CN109689109A - 结合蛋白-小分子缀合物的ev介导的递送 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含结合蛋白的细胞外囊泡(EV)，其可用于递送包含结合蛋白和小分子试剂(通常为小分子药物)的蛋白质‑药物缀合物。本发明还涉及制备这样的EV的方法以及这样的EV的药物组合物和医学用途。

Description

结合蛋白-小分子缀合物的EV介导的递送
技术领域
本发明涉及包含结合蛋白的细胞外囊泡(EV)，其用于递送包含结合蛋白和小分子试剂(通常是小分子药物)的蛋白质-药物缀合物。
背景技术
细胞外囊泡(EV)通过将其内容物(主要是RNA、蛋白质和脂质)呈递给靶组织中的受体细胞来调节正常生理学和病理学中的细胞间通讯。已经在许多背景下研究了对EV进行修改以掺入各种类型的药理学试剂，例如WO2013/084000公开了外来体用于细胞内递送生物治疗剂的用途，或WO2010/119256描述了使用外来体递送外源遗传物质。
EV作为药物递送载体的效用在例如基于核酸的药物如siRNA、靶向细胞内组分的基于大蛋白质的药物和例如溶解性差或剧毒的小分子治疗剂的情况下是无可挑剔的。EV介导的小分子药物递送也已在很大程度上进行了探索，例如WO2011/097480代表了EV的药物装载的典型方法。WO2011/097480描述了一种非常便利的方法，其中例如使用简单的共孵育步骤将植物化学小分子试剂姜黄素和白藜芦醇装载到EV中，在此期间，纯化的EV和游离的药物(例如姜黄素)在室温下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一起孵育，依赖于药物的扩散而进入EV。虽然非常方便和直接，但是将小分子试剂装载到EV中的这种常规方法不是特别有效，导致小分子试剂的显著浪费。而且，装载过程可能非常难以控制。其他人(例如Fuhrman等人,J.Control Rel.,2015)还使用诸如皂苷的去污剂评估了EV的透化作用，作为提高在这种情况下光活性小分子试剂卟啉的装载效率的方法。
最近的专利申请(WO2015/120150)还涉及用各种类型的抗癌药物(包括小分子和大的生物药物)装载肿瘤来源的EV。然而，正如本领域中通常的情况那样，关于如何装载外来体的信息非常少，并且如果有可用的方法，则它们很少可用于携带小分子的EV的装载和实际治疗应用。
发明内容
因此，本发明的一个目的是克服上述与用小分子试剂(通常是小分子药物或诊断试剂)装载EV用于随后的治疗应用相关的问题。此外，本发明旨在满足本领域内的其他现有需求，例如以靶向和可控制的方式有效递送不仅小分子试剂而且小分子与EV上存在的结合蛋白之间的缀合物(本文称为结合蛋白-小分子缀合物和类似术语)。
本发明通过使用EV作为用于小分子试剂本身或小分子试剂和具有治疗和/或预防效果的结合蛋白的组合的递送方式来实现这些和其他目的。根据本发明的EV通常可以包含结合蛋白，其可以是治疗性蛋白质(例如受体)，其充当至少一种小分子试剂(例如小分子药物)的相互作用配偶体(即结合剂)。
因此，在第一方面，本发明涉及包含结合蛋白的EV，其特征在于小分子试剂与结合蛋白结合。结合剂蛋白可以起到几种不同的作用：它可以例如是(i)载体和/或递送物，其主要用于运输与其连接的小分子试剂，(ii)靶向剂以指导携带结合剂蛋白-小分子缀合物的EV运输到特定位置，(iii)治疗活性蛋白，其通过附着可能具有激动或拮抗作用的小分子而变得具有治疗活性或无活性，(iv)信号传导蛋白，其在具有或者没有其小分子货物的情况下可以发挥或促成细胞和/或身体变化以及相关的治疗和/或预防效果。结合蛋白可以通过在合适的位置释放小分子试剂进一步促进身体和/或细胞作用或活性和相关的治疗效果，或者其通过保留与其结合的小分子试剂可以促成这种效果。
在一个有利的实施方案中，结合蛋白是包含结合蛋白和EV蛋白的融合蛋白，以便能够将结合蛋白受控地装载并展示在EV表面上。然而，天然存在于EV中的结合蛋白或经工程化以转运至EV的结合蛋白也在本发明的范围内，并且结合蛋白的选择和/或设计将受到待治疗疾病、药理学靶标和结合蛋白结合的小分子试剂的很大影响。
另一方面，本发明涉及调节细胞信号转导的方法，包括允许小分子试剂与EV上展示的结合蛋白非共价或共价相互作用并随后将所得的结合蛋白-小分子药物缀合物、结合蛋白本身和/或与结合蛋白结合的小分子试剂暴露于特定靶和/或靶位置的步骤。
在另一方面，本发明涉及产生根据本发明的EV的方法。此类方法可包括以下步骤：(a)提供包含与EV蛋白的融合蛋白形式的结合蛋白的EV，和(b)将结合蛋白暴露于小分子试剂以使小分子试剂能够与结合蛋白相互作用和结合。
此外，本发明还涉及递送结合蛋白、结合蛋白-小分子缀合物和/或小分子的方法，包括以下步骤：(a)提供根据本发明的EV和(b)递送结合蛋白质、结合蛋白-小分子缀合物和/或小分子试剂(通常是小分子药物)至靶位置。
通常，本发明的小分子试剂可选自广泛多样的药物和/或诊断剂类别，例如抗癌剂，例如多柔比星，5-氟尿嘧啶或其他核苷类似物，例如阿糖胞苷，蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米，或激酶抑制剂如伊马替尼或塞利西利，或NSAID如萘普生，阿司匹林或塞来昔布，抗生素如赫西西林，或抗高血压药如ACE抑制剂如依那普利，ARB如坎地沙坦。各种类型的杂-或同-二聚体、三聚体或多聚体小分子试剂也在本发明的范围内，因为这些试剂可促进结合蛋白与另一种感兴趣的蛋白质或非蛋白质靶分子之间的相互作用。
另一方面，本发明涉及将小分子药物递送至靶位置例如靶细胞、靶细胞组分(例如细胞质或细胞核)、靶组织、靶器官或任何靶隔室(其也可包括体液，例如血流或脑脊髓液)的方法。这些方法可以包括将靶位置暴露于装载有小分子的EV，以与结合蛋白的缀合物(在小分子与结合蛋白结合的意义上的缀合物)的形式或已从结合蛋白释放到EV或从EV释放的小分子的形式。
在另一方面，本发明还涉及改变小分子药物的药代动力学或药效学特征的方法。此类方法包括将所讨论的小分子装载到EV上和/或EV中存在的结合蛋白上，以调节所讨论的小分子药物的体内和潜在体外特性。
另外，在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含以结合蛋白-小分子缀合物形式的携带小分子的EV。在实践中，根据本发明的药物组合物不是仅包含少量EV，而是实际上包含大量EV。这些组合物中的EV浓度可以以许多不同的方式表达，例如每单位(通常体积)或每剂量的EV蛋白量，每单位(通常体积，每只动物，每kg体重等)或每剂量的EV或颗粒数量，每单位或每剂量的小分子药物的浓度等。通常，使用药学上可接受的赋形剂配制这些药物组合物用于体内和体外使用。
最后，本发明还涉及包含结合蛋白-小分子缀合物的EV的医学用途和应用，例如用于治疗、诊断、预防或监测炎性疾病、自身免疫疾病、癌症、代谢紊乱或任何合适的疾病或疾病，或用于美容或其他非疾病相关的应用。
附图说明
图1显示装载EV的APO保留或甚至增加其功能以诱导PKA和MARK依赖性信号传导，其导致下游促存活FGF-2的产生增加。
图2显示携带ABL1受体酪氨酸激酶-伊马替尼缀合物的EV降低肿瘤重量并增加存活。
图3举例说明了在LPS诱导的急性败血症模型中携带ABL1受体酪氨酸激酶-伊马替尼缀合物的EV的作用。
图4显示了携带结合FKBP12的小分子雷帕霉素的包含结合蛋白-小分子缀合物(其包含FKBP12或含有FKBP12和CD63的融合蛋白)的MSC衍生的EV对MCF7乳腺癌的抗癌作用。
图5显示了使用装载于EV上的肾上腺髓质素(AM)诱导3T3-L1细胞中的脂解，所述EV包含结合蛋白CALC L(AM的受体)或与EV蛋白CD81融合的CALCRL。
具体实施方式
本发明尤其描述了用于递送小分子，蛋白质生物制剂和/或蛋白质-小分子缀合物的EV的新方法，组合物，EV和用途。此外，本发明涉及用于EV装载的方法，携带小分子的EV，利用这种EV的各种方法，包含治疗有效量的EV的药物组合物，以及根据本发明的携带小分子的EV的医学用途。
为了方便和清楚起见，本文采用的某些术语在下面被收集和描述。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在根据马库什组描述本发明的特征、方面、实施方案或替代方案的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员子群的形式描述。本领域技术人员将进一步认识到，本发明也因此根据马库什组的单个成员或成员子群的任何组合来描述。另外，应该注意，结合本发明的一个方面和/或实施方案描述的实施方案和特征也适用于本发明的所有其他方面和/或实施方案。例如，关于携带小分子的EV描述的各种小分子应被理解为还公开、相关并且包括在用结合蛋白-小分子药物缀合物装载EV的方法的上下文中，即所有小分子试剂和所有结合蛋白应被认为也公开了它们所有潜在的相互作用配偶体。此外，结合某些方面描述的某些实施方案，例如携带小分子的EV的施用途径，如关于有关的方面所述的用这样的EV治疗某些医学适应症，当然也可以与其他方面和/或实施方案有关，例如与本发明的药物组合物有关的那些。此外，任何和所有特征(例如马库什组的任何和所有成员)可以与任何和所有其他特征(例如任何其他马库什组的任何和所有成员)自由组合，例如，任何结合蛋白可以与任何小分子试剂组合，或者任何结合蛋白可以与任何EV蛋白组合，而不脱离本发明的要旨。此外，当本文的教导以单数提及EV和/或提及EV为离散的天然EV纳米颗粒状囊泡时，应该理解，所有这些教导对于多个EV和EV的群体同样相关和适用。作为一般说明，根据本发明的小分子试剂、结合蛋白、靶向部分、细胞来源、EV蛋白和所有其他方面、实施方案和替代方案可以以任意和所有可能的方式自由组合而不脱离本发明的范围和主旨。此外，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽或多核苷酸序列(分别为氨基酸序列或核苷酸序列)可以显著地偏离原始多肽、多核苷酸和序列，只要任何给定分子保留进行与之相关的技术效果。只要保留它们的生物学特性，与天然序列相比，根据本申请的多肽和/或多核苷酸序列可以偏离多达50％(使用例如BLAST或ClustalW计算)，尽管尽可能高的序列同一性是优选的(例如60％，70％，80％或例如90％或更高)。例如至少一种结合蛋白和至少一种外来体蛋白的组合(融合)意味着可以替换和/或修饰相应多肽的某些区段，这意味着只要关键性质(例如靶向性质，运输至外来体的表面，治疗活性，与小分子试剂的结合等)得到保留，与天然序列的偏差可以是相当大的。因此，类似的推理自然地适用于编码这种多肽的多核苷酸序列。
术语“细胞外囊泡”或“EV”或“外来体”在本文中可互换使用，并且应理解为涉及可以以任何形式从细胞获得的任何类型的囊泡，例如微泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)，外来体(例如来源于内-溶酶体途径的任何囊泡)，凋亡小体(例如可从凋亡细胞获得)，微粒(可以来源于例如血小板)，核外粒(来源于例如，血清中的中性粒细胞和单核细胞)，前列腺体(例如可从前列腺癌细胞获得)，或心肌细胞外来体(cardiosome)(例如可来源于心肌细胞)等。此外，所述术语还应理解为涉及脂蛋白颗粒，例如LDL、VLDL、HDL和乳糜微粒，以及脂质体，杂合囊泡，细胞外囊泡(EV)模拟物，通过膜挤出或其他技术获得的基于细胞膜的囊泡等。本质上，本发明可涉及任何类型的基于脂质的结构(具有囊泡形态或具有任何其他类型的合适形态)，其可以充当感兴趣的小分子的递送或运输载体。本领域技术人员将清楚，当描述EV的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个EV，即EV群，其可包括数千、数百万、数十亿甚至数万亿的EV。从下面的实验部分可以看出，EV可以以每单位体积(例如每毫升)1010、1011、1015、1018,1025个EV(通常称为“颗粒”)或更大、更小或介于两者之间的任何其他数量的浓度存在。同样，可例如涉及包含某种小分子的EV的术语“群体”应理解为包括构成这种群体的多个基本相似的实体。换句话说，当以多个存在时的个体EV构成EV群体。
因此，如本领域技术人员所清楚的，本发明涉及包含小分子的个体EV和包含含有通常与结合蛋白结合的小分子的EV的群体。当在体内应用时，EV的剂量自然地可以根据待治疗的疾病、施用途径、小分子货物等变化很大。
术语“小分子试剂”或“小分子”或“小分子药物”或“小分子治疗剂”在本文中可互换使用，并应理解为涉及可用于治疗和/或诊断疾病和/或病症以及用于调节或改变例如结合蛋白的活性和/或结合和/或位置的任何分子试剂。小分子试剂通常通过化学合成方法合成，但也可以是天然衍生的，例如通过从天然来源纯化，或者可以通过任何其他合适的方法或技术组合获得。“小分子”的简要、非限制性定义是分子量小于900g/mol(道尔顿)的任何有机化合物，其可以基本上以任何方式调节、改变或影响生物过程。出于本发明的目的，小分子可以基本上大于900g/mol，例如1500g/mol，3000g/mol，或偶尔甚至更大。总的来说，分子量和/或分子大小不是构成小分子试剂的决定因素。事实上，出于本发明的目的，任何可以被展示在EV上的结合蛋白结合的试剂被认为是“小分子试剂”。因此，合成和天然肽、包含天然和/或修饰的核苷酸的RNA基试剂、甚至蛋白质被认为是本发明的小分子试剂，只要它们可以被结合蛋白结合即可。在某些实施方案中，小分子试剂可以是寡核苷酸，例如短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，CRISPR引导RNA链，mRNA，反义寡核苷酸或剪接转换寡核苷酸，或任何其他类型的RNA分子。在另一个实施方案中，小分子试剂可以是肽，例如受体配体，神经肽，Aβ抑制剂，细胞穿透肽(CPP)，诱导内体逃逸的肽，靶向肽或任何其它合适的肽。尽管小分子通常表现出良好的口服生物利用度，但是许多小分子药物需要静脉内施用或通过一些其它施用途径施用，出于无论是药代动力学、药效学和/或毒性或稳定性原因。小分子的实例包括抗癌剂如多柔比星，柔红霉素，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，蛋白酶体抑制剂如硼替佐米，或激酶抑制剂如伊马替尼或塞利西利，NSAID如萘普生、阿司匹林或塞来昔布，抗生素如赫西西林，抗高血压药如ACE抑制剂如依那普利，ARB如坎地沙坦，寡核苷酸如siRNA、剪接转换RNA，肽，异二聚体或同二聚体小分子等。本发明自然也适用于基本上任何其他小分子而不脱离本发明的主旨，如本领域技术人员所清楚的。
术语“结合剂蛋白”、“结合蛋白”、“结合剂”、“受体蛋白”和类似术语在本文中可互换使用，并应理解为涉及小分子试剂可通过非共价或共价连接或通过共价和非共价相互作用的组合连接到其上的任何蛋白质、多肽或肽(即包含氨基酸序列的任何分子)。结合蛋白和小分子试剂的组合在本文中使用如下术语描述：“结合蛋白-小分子缀合物”或“结合蛋白-小分子药物缀合物”或“结合蛋白-小分子试剂缀合物”，或仅仅是“缀合物”。结合蛋白可以起到几种不同的作用：它可以例如是(i)载体和/或递送方式，其主要用于运输与其连接的小分子试剂，(ii)靶向剂以指导携带结合剂蛋白-小分子缀合物的EV运输至特定的位置，(iii)治疗活性蛋白质，其通过附着可能具有激动或拮抗作用的小分子而具有治疗活性或无活性，(iv)信号传导蛋白，其在具有或者没有其小分子货物的情况下可以发挥或促成细胞和/或身体变化以及相关的治疗和/或预防效果，(v)仅在接近另一种蛋白质时进行或催化特定反应的蛋白质，等。结合蛋白可以通过在合适的位置释放小分子试剂进一步促进身体和/或细胞作用或活性和相关的治疗效果，或者其通过保留与其结合的小分子试剂可以促成这种效果。第一种情况的实例是当EV介导的递送后结合蛋白在靶细胞内释放小分子药物时，而第二种情况的实例是将抗体-小分子药物缀合物递送到肿瘤中。通常，结合蛋白是人源的，尽管在技术人员已知的某些情况下，结合蛋白可以从任何其他物种获得(例如，使用非限制性实例，当结合蛋白是核酸酶如Cas9时，这是一种细菌蛋白质)。此外，结合蛋白不需要以其整体存在，而是可以以亚基、结构域、截短蛋白、衍生物或其变体的形式存在，只要期望的效果(与递送、治疗活性、靶向等有关的任何效果)得到维持。结合蛋白可以天然存在于EV和/或EV源细胞中，或者它们可以通过与EV蛋白的融合构建体被运输至EV。根据本发明的结合蛋白的非限制性实例包括GPCR，多克隆和单克隆抗体，单链可变片段(scFv)，整联蛋白，酶如酪氨酸激酶(例如BTK或Bcr-Abl酪氨酸激酶)，核酸酶如Cas和Cas9，蛋白酶，整合酶，磷酸酶，连接酶，GTP酶，DNA结合和RNA结合蛋白，例如Ago2，Dicer，GW182，hnRNPAI，hnRNPA2B1，DDX4，ADAD1，DAZL，ELAVL4，IGF2BP3，SAMD4A，TDP43，FUS，F R1，FXR1，FXR2，EIF4A1-3，MS2外壳蛋白；芳香酶或酯酶，衔接蛋白(如SH2结构域)，G蛋白，GEF，钙调蛋白，Ras，踝蛋白，纽蛋白，paxilin，Raf，半胱天冬酶，转录因子如MyoD和Myf5，肿瘤抑制因子如p53，神经营养因子如脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子，神经递质受体，多巴胺受体，结构蛋白如肌营养不良蛋白，肌营养不良蛋白相关蛋白，肌联蛋白，伴肌动蛋白，肌营养不良蛋白相关的蛋白如小肌营养蛋白，互养蛋白，成束蛋白，结蛋白，肌聚糖，肌营养不良蛋白聚糖，sarcospan，集聚蛋白和/或fukutin，白细胞介素如IL1α和β，IL2，IL4，IL6，IL10，IL17，IL23和其他白细胞介素和所有白细胞介素受体如IL2R，IL6R，gp130，IL10R，IL17R，IL23R，干扰素(如INFα和β)和干扰素受体，肿瘤坏死因子(TNF)如TNFα和β及其受体，膜联蛋白如ANXA2和ANXA5，信号识别颗粒和受体组分如SRPB2和SRP 54，细胞外基质成分如COL1A1和COL6A1，溶质载体SLC25A5和SLC25A13，核糖体蛋白RPS27A和RPL7，翻译延伸因子如EEF1A1和EEF1A2，起始因子如EIF4A1和EIF4A2，GPI-锚定蛋白，四跨膜蛋白如CD63和CD81，组织因子，生长因子及其受体如EGF和EGFR，以及任何上述结合蛋白的任何融合物、组合、亚基、衍生物或结构域。
术语“EV蛋白”、“外来体蛋白”、“外来体分选结构域”、“EV分选结构域”、“EV分选蛋白”、“外来体蛋白”、“外来体多肽”、“EV多肽”等在本文中可互换使用且应理解为涉及可用于将多肽构建体(其通常除EV蛋白质之外还包含至少一种感兴趣的蛋白质)转运至合适的囊泡结构(即合适的EV)的任何多肽。更具体地，所述术语应理解为包括能够将多肽构建体转运、运输或穿梭至囊泡结构(例如外来体)的任何多肽。这种外来体分选结构域的实例是例如CD9，CD53，CD63，CD81，CD54，CD50，FLOT1，FLOT2，CD49d，CD71，CD133，CD138，CD235a，ALIX，Syntenin-1，Syntenin-2，Lamp2b，TSPAN8，TSPAN14，CD37，CD82，CD151，CD231，CD102，NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，NOTCH4，DLL1，DLL4，JAG1，JAG2，CD49d/ITGA4，ITGB5，ITGB6，ITGB7，CD11a，CD11b，CD11c，CD18/ITGB2，CD41，CD49b，CD49c，CD49e，CD51，CD61，CD104，Fc受体，白细胞介素受体，免疫球蛋白，MHC-I或MHC-II成分，CD2，CD3ε，CD3ζ，CD13，CD18，CD19，CD30。CD34，CD36，CD40，CD40L，CD44，CD45，CD45RA，CD47，CD86，CD110，CD111，CD115，CD117，CD125，CD135，CD184，CD200，CD279，CD273，CD274，CD362，COL6A1，AGRN，EGFR，GAPDH，GLUR2，GLUR3，HLA-DM，HSPG2，L1CAM，LAMB1，LAMC1，LFA-1，LGALS3BP，Mac-1α，Mac-1β，MFGE8，SLIT2，STX3，TCRA，TCRB，TCRD，TCRG，VTI1A，VTI1B及其任何组合，但是许多能够将多肽构建体转运至EV的其他多肽包括在本发明的范围内。根据本发明的EV蛋白通常是人来源的并且可以在各种公众可获得的数据库中找到，例如Uniprot，RCSB等。EV蛋白可以与各种其他蛋白质和/或蛋白质结构域融合，以例如增强表面展示、增加亲合力或使得能够以非共价方式与特定类型的结合蛋白相互作用。
术语“源细胞”或“EV源细胞”或“亲本细胞”或“细胞来源”或“产生EV的细胞”或任何其他类似术语应被理解为涉及能够在合适的细胞培养条件下产生EV例如外来体的任何类型的细胞。这样的条件可以是悬浮细胞培养或贴壁培养或任何其他类型的培养系统。中空纤维生物反应器、搅拌槽生物反应器和其他类型的生物反应器代表了非常适合的细胞培养基础设施。本发明的源细胞可选自多种细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞或成纤维细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶质、围产组织、牙蕾、脐带血液、皮肤组织等获得)，羊膜细胞和更具体地任选地表达各种早期标志物的羊膜上皮细胞，骨髓抑制细胞。特别感兴趣的细胞系包括人脐带内皮细胞(HUVEC)，人胚肾(HEK)细胞，内皮细胞系如微血管或淋巴管内皮细胞，软骨细胞，MSC，气道或肺泡上皮细胞，以及细胞来源的各种其他非限制性实例。
源细胞在性质上对于待治疗的患者而言可以是同种异体的、自体的或甚至是异种的，即细胞可以来自患者本身或来自不相关、匹配或不匹配的供体。在某些情况下，从物流的角度来看，同种异体细胞可能是优选的，因为这样的来源提供了现成的治疗方法。
在第一方面，本发明涉及包含结合蛋白的EV，其中小分子试剂(例如，小分子药物)与结合蛋白结合。通常，小分子试剂通过非共价连接/键联与结合蛋白结合，但连接也可以基于共价相互作用。非共价相互作用的非限制性实例是ABL1受体酪氨酸激酶和小分子药物伊马替尼之间的连接。结合蛋白和小分子药物之间的共价相互作用的非限制性实例是共价键，其通常连接抗体-药物缀合物中的单克隆抗体和抗癌剂，例如本妥昔单抗和单甲基瑞奥西汀E之间的共价连接(brentuximab-vedotin)。虽然有利，但是从结合蛋白释放小分子药物不是必需的，只要小分子药物、结合蛋白和/或蛋白质-药物缀合物可以发挥其所需效果即可。可释放的共价键的合适的非限制性实例包括可以在还原环境中经历还原的二硫键和硫醚键，可以通过例如蛋白酶和其他酶裂解的酰胺键，在某些体内条件下解离的生物素-链霉抗生物素蛋白连接等。尽管如此，仍有多种策略可用于小分子药物与结合蛋白的共价缀合/连接，其中非限制性实例是例如酯键、酰胺键、二硫键、硫醚键、生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用、通过马来酰亚胺-NHS反应获得的键联、通过EDC-NHS反应获得的键联、订书钉键联(例如全烃订书钉)和其他各种键。
在一个有利的实施方案中，结合蛋白是融合蛋白，其包含与EV蛋白融合的结合蛋白本身。如上所述，结合蛋白质不一定必须是整个蛋白质，而是可以是亚基、结构域、衍生物、截短体或任何其他类型的相较于原始序列经修饰的氨基酸序列。这种修饰的一个实例是使用抗体的单链片段可变(scFv)结构域，而不是使用整个抗体。
根据本发明的结合蛋白基本上可以是任何能够结合本发明的小分子的蛋白质。如上所述，根据本发明的结合蛋白的一些非限制性实例包括GPCR，多克隆和单克隆抗体，单链可变片段(scFv)，整联蛋白，酶如酪氨酸激酶，核酸酶如Cas和Cas9，DNA结合或RNA结合蛋白或其结构域，蛋白酶，连接酶，异构酶，整合酶，磷酸酶，GTP酶，芳香酶或酯酶，衔接蛋白如SH2结构域，G蛋白，GEF，钙结合蛋白如钙调蛋白，Ras，踝蛋白，纽蛋白，paxilin，Raf，半胱天冬酶，转录因子如MyoD和Myf5，肿瘤抑制因子如p53，p21，pVHL，APC，CD95，ST5，YPEL3，ST7和ST14，神经营养因子如脑源性神经营养因子因子(BDNF)和神经生长因子，结构蛋白如肌营养不良蛋白，肌营养不良蛋白相关蛋白，肌联蛋白，伴肌动蛋白，肌营养不良蛋白相关的蛋白如小肌营养蛋白，互养蛋白，成束蛋白，结蛋白，肌聚糖，肌营养不良蛋白聚糖，sarcospan，集聚蛋白和/或fukutin，以及任何上述结合蛋白的任何融合物、组合、亚基、衍生物或结构域。
在非限制性实施方案中，抗体形式的结合蛋白可包括以下的任何一种或多种：阿巴伏单抗，阿昔单抗，阿克托单抗，阿达木单抗，阿德木单抗，Aducanumab，阿非莫单抗，阿托珠单抗，Alacizumab，阿伦单抗，Alirocumab，阿妥莫单抗三胺五乙酸，Amatuximab，Anatumomabmafenatox，Anifrolumab，安芦珠单抗，阿泊珠单抗，阿西莫单抗，阿塞珠单抗，Atinumab，Atlizumab，Atorolimuma，巴匹珠单抗，巴利昔单抗，巴维昔单抗，贝妥莫单抗，贝利木单抗，Benralizumab，柏替木单抗，贝索单抗，贝伐单抗，Bezlotoxumab，比西单抗，Bimagrumab，比伐珠单抗美登素，兰妥莫单抗，Blosozumab，本妥昔单抗，布拉吉单抗，Brodalumab，卡那奴单抗，美坎珠单抗，Cantuzumab ravtansine，Caplacizumab，卡罗单抗喷地肽，Carlumab，卡妥索单抗，cBR96-多柔比星免疫缀合物，西地珠单抗，培化舍珠单抗，西妥昔单抗，泊西他珠单抗，西妥木单抗，Ciazakizumab，克立昔单抗，Clivatuzumabtetraxetan，可那木单抗，Concizumab，Crenezumab，达西珠单抗，达克珠单抗，Dalotuzumab，达雷木单抗，Demcizumab，地舒单抗，地莫单抗，阿度莫单抗，Drozitumab，Duligotumab，Dupilumab，Dusigitumab，依美昔单抗，依库珠单抗，埃巴单抗，依决洛单抗，依法珠单抗，依芬古单抗，Eldelumab，依洛珠单抗，Elsilimomab，恩伐珠单抗，培化恩莫单抗，Enokizumab，Enoticumab，Ensituximab，西依匹莫单抗，依帕珠单抗，厄利珠单抗，厄马索单抗，埃达珠单抗，Etrolizumab，Evolocumab，艾韦单抗，Fanolesomab，法拉莫单抗，法利珠单抗，Fasinumab，泛维珠单抗，非扎奴单抗，Ficlatuzumab，芬妥木单抗，Flanvotumab，芳妥珠单抗，Foraiumab，福拉韦单抗，夫苏木单抗，Fulranumab，Futuximab，加利昔单抗，盖尼塔单抗，更汀芦单抗，加维莫单抗，吉妥珠单抗奥佐米星，Gevokizumab，吉瑞昔单抗，Glembatumumab vedotin，戈利木单抗，Gomiliximab，Guselkumab，艾巴利珠单抗，替伊莫单抗，Icrucumab，伊戈伏单抗，英西单抗，Imgatuzumab，Inclacumab，Indatuximabravtansine，英夫利昔单抗，英妥木单抗，伊诺莫单抗，伊珠单抗奥加米星，伊匹木单抗，伊妥木单抗，依托珠单抗，Ixekizumab，凯利昔单抗，拉贝珠单抗，Lambrolizumab，Lampalizumab，来金珠单抗，来马索单抗，乐德木单抗，来沙木单抗，利韦单抗，Ligelizumab，林妥珠单抗，Lirilumab，洛迪赛珠单抗，Lorvotuzumabmertansine，鲁卡木单抗，鲁昔单抗，马帕木单抗，Margetuximab，马司莫单抗，Mavrilimumab，马妥珠单抗，美泊利单抗，美替木单抗，米拉珠单抗，明瑞莫单抗，米妥莫单抗，莫加木珠单抗，莫罗木单抗，莫维珠单抗，Moxetumomab pasudotox，莫罗单抗-CD3，他那可单抗，Namilumab，他那莫单抗，Narnatumab，那他珠单抗，奈巴库单抗，奈昔木单抗，奈瑞莫单抗，Nesvacumab，尼妥珠单抗，尼鲁单抗，巯诺莫单抗，Ocaratuzumab，奥瑞珠单抗，奥度莫单抗，奥法木单抗，奥拉单抗，Olokizumab，奥马珠单抗，Onartuzumab，Ontuxizumab，莫奥珠单抗，奥戈伏单抗，Orticumab，奥昔珠单抗，Otiertuzumab，Oxeiumab，Ozanezumab，Ozoraiizumab，帕吉昔单抗，帕利珠单抗，帕木单抗，Pankomab，帕诺库单抗，Parsatuzumab，帕考珠单抗，Pateclizumab，Patritumab，Pemtumomab，Perakizumab，帕妥珠单抗，培克珠单抗，Pidilizumab，Pinatuzumab vedotin，喷妥莫单抗，Placulumab，Polatuzumab vedotin，Ponezumab，普立昔单抗，Pritoxaximab，普立木单抗，Quilizumab，雷妥莫单抗，Radretumab，雷韦单抗，雷莫芦单抗，雷珠单抗，雷昔库单抗，瑞加韦单抗，瑞利珠单抗，利妥木单抗，利妥昔单抗，罗妥木单抗，Roledumab，Romosozumab，罗利珠单抗，罗维珠单抗，芦利珠单抗，Samalizumab，Sarilumab，沙妥莫单抗喷地肽，苏金单抗，Seribantumab，色托西单抗，司韦单抗，西罗珠单抗，西法木单抗，司妥昔单抗，Simtuzumab，西利珠单抗，Sirukumab，苏兰珠单抗，Solitomab，Sonepcizumab，松妥珠单抗，司他芦单抗，硫索单抗，索维单抗，Tabalumab，Tacatuzumab tetraxetan，他度珠单抗，他利珠单抗，他尼珠单抗，帕他莫单抗，替非珠单抗，阿替莫单抗，Tenatumomab，Teneliximab，替利珠单抗，替妥木单抗，Ticilimumab，Tildrakizumab，替加珠单抗，托珠单抗，托利珠单抗，托西莫单抗，利妥昔单抗，Tovetumab，川隆单抗，曲妥珠单抗，Tregalizumab，曲美木单抗，西莫白介素单抗，妥韦单抗，Ublituximab，Urelumab，乌珠单抗，乌司奴单抗，Vantictumab，伐利昔单抗，Vatelizumab，维多珠单抗，维妥珠单抗，维帕莫单抗，Vesencumab，维西珠单抗，伏洛昔单抗，Vorsetuzumab mafodotin，伏妥木单抗，扎芦木单抗，扎木单抗，Zatuximab，齐拉木单抗，阿佐莫单抗，或其任何组合。当用作结合蛋白时，抗体可以发挥多种作用。例如，抗体可以(i)提供至感兴趣的细胞、组织和/或器官的靶向递送，(ii)具有固有的治疗活性，(iii)当连接至EV表面时，它们可以被体外或体内递送至靶细胞中，(iv)充当结合蛋白以递送小分子药物(通常称为进入细胞或在体内细胞外的抗体-药物缀合物(ADC))，并且(v)提供用于多个小分子试剂的多个结合位点。
如上所述，根据本发明的小分子药物可以基本上从药学和/或药理学和/或诊断相关药剂的整个范围获得，例如抗癌剂，细胞抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，他汀类药物，NSAID，抗生素，抗真菌药，抗细菌药，抗寄生虫药，抗炎药，抗纤维化药，抗高血压药，芳香酶或酯酶抑制剂，抗胆碱能药，SSRI，BKT抑制剂，PPAR激动剂，HER抑制剂，AKT抑制剂，BCR-ABL抑制剂，信号转导抑制剂，血管生成抑制剂，合酶抑制剂，ALK抑制剂，BRAF抑制剂，MEK抑制剂，PI3K抑制剂，脑啡肽酶抑制剂，β2-激动剂，CRTH2拮抗剂，FXR激动剂，BACE抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂，MARK抑制剂，Hedgehog信号传导抑制剂，MDM2拮抗剂，LSD1抑制剂，内酰胺酶抑制剂，TLR激动剂，TLR拮抗剂，IDO抑制剂，ERK抑制剂，Chk1抑制剂，剪接调节剂，DNA或RNA嵌入剂，血管扩张剂，其为异聚体或同聚体的单体、二聚体、三聚体和/或多聚体小分子，等。根据本发明的小分子药物的其他非限制性实例包括例如依维莫司，曲贝替定，白蛋白结合型紫杉醇，帕唑帕尼，恩扎妥林，凡他尼布，FLT-3抑制剂，VEGFR抑制剂，EGFR TK抑制剂，极光激酶抑制剂，PIK-1调节剂，Bcl-2抑制剂，HDAC抑制剂，c-MET抑制剂，PARP抑制剂，Cdk抑制剂，EGFR TK抑制剂，IGFR-TK抑制剂，抗HGF抗体，PI3激酶抑制剂，AKT抑制剂，JAK/STAT抑制剂，检查点-1或2抑制剂，粘着斑激酶抑制剂，Map激酶激酶(mek)抑制剂，培美曲塞，厄洛替尼，达沙替尼，尼罗替尼，decatanib，帕木单抗，氨柔比星，奥戈伏单抗，诺拉曲塞，巴他布林，奥法木单抗，扎木单抗，艾特咔林，粉防己碱，芦比替康，替米利芬，奥利美生，ticilimumab，伊匹木单抗，棉酚，西仑吉肽，吉马替康，硫蒽酮，neuradiab，vitespan，他仑帕奈，阿曲生坦，罗米地新，舒尼替尼，5-氟尿嘧啶，伏立诺他，依托泊苷，吉西他滨，多柔比星，5'-脱氧-5-氟尿苷，长春新碱，替莫唑胺，塞利西利，卡培他滨，喜树碱，PEG标记的伊立替康，他莫昔芬，柠檬酸托瑞米芬，阿那曲唑，依西美坦，来曲唑，瓦他拉尼，醋酸戈舍瑞林，醋酸亮丙瑞林，双羟萘酸曲普瑞林，醋酸甲羟孕酮，己酸羟孕酮，醋酸甲地孕酮，雷洛昔芬，比卡鲁胺，氟他胺，尼鲁米特，醋酸甲地孕酮，厄洛替尼，拉帕尼尼，卡纽替尼，氯那法尼，替比法尼，氨磷汀，辛二酰苯胺异羟肟酸，丙戊酸，曲古菌素索拉非尼，arnsacrine，阿那格雷，博来霉素，布舍瑞林，白消安，卡铂，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，顺铂，克拉屈滨，氯膦酸盐，环丙孕酮，阿糖胞苷，达卡巴嗪，放线菌素，柔红霉素，己烯雌酚，表柔比星，氟达拉滨，氟氢可的松，氟甲睾酮，氟他胺，吉西他滨，羟基脲，伊达比星，异环磷酰胺，伊马替尼，亮丙瑞林，左旋咪唑，洛莫司汀，氮芥，美法仑，6-巯基嘌呤，美司钠，甲氨蝶呤，丝裂霉素，米托坦，米托蒽醌，尼鲁米特，奥曲肽，奥沙利铂，帕米膦酸盐，喷司他丁，普力霉素，卟吩，丙卡巴肼，雷替曲塞，利妥昔单抗，链脲佐菌素，替尼泊苷，睾酮，沙利度胺，硫鸟嘌呤，硫噻嗪，维甲酸，长春地辛，13-顺式-维甲酸，苯丙氨酸氮芥，尿嘧啶氮芥，雌莫司汀，六甲蜜胺，氟尿苷，5-脱氧尿苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，6-巯基嘌呤，脱氧肋间霉素，骨化三醇，戊柔比星，光神霉素，长春碱，长春瑞滨，拓扑替康，雷佐生，马立马司他，COL-3，新伐司他，角鲨胺，内皮抑素，vitaxin，屈洛昔芬，idoxyfene，螺内酯，非那甾胺，西咪替丁，曲妥珠单抗，地尼白介素2，吉非替尼，硼替佐米，紫杉醇，无氢化蓖麻油的紫杉醇，多西紫杉醇，epithilone B，屈洛昔芬，4-羟基三苯氧胺，哌喷昔芬，阿佐昔芬，氟维司群，阿考比芬，拉索昔芬，艾多昔芬，拓扑替康，雷帕霉素，坦罗莫司，唑来膦酸盐，泼尼松，来那度胺，吉妥珠单抗，氢化可的松，右雷佐生，阿仑单抗，全反式维甲酸，酮康唑，甲地孕酮，免疫球蛋白，氮芥，甲泼尼龙，替伊莫单抗，雄激素，地西他滨，六甲基三聚氰胺，贝沙罗汀，托西莫单抗，三氧化二砷，可的松，依替膦酸二钠，米托坦，环孢菌素，脂质体柔红霉素，Edwina-asparaginase，锶89，卡索匹坦，奈妥匹坦，NK-1受体拮抗剂，帕洛诺司琼，阿瑞吡坦，苯海拉明，羟嗪，甲氧氯普胺，劳拉西泮，阿普唑仑，氟哌啶醇，氟哌啶醇，屈大麻酚，地塞米松，甲基强的松龙，丙氯拉嗪，格拉司琼，恩丹西酮，多拉司琼，托烷司琼，培非司亭，促红细胞生成素，促红素α和达促红素α，依法韦仑等。如上所述，本发明自然也适用于其它小分子而不脱离本发明的主旨，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
如上所述，结合蛋白有利地在EV上表达为结合蛋白本身与合适的EV蛋白之间的融合蛋白。EV蛋白可选自包含例如以下蛋白质的组：CD9，CD53，CD63，CD81，CD54，CD50，FLOT1，FLOT2，CD49d，CD71，CD133，CD138，CD235a，ALIX，Syntenin-1，Syntenin-2，Lamp2b，TSPAN8，TSPAN14，CD37，CD82，CD151，CD231，CD102，NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，NOTCH4，DLL1，DLL4，JAG1，JAG2，CD49d/ITGA4，ITGB5，ITGB6，ITGB7，CD11a，CD11b，CD11c，CD18/ITGB2，CD41，CD49b，CD49c，CD49e，CD51，CD61，CD104，Fc受体，白细胞介素受体，免疫球蛋白，MHC-1或MHC-II成分，CD2，CD3ε，CD3ζ，CD13，CD18，CD19，CD30，CD34，CD36，CD40，CD40L，CD44，CD45，CD45RA，CD47，CD86，CD110，CD111，CD115，CD117，CD125，CD135，CD184，CD200，CD279，CD273，CD274，CD362，COL6A1，AGRN，EGFR，GAPDH，GLUR2，GLUR3，HLA-DM，HSPG2，L1CAM，LAMB1，LAMC1，LFA-1，LGALS3BP，Mac-1α，Mac-1β，MFGE8，SLIT2，STX3，TCRA，TCRB，TCRD，TCRG，VTI1A，VTI1B及其任何组合，但是能够将多肽构建体转运至EV的许多其他多肽包括在本发明的范围内。EV蛋白通常是人来源的，并且可以在各种公开的数据库中找到，例如Uniprot，RCSB等。EV蛋白可以与各种其他蛋白质和/或蛋白质结构域融合，以例如增强表面展示、增加亲合力或使得能够以非共价方式与特定类型的结合蛋白相互作用。
在进一步的实施方案中，小分子试剂的结合可以使结合蛋白具有治疗活性。其非限制性实例可以是通过激动或拮抗小分子与结合蛋白的结合，其可以使结合蛋白治疗性活化，例如通过启动信号传导或通过抑制信号传导。因此，在该特定情况下，结合蛋白在能够传导信号时可以变得治疗性活化，但是不能够传导信号的结合蛋白也可以是治疗活性的，例如它可以通过阻碍特定的信号传导途径来实现药理学作用。治疗性活化的结合蛋白的另一个非限制性实例是酶，其中酶活性任选地需要小分子试剂和靶的存在。
在又一个实施方案中，根据本发明的EV可包含展示在EV表面上的至少一种靶向部分，以通过靶向感兴趣的组织、器官或细胞类型甚至进一步增强其治疗潜力。靶向部分通常包含氨基酸序列，其可以例如通过噬菌体展示或任何其他类型的筛选方法鉴定。靶向部分通常通过EV源细胞的基因工程化展示在EV表面上，其中源细胞经转染以产生包含融合蛋白的EV，所述融合蛋白包含靶向部分和外来体蛋白。根据本发明的EV蛋白尤其包括CD9，CD53，CD63，CD81，CD54，CD50，FLOT1，FLOT2，CD49d，CD71，CD133，CD138，CD235a，ALIX，Syntenin-1，Syntenin-2，Lamp2b，TSPAN8，TSPAN14，CD37，CD82，CD151，CD231，CD102，NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，NOTCH4，DLL1，DLL4，JAG1，JAG2，CD49d/ITGA4，ITGB5，ITGB6，ITGB7，CD11a，CD11b，CD11c，CD18/ITGB2，CD41，CD49b，CD49c，CD49e，CD51，CD61，CD104，Fc受体，白细胞介素受体，免疫球蛋白，MHC-I或MHC-II成分，CD2，CD3ε，CD3ζ，CD13，CD18，CD19，CD30，CD34，CD36，CD40，CD40L，CD44，CD45，CD45RA，CD47，CD86，CD110，CD111，CD115，CD117，CD125，CD135，CD184，CD200，CD279，CD273，CD274，CD362，COL6A1，AGRN，EGFR，GAPDH，GLUR2，GLUR3，HLA-DM，HSPG2，L1CAM，LAMB1，LAMC1，LFA-1，LGALS3BP，Mac-1α，Mac-1β，MFGE8，SLIT2，STX3，TCRA，TCRB，TCRD，TCRG，VTI1A，VTI1B及其任何组合，但是许多能够将多肽构建体转运至EV的其他多肽包括在本发明的范围内。EV蛋白通常是人来源的，并且可以在各种公开的数据库中找到，例如Uniprot，RCSB等。
在另一方面，本发明涉及向靶位置递送以下的至少一种的方法：(i)小分子药物，(ii)治疗活性形式或准备用于在与例如靶接触时治疗活化的形式的结合蛋白，和/或(iii)结合蛋白-小分子药物缀合物。这样的递送方法可以包括将靶细胞、靶组织或靶器官(其可以包括流体和液体，例如血液、胆汁、淋巴、间质液、脑脊髓液等)暴露于根据本发明的EV。如上所述，EV可以包含在其表面上表达的靶向部分，或者它可以依赖于天然向性和靶向，或者它可以是非靶向的。根据上下文，可以在体外和/或体内进行向靶细胞和靶细胞的递送。此外，本发明涉及改变小分子药物或蛋白质-药物缀合物的药代动力学或药效学特征的方法。这是通过将所讨论的小分子试剂和结合蛋白装载到EV中和EV上来实现的，这将影响因素诸如吸附、分布、代谢、酶活性、组织穿透、清除等。
另一方面，本发明涉及调节细胞信号转导的方法，包括将小分子试剂与展示在EV上的结合蛋白结合并将包含结合蛋白和小分子试剂的缀合物暴露于靶信号传导途径的步骤。
在另一方面，本发明涉及产生根据本发明的EV的方法。此类方法可以使用从任何合适的产生EV的细胞(例如MSC、成纤维细胞、免疫细胞、HEK细胞或任何其他合适的细胞类型)获得的EV进行。所谓的用于产生包含结合蛋白质-药物缀合物的EV的外源方法可以包括以下步骤：(a)提供包含与EV蛋白的融合蛋白形式的结合蛋白的EV，和(b)将结合蛋白暴露于小分子试剂，以使得能够使小分子试剂与结合蛋白非共价或共价结合。通常，在上述步骤之前可以通过遗传修饰产生EV的细胞以分泌已在其表面上展示任选地以与EV多肽(例如CD63，CB81，CD9或Lamp2b或任何其他合适的EV多肽)的融合蛋白的形式的结合蛋白的EV。在分泌EV后，用EV调节的培养基(即含有EV)可以使用如下面将更详细描述的多种方法纯化，然后暴露于感兴趣的小分子药物。暴露于小分子药物将使所讨论的药物与结合蛋白之间相互作用，从而形成连接并因此产生结合蛋白-小分子药物缀合物。
在另一方面，产生根据本发明的EV的方法还可包括EV结合蛋白与小分子药物的内源装载。此类方法可包括例如以下步骤：(a)将小分子试剂与任选地以与EV蛋白的融合蛋白的形式包含结合蛋白的EV源细胞培养物一起孵育。随后，收获由EV源细胞产生的EV，其中EV包含与结合蛋白结合的小分子试剂。
在一些实施方案中，产生包含结合蛋白-小分子缀合物的EV的方法可以包括以下步骤：遗传修饰产生EV的细胞以分泌包含衔接蛋白的EV。任选地可以与EV蛋白融合的衔接蛋白可以用于非共价连接各种类型的结合蛋白，例如抗体。因此，在一个非限制性实例中，在产生包含衔接蛋白的EV之后，可以进行第一外源装载步骤，在此期间，例如抗体与EV结合。随后，可以进行第二次外源装载步骤，其中小分子试剂可以与抗体或任何其他结合蛋白连接。任选地，通过用已经预装载有小分子试剂的结合蛋白包被EV，这两个装载步骤可以作为一个单一步骤进行。
在另一方面，本发明涉及包含EV的药物组合物，所述EV包含结合蛋白-小分子缀合物。通常，根据本发明的药物组合物包含与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的一种类型的治疗性EV(即，包含与其结合蛋白配偶体组合的某一或某些所需小分子的EV群体)，但超过一种类型的EV群体可以包含在药物组合物中，例如在需要组合治疗的情况下。所述至少一种药学上可接受的赋形剂可选自任何药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如固体或液体填充剂，稀释剂，赋形剂，载体，溶剂或包封材料，其可以参与例如悬浮EV群体、维持EV群体的活性或携带EV群体或运送EV群体从一个器官或身体的一部分到另一个器官或身体的一部分(例如从血液到任何组织和/或器官和/或感兴趣的身体部分)。
本发明还涉及携带结合蛋白-小分子的EV的美容和皮肤病学应用。因此，本发明涉及包含合适的EV的护肤产品，例如乳膏，乳液，凝胶，乳剂，软膏，糊剂，粉末，搽剂，防晒剂，洗发剂等，以改善和/或缓解症状和问题诸如皮肤干燥、皱纹、皱褶、隆起和/或皮肤褶皱。在一个实施方案中，EV(其包含感兴趣的小分子)从合适的产生EV的细胞源获得，其具有再生特性(例如间充质干细胞)，其包含在美容霜、洗剂或凝胶中用于皱纹、起皱，皱褶，隆起和/或皮肤褶皱的美容或治疗缓解。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的EV用于医药中的用途。自然地，当根据本发明的包含小分子的EV用于医药时，实际上通常使用的是EV群。施用于患者的EV的剂量将取决于已经装载到EV中的小分子药物的量、待治疗或缓解的疾病或症状、施用途径、小分子本身的药理作用、EV的固有属性以及各种其他相关参数。
因此，根据本发明的EV及其EV群可用于预防和/或治疗目的，例如，用于预防和/或治疗和/或减轻各种疾病和病症。可以应用根据本发明的EV的非限制性疾病实例包括克罗恩病，溃疡性结肠炎，强直性脊柱炎，类风湿性关节炎，多发性硬化，系统性红斑狼疮，结节病，特发性肺纤维化，牛皮癣，肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期综合征(TRAPS)，白细胞介素-1受体拮抗剂(DIRA)缺乏，子宫内膜异位症，自身免疫性肝炎，硬皮病，肌炎，中风，急性脊髓损伤，血管炎，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，纤维化，格林-巴利综合征，急性心肌梗死，ARDS，败血症，脑膜炎，脑炎，肝功能衰竭，肾功能衰竭，心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭及相关的潜在病因，移植物抗宿主病，Duchenne肌营养不良症，Becker肌营养不良症和其他肌营养不良症，溶酶体贮积病如戈谢病，Fabry病，MPS I、II(Hunter综合征)和III，Niemann-Pick病，胱氨酸病，Pompe病等，神经退行性疾病包括阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿病和其他三核苷酸重复相关疾病，痴呆，ALS，癌症诱发的恶病质，厌食症，2型糖尿病和各种癌症。几乎所有类型的癌症都是本发明的相关疾病靶标，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关癌症，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，小脑或脑，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨肿瘤，脑干胶质瘤，脑癌，脑肿瘤(小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)，乳腺癌，支气管腺瘤/类癌，伯基特淋巴瘤，类癌(儿童期，胃肠道)，未知的原发灶的癌，中枢神经系统淋巴瘤，小脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，宫颈癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，皮肤T细胞淋巴瘤，增生性小圆细胞瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食管癌，颅外生殖细胞瘤，外生殖细胞瘤，肝外胆管癌症，眼癌(眼内黑色素瘤，视网膜母细胞瘤)，胆囊癌，胃(胃部)癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠道间质瘤(GIST)，生殖细胞肿瘤(颅外，性腺外或卵巢)，妊娠滋养细胞肿瘤，胶质瘤(脑干的胶质瘤，脑星形细胞瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤)，胃类癌，毛细胞白血病，头颈癌，心脏癌，肝细胞癌(肝癌)，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌(内分泌胰腺)，卡波西肉瘤，肾癌(肾细胞癌)，喉癌，白血病(急性淋巴母细胞性白血病(又称急性淋巴细胞白血病)，急性髓样白血病(又称急性髓性白血病)，慢性淋巴母细胞白血病(又称慢性淋巴细胞白血病)，慢性髓性白血病(也称为慢性髓样白血病)，毛细胞白血病)，唇和口腔、腔癌，脂肪肉瘤，肝癌(原发性)，肺癌(非小细胞，小细胞)，淋巴瘤，艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，成神经管细胞瘤，Merkel细胞癌，间皮瘤，隐匿原发灶性转移性鳞状颈部癌，口腔癌，多发性内分泌肿瘤综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，蕈样真菌病，骨髓增生异常/骨髓增生性疾病，髓性白血病，慢性髓样白血病(急性，慢性)，骨髓瘤，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性潜能肿瘤，胰腺癌，胰岛细胞癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体星形细胞瘤，松果体生殖细胞瘤，松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体腺瘤，胸膜肺母细胞瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞癌(肾癌)，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，肉瘤(Ewing家族肿瘤肉瘤，卡波西肉瘤，软组织肉瘤，子宫肉瘤)，Sezary综合征，皮肤癌(非黑色素瘤，黑色素瘤)，小肠癌，鳞状细胞癌，鳞状颈癌，胃癌，幕上原始神经外胚层肿瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂和输尿管的移行细胞癌，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和/或威尔姆氏肿瘤。
根据本发明的结合蛋白-小分子EV可以通过各种不同的施用途径施用至人或动物受试者，例如耳(耳内)、口腔、结膜、皮肤、牙齿、电渗、宫颈内膜、内窦、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜腔内、动脉内、关节内、颅内、支气管内、颅内、心内、软骨内、尾部内、海绵窦内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠状动脉内(牙科)、冠状动脉内、阴茎海绵体内、皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食管内、胃内、龈内、回肠内、病灶内、管腔内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌肉内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、小管内、瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、电离子透入、灌洗、喉、鼻腔、鼻胃管、闭塞性敷料技术、眼科、口服、口咽、其他、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道和/或阴道施用，和/或上述施用途径的任何组合，其通常取决于待治疗的疾病和/或小分子药物或EV群本身的特征。
本发明的方法还可包括将EV源细胞暴露于血清饥饿、缺氧、巴弗洛霉素或细胞因子如TNF-α和/或IFN-γ，以影响所得EV的产率或性质。EV生产规模和时间线将严重依赖于产生EV的细胞或细胞系，因此可以由本领域技术人员相应地进行调整。根据本发明的方法可以进一步包括EV纯化步骤，其中通过选自包括以下的技术的程序纯化EV：液相色谱(LC)，高效液相色谱(HPLC)，旋转过滤，切向流过滤，中空纤维过滤，离心，免疫沉淀，流场分级分离，透析，基于微流体的分离等，或其任何组合。在一个有利的实施方案中，EV的纯化使用过滤(优选超滤(UF)，切向流过滤或中空纤维过滤)和尺寸排阻液相色谱(LC)的顺序组合进行。纯化步骤的这种组合导致优化的纯化，这进而导致优异的治疗活性。此外，与通常用于纯化外来体的超离心(UC)相比，顺序过滤-色谱法相当快并且可以扩展到更高的制造量，这是当前在现有技术中占主导地位的UC方法的主要缺点。另一种有利的纯化方法是切向流过滤(TFF)，其提供可扩展性和纯度，并且可以与其他类型的纯化技术如过滤组合。
应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以修改上述示例性方面、实施方案、替代方案和变型。现在将通过所附实施例进一步举例说明本发明，在不脱离本发明的范围和主旨的情况下，这些实施例自然也可以进行相当大的改进。
材料和方法
已经设计并评估了包含结合蛋白和EV蛋白(例如CD81，CD63，CD9，syntenin，syndecan，Alix，CD133等)的各种融合蛋白。通常通过合成产生ORF并将其克隆到哺乳动物表达载体pSF-CAG-Amp中。简而言之，根据制造商说明书(NEB)，用酶NotI和SalI消化合成的DNA和载体质粒。根据制造商的说明书(NEB)，使用T4连接酶将受限制性消化的纯化的DNA片段连接在一起。通过在补充氨苄青霉素的平板上进行细菌转化来选择成功的连接事件。根据制造商的说明，通过“maxi-prep”产生用于转染的质粒。
大多数克隆使用NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒(NEB，Inc.)进行，并经Sanger测序(Source Bioscience)确认。
根据制造商的推荐将质粒转化到NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞(NEB，Inc.)中，并在振荡培养箱中培养过夜。根据制造商的说明书(Macherey-Nagel)，使用“maxi-prep”试剂盒分离和纯化质粒。
取决于实验设计和测定，在某些情况下，非病毒瞬时转染和外来体产生在常规2D细胞培养物中进行，而在其他情况下，使用病毒介导的转导来产生稳定的细胞系，其通常在不同类型的生物反应器如中空纤维生物反应器和搅拌槽生物反应器中培养。为简明起见，这里仅提及几个例子。
通常将HEK293T细胞接种到15cm培养皿(每皿9x106个细胞)中，并按照ATCC的推荐在含有血清的DMEM中放置过夜。第二天，用直接添加到细胞上的脂质复合DNA瞬时转染细胞。简言之，将DNA和聚乙烯亚胺(PEI)分别在OptiMEM中孵育5分钟，然后在室温下一起混合20分钟。将脂质复合的DNA和细胞共孵育6小时，然后将条件培养基更换为OptiMEM保持48小时。在培养皿、烧瓶和其他细胞培养容器中评估的其他细胞和细胞系包括骨髓来源的间充质基质细胞(BM-MSC)和脐带胶质来源的MSC(WJ-MSC)、羊膜细胞、成纤维细胞、各种内皮细胞和上皮细胞，以及各种免疫细胞和细胞系。
在病毒转导和产生稳定细胞系的情况下，通常使用慢病毒(LV)对细胞来源如BM-MSC、WJ-MSC、成纤维细胞、羊膜细胞、成纤维细胞、各种内皮细胞和上皮细胞进行病毒转导。通常，在感染前24小时，将100000个细胞(例如成纤维细胞，MSC等)或200000个细胞(例如HEK293T)接种在6孔板中。加入2μL LV和任选聚凝胺(或溴化己二甲铵，最终浓度为每孔8μg/mL)，转导后24小时，将转导细胞的细胞培养基更换为新鲜的完全培养基。在转导后72小时，进行嘌呤霉素选择(4-6μg/ml)，通常进行7天，然后分析多肽构建体的稳定表达。
在2D培养物或生物反应器(通常为中空纤维生物反应器和搅拌槽生物反应器)中培养稳定的细胞，随后收获条件培养基用于外来体制备。进行各种制备和纯化步骤。标准工作流程包括以下步骤：预清除上清液，基于过滤的浓缩，基于色谱的蛋白质污染物的去除，以及在合适的缓冲液中任选配制所得的外来体组合物用于体外和/或体内测定。
至于测定和分析，Western印迹用于评估EV中任选与外来体蛋白融合的结合蛋白的富集。简而言之，根据制造商的说明书(Invitrogen，NovexPAGE 4-12％凝胶)进行SDS-PAGE，其中每孔装载1×1010个外来体和20μg细胞裂解物。根据制造商的说明书(Immobilon，Invitrogen)将来自SDS-PAGE凝胶的蛋白质转移到PVDF膜上。将膜在Odyssey封闭缓冲液(Licor)中封闭，并根据供应商的说明用针对结合蛋白和外来体蛋白的抗体进行探测(一抗-Abeam，二抗-Licor)。分子探针在680和800nm波长下可见。
对于EV尺寸确定，使用配备有分析软件的NanoSight仪器进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)。对于所有录制，我们使用13或15的摄像机级别和所有采集后设置的自动功能。通常使用电子显微镜和荧光显微镜来定量和分析EV。
使用多种方法分离和纯化EV，通常是过滤例如TFF和液相色谱的组合。通常，收集含EV的培养基并在300g下进行低速旋转5分钟，然后2000g旋转10分钟以除去较大的颗粒和细胞碎片。然后用0.22μm注射过滤器过滤上清液，并进行不同的纯化步骤。使用具有100kDa截留过滤器的Vivaflow 50R切向流(TFF)装置(Sartorius)或具有100或300kDa截留中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(SpectrumLabs)将大体积渗滤并浓缩至约20ml。随后将预浓缩的培养基装载到珠子洗脱液柱(HiScreen或HiTrap Capto Core 700柱，GE Healthcare LifeSciences)，其连接至AKTAprime plus或AKTAPure 25色谱系统(GE Healthcare LifeSciences)。根据制造商的说明选择用于柱平衡、样品装载和柱原位清洗过程中的流速设置。根据UV吸光度色谱图收集样品，并使用Amicon Ultra-1510kDa分子量截留旋转过滤器(Millipore)浓缩至最终体积为100μl，并储存在-80℃下用于进一步的下游分析。为了评估蛋白质和RNA洗脱曲线，使用100kDa和300kDa中空纤维过滤器用KR2i TFF系统浓缩和渗滤培养基，并在Tricorn 10/300Sepharose 4Fast Flow(S4FF)柱(GE HealthcareLifeSciences)上分析样品。通过共孵育适当的时间段，将小分子药物外源装载到包含结合蛋白的EV上，然后使用基本上相同的步骤或至少部分这些步骤进行再纯化。
实施例1：用于帕金森病的装载阿扑吗啡的EV
内源性表达多巴胺受体D2的MSC和经遗传工程改造以表达包含EV蛋白CD63和多巴胺受体D2的融合蛋白的MSC在MSCGM生长培养基中培养。为了用阿扑吗啡(APO)(用于治疗帕金森氏病的药物)内源性装载MSC-EV，用Opti-EM培养基替换MSC培养基，并用2μM APO孵育12小时。此后，收集条件培养基并通过切向流过滤和尺寸排阻色谱分离APO-EV。为了用APO外源装载MSC-EV，如上分离来自未处理的MSC的EV，然后与2μMAPO孵育2小时，并重新分离以除去未装载到EV中的APO分子。通过其在EV表面上的多巴胺受体D2的相互作用促进了向EV的APO装载，这导致能够传导信号的多巴胺受体的“预充电”。
测试从经遗传修饰的和未修饰的MSC获得的APO-EV的活性，以增强原代星形胶质细胞中的多巴胺受体信号传导。将星形胶质细胞在无血清DMEM/F12培养基中培养，并用2μM游离APO或APO-EV(内源或外源装载的)处理0.5或6小时。通过在0.5小时时间点测量星形胶质细胞裂解物中磷酸化蛋白激酶A(p-PKA)和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-MAPK)的水平来评估信号传导活性，并在6小时时间点在星形胶质细胞条件培养基中评估成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的下游产生。使用LI-COR成像系统通过半定量Western印迹评估p-PKA、p-MAPK和FGF-2的水平。
实施例2：伊马替尼装载至EV用于癌症治疗
在MSCGM生长培养基中培养内源性表达ABL1受体酪氨酸激酶的MSC和经遗传工程改造以表达EV蛋白质syntenin和ABL1受体酪氨酸激酶的融合蛋白的MSC。为了用伊马替尼(IMA)内源性装载MSC-EV，用Opti-MEM培养基替换MSC培养基并与2mg IMA一起孵育。此后，收集条件培养基并通过切向流过滤和尺寸排阻色谱分离IMA-EV。为了用IMA外源装载MSC-EV，如上所述分离来自未处理的MSC的EV，然后与2mgIMA一起孵育2小时，并重新分离以除去未装载到EV中的IMA分子
IMA是一种用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)的药物，因为它与ABL1结合并随后稳定Bcr-Abl受体酪氨酸激酶复合物，使IMA成为激酶的有效抑制剂。通过其与分选至EV的ABL1(内源性地或借助于EV蛋白诸如syntenin)的相互作用，促进了IMA向EV的装载。
在用KU812细胞异种移植物接种小鼠并在用50mg/kg IMA的等量日剂量的游离IMA或IMA-EV腹膜内处理后测量肿瘤重量和小鼠存活后，在裸鼠中评估IMA-EV的活性。
实施例3：伊马替尼装载至EV用于预防静脉内LPS诱导的败血症
如实施例2中进行细胞培养、EV装载和EV分离，但在静脉内LPS诱导的急性败血症模型中测试EV装载的IMA的活性。已知LPS处理诱导与脓毒性休克和ARDS有关的高水平的活性氧物质。增加过氧化氢酶活性的IMA功能与降低的DNA损伤和降低的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生有关。
通过眼眶后注射5mg/kg LPS使小鼠对LPS敏感。在每天用等量的200mg/kg/天的IMA进行前一天开始IMA和EV-IMA治疗，并监测小鼠存活。
实施例4.雷帕霉素装载至EV用于抑制mTOR活性
内源表达肽基-脯氨酰顺反异构酶FKBP12(MSC-FKBP12)的MSC和基因工程化以表达包含EV蛋白CD63和FKBP12(MSC-CD63FKBP12)异构酶的融合蛋白的MSC在MSCGM生长培养基中培养。为了用雷帕霉素(直接结合FKBP12的分子)内源性装载MSC-EV，用Opti-MEM培养基替换MSC培养基，并与20nM雷帕霉素一起孵育12小时。此后，收集条件培养基并通过切向流过滤和尺寸排阻色谱分离雷帕霉素-EV。为了用雷帕霉素外源装载MSC-EV，如上所述分离来自未处理的MSC-FKBP12和MSC-CD63FKBP21细胞的EV，然后与500nM雷帕霉素一起孵育2小时，并重新分离以除去未装载至EV的雷帕霉素分子。向EV的雷帕霉素装载通过其与EV装载的FKBP12异构酶的相互作用而促进，这导致其在递送至受体细胞(在其上FKBP-雷帕霉素复合物抑制mTOR活性)之前“预充电”。
在MCF7乳腺癌细胞中测试了用雷帕霉素外源或内源装载的EV的活性。将在补充有10％FBS和抗生素的DMEM/F12培养基中培养的MCF7细胞接种到24孔组织培养板中。第二天，用装载雷帕霉素的EV、裸雷帕霉素、未装载的EV处理MCF7细胞，或不处理。处理后24小时，收获MCF7细胞并使用K-LIS mTOR活性试剂盒(Merck Millipore)测定mTORC活性。
实施例5：肾上腺髓质素装载至EV用于诱导脂肪细胞中的脂解作用
将基因工程化以表达肾上腺髓质素(AM)CALCRL(AM的受体)作为结合蛋白或使用CALCRL-CD81融合蛋白特异性靶向至EV的结合蛋白的MSC在MSCGM生长培养基中培养，导致AM至分泌的EV的内源性装载。为了分离装载AM的EV，将MSC培养基替换为Opti-MEM培养基并孵育48小时。此后，收集条件培养基并通过切向流过滤和尺寸排阻色谱分离装载AM的EV。在鼠3T3-L1细胞中测试装载AM的EV的脂解活性。将在补充有10％FBS和抗生素的DMEM培养基中培养的3T3-L1细胞接种在12孔组织培养板中并进行分化，血清饥饿12小时并用游离的AM、装载AM的EV或对照处理。根据制造商的推荐，使用游离甘油试剂(Sigma)测量甘油释放的相对变化。

Claims (14)

1.一种包含结合蛋白的细胞外囊泡(EV)，其特征在于至少一种小分子试剂与所述结合蛋白结合。
2.根据权利要求1所述的EV，其中所述结合蛋白选自：GPCR，多克隆和单克隆抗体，单链可变片段(scFv)，脂蛋白，整联蛋白，酪氨酸激酶，DNA结合蛋白，RNA结合蛋白，核酸酶，连接酶，蛋白酶，整合酶，异构酶，磷酸酶，GTP酶，芳香酶，酯酶，衔接蛋白，G蛋白，GEF，细胞因子，白细胞介素和白细胞介素受体，干扰素和干扰素受体，半胱天冬酶，转录因子，神经营养因子及其受体，生长因子及其受体，信号识别颗粒和受体成分，细胞外基质蛋白，膜的整合成分，核糖体蛋白，翻译延伸因子，翻译起始因子，GPI锚定蛋白，组织因子，肌营养不良蛋白，肌营养不良蛋白相关蛋白，小肌营养蛋白，以及其任何融合物、组合、亚基、衍生物或结构域。
3.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述至少一种小分子试剂是选自以下的药物：抗癌剂，细胞抑制剂，DNA或RNA嵌入剂，核苷，剪接调节剂，激酶抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂如BTK抑制剂或Bcr-Abl抑制剂，他汀类药物，NSAID，抗生素，抗真菌药，抗细菌药，抗炎药，抗纤维化药，抗高血压药，血管扩张药，激素及其类似物，芳香酶抑制剂，酯酶抑制剂，抗胆碱能药，SSRI，BKT抑制剂，PPAR激动剂，多巴胺激动剂，HER抑制剂，AKT抑制剂，BCR-ABL抑制剂，信号转导抑制剂，细胞因子抑制剂，IL和ILR抑制剂，TNF和TNFR抑制剂，血管生成抑制剂，合酶抑制剂，寡核苷酸如siRNA，mRNA，反义寡核苷酸，剪接转换寡核苷酸，肽，细胞穿透肽，ALK抑制剂，BRAF抑制剂，MEK抑制剂，PI3K抑制剂，脑啡肽酶抑制剂，β2-激动剂，CRTH2拮抗剂，FXR激动剂，BACE抑制剂，鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂，MAPK抑制剂，Hedgehog信号传导抑制剂，MDM2拮抗剂，LSD1抑制剂，内酰胺酶抑制剂，IDO抑制剂，ERK抑制剂，Chk1抑制剂，以及其任何衍生物、亚基、结构域或组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述至少一种小分子试剂的结合任选地使所述结合蛋白具有治疗活性。
5.根据权利要求4所述的EV，其中所述具有治疗活性的结合蛋白是能够传导信号或不能够传导信号的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述结合蛋白是包含结合蛋白部分和EV蛋白的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的EV，其中所述EV蛋白选自：CD9，CD53，CD63，CD81，CD54，CD50，FLOT1，FLOT2，CD49d，CD71，CD133，CD138，CD235a，ALIX，Syntenin-1，Syntenin-2，Lamp2b，TSPAN8，TSPAN14，CD37，CD82，CD151，CD231，CD102，NOTCH 1，NOTCH2，NOTCH3，NOTCH4，DLL1，DLL4，JAG1，JAG2，CD49d/ITGA4，ITGB5，ITGB6，ITGB7，CD11a，CD11b，CD11c，CD18/ITGB2，CD41，CD49b，CD49c，CD49e，CD51，CD61，CD104，白细胞介素受体，CD2，CD3ε，CD3ζ，CD13，CD18，CD19，CD30，CD34，CD36，CD40，CD40L，CD44，CD45，CD45RA，CD47，CD86，CD110，CD111，CD115，CD117，CD125，CD135，CD184，CD200，CD279，CD273，CD274，CD362，COL6A1，AGRN，EGFR，GAPDH，GLUR2，GLUR3，HLA-DM，HSPG2，L1CAM，LAMB1，LAMC1，LFA-1，LGALS3BP，Mac-1α，Mac-1β，MFGE8，SLIT2，STX3，TCRA，TCRB，TCRD，TCRG，VTI1A，VTI1B，及其任何组合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其还包含靶向部分。
9.一种外源产生根据权利要求1至8中任一项所述的EV的方法，其包括以下步骤：
a.提供任选地以与EV蛋白形成的融合蛋白的形式包含结合蛋白的EV；和，
b.将EV暴露于小分子试剂以使小分子试剂与所述结合蛋白结合。
10.一种内源产生根据权利要求1至8中任一项所述的EV的方法，其包括以下步骤：
a.将任选地以与EV蛋白形成的融合蛋白的形式包含结合蛋白的EV源细胞与至少一种小分子试剂一起孵育；
b.收获由所述EV源细胞产生的EV，其中所述EV包含与结合蛋白结合的小分子试剂。
11.一种递送结合蛋白-小分子缀合物、结合蛋白和/或小分子试剂的方法，其包括以下步骤：
a.提供根据权利要求1至8中任一项所述的EV；和，
b.将EV递送至靶位置。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶位置是细胞、细胞或亚细胞区室、器官、组织和/或血液、胆汁、淋巴或间质液。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的EV和药学上可接受的载体。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的EV，或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于医药中。
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