酸铵沉淀，然后进行层析(优选亲和层析)的方法，从血浆中纯化抗体。用于产生和处理多克隆抗血清的技术在本领域中是已知的。

也可生产针对Env与CD4结合后所暴露表位的单克隆抗体。可将获自用例如本文所述的Evn-CD4复合物免疫的哺乳动物(例如小鼠)的正常B细胞与例如HAT敏感型小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。可通过RIA或ELISA鉴别杂交瘤，所述杂交瘤可生产对CD4小蛋白与Env结合时暴露出的表位具有特异性的抗体，并通过在半固体琼脂中克隆或通过有限稀释来对其进行分离。通过另一轮的筛选分离产生所需特异性抗体的克隆。

针对表位的抗体(单克隆和多克隆)在检测样品(例如获自HIV感染的人体的血清样品)中抗原的存在中尤为有用。用于HIV抗原的免疫分析法可采用一种抗体或多种抗体。对于HIV抗原的免疫分析可采用例如：针对HIV表位的单克隆抗体、针对Env或Env-含CD4最小组件的融合多肽的表位的单克隆抗体组合、针对不同多肽的单克隆抗体、针对相同HIV抗原的多克隆抗体、针对不同HIV抗原的多克隆抗体、或单克隆和多克隆抗体的组合。免疫分析实验方法可基于例如竞争、直接反应或采用例如标记抗体的夹心型分析。该标记可为例如：荧光、化学发光或放射性。

还可通过免疫亲和层析，利用多克隆或单克隆抗体分离Env或与融合蛋白复合的Env。可通过例如吸附或通过共价连接键将抗体固定到固相载体上，从而使得抗体保留它们的免疫选择活性。可任选地包含间隔基团以使抗体的抗原结合位点易于接近。然后可将固定化抗体用于结合获自生物样品(例如血液或血浆)的靶标。通过例如改变pH从柱基质回收结合的蛋白质或复合物。

诊断、疫苗和治疗用途

可将本发明的融合分子和包含这些融合分子的复合物(例如与Env的复合物)或其编码多核苷酸用于多种诊断和治疗目的。例如，可将所产生的针对它们的蛋白质和多核苷酸或抗体用于各种分析以测定生物样品中活性抗体和/或Env蛋白的存在，以帮助诊断HIV感染或疾病状态或作为对免疫应答的测定。

如上所述，可采用标准的电泳和免疫诊断技术来检测与Env(例如gp120)多肽反应的抗体的存在，或反之与针对其产生的抗体反应的抗原的存在，所述技术包括免疫分析法，例如竞争、直接反应或夹心型分析法。这些分析法包括但不限于：免疫印迹法；凝集测试；酶标记和介导的免疫分析，例如ELISA；生物素/抗生物素蛋白型分析；放免分析；免疫电泳；免疫沉淀等。该反应通常包括显示标记，例如：荧光、化学发光、放射性或酶标记或染料分子，或检测抗原和抗体或与它们反应的抗体间复合物的形成的其它方法。

可将例如以下的固相载体用于分析中：膜或微量滴定孔形式的硝基纤维素；片状或微量滴定孔形式的聚氯乙烯；珠或微量滴定板形式的聚苯乙烯橡胶；聚偏二氟乙烯树脂(polyvinylidine fluoride)；重氮化纸；尼龙膜；活性珠等。

通常，首先使固相载体与生物样品(或gp120蛋白)反应，洗涤，然后施用抗体(或怀疑含有抗体的样品)。在洗涤去除任何未结合的配体后，在适于结合的条件下加入第二结合部分，从而使得该第二结合剂能选择性地与结合的配体结合。然后可采用本领域熟知的技术检测第二结合剂的存在。通常，第二结合剂包含针对该抗体配体的抗体。多种抗人免疫球蛋白(Ig)分子在本领域中是已知的(例如市售的山羊抗人Ig或兔抗人Ig)。用于本文的Ig分子优选为IgG或IgA型，然而，在某些情况下IgM适用。可采用本领域技术人员已知的方法，使Ig分子能够很容易地与可检测酶标记结合，例如马辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和脲酶。然后采用适宜的酶底物来产生可检测信号。

在另一实施方式中，可采用＂两种抗体夹心＂分析法来检测本发明的蛋白质。在该技术中，首先将固相载体与一种或多种抗Env(例如gp120)的抗体反应，洗涤，并暴露于测试样品。再次加入抗体，采用直接的颜色反应或采用标记的二抗(例如马辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或脲酶标记的抗免疫球蛋白)使反应可见化。

也可在溶液中进行分析，从而使病毒蛋白与其抗体在沉淀条件下形成复合物。然后从测试样品中通过例如离心的方法分离沉淀的复合物。可采用多种标准方法中的任何一种(例如上文所述的免疫诊断方法)来分析反应混合物以得到是否存在抗体-抗原复合物。

可在试剂盒中提供本文所述的如前所述产生的复合物或该复合物的抗体，在试剂盒中附有说明书和其它必需的试剂，以如上所述地进行免疫分析。根据所用的具体免疫分析法，该试剂盒还可包含适宜的标记和其它包装好的试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。可采用这些试剂盒来进行诸如上文所述的标准免疫分析。

还可将复合物和编码该多肽的多核苷酸单独或组合用于疫苗组合物中，用于例如预防性(即为了预防感染)或治疗性(为了治疗感染后的HIV)疫苗。所述疫苗可包含一种或多种修饰Env蛋白(或编码该蛋白质的核苷酸序列)的混合物，例如衍生自一个以上病毒隔离群的Env(例如gp120)蛋白。还可将该疫苗与其它抗原和免疫调节剂(例如，免疫球蛋白、细胞因子、淋巴因子和趋化因子，包括但不限于：IL-2、修饰的IL-2(cys125-ser125)、GM-CSF、IL-12、-干扰素、IP-10、MIP1和RANTES)一起给药。可将该疫苗作为多肽或作为裸核酸疫苗(例如DNA)，采用病毒载体(例如逆转录病毒载体、α病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)或非病毒载体(例如脂质体、用核酸或蛋白质包被的颗粒，包括病毒复制子颗粒)来给予。该疫苗还可包含蛋白和核酸的混合物，然后使用相同或不同的载体对其进行递送。可多于一次地给予所述疫苗(例如＂初免＂(prime)给药，然后进行一次或多次的＂增强”(boost))以获得所需的效果。可给予相同的组合物作为初免和给予一次或多次作为增强。在另一实施方式中，在首次和增强给药中可采用不同的组合物。

已开发了多种基于病毒的系统将核酸分子递送和给到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为核酸递送系统提供了简便平台。可采用本领域已知的技术，将所选序列插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。然后分离重组病毒，体内或离体递送到对象的细胞中。已描述了多种逆转录病毒系统(美国专利5,219,740；Miller和Rosman，(1989)BioTech.7：980-990；Miller，A.D.，(1990)Hum.GeneTher.1：5-14；Scarpa等，(1991)Virol.180：849-852；Burns等(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Curr.Opin.Genet.Develop.3：102-109。

已描述了用于核酸递送的多种腺病毒载体。腺病毒与插入宿主基因组的逆转录病毒不同，它保持在染色体之外，因此使得与插入突变相关的风险最小化(Haj-Ahmad和Graham，(1986)J.Virol.57：267-274；Bett等，(1993)J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等，(1994)Hum.Gene Ther.5：717-729；Seth等，(1994)J.Virol.68：933-940；Barr等，(1994)Gene Therapy1：51-58；Berkner，K.L.，(1988)BioTech.6：616-629；以及Rich等，(1993)Hum.Gene Ther.4：461-476)。

此外，已开发了用于核酸递送和给药的各种腺相关病毒(AAV)载体系统。可采用本领域熟知的技术很容易地构建AAV载体。参见例如美国专利5,173,414和5,139,941；WO 92/01070；WO 93/03769；Lebkowski，等(1988)Mol.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent等，(1990)Vaccinces 90(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Carter，B.J.，(1992)Curr.Opin.BioTech.3：533-539；Muzyczka，N.，(1992)Curr.Top.Microbiol.Immunol.158：97-129；Kotin，R.M.，(1994)Hum.Gene Ther.5：793-801；Shellingh和Smith，(1994)Gene Ther.1：165-169；以及Zhou等，(1994)J.Exp.Med.179：1867-1875。

用于递送多核苷酸的其它载体系统是Small，Jr.，P.A.等(美国专利5,676,950)描述的肠道内给药的重组痘病毒疫苗。

可用于递送和给予核酸分子的其它病毒载体包括衍生自痘病毒家族的病毒载体，包括牛痘病毒和禽痘病毒。在另一实施方式中，也可采用贾恩科痘病毒(avipoxvirus)例如禽痘和金丝雀病毒递送核酸分子。已知将从哺乳动物病原体表达免疫原的重组贾恩科痘病毒给予非禽类物种时，能提供预防性免疫。在人和其它哺乳动物物种中使用贾恩科痘病毒载体尤为理想，这是由于多种贾恩科痘病毒属只能在易感的禽类物种中有效复制，因而在哺乳动物细胞中不具有感染性。产生重组贾恩科痘病毒的方法在本领域中是已知的，这些方法都采用上述关于牛痘病毒的生产中的描述中所述的基因重组技术。参见例如WO91/12882；WO 89/03429；和WO 92/03545。

在核酸递送或给药中也可采用分子连接载体，例如Michael等，(1993)J.Biol.Chem.268：6866-6869和Wagner等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6099-6103中描述的腺病毒嵌合载体。

α病毒属的成员，例如但不限于衍生自辛德比斯病毒(Sindbis)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan EquineEncephalitis)的载体也可用作递送和给予核酸分子的病毒载体。关于衍生自辛德比斯病毒的载体，可参见例如Dubensky等，(1996)J.Virol.70：508-519；WO95/07995；WO 96/17072；美国专利5,843,723；以及美国专利5,789,245。还可参见WO 02/099035；以及美国专利公开号2003/018262。

可将病毒复制子颗粒用于核酸和多肽分子递送和给药。例如，α病毒复制子颗粒(包括嵌合α病毒复制子颗粒)可用于递送和给予核酸和多肽分子。关于α病毒复制子颗粒系统的描述可参见例如WO 02/099035；美国专利公开号2003/018262；WO 96/37616；美国专利公开号2003/0119182；WO 03/023026；以及WO 05/016961。

也可不使用病毒载体递送核酸和多肽分子。例如，可在将核酸和/或多肽分子递送给对象或获自对象的细胞之前，将其包装在脂质体中。脂质包封通常是采用可稳定结合或捕获和保留核酸的脂质体来完成的。浓缩DNA与脂质的比例是可变的，但通常为1:1左右(mg DNA:微摩尔脂质)，或更多的脂质。关于将脂质体用作递送核酸的运载体的描述可参见Hug和Sleight，(1991)Biochim.Biophys.Acta.1097：1-17；Straubinger等，(1983)，Meth.Enzymol.101：512-527。

用于本发明脂质体制剂包括阳离子(正电荷)、阴离子(负电荷)和中性制剂，其中阳离子脂质体尤为优选。已显示阳离子型脂质体可介导功能形式的质粒DNA(Felgner等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416)；mRNA(Malone等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6077-6081)；以及纯化的转录因子(Debs等，(1990)J.Biol.Chem.265：10189-10192)的胞内递送。

易于购得阳离子型脂质体。例如，可从GIBCO BRL，Grand Island，NY以Lipofectin的商品名购得N[1-2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三乙基铵(DOTMA)脂质体。(也可参见，Felgner等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413-7416)。其它市售脂质包括(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。可采用本领域熟知的技术从容易购得的材料制得其它阳离子型脂质体。参见例如Szoka等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4194-4198；WO90/11092中关于DOTAP(1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲铵)丙烷)脂质体的描述。

类似地，可从Avanti Polar Lipids(Birmingham，AL)很容易地获得阴离子和中性脂质体，或采用易于获得的材料容易地制备阴离子和中性脂质体。该材料包括磷脂酰氯、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰氯(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)及其它。也可将这些材料与DOTMA和DOTAP起始材料以适当的比例混合。采用这些材料制备脂质体的方法在本领域中是熟知的。

脂质体可包括多层囊泡(MLV)、小型单层囊泡(SUV)或大型单层囊泡(LUV)。可采用本领域已知的方法制备各种脂质体-核酸复合物。参见例如Straubinger等，(1983)Meth.Immunol.101：512-527；Szoka等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4194-4198；Papahadjopoulos等，(1975)Biochim.Biophys.Acta394：483-491；Wilson等，(1979)细胞17：77-84)；Deamer和Bangham，(1976)Biochim.Biophys.Acta 443：629-634；Ostro等，(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76：836-842；Fraley等，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：3348-3352)；Enoch和Strittmatter，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：145-149；Fraley等，(1980)J.Biol.Chem.255：10431-10435；Szoka和Papahadjopoulos，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4194-4198；以及Schaefer-Ridder等，(1982)Science215：166-168。

还可以类似于Papahadjopoulos等，(1975)Biochem.Biophys.Acta.394：483-491中所描述，在螺旋状脂质组合物中递送核酸和/或多肽分子。也可参见，美国专利4,663,161和4,871,488。

还可使核酸和/或多肽分子包封、吸附或结合于微粒运载体。微粒运载体的例子包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的运载体，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(称为PLG)的微粒。参见例如Jeffery等，(1993)Pharm.Res.10：362-368；McGee，JP等，(1997)J Microencapsul.14(2)：197-210；O′HaganDT等，(1993)Vaccine 11(2)：149-154。还可在带电荷去污剂(例如阴离子型或阳离子型去污剂)的存在下制备适宜的微粒，以获得表面带有净负电荷或净正电荷的微粒。例如，用阴离子型去污剂，例如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)，制备的微粒，即CTAB-PLG微粒吸附带负电荷的大分子，例如DNA(参见例如WO 00/06123)。疫苗通常包括一种或多种＂药学上可接受的赋形剂或载体＂，例如水、盐水、甘油、乙醇等。此外，在此类载体中还可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

任选存在运载体，运载体是本身不会导致对接受组合物的个体产生有害抗体的一种分子。适宜的运载体通常是大且代谢慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集物(例如油滴或脂质体)，以及无活性的病毒颗粒。此类运载体对于本领域的普通技术人员而言是熟知的。此外，可将Env多肽与细菌类毒素结合，例如获自白喉、破伤风、霍乱等的类毒素。

还可使用佐剂来增强疫苗的效果。用于本发明的佐剂包括但不限于：一种或多种下述的佐剂：

A.含无机物的组合物

适于用作佐剂的含无机物的组合物包括无机盐，例如铵盐和钙盐。本发明包括无机盐，例如氢氧化物(例如氢氧化合物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等等(例如参见《疫苗设计》，Vaccine Design的第8和9章(1995)编Powell & Newman，ISBN：030644867X.Plenum.)或不同无机化合物的混合(例如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选具有过量的磷酸盐)，该化合物可以任何适宜的形式存在(例如胶态、结晶、无定形等等)，优选吸附到该盐上。还可将含无机物的组合物配制成具体的金属盐(WO00/23105)。

可包含铝盐从而使得Al³⁺的剂量为0.2-1.0mg/制剂。

在一个实施方式中，基于铝的佐剂是明矾(硫酸钾铝(AlK(SO₄)₂))或明矾的衍生物，例如通过将磷酸盐缓冲液中的抗原与明矾混合，然后用碱(例如氢氧化铵或氢氧化钠)滴定和沉淀而原位形成的佐剂。

另一基于铝的佐剂的例子是氢氧化铝佐剂(Al(OH)₃)或结晶氢氧化合铝(AlOOH)，它是一种优良的吸附剂，其表面积约为500m²/g。或者，提供磷酸铝佐剂(AlPO₄)或羟基磷酸铝(含有取代氢氧化铝佐剂中一些或全部羟基的磷酸基团)。本文所提供的优选的磷酸铝佐剂是无定形的，且可溶于酸、碱和中性介质。

在另一实施方式中，该佐剂同时包含磷酸铝和氢氧化铝。在其更为优选的实施方式中，所述佐剂中磷酸铝的量大于氢氧化铝的量，例如以磷酸铝对氢氧化铝的重量比计为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或大于9:1。更具体的是，疫苗中所存在的铝盐的量为0.4-1.0mg/剂疫苗，或0.4-0.8mg/剂疫苗，或0.5-0.7mg/剂疫苗，或约0.6mg/剂疫苗。

通常而言，优选的基于铝的佐剂或多种基于铝的佐剂间的优选比例(例如磷酸铝比氢氧化铝)是通过最优化分子间的静电吸引来选择的，从而使得在所需的pH下抗原携带与佐剂相反的电荷。例如，pH7.4时，磷酸铝佐剂(iep＝4)吸附溶菌酶，而不吸附白蛋白。如果将白蛋白作为靶标，则应选择氢氧化铝佐剂(iep11.4)。或者，用磷酸盐对氢氧化铝进行预处理，降低其等电点，使其成为更多碱性抗原的优选佐剂。

B.油乳胶

适于用作佐剂的油乳胶组合物包括但不限于：鲨烯-水乳剂，例如MF59(5％鲨烯、0.5％ Tween 80和0.5％ Span 85，通过使用微流化仪制备成亚微粒)。参见WO90/14837。也可参见Podda，＂含有新型佐剂的辅助流感疫苗：利用MF59-辅助疫苗的经验”，＂The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants：experience with the MF59-adjuvanted vaccine＂，Vaccine(2001)19：2673-2680；Frey等，＂用MF59-辅助的流感疫苗和无辅助的流感疫苗在非老年成人中的安全性、耐受性和免疫原性比较”，＂Comparison of the safety，tolerability，andimmunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvantedinfluenza vaccine in non-elderly adults＂，Vaccine(2003)21：4234-4237。在FLUAD^TM流感病毒三价亚单位疫苗中，将MF59用作佐剂。

尤为优选的佐剂是是亚微粒水包油乳剂。在本文中优选的亚微粒水包油乳剂是任选地含有可变量的MTP-PE的鲨烯/水乳剂，例如含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％ w/v Tween 80^TM(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span85TM(去水山梨糖醇三油酸酯)以及任选的N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酸磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)的亚微粒水包油乳剂，例如，已知称为＂MF59”的亚微粒水包油乳剂(国际申请WO90/14837；美国专利6,299,884和6,451,325，以及Ott等，《疫苗设计：亚单位和佐剂进展》Vaccine Design：The Subunit and adjuvant Approach(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)中的＂MF59—设计以及在人用疫苗中的安全性和有效辅助性评估”，＂MF59--Design and Evaluation of a Safe and Pot entadjuvant for Human Vaccines＂Plenum Press，New York，1995，第277-296页)。MF59含有4-5％w/v鲨烯(例如4.3％)、0.25-0.5％w/v Tween 80^TM和0.5％w/vSpan 85^TM以及任选含有不同量的MTP-PE，采用微流化仪(例如110Y型微粒化仪(Microfluidics，Newton，MA))配制成亚微粒颗粒。例如，MTP-PE的量可为约0-500μg/剂，更优选为0-250μg/剂，最优选0-100μg/剂。

如本文中所用，术语＂MF59-0＂是指上述亚微粒水包油乳剂中没有MTP-PE，而术语MF59-MTP则表示含有MTP-PE的制剂。例如，＂MF59-100＂为每剂中含有100μg MTP-PE，依此类推。MF69是本文中所用的另一种亚微粒水包油乳剂，它含有4.3％w/v鲨烯、0.25％ w/v Tween 80^TM和0.75％ w/v Span 85^TM以及任选的MTP-PE。另一种亚微粒水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10％鲨烯、0.4％ Tween 80^TM、5％普流罗尼(pluronic)封端的聚合物L121以及thr-MDP，它也是通过微流化成为亚微粒乳剂。MF75-MTP表示包含MTP的MF75制剂，例如每剂中含100-400μg MTP-PE。

用于组合物中的亚微粒水包油乳剂、其制备方法以及免疫刺激剂(例如胞壁酰肽)在国际申请WO90/14837和美国专利6,299,884以及6,451,325中有详细描述。

也可将弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)用作本发明中的佐剂。

C.皂苷制剂

也可将皂苷制剂用作佐剂。皂苷是甾醇糖苷类(glycoside)和三萜系糖苷类的异种类型，其存在于众多植物种类的树皮、叶、茎、根以及甚至花中。已对作为佐剂的从皂树皮(Quillaia saponaria Molina)中分离的皂苷进行了广泛的研究。皂苷还可从商业途径获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜，sarsaprilla)、满天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根，soap root)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOMs。

已通过高效薄层色谱(HP-TLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC))纯化了皂苷组合物。已对用这些技术获得的特定纯化部分进行了鉴别，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，所述皂苷是QS21。生产QS21的方法在美国专利5,057,540中有所揭示。皂苷制剂还可包括甾醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。

可将皂苷和胆固醇的组合用于形成被称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常还包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或卵磷脂。可将任何已知的皂苷用于ISCOM中。优选地，ISCOM包括一种或多种Quil A、QHA和QHC。ISCOM在EP0109942、WO96/11711和WO96/33739中有进一步的描述。任选地，ISCOMS可不含一种或多种其它去污剂。参见WO00/07621。关于基于皂苷的佐剂的发展的综述可参见Barr等，＂ISCOM和其它基于皂苷的佐剂”(＂ISCOMs and other saponin based adjuvant＂)，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：247-271。还可参见Sjolander等，＂口服皂苷和ISCOM疫苗的吸收和辅助活性”(＂Uptake and adjuvant activity of oral delivered saponin and ISCOMvaccines＂)，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：321-338。

D.病毒小体和病毒样颗粒(VLP)

也可将病毒小体和病毒样颗粒(VLP)用作佐剂。这些结构物中通常含有任选与磷脂组合或一起配制的一种或多种获自病毒的蛋白质。它们通常是非病原性、不可复制且通常不含任何天然病毒基因组。可重组产生病毒蛋白或从全病毒中分离病毒蛋白。适用于病毒小体或VLP中的这些病毒蛋白包括衍生自下组的蛋白质：流感病毒(例如HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、呼肠孤病毒、口蹄病病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA噬菌体、Qβ噬菌体(例如衣壳蛋白)、GA噬菌体、fr噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)。关于VLP的进一步讨论见WO03/024480、WO03/024481和Niikura等，＂作为口服疫苗载体递呈外源表位的嵌合重组戊型肝炎病毒样颗粒”(＂Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral VaccineVehicle Presenting Foreign Epitopes＂)，Virology(2002)293：273-280；Lenz等，＂诱导树突状细胞急性激活的乳头瘤病毒样颗粒”(＂Papillomarivurs-LikeParticles Induce Acute Activation of Dendritic Cells＂)，Journal of Immunology(2001)5246-5355；Pinto等，＂用重组HPV-16 L1病毒样颗粒免疫的健康志愿者中，对人乳头瘤病毒(HPV)-16 L1的细胞免疫应答”(＂Cellular ImmuneResponses to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunizedwith Recombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles＂)，Journal of InfectiousDiseases(2003)188：327-338；以及Gerber等，＂人乳头瘤病毒样颗粒与大肠杆菌热不稳定肠毒素突变体R192G或CpG共同给予时是有效的口服免疫原”(＂Human Papillomavrisu Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogenswhen Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192Gor CpG＂)，Journal of Virology(2001)75(10)：4752-4760。关于病毒小体的进一步讨论可见例如，Gluck等，＂未来疫苗开发中的新技术平台”(＂New TechnologyPlatforms in the Development of vaccines for the Future＂)，Vaccine(2002)20：B10-B16。在鼻内三价INFLEXAL^TM产品{Mischler & Metcalfe(2002)Vaccine 20增刊5：B17-23}和INFLUVAC PLUS^TM产品中，将免疫增强剂重新配制的流感病毒小体(IRIV)用作亚单位抗原递送系统。

E.细菌或微生物衍生物

其它的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如：

(1)肠杆菌脂多糖(LPS)的非毒性衍生物

这些衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-乙酰化单磷酰基脂质A与4，5或6酰化链的混合物。3脱-O-乙酰化单磷酰基脂质A的优选＂小微粒”形式在EP 0 689 454中有所揭示。这些3dMPL的＂小颗粒＂小到足以无菌滤过0.22微米膜(参见EP 0 689 454)。其它无毒性的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A同效物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物例如RC-529。参见Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett9：2273-2278。

(2)脂质A衍生物：脂质A衍生物包括获自大肠杆菌的脂质A衍生物，例如OM-174。OM-174在例如Meraldi等，＂OM-174，一种具有人用潜力的新佐剂，与合成的来自疟原虫环子孢子蛋白的C端片段242-310一起给予时引发保护性应答”(＂OM-174，a New Adjuvant with a Potential for Human Use，Inducesa Protective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei＂)，Vaccine(2003)21：2485-2491；和Pajak等，＂体内诱导小鼠树突状细胞迁移和成熟的佐剂OM-174”(＂The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturationof murine dendritic cells in vivo＂)，Vaccine(2003)21：836-842中有所描述。

(3)免疫刺激性寡核苷酸：适于用作佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(一种包含未甲基化胞嘧啶、其后通过磷酯键连接有鸟苷的序列)的核苷酸序列。包含palindromic或poly(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也已显示具有免疫刺激性。

CpG可包含核苷酸修饰/类似物(例如硫代磷酸酯修饰)，可为双链或单链。可任选地以类似物(例如2’-脱氧-7-二氮杂鸟苷，2’-deoxy-7-deazaguanosine)取代鸟苷。参见Kandimalla等，＂分枝合成核苷酸基序识别模式：具有细胞因子诱导性的有效免疫调节剂设计和进展”(＂Divergent synthetic nucleotide motifrecognition pattern：design and development of potent immunomodulatoryoligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles＂)，Nucleic Acids Research(2003)31(9)：2393-2400；WO02/26757和WO99/62923中关于可能的类似取代。CpG寡核苷酸的佐剂效果在以下文献中有进一步讨论：Krieg，＂CpG基序：细菌提取物中的活性成分？”(＂CpG motifs：the activeingredient in bacterial extracts？＂)，Nature Medicine(2003)9(7)：831-835；McCluskie等，＂小鼠中采用乙型肝炎表面抗原和CpG DNA的非胃肠道和粘膜初免-增强免疫策略”(＂Parenteral and mucosal prime-boost immunizationstrategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA＂)，FEMSImmunology and Medical Microbiology(2002)32：179-185；WO98/40100；美国专利6,207,646；美国专利6,239,116和美国专利6,429,199。

CpG序列可针对TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等，＂Toll样受体9：采用新合成的CpG DNA对识别和细胞因子诱导的调节”(＂Toll-like receptor 9：modulation of recognition and cytokine induction by novelsynthetic CpG DNAs＂)，Biochemical Society Transactions(2003)31(part 3)：654-658。该CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或可对B细胞应答更具特异性，例如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN在以下文献中有所讨论：Blackwell等，＂CpG-A-诱导的单核细胞可由IFN-γ诱导的蛋白-10的产生是由类浆树突状细胞衍生的IFN-α调节的”(＂CpG-A-Induced MonocyteIFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by PlasmacytoidDendritic Cell Derived IFN-alpha＂)，J.Immunol.(2003)170(8)：4061-4068；Krieg，＂CpG的A-Z”(＂From A to Z on CpG＂)，TRENDS in Immunology(2002)23(2)：64-65和WO01/95935。优选地，所述CpG是CpG-A ODN。

优选构建CpG寡核苷酸以使得5’端易于接受受体识别。任选地，可将两种CpG寡核苷酸序列连接在它们的3’端以形成＂免疫物＂(immunomer)。参见例如，Kandimalla等，＂影响免疫刺激活性的CpG寡核苷酸二级结构”(＂Secondarystructures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity＂)，BBRC(2003)306：948-953；Kandimalla等，＂Toll样受体9：采用新合成的CpG DNA对识别和细胞因子诱导的调节”(＂Toll-like receptor 9：modulation of recognitionand cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs＂)，Biochemical SocietyTransactions(2003)31(第3部分)：664-658；Bhagat等，＂作为强效免疫调节剂的CpG戊和己脱氧核苷酸”(＂CpG penta-and hexadeoxyribonucleotides as potentimmunomodulatory agents＂)，BBRC(2003)300：853-861和WO03/035836。

(4)ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物：可将细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物用作佐剂。优选地，所述蛋白质衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素＂LT”)、霍乱(＂CT＂)或百日咳(＂PT＂)。去毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途在WO95/17211有所描述，作为胃肠道外佐剂的用途在WO98/42375中有所描述。优选地，所述佐剂是去毒LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物(尤其是LT-K63和LT-R72)作为佐剂的用途可见以下参考文献：Beignon等，＂共同施用于裸露皮肤后能增强肽抗原引发CD4+T细胞和分泌γ干扰素能力的大肠杆菌热不稳定肠毒素LTR72突变体”(＂The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coliEnhances the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+ T Cells and SecreteGamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin＂)，Infection and Immunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza等，＂粘膜疫苗：作为粘膜佐剂的LT和CT的非毒性衍生物”(＂Mucosal vaccines：non toxic derivatives of LT and CT as mucosaladjuvants＂)，Vaccine(2001)19：2534-2541；Pizza等，＂LTK63 and LTR72，两种已准备用于临床试验的粘膜佐剂”，(＂LTK63 and LTR72，two mucosal adjuvantsready for clinical trials＂)，Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，＂采用细菌ADP-核糖基化外毒素、亚单位和无关佐剂的经皮免疫”，(＂Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-RibosylatingExotoxins，Subunits and Unrelated Adjuvants＂)，Infection and Immunity(2000)68(9)：5306-5313；Ryan等，＂作为鼻内递送无细胞百日咳疫苗的有效粘膜佐剂的大肠杆菌热不稳定毒素突变体：无毒性AB复合物的鉴别及其对Th1和Th2细胞的酶活性”，(＂Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as EffectiveMucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine：Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1 andTh2 Cells＂)，Infection and Immunity(1999)67(12)：6270-6280；Partidos等，＂大肠杆菌热不稳定肠毒素及其定位突变体LTK63对T细胞应答鼻内共免疫的合成肽的增殖和细胞毒性的促进”，(＂Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli andits site-directed mutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cellresponses to intranasally co-immunized synthetic peptides＂)，Immunol.Lett.(1999)67(3)：209-216；Peppoloni等，＂作为鼻内递送疫苗的安全强效佐剂的大肠杆菌热不稳定肠毒素”，(＂Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin assafe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines＂)，Vaccines(2003)2(2)：285-293；以及Pine等，(2002)＂采用流感疫苗和去毒化的大肠杆菌热不稳定肠毒素(LTK63)的鼻内免疫”，(＂Intranasal immunization with influenza vaccineand a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli(LTK63)＂)，J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸取代的数目参考优选以Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)15(6)：1165-1167中所述的ADP-核糖基化毒素A和B亚单位比对为基础进行。

F.生物粘附剂和粘膜粘着剂

也可将生物粘附剂和粘膜粘着剂用作佐剂。适宜的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001)J.Cont.Rele.70：267-276)，或粘膜粘着剂例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、羧甲基纤维素、聚丙烯酸的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可在本发明中用作佐剂。例如WO99/27960。

G.微粒

还可将微粒用作佐剂。优选由生物可降解和无毒性材料形成的微粒(即直径为～100nm到～150μm，更优选直径为～200nm到～30μm，最优选直径为～500nm到～10μm的颗粒)例如，聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚已酸内酯等等，其中优选聚(丙交酯-共-乙交酯)，任选地对其处理，使其具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子型去污剂，例如CTAB处理)。

H.脂质体

适于用作佐剂的脂质体制剂的例子在美国专利6,090,406、美国专利5,916,588和EP 0 626 169中有描述。

I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

其它佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。WO99/52549。此类制剂还包括与辛苯聚醇(octoxynol)组合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)，以及与至少一种其它非离子型表面活性剂(例如辛苯聚醇)组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。

优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-steoryl醚、聚氧乙烯-8-steoryl醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

J.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂在例如Andrianov等，＂通过使聚磷腈溶液共凝聚制备水凝胶微球”(＂Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueouspolyphophazene solutions＂)，Biomaterials(1998)19(1-3)：109-115和Payne等＂从聚磷腈基质中释放蛋白质”(＂Protein Release from Polyphosphazene Matrices＂)，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)：185-196中有所描述。

K.胞壁酰肽

适于在本发明中用作佐剂的胞壁酰肽包括：N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-1-丙氨酰基-d-异谷酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酸基-1-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺酰基-1-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酸磷酰氧)-乙胺MTP-PE)。

L.咪唑并喹啉化合物

适于用作佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特及其类似物，其进一步的描述见Stanley，＂咪喹莫特和咪唑并喹啉：作用机制和治疗效果”(＂Imiquimod and the imidazoquinolines：mechanism of action and therapeuticpotential＂)，Clin Exp Dermatol(2002)27(7)：571-577；Jones，＂咪喹莫特3M”(＂Resiquimod 3M＂)，Curr Opin Investig Drugs(2003)4(2)：214-218；和美国专利4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944和5,525,612。

M.缩氨基硫脲化合物

适于用作本发明中佐剂的缩氨基硫脲化合物及其配制、生产和筛选方法的例子包括WO04/60308中所描述的那些。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞以产生细胞因子(例如TNF-α)中尤为有效。

N.色胺酮化合物。

适于用作本发明中佐剂的色胺酮化合物及其配制、生产和筛选方法的例子包括WO04/64759中所描述的那些。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞以产生细胞因子(例如TNF-α)中尤为有效。

本发明还可包括一种或多种上述鉴定佐剂的组合。例如，在本发明中可使用以下佐剂组合：

(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；

(2)皂苷(例如QS21)+无毒性LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153)；

(3)皂苷(例如QS21)+无毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；

(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)(WO98/57659)；

(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；

(6)SAF：含10％鲨烯、0.4％ Tween 80、5％普流罗尼封端的聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微粒乳剂或经涡旋产生较大粒径的乳剂。

(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)：含有2％鲨烯、0.2％ Tween80和一种或多种选自下组的细菌细胞壁成分：单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；以及

(8)一种或多种无机盐(例如铝盐)+LPS的无毒性衍生物(例如3dPML)。

(9)一种或多种无机盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的核苷酸序列)。

O.人免疫调节剂

适于用作本发明中佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如：白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等等)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

铝盐和MF59是用于注射用流感疫苗的优选佐剂。细菌毒素和生物粘附剂是用于粘膜递送疫苗(例如鼻内疫苗)的优选佐剂。

上文引用的全部专利、专利申请和期刊文章中的内容以其全文纳入本文作为参考。

通常，疫苗组合物以液体溶液或悬液形式配制成供注射用的组合物；也可制备成适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。如前所述，还可乳化或在脂质体中包封该制剂以增强佐剂的效果。

疫苗可包含治疗有效量的Env-含CD4最小组件的融合蛋白复合物、含有这些复合物的进一步的复合物、其编码核苷酸序列、抗这些复合物的抗体以及可上述组分中的任何其它组分，根据需要而定。＂治疗有效量＂是指可接受给药的未感染的、感染的或未暴露的个体中诱导保护性免疫应答的量。该应答通常会使得对象中发生针对疫苗的分泌型细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，该应答包括但不限于一种或多种以下效果：产生任何免疫类型的抗体，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴细胞的增殖；为免疫细胞提供活化、生长和分化信号；辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞的扩增。

优选地，所述有效量足以对疾病症状形成治疗或预防作用。所需的确切量随以下因素而变化：治疗对象；待治疗个体的年龄和总体情况；个体免疫系统合成抗体的能力；所需的保护程度；所治疗病症的严重程度；所选复合物及其给药模式以及其它因素。本领域技术人员可很容易地确定适宜的有效量。＂治疗有效量＂落于可通过常规试验确定的相对宽泛的范围内。

一旦配制完成，可如上所述地通过用常规注射器或基因枪(例如基因递送系统(PowderJect Technologies，Inc.，Oxford，England))的注射，利用病毒载体或不利用病毒载体来施用该核酸疫苗。将DNA递送入表皮是尤为优选的给药方式，因为该给予方式为皮肤相关的淋巴细胞提供了通路，并在接受者中提供了瞬时存在的DNA。可注射核酸和/或肽，或通过皮下、表皮、皮内、粘膜内例如鼻内、直肠、阴道、腹膜内、静脉内、口服或肌内方式给药。给药的其它模式包括口服和肺部给药、栓剂、无针注射、经表皮和经真皮施用。药量治疗可为单剂方案或多剂方案。还可将肽或其它物质与核酸联合给药。

虽然已结合优选的特定实施方式描述了本发明，应理解上述描述以及下文的实施例是用于说明，而不是限定本发明的范围。本发明范围中的其它方面、优点和改变对于本发明所属领域技术人员而言是显而易见的。

试验部分

以下是实施本发明的特定实施方式的实施例。提供这些实施例是仅为说明的目的，而不是为了以任何方式限定本发明的范围。

已尽可能确保所用数据(例如数量、温度等等)的精确性，但理所当然应允许存在某些试验误差和偏差。

实施例1

含CD4最小组件的融合蛋白的设计

如下设计了含有gp120的人CD4结合区的新型融合蛋白。分析CD4-gp120的晶体结构，并鉴别了gp120结合所涉及的CD4区。具体而言，对应于CD4的第15-85号氨基酸残基的这一区域几乎完全埋藏在gp120结合袋中(图4)。该片段被称为CD4最小组件，且该片段通过Cys16和Cys84间存在的二硫桥稳定化。

在结构数据库中对整体构型与CD4蛋白质类似的蛋白质进行搜索以鉴别适于插入CD4最小组件以形成融合蛋白的结构骨架。共鉴别了212种与天然的CD4具有结构相似性的结构物。为了使发生不为所需的自身免疫的风险最小化，剔除了获自人和灵长类的蛋白质以及与人蛋白具有序列相似性的蛋白质。

选择了细菌假结核耶尔森氏菌透明质酸酶的胞外结构域。该蛋白质由后接5个胞外结构域(D1-D5)的N端跨膜结构域组成。前4个结构域(D1-D4)主要由β链组成，并各自采取了Ig样拓朴结构。第五个结构域具有与C型凝集素样结构域相关的α螺旋和β链交替区域。鉴别了获自假结核耶尔森氏菌的具有类似于CD4的球状Ig样结构的透明质酸酶。

此外，对透明质酸酶片段进行评估以测定其与CD4第1-14和86-433号残基间的结构相似性。图6所示为对这些区域结构检索的结果。由结构检索获得的显示所选CD4区域和假结核耶尔森氏菌透明质酸酶之间的相容结构的这些结果和其它结果示于表1中：

表1

 

CD4氨基酸残基	假结核耶尔森氏菌透明质酸酶的氨基酸残基
		1-14	GLN 737-SER 751
78-109	THR 576-SER 603
		86-98	GLY 584-LYS 595
99-110	THR 506-ASN 517
		111-121	LYS 519-ALA 529
122-136	LEU 536-LEU 550
		137-141	ASN 552-GLU 556
142-146	ALA 564-LEU 568
		149-152	ASN 570-ASP 573
154-163	GLY 574-GLU 583
		166-181	GLY 584-ALA 599

因此，CD4的第99-181号残基包括了与透明质酸酶第506-599号残基结构类似的多个区域。

然后，采用标准分子生物技术将CD4最小组件(第15-85号残基)克隆入各种表达盒。所述表达盒包括编码透明质酸酶多个区域的序列。

具体而言，图7所示的表达盒包括5′-3′方向的以下多肽的编码序列：透明质酸酶的第737-751号残基；CD4的第15-85号残基(CD4最小组件)；透明质酸酶的第584-595号残基；以及透明质酸酶的第506-986号残基。

图8A-D所示为其它的表达盒。图8A所示表达盒中包括5′-3′方向的以下多肽的编码序列：透明质酸酶的第737-751号残基；CD4的第15-85号残基(CD4最小组件)；透明质酸酶的第584-595号残基；以及透明质酸酶的第503-595号残基。图8B所示表达盒中包括5′-3′方向的以下多肽的编码序列：透明质酸酶的第737-751号残基；CD4的第15-85号残基(CD4最小组件)；透明质酸酶的第584-595号残基；以及透明质酸酶的第503-694号残基。图8C所示表达盒中包括以下多肽的编码序列(5′-3′方向)：透明质酸酶的第737-751号残基；CD4的第15-85号残基(CD4最小组件)；透明质酸酶的第584-595号残基；以及透明质酸酶的第503-795号残基。图8D所示表达盒中包括以下多肽的编码序列(5′-3′方向)：透明质酸酶的第737-751号残基；CD4的第15-85号残基(CD4最小组件)；透明质酸酶的第584-595号残基；以及透明质酸酶的第503-888号残基。

表达时，所述融合蛋白包含位于模拟CD4整体结构的结构骨架中的CD4Env结合位点而不会提供不为所需的CD4表位。

实施例2

透明质酸酶-CD4融合蛋白的表达

在大肠杆菌中表达图2G、2H、2I和2J所示的编码透明质酸酶-CD4融合蛋白的表达盒。用1mmIPTG诱导3小时后，制备总细胞裂解物和可溶部分，在SDS-PAGE(4-12％ MES)凝胶上进行电泳。示于图2H、2I和2J(分别为SEQID NO：11、12和13)的构建物在可溶部分中表达具有预期分子量的蛋白质。

然后，在细菌(大肠杆菌)中表达图2H、2I和2J(分别为SEQ ID NO：11、12和13)所示编码透明质酸酶-CD4融合蛋白的表达盒，使其生长到高密度并用1mM IPTG进行诱导。在诱导前，收集未经诱导的样品用于进行评估。在3小时的诱导后，通过离心收集细胞，在裂解缓冲液中裂解并用SDS-PAGE/考马斯蓝染色进行分析。

具有预期分子量的蛋白质存在于所有三种构建物的诱导和未经诱导的样品中。因此，透明质酸酶-CD4融合蛋白可由表达盒表达。

任选通过亲和层析对获自诱导后的粗细胞裂解物和细胞裂解液中的蛋白进行纯化。

实施例3

结合特性

如下评估各种透明质酸酶-CD4融合分子和包含这些分子的复合物的结合特性。

A.用CD4抗体的结合

采用自己产生的抗CD4单克隆抗体和多克隆抗体，对按照实施例2所述表达的蛋白质进行免疫印迹。简而言之，在标准SDS-PAGE凝胶上对细胞裂解物和纯化蛋白(上清、片状沉淀物(pellet)、流过物(flow through))进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。用抗CD4单克隆抗体和多克隆抗体探测所述膜，用市售的抗小鼠和抗兔IgG对斑点显影。用

红外成像系统(LI-CORBiosciences)对斑点进行扫描。

用这些试验中所用的抗CD4单克隆和多克隆抗体不能检测出待测透明质酸酶-CD4融合蛋白。

B.与gp120的结合

采用表面核磁共振(BIAcore)测试含按照实施例2所述表达的蛋白质的上清液，以对其与gp120和单克隆抗体48D(结合当CD4结合于Env时暴露出的表位，参见例如Wyatt等，(1995)J.Virol.69(9)：5723-5733，由James Robinson博士提供，Department of Pediatrics，Tulane University)的结合进行测试。

除了获自细胞裂解物的上清以外，也将诱导和细胞裂解后获得的粗细菌提取物与gp120亲和柱一起孵育过夜。孵育过夜后，用PDS洗涤该柱，用缓冲液(SDS和bME)洗脱。通过SDS-PAGE凝胶筛选(考马斯蓝染色)对洗脱物进行分析。

然后，将用甘氨酸洗脱的材料与标记的gp120(荧光记号)一起孵育。孵育后，以带有BioSil250柱(BioRad)的Water HPLC对获自各纯化阶段的样品进行HPLC。

由图2J(SEQ ID NO：13)所示构建物表达的透明质酸酶-CD4融合蛋白的BIAcore检测的和gp120-亲和柱洗脱物测试的样品都与gp120结合。此外，单克隆抗体48D也识别该透明质酸酶-CD4融合蛋白与gp120的复合物，这表明透明质酸酶-CD4融合蛋白在结合于gp120后能暴露出隐藏(可诱导)表位。

实施例4

ENV-融合蛋白复合物的制备

在用甲醛处理和不用甲醛处理的条件下，制备稳定的纯化的env-融合蛋白(CD4-透明质酸酶)复合物。例如，为了在env中诱导构象变化，将等摩尔浓度的env(例如SF2或SF162)以及本文所述的融合蛋白在37℃下一起孵育1小时。在细胞水平上，这些相互反应是瞬时的。因此，在孵育结束后，一半的复合物经甲醛固定，而另一半则保持为未处理。在Superdex-200柱上分离处理和未经处理的复合物。在HPLC柱和SDS-PAGE上分析纯化部分。该纯化复合物同时包含env和融合蛋白。此外，这些复合物可望是均匀的并将包含不超过2-3％的游离融合蛋白。

通过对可由CD4诱导的表位的诱导来监测Env与本文所述融合蛋白的复合能力，所述可由CD4诱导的表位是采用标准技术用MAb 17b和48d识别的。具体而言，随后通过表面质谱共振(SPR)对在SF162Env背景下产生的纯化嵌合物(chimerae)进行表征以评估CD4i表位的暴露，并通过复合物受体结合测试评估它们的结合亲和力。也可参见Devico等，(1996)Virology 218：258-263和Zhang等，(1999)Biochemistry 38(29)：9405-9416，这些文献显示对另一CD4小蛋白的SPR测试，通过采用单克隆抗体17b的检测显示该CD4小蛋白能与sCD4竞争结合相同的env位点，并诱导包膜构象变化(Sullivan等，(1998)J Virol72(8)：6332-6338)。该抗体识别位于gp120 V3环附近且主要由V1/V2保守茎部组成的表位，该表位可能被侧接的V1/V2和V3环所掩盖(Kwong等，(1998)Nature(伦敦)393：648-659；Rizzuto等，(1998)Science 280：1949-1953)但在与CD4复合的env中暴露出来。小蛋白的加入对抗体最大结合和结合速率提高的影响是很小的，可能反映了它的env结合亲和力较低，但具有特异性和易于检测。这些操作可应用于gp120、gp140和gp160单体、寡聚物及其变体(例如制备稳定纯化的融合蛋白复合物)。此类变体包括例如：env中β片层的缺失以及V2/V3环的缺失等。

实施例5

采用CD4-透明质酸酶融合蛋白-ENV复合物产生中和抗体

可通过多种本领域熟知的途径来递送含有本发明组合物的疫苗，这些途径包括，例如在一种或多种制剂中递送多肽抗原和/或递送表达所述多肽的多核苷酸。例如，DNA初免/蛋白质强化策略允许在兔和非人灵长类中筛选多种具有在作为DNA疫苗送递时在宿主中呈递表位的能力的Env结构。DNA接种可包括给予裸DNA、与例如PLG颗粒复合的DNA或作为病毒载体的一部分的DNA，然后进行蛋白质强化。通过使用本文所述的病毒载体和其它方法的电穿孔或DNA接种法用于有效地将编码融合蛋白(CD4-透明质酸酶)和/或Env多肽的多核苷酸递送给非人哺乳动物(例如灵长类)。

A.融合蛋白-Env复合物

用固定化或未固定化的Env-融合蛋白(CD4-透明质酸酶)复合物在第0、4、12和24周对4-5只/组或更多只/组的兔分别进行免疫。两周一次(biweekly)收集血清并通过针对例如SF2或SF162 gp120进行ELISA分析。获自对这些兔的研究的结果将揭示那些动物将对gp120发生强的免疫应答。因此，该结果将揭示合理设计的含CD4小蛋白和异源多肽序列(例如透明质酸酶)的融合蛋白，能以高亲和力结合于不同包膜形式(包括带有和不带有V2缺失的低聚和单体形式的SF162)，在这些蛋白质中诱导构象变化并诱导完全暴露出保守隐藏的、可由CD4诱导的表位和/或共同受体结合位点。因此，该融合蛋白可用于与包膜蛋白复合以暴露出针对中和抗体的包膜表位，从而可在疫苗制剂中具有潜在的用途。然后在恒河猴中对在这些兔的研究中鉴别出的复合物进行测定。

B.Env-融合蛋白构建物

在第0、4、12和24周用编码Env和本文所述融合蛋白的单一构建物(作为融合物)或用两个独立的构建物免疫4-5只/组或更多只/组的兔。两周收集血清一次并进行ELISA分析。然后在恒河猴中对这些兔的研究中鉴别出的共构建物进行测定。

C.猴

用带有佐剂的Env-融合蛋白复合物或Env-融合蛋白构建物免疫5只/组或更多只/组的猴子，并同时设立仅采用Env蛋白和仅采用融合分子的对照组。用带有和不带有V2缺失的单体和低聚形式的SF162 Env制备复合物，比较抗体应答。免疫方案是在第0、4和24周时进行免疫。认为需要时，可在以后的时间点加入其它的增强剂。

实施例6

低聚包膜蛋白中GP41亚单位的隐藏表位的暴露

CD4最小组件和包含这些最小组件(CD4-透明质酸酶融合物)的融合蛋白可诱导低聚(o-gp140)包膜蛋白构型的转化，暴露出接近gp120亚单位中的共同受体位点的隐藏表位，并有效提高在不同gp120包膜蛋白中的共同受体结合亲和力。采用SPR技术和2F5 mAb或DP178肽(或同源物)对通过本文所述融合分子诱导的构象转化、与不同低聚Env结构的结合进行了测试。还检测了加上获自CCR5共同受体N端结构域的肽(已显示该肽结合于gp120)的效果。

如果证实了gp41表位的暴露，该肽化学偶联于CD4-透明质酸酶融合蛋白，以产生新型的在暴露gp41表位中具有提高潜能的二官能配体。也采用化学或遗传学方法产生掺入了该二官能配体的新型嵌合低聚包膜蛋白，并对其进行了测试。然后在动物中测试具有优良暴露gp120和gp41隐藏表位特性的候选包膜蛋白对中和抗体的诱导作用。

实施例7

靶向ENV隐藏保守表位的单克隆抗体的产生

按照标准操作，将所选融合蛋白和含有这些融合蛋白的复合物免疫原注射入大鼠以制备单克隆抗体。在ELISA中筛选抗CD4小蛋白-gp120复合物、抗与o-gp140、o-gp140复合的CD4小蛋白-透明质酸酶融合蛋白以及抗单独的gp120和o-gp140的克隆。在Biacore中进一步测试与单独的包膜蛋白相比对于复合物具有最高亲和力的克隆。选择在Biacore中抗CD4M33-gp120和/或CD4M33-o-gp140复合物的评分为阳性的克隆，并用于大量生产腹水。

实施例8

给予ENV-CD4-透明质酸酶复合物后的粘膜激发

在恒河猴中对Env-CD4模拟复合物对异源激发引起保护的能力评估进行了测试。明确而言，将这些复合物与各种佐剂的组合给予恒河猴，并用粘膜SHIV激发评估激发前和激发后动物的应答(例如病毒载量、抗体和/或T细胞应答)。获自激发前(免疫原性)和激发后保护(arm)的结果应提供揭示哪些候选免疫原和递送可保证用于在恒河猴中进行进一步的评估的数据。考虑了所观察免疫应答的效能和幅度以及保护效力。

A.细胞免疫应答

常规监测的细胞免疫参数包括：通过ELISpot和淋巴细胞增殖(LP)应答所测的抗原特异性T辅助细胞应答(IFN-γ、IL-2和IL-4)的计数。通过计数应答特异性肽而分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的数目初步测定T细胞应答动力学。如果不能获得特殊的(匹配的)MHC特异性四聚体试剂，那么大部分的分析将通过采用肽重叠文库的CD8+ELISpot分析进行，由此来测定表位的特异性。进行经典批量溶菌(铬释放)分析以作为确证分析。可在一个动物亚组中进行其它补充分析法，例如：用于测定T细胞亚型中的抗原特异性胞内细胞因子的流式细胞计数分析、用于测量动物中具有与可获得的四聚体匹配的MHC特异性的抗原特异性CD8+T细胞群的四聚体分析。

在粘膜中测定细胞免疫应答的分析法包括：ELISpot，抗体分泌细胞(ASC)的测定，以及粘膜T细胞中抗原特异性胞内细胞因子的FACS分析法。

B.体液/中和抗体应答

如前所述进行抗体应答和中和分析和/或将样品送到外面的公司(outsidevendor)进行评估(例如Virologic，Inc)。

C.激发后疫苗效力的测定

通过同源和异源全身性激发(IV)和粘膜(IR)激发，对给出强烈而宽泛的中和作用并伴有强烈的CD4和CD8T细胞应答的Env-CD4模拟物复合物进行测试。在过去的10年中，其被证实是最为可靠的激活剂量，通过该方法可在获得保护的同时全面控制接触性疾病。在最后一次免疫后8周进行激发，除了在研究的最后一年，在对猴的平行组进行激发时，在最后一次免疫后8个月对指定组的半数进行激发。

表2中总结了待评估的激发后疫苗效力测定。在激发后的前2个月中每2周收集血浆和PBMC用于分析(例如病毒学分析和FACS)，其后每月进行分析。

进行了血浆病毒载量分析，并对任何保持低拷贝原病毒感染的PBMC或淋巴结细胞进行详尽分析。详尽的FACS分析提供了T细胞活化和/或CD4+ T细胞丢失的证据，并提供了疾病进展信息。采用对非疫苗病毒抗原的免疫斑点分析和ELISA来测定是否发生血清转化。

在考虑了所有这些参数后鉴别了受保护的动物。＂抗感染保护＂定义为通过表2中所列的任何病毒学(和血清学)敏感分析均未指示有病毒感染。＂部分保护作用＂定义为通过对定量病毒分离、病毒RNA水平、在PBMC和淋巴结(LN)中检出原病毒DNA的频率的测定，病毒载量有显著降低。＂免受疾病的保护＂首先定义为CD4+ T细胞下降的减少、严重体征和症状较少或减少、存活，其次定义为病毒载量的减少，以及激发后免疫应答的耐久性(robustness)。

表2：疫苗的激发后测定

 

病毒载量的测定	免疫状态/疾病发展
		血浆RNA(定量PCR)	FACS(CD3、CD4、CD8、CD16、HLA-DR、CD20)
原病毒DNA(巢床PCR/PBMC和LN)	免疫印迹和ELISA(血清转化)
		定量病毒分离(PBMC)	临床体征和症状
	Ag特异性IFN-γ、IL-2、IL-4、ELISPot
			对CD4亚型中IL-2丢失的ICS

在激发结果和观察到的效能、幅度以及激发前和激发后免疫应答耐久性的基础上，确定用于未来研究的疫苗疗法的相对优势。除了激发前抗原特异性IL-2应答(ELISPot)的强度，通过ICS测定的产生Ag-特异性IL-2的CD4 T细胞亚群的丢失也是在激发后无法含有/控制病毒载量的预兆(也可参见，Ogg等，(1998)Science 279(5359)：2103-2106；Oldstone等(1997)Virol.234(2)：179-185)。

Claims (56)

1.一种融合蛋白，其包含结合于HIV Env的CD4最小组件以及一种或多种异源多肽序列，其中所述融合蛋白的三级结构与天然的CD4具有结构相似性。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD4最小组件包含CD4的第15-85号残基(SEQ ID NO：4)。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，一种或多种所述异源多肽获自肺结核耶尔森氏菌的透明质酸酶。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述透明质酸酶多肽为选自SEQ ID NO：5-13中的一种或多种。

5.如权利要求4所述的融合蛋白，其从N端到C端包含：SEQ ID NO：5、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，其从C端到SEQ ID NO：7还包括：SEQ IDNO：8、9和10中的一种或多种。

7.如权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，其还包括其它的异源多肽。

8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述其它的异源多肽选自：病毒多肽、免疫调制多肽或细菌多肽。

9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述其它的异源多肽是病毒多肽，所述病毒是HIV。

10.如权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽是HIV Env多肽。

11.如权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述HIV Env多肽包括gp140、低聚的gp140(ogp140)或gp120。

12.一种编码权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。

13.一种多肽复合物，其包含与权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白复合的HIV Env多肽。

14.如权利要求10或11所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和CD4蛋白是采用固定剂或通过交联复合的。

15.如权利要求14所述的多肽，其特征在于，所述固定剂包括福尔马林。

16.如权利要求14所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和CD4蛋白是自发复合的。

17.如权利要求14所述的多肽，其特征在于，所述Env多肽和所述融合蛋白是采用甲醛交联的。

18.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-11中所述的融合蛋白或权利要求13-17中任一项所述的多肽复合物。

19.如权利要求18所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

20.一种细胞，其包含权利要求12所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列操作性连接于与在所选细胞中的表达相容的控制元件。

21.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。

22.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自：BHK、VERO、HT1080、293、RD、COS-7或CHO细胞。

23.如权利要求22所述的细胞，其特征在于，所述细胞是CHO细胞。

24.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述细胞是抗原递呈细胞。

25.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述细胞是选自下组的淋巴细胞：巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、干细胞、或其祖细胞。

26.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述细胞是原代细胞。

27.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述细胞是无限增殖细胞。

28.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述细胞是肿瘤衍生的细胞。

29.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自：细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或禽类细胞。

30.如权利要求29所述的细胞，其特征在于，所述昆虫细胞是粉纹夜蛾(Tn5)或Sf9昆虫细胞。

31.一种用于哺乳动物对象中的基因递送载体，其包含：

一种适用于所述对象的基因递送载体，其中所述载体包含权利要求12所述的多核苷酸，且其中所述多核苷酸序列操作性连接于与在所述对象中的表达相容的控制元件。

32.一种产生结合于HIV Env隐藏表位的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

在允许在对象中产生抗体的条件下，将权利要求18或19所述的免疫原性组合物给予对象。

33.如权利要求32所述的方法，其还包括分离在所述对象中产生的抗体的步骤。

34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述抗体是中和抗体。

35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。

36.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体。

37.一种产生包含与CD4蛋白复合的HIV Env多肽序列的多肽的方法，所述方法包括：

在适于产生所述多肽的条件下，孵育权利要求20-30中任一项所述的细胞。

38.一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：给予足以在所述对象中诱导免疫应答的量的权利要求18或19所述的组合物。

39.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括：

在允许所述多核苷酸表达和产生所述多肽的条件下，将权利要求12所述的多核苷酸或权利要求31所述的基因递送载体给予对象，从而引发对所述多肽的免疫应答。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述基因递送载体是非病毒载体。

41.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，采用微粒运载体递送所述载体。

42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，将所述载体包被在金或钨颗粒上，并采用基因枪将所述包被的颗粒递送到所述对象。

43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，将所述载体包封在脂质体制剂中。

44.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。

45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。

46.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

48.如权利要求39-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是用多核苷酸或基因递送载体转染的，且所述转染是离体进行的，并将所述转染细胞重新导入所述对象。

49.如权利要求39-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是用多核苷酸或基因递送载体转染的，且所述转染是在体内进行的，并将所述转染细胞重新导入所述对象。

50.如权利要求39-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是体液免疫应答。

51.如权利要求39-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是细胞免疫应答。

52.如权利要求39-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述基因递送载体是通过肌内、粘膜内、鼻内、皮下、皮内、经皮、阴道内、直肠内、口服或静脉内给予的。

53.一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)在初免步骤中给予包含权利要求12所述的多核苷酸的第一组合物；

(b)以足以在所述对象中诱导免疫应答的量给予包含权利要求1-11所述的多肽的第二组合物，作为增强剂。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述第一组合物或第二组合物还包含佐剂。

55.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述第一组合物还包含编码HIV Gag多肽的序列。

56.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述第二组合物还包含HIVGag多肽。

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