WO2021112055A1 - がんの処置に用いるｎｙ－ｅｓｏ－１含有人工アジュバントベクター細胞 - Google Patents

がんの処置に用いるｎｙ－ｅｓｏ－１含有人工アジュバントベクター細胞 Download PDF

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彩佳 秋葉
達也 奥平
泰英 増原
恵介 大隅
眞一郎 藤井
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アステラス製薬株式会社
国立研究開発法人理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to NY-ESO-1 containing artificial adjuvant vector cells (artificial adjuvant vector cells: aAVC-NY-ESO-1 cells) used for the treatment of cancer.
  • artificial adjuvant vector cells artificial adjuvant vector cells: aAVC-NY-ESO-1 cells
  • New York esophageal squamomous cell carcinoma 1 NY-ESO-1 is one of the cancer / testicular antigens, and its expression is observed in a wide range of tumors such as prostate cancer and bladder cancer. Be done. On the other hand, since it is not expressed in normal adult cells except in the testis, it is considered to be a suitable target molecule for cancer treatment, and the development of drugs such as vaccines is being promoted (Non-Patent Document 1). ⁇ 3).
  • G305 a vaccine that is a mixture of NY-ESO-1 protein and glucopyranosyl lipid A (GLA) adjuvant, has been clinically tested in patients with NY-ESO-1 expressing cancer and is a vaccine. Induction of NY-ESO-1-specific T cells has been confirmed after administration (Non-Patent Document 4).
  • GLA glucopyranosyl lipid A
  • the aAVC activates natural killer T (NKT) cells via the CD1d / ⁇ -GalCer complex, and the activated NKT cells produce cytokines such as interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) to produce natural killer (NKT).
  • cytokines such as interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) to produce natural killer (NKT).
  • NK cell-dependent antitumor effect by administration of aAVC has been shown (Patent Documents 1 to 3).
  • the aAVC administered to the mouse is rapidly killed by the activated NKT cells in vivo, and the fragment of the aAVC is taken up by the dendritic cells.
  • the dendritic cell incorporating the aAVC fragment presents the cancer antigen fragment incorporated into the major histocompatibility complex (MHC) on the cell surface, and produces cancer antigen-specific T cells. Induce.
  • MHC major histocompatibility complex
  • an antitumor effect mediated by induction of cancer antigen-specific T cells by administration of aAVC has been shown (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 5 and 6).
  • aAVC can strongly induce two immune mechanisms: innate immunity activation by NK cell activation via NKT cell activation and acquired immune induction by cancer antigen-specific T cell induction. ing.
  • An object of the present invention is to provide aAVC that stably expresses NY-ESO-1 or a fragment thereof.
  • the present inventors have succeeded in obtaining aAVC that stably expresses NY-ESO-1 as a result of repeated creative studies in the production of aAVC that expresses NY-ESO-1 as a cancer antigen. .. Specifically, the present inventors have found a problem that when NY-ESO-1 is constantly expressed, the expression level and the positive rate decrease as the number of culture days elapses, and the present inventors have diligently examined the problem. Solved the problem. Specifically, cells inducibly expressing NY-ESO-1 with an inducible promoter (particularly a drug-inducible promoter) have a higher NY-ESO-1 than constitutively expressing NY-ESO-1.
  • the present invention provides aAVC that can be used for treating cancer, a method for producing the aAVC, a pharmaceutical composition containing the aAVC, a method for treating cancer with the aAVC, and the like.
  • the present invention may include the following inventions as medically or industrially useful substances or methods.
  • a human-derived cell comprising a polynucleotide encoding CD1d and a polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof operably linked to an inducible promoter.
  • NY-ESO-1 is human NY-ESO-1.
  • CD1d is a human CD1d.
  • the inducible promoter is a drug-inducible promoter.
  • the drug-induced promoter is a tetracycline-based induced promoter.
  • the human-derived cell is a cell derived from human fetal kidney cell 293 (HEK293) cell.
  • Expression of NY-ESO-1 or a fragment thereof is 10 6 cells per 245ng ⁇ 45000ng, according to [9] cells.
  • [11] The cell according to [9] or [10], which carries a CD1d ligand on the surface of the cell.
  • [12] The cell according to [11], wherein the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • a pharmaceutical composition comprising the cells according to [11] or [12].
  • [14] The pharmaceutical composition according to [13] for use in the treatment of cancer.
  • a method for treating cancer which comprises the step of administering the cells according to [11] or [12] to a subject.
  • [17] Use of the cells according to [11] or [12] for producing a pharmaceutical composition used for treating cancer.
  • [18] A method for producing cells used for treating cancer, in which the cells according to any one of [1] to [8] are cultured in the presence of an inducing factor of an inducible promoter, NY. -A method comprising the step of inducing the expression of ESO-1 or a fragment thereof. [19] The method according to [18], further comprising the step of loading ⁇ -GalCer on the surface of cells. [20] A method for producing cells used for treating cancer.
  • Introducing a polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof operably linked to an inducible promoter Including methods.
  • the method according to [20] further comprising a step of inducing the expression of NY-ESO-1 or a fragment thereof by culturing the cells obtained in the above step in the presence of an inducing factor of an inducible promoter. ..
  • a method for treating cancer which comprises the step of administering the cell and the immune checkpoint inhibitor according to [11] or [12] to a subject.
  • the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 immune checkpoint inhibitor or a CTLA-4 immune checkpoint inhibitor.
  • a method for producing a pharmaceutical composition used for treating cancer is a PD-1 immune checkpoint inhibitor or a CTLA-4 immune checkpoint inhibitor.
  • a method comprising loading ⁇ -GalCer on the surface of the cell.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention and the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of cancer.
  • FIG. 1-1 shows the antigen-specific T cell-inducing effect of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells on NY-ESO-1 specific T cells in aVC (3T3) -NY-ESO-1 cell-administered mice. It is indicated by a number.
  • the vertical axis shows the number of spots in 4 ⁇ 10 5 spleen cells as counted by the ELISPOT reader.
  • the solvent on the horizontal axis indicates the control group to which BICANATE was administered, and aAVC-NY indicates the aAVC (3T3) -NY-ESO-1 administration group.
  • PAP and NY indicate the PAP peptide and NY-ESO-1 peptide used for stimulation, respectively.
  • FIG. 1-2 shows the antitumor effect of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells in NY-ESO-1-expressing B16-bearing mice and B16-F10-bearing mice.
  • the vertical axis shows the tumor volume, and the horizontal axis shows the number of days after cancer cell inoculation.
  • the vertical line shows the average value ⁇ the standard error of the average, and the numbers in parentheses indicate the number of mice at the time of measurement.
  • FIG. 1-3 shows the antitumor effect of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells in NY-ESO-1 expression B16 cancer-bearing mice.
  • the vertical axis shows the tumor volume, and the horizontal axis shows the number of days after administration of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells.
  • the vertical line shows the standard error of the mean ⁇ mean.
  • the significance probability P value (**: P ⁇ 0.01) is to compare the tumor volume on the 10th day between the solvent-administered group and the aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cell-administered group by a multiple comparison test of Danette.
  • FIGS. 2-1 to 2-4 show changes over time with respect to various indexes of the FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool (CMV in the figure) and the FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool (Tet-on in the figure). Shown.
  • FIG. 2-1 shows the expression level of NY-ESO-1 per 1 ⁇ 10 6 cells of CMV and Tet-on.
  • the vertical axis shows the expression level of NY-ESO-1, and the horizontal axis shows the number of days of culture after infection.
  • FIG. 2-2 shows the NY-ESO-1 positive rate of CMV and Tet-on.
  • the vertical axis shows the NY-ESO-1 positive rate, and the horizontal axis shows the number of days of culture after infection.
  • FIG. 2-3 shows the survival rates of CMV and Tet-on.
  • the vertical axis shows the cell viability of each pool, and the horizontal axis shows the number of days of culture after infection.
  • FIG. 2-4 shows the doubling time of CMV and Tet-on cells.
  • the vertical axis shows the doubling time, and the horizontal axis shows the number of days of culture after infection.
  • FIG. 3 shows the expression level of NY-ESO-1 in various clones isolated from the FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool (CMV in the figure) and the FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool (Tet-on in the figure). Is shown. No. Indicates the clone number, and the numerical value indicates the NY-ESO-1 expression level per 1 ⁇ 10 6 cells.
  • FIG. 4-1 shows aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells, anti-PD-1 antibody, and antitumor effect when they are used in combination in NY-ESO-1-expressing B16 cancer-bearing mice.
  • the vertical axis shows the tumor volume, and the horizontal axis shows the number of days after administration of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells.
  • the vertical line shows the average value ⁇ the standard error of the average, and the numbers in parentheses indicate the number of mice at the time of measurement.
  • FIG. 4-2 shows aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells, anti-PD-1 antibody, and antitumor effect when they are used in combination in NY-ESO-1-expressing CT26 cancer-bearing mice.
  • the vertical axis shows the tumor volume, and the horizontal axis shows the number of days after administration of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells.
  • the vertical line shows the standard error of the mean ⁇ mean.
  • FIG. 5 shows aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells, anti-CTLA-4 antibody, and antitumor effect when they are used in combination in NY-ESO-1-expressing CT26 cancer-bearing mice.
  • the vertical axis shows the tumor volume, and the horizontal axis shows the number of days after cancer cell inoculation.
  • the vertical line shows the standard error of the mean ⁇ mean.
  • the number of cases after the 18th day in the combination group of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells and anti-CTLA-4 antibody is 9.
  • Artificial adjuvant vector cell and “aAVC” are synonymous and are used interchangeably with a polynucleotide encoding a CD1d polypeptide (hereinafter, also referred to as "CD1d") and one or more.
  • CD1d CD1d polypeptide
  • the term "containing a polynucleotide” refers to a state in which a cell has the polypeptide internally or the polynucleotide has been introduced by an exogenous method.
  • intrasic or “intrinsic” is used in the sense commonly used by those skilled in the art, such as when an isolated cell contains a specific gene or polynucleotide or expresses a protein. sell.
  • foreign or “foreign” means that an artificially produced gene or polynucleotide is introduced into a target cell by an operation such as gene manipulation or gene transfer, and artificially introduced into the target cell. It is used interchangeably as a term to refer to the artificial expression of the proteins encoded by the introduced genes or polynucleotides.
  • ⁇ AAVC-NY-ESO-1 cell of the present invention Human-derived cells containing a polynucleotide encoding CD1d and a polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof operably linked to an inducible promoter (as used herein, "aAVC-NY-ESO-”. Also referred to as "1 cell").
  • the human-derived cells used in the present invention are normal cells or cells derived from cancer tissues, and may express CD1d endogenously.
  • human-derived cells such as cells isolated and / or purified from any human tissue, cells derived from a specific cell type, established cells derived from human tissue, and cells differentiated from stem cells are used. be able to.
  • the cells derived from cancer tissue cells isolated and / or purified from the cancer tissue of the patient, or cell lines derived from human cancer tissue can be used.
  • isolated means separation from living tissue.
  • purification means the separation of human-derived cells from one or more of the other components contained in the tissue from which the cells are derived. Cell isolation and purification can be performed by known methods.
  • the human-derived cells used in the present invention are normal cells.
  • Cells isolated and / or purified from any human tissue can be, for example, stomach, small intestine, large intestine, lung, pancreas, kidney, liver, thymus, spleen, prostate, uterus, uterus, bone marrow, skin, muscle, or peripheral. It may be a cell derived from any human tissue such as blood. In one embodiment, the human-derived cells used in the present invention are non-blood cell cells.
  • Cells derived from a particular cell type are cells of a particular cell type in human tissue (eg, epithelial cells, endothelial cells, epidermal cells, stromal cells, fibroblasts, adipose tissue, mammary gland cells, mesangial cells, pancreatic ⁇ cells, nerves. Derived from cells, glial cells, exocrine epithelial cells, endocrine cells, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myocardial cells, osteoblasts, embryonic cells, or immune cells (eg, dendritic cells, macrophages, B cells, etc.) It is a cell.
  • human tissue eg, epithelial cells, endothelial cells, epidermal cells, stromal cells, fibroblasts, adipose tissue, mammary gland cells, mesangial cells, pancreatic ⁇ cells, nerves.
  • derived from cells glial cells, exocrine epithelial cells,
  • Cell lines derived from human tissue can be prepared using methods known to those skilled in the art or can be commercially available. Examples of the cell line include human fetal kidney cell 293 (HEK293) cell (J. Gen. Virol .; 1977; 36: 59-74), WI-38 cell, SC-01 MFP cell, or MRC-5 cell. , Or cells derived from those cells.
  • the human-derived cell used in the present invention is a cell derived from HEK293 cells.
  • the cell derived from HEK293 cells is a FreeStyle TM 293-F cell.
  • the cells differentiated from stem cells are cells differentiated from human-derived induced pluripotent stem cells (iPS cells) or embryonic stem cells (ES cells). Preparation of iPS cells or ES cells and cells differentiated from the cells can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • Cells derived from cancer tissue can be obtained by isolation and / or purification from the cancer tissue of a patient by a method known to those skilled in the art. It is also possible to use cell lines derived from human cancer tissues that are generally available to those skilled in the art from institutions such as the American Type Culture Collection (ATCC®).
  • ATCC® American Type Culture Collection
  • NY-ESO-1 The aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention contain, as a cancer antigen, a polynucleotide encoding New York esophageal cancer cell carcinoma 1 or a fragment thereof. I'm out. NY-ESO-1 is a protein also called cancer / testis antigen 1 (CTAG1) and is expressed in various cancers, but it is expressed only in the testis in normal adult tissues. It has been known.
  • CTAG1 cancer / testis antigen 1
  • the NY-ESO-1 used in the present invention may be a naturally occurring NY-ESO-1, or as long as it induces NY-ESO-1 specific T cells when administered as aAVC. It may be a variant thereof.
  • the NY-ESO-1 used in the present invention is a NY-ESO-1 derived from a mammal (eg, human, monkey, mouse, rat, dog, chimpanzee, etc.).
  • NY-ESO-1 is human NY-ESO-1.
  • human NY-ESO-1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • human NY-ESO-1 has at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more identity with the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. It is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having. In one embodiment, human NY-ESO-1 has one or several, preferably 1-10, more preferably 1-7, even more preferably 1-5, in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which 1, 1 to 3, or 1 to 2 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added.
  • NY-ESO-1 used in the present invention may be a fragment of NY-ESO-1 as long as it induces NY-ESO-1 specific T cells when administered as aAVC.
  • the NY-ESO-1 fragment is a human NY-ESO-1 fragment.
  • the fragment of human NY-ESO-1 is 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the induction of NY-ESO-1-specific T cells by administration as aAVC can be evaluated, for example, by the method described in Example 1-2 below.
  • a base sequence is designed from the amino acid sequence of NY-ESO-1 or a fragment thereof used by a method known in the art. And can be made.
  • the polynucleotide encoding NY-ESO-1 is a polynucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • CD1d The aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention contain a polynucleotide encoding CD1d.
  • CD1d is an MHC class I-like glycoprotein expressed on the cell surface.
  • the CD1d used in the present invention may be a naturally occurring CD1d or a variant thereof, as long as it has the function of CD1d when expressed in human-derived cells.
  • Functions of CD1d include the ability to bind to a CD1d ligand (eg, ⁇ -GalCer). The ability of CD1d to bind to a CD1d ligand can be readily evaluated by one of ordinary skill in the art using known methods.
  • the function of CD1d can also be evaluated using the ability of aAVC to activate human NKT cells as an index.
  • the ability to activate human NKT cells is described, for example, in Fig. 5 of Non-Patent Document 5. It can be evaluated in the in vitro evaluation system described in 1. Simply, the activation of NKT cells can be evaluated by co-culturing CD1d-expressing cells cultured in the presence of ⁇ -GalCer with NKT cells and measuring the amount of IFN- ⁇ in the culture medium.
  • the CD1d used in the present invention is a CD1d derived from a mammal (eg, human, monkey, mouse, rat, dog, chimpanzee, etc.).
  • the CD1d is a human CD1d.
  • human CD1d is a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • human CD1d lacks 1-10, 1-7, 1-5, 1-3, or 1-2 amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • human CD1d is an amino acid having at least 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity with the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 4. It is a polypeptide consisting of a sequence and having the function of CD1d.
  • the polynucleotide encoding CD1d used in the present invention may be a polynucleotide inherent in the human-derived cell used, or may be an exogenously introduced polynucleotide.
  • the polynucleotide shall be prepared by designing a base sequence from the amino acid sequence of CD1d used by a method known in the art. Can be done.
  • the polynucleotide encoding CD1d is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof is operably linked to an inducible promoter.
  • "operably linked” means a state in which a promoter is linked to a polynucleotide in order to control expression of the polypeptide in a host cell.
  • the polynucleotide encoding CD1d when the polynucleotide encoding CD1d is introduced into a human-derived cell exogenously, the polynucleotide may be operably linked to a promoter.
  • the promoter for expressing CD1d either a promoter that constitutively promotes expression or an inducible promoter can be used.
  • an “inducible promoter” is a promoter that induces expression, and is an inducing factor that drives the promoter (also referred to herein as an "inducible factor of an inducible promoter” or simply an “inducible factor”).
  • the inducible promoter include a thermal inducible promoter (for example, a heat shock promoter) and a drug-inducible promoter.
  • the inducible promoter is a drug-inducible promoter.
  • drug-induced promoter means a promoter whose expression of a polynucleotide operably linked to the promoter is regulated by a drug that is an inducing factor.
  • examples of the drug-induced promoter include a Cumate operator sequence, a ⁇ operator sequence (for example, 12 ⁇ ⁇ Op), an inducible promoter of a tetracycline gene expression-inducing system (hereinafter, referred to as “tetracycline-based inducible promoter”), and the like.
  • the Cumate operator sequence is inactive in the presence of the CymR repressor, but dissociates from the CymR repressor in the presence of the inducing factor Cumate to induce expression of the polynucleotide operably linked to the promoter.
  • the ⁇ operator sequence is operably linked to the promoter in the presence of an inducer (eg, cumermycin) that dimers an activator ( ⁇ Rep-GyrB-AD) capable of activating transcription by dimerization. Induces the expression of the polynucleotide.
  • Tetracycline-based inducible promoters act on the promoter in the presence of inducing factors tetracycline or derivatives thereof (eg, doxycycline, etc.) and reverse tetracycline-controlled trans-activating factor (rtTA) (eg, Tet-On 3G). Induces the expression of the freely linked polynucleotide.
  • inducing factors tetracycline or derivatives thereof eg, doxycycline, etc.
  • rtTA reverse tetracycline-controlled trans-activating factor
  • Tet-On 3G Tet-On 3G
  • the tetracycline-based inducible promoter include the TRE3G promoter.
  • the drug-induced promoter is a tetracycline-based inducible promoter
  • the tetracycline-based inducible promoter is a TRE3G promoter.
  • promoters that constitutively promote expression include virus-derived promoters such as CMV (cytomegalovirus), RSV (respiratory syncytial virus), SV40 (simian virus 40), actin promoters, and EF (elongation factor) ⁇ . Be done.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV respiratory syncytial virus
  • SV40 simian virus 40
  • actin promoters simian virus 40
  • EF elongation factor
  • the expression of NY-ESO-1 or a fragment thereof can be induced by culturing the cells in the presence of an inducing factor of an inducible promoter.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention express NY-ESO-1 or a fragment thereof.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention express CD1d and NY-ESO-1 or fragments thereof.
  • the lower limit of the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is greater than 10 6 cells per 88Ng, or 90 ng, 100 ng or more, more 150ng , 200 ng or more, 245 ng or more, 250 ng or more, 300 ng or more, 400 ng or more, 500 ng or more, 600 ng or more, 700 ng or more, 800 ng or more, 900 ng or more, 1000 ng or more, 1500 ng or more, 2000 ng or more, 2500 ng or more, 3000 ng or more, 4000 ng or more, 5000 ng
  • the above is 6000 ng or more, 7000 ng or more, 8000 ng or more, 9000 ng or more, or 10000 ng or more, and the upper limit is 30,000 ng or less, 35,000 ng or less, 40,000 ng or less, 43890 ng or less, 45,000 ng or less, 50,000 ng
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 89 ng to 50,000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 89 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 89 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 89 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 89 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 106 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 106 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 106 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 106 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 245 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 245 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 245 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 245 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 1000 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 1000 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 1000 ng to 40,000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is 1000 ng to 35000 ng.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention may carry the CD1d ligand on the cell surface.
  • the phrase "loaded with a CD1d ligand on the cell surface” refers to a state in which the CD1d ligand is bound to the surface of aAVC cells.
  • a CD1d ligand for example, ⁇ -GalCer
  • a CD1d ligand is applied to cells expressing CD1d. It can be done by pulsing.
  • pulse the CD1d ligand refers to contacting the cells with the CD1d ligand in the culture medium. In aAVC pulsed with the CD1d ligand, all or at least some of the CD1d are loaded with the CD1d ligand.
  • CD1d ligand used in the present invention examples include ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ -GalCer), ⁇ -C-galactosylceramide ( ⁇ -C-GalCer), 7DW8-5, and isoglobotolihexosylceramide (iGb3). Etc. exist.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • ⁇ -GalCer The chemical name of ⁇ -GalCer is (2S, 3S, 4R) -1-O- ( ⁇ -D-galactosyl) -N-hexacosanoyl-2-amino-1,3,4-octadecanetriol, and CAS RN: It is a substance (molecular weight: 858.34) registered under 158021-47-7 and represented by the molecular formula: C 50 H 99 NO 9.
  • ⁇ -GalCer may be synthesized according to a technique known in the art, or commercially available one (for example, ⁇ -Galactosylceramide (Funakoshi, Cat.KRN7000)) may be used.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention are polynucleotides encoding NY-ESO-1 or fragments thereof operably linked to an inducible promoter to human-derived cells, and, if necessary, CD1d. It can be prepared by introducing a polynucleotide encoding the above.
  • the method for producing aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention further includes a step of culturing the aAVC-NY-ESO-1 cells, a step of cloning the cells, and a step of loading the CD1d ligand on the cell surface. You may.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention are NY-ESO-1 or NY-ESO-1 operably linked to human-derived cells with a polynucleotide encoding CD1d and an inducible promoter. It can be prepared by introducing a polynucleotide encoding a fragment (hereinafter, the polynucleotide to be introduced is also referred to as a "target polynucleotide").
  • the aAVC-NY-ESO-1 cell of the present invention can act as an inducible promoter for the human-derived cell that endogenously expresses CD1d. It can be prepared by introducing a polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof linked to.
  • a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence is obtained from NCBI RefSeq ID or GenBank's Accession number, and standard molecular biology is performed. And / or can be designed and made using chemical techniques.
  • the polynucleotide can be synthesized based on its base sequence by a phosphoramidite method or the like, or is prepared by combining DNA fragments obtained from a cDNA library using a polymerase chain reaction (PCR). can do.
  • the target polynucleotide can be introduced into human-derived cells by using either a non-viral vector method such as electroporation, lipofection, or microinjection, or a viral vector method.
  • a non-viral vector method such as electroporation, lipofection, or microinjection
  • a viral vector method e.g., a viral vector method
  • the target polynucleotide may be in the form of a plasmid vector, cDNA, etc. or in the form of mRNA.
  • the plasmid vector or viral vector can be used as an expression vector for exogenously expressing CD1d or NY-ESO-1 or a fragment thereof in human-derived cells.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can express the target polypeptide, and can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • As the expression vector for example, pcDNA series (Thermo Fisher Scientific), pALTER (registered trademark) -MAX (Promega), pHEK293 Ultra Expression Vector (Takara Bio), etc. can be used as the plasmid vector.
  • the viral vector for example, lentivirus, adenovirus, retrovirus, or adeno-associated virus can be used.
  • the lentivirus when a lentivirus is used for introducing a target polynucleotide into a human-derived cell, the lentivirus can be prepared using a pLVSIN-CMV / EF1 ⁇ vector (Takara Bio Inc.) or a pLenti vector (Thermo Fisher Scientific). ..
  • CD1d and NY-ESO-1 or a fragment thereof are expressed exogenously in human-derived cells
  • one expression vector is used for the polynucleotide encoding CD1d and the polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof. It may be introduced into human-derived cells, or it may be introduced using separate expression vectors.
  • the expression vector contains a gene that can be a marker for confirming the expression of the target gene or polynucleotide (for example, a drug resistance gene, a gene encoding a reporter enzyme, a gene encoding a fluorescent protein, etc.). You may be.
  • the expression vector may further include start and stop codons, enhancer sequences, untranslated regions, splicing junctions, polyadenylation sites, replicable units, and the like.
  • the method of making aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is NY-ESO operably linked to an expression vector containing a polynucleotide encoding CD1d and an inducible promoter in human-derived cells. Including the step of introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding -1 or a fragment thereof.
  • the method for producing aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is NY-ESO-1 or operably linked to a human-derived cell with a polynucleotide encoding CD1d and an inducible promoter. It comprises the step of introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding a fragment.
  • the method for producing aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is NY-ESO-1 or NY-ESO-1 operably linked to an inducible promoter to human-derived cells that endogenously express CD1d. It comprises the step of introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding the fragment.
  • the expression vector is a plasmid vector or a viral vector
  • the expression vector is a viral vector
  • the viral vector is a lentivirus. It is a vector.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention are NY-ESO-1 or operably linked to an expression vector containing a polynucleotide encoding CD1d and an inducible promoter in human-derived cells.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention encode NY-ESO-1 or fragments thereof operably linked to a human-derived cell with a polynucleotide encoding CD1d and an inducible promoter. It is a cell prepared by introducing an expression vector containing a polynucleotide to be used.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention are a human-derived cells that endogenously express CD1d with NY-ESO-1 or fragments thereof operably linked to an inducible promoter.
  • the expression vector is a plasmid vector or viral vector, in one embodiment, the expression vector is a viral vector, and in one embodiment, the viral vector is lentivirus. It is a vector.
  • the generated aAVC-NY-ESO-1 cells are operably linked to a polynucleotide encoding CD1d and an inducible promoter on the genomic DNA of the extrachromosomal or cell nucleus of NY-ESO-. It has a polynucleotide encoding one or a fragment thereof.
  • the cells produced have a polynucleotide encoding CD1d and a polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof operably linked to an inducible promoter on the genomic DNA of its cell nucleus. Have.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells produced by the above method can be further grown by culturing.
  • the cells for maintaining or proliferating aAVC-NY-ESO-1 cells are cultured by a known method.
  • the basal medium include MEM medium (Science; 1952; 122: 501), DMEM medium (Virology; 1959; 8: 396-397), and RPMI 1640 medium (J. Am. Med. Assoc .; 1967; 199: 519). -524), 199 Medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med .; 1950; 73: 1-8), FreeStyle TM 293 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat.
  • Culture media include, for example, serum (eg, fetal bovine serum), serum substitutes (eg, KnockOut Serum Replacement: KSR), fatty acids or lipids, amino acids, vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, It can contain serum, buffers, inorganic salts, antibiotics and the like.
  • the medium used for culturing is serum-free medium or chemically defined medium.
  • Culture conditions for example, culture conditions such as culture time, temperature, pH of medium, CO 2 concentration, etc.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8
  • the culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the culturing time is not particularly limited, but is about 15 to 336 hours. Ventilation and agitation can be performed if necessary.
  • aAVC-NY-ESO-1 cells When culturing aAVC-NY-ESO-1 cells, aAVC-NY-ESO-1 cells may be brought into contact with an inducer of an inducible promoter to induce the expression of NY-ESO-1 or a fragment thereof.
  • the method of making aAVC-NY-ESO-1 cells is to culture aAVC-NY-ESO-1 cells in the presence of an inducer of an inducible promoter to create NY-ESO-1 or a fragment thereof. Includes the step of inducing the expression of.
  • the inducible promoter is a drug-inducible promoter
  • the production method comprises culturing aAVC-NY-ESO-1 cells in the presence of an inducer of the drug-inducible promoter.
  • a drug-induced promoter When a drug-induced promoter is used, cells are cultured in a medium containing a drug such as tetracycline, doxycycline, Cumate, or cumermycin, which are inducing factors, and a gene or polynucleotide operably linked to the drug-induced promoter is used. Expression may be induced.
  • the step can be performed according to a gene induction method using a general gene induction system.
  • the drug-inducible promoter is a tetracycline-based inducible promoter
  • the production method comprises culturing aAVC-NY-ESO-1 cells in the presence of tetracycline or a derivative thereof and rtTA.
  • the tetracycline-based inducible promoter is a TRE3G promoter, the production method comprising culturing aAVC-NY-ESO-1 cells in the presence of tetracycline or a derivative thereof and Tet-On 3G.
  • the expression levels of CD1d and NY-ESO-1 or fragments thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells were determined by the Western Blot method, ELISA method, and flow site using an anti-CD1d antibody or an anti-NY-ESO-1 antibody. It can be measured by a method known by those skilled in the art such as a metric method.
  • NY-ESO operably linked to a polynucleotide encoding CD1d and an inducible promoter by a method of obtaining cells having a single genotype from the cell pool (referred to herein as "cloning").
  • a cell population having a single genotype (hereinafter, "" A “population of cloned cells”) can be obtained.
  • Cloning of aAVC-NY-ESO-1 cells can be performed using methods well known to those of skill in the art, for example, ultradilution, single cell sorting, or colony pickup methods. it can.
  • the cloning method for aAVC-NY-ESO-1 cells can also be a combination of one or more of the ultradilution method, the single cell sorting method, or the colony pickup method. In one embodiment, the cloning method for aAVC-NY-ESO-1 cells is the ultradilution method.
  • a part of the cloned aAVC-NY-ESO-1 cell was contacted with an inducer of an inducible promoter, and CD1d and NY-ESO-1 or NY-ESO-1 or A population of cloned aAVC-NY-ESO-1 cells showing the desired expression level for CD1d and NY-ESO-1 or a fragment thereof in the presence of an inducer by measuring the expression level of the fragment.
  • a frozen population of selected cloned cells also referred to as "frozen product" can be used as a research cell bank (RCB).
  • RCB cells can be cultured, proliferated, frozen and used as a master cell bank (MCB).
  • MCB cells can be cultured, proliferated, and frozen to be used as a working cell bank (WCB).
  • Cultured WCB cells can be used as a raw material for pharmaceutical products.
  • Each cell bank may contain a cryoprotectant.
  • Each cell bank may be dispensed into a plurality of containers (for example, 2 to 10000 containers, for example, 10 to 1000 containers, for example, 100 to 500 containers) and stored in a frozen state.
  • the lower limit of the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells obtained, more than 10 6 cells per 88Ng, or 90 ng, 100 ng or more, 150 ng or more, 200 ng or more, 245 ng or more, 250 ng or more, 300 ng or more, 400 ng or more, 500 ng or more, 600 ng or more, 700 ng or more, 800 ng or more, 900 ng or more, 1000 ng or more, 1500 ng or more, 2000 ng or more, 2500 ng or more, 3000 ng or more, 4000 ng or more, 5000 ng or more , 6000 ng or more, 7,000 ng or more, 8,000 ng or more, 9000 ng or more, or 10000 ng or more, and the upper limit values are 30,000 ng or less, 35,000 ng or less, 40,000 ng or less, 43890 ng or less, 45,000 ng or less, 50,000 ng
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 50,000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 40,000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in the obtained aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 35000 ng.
  • aAVC-NY-ESO-1 cells loaded with CD1d ligand can be prepared. ..
  • the conditions for pulsing the CD1d ligand are determined in consideration of the cells to be used and various conditions at the time of culture. It can be adjusted appropriately by the vendor.
  • the concentration of the CD1d ligand added to the culture medium of aAVC-NY-ESO-1 cells is not particularly limited, but can be appropriately selected in the range of, for example, 1 ng / mL to 10000 ng / mL.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • loading of the CD1d ligand into aAVC-NY-ESO-1 cells can occur prior to contact of the cells with the inducer.
  • loading of the CD1d ligand into aAVC-NY-ESO-1 cells can occur after contact of the cells with the inducer.
  • loading of the CD1d ligand into aAVC-NY-ESO-1 cells can occur at the same time as contact of the cells with the inducer.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells are preferably cloned.
  • aAVC-NY-ESO-1 cells expressing the CD1d and NY-ESO-1 prepared above or fragments thereof and carrying the CD1d ligand the proliferation of the cells is stopped by an artificial method. May be good.
  • the method for stopping the proliferation of the cells is not particularly limited, and for example, a method for stopping the cell proliferation by irradiation with radiation (for example, X-ray), a method for adding a drug such as mitomycin C, or the like can be used.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention can be cells that express CD1d and NY-ESO-1 or fragments thereof and have arrested proliferation.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention can be cells that express CD1d and NY-ESO-1 or fragments thereof, are loaded with a CD1d ligand, and have arrested proliferation.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention.
  • aAVC-NY-ESO-1 cells express CD1d and NY-ESO-1 or fragments thereof, and the CD1d ligand is loaded on the surface of the cells.
  • the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the pharmaceutical composition can be prepared by a commonly used method using excipients commonly used in the art, such as pharmaceutical excipients and pharmaceutical carriers.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a frozen product of aAVC-NY-ESO-1 cells. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a frozen product of aAVC-NY-ESO-1 cells and a cryoprotectant. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the invention may comprise a suspension of aAVC-NY-ESO-1 cells. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a suspension of aAVC-NY-ESO-1 cells and a cryoprotectant.
  • the present invention is also the use of the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention for producing pharmaceutical compositions for use in the treatment of cancer, wherein the cells are CD1d and NY-ESO-1 or.
  • the fragment is expressed and the surface of the cell is loaded with a CD1d ligand, which provides the use.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the present invention is also the aAVC-NY-ESO-1 cell of the present invention for treating cancer, expressing CD1d and NY-ESO-1 or a fragment thereof, and loading a CD1d ligand on the surface of the cell. Donate cells.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the present invention also provides a method of treating cancer, comprising the step of administering the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention to a subject.
  • aAVC-NY-ESO-1 cells express CD1d and NY-ESO-1 or fragments thereof, and carry a CD1d ligand on the surface of the cells.
  • the CD1d ligand is ⁇ -GalCer.
  • the "subject” is a mammal (eg, human, monkey, mouse, rat, dog, chimpanzee, etc.), and in one embodiment, the subject is a human.
  • the term "treatment” is used to include therapeutic and prophylactic treatment.
  • aAVC-NY-ESO-1 cells When administered to a subject, they can be administered to the subject in the form of a pharmaceutical composition comprising aAVC-NY-ESO-1 cells and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the dose and frequency of administration of aAVC-NY-ESO-1 cells to a subject can be appropriately adjusted according to the type, location, severity of cancer, age, body weight and condition of the subject to be treated.
  • the dose of aAVC-NY-ESO-1 cells can be, for example, 1 ⁇ 10 3 cells / kg to 1 ⁇ 10 9 cells / kg in a single administration to a subject.
  • a method of administering aAVC-NY-ESO-1 cells to a subject may be administered by injection or infusion into a vein, intratumor, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial or the like. it can.
  • the treatment method of the present invention can be used in combination with other cancer treatment methods.
  • Other cancer treatment methods include surgery, radiation therapy, hematopoietic stem cell transplantation, or treatment with other anticancer agents.
  • the cancer to be treated according to the present invention is not particularly limited, but is limited to acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), hodgkin lymphoma, non-hodgkin lymphoma, B-cell lymphoma, and multiple cancers.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • hodgkin lymphoma non-hodgkin lymphoma
  • B-cell lymphoma B-cell lymphoma
  • multiple cancers multiple cancers.
  • Hematological cancers such as myeloma and T-cell lymphoma, myelodystrophy syndrome, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, squamous cell carcinoma, undifferentiated cancer, large cell cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer , Middle dermatoma, skin cancer, breast cancer, prostate cancer, bladder cancer, vaginal cancer, cervical cancer, head and neck cancer, uterine cancer, cervical cancer, liver cancer, cholecyst cancer, Solid cancers such as bile duct cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, lung cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, small intestine cancer, stomach cancer, esophageal cancer, testis cancer, ovarian cancer, and brain cancer , And cancers of bone tissue, cartilage tissue, adipose tissue, muscle tissue, vascular tissue and hematopoietic tissue, as well as sarcoma such as chondrosarcoma, Ewing sarcoma
  • the cancer targeted for the treatment of the present invention is a NY-ESO-1 positive cancer.
  • compositions of the present invention use, cells, and the method of treating cancer, the expression level per 10 6 cells of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells, for example, the lower limit value Is over 88 ng, 90 ng or more, 100 ng or more, 150 ng or more, 200 ng or more, 245 ng or more, 250 ng or more, 300 ng or more, 400 ng or more, 500 ng or more, 600 ng or more, 700 ng or more, 800 ng or more, 900 ng or more, 1000 ng or more, 1500 ng or more, 2000 ng or more, 2500 ng or more, 3000 ng or more, 4000 ng or more, 5000 ng or more, 6000 ng or more, 7000 ng or more, 8000 ng or more, 9000 ng or more, or 10000 ng or more, and the upper limit is 30,000 ng or less, 35,000 ng or less, 40,000 ng or less, 4
  • the lower limit of the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells more than 10 6 cells per 88Ng, or 90 ng, 100 ng or more, 150 ng or more, more 200ng 245 ng or more, 250 ng or more, 300 ng or more, 400 ng or more, 500 ng or more, 600 ng or more, 700 ng or more, 800 ng or more, 900 ng or more, 1000 ng or more, 1500 ng or more, 2000 ng or more, 2500 ng or more, 3000 ng or more, 4000 ng or more, 5000 ng or more, 6000 ng
  • the above is 7,000 ng or more, 8,000 ng or more, 9000 ng or more, or 10,000 ng or more, and the upper limit is 30,000 ng or less, 35,000 ng or less, 40,000 ng or less, 43890
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 50,000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 89 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 106 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 40,000 ng.
  • the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 245 ng to 35000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 45000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 43890 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 40,000 ng. In one embodiment, the expression level of NY-ESO-1 or a fragment thereof in aAVC-NY-ESO-1 cells is 1000 ng to 35000 ng.
  • the present invention is also used in the treatment of cancer, which comprises contacting the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention with an inducing factor of an inducible promoter to induce the expression of NY-ESO-1 or a fragment thereof.
  • a method for producing a cell or a pharmaceutical composition is provided.
  • the production method comprises the step of inducing the expression of NY-ESO-1 or a fragment thereof by culturing the aAVC-NY-ESO-1 cells in the presence of an inducing factor of an inducible promoter. Including.
  • the production method further comprises loading ⁇ -GalCer on the cell surface.
  • the loading of the CD1d ligand on the cell surface may be before, after, or at the same time the contact between the aAVC-NY-ESO-1 cells and the inducer.
  • the present invention also provides the use of the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention in the manufacture of pharmaceutical compositions used in the treatment of cancer.
  • the present invention also provides a method for producing a cell or pharmaceutical composition used in the treatment of cancer, which comprises the following steps: A step of introducing a polynucleotide encoding CD1d and a polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof operably linked to an inducible promoter into a human-derived cell, or a human-derived cell that endogenously expresses CD1d. Introducing a polynucleotide encoding NY-ESO-1 or a fragment thereof operably linked to an inducible promoter.
  • the production method brings the cells (aAVC-NY-ESO-1 cells) obtained in the step into contact with an inducer of an inducible promoter to express NY-ESO-1 or a fragment thereof. It further includes a step of inducing. In one embodiment, the production method comprises the step of inducing the expression of NY-ESO-1 or a fragment thereof by culturing the aAVC-NY-ESO-1 cells in the presence of an inducing factor of an inducible promoter. Including. In one embodiment, the production method further comprises loading ⁇ -GalCer on the cell surface. The loading of the CD1d ligand on the cell surface may be before, after, or at the same time the contact between the aAVC-NY-ESO-1 cells and the inducer.
  • the present invention also provides a method of treating cancer, comprising the step of administering the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention and an immune checkpoint inhibitor to a subject.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cancer containing the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention, which is used in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention also provides the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention for treating cancer, which are used in combination with immune checkpoint inhibitors.
  • the present invention also provides the use of the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention to produce a pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer, which is used in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cell of the invention expresses CD1d and NY-ESO-1 or a fragment thereof, and loads the CD1d ligand on the surface of the cell.
  • immune checkpoint inhibitor means an agent that activates immunity by releasing the suppression of immune cells caused by an immune checkpoint molecule.
  • Immunocheckpoint molecules include programmed cell death-1 (Programmed cell death 1; PD-1), cytotoxic T-lymphocyte-related protein 4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4; CTLA-4), and T cell immunity.
  • T-cells containing globulin domain and mucin domain-3 T-cell immunoglobulin domine and mucin domain-3; TIM-3
  • lymphocyte activation gene 3 lymphocyte activation gene 3; LAG-3
  • V-type immunoglobulin domain examples thereof include an activation inhibitor (V-type immunoglobulin domine-contining support of T-cell activation; VISTA) and the like.
  • the immune checkpoints carried by these molecules are called PD-1 immune checkpoints, CTLA-4 immune checkpoints, TIM-3 immune checkpoints, LAG-3 immune checkpoints, and VISTA immune checkpoints.
  • Immune checkpoint inhibitors can inhibit the function of immune checkpoints, for example by binding to immune checkpoint molecules or their ligands.
  • a PD-1 immune checkpoint inhibitor can inhibit a PD-1 immune checkpoint by inhibiting the binding of PD-1 to PD-L1 or PD-L2.
  • CTLA-4 immune checkpoint inhibitors can inhibit CTLA-4 immune checkpoints by inhibiting the binding of CTLA-4 to CD80 or CD86.
  • the TIM-3 immune checkpoint inhibitor can inhibit the TIM-3 immune checkpoint by inhibiting the binding of TIM-3 to galectin-9.
  • LAG-3 immune checkpoint inhibitors can inhibit LAG-3 immune checkpoints by inhibiting the binding of LAG-3 to MHC class II molecules.
  • the VISTA-based immune checkpoint inhibitor can inhibit the VISTA-based immune checkpoint by inhibiting the binding between VISTA and VISIG-3 / IGSF11.
  • Immune checkpoint inhibitors are one or more immune checkpoints such as PD-1 immune checkpoints, CTLA-4 immune checkpoints, TIM-3 immune checkpoints, LAG3 immune checkpoints, and VISTA immune checkpoints.
  • antibodies that inhibit the PD-1 immune checkpoint include anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, or anti-PD-L2 antibody, such as nivolumab, pemprolizumab, MK-3475, AMP-.
  • pidirisumab AMP-514, ANB-011, BGB-A317, REGN-2810, HR301210, PF-06801591, JS-001, IBI-308, CBT-501, abelumab, atezolizumab, BMS-936559, LY-3300054, JNJ-61610588, and durvalumab
  • the antibody that inhibits the CTLA-4 immune checkpoint include anti-CTLA-4 antibody, anti-CD80 antibody, and anti-CD86 antibody, and for example, ipilimumab and tremelimumab can be used.
  • Examples of the antibody that inhibits the TIM-3 immune checkpoint include anti-TIM-3 antibody and anti-galectin-9 antibody, and for example, MGB453 can be used.
  • Examples of the antibody that inhibits the VISTA immune checkpoint include an antibody selected from the group consisting of an anti-VISTA antibody or an anti-VSIG-3 / IGSF11 antibody, and for example, JNJ-61610588 can be used.
  • AUPM-170 can also be used as a low molecular weight compound.
  • the combined use of the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention with an immune checkpoint inhibitor can enhance the antitumor effect of aAVC-NY-ESO-1 cells.
  • the immune checkpoint inhibitor that can be used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is a PD-1 immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, or an anti-PD-L2 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is nivolumab, pemprolizumab, avelumab, atezolizumab, or durvalumab. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is nivolumab or pemprolizumab. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is pemprolizumab. In yet another embodiment, the immune checkpoint inhibitor that can be used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is a CTLA-4 immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is an anti-CTLA-4 antibody, an anti-CD80 antibody, or an anti-CD86 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is ipilimumab or tremelimumab.
  • the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is nivolumab or pemprolizumab.
  • the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is ipilimumab.
  • an immune check administered to a subject for a method of treating cancer comprising administering to the subject the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention and an immune checkpoint inhibitor.
  • the point inhibitor is a PD-1 immune checkpoint inhibitor or a CTLA-4 immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is a PD-1 immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, or an anti-PD-L2 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is nivolumab, pemprolizumab, avelumab, atezolizumab, or durvalumab.
  • the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is nivolumab or pemprolizumab. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention is pemprolizumab. In yet another embodiment, the immune checkpoint inhibitor that can be used in combination with the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention is a CTLA-4 immune checkpoint inhibitor. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is an anti-CTLA-4 antibody, an anti-CD80 antibody, or an anti-CD86 antibody. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is ipilimumab or tremelimumab. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is nivolumab or pemprolizumab. In one embodiment, the immune checkpoint inhibitor administered to the subject is ipilimumab.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention and immune checkpoint inhibitors can be administered simultaneously, sequentially, sequentially or in duplicate. Either of the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention and the immune checkpoint inhibitor may be administered first. In one embodiment, administration of the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention can be initiated prior to administration of an immune checkpoint inhibitor. In one embodiment, administration of the immune checkpoint inhibitor can be initiated prior to administration of the aAVC-NY-ESO-1 cells of the invention.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention and the immune checkpoint inhibitor can be independently administered as a single dose or multiple doses, respectively. In one embodiment, in the combination therapy of aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention and a monotherapy with an immune checkpoint inhibitor, an anticancer agent such as an additional additional chemotherapeutic agent may be used in combination. ..
  • Example 1-1 Preparation of mouse type aAVC (3T3) -NY-ESO-1
  • NY-ESO was applied to mouse NIH / 3T3 cells (ATCC, Cat.CRL-1658).
  • a mouse-type aAVC also referred to as aAVC (3T3) -NY-ESO-1) into which the mRNAs of the -1 gene and the CD1d gene were introduced was prepared.
  • the NY-ESO-1 gene (SEQ ID NO: 1) was prepared by artificial gene synthesis based on the amino acid sequence of human NY-ESO-1 shown in SEQ ID NO: 2.
  • the NY-ESO-1 gene is amplified by the PCR method using a primer added with a sequence complementary to 15 bases including the HindIII or EcoRI recognition sequence of the pGEM®-4Z plasmid (Promega, Cat. P2161). did.
  • the amplified NY-ESO-1 gene was inserted into the HindIII-EcoRI site of pGEM®-4Z using an In-Fusion® HD Cloning Kit (Takara Bio Inc., Cat. 639648).
  • the obtained plasmid is referred to as a pGEM-4Z-NY-ESO-1 plasmid.
  • a gene was synthesized by artificial gene synthesis based on the mouse CD1d gene (UniProt: P11609-1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 6)) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 at the HindIII-BamHI site of the pGEM®-4Z plasmid. Synthetic) was inserted.
  • the obtained plasmid is referred to as a pGEM-4Z-mCD1d plasmid.
  • mMESSAGE mMACHINE TM T7 ULTRA Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Cat AMB13455) was used to prepare NY-ESO-1 mRNA and CD1d mRNA.
  • NY-ESO-1 mRNA and CD1d mRNA are added to the turbid solution, and electroporation (pouring pulse: voltage 150 V, pulse width 8 ms, pulse interval 50 ms, number of times 2 times) using NEPA21 electroporator (Neppagene Co., Ltd.) , Attenuation rate 10%, polarity +, transfer pulse: voltage 20V, pulse width 50ms, pulse interval 50ms, number of times ⁇ 5 times, attenuation rate 40%, polarity +/-).
  • the cells were collected and irradiated with an amount of 30 Gy of X-rays using an X-ray irradiation device MBR-1520R-3 (Hitachi Power Solutions Co., Ltd.).
  • the cells obtained by the above method are referred to as aAVC (3T3) -NY-ESO-1.
  • Example 1-2 NY-ESO-1 specific T cell inducing ability of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 in mouse] 5 ⁇ 10 5 cells aAVC (3T3) -NY- suspended in BICANATE Injection (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) in the tail vein of 5 6-week-old C57BL / 6J female mice (Charles River, Japan) in each group. ESO-1 was administered. The control group received 200 ⁇ L of BICANATE Injection.
  • Spleen cells were collected from mice 7 days after administration and seeded on a plate of mouse IFN- ⁇ single-color enzamatic ELISPOT assay kit (Cellular Technology Lymited, Cat.mIFNgp-2M / 5) in 4 ⁇ 10 5 cells. .. Furthermore, in order to stimulate NY-ESO-1-specific T cells, the NY-ESO-1 peptide (PepTivator NY-ESO-1-premium grade), which is an overlapping peptide covering the entire length of the NY-ESO-1 protein sequence, is used. , Human (Miltenyi Biotec, Cat.
  • Example 1-3 Antigen-specific antitumor effect of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 in NY-ESO-1 expression B16 melanoma cell-bearing mice
  • the tail veins of 10 8-week-old C57BL / 6J female mice (Charles River, Japan) in each group were administered with 5 ⁇ 10 5 cells of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 suspended in BICANATE Injection.
  • the control group received 200 ⁇ L of BICANATE Injection. 14 days after administration, 3 ⁇ 10 5 cells of B16-F10 melanoma cells (ATCC, Cat) suspended in D-PBS (-) (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Cat.
  • B16-F10 melanoma cells expressing the NY-ESO-1 protein prepared by introducing the NY-ESO-1 gene of 3 ⁇ 10 5 cells suspended in CRL-6475) or D-PBS (-). (Hereinafter referred to as B16-NY-ESO-1 or B16-NY-ESO-1 cells) were inoculated respectively. The day when the cancer cells were inoculated was set as the 0th day, and the change in tumor volume for 20 days was measured.
  • aAVC (3T3) -NY-ESO-1 significantly suppressed the growth of B16-NY-ESO-1 tumors, whereas the growth of B16-F10 tumors that did not express NY-ESO-1 was It was not suppressed (Fig. 1-2). From this result, it was suggested that aAVC (3T3) -NY-ESO-1 has a NY-ESO-1-specific antitumor effect based on the induction of NY-ESO-1-specific immunity.
  • Example 1-4 Examination of the number of cells of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 showing an antitumor effect in NY-ESO-1 expression B16 melanoma cell-bearing mice] Eight-week-old C57BL / 6J female mice (Charles River, Japan) were subcutaneously inoculated with 3 ⁇ 10 5 cells of B16-NY-ESO-1 cells suspended in D-PBS (-). Seven days after cell inoculation, the mice were divided into 5 groups of 10 cases in each group based on the tumor volume, and aAVC (3T3) -NY-ESO-1 suspended in the solvent BICANATE Injection was 5 each from the tail vein.
  • the dose was administered so as to be ⁇ 10 2 cells / mouse, 5 ⁇ 10 3 cells / mouse, 5 ⁇ 10 4 cells / mouse, and 5 ⁇ 10 5 cells / mouse.
  • the control group received 200 ⁇ L of BICANATE Injection.
  • the day on which aAVC (3T3) -NY-ESO-1 was administered was set as day 0, and changes in tumor volume were measured for 10 days.
  • 2 individuals died after administration of aAVC (3T3) -NY-ESO-1, so the number of cases after the 0th day is set to 8.
  • the growth of B16-NY-ESO-1 tumor was significantly suppressed in the administration group of 5 ⁇ 10 3 cells / mouse or higher (Fig. 1-3).
  • the expression level of NY-ESO-1 of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 used in this experiment was 245 ng / 1 ⁇ 10 6 cells.
  • mouse-type aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cells are NY-ESO-1 specific by inducing NY-ESO-1 specific T cells in a mouse in vivo evaluation system. It was confirmed that it has an antitumor effect.
  • human-type aAVC-NY-ESO-1 cells induce innate immunity to exert an antitumor effect, induce antigen-specific acquired immunity, and exert an antitumor effect based on acquired immunity. Since it can be expected, the purpose is to create a therapeutic drug showing a NY-ESO-1-specific antitumor effect on human NY-ESO-1-expressing cancer, and the following are human aAVC-NY-ESO-1 cells. Was examined.
  • Human type aAVC-NY-ESO-1 cells were prepared by the following method.
  • a lentivirus was prepared using a plasmid carrying the NY-ESO-1, CD1d, and Tet3G genes, respectively, and the gene was transferred to FreeStyle 293-F cells (Thermo Fisher Scientific, Cat. R79007) using the lentivirus.
  • FreeStyle 293-F cells Thermo Fisher Scientific, Cat. R79007
  • aAVC cells expressing NY-ESO-1, CD1d, and Tet3G were constructed.
  • Example 2-1 Lentivirus preparation
  • a lentivirus plasmid pLVsyn-CMV (SEQ ID NO: 7) was prepared.
  • An EcoRI recognition sequence was added to the 5'end side of the NY-ESO-1 gene (SEQ ID NO: 1), and a BamHI recognition sequence was added to the 3'end side to prepare the NY-ESO-1 gene by artificial gene synthesis.
  • the NY-ESO-1 gene excised with restriction enzymes EcoRI and BamHI was inserted into the EcoRI-BamHI site of the pLVsin-CMV plasmid.
  • the obtained plasmid is referred to as a pLVsyn-CMV-NY-ESO-1 plasmid.
  • the TRE3G promoter excised with the restriction enzymes ClaI and EcoRI was removed from the TRE3G plasmid prepared by the artificial gene synthesis service, and the CMV promoter was removed with the restriction enzymes ClaI and EcoRI. It was inserted into the pLVsyn-CMV-NY-ESO-1 plasmid.
  • the obtained plasmid is referred to as a pLVsyn-TRE3G-NY-ESO-1 plasmid.
  • the CD1d gene (SEQ ID NO: 3) is designed based on the amino acid sequence of human CD1d shown in SEQ ID NO: 4, and an artificial gene is added by adding an XhoI recognition sequence to the 5'end side of the gene and a NotI recognition sequence to the 3'end side. Made by synthesis.
  • the obtained plasmid is referred to as a pLVsyn-CMV-CD1d plasmid.
  • the Tet-On 3G gene is artificial by adding an XhoI recognition sequence to the 5'end side of the Tet-On 3G gene sequence of the pCMV-Tet3G plasmid (Takara Bio, Cat. 613335) and a NotI recognition sequence to the 3'end side. It was prepared by gene synthesis.
  • the Tet-On 3G gene excised with restriction enzymes XhoI and NotI was inserted into the XhoI-NotI site of the pLVsin-CMV plasmid.
  • the obtained plasmid is referred to as a pLVsyn-CMV-Tet3G plasmid.
  • SLHV033RS PEG-it TM Virus Precipitation Solution
  • 5x System Biosciences, Cat.LV810A-1
  • the amount was added, mixed, and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • the supernatant was removed by centrifugation at 1500 xg at 4 ° C. for 30 minutes, and again centrifuged at 1500 xg at 4 ° C. for 5 minutes to completely remove the supernatant.
  • the pellet was suspended in 500 ⁇ L DPBS (Thermo Fisher Scientific, Cat. 14190144), CMV-NY-ESO-1 equipped lentivirus, TRE3G-NY-ESO-1 equipped lentivirus, CD1d mounted lentivirus, and Tet3G mounted lentivirus. I got a virus.
  • DPBS Thermo Fisher Scientific, Cat. 14190144
  • CMV-NY-ESO-1 equipped lentivirus CMV-NY-ESO-1 equipped lentivirus
  • Example 2-2 Preparation and cloning of Lentivirus-infected cells
  • FreeStyle 293-F cells were infected with each lentivirus prepared in Example 2-1.
  • the cell population infected with lentivirus is referred to as FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool. Cells were cloned from these cell pools, and multiple clones from each cell pool were obtained.
  • FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool FreeStyle 293F cells were infected with CD1d-loaded lentivirus and CMV-NY-ESO-1 mounted lentivirus to obtain FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1 cells.
  • an infection method a method of simultaneously infecting a CD1d-equipped lentivirus and a CMV-NY-ESO-1 -equipped lentivirus (cell pool A production method) and a method of sequentially infecting a CD1d-equipped lentivirus and a CMV-NY-ESO-1 -equipped lentivirus. Two different methods of infection (cell pool C preparation method) were used. Culturing of FreeStyle 293-F cells was performed on FreeStyle 293 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat. 12338018) containing 0.1% amount of gentamicin.
  • Cell pool A was prepared by the following method. FreeStyle 293-F cells were prepared at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL and at 1 mL / well volume Falcon® cell culture 12-well multi-well plate for cell culture with flat bottom lid (Corning, Cat. 353043, Hereinafter, the cells were seeded on a 12-well plate), and 50 ⁇ L each of the CD1d-equipped lentivirus and the CMV-NY-ESO-1 -equipped lentivirus obtained in Example 2-1 or 100 ⁇ L each were added. After centrifuging at 540 ⁇ g at room temperature for 30 minutes, the cells were gently suspended by pipetting and cultured with shaking.
  • the cells were subcultured from a 12-well plate to 125 mL of Corning® polycarbonate Erlenmeyer flask vent cap (Corning, Cat.431143, hereinafter referred to as 125 mL Erlenmeyer flask), and further subcultured at appropriate intervals. Obtained pool A.
  • Cell pool C was prepared by the following method. FreeStyle 293-F cells were prepared at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL and seeded at a volume of 1 mL / well with a Falcon® cell culture 12-well multi-well plate for cell culture with a flat bottom lid, Example 2- 100 ⁇ L of the CD1d-loaded lentivirus obtained in 1 was added. After centrifuging at 540 ⁇ g at room temperature for 30 minutes, the cells were gently suspended by pipetting and cultured with shaking.
  • cell pool B a FreeStyle 293F_CD1d cell pool
  • Cell pool B was seeded again on a 12-well plate, 50 ⁇ L or 200 ⁇ L of CMV-NY-ESO-1 carrying lentivirus was added, and a second lentivirus infection was performed in the same procedure as the first.
  • the cells were subcultured from a 12-well plate into a 125 mL Erlenmeyer flask, and further subcultured at appropriate intervals to obtain a cell pool C.
  • the cell pool A and the cell pool C were designated as a FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool.
  • doxycycline (Takara Bio Inc., Cat. 631311) having a final concentration of 100 ng / mL was added to the medium to induce expression via Tet-On System.
  • NY-ESO-1 expression was measured by ELISA and flow cytometry.
  • Anti-NY-ESO-1 antibody (Millipore, Cat.MABC1151) was used as an antibody for immobilization
  • Anti-CTAG1B antibody (ABCAM, Cat.ab183740) was used as a primary antibody, and as a secondary antibody.
  • Measurements were performed using a Rabbit IgG Horseradish Peroxidase-conjugated Antibody (R & D Systems, Cat.HAF008) according to a general measurement method of a sandwich ELISA method.
  • Anti-NY-ESO-1 antibody was used as the primary antibody
  • APC Goat anti Mouse IgG was used as the secondary antibody
  • FACSVerse TM was used as the secondary antibody.
  • the measurement was performed according to the general measurement method used.
  • the survival rate was measured (Fig. 2-3) and the doubling time was calculated (Fig. 2-4) as culture characteristics at the time of passage after infection.
  • the FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool showed the NY-ESO-1 expression level and positive rate immediately after lentivirus infection, and the FreeStyle 293F_Tet- Although it showed a very high value as compared with the on_NY-ESO-1_CD1d cell pool, the expression level and the positive rate decreased as the number of culture days passed. On the other hand, in the FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool, such a decrease in the expression level and the expression rate was not observed.
  • the FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool showed a decrease in survival rate and an increase in doubling time 7 days after lentivirus infection.
  • the expression level and expression rate of NY-ESO-1 in the cell pool as a whole as the number of culture days passed. Is presumed to have decreased.
  • such changes in culture characteristics were not observed in the FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool.
  • Cloning Single-cell cloning was performed from the FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool prepared in (1) and (2) and the FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool by the ultra-dilution method, and all genes were stable. The clones expressed in were selected. The cells were seeded on a 96-well plate so as to be 1 cell / well, and the cells were passaged according to the growth of the cells to proliferate the cells.
  • NY-ESO-1 The expression levels of NY-ESO-1 protein and CD1d protein in the proliferated cells were measured by the ELISA method for NY-ESO-1 and the flow cytometry method for CD1d to stabilize NY-ESO-1 and CD1d protein.
  • the clones that express the protein were selected.
  • NY-ESO-1 a clone derived from the FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool, was evaluated by adding doxycycline at a final concentration of 100 ng / mL to the medium and inducing expression via Tet-On System. ..
  • Anti-NY-ESO-1 Antibodies were used as the immobilization antibody
  • Anti-CTAG1B antibody was used as the primary antibody
  • Rabbit IgG Horseradish Peroxidase-conjugated Antibodies were used as the secondary antibody.
  • the measurement was performed according to various measurement methods.
  • an APC Mouse Anti-Human CD1d antibody (BD Biosciences, Cat.563505) was used, and the measurement was performed according to a general measurement method using FACSVerse TM (BD Biosciences). went.
  • the expression level of NY-ESO-1 of the clone isolated from the FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool was as low as 88 ng / 10 6 cells at the maximum.
  • the clones derived from the FreeStyle 293F_Tet-on_NY-ESO-1_CD1d cell pool have a large difference between the clones, which gives room for selecting a clone having a desired expression level, and are derived from the FreeStyle 293F_CMV_NY-ESO-1_CD1d cell pool. There were more highly expressed clones than clones.
  • Example 3 Effect of combined use of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 and anti-PD-1 antibody]
  • aAVC (3T3) -NY-ESO-1 and anti-PD-1 antibody (1) Concomitant effect in NY-ESO-1-expressing B16 melanoma cell-bearing cancer mice 3 ⁇ 10 5 suspended in D-PBS (-) subcutaneously in 9-week-old C57BL / 6J female mice (Charles River, Japan) B16-NY-ESO-1 cells of cells were inoculated. Seven days after cell inoculation, the mice were divided into four groups of 10 patients in each group based on tumor volume, and 0.1 mg of anti-PD-1 antibody (InVivoMAb anti-mouse PD-1 (CD279), Bio X Cell, Cat).
  • an isotype antibody (InVivoMAbrat IgG2a isotype control, anti-trinintropenol, Bio X Cell, Cat. BE089) was intraperitoneally administered.
  • the antibody was administered twice a week at intervals of 3 to 4 days, for a total of 5 times.
  • Three days after the start of antibody administration 5 ⁇ 10 4 cells of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 suspended in the solvent BICANATE Injection was administered to the tail vein of the mouse.
  • the control group received 200 ⁇ L of BICANATE Injection.
  • the day on which aAVC (3T3) -NY-ESO-1 was administered was set as the 0th day, and the change in tumor volume up to the 11th day was measured.
  • aAVC (3T3) -NY-ESO-1 + isotype antibody and administration of anti-PD-1 antibody suppressed the growth of B16-NY-ESO-1 tumors.
  • the combination of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 administration and anti-PD-1 antibody was compared with aAVC (3T3) -NY-ESO-1 + isotype antibody administration and anti-PD-1 antibody administration, B16-NY- The growth of ESO-1 tumors was suppressed more remarkably (Fig. 4-1). From this result, it was suggested that the combined use of anti-PD-1 antibody enhances the antitumor effect of aAVC (3T3) -NY-ESO-1.
  • CT26 colorectal cancer cell-bearing cancer mice 7-week-old BALB / c female mice (Japan Charles River) subcutaneously suspended in D-PBS (-) 7 ⁇ 10 5 cells of NY-ESO-1 gene expressing NY-ESO-1 protein prepared by introducing CT26 colon carcinoma cells (ATCC, Cat.CRL-2638) (hereinafter, CT26-NY-ESO-1 cells (Called) was inoculated. 14 days after cell inoculation, the mice were divided into 4 groups of 8 cases in each group based on the tumor volume, and 0.1 mg of anti-PD-1 antibody was intraperitoneally administered. No antibody was administered to the non-antibody group.
  • the antibody was administered twice a week at intervals of 3 to 4 days, for a total of 4 times.
  • 5 ⁇ 10 5 cells of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 suspended in the solvent BICANATE Injection was administered to the tail vein of the mouse.
  • the control group received 200 ⁇ L of BICANATE Injection.
  • the day on which aAVC (3T3) -NY-ESO-1 was administered was set as the 0th day, and the change in tumor volume up to the 14th day was measured.
  • CT26-NY-ESO-1 tumor was suppressed by the administration of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 alone and the anti-PD-1 antibody alone, whereas aAVC (3T3)-
  • the combined use of NY-ESO-1 administration and anti-PD-1 antibody suppressed the growth of CT26-NY-ESO-1 tumors more remarkably than the administration of each single agent (Fig. 4-2). From this result, it was suggested that the combined use of anti-PD-1 antibody enhances the antitumor effect of aAVC (3T3) -NY-ESO-1.
  • Example 4 Effect of combined use of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 and anti-CTLA-4 antibody
  • Seven-week-old BALB / c female mice (Charles River Laboratories, Japan) were subcutaneously inoculated with 7 ⁇ 10 5 cells of CT26-NY-ESO-1 cells suspended in D-PBS (-). Seven days after cell inoculation, the mice were divided into four groups of 10 patients in each group based on tumor volume, and seven days after grouping, 0.15 mg of anti-CTLA-4 antibody (InVivoMAb anti-mouse CTLA-4 (CD152), Bio). X Cell, Cat. BE0164) was intraperitoneally administered. No antibody was administered to the non-antibody group.
  • the antibody was administered twice a week at intervals of 3 to 4 days, for a total of 5 times.
  • 5 ⁇ 10 5 cells of aAVC (3T3) -NY-ESO-1 suspended in the solvent BICANATE Injection was administered to the tail vein of the mouse.
  • aAVC (3T3) -NY-ESO-1 cell administration and anti-CTLA-4 antibody one individual died after administration of aAVC (3T3) -NY-ESO-1.
  • the control group received 200 ⁇ L of BICANATE Injection.
  • the day when the cancer cells were inoculated was set as the 0th day, and the change in tumor volume was measured for 32 days.
  • the aAVC-NY-ESO-1 cells of the present invention can be expected to be useful in the treatment of cancer.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is the base sequence encoding the human NY-ESO-1 protein
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 is a base sequence encoding a human CD1d protein
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is an amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5 is the nucleotide sequence encoding the mouse CD1d protein
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 5.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing is the base sequence of pLVsyn-CMV. It is as described as an explanation of "Artificial Sequence" in the numerical heading ⁇ 223> of the following sequence listing.

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Abstract

本発明の課題は、ＮＹ－ＥＳＯ－１発現がんを有する患者の処置にａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を用いるために、ＮＹ－ＥＳＯ－１を安定的に発現し、臨床応用可能なａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を提供することにある。本発明は、例えば、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、ヒト由来細胞を提供する。

Description

がんの処置に用いるＮＹ－ＥＳＯ－１含有人工アジュバントベクター細胞
　本発明は、がんの処置に用いるＮＹ－ＥＳＯ－１含有人工アジュバントベクター細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ：ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞）に関する。
　ニューヨーク食道扁平上皮がん１（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　１、ＮＹ－ＥＳＯ－１）はがん／精巣抗原の一つであり、前立腺がん、膀胱がん等の広範囲な腫瘍で発現が認められる。一方で成人の正常細胞においては精巣を除き発現がみられないため、がん治療の好適な標的分子と考えられており、ワクチンをはじめとする薬剤の開発がすすめられている（非特許文献１～３）。
　ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質とグルコピラノシル脂質　Ａ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ　ｌｉｐｉｄ　Ａ、ＧＬＡ）アジュバントを混合したワクチンであるＧ３０５は、ＮＹ－ＥＳＯ－１発現がんを有する患者を対象に臨床試験が実施されており、ワクチン投与後にＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞の誘導が確認されている（非特許文献４）。
　藤井らは、ヒト由来細胞に外来的にＣＤ１ｄ及びがん抗原を発現させ、さらに該細胞にα－ガラクトシルセラミド（α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ、α－ＧａｌＣｅｒ）をパルスした人工アジュバントベクター細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ：ａＡＶＣ）を作製した（特許文献１～３）。当該ａＡＶＣは、ＣＤ１ｄ／α－ＧａｌＣｅｒ複合体を介してナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を活性化し、活性化されたＮＫＴ細胞はインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）等のサイトカインを産生してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等を活性化する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるＮＫ細胞依存的な抗腫瘍効果が示されている（特許文献１～３）。また、マウスに投与されたａＡＶＣは生体内において活性化されたＮＫＴ細胞により速やかに殺傷され、該ａＡＶＣの断片は樹状細胞に取り込まれる。当該ａＡＶＣ断片を取り込んだ樹状細胞は、該細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）に取り込んだがん抗原の断片を抗原提示し、がん抗原特異的なＴ細胞を誘導する。マウスモデルにおいて、ａＡＶＣ投与によるがん抗原特異的Ｔ細胞の誘導を介した抗腫瘍効果が示されている（特許文献１～３、非特許文献５及び６）。このように、ａＡＶＣはＮＫＴ細胞活性化を介したＮＫ細胞活性化による自然免疫活性化及びがん抗原特異的Ｔ細胞誘導による獲得免疫誘導の二つの免疫機構を強力に誘導し得ることが示されている。
国際公開番号２００７／０９７３７０ 国際公開番号２０１０／０６１９３０ 国際公開番号２０１３／０１８７７８
Ｔｈｏｍａｓ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，「フロンティアーズ　イン　イムノロジー（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、（スイス）、２０１８；９：９４７ Ｇａｓｓｅｒ　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．，「キャンサー　イムノロジー、イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、（ドイツ）、２０１８；６７（２）：２８５－２９８ Ｒｏｂｂｉｎｓ　Ｐ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，「クリニカル　キャンサー　リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１５；２１（５）：１０１９－１０２７ Ｍａｈｉｐａｌ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，「キャンサー　イムノロジー、イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、（ドイツ）、２０１９；６８（７）：１２１１－１２２２ Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１３；７３（１）：６２－７３ Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、２０１６；７６（１３）：３７５６－３７６６
　本発明の課題は、ＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を安定的に発現するａＡＶＣを提供することにある。
　本発明者らは、がん抗原としてＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するａＡＶＣの作製において相当の創意検討を重ねた結果、ＮＹ－ＥＳＯ－１を安定的に発現するａＡＶＣを取得することに成功した。具体的には、本発明者らは、恒常的にＮＹ－ＥＳＯ－１を発現させた場合、培養日数を経るに従い発現量及び陽性率の低下が認められるという課題を見出し、鋭意検討してその課題を解決した。詳細には、誘導型プロモーター（特に、薬剤誘導型プロモーター）にて誘導的にＮＹ－ＥＳＯ－１を発現させた細胞は、恒常的にＮＹ－ＥＳＯ－１を発現させた場合よりも高いＮＹ－ＥＳＯ－１の発現量を示すことを見出し、誘導型プロモーター支配下にてＮＹ－ＥＳＯ－１を安定的に高発現させたａＡＶＣを取得することに成功した（実施例２－２）。すなわち、本発明は、がんの処置に使用し得るａＡＶＣ、該ａＡＶＣの製造方法、該ａＡＶＣを含む医薬組成物、該ａＡＶＣによるがんの処置方法等を提供する。
　すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。
［１］ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、ヒト由来細胞。
［２］ＮＹ－ＥＳＯ－１がヒトＮＹ－ＥＳＯ－１である、［１］に記載の細胞。
［３］ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］誘導型プロモーターが薬剤誘導型プロモーターである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の細胞。
［５］薬剤誘導型プロモーターがテトラサイクリン系誘導型プロモーターである、［４］に記載の細胞。
［６］テトラサイクリン系誘導型プロモーターがＴＲＥ３Ｇプロモーターである、［５］に記載の細胞。
［７］ヒト由来細胞が正常細胞である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の細胞。
［８］ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に由来する細胞である、［７］に記載の細胞。
［９］ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現している、［１］～［８］のいずれか一項に記載の細胞。
［１０］ＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量が１０６細胞当たり２４５ｎｇ～４５０００ｎｇである、［９］に記載の細胞。
［１１］細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、［９］又は［１０］に記載の細胞。
［１２］ＣＤ１ｄリガンドがα－ＧａｌＣｅｒである、［１１］に記載の細胞。
［１３］［１１］又は［１２］に記載の細胞を含む医薬組成物。
［１４］がんの処置に用いるための、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］がんを処置する方法であって、［１１］又は［１２］に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、方法。
［１６］がんを処置するための、［１１］又は［１２］に記載の細胞。
［１７］がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための、［１１］又は［１２］に記載の細胞の使用。
［１８］がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、［１］～［８］のいずれか一項に記載の細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程を含む、方法。
［１９］細胞の表面にα－ＧａｌＣｅｒを積載する工程をさらに含む、［１８］に記載の方法。
［２０］がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、
　ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、又は
　内在的にＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞に誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、
を含む、方法。
［２１］前記工程で得られた細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程をさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２２］細胞の表面にα－ＧａｌＣｅｒを積載する工程をさらに含む、［２１］に記載の方法。
［２３］がんを処置する方法であって、［１１］又は［１２］に記載の細胞と免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与する工程を含む、方法。
［２４］免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤、又はＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤である、［２３］に記載の方法。
［２５］がんの処置に用いる医薬組成物を製造する方法であって、
　ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ、クローニングされたヒト由来の細胞を含む凍結物を解凍する工程、
凍結物中に含まれていた前記ヒト細胞を増殖させて、ＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程、
及び、その細胞の表面にα－ＧａｌＣｅｒを積載する工程
を含む、方法。
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞及び本発明の医薬組成物は、がんの処置に使用できる。
図１－１はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞による抗原特異的Ｔ細胞誘導作用を、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞投与マウスにおけるＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞の数により示している。縦軸はＥＬＩＳＰＯＴリーダーにてカウントした際の４×１０５脾臓細胞中のスポット数を示す。横軸の溶媒はＢＩＣＡＮＡＴＥを投与したコントロール群を、ａＡＶＣ－ＮＹはａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与群をそれぞれ示す。ＰＡＰ及びＮＹは、それぞれ刺激に用いたＰＡＰペプチド及びＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドを示す。「－」は、ペプチド添加無しを示す。個体ごとのスポット数とスポット数の平均値±平均の標準誤差を示す。 図１－２はＮＹ－ＥＳＯ－１発現Ｂ１６担癌マウス及びＢ１６－Ｆ１０担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の抗腫瘍効果を示す。縦軸は腫瘍体積を、横軸はがん細胞接種後日数を示す。縦線は平均値±平均の標準誤差を示し、括弧内は計測時のマウスの匹数を示す。有意確率Ｐ値（＊＊：Ｐ＜０．０１)は、スチューデントのｔ検定により溶媒投与群とａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞投与群の２０日目の腫瘍体積を比較することにより算出した。 図１－３はＮＹ－ＥＳＯ－１発現Ｂ１６担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の抗腫瘍効果を示す。縦軸は腫瘍体積を、横軸はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞投与後日数を示す。縦線は平均値±平均の標準誤差を示す。有意確率Ｐ値（＊＊：Ｐ＜０．０１)は、ダネットの多重比較検定により溶媒投与群とａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞投与群の１０日目の腫瘍体積を比較することにより算出した。 図２－１～図２－４はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール（図中のＣＭＶ）及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール（図中のＴｅｔ－ｏｎ）の各種指標に対する経時変化を示す。図２－１はＣＭＶ及びＴｅｔ－ｏｎの１×１０６細胞あたりのＮＹ－ＥＳＯ－１発現量を示す。縦軸はＮＹ－ＥＳＯ－１の発現量を示し、横軸は感染後培養日数を示す。 図２－２はＣＭＶ及びＴｅｔ－ｏｎのＮＹ－ＥＳＯ－１陽性率を示す。縦軸はＮＹ－ＥＳＯ－１陽性率を示し、横軸は感染後培養日数を示す。 図２－３はＣＭＶ及びＴｅｔ－ｏｎの生存率を示す。縦軸は各プールの細胞生存率を示し、横軸は感染後培養日数を示す。 図２－４はＣＭＶ及びＴｅｔ－ｏｎの細胞の倍加時間を示す。縦軸は倍加時間を示し、横軸は感染後培養日数を示す。 図３はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール（図中のＣＭＶ）とＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール（図中のＴｅｔ－ｏｎ）から単離した各種クローンにおけるＮＹ－ＥＳＯ－１発現量を示す。Ｎｏ．はクローンの番号を示し、数値は１×１０６細胞あたりのＮＹ－ＥＳＯ－１発現量を示す。 図４－１はＮＹ－ＥＳＯ－１発現Ｂ１６担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞、抗ＰＤ－１抗体及びそれらを併用した場合の抗腫瘍効果を示す。縦軸は腫瘍体積を、横軸はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞投与後日数を示す。縦線は平均値±平均の標準誤差を示し、括弧内は計測時のマウスの匹数を示す。 図４－２はＮＹ－ＥＳＯ－１発現ＣＴ２６担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞、抗ＰＤ－１抗体及びそれらを併用した場合の抗腫瘍効果を示す。縦軸は腫瘍体積を、横軸はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞投与後日数を示す。縦線は平均値±平均の標準誤差を示す。 図５はＮＹ－ＥＳＯ－１発現ＣＴ２６担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞、抗ＣＴＬＡ－４抗体及びそれらを併用した場合の抗腫瘍効果を示す。縦軸は腫瘍体積を、横軸はがん細胞接種後日数を示す。縦線は平均値±平均の標準誤差を示す。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞、抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用群の18日目以降の例数は９とする。
　以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
＜人工アジュバントベクター細胞＞
　本明細書において、「人工アジュバントベクター細胞」と「ａＡＶＣ」は、同義であり、相互互換的に用いられ、ＣＤ１ｄポリペプチド（以下、「ＣＤ１ｄ」とも称する）をコードするポリヌクレオチド及び１又は２以上の任意のがん抗原又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を意味する。
　本明細書において、「ポリヌクレオチドを含む」とは、細胞が内在的に該ポリペプチドを有している、又は外来的な方法により該ポリヌクレオチドが導入された状態を表す。ここで「内在」又は「内在的」とは、単離された細胞が特定の遺伝子又はポリヌクレオチドを含んでいる、又はタンパク質を発現している等の当業者により通常使用される意味で使用されうる。また、「外来性」又は「外来的」とは、人工的に作製された遺伝子又はポリヌクレオチドを遺伝子操作又は遺伝子導入等の操作により目的の細胞内に導入すること、及び目的の細胞内に人為的に導入された遺伝子又はポリヌクレオチドによりそれらがコードするタンパク質を人為的に発現させることを指す用語として相互互換的に使用される。
＜本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞＞
　本発明は、
　ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド、及び
　誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチド
を含む、ヒト由来細胞（本明細書において、「ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞」とも称する）を提供する。
１．ヒト由来細胞
　本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞又はがん組織由来の細胞であり、ＣＤ１ｄを内在的に発現していてもよい。
　正常細胞としては、任意のヒト組織より単離及び／又は精製された細胞、特定の細胞種由来の細胞、ヒト組織由来の株化細胞、幹細胞より分化させた細胞等のヒト由来の細胞を用いることができる。また、がん組織由来の細胞としては、患者のがん組織より単離及び／又は精製された細胞、又はヒトがん組織由来の株化細胞を用いることができる。ここで、「単離」とは、生体組織からの分離を意味する。また、「精製」とは、ヒト由来の細胞を、細胞が由来する組織に含まれるその他の成分の１以上からの分離を意味する。細胞の単離及び精製は、公知の方法により行うことができる。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、正常細胞である。
　任意のヒト組織より単離及び／又は精製された細胞は、例えば、胃、小腸、大腸、肺、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、前立腺、卵巣、子宮、骨髄、皮膚、筋肉、又は末梢血等の任意のヒト組織由来の細胞であってよい。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、非血球細胞である。
　特定の細胞種由来の細胞は、ヒト組織における特定の細胞種（例えば、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、間質細胞、線維芽細胞、脂肪組織、乳腺細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、神経細胞、グリア細胞、外分泌上皮細胞、内分泌細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨芽細胞、胚細胞、又は免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等）等）由来の細胞である。
　ヒト組織由来の株化細胞は、当業者により公知の方法を用いて作製することができ、又は商業的に入手することができる。当該株化細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．；１９７７；３６：５９－７４）、ＷＩ－３８細胞、ＳＣ－０１ＭＦＰ細胞、若しくはＭＲＣ－５細胞、又はそれら細胞に由来する細胞が挙げられる。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト由来細胞は、ＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞である。１つの実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ　２９３－Ｆ細胞である。
　幹細胞より分化させた細胞は、ヒト由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から分化させた細胞である。ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の作製及び該細胞から分化させた細胞は、当業者により公知の方法を用いて作製することができる。
　がん組織由来の細胞は、当業者に公知の方法により、患者のがん組織より単離及び／又は精製により取得することができる。また、当業者がＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））等の機関より一般的に入手可能なヒトがん組織由来の株化細胞を用いることもできる。
２．ＮＹ－ＥＳＯ－１
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、がん抗原として、ニューヨーク食道扁平上皮がん１（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　１；ＮＹ－ＥＳＯ－１）又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。ＮＹ－ＥＳＯ－１は、がん／精巣抗原１（ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ　ａｎｔｉｇｅｎ　１；ＣＴＡＧ１）とも呼ばれるタンパク質であり、様々ながんにおいて発現が認められるが、成体の正常組織では精巣のみに発現することが知られている。
　本発明で使用されるＮＹ－ＥＳＯ－１は、天然に存在するＮＹ－ＥＳＯ－１であってもよく、又は、ａＡＶＣとして投与した場合にＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞を誘導する限り、その改変体であってもよい。１つの実施形態において、本発明で使用されるＮＹ－ＥＳＯ－１は、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）由来のＮＹ－ＥＳＯ－１である。１つの実施形態において、ＮＹ－ＥＳＯ－１は、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１である。１つの実施形態において、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～７個、さらにより好ましくは１～５個、１～３個、又は１～２個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、本発明で使用されるＮＹ－ＥＳＯ－１は、ａＡＶＣとして投与した場合にＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞を誘導する限り、ＮＹ－ＥＳＯ－１の断片であってよい。１つの実施形態において、ＮＹ－ＥＳＯ－１の断片は、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１の断片である。１つの実施形態において、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１の断片は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の長さを有するポリペプチドである。ａＡＶＣとして投与することによるＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞の誘導は、例えば、後記実施例１－２に記載の方法により評価できる。本発明で使用されるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いて、使用されるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片のアミノ酸配列から塩基配列を設計し、作製することができる。１つの実施形態において、ＮＹ－ＥＳＯ－１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本明細書における「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ　Ｎｅｅｄｌｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．；２０１５；４３：Ｗ５８０－Ｗ５８４）を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたＩｄｅｎｔｉｔｙの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
　Ｇａｐ　Ｏｐｅｎ　Ｐｅｎａｌｔｙ　＝　１０
　Ｇａｐ　Ｅｘｔｅｎｄ　Ｐｅｎａｌｔｙ　＝　０．５
　Ｍａｔｒｉｘ　＝　ＥＢＬＯＳＵＭ６２
　Ｅｎｄ　Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ　＝　ｆａｌｓｅ
３．ＣＤ１ｄ
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。ＣＤ１ｄは、細胞表面に発現するＭＨＣクラスＩ様糖タンパク質である。本発明で使用されるＣＤ１ｄは、ヒト由来細胞において発現させた場合にＣＤ１ｄの機能を有する限りにおいて、天然に存在するＣＤ１ｄ又はその改変体であってよい。ＣＤ１ｄの機能としては、ＣＤ１ｄリガンド（例えば、α－ＧａｌＣｅｒ）に結合する能力が挙げられる。ＣＤ１ｄのＣＤ１ｄリガンドへの結合能は公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。また、ＣＤ１ｄの機能は、ａＡＶＣによるヒトＮＫＴ細胞を活性化する能力を指標に評価することもできる。このヒトＮＫＴ細胞の活性化能は、例えば、非特許文献５のＦｉｇ．１に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏの評価系において評価することができる。簡単には、α－ＧａｌＣｅｒ存在下で培養したＣＤ１ｄ発現細胞をＮＫＴ細胞と共培養し、培養液中のＩＦＮ－γの量を測定することにより、ＮＫＴ細胞の活性化を評価することができる。
　１つの実施形態において、本発明で使用されるＣＤ１ｄは哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）由来のＣＤ１ｄである。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄはヒトＣＤ１ｄである。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、又は１～２個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するポリペプチドである。１つの実施形態において、ヒトＣＤ１ｄは、配列番号４に示されるポリペプチドと少なくとも９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、ＣＤ１ｄの機能を有するポリペプチドである。
　本発明で使用されるＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドは、使用されるヒト由来細胞に内在するポリヌクレオチドであってもよく、又は、外来的に導入されたポリヌクレオチドであってもよい。ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドをヒト由来細胞に外来的に導入する場合、該ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いて、使用されるＣＤ１ｄのアミノ酸配列から塩基配列を設計し、作製することができる。１つ実施形態において、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
４．プロモーター
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞において、ＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、誘導型プロモーターに作動可能に連結されている。本明細書において、「作動可能に連結された」とは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現をプロモーターによって制御するために当該プロモーターがポリヌクレオチドに連結されている状態を意味する。また、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞において、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドをヒト由来細胞に外来的に導入する場合、該ポリヌクレオチドをプロモーターに作動可能に連結させてもよい。この場合、ＣＤ１ｄを発現させるためのプロモーターとしては、恒常的に発現を促進するプロモーター又は誘導型プロモーターのいずれも用いることができる。
　「誘導型プロモーター」とは、誘導的に発現を促進するプロモーターであり、当該プロモーターを駆動する誘導因子（本明細書において、「誘導型プロモーターの誘導因子」又は単に「誘導因子」とも称する）の存在下において、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導することができるプロモーターをいう。誘導型プロモーターとしては、例えば、温熱誘導型プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、薬剤誘導型プロモーターが挙げられる。１つの実施形態において、誘導型プロモーターは、薬剤誘導型プロモーターである。本明細書において、「薬剤誘導型プロモーター」とは、誘導因子である薬剤により該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現が調節されるプロモーターを意味する。薬剤誘導型プロモーターとしては、例えば、Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列、λオペレーター配列（例えば、１２×λＯｐ）、テトラサイクリン遺伝子発現誘導系の誘導型プロモーター（以下、「テトラサイクリン系誘導型プロモーター」という）等が挙げられる。Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列は、ＣｙｍＲリプレッサー存在下において不活性であるが、誘導因子であるＣｕｍａｔｅの存在下において、ＣｙｍＲリプレッサーと解離して、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。λオペレーター配列は、二量体化により転写活性化能を有するアクチベーター（λＲｅｐ－ＧｙｒＢ－ＡＤ）を二量体化する誘導因子（例えば、クメルマイシン）の存在下において、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、誘導因子であるテトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン等）及びリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）（例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ　３Ｇ）の存在下において、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を誘導する。テトラサイクリン系誘導型プロモーターとしては、例えば、ＴＲＥ３Ｇプロモーターが挙げられる。１つの実施形態において、薬剤誘導型プロモーターは、テトラサイクリン系誘導型プロモーターであり、１つの実施形態において、テトラサイクリン系誘導型プロモーターは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターである。
　恒常的に発現を促進するプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０）等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞において、当該細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現が誘導され得る。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現している。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現している。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量の下限値は、１０６細胞当たり８８ｎｇを超える、９０ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、１５０ｎｇ以上、２００ｎｇ以上、２４５ｎｇ以上、２５０ｎｇ以上、３００ｎｇ以上、４００ｎｇ以上、５００ｎｇ以上、６００ｎｇ以上、７００ｎｇ以上、８００ｎｇ以上、９００ｎｇ以上、１０００ｎｇ以上、１５００ｎｇ以上、２０００ｎｇ以上、２５００ｎｇ以上、３０００ｎｇ以上、４０００ｎｇ以上、５０００ｎｇ以上、６０００ｎｇ以上、７０００ｎｇ以上、８０００ｎｇ以上、９０００ｎｇ以上、又は１００００ｎｇ以上であり、上限値は３００００ｎｇ以下、３５０００ｎｇ以下、４００００ｎｇ以下、４３８９０ｎｇ以下、４５０００ｎｇ以下、５００００ｎｇ以下、５５０００ｎｇ以下、６００００ｎｇ以下である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～５００００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～３５０００ｎｇである。
５．ＣＤ１ｄリガンド
　１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載していてもよい。本明細書において、「細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載した」とは、ａＡＶＣ細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドが結合している状態を指す。
細胞表面へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、＜本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法＞の項に記載のように、ＣＤ１ｄを発現する細胞にＣＤ１ｄリガンド（例えば、α－ＧａｌＣｅｒ）をパルスすることによって行い得る。本明細書において、「ＣＤ１ｄリガンドをパルスする」とは、培養培地中にて細胞をＣＤ１ｄリガンドと接触させることを指す。ＣＤ１ｄリガンドをパルスされたａＡＶＣにおいては、すべての、又は少なくとも一部のＣＤ１ｄにＣＤ１ｄリガンドが積載されている。
　本発明で使用されるＣＤ１ｄリガンドとしては、例えば、α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）、α－Ｃ－ガラクトシルセラミド（α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ）、７ＤＷ８－５、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３）等が存在する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。α－ＧａｌＣｅｒは、化学名は（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－１－Ｏ－（α－Ｄ－ガラクトシル）－Ｎ－ヘキサコサノイル－２－アミノ－１，３，４－オクタデカントリオールであり、ＣＡＳ　ＲＮ：１５８０２１－４７－７で登録され、分子式：Ｃ５０Ｈ９９ＮＯ９で表される物質（分子量：８５８．３４）である。α－ＧａｌＣｅｒは、当該分野で公知の技術に従って合成してもよく、商業的に入手可能なもの（例えば、α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（フナコシ、Ｃａｔ．ＫＲＮ７０００））を使用してもよい。
＜本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法＞
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ヒト由来細胞に、誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチド、及び、必要に応じて、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる。本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法は、さらに、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を培養する工程、細胞をクローニングする工程、及び細胞表面にＣＤ１ｄリガンドを積載させる工程を含んでいてもよい。
１．ヒト由来細胞へのポリヌクレオチドの導入
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる（以下、導入されるポリヌクレオチドを「目的ポリヌクレオチド」とも称する）。或いは、ヒト由来細胞としてＣＤ１ｄを内在的に発現する細胞を用いる場合には、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄを内在的に発現するヒト由来細胞に誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入することにより作製することができる。
　ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤやＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、標準的な分子生物学及び／又は化学的手法を用いて設計及び作製することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づいてホスホロアミダイト法等を用いて合成することができ、又ｃＤＮＡライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られるＤＮＡ断片を組み合わせて作製することができる。
　ヒト由来細胞への目的ポリヌクレオチドの導入は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション等の非ウイルスベクター系の方法又はウイルスベクター系のいずれかの方法を用いて行うことができる。非ウイルスベクター系の方法を用いる場合は、目的ポリヌクレオチドは、プラスミドベクター、ｃＤＮＡ等の形態又はｍＲＮＡの形態であってよい。
　プラスミドベクター又はウイルスベクターは、ヒト由来細胞中でＣＤ１ｄ又はＮＹ－ＥＳＯ－１若しくはその断片を外来的に発現させるための発現ベクターとして使用しうる。発現ベクターは、目的とするポリペプチドを発現できるものであれば特に制限されず、当業者により公知の方法を用いて作製することができる。発現ベクターは、プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）－ＭＡＸ（プロメガ）、又はｐＨＥＫ２９３　Ｕｌｔｒａ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）等）を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、又はアデノ随伴ウイルスを使用することができる。例えば、ヒト由来細胞への目的ポリヌクレオチドの導入にレンチウイルスを使用する場合、該レンチウイルスは、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ／ＥＦ１αベクター（タカラバイオ社）、ｐＬｅｎｔｉベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて作製できる。ヒト由来細胞においてＣＤ１ｄとＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を外来的に発現させる場合、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドとＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを、１つの発現ベクターを用いてヒト由来細胞に導入してもよく、別々の発現ベクターを用いて導入してもよい。また、発現ベクターには、目的とする遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を確認するためのマーカーとなり得る遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を含んでいてもよい。発現ベクターは、さらに、開始コドン及び終止コドン、エンハンサー配列、非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位等を含んでいてもよい。
　１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程を含む。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程を含む。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法は、内在的にＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞に、誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する工程を含む。これらの方法について、１つの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり、１つの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、１つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
　１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより作製された細胞である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより作製された細胞である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、内在的にＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞に、誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより作製された細胞である。これらの細胞について、１つの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり、１つの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり、１つの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。１つの実施形態において、作製されたａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、染色体外又は細胞核のゲノムＤＮＡ上に、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドと誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、作製された細胞は、その細胞核のゲノムＤＮＡ上にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを有する。
２．ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の培養
　前記の方法にて作製されたａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、さらに培養により増殖させることができる。ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を維持するため、又は増殖させるための細胞の培養は、公知の方法により行われる。基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９５２；１２２：５０１）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９５９；８：３９６－３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．；１９６７；１９９：５１９－５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；１９５０；７３：１－８）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３３８０２２）、ＣＤ　２９３　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１１９１３０１９）、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ａ１４３５１０１）を使用することができる。培養培地は、例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清）、血清代替物（例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ＫＳＲ）、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質等を含むことができる。１つの実施形態において、培養に使用される培地は、無血清培地又は化学的に定義された培地である。
　培養条件（例えば、培養時間、温度、培地のｐＨ、ＣＯ２濃度等の培養条件）は当業者により適宜選択され得る。培地のｐＨは約６～８であるのが好ましく、培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は約１～１０％、好ましくは約５％である。培養時間は、特に限定されるものではないが、約１５～３３６時間行なわれる。必要により通気や撹拌を行うこともできる。
　ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の培養時にａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を誘導型プロモーターの誘導因子に接触させて、ＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させてもよい。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。１つの実施形態において、当該誘導型プロモーターは薬剤誘導型プロモーターであり、当該作製方法は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を薬剤誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養する工程を含む。薬剤誘導型プロモーターを使用する場合、誘導因子であるテトラサイクリン、ドキシサイクリン、Ｃｕｍａｔｅ、クメルマイシン等の薬剤を加えた培地にて細胞を培養し、薬剤誘導型プロモーターに作動可能に連結された遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を誘導させてもよい。当該工程は、一般的な遺伝子誘導システムを用いた遺伝子誘導方法に準拠して行うことができる。１つの実施形態において、当該薬剤誘導型プロモーターはテトラサイクリン系誘導型プロモーターであり、当該作製方法は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞をテトラサイクリン又はその誘導体及びｒｔＴＡの存在下で培養する工程を含む。１つの実施形態において、テトラサイクリン系誘導型プロモーターはＴＲＥ３Ｇプロモーターであり、当該作製方法は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞をテトラサイクリン又はその誘導体及びＴｅｔ－Ｏｎ　３Ｇの存在下で培養する工程を含む。得られたａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、抗ＣＤ１ｄ抗体又は抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法等の当業者によって公知の方法にて測定することができる。
３．ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞のクローニング
　細胞にポリヌクレオチドを導入する場合、目的ポリヌクレオチドが導入された細胞及び導入されていない細胞が混在しているため、さらに、目的ポリヌクレオチドを細胞核のゲノムＤＮＡ上に組み込む場合には、その組み込まれている場所も細胞により異なるため、不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）な細胞の集団となっている場合がある。本明細書において、前記の不均質な細胞の集団を「細胞プール」と称す。該細胞プールから単一の遺伝子型を有する細胞を取得する方法（本明細書にて、「クローニング」という）により、ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドが導入された１細胞（以下、「クローン化された細胞」という。）を取得し増殖させることにより、単一の遺伝子型を有する細胞集団（以下、「クローン化された細胞の集団」という。）を取得することができる。ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞のクローニングは、当業者によく知られている方法を用いて実施することができ、例えば、限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法を用いることができる。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞のクローニング方法は限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法の１又は２以上の方法を組み合わせて用いることもできる。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞のクローニング方法は限外希釈法である。
　前記方法にて取得された各クローン化されたａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞について、その一部を誘導型プロモーターの誘導因子に接触させて、得られた細胞におけるＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量を測定することによって、誘導因子の存在下においてＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片について目的の発現量を示す、クローン化されたａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の集団を選択することができる。選択したクローン化された細胞の集団を凍結状態で保存したもの（又は「凍結物」ともいう）を、リサーチセルバンク（ＲＣＢ）として使用しうる。ＲＣＢの細胞を培養して増殖させ、凍結させたものをマスターセルバンク（ＭＣＢ）として使用しうる。ＭＣＢの細胞を培養して増殖させ、凍結させたものをワーキングセルバンク（ＷＣＢ）として使用しうる。ＷＣＢの細胞を培養したものを医薬品の原料として使用しうる。各セルバンクは、凍結保護剤を含んでもよい。各セルバンクは、複数の容器（例えば、２～１００００の容器、例えば、１０～１０００の容器、例えば、１００～５００の容器）に分注され、凍結状態で保管してもよい。クローン化されたａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の解凍、培養、及び誘導因子との接触、並びにＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量の測定はそれぞれ、当業者に公知の方法で行うことができ、培養、誘導因子との接触、及び発現量の測定は、例えば、「２．ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の培養」に記載の方法等を使用して行うことができる。１つの実施形態において、クローン化されたａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の培養、及び誘導因子との接触、並びにＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量の測定は、ＲＣＢ及びＷＣＢの解凍後に行うことができる。
　１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量の下限値は、１０６細胞当たり８８ｎｇを超える、９０ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、１５０ｎｇ以上、２００ｎｇ以上、２４５ｎｇ以上、２５０ｎｇ以上、３００ｎｇ以上、４００ｎｇ以上、５００ｎｇ以上、６００ｎｇ以上、７００ｎｇ以上、８００ｎｇ以上、９００ｎｇ以上、１０００ｎｇ以上、１５００ｎｇ以上、２０００ｎｇ以上、２５００ｎｇ以上、３０００ｎｇ以上、４０００ｎｇ以上、５０００ｎｇ以上、６０００ｎｇ以上、７０００ｎｇ以上、８０００ｎｇ以上、９０００ｎｇ以上、又は１００００ｎｇ以上であり、上限値は３００００ｎｇ以下、３５０００ｎｇ以下、４００００ｎｇ以下、４３８９０ｎｇ以下、４５０００ｎｇ以下、５００００ｎｇ以下、５５０００ｎｇ以下、６００００ｎｇ以下である。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～５００００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、得られるａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～３５０００ｎｇである。
４．ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載
　ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞にＣＤ１ｄリガンドをパルスすることによって、ＣＤ１ｄリガンドを積載したａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を作製することができる。ＣＤ１ｄリガンドをパルスする条件（例えば、細胞の培養培地にＣＤ１ｄリガンドを添加するタイミング、培養培地中のＣＤ１ｄリガンドの濃度及び培養時間等）は、使用する細胞及び培養時の諸条件を考慮して当業者にて適宜調整され得る。ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の培養培地に添加するＣＤ１ｄリガンドの濃度は、特に限定されないが、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００００ｎｇ／ｍＬの範囲で適宜選択され得る。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、該細胞と誘導因子との接触の前に行われ得る。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、該細胞と誘導因子との接触の後に行われ得る。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、該細胞と誘導因子との接触と同時に行われ得る。これらの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、好ましくは、クローン化されている。
　上記で作製したＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、ＣＤ１ｄリガンドを積載しているａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞において、該細胞の増殖を人為的な方法を用いて停止させてもよい。当該細胞の増殖を停止させる方法は、特に限定されないが、例えば、放射線（例えば、Ｘ線）照射にて細胞増殖を停止させる方法、マイトマイシンＣ等の薬剤を添加する方法等を使用し得る。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、増殖を停止させた細胞であり得る。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、ＣＤ１ｄリガンドを積載し、増殖を停止させた細胞であり得る。
＜本発明の医薬組成物等＞
　本発明はまた、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している。１つの実施形態において、当該医薬組成物は、がんの処置に用いるための医薬組成物である。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。当該医薬組成物は、当該分野において通常用いられる賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。医薬組成物の製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の凍結物を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の凍結物及び凍結保護剤を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の懸濁液を含み得る。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の懸濁液及び凍結保護剤を含み得る。本発明はまた、がんの処置に用いるための医薬組成物を製造するための本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の使用であって、該細胞は、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、使用を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。本発明はまた、がんを処置するための本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞であって、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、細胞を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。
　本発明はまた、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を対象に投与する工程を含む、がんを処置する方法を提供する。当該方法において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している。１つの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、α－ＧａｌＣｅｒである。本明細書において、「対象」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー等）であり、１つの実施形態において、対象はヒトである。本明細書において、「処置」とは、治療的処置及び予防的処置を含む意味で用いられる。ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を対象へ投与する場合、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態で対象に投与することができる。対象へのａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の投与量及び投与回数は、がんの種類、位置、重症度、処置を受ける対象の年齢、体重及び状態などに応じて適宜調節できる。ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の投与量は、例えば、対象への一回の投与において１×１０3ｃｅｌｌｓ／ｋｇ～１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｋｇを用いることができる。対象へのａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の投与方法としては、例えば、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は動脈内等への注射又は点滴により投与することができる。本発明の処置方法は、他のがん治療方法と併用して用いることができる。他のがん治療方法としては、手術、放射線治療、造血幹細胞移植、又は、他の抗がん剤による治療が挙げられる。
　本発明の処置の対象となるがんとしては、特に限定はされないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等の固形がん、及び骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、及び網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の処置の対象となるがんは、ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性のがんである。
　本発明の医薬組成物、使用、細胞、及びがんの処置方法において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の１０６細胞当たりの発現量は、例えば、下限値は８８ｎｇを超える、９０ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、１５０ｎｇ以上、２００ｎｇ以上、２４５ｎｇ以上、２５０ｎｇ以上、３００ｎｇ以上、４００ｎｇ以上、５００ｎｇ以上、６００ｎｇ以上、７００ｎｇ以上、８００ｎｇ以上、９００ｎｇ以上、１０００ｎｇ以上、１５００ｎｇ以上、２０００ｎｇ以上、２５００ｎｇ以上、３０００ｎｇ以上、４０００ｎｇ以上、５０００ｎｇ以上、６０００ｎｇ以上、７０００ｎｇ以上、８０００ｎｇ以上、９０００ｎｇ以上、又は１００００ｎｇ以上であり、上限値は３００００ｎｇ以下、３５０００ｎｇ以下、４００００ｎｇ以下、４３８９０ｎｇ以下、４５０００ｎｇ以下、５００００ｎｇ以下、５５０００ｎｇ以下、６００００ｎｇ以下である。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量の下限値は、１０６細胞当たり８８ｎｇを超える、９０ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、１５０ｎｇ以上、２００ｎｇ以上、２４５ｎｇ以上、２５０ｎｇ以上、３００ｎｇ以上、４００ｎｇ以上、５００ｎｇ以上、６００ｎｇ以上、７００ｎｇ以上、８００ｎｇ以上、９００ｎｇ以上、１０００ｎｇ以上、１５００ｎｇ以上、２０００ｎｇ以上、２５００ｎｇ以上、３０００ｎｇ以上、４０００ｎｇ以上、５０００ｎｇ以上、６０００ｎｇ以上、７０００ｎｇ以上、８０００ｎｇ以上、９０００ｎｇ以上、又は１００００ｎｇ以上であり、上限値は３００００ｎｇ以下、３５０００ｎｇ以下、４００００ｎｇ以下、４３８９０ｎｇ以下、４５０００ｎｇ以下、５００００ｎｇ以下、５５０００ｎｇ以下、６００００ｎｇ以下である。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～５００００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、８９ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０６ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、２４５ｎｇ～３５０００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４５０００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４３８９０ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～４００００ｎｇである。１つの実施形態において、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞におけるＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量は、１０００ｎｇ～３５０００ｎｇである。
　＜がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法＞
　本発明はまた、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を誘導型プロモーターの誘導因子に接触させてＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程を含む、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法を提供する。１つの実施形態において、当該製造方法は、当該ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。１つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にα－ＧａｌＣｅｒを積載する工程をさらに含む。細胞表面へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と誘導因子との接触の前でも後でも同時でもよい。本発明はまた、がんの処置に用いる医薬組成物の製造における本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の使用を提供する。
　本発明はまた、以下の工程を含む、がんの処置に用いる細胞又は医薬組成物の製造方法を提供する：
　ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、又は
　内在的にＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞に誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程。
　１つの実施形態において、当該製造方法は、前記工程で得られた細胞（ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞）を誘導型プロモーターの誘導因子に接触させてＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程をさらに含む。１つの実施形態において、当該製造方法は、当該ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程を含む。１つの実施形態において、当該製造方法は、細胞表面にα－ＧａｌＣｅｒを積載する工程をさらに含む。細胞表面へのＣＤ１ｄリガンドの積載は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と誘導因子との接触の前でも後でも同時でもよい。
　本項に記載の製造方法に用いる細胞及び工程等に関する具体的な実施形態については、前記の＜本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞＞及び＜本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製方法＞の項に記載のとおりである。
＜本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤との併用＞
　本発明はまた、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与する工程を含む、がんを処置する方法を提供する。本発明はまた、免疫チェックポイント阻害剤と併用される、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を含むがんを処置するための医薬組成物を提供する。本発明はまた、免疫チェックポイント阻害剤と併用される、がんを処置するための本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を提供する。本発明はまた、免疫チェックポイント阻害剤と併用される、がんの処置に用いるための医薬組成物を製造するための本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の使用を提供する。当該方法、医薬組成物、細胞又は使用において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現し、該細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している。
　本明細書において、「免疫チェックポイント阻害剤」とは、免疫チェックポイント分子によって引き起こされる免疫細胞の抑制を解除することによって免疫を賦活する薬剤を意味する。免疫チェックポイント分子としては、プログラム細胞死－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　１；ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４；ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン－３（Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｍｕｃｉｎ　ｄｏｍａｉｎ－３；ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化遺伝子３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　３；ＬＡＧ－３）、及びＶ型免疫グロブリンドメイン含有Ｔ細胞活性化抑制因子（Ｖ－ｔｙｐｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ；ＶＩＳＴＡ）等が挙げられる。これらの分子が担う免疫チェックポイントはＰＤ－１系免疫チェックポイント、ＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント、ＴＩＭ－３系免疫チェックポイント、ＬＡＧ－３系免疫チェックポイント、及びＶＩＳＴＡ系免疫チェックポイントと呼ばれる。免疫チェックポイント阻害剤は、例えば免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに結合して、免疫チェックポイントの機能を阻害し得る。例えば、ＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２との結合を阻害することによりＰＤ－１系免疫チェックポイントを阻害することができる。また、ＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０又はＣＤ８６との結合を阻害することによりＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイントを阻害することができる。また、ＴＩＭ－３系免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ－３とガレクチン－９との結合を阻害することによりＴＩＭ－３系免疫チェックポイントを阻害することができる。また、ＬＡＧ－３系免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を阻害することによりＬＡＧ－３系免疫チェックポイントを阻害することができる。また、ＶＩＳＴＡ系免疫チェックポイント阻害剤は、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ－３／ＩＧＳＦ１１との結合を阻害することにより、ＶＩＳＴＡ系免疫チェックポイントを阻害することができる。免疫チェックポイント阻害剤とは、ＰＤ－１系免疫チェックポイント、ＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント、ＴＩＭ－３系免疫チェックポイント、ＬＡＧ３系免疫チェックポイント、及びＶＩＳＴＡ系免疫チェックポイント等の１以上の免疫チェックポイントを阻害することができる物質を指し、抗体、抗原結合性タンパク質、及び低分子化合物等が挙げられる。抗体には受容体又はリガンドのいずれかに結合するものが存在する。例えば、ＰＤ－１系免疫チェックポイントを阻害する抗体としては、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体が挙げられ、例えば、ニボルマブ、ペムプロリズマブ、ＭＫ－３４７５、ＡＭＰ－２２４、ピジリズマブ、ＡＭＰ－５１４、ＡＮＢ－０１１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＲＥＧＮ－２８１０、ＨＲ３０１２１０、ＰＦ－０６８０１５９１、ＪＳ－００１、ＩＢＩ－３０８、ＣＢＴ－５０１、アベルマブ、アテゾリズマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＬＹ－３３０００５４、ＪＮＪ－６１６１０５８８、及びデュルバルマブが使用され得る。また、ＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイントを阻害する抗体としては、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ８０抗体、又は抗ＣＤ８６抗体が挙げられ、例えば、イピリムマブ、及びトレメリムマブが使用され得る。また、ＴＩＭ－３系免疫チェックポイントを阻害する抗体は、抗ＴＩＭ－３抗体又は抗ガレクチン－９抗体が挙げられ、例えば、ＭＧＢ４５３が使用され得る。また、ＶＩＳＴＡ系免疫チェックポイントを阻害する抗体は、抗ＶＩＳＴＡ抗体又は抗ＶＳＩＧ－３／ＩＧＳＦ１１抗体からなる群から選択される抗体が挙げられ、例えば、ＪＮＪ－６１６１０５８８が使用され得る。また、低分子化合物としてＡＵＰＭ－１７０も用いられ得る。
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤との併用は、ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の抗腫瘍作用を増強し得る。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用され得る免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤は抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ、ペムプロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はデュルバルマブである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ又はペムプロリズマブである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はペムプロリズマブである。また別の実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用され得る免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤は抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ８０抗体、又は抗ＣＤ８６抗体である。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ又はトレメリムマブである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ又はペムプロリズマブである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブである。
　例えば、対象に本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤とを投与することを含む、がんを処置する方法について、１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤又はＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤は抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ、ペムプロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はデュルバルマブである。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ又はペムプロリズマブである。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用される免疫チェックポイント阻害剤はペムプロリズマブである。また別の実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と併用され得る免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤は抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ８０抗体、又は抗ＣＤ８６抗体である。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ又はトレメリムマブである。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はニボルマブ又はペムプロリズマブである。１つの実施形態において、対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブである。
本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤は、同時に、逐次的に、連続的に、又は重複的に投与され得る。本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤は、いずれを先に投与してもよい。１つの実施形態では、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の投与を免疫チェックポイント阻害剤の投与よりも先に開始することができる。１つの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の投与を本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の投与よりも先に開始することができる。本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤は、それぞれ独立して単回投与又は複数回投与され得る。１つの実施形態において、本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と免疫チェックポイント阻害剤による単剤療法の併用療法において、さらなる追加の化学療法剤などの抗がん剤を併用してもよい。
　本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
［実施例１：マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の抗腫瘍作用］
［実施例１－１：マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の作製］
　がん抗原であるＮＹ－ＥＳＯ－１を搭載したａＡＶＣのがんワクチンとしての効果をｉｎ　ｖｉｖｏ評価系にて確認するため、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ－１６５８）にＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子及びＣＤ１ｄ遺伝子のｍＲＮＡを導入したマウス型ａＡＶＣ（ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１とも称する）を作製した。
　ＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子（配列番号１）は、配列番号２に示されるヒトＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸配列を基に、人工遺伝子合成にて作製した。ｐＧＥＭ（登録商標）－４Ｚプラスミド（プロメガ社、Ｃａｔ．Ｐ２１６１）のＨｉｎｄＩＩＩ又はＥｃｏＲＩ認識配列を含む１５塩基と相補的な配列を付加したプライマーを用い、ＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子をＰＣＲ法にて増幅した。増幅したＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子をｐＧＥＭ（登録商標）－４ＺのＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイトにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３９６４８）を用いて挿入した。得られたプラスミドを、ｐＧＥＭ－４Ｚ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミドと称する。ｐＧＥＭ（登録商標）－４ＺプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩサイトに配列番号５に示す塩基配列からなるマウスＣＤ１ｄ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１１６０９－１のアミノ酸配列（配列番号６）を基に人工遺伝子合成にて遺伝子を合成）を挿入した。得られたプラスミドをｐＧＥＭ－４Ｚ－ｍＣＤ１ｄプラスミドと称する。ｐＧＥＭ－４Ｚ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミド及びｐＧＥＭ－４Ｚ－ｍＣＤ１ｄプラスミドをそれぞれＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断して直鎖にしたものをテンプレートとして用い、ｍＭＥＳＳＡＧＥ　ｍＭＡＣＨＩＮＥＴＭ　Ｔ７　ＵＬＴＲＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．ＡＭＢ１３４５５）を用いてＮＹ－ＥＳＯ－１　ｍＲＮＡ及びＣＤ１ｄ　ｍＲＮＡを作製した。α－ＧａｌＣｅｒを５００ｎｇ／ｍＬ添加した１０％量のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１０５６９）にて２日間培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞を回収し、細胞懸濁液にＮＹ－ＥＳＯ－１　ｍＲＮＡとＣＤ１ｄ　ｍＲＮＡを添加し、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーター（ネッパジーン株式会社）を用いてエレクトロポレーション（ポアーリングパルス：電圧１５０Ｖ、パルス幅８ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓ、回数２回、減衰率１０％、極性＋、トランスファーパルス：電圧２０Ｖ、パルス幅５０ｍｓ、パルス間隔５０ｍｓ、回数±５回、減衰率４０％、極性＋／－）を行った。細胞を回収し、Ｘ線照射装置ＭＢＲ－１５２０Ｒ－３（株式会社　日立パワーソリューションズ）を用いて３０Ｇｙ量のＸ線を照射した。前記の方法により得られた細胞をａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１と称する。
［実施例１－２：マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１のＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞誘導能］
　各群５例の６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（株式会社大塚製薬工業）に懸濁した５×１０５ｃｅｌｌｓのａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。投与７日後にマウスから脾臓細胞を回収し、ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮ－γ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｌｏｒ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ＥＬＩＳＰＯＴ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｙｍｉｔｅｄ社、Ｃａｔ．ｍＩＦＮｇｐ－２Ｍ／５）のプレートに４×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種した。さらに、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞を刺激するために、ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク配列の全長をカバーするオーバーラッピングペプチドであるＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　ＮＹ－ＥＳＯ－１　－　ｐｒｅｍｉｕｍ　ｇｒａｄｅ，　ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社、Ｃａｔ．１３０－０９５－３８１））、又は、抗原非特異的ペプチドとしてＰＡＰペプチド（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ　ＰＡＰ　－　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｇｒａｄｅ，　ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社、Ｃａｔ．１３０－０９６－７６７））を添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１日間培養した。ウェル底のスポット数をカウントすることにより、ＩＦＮ－γ産生細胞数を計測した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与マウスでは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド刺激によりＩＦＮ－γを産生する細胞が増加した（図１－１）。抗原非特異的であるＰＡＰペプチド刺激によるスポット数との差が、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞数を示す。この結果より、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与によりＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞が誘導されることが示唆された。
［実施例１－３：ＮＹ－ＥＳＯ－１発現Ｂ１６メラノーマ細胞担癌マウスにおけるａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の抗原特異的抗腫瘍効果］
　各群１０例の８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の尾静脈に、ＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁した５×１０５ｃｅｌｌｓのａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。投与１４日後、前記マウスの皮下に、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬株式会社、Ｃａｔ．０４５－２９７９５）に懸濁した３×１０５ｃｅｌｌｓのＢ１６－Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ－６４７５）、又は、Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁した３×１０５ｃｅｌｌｓのＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子を導入して作製したＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質を発現するＢ１６－Ｆ１０メラノーマ細胞（以下、Ｂ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１又はＢ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と称する）をそれぞれ接種した。がん細胞を接種した日を０日目と設定し、２０日間の腫瘍体積の変化を計測した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与により、Ｂ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大が有意に抑制されたのに対し、ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現していないＢ１６－Ｆ１０腫瘍の増大は抑制されなかった（図１－２）。この結果より、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１は、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的免疫の誘導に基づくＮＹ－ＥＳＯ－１特異的抗腫瘍効果を有することが示唆された。
［実施例１－４：ＮＹ－ＥＳＯ－１発現Ｂ１６メラノーマ細胞担癌マウスにおいて抗腫瘍効果を示すａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の細胞数の検討］
　８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の皮下に、Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁した３×１０５ｃｅｌｌｓのＢ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を接種した。細胞接種７日後、前記マウスを腫瘍体積に基づき各群１０例の５つの群に分け、尾静脈から、溶媒であるＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁したａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を、それぞれ５×１０２ｃｅｌｌｓ／マウス、５×１０３ｃｅｌｌｓ／マウス、５×１０４ｃｅｌｌｓ／マウス、５×１０５ｃｅｌｌｓ／マウスとなるように投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した日を０日目と設定し、１０日間の腫瘍体積の変化を計測した。なお、５×１０５ｃｅｌｌｓ／マウス投与群ではａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与後に２個体の死亡が発生したため、０日目以降の例数は８匹とする。５×１０３ｃｅｌｌｓ／マウス以上の投与群でＢ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大が有意に抑制された（図１－３）。本実験に用いたａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１のＮＹ－ＥＳＯ－１の発現量は、２４５ｎｇ／１×１０６ｃｅｌｌｓであった。
　実施例１の結果より、マウス型ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、マウスｉｎ　ｖｉｖｏ評価系において、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞を誘導することによりＮＹ－ＥＳＯ－１特異的抗腫瘍効果を示すことが確認された。ヒトにおいても、ヒト型ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、自然免疫を惹起して抗腫瘍効果を奏すると共に、抗原特異的な獲得免疫を誘導し、獲得免疫に基づく抗腫瘍効果を奏することを期待し得るため、ヒトのＮＹ－ＥＳＯ－１発現がんに対してＮＹ－ＥＳＯ－１特異的抗腫瘍効果を示す治療薬の創製を目的とし、以下にヒト型ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製検討を行った。
［実施例２：ヒト型ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞の作製及び調製］
　ヒト型ａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を以下の方法で作製した。ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ１ｄ、及びＴｅｔ３Ｇ遺伝子をそれぞれ搭載したプラスミドを用いてレンチウイルスを作製し、該レンチウイルスを用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３－Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｒ７９００７）に該遺伝子を導入することにより、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ１ｄ、及びＴｅｔ３Ｇを発現するａＡＶＣ細胞を構築した。
［実施例２－１：レンチウイルス作製］
（１）レンチウイルス作製用プラスミドの構築
　レンチウイルスプラスミドｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ（配列番号７）を作製した。ＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子（配列番号１）の５’末側にＥｃｏＲＩ認識配列、３’末側にＢａｍＨＩ認識配列を付加したＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子を人工遺伝子合成にて作製した。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切り出したＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子を、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶプラスミドのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミドと称する。ｐＴＲＥ３Ｇ（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１１７３）の配列に基づき、人工遺伝子合成サービスにて作製したＴＲＥ３Ｇプラスミドから制限酵素ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩで切り出したＴＲＥ３Ｇプロモーターを、制限酵素ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩにてＣＭＶプロモーターを除去したｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミドに挿入した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミドと称する。
　ＣＤ１ｄ遺伝子（配列番号３）は、配列番号４に示されるヒトＣＤ１ｄのアミノ酸配列を基に設計し、遺伝子の５’末側にＸｈｏＩ認識配列、３’末側にＮｏｔＩ認識配列を付加し人工遺伝子合成にて作製した。制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切り出したＣＤ１ｄ遺伝子を、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶプラスミドのＸｈｏＩ－ＮｏｔＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＣＤ１ｄプラスミドと称する。
　Ｔｅｔ－Ｏｎ　３Ｇ遺伝子は、ｐＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇプラスミド（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１３３５）のＴｅｔ－Ｏｎ　３Ｇ遺伝子配列の５’末側にＸｈｏＩ認識配列、３’末側にＮｏｔＩ認識配列を付加し、人工遺伝子合成にて作製した。制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切り出したＴｅｔ－Ｏｎ　３Ｇ遺伝子を、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶプラスミドのＸｈｏＩ－ＮｏｔＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇプラスミドと称する。
（２）レンチウイルス作製
　（１）で作製したｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミド、ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミド、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＣＤ１ｄプラスミド、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇプラスミドを用いて、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ１ｄ及びＴｅｔ３Ｇ遺伝子を搭載したレンチウイルスを作製した。得られたレンチウイルスを、それぞれ、ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルス、ＴＲＥ３Ｇ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルス、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス及びＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスと称する。
　ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミド、ｐＬＶｓｙｎ－ＴＲＥ３Ｇ－ＮＹ－ＥＳＯ－１プラスミド、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－ＣＤ１ｄプラスミド、又はｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇプラスミドのいずれかのプラスミドを６μｇとＶｉｒａＰｏｗｅｒ　Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．Ｋ４９７５００）１８μＬを混合し、３ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯＴＭ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３０９０１９）を加えて混合した（Ａ）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００　ＣＤ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２５６６－０１４）２８８μＬとＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＦＭ　１２ｍＬを混合して５分静置した（Ｂ）。（Ａ）と３ｍＬの（Ｂ）を混合して室温で２０分静置後、前日にＦａｌｃｏｎ（登録商標）１００ｍｍ　ＴＣ－ｔｒｅａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．３５３００３）に５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅで播種したＬｅｎｔｉ－ＸＴＭ　２９３Ｔ細胞（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３２１８０）に（Ａ）と（Ｂ）の混合液３ｍＬ／ｐｌａｔｅで添加して遺伝子導入を行った。Ｌｅｎｔｉ－ＸＴＭ　２９３Ｔ細胞は、１０％量のウシ胎児血清(ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．１２００７Ｃ（γ線照射品）)と０．１％量のゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１５７５００６０）を含むＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１０５６９０１０）にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行った。遺伝子導入後、同条件にて２日間培養し、各遺伝子を搭載したレンチウイルスを含む培養上清を回収した。培養上清を４℃にて８４０×ｇで１０分間遠心した。上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｅｒｃｋ社、Ｃａｔ．ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）でろ過し、ＰＥＧ－ｉｔＴＭ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ｘ）（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．ＬＶ８１０Ａ－１）を上清液量の１／４量添加して混合し、４℃で終夜静置した。１５００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を除去し、再度１５００×ｇ、４℃で５分間遠心して上清を完全に除去した。ペレットを５００μＬのＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１４１９０１４４）に懸濁し、ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルス、ＴＲＥ３Ｇ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルス、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス、及びＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスを得た。
［実施例２－２：Ｌｅｎｔｉ　ｖｉｒｕｓ感染細胞の作製とクローニング］
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３－Ｆ細胞に実施例２－１で作製した各レンチウイルスを感染させた。ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルス及びＣＤ１ｄ搭載レンチウイルスを感染させた細胞集団をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール、ＴＲＥ３Ｇ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルス、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス、及びＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスを感染させた細胞集団をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールと称する。これらの細胞プールから細胞のクローニングを実施し、各細胞プール由来のクローンを複数取得した。
（１）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールの作製
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３－Ｆ細胞にＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス及びＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルスを感染させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を得た。感染方法として、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス及びＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルスを同時に感染させる方法（細胞プールＡ作製方法）と、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルス及びＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルスを順次感染させる方法（細胞プールＣ作製方法）の２つの異なる方法を用いた。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３－Ｆ細胞の培養は、０．１％量のゲンタマイシンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ．１２３３８０１８）にて行った。
　細胞プールＡ作製を以下の方法で行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３－Ｆ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製し、１ｍＬ／ウェル量でＦａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャー　１２ウェル　細胞培養用マルチウェルプレート　平底　フタ付き（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．３５３０４３、以後１２ウェルプレートという。）に播種し、実施例２－１で得た、ＣＤ１ｄ搭載レンチウイルスとＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルスを各５０μＬ、又は各１００μＬ添加した。５４０×ｇ、室温で３０分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に１２ウェルプレートからＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ポリカーボネート製三角フラスコベントキャップ１２５ｍＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ．４３１１４３、以後１２５ｍＬ三角フラスコという。）に継代し、さらに適当な間隔で継代して細胞プールＡを得た。
　細胞プールＣ作製を以下の方法で行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３－Ｆ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製し、１ｍＬ／ウェル量でＦａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャー　１２ウェル　細胞培養用マルチウェルプレート　平底　フタ付きに播種し、実施例２－１で得たＣＤ１ｄ搭載レンチウイルスを１００μＬ添加した。５４０×ｇ、室温で３０分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。数日培養後に１２ウェルプレートから１２５ｍＬフラスコに継代し、さらに適当な間隔で継代し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＤ１ｄ細胞プール（細胞プールＢと称する）を得た。細胞プールＢを再度１２ウェルプレートに播種して、ＣＭＶ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルス５０μＬ又は２００μＬ添加し、１回目と同様の手順で２回目のレンチウイルス感染を行った。数日培養後に１２ウェルプレートから１２５ｍＬ三角フラスコに継代し、さらに適当な間隔で継代して細胞プールＣを得た。細胞プールＡと細胞プールＣを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールとした。
（２）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールの作製
　（１）細胞プールＣ作製方法の過程で得られた細胞プールＢを再度１２ウェルプレートに播種して、実施例２－１で得たＴＲＥ３Ｇ－ＮＹ－ＥＳＯ－１搭載レンチウイルスとＴｅｔ３Ｇ搭載レンチウイルスを各４０μＬ又は各２００μＬ添加し、（１）に記載した手順に準拠してレンチウイルス感染を行った。１日後に１２ウェルプレートから１２５ｍＬ三角フラスコに継代し、さらに適当な間隔で継代してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールを得た。
（３）細胞プールでのＮＹ－ＥＳＯ－１発現安定性と培養特性
（１）、（２）で取得したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールについて、レンチウイルス感染後のＮＹ－ＥＳＯ－１発現量（図２－１）及びＮＹ－ＥＳＯ－１陽性率のタイムコースを取得した（図２－２）。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールについては感染後３、７、１０、１４日目にＮＹ－ＥＳＯ－１発現の解析を行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールについては感染後７、１４日目に解析を行った。また、解析の２日前に培地に終濃度１００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリン（タカラバイオ社、Ｃａｔ．６３１３１１）を添加し、Ｔｅｔ－Ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを介して発現を誘導した。ＮＹ－ＥＳＯ－１発現は、ＥＬＩＳＡ法とフローサイトメトリー法にて測定した。ＥＬＩＳＡ法による測定には、固相化用抗体としてＡｎｔｉ－ＮＹ－ＥＳＯ－１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｃａｔ．ＭＡＢＣ１１５１）、一次抗体としてＡｎｔｉ－ＣＴＡＧ１Ｂ　抗体（ＡＢＣＡＭ社、Ｃａｔ．ａｂ１８３７４０）、二次抗体としてＲａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ．ＨＡＦ００８）を使用し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一般的な測定方法に準拠して測定を行った。フローサイトメトリー法による測定には、一次抗体としてＡｎｔｉ－ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、二次抗体としてＡＰＣ　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｌｉｆｅｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社、Ｃａｔ．Ａ１０５３９）を使用し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた一般的な測定方法に準拠して測定を行った。また、感染後の継代時に培養特性として生存率の測定（図２－３）と、倍加時間の算出（図２－４）を行った。
　発現量に関しては図２－１及び陽性率に関しては図２－２に示す通り、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールはレンチウイルス感染直後にはＮＹ－ＥＳＯ－１発現量、陽性率ともにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールと比較して非常に高い値を示していたが、培養日数を経るに従い発現量及び陽性率の低下が認められた。一方でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールではこのような発現量と発現率の低下は観察されなかった。
　生存率に関しては図２－３及び倍加時間に関しては図２－４に示す通り、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールはレンチウイルス感染後７日目にかけて、生存率の低下と倍加時間の延長が認められた。細胞プールのなかでＮＹ－ＥＳＯ－１発現量の高い細胞の生存率の低下に伴う倍加時間の延長により、培養日数を経るにしたがって細胞プール全体としてのＮＹ－ＥＳＯ－１の発現量や発現率が低下していったと推測される。一方でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールではこのような培養特性の変動は観察されなかった。
（４）クローニング
　（１）（２）で作製したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールとＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールから限外希釈法によるシングルセルクローニングを行い、全ての遺伝子が安定的に発現するクローンを選抜した。９６ウェルプレートに１ｃｅｌｌ／ウェルとなるように細胞を播種し、細胞の増殖に合わせて継代を行い、細胞を増殖させた。増殖した細胞のＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質及びＣＤ１ｄタンパク質の発現量を、ＮＹ－ＥＳＯ－１はＥＬＩＳＡ法にて、ＣＤ１ｄはフローサイトメトリー法にて測定し、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＣＤ１ｄタンパク質を安定的に発現するクローンを選抜した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール由来のクローンのＮＹ－ＥＳＯ－１は、培地に終濃度１００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加し、Ｔｅｔ－Ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを介して発現を誘導して評価を行った。ＥＬＩＳＡ法による測定には固相化用抗体としてＡｎｔｉ－ＮＹ－ＥＳＯ－１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、一次抗体としてＡｎｔｉ－ＣＴＡＧ１Ｂ　抗体、二次抗体としてＲａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙを使用し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一般的な測定方法に準拠して測定を行った。フローサイトメトリー法による測定には、ＡＰＣ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ１ｄ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ．５６３５０５）を使用し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いた一般的な測定方法に準拠して測定を行った。
（５）取得クローンのＮＹ－ＥＳＯ－１発現量
（４）で取得したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール由来又はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール由来のクローンについてＮＹ－ＥＳＯ－１の発現量を測定した。測定は（４）に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて実施した（図３）。
　図３に示す通り、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プールより単離されたクローンのＮＹ－ＥＳＯ－１の発現量は最大でも８８ｎｇ／１０６ｃｅｌｌｓと非常に低かった。一方で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿Ｔｅｔ－ｏｎ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール由来のクローンは、クローン間の差が大きく、所望の発現量のクローンを選択する余地を与える上に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ＿ＣＭＶ＿ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＣＤ１ｄ細胞プール由来のクローンに比べて高発現のクローンが多かった。
［実施例３：ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１と抗ＰＤ－１抗体の併用効果］
（１）ＮＹ－ＥＳＯ－１発現Ｂ１６メラノーマ細胞担癌マウスにおける併用効果
　９週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の皮下に、Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁した３×１０５ｃｅｌｌｓのＢ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を接種した。細胞接種７日後、前記マウスを腫瘍体積に基づき各群１０例の４つの群に分け、０．１ｍｇの抗ＰＤ－１抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＰＤ－１（ＣＤ２７９）、Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ社、Ｃａｔ．ＢＥ０１４６）、又はアイソタイプ抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ　ｒａｔ　ＩｇＧ２ａ　ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ、ａｎｔｉ－ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ、Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ社、Ｃａｔ．ＢＥ００８９）を腹腔内投与した。抗体は３～４日間隔で週に２回、合計５回投与した。抗体投与開始３日後、前記マウスの尾静脈に、溶媒であるＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁した５×１０４ｃｅｌｌｓのａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した日を０日目と設定し、１１日目までの腫瘍体積の変化を計測した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１＋アイソタイプ抗体の投与及び抗ＰＤ－１抗体の投与によりＢ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大が抑制された。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与と抗ＰＤ－１抗体の併用は、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１＋アイソタイプ抗体投与及び抗ＰＤ－１抗体投与と比較して、Ｂ１６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大をより顕著に抑制した（図４－１）。この結果から、抗ＰＤ－１抗体の併用はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の抗腫瘍効果を増強することが示唆された。
（２）ＮＹ－ＥＳＯ－１発現ＣＴ２６大腸がん細胞担癌マウスにおける併用効果
　７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の皮下に、Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁した７×１０５ｃｅｌｌｓのＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子を導入して作製したＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質を発現するＣＴ２６大腸がん細胞（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．ＣＲＬ－２６３８）（以下、ＣＴ２６－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞と称する）を接種した。細胞接種１４日後、前記マウスを腫瘍体積に基づき各群８例の４つの群に分け、０．１ｍｇの抗ＰＤ－１抗体を腹腔内投与した。抗体非投与群には投与は行わなかった。抗体は３～４日間隔で週に２回、合計４回投与した。抗体投与開始日に、前記マウスの尾静脈に、溶媒であるＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁した５×１０５ｃｅｌｌｓのａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した日を０日目と設定し、１４日目までの腫瘍体積の変化を計測した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の単剤の投与及び抗ＰＤ－１抗体の単剤の投与によりＣＴ２６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大が抑制されたのに対し、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与と抗ＰＤ－１抗体の併用は各単剤の投与と比較して、ＣＴ２６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大をより顕著に抑制した（図４－２）。この結果から、抗ＰＤ－１抗体の併用はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の抗腫瘍効果を増強することが示唆された。
［実施例４：ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１と抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用効果］
　７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（日本チャールス・リバー）の皮下に、Ｄ－ＰＢＳ（－）に懸濁した７×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴ２６－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞を接種した。細胞接種７日後、前記マウスを腫瘍体積に基づき各群１０例の４つの群に分け、群分け７日後、０．１５ｍｇの抗ＣＴＬＡ－４抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ社、Ｃａｔ．ＢＥ０１６４）を腹腔内投与した。抗体非投与群には投与は行わなかった。抗体は３～４日間隔で週に２回、合計５回投与した。抗体投与開始日に、前記マウスの尾静脈に、溶媒であるＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに懸濁した５×１０５ｃｅｌｌｓのａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１を投与した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞投与と抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用群ではａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与後に1個体の死亡が発生した。コントロール群には２００μＬのＢＩＣＡＮＡＴＥ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎを投与した。がん細胞を接種した日を０日目と設定し、３２日間の腫瘍体積の変化を計測した。ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の単剤の投与及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の単剤の投与によりＣＴ２６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大が抑制されたのに対し、ａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１投与と抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用は各単剤の投与と比較して、ＣＴ２６－ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍の増大をより顕著に抑制した（図５）。この結果から、抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用はａＡＶＣ（３Ｔ３）－ＮＹ－ＥＳＯ－１の抗腫瘍効果を増強することが示唆された。
　本発明のａＡＶＣ－ＮＹ－ＥＳＯ－１細胞は、がんの処置に有用であることが期待できる。
　配列表の配列番号１で示される塩基配列は、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号３で示される塩基配列は、ヒトＣＤ１ｄタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号５で示される塩基配列は、マウスＣＤ１ｄタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号５によりコードされるアミノ酸配列である。配列表の配列番号７で示される塩基配列は、ｐＬＶｓｙｎ－ＣＭＶの塩基配列である。以下の配列表の数字見出し＜２２３＞において、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明として記載される通りである。

Claims (24)

  1. 　ＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む、ヒト由来細胞。
  2. 　ＮＹ－ＥＳＯ－１がヒトＮＹ－ＥＳＯ－１である、請求項１に記載の細胞。
  3. 　ＣＤ１ｄがヒトＣＤ１ｄである、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. 　誘導型プロモーターが薬剤誘導型プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
  5. 　薬剤誘導型プロモーターが、テトラサイクリン系誘導型プロモーターである、請求項４に記載の細胞。
  6. 　テトラサイクリン系誘導型プロモーターがＴＲＥ３Ｇプロモーターである、請求項５に記載の細胞。
  7. 　ヒト由来細胞が正常細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞。
  8. 　ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞に由来する細胞である、請求項７に記載の細胞。
  9. 　ＣＤ１ｄ及びＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片を発現している、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞。
  10. 　ＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現量が１０６細胞当たり２４５ｎｇ～４５０００ｎｇである、請求項９に記載の細胞。
  11. 　細胞の表面にＣＤ１ｄリガンドを積載している、請求項９又は１０に記載の細胞。
  12. 　ＣＤ１ｄリガンドがα－ＧａｌＣｅｒである、請求項１１に記載の細胞。
  13. 　請求項１１又は１２に記載の細胞を含む医薬組成物。
  14. 　がんの処置に用いるための、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　がんを処置する方法であって、請求項１１又は１２に記載の細胞を対象に投与する工程を含む、方法。
  16. 　がんを処置するための、請求項１１又は１２に記載の細胞。
  17. 　がんの処置に用いる医薬組成物を製造するための、請求項１１又は１２に記載の細胞の使用。
  18. 　がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程を含む、方法。
  19. 　細胞の表面にα－ＧａｌＣｅｒを積載する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 　がんの処置に用いる細胞を製造する方法であって、
    　ヒト由来細胞にＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチド及び誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、又は
    　内在的にＣＤ１ｄを発現するヒト由来細胞に誘導型プロモーターに作動可能に連結されたＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片をコードするポリヌクレオチドを導入する工程、
    を含む、方法。
  21. 　前記工程で得られた細胞を誘導型プロモーターの誘導因子の存在下で培養することによりＮＹ－ＥＳＯ－１又はその断片の発現を誘導させる工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 　細胞の表面にα－ＧａｌＣｅｒを積載する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. がんを処置する方法であって、請求項１１又は１２に記載の細胞と免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与する工程を含む、方法。
  24. 免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－１系免疫チェックポイント阻害剤、又はＣＴＬＡ－４系免疫チェックポイント阻害剤である、請求項２３に記載の方法。
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