JP6912765B1 - 人工アジュバント細胞(aAVC)を用いたがんの治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
該細胞は、外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ
該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される、
方法。
[2]ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、[1]に記載の方法。
[3]CD1dがヒトCD1dである、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)由来細胞である、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]細胞表面に積載されているα−GalCer量が、1×106細胞当たり3.9〜275ngの範囲である、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物であって、
該細胞は、外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ
該組成物は、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される、
医薬組成物。
[7]ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、[6]に記載の医薬組成物。
[8]CD1dがヒトCD1dである、[6]又は[7]に記載の医薬組成物。
[9]ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)由来細胞である、[6]〜[8]のいずれかに記載の医薬組成物。
[10]細胞表面に積載されているα−GalCer量が、1×106細胞当たり3.9〜275ngの範囲である、[6]〜[9]のいずれかに記載の医薬組成物。
[11]がんの治療又は予防のための医薬組成物を製造するためのヒト由来細胞の使用であって、
該細胞は、外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ
該組成物は、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される、
使用。
[12]ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、[11]に記載の使用。
[13]CD1dがヒトCD1dである、[11]又は[12]に記載の使用。
[14]ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)由来細胞である、[11]〜[13]のいずれかに記載の使用。
[15]細胞表面に積載されているα−GalCer量が、1×106細胞当たり3.9〜275ngの範囲である、[11]〜[14]のいずれかに記載の使用。
[16]がんの治療又は予防に使用するためのヒト由来細胞であって、
該細胞は、外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ
該細胞は、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される、
ヒト由来細胞。
[17]ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、[16]に記載のヒト由来細胞。
[18]CD1dがヒトCD1dである、[16]又は[17]に記載のヒト由来細胞。
[19]ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)由来細胞である、[16]〜[18]のいずれかに記載のヒト由来細胞。
[20]細胞表面に積載されているα−GalCer量が、1×106個の細胞当たり3.9〜275ngの範囲である、[16]〜[19]のいずれかに記載のヒト由来細胞。
[21]外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性CD1dを発現するヒト由来細胞を56ng/mL〜3000ng/mLのα−GalCerを含む培養培地で培養する工程を含む、方法。
[22]前記培養工程により得られた細胞に積載されているα−GalCer量を測定し、細胞表面に積載されているα−GalCer量が1×106個の細胞当たり3.9〜275ngの範囲である細胞を選択する工程をさらに含む、[21]に記載の方法。
本発明は、以下に示すがんの治療又は予防する方法を提供する:
ヒト由来細胞をヒトに投与する工程を含むがんを治療又は予防する方法であって、
該細胞は、外来性又は内在性のCD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ
該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される、
方法。
本発明の方法は、外来性又は内在性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞(本明細書中、aAVCとも称する)を使用しうる。aAVCはさらに1以上の任意の外来性又は内在性のがん抗原を発現していてもよい。がん抗原を発現していないaAVCは、NKT細胞の活性化によりある程度の抗腫瘍効果をもたらすが、がん抗原を発現するaAVCは、がんに対する獲得免疫も誘導するため、より多くの利点がある。aAVCは、当該分野で公知の方法を使用して当業者に容易に作製され得る(例えば、非特許文献7及び8、特許文献1〜3)。
Gap Open Penalty = 10
Gap Extend Penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
End Gap Penalty = false
本発明は、α−GalCerを積載する前の段階の細胞(本明細書中、aAVC前駆細胞とも称する)を作製すること、及びaAVC前駆細胞にα−GalCerを積載させることを含みうる。また、本発明は、外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性CD1dを発現するヒト由来細胞を56ng/mL〜3000ng/mLのα−GalCerを含む培養培地で培養する工程を含む、方法を提供する。また、本発明は、外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性CD1dを発現するヒト由来細胞を56ng/mL〜3000ng/mLのα−GalCerを含む培養培地で培養する工程と、細胞表面に積載されているα−GalCer量が1×106個の細胞当たり3.9〜275ngの範囲である細胞を選択する工程を含む、ヒト由来細胞の製造方法を提供する。
aAVC前駆細胞は、ヒト由来細胞にCD1d遺伝子若しくはがん抗原をコードする遺伝子のいずれか、又はCD1d遺伝子及びがん抗原をコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。CD1d遺伝子及びがん抗原をコードする遺伝子は、NCBI RegSeq IDやGenBankのAccession番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、標準的な分子生物学及び/又は化学的手法を用いて設計及び作製することができる。例えば、前記遺伝子は、塩基配列をもとにホスホロアミダイト法等を用いて合成することができ、又cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて作製することができる。ヒト由来細胞への目的の遺伝子の導入はcDNAやmRNA等の形態にて導入する遺伝子を含む発現ベクターを用いて行うことができる。又ヒト由来細胞へエレクトロポレーション、リポフェクション等の方法によって目的遺伝子を直接細胞に導入してもよい。さらに、ヒト由来細胞に目的の遺伝子を導入してaAVC前駆細胞を作製した後、該細胞を培養して増殖させてもよい。
aAVC前駆細胞にα−GalCerをパルスすることによって、細胞表面にα−GalCerを積載したaAVCを作製する。本明細書において、「細胞表面にα−GalCerを積載した」とは、aAVC細胞の表面にα−GalCerが結合している状態を指す。その結合量は「2−3.aAVCに積載されているα−GalCer量の測定」の項に記載の方法を用いて測定することができる。本明細書において、α−GalCerを「パルスする」とは、aAVC前駆細胞をα−GalCerと接触させて、CD1dを発現するaAVC前駆細胞の細胞表面にα−GalCerを結合させることを指す。パルスは、細胞の培養培地中で行うことができる。
本発明者らは、aAVC細胞表面に積載されているα−GalCer量の測定方法を確立した。aAVC細胞表面に積載されているα−GalCerの量の測定は、aAVCの細胞抽出液を調製し、質量分析(MS)を用いる方法(例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC−MS/MS))にて当該抽出液中のα−GalCerを定量することにより行うことができる。
ステップ1:数種の濃度に調製したα−GalCerの標準物質の分析を行う。
ステップ2:標準物質由来のイオンのm/z(質量/電荷比)に対し、イオン強度の時間変化(マスクロマトグラム)を取得し、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。
ステップ3:ステップ2において求めた各標準物質のピーク面積と物質濃度との関係より、検量線を作成する。
ステップ4:定量する試料を分析し、試料中のα−GalCerのマスクロマトグラムのピーク面積を求める。
ステップ5:ステップ3にて作成した検量線に基づき、ステップ4のマスクロマトグラムのピーク面積に対応する試料のα−GalCerの濃度を決定する。
本発明の治療又は予防方法は、ヒトに投与されるaAVC細胞表面に積載されたα−GalCerの1回用量が所定の用量となるように対象に投与されうる。
本発明はまた、ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、外来性又は内在性のCD1dを発現し、細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞を含み、且つ、ヒトに投与される該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される。当該ヒト由来細胞は、1以上の外来性又は内在性のがん抗原をさらに発現していてもよい。本発明はまた、がんの治療又は予防のための医薬組成物を製造するためのヒト由来細胞の使用であって、該細胞は、外来性又は内在性のCD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ、該組成物は、ヒトに投与される該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される、使用を提供する。当該ヒト由来細胞は、1以上の外来性又は内在性のがん抗原をさらに発現していてもよい。本発明はまた、がんの治療又は予防のためのヒト由来細胞であって、該細胞は、外来性又は内在性のCD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ、該細胞は、ヒトに投与される該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される、細胞を提供する。当該ヒト由来細胞は、1以上の外来性又は内在性のがん抗原をさらに発現していてもよい。
本発明はまた、ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物の製造方法を提供する。本発明の医薬組成物の製造方法は、外来性又は内在性CD1dを発現し、細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞を提供することと、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲でヒトに投与されうるように該細胞を医薬組成物としてパッケージングすることを含む、方法でありうる。当該方法は、さらに、ヒト由来細胞の増殖を放射線照射等の方法により停止させる工程を含んでいてもよい。1つの実施形態において、本発明の医薬組成物の製造方法は、外来性又は内在性CD1dを発現し、細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞を提供することと、該細胞表面に積載されているα−GalCer量を指標として医薬組成物としてパッケージングする該細胞を選択するまたは該細胞の数を決定すること、及び、選択または決定された該細胞をパッケージングして医薬組成物を得ることを含む、方法であり得る。この実施形態において、医薬組成物に含まれる細胞表面に積載されたα−GalCerの総量は、1.7ng〜275ngの任意の数値に平均的なヒトの体重を乗じて算出された一定の数値範囲となり得る。本発明の医薬組成物の製造方法は、<細胞に積載されているα−GalCer量の測定法>の項に記載の、細胞表面に積載されているα−GalCerの量を測定する方法をさらに含みうる。本発明の医薬組成物の製造方法は、細胞当たりのα−GalCerの積載量が一定の数値範囲である細胞集団を選択することと、当該選択された細胞集団を医薬組成物としてパッケージングすることをさらに含みうる。細胞当たりのα−GalCerの積載量は、例えば、1×106個の細胞当たり3.9ng〜275ng、10〜275ng、10〜140ng又は10〜100ngの範囲内であり得る。製造される当該医薬組成物は、上記の用量でヒトに投与される。
本発明はまた、以下のような、細胞に積載されたα−GalCer量を測定する方法を提供する:
細胞に積載されたα−GalCer量を測定する方法であって、該細胞は、CD1dを発現し、細胞表面にα−GalCerが積載されている細胞であり、該方法は、
該細胞の細胞抽出液を調製する工程、及び
細胞抽出液を質量分析(MS)に供し、該液中のα−GalCer量を測定する工程
を包含する、方法。
WT1、CD1d、及びTet3G(リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子)遺伝子をそれぞれ搭載したプラスミドを用いてレンチウイルスを作製した。当該レンチウイルスを用いてFreeStyleTM 293−F細胞(Thermo Fisher Scientific社、Cat.R79007)に該遺伝子を導入することにより、CD1d及びWT1を発現し、細胞表面にα−GalCerを積載しているaAVCを構築した。
WT1遺伝子(配列番号1)の5’末側にXhoI認識配列、3’末側にNotI認識配列を付加した遺伝子を、pLVSIN−CMV Purプラスミド(タカラバイオ社、Cat.6183)のXhoI−NotIサイトに挿入することによりpLVSIN−CMV−WT1プラスミドを構築した。配列番号1の遺伝子は、Wilms tumor protein isoform D(NCBI Reference Sequence:NP_077744.3)のアミノ酸配列を基に、Thermo Fisher Scientific社の人工遺伝子合成サービスにてヒトのコドンへ最適化して作製した。pLVSIN−CMV−WT1プラスミドのCMVプロモーターを制限酵素ClaI及びEcoRIにて切断した後に、T4 DNA Polymerase(TOYOBO社、Cat.TPL−101)にて切断面を平滑化し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ社、Cat.6023)にてライゲーション反応を行い、pLVSIN−Δ−WT1プラスミドを構築した。pLVSIN−Δ−WT1プラスミドのEcoRI−XhoIサイトに、pTRE3G(タカラバイオ社、Cat.631173)から制限酵素EcoRI及びSalIで切り出したTRE3Gプロモーターを挿入し、pLVSIN−TRE3G−WT1プラスミドを構築した。pLVSIN−TRE3G−WT1プラスミドを制限酵素BamHI及びMluIで切断し、PGKプロモーターとピューロマイシン耐性遺伝子を除去した後に、当該プラスミドの切断面をT4 DNA Polymeraseにて平滑化し、DNA Ligation Kitにてライゲーション反応を行い、pLVSIN−TRE3G−WT1Δpurプラスミドを構築した。
(1)で作製したpLVSIN−TRE3G−WT1Δpurプラスミド、pLVSIN−CMV−CD1dΔpurプラスミド、pLVSIN−CMV−Tet3GΔpurプラスミドを用いて、WT1搭載レンチウイルス、CD1d搭載レンチウイルス及びTet3G搭載レンチウイルスを作製した。
FreeStyleTM 293−F細胞に(2)で作製した3種のレンチウイルスを順次感染させ、FreeStyle 293F_WT1_CD1d_Tet3G細胞を得た。FreeStyleTM 293−F細胞の培養は、0.1%量のゲンタマイシンを含むFreeStyle 293 Expression Mediumにて行った。FreeStyleTM 293−F細胞を1×106cells/mLの濃度に調製し、1mL/ウェル量でFalcon(登録商標)セルカルチャー 12ウェル 細胞培養用マルチウェルプレート 平底 フタ付き(Corning社、Cat.353043、以後12ウェルプレートという。)に播種し、(2)で作製したWT1搭載レンチウイルス50μLとTet3G搭載レンチウイルス100μLを添加した。540×g、室温で30分間遠心した後、ピペッティングで優しく細胞を懸濁して振盪培養を行った。3日後に12ウェルプレートからCorning(登録商標)ポリカーボネート製三角フラスコベントキャップ125mL(Corning社、Cat.431143、以後125mL三角フラスコという。)に継代し、さらに3日又は4日間隔で継代して11日間培養した。この細胞を再度12ウェルプレートに播種して、(2)で作製したCD1d搭載レンチウイルス100μLを添加し、1回目と同様の手順で2回目のレンチウイルス感染を行った。1日後に12ウェルプレートから125mL三角フラスコに継代し、さらに3日又は4日間隔で継代して10日間培養した。これをFreeStyle 293F_WT1_CD1d_Tet3G細胞とした。
(3)で作製したFreeStyle 293F_WT1_CD1d_Tet3G細胞から限外希釈法によるシングルセルクローニングを行い、全ての遺伝子が安定的に発現するクローンを選抜した。96ウェルプレートに1cell/ウェルとなるように細胞を播種し、細胞の増殖に合わせて継代を行った。増殖した細胞のWT1タンパク質及びCD1dタンパク質の発現量を、WT1はELISAにて、CD1dはフローサイトメトリーにて測定し、WT1及びCD1dタンパク質を安定的に発現するクローンを選抜した。WT1は、培地に終濃度100ng/mLのドキシサイクリン(タカラバイオ社、Cat.631311)を添加し、Tet−On Systemを介して発現を誘導して評価を行った。ELISAには固相化用抗体としてAnti−Wilms’tumor Antibody,NT clone 6F−H2(Merck社、Cat.MAB4234−C)、一次抗体としてAnti WT1抗体(Wuxi AppTec社、Cat.AP11964c)、二次抗体としてRabbit IgG Horseradish Peroxidase−conjugated Antibody(R&D Systems社、Cat.HAF008)を使用し、サンドイッチELISA法の一般的な測定方法に準拠して測定を行った。フローサイトメトリーには、APC Mouse Anti−Human CD1d抗体(BD Biosciences社、Cat.563505)を使用し、FACSVerseTM(BD Biosciences社)を用いて測定を行った。選抜されたクローンを、aAVC−WT1前駆細胞とした。
aAVC−WT1前駆細胞に種々の濃度のα−GalCer(十全化学株式会社に合成を委託)を添加して培養することによりパルスを行い、α−GalCer積載量が異なるaAVC(aAVC−WT1とも称する)を作製した。
マウスNIH/3T3細胞(ATCC、Cat.CRL−1658)にWT1遺伝子及びCD1d遺伝子のmRNAを導入し、α−GalCer(十全化学株式会社に合成を委託)を添加することによりマウス型aAVC(aAVC(3T3)−WT1とも称する)を作製した。
(1)α−GalCer Standard solution調製
400mLの注射用水(Thermo Fisher Scientific社 Cat.A12873−02)にSucrose(Merck社、 Cat.S7903)28g及びL−histidine(Merck社、 Cat.H8000)3.75gを加え、80℃の恒温水槽で加熱して溶解した。上記溶液にα−GalCer 100mg、10% ポリソルベート20(MP Biomedical社、Cat.194724)25gを加え、80℃の恒温槽で1時間以上加熱した。溶液中の固形物が溶解していることを確認した後、注射用水を加えて500gとし、この溶液を200μg/mLのα−GalCer溶液とした。200μg/mLのα−GalCer溶液を希釈液(10%水及び90%移動相B(70%エタノール、29.5%メタノール、0.5%ギ酸))で希釈し、1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mLの濃度のα−GalCer溶液をそれぞれ調製し、α−GalCer Standard solutionとした。
実施例1にて作製した、種々の濃度のα−GalCerでパルスした1×106cellsのaAVCに1mL又は0.25mLのMilli−Q水を加え、超音波ホモジナイザー(SMT社、Cat.UH−50)を用いて、細胞を20秒間ホモジナイズした。ホモジナイズした細胞破砕液100μLに900μLの移動相Bを加え、10分以上撹拌した。10000×gで5分間遠心し、上清250μLをポリプロピレン型スクリューバイアル(GLScience社、Cat.1030−61024)に回収し細胞抽出液を調製した。
(1)で調製したα−GalCer Standard solutionと、(2)で調製した細胞抽出液をLC−MS/MSの多重反応モニタリングによって測定した。α−GalCer Standard solutionは測定回数1、細胞抽出液は(5)の表1の通り測定回数6回、3回、又は1回で測定を実施した。LCは1200series(Agilent Technologies社)を使用し、MSは6410 Triple Quad LC−MS(Agilent Technologies社、Cat.G6410B)を使用した。LCでサンプルの分離を行った。10μLのα−GalCer Standard solution及び細胞抽出液を、Accucore−150−C4(Thermo Fisher Scientific社、Cat.16526−103030)カラムに供し、移動相A(0.1%ギ酸)および移動相B(70%エタノール、29.5%メタノール、0.5%ギ酸)で移動相Bが60%〜100%のグラジエント勾配にてサンプルを分離した。カラムへの流速は0.4ml/分、カラム温度は40℃で実施した。分離した溶液を順次MSに導入し、溶液中の化合物をエレクトロスプレーイオン化法によりイオン化した。発生したイオンの中から、α−GalCerの前駆イオンとして858.7[m/z]を選択した。さらにこの前駆イオンを分解し、696.7[m/z]をα−GalCerのプロダクトイオンとして検出した。前駆イオンとプロダクトイオンは、α−GalCer Standard solutionを上記LC−MS/MSで分析して予め求めた値を使用した。
解析ソフト(Agilent Technologies社、Agilent MassHunter Quantitative Analysis)を使用してα−GalCer濃度の定量を行った。α−GalCer Standard solutionの測定結果からα−GalCerの保持時間を判断し、測定サンプルが同様の保持時間を示すことを確認し、各測定サンプルのα−GalCer量をピーク面積法で解析を行った。(1)で調製したα−GalCer Standard solutionの解析結果から検量線を作成し、目的サンプルの定量を行った。検量線の作成には測定した1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mLの6点又は500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mLの6点の中から4点又は5点の測定結果を用いた。
aAVC(3T3)−WT1又はaAVC−WT1に積載されたα−GalCer量をLC−MS/MSにて測定した結果を下表に示す。表1において、α−GalCer添加濃度1500ng/mLに示す3つの値は、培養スケールが異なる独立した3回の実験にて得られた細胞に積載されたをα−GalCer量示す。
aAVC(3T3)−WT1を用い、マウスB16メラノーマ細胞静注肺転移モデルにおける、aAVCに積載されたα−GalCerを介したNKT細胞の活性化による抗腫瘍活性を評価した。各群16例の7週齢C57BL/6J雌性マウス(日本チャールス・リバー)の尾静脈から、PBSに懸濁したB16−F10メラノーマ細胞(ATCC、Cat.CRL−6475)を2×104cells投与して、マウスB16メラノーマ細胞静注肺転移モデルを作製した。投与3時間後、前記マウスの尾静脈から、BICANATE Injection(株式会社大塚製薬工場)に懸濁したaAVC(3T3)−WT1(実施例2 表1最上段、α−GalCer積載量は2.4ng/106cells)を、それぞれ1.7×104cells/kg、1.7×105cells/kg、1.7×106cells/kgとなるように投与した。コントロール群には200μLのBICANATE Injectionを投与した。B16−F10投与から61日にわたり生存を観察した結果、コントロール群の生存期間中央値が29.5日であったのに対し、aAVC(3T3)−WT1投与群の生存期間中央値はそれぞれ、1.7×104cells/kg投与群が31.5日、1.7×105cells/kg投与群が42.0日、1.7×106cells/kg投与群が37.0日であった。ログランク検定により生存期間を比較したところ、aAVC(3T3)−WT1を1.7×105cells/kg、1.7×106cells/kg投与した群は、コントロール群と比較して有意に生存期間が延長された(図1)。よって、本モデルにおいてaAVC(3T3)−WT1は1.7×105cells/kgで有効であると判定した。α−GalCerを積載した細胞の本モデルにおける抗腫瘍効果はNKT細胞欠損マウスやNK細胞の除去により減弱することが報告されている(J.Immunolo.;2007;178:2853−2861)。従って、本モデルにおけるaAVC(3T3)−WT1の抗腫瘍効果は、積載されたα−GalCerによるNKT細胞の活性化を介したものと考えられる。
マウス型aAVC(3T3)−WT1を用いてヒト型aAVC−WT1の薬効用量を推定するために、実施例2の表1に記載のaAVC(3T3)−WT1及び各種aAVC−WT1について、マウスにおけるNKT細胞活性化能を測定し、比較を行った。この結果を用いて、ヒトにおけるaAVC−WT1投与によるNKT細胞活性化を介した薬効発現に必要なα−GalCer投与量を設定した。NKT細胞活性化能の指標として、aAVC(3T3)−WT1投与後の脾臓細胞中NKT細胞割合を測定した。
また、aAVC細胞表面のα−GalCer積載量は、最小値である3.9ng/106cellsの濃度であっても、α−GalCer投与量が1.7ng/kgを超える投与量であれば、1.1%以上のNKT細胞割合を示した(図2、α−GalCer積載量が3.9ng/106cellsであるaAVC−WT1 3.9の黒の棒グラフ)。従って、α−GalCer積載量が3.9ng/106cells以上の濃度である細胞を用いることが望ましいと考えられる。
aAVC−WT1(α−GalCer積載量は275ng/106cells)をマウスに単回静脈内投与した後の毒性を評価した。動物は各群5例ずつ、8週齢C57BL/6Jの雌雄マウス(日本チャールスリバー)を使用した。投与群として、溶媒対照群、低用量群(1×106cells/kg)、中用量群(1×107cells/kg)及び高用量群(1×108cells/kg)の4群を設定した。溶媒として細胞投与液作製にはBICANATE Injection(大塚製薬)を用い、aAVC−WT1をBICANATE Injectionに懸濁して、低用量群用投与液1×105cells/mL、中用量群用投与液1×106cells/mL、高用量群用投与液1×107cells/mLをそれぞれ調製した。マウスへの投与容量は10mL/kgとし、投与日に測定した体重をもとにマウスごとに投与液量を算出し、溶媒又は細胞投与液をマウスの尾静脈内に単回投与した。投与後のマウスは、投与後7日間にわたり一般状態の観察、体重測定を行い、投与7日後に屠殺して剖検に供した。一般状態の観察(投与日は投与前、投与1時間後、投与4時間後の計3回、投与翌日〜剖検までは1日1回の観察)において、溶媒又は各細胞投与による影響(死亡、瀕死、その他自発運動低下など)は認められなかった。体重測定は投与前日、投与日、投与翌日、3日後及び7日後にに行った。高用量群の雌雄で投与3日後に体重減少が認められた(図3)。摂餌量測定(投与3日前〜投与前日、投与日〜投与翌日、投与翌日〜投与3日後、投与3日後〜投与7日後における1日当たりの摂餌量を測定)において、中用量群の雌及び高用量群の雌雄で、投与日〜投与翌日、及び投与翌日〜投与3日後における摂餌量の減少が認められた(図4)。本試験結果より、低用量群においては体重及び摂餌量に影響は認められないことから、1×106cells/kgが体重と摂餌量に影響を及ぼさない投与量の上限(α−GalCer積載量から換算して、α−GalCer投与量は275ng/kgに相当)であると考えられた。
配列表の配列番号1で示される塩基配列は、ヒトWT1タンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号2で示されるアミノ酸配列は、配列番号1によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号3で示される塩基配列は、ヒトCD1dタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号4で示されるアミノ酸配列は、配列番号3によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号5で示される塩基配列は、マウスCD1dタンパク質をコードする塩基配列であり、配列表の配列番号6で示されるアミノ酸配列は、配列番号5によりコードされるアミノ酸配列である。
Claims (6)
- ヒト由来細胞を含むがんの治療又は予防のための医薬組成物であって、
該細胞は、外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しており、且つ
該組成物は、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngとなるようにヒトに投与される、
医薬組成物。 - ヒト由来細胞が外来性がん抗原を発現する、請求項1に記載の医薬組成物。
- CD1dがヒトCD1dである、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- ヒト由来細胞がヒト胎児腎細胞293(HEK293)由来細胞である、請求項1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 細胞表面に積載されているα−GalCer量が、1×106細胞当たり3.9〜275ngの範囲である、請求項1〜4のいずれかに記載の医薬組成物。
- 外来性CD1dを発現し、該細胞表面にα−GalCerを積載しているヒト由来細胞であり、該細胞表面に積載されているα−GalCerの1回用量がヒト体重1kg当たり1.7ng〜275ngの範囲となるようにヒトに投与される細胞を製造する方法であって、外来性CD1dを発現するヒト由来細胞を56ng/mL〜3000ng/mLのα−GalCerを含む培養培地で培養する工程、及び
該培養工程により得られた細胞に積載されているα−GalCer量を測定し、細胞表面に積載されているα−GalCer量が1×10 6 個の細胞当たり3.9〜275ngの範囲である細胞を選択する工程を含む、方法。
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