CN108431039A

CN108431039A - 改进的p2x7受体结合剂和包含其的多肽

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Publication number: CN108431039A
Application number: CN201680072738.6A
Authority: CN
Inventors: 玛丽-安格·比斯; 卡特林恩·斯托特勒斯
Original assignee: Ablynx NV
Current assignee: Ablynx NV
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2036-11-11
Also published as: EP3374395A1; CA3005082A1; WO2017081265A1; HK1258507A1; AU2016352695A1; US20180327491A1; JP2019503987A; US10875918B2; CN108431039B; JP7403224B2; AU2016352695B2

Abstract

本发明涉及与P2X7受体结合的氨基酸序列和多肽。具体而言，本发明涉及与P2X7受体结合的改良的重链免疫球蛋白单可变结构域(本文也称为“ISV”或“ISVD”)，以及包含此类ISVD的蛋白质，多肽和其他构建体，化合物，分子或5化学实体。

Description

改进的P2X7受体结合剂和包含其的多肽

本发明涉及与P2X7受体结合的氨基酸序列和多肽。

具体而言，本发明涉及与P2X7受体结合的改良的重链免疫球蛋白单可变结构域(本文也称为“ISV”或“ISVD”)，以及包含此类ISVD的蛋白质，多肽和其他构建体，化合物，分子或化学实体。

本发明提供的抗P2X7受体ISVD在本文中也称为“本发明的P2X7结合剂”或“P2X7结合剂”。本文中所述的抗P2X7受体多肽，构建体，化合物，分子或化学实体在本文中也称为“本发明的多肽”或“本发明的化合物”。

从以下进一步的描述可以清楚地看出，本发明提供了两种不同组的P2X7结合剂，在本文中通常分别称为“基于3c23的P2X7结合剂”，“基于3c23的结合剂”或“基于3c23的结构单元”，以及“基于1c81的P2X7结合剂”，“基于1c81的结合剂”或“基于1c81的结构单元”。在这方面，本发明不仅提供了这些P2X7结合剂和包含其的化合物和多肽，而且还提供了包含至少一个(例如一个或两个)这种基于3c23的结合剂和至少一个(如一个或两个)基于1c81的结合剂的双互补位(如本文所定义的)多肽。

本发明提供的多肽和化合物优选为融合蛋白。而且，如本文进一步描述的，本发明的多肽还可以具有延长的半衰期(如本文所定义)，并且为此目的可以例如还包含至少一个与血清蛋白例如人血清白蛋白结合的ISVD。本发明的多肽优选还包含C-末端延伸X(n)(如本文进一步所述)。

基于本文的公开，本发明的其他方面，实施方案，特征，用途和优点对于本领域技术人员将是清楚的。

嘌呤核苷酸作为细胞外信号传导分子被很好地建立。P2X受体是例如在脑和脊髓的不同区域介导快速兴奋性传递的ATP-门控阳离子通道。P2X7亚型在长期暴露于ATP期间具有改变其离子选择性的不寻常性质，其导致通道孔隙的进行性扩张和对大至900Da的分子的渗透性的发展。P2X7受体最初描述于造血起源的细胞中，包括巨噬细胞，小胶质细胞和某些淋巴细胞，并介导Ca2+和Na+离子的流入以及促炎细胞因子的释放。P2X7受体可能通过其调节白介素-1β(一种神经变性，慢性炎症和慢性疼痛中的关键介质)的加工和释放的能力来影响神经元细胞死亡。P2X7受体的激活提供了炎症刺激，并且P2X7受体缺陷型小鼠显著减弱了炎症反应，包括神经性和慢性炎性疼痛的模型。此外，通过调节促炎细胞因子的释放，P2X7受体活性可能参与抑郁症的病理生理学。因此P2X7受体可以代表神经和免疫系统之间的关键通讯联系(Skaper等，2010 FASEB J.24：337-345)。P2X7受体定位于免疫系统的关键细胞，加上其释放来自这些细胞的重要炎症介质的能力，表明P2X7受体拮抗剂在治疗广泛疾病包括疼痛和神经退行性疾病中的潜在作用，而提供治疗性开发的目标。

在凋亡性细胞死亡是疾病的重要机制的癌症中，与正常组织相比，在凋亡中具有直接作用的P2X7具有显著作用，因为它在皮肤癌和子宫上皮癌中所显示。在啮齿动物模型中糖尿病视网膜的早期凋亡细胞死亡与该部分眼睛中的P2X7活化相关，提示可能与糖尿病微血管损伤有关。据报道，在基于家族的定量遗传关联研究中，P2X7受体多态性可能与高血压有关，P2X7的第一个内含子中的单核苷酸多态性rs591874与夜间舒张压具有强关联。P2X7受体在心血管系统细胞中表达，影响该信号系统的药物可能提供新的高血压疗法和血栓事件的预防。P2X7受体在健康肾脏中的表达很少(如果有的话)。相反，在患病的肾脏组织中P2X7的表达增加，并且肾脏疾病的两种啮齿动物模型的肾小球的免疫组织化学已经显示主要表达在足细胞，内皮和系膜细胞中。已经描述了P2X7受体对多囊肾病和肾纤维化的潜在作用。

由于ATP在神经传递和神经调节中起关键作用，嘌呤受体亚家族(包括P2X7)已经参与各种病理状况。中枢神经系统(CNS)障碍的这种病理生理学包括脑外伤，局部缺血，神经退行性疾病和神经精神疾病。当损伤发生时，大量的ATP在细胞外环境中释放，这对触发细胞对创伤的反应是重要的。在这种情况下，P2X4和P2X7的表达水平发生改变，这可能会刺激休眠小胶质细胞向损伤部位的迁移和趋化。P2X7在控制小胶质细胞增殖和死亡中发挥重要作用。脑缺血可以产生并加剧包括中风在内的中枢神经系统的问题，并且有可能由小胶质细胞表达的P2X7受体(P2X7R)由于葡萄糖/氧剥夺而参与皮质损伤。神经炎症在许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森氏病的发病机理中起主要作用。虽然精确的机制是模糊的，小胶质细胞中信号转导通路的失调可能增强炎症，导致突触功能障碍并最终导致神经元细胞死亡。P2X7受体的表达和功能在阿尔茨海默病患者和各种神经退行性疾病动物模型的死后脑中显著上调。这支持P2X7R途径在神经变性进程中的作用。已显示阻断P2X7R导致各种动物模型中神经病理学的改善。

总之，这些结果表明，P2X7R信号途径构成治疗各种神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病和亨廷顿舞蹈病的治疗靶点。

可结合P2X7受体的ISVD(特别是纳米抗体)及其用途在本领域中是已知的，特别是从WO 2010/070145和WO 2013/178783已知。

WO 2013/178783公开了作为SEQ ID NO：12的被称为3c23的抗-P2X7受体纳米抗体(参见本文的SEQ ID NO：87)。在本申请中，使用具有与3c23相同序列，但是与3c23相比具有人源化A14P和Q108L取代的参照纳米抗体(在本文中称为“参比A”)。3c23的氨基酸序列和参比A的氨基酸序列(连同其根据Kabat和Abm惯例的CDR；注意SEQ ID NO：4和7是相同的)在下表A中作为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2至7给出。

WO2013/178783还公开了作为SEQ ID NO：6的被称为1c81的抗P2X7受体纳米抗体(参见本文的SEQ ID NO：88)。在本申请中，使用具有与1c81相同的序列但是与1c81相比具有人源化A14P和Q108L取代的参考纳米抗体(在本文中称为“参比B”)。1c81和参比B的氨基酸序列(连同其根据Kabat和Abm惯例的CDRs；注意SEQ ID NO：11和14是相同的)在下表B中以SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9到14给出。

表A：3c23，参比A及其CDR。

表B：1c81，参比B及其CDR。

本发明旨在提供改进的P2X7受体结合剂，特别是改进的抗P2X7受体ISVD，更特别是改进的抗P2X7受体纳米抗体。

本发明还旨在提供包含至少一种此类抗P2X7受体ISVD的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体。这样的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体优选如本文进一步描述的。

更具体而言，本发明旨在提供改进的P2X7受体结合剂，其是3c23和参照A的变体，并且具有被干扰因子(通常称为“先前存在的抗体”)降低的结合，所述干扰因子可能存在于来自一些健康人类受试者和患者的血清中。参考WO12/175741，WO2013/024059以及例如Holland et al.(J.Clin.Immunol.2013，33(7)：1192-203)以及受让人于2015年5月13日提交的标题为“改进的免疫球蛋白可变结构域”的共同待决的未提前公开的PCT申请PCT/EP2015/060643。

本发明还旨在提供包含至少一种这样的基于3c23的结合剂的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体。这样的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体优选如本文进一步描述的。

本发明还旨在提供改进的P2X7受体结合剂，其是1c81和参比B的变体并且具有被先前存在的抗体降低的结合。本发明进一步旨在提供包含至少一种这样的基于1c81的结合剂的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体。这样的多肽，蛋白质和其他化合物和构建体优选如本文进一步描述的。

如上所述，在一个优选的方面，本发明提供了包含这些基于3c23和/或1c81的本发明结构单元的双互补位抗-P2X7受体多肽。

本发明的一些优选的但非限制性的基于3c23的结构单元在图2中作为SEQ ID NO：15至42列出，并且图3A给出了参比A，3c23和SEQ ID NO：15至42的序列的比对。

本发明的一些优选的但非限制性的基于1c81的结构单元在图2中列为SEQ ID NO：43至70，并且图3B给出参比B，1c81和SEQ ID NO：43至70的序列的比对。

在图3和4中所示的P2X7结合剂中，SEQ ID NO：29至42和57至70的序列是本发明的P2X7受体结合剂的实例，其具有C-末端丙氨酸延伸，即与通常的C末端序列VTVSS(如参比A中存在的SEQ ID NO：84)相比，在ISVD序列的C-末端具有丙氨酸残基(有时也称为“位置114”)。如WO 12/175741(但也例如在WO2013/024059和PCT/EP2015/060643中)所述，该C端丙氨酸延伸可以防止所谓的“先前存在的抗体”(假定为IgG′s)与位于ISV的C端区域的推定表位的结合。假设该表位除了其他残基之外还包括C-末端序列VTVSS的表面暴露的氨基酸残基以及位置14处的氨基酸残基(以及氨基酸序列中相同位置的下一个/接近的氨基酸残基，如位置11,13和15)，并且还可以包含位置83处的氨基酸残基(以及氨基酸序列中相同位置的下一个/接近的氨基酸残基，例如位置82,82a,82b和84)和/或位置108的氨基酸残基(和氨基酸序列中相同位置的下一个/接近的氨基酸残基，例如位置107)。

然而，虽然这种C-末端丙氨酸(或一般C-末端延伸)的存在可以大大减少(并且在很多情况下甚至基本完全防止)可以找到可以在来自一系列受试者(作为患者的健康受试者)的血清中发现的“先前存在的抗体”的结合，但是已经发现来自一些受试者的血清(例如来自患有某些免疫疾病如SLE的患者的血清)可以含有可以结合ISV的C端区域(当这种区域暴露时)的先前存在的抗体，即使当ISV含有这样的C端丙氨酸(或更一般地，这样的C端延伸)时。再次提及受让人于2015年5月13日提交并且标题为“改进的免疫球蛋白可变结构域”的共同未决的未预先公开的PCT申请PCT/EP2015/060643。

因此，本发明的一个具体目标是提供P2X7受体结合剂(并且特别是参比A或参比B的改进变体的P2X7受体结合剂)并且其具有降低的被所谓的“先前存在的抗体”的结合，以及特别是在PCT/EP2015/060643中描述的那种(即，即使存在C端延伸也可以与ISV的暴露的C端区域结合的那些先前存在的抗体)。如上所述，由本发明提供的P2X7结合剂也可以适当地用作结构单元，以提供也具有被先前存在的抗体的低结合或降低的结合的本发明的多肽。同样，这样的多肽优选如本文进一步描述的。

通常，本发明提供的P2X7结合剂将包含在本文进一步描述的位置11,89,110和/或112处的突变(的适当组合)。

表C列出了可以存在于本发明P2X7结合剂的位置11,89,110和112处的氨基酸残基的一些优选但非限制性的可能的组合。特别优选的组合用粗体表示，最优选的组合用粗体/ 下划线表示。

表C：位置11,89,110和位置112氨基酸的可能组合。

当本发明的P2X7结合剂以单价形式使用时，或当它们存在于本发明多肽的N-末端时，P2X7结合剂(以及由此得到的本发明多肽)优选在位置1处具有天冬氨酸残基(D)(例如分别与SEQ ID NO 15至42或43至70的序列相比具有E1D突变)。

而且，当本发明的P2X7结合剂以单价形式使用时，或当它们存在于本发明多肽的C-末端时，P2X7结合剂(以及由此得到的本发明多肽)优选具有C端延伸X(n)。如C端延伸可以如本文和WO2012/175741和PCT/EP2015/06043中进一步描述的)，并且优选具有式(X)_n，其中n是1至10，优选1至5，如1，2，3，4或5(并且优选1或2，例如1)；并且每个X是独立地选自天然存在的氨基酸残基的(优选天然存在的)氨基酸残基(尽管根据优选的一个方面，其不包含任何半胱氨酸残基)，并且优选独立地选自丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。

根据此类C端延伸X(n)的一些优选但非限制性实例，X和n可以如下：

(a)n＝1且X＝Ala；

(b)n＝2并且每个X＝Ala；

(c)n＝3并且每个X＝Ala；

(d)n＝2和至少一个X＝Ala(其余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)；

(e)n＝3并且至少一个X＝Ala(其余的氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)。

(f)n＝3且至少两个X＝Ala(其余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)；

(g)n＝1且X＝Gly；

(h)n＝2并且每个X＝Gly；

(i)n＝3并且每个X＝Gly；

(j)n＝2且至少一个X＝Gly(其余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)；

(k)n＝3并且至少一个X＝Gly(其余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)；

(l)n＝3且至少两个X＝Gly(其余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)；

(m)n＝2并且每个X＝Ala或Gly；

(n)n＝3并且每个X＝Ala或Gly；

(o)n＝3并且至少一个X＝Ala或Gly(其余的氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)；或

(p)n＝3并且至少两个X＝Ala或Gly(其余氨基酸残基X独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自Val，Leu和/或Ile)；

(a)，(b)，(c)，(g)，(h)，(i)，(m)和(n)是特别优选的，其中n＝1或2的方面是优选的方面，其中n＝1的方面是特别优选的。

还应该注意的是，优选地，存在于本发明多肽中的任何C-末端延伸不含有(游离)半胱氨酸残基(除非所述半胱氨酸残基被用于或打算进一步官能化，例如用于聚乙二醇化)。

有用的C-末端延伸的一些具体但非限制性实例是以下氨基酸序列：A，AA，AAA，G，GG，GGG，AG，GA，AAG，AGG，AGA，GGA，GAA或GAG。

本发明还提供了许多序列优化的免疫球蛋白单可变结构域，包括序列优化的3c23和1c81变体。

具体而言，序列优化的免疫球蛋白单可变结构域可以是如本文中一般针对免疫球蛋白单可变结构域所定义的氨基酸序列，但是其中存在至少一个氨基酸残基(并且特别是在至少一个框架残基中)是和/或对应于人源化取代(如本文所定义的)。基于本文的公开，一些优选的但非限制性的人源化取代(及其合适的组合)对于本领域技术人员将变得清楚。另外或可选地，可以通过将天然存在的VHH序列的框架区的序列与一个或多个密切相关的人VH序列的相应框架序列进行比较来确定其他可能有用的人源化取代，然后将一个或多个可以将由此确定的潜在有用的人源化取代(或其组合)引入所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步描述的)并且可以测试所得人源化VHH序列对靶标的亲和力，稳定性，表达的容易性和水平，和/或其他期望的性质。以这种方式，通过有限程度的试验和错误，本领域技术人员可以基于本文的公开内容来确定其他合适的人源化取代(或其合适的组合)。而且，基于前述，免疫球蛋白单可变结构域(的框架区)可以是部分人源化的或完全人源化的。另外，如上所述，本发明提供的多肽优选具有延长的半衰期(如本文所定义)。优选地，为此目的，本发明的多肽还包含与血清蛋白例如人血清白蛋白结合的至少一种(例如一种)ISVD。基于本文的公开内容，本领域技术人员可以清楚可以包括在用于此目的的本发明多肽中的血清白蛋白结合ISVD的优选实例。

本发明还涉及包含如本文所述的本发明的P2X7受体结合剂或基本上由其组成的蛋白质，多肽和其他构建体，分子或化学实体(即一个或多个例如一个或两个基于3c23的结构单元和/或一个或多个诸如一个或两个基于1c81的结构单元)；涉及用于表达/产生本发明的P2X7受体结合剂和/或用于表达/生产包含其的蛋白质，多肽和构建体，分子或化学实体的方法；涉及包含本发明的P2X7受体结合剂和/或包含其的蛋白质，多肽和构建体，分子或化学实体的组合物和产品(例如药物组合物和产品)；涉及编码本发明的P2X7受体结合剂和/或编码包含其的蛋白质或多肽的核苷酸序列和核酸；以及本发明的P2X7受体结合剂以及包含其的蛋白质，多肽和构建体，分子或化学实体的用途(并且特别是治疗，预防和诊断用途)。

根据本文的进一步描述，本发明的这些和其他方面，实施方案，优点，应用和用途将变得清楚。

在本说明书中，免疫球蛋白重链可变区中的氨基酸残基/位置将用根据Kabat的编号表示。为了方便起见，图1给出了一张表格，其列出了本文将特别提到的一些氨基酸位置以及根据一些替代编号系统(例如Aho和IMGT。注意：除非明确指出，否则对于目前的说明书和权利要求，Kabat编号是决定性的；其他编号系统仅供参考)。

关于CDR，如本领域中众所周知的那样，有多种惯例来定义和描述VH或VHH片段的CDR，例如Kabat定义(其基于序列变异性并且是最常用的)和Chothia定义(基于结构环区域的位置)。例如参考网站http：//www.bioinf.org.uk/abs/。为了本说明书和权利要求的目的，即使也可以提及根据Kabat的CDR，但是CDR最优选基于Abm定义(其基于牛津分子的AbM抗体建模软件)定义，因为这被认为是Kabat和Chothia定义之间的最佳折衷方案。请参考网站http：//www.bioinf.org.uk/abs/)。

而且，在本说明书中：

-术语“免疫球蛋白单可变结构域”(也称为“ISV”或ISVD”)通常用于指免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH，VHH或VL结构域)，其可以形成功能性抗原结合位点而不与另一可变结构域相互作用(例如没有常规4-链单克隆抗体的VH和VL结构域之间需要的VH/VL相互作用)。ISVD的实例将是技术人员清楚的并且例如包括纳米抗体(包括VHH，人源化VHH和/或骆驼化VH例如骆驼化人VH)，IgNAR结构域，(单结构域)抗体(例如dAb’s^TM)，其是VH结构域或衍生自VH结构域和(单结构域)抗体(例如dAb’s^TM)，其是VL结构域或衍生自VL结构域。除非本文另外明确提及，否则基于和/或来自重链可变结构域(如VH或VHH结构域)的ISVD通常是优选的。最优选地，除非在本文中另外明确指出，ISVD将是纳米抗体。

-术语“纳米抗体”通常如WO2008/020079或WO2009/138519中所定义的，因此在特定方面通常表示VHH，人源化VHH或骆驼化VH(例如骆驼化人VH)或通常为序列优化的VHH(诸如例如针对化学稳定性和/或溶解性进行优化，与已知的人构架区最大重叠和最大表达)。注意到术语纳米抗体是Ablynx N.V.的注册商标，因此也可以被称为和/或)；

-通常，除非本文另外指出，否则本文提及的ISVD，纳米抗体，多肽，蛋白质和其它化合物和构建体将预期用于预防或治疗人类(和/或任选地也用于温血动物特别是哺乳动物)中的疾病或病症。因此，通常，本文描述的ISVD，纳米抗体，多肽，蛋白质和其它化合物和构建体优选是这样的，使得它们可以用作(生物)药物或其他药学或治疗活性化合物和/或药物产品或组合物和/或可以适当地作为其一部分。这样的药物，化合物或产品优选使得适合施用于人，例如用于预防或治疗需要这种预防或治疗或例如作为临床试验的一部分的受试者。如本文进一步描述的，为了该目的，除了本发明提供的ISVD之外，这种药物或化合物可以含有其他部分，实体或结合单位(其也可以是例如一种或多种其它进一步的治疗性部分和/或影响基于ISVD或纳米抗体的生物制剂的药代动力学或药效学性质例如其半衰期的一个或多个其他部分)。这种进一步的治疗或其他部分的合适例子对本领域技术人员将是清楚的，并且例如通常可以包括任何治疗活性蛋白，多肽或其他结合结构域或结合单位。而且，如本文进一步描述的，本文所述的ISVD或纳米抗体可以针对(人)血清蛋白例如(人)血清白蛋白，并且此类ISVD或纳米抗体也可以发现治疗用途，特别是在和/或用于延长治疗部分和化合物的半衰期(例如在本文描述的基于ISV的生物制剂中)。例如参考WO 2004/041865，WO 2006/122787和WO2012/175400，其通常描述了血清-白蛋白结合纳米抗体用于半衰期延长的用途。而且，在本说明书中，除非本文另有明确提及，否则本文提及的所有术语具有在WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用的现有技术)或WO 2008/020079(或在WO 2008/020079中引用的现有技术中)中给出的含义。此外，在本文没有具体描述方法或技术的情况下，其可以如WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用的现有技术)或WO2008/020079(或在WO 2008/020079引用的现有技术中)中所述进行。而且，如本文所述，包含本发明的任何ISVD或化合物的任何药物产品或组合物还可包含本身已知用于药物产品或组合物中的一种或多种其他组分(即取决于预期的药物形式)和/或例如意图用于治疗用途(即提供组合产品)的一种或多种其他化合物或活性成分。

而且，当在本说明书或权利要求书中使用时，以下术语具有与在WO2009/138519的第62-75页中描述的方式相同的含义和/或在适用的情况下可以确定：“激动剂”，“拮抗剂”，“反向激动剂”，“非极性，不带电的氨基酸残基”，“极性不带电的氨基酸残基”，“极性荷电氨基酸残基”，“序列同一性”，“完全相同”和“氨基酸差异”(涉及两个氨基酸序列的序列比较时)，“(以)基本上分离的(形式)”，“结构域”，“结合结构域”，“抗原决定簇”，“表位”，“针对”或“针对”(抗原)，“特异性”和“半衰期”。另外，术语“调节”和“调节”，“相互作用位点”，“特异的”，“交叉阻断”，“交叉阻断的”和“交叉阻断”和“基本上独立于pH”是如在Ablynx N.V.的WO 2010/130832的第74-79页上定义的(和/或可以如其描述的那样确定)。此外，当提及本发明的构建体，化合物，蛋白质或多肽时，术语如“单价”，“二价”(或“多价”)，“双特异性”(或“多特异性”)和“双互补位”(或“多互补位”)可具有WO2009/138519，WO2010/130832或WO2008/020079中给出的含义。

本文使用的术语“半衰期”涉及ISVD，纳米抗体，基于ISVD的生物制品，基于纳米抗体的生物制品或本文提到的任何其他氨基酸序列，化合物或多肽通常可以如WO 2008/020079的第57页段落o)中所述定义并且如其中所述是指氨基酸序列，化合物或多肽的血清浓度在体内例如由于序列或化合物的降解和/或通过天然机制清除或螯合序列或化合物而降低50％所需的时间。本发明的氨基酸序列，化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，例如通过药代动力学分析。合适的技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且可以例如通常如WO 2008/020079的第57页的段落o)中所述。也如WO 2008/020079的第57页第o)段所述，可以使用诸如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)的参数来表示半衰期。在这方面，应该注意的是，本文所用的术语“半衰期”特别是指t1/2-β或末端半衰期(其中t1/2-α和/或AUC或二者可以不用考虑)。例如参考下面的实验部分以及标准手册，例如Kenneth，A et al：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook forPharmacists和Peters et al，Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)。还参考Marcel Dekker出版的第二修订版(1982)的″Pharmacokinetics″，M Gibaldi&DPerron。类似地，术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如WO 2008/020079第57页第o)段中所定义，特别是指t1/2-β的增加，或者伴或不伴t1/2-α和/或AUC或两者的增加。

当术语在本文中没有具体限定时，其在本领域中具有其通常的含义，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如参考标准手册，例如Sambrook et al，″MolecularCloning：A Laboratory Manual″(2nd.Ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；F.Ausubel et al，eds.，″Current protocols in molecular biology″，Green Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)；Lewin，“Genes II”，JohnWiley&Sons，New York，N.Y.，(1985)；Old et al.，“Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering”，2nd edition，University of CaliforniaPress，Berkeley，CA(1981)；Roitt et al.，“Immunology”(6th.Ed.)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt et al.，Roitt’s Essential Immunology，10th Ed.BlackwellPublishing，UK(2001)；and Janeway et al.，“Immunobiology”(6th Ed.)，GarlandScience Publishing/Churchill Livingstone，New York(2005)，以及本文引用的一般背景技术。

而且，如本文中已经指出的，纳米抗体的氨基酸残基根据由Kabat等人(“Sequenceof proteins of immunological interest”，US Public Health Services，NIHBethesda，MD，Publication No.91)给出的VH的通用编号进行编号，如Riechmann andMuyldermans，J.Immunol.Methods 2000 Jun 23；240(1-2)：185-195的文章中应用于来自骆驼科动物的VHH结构域；或在此引用。根据该编号，纳米抗体的FR1包含1-30位的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包含31-35位的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包含36-49位的氨基酸，纳米抗体的CDR2包含50-65位的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包含66-94位的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包含95-102位的氨基酸残基，并且纳米抗体的FR4包含103-113位的氨基酸残基。[在这方面，应该注意的是-如本领域对于VH结构域和VHH结构域熟知的-在每个CDR中的氨基酸残基的总数可以变化并且可以不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可能不被实际序列占据，或者实际序列可能含有比Kabat编号所允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，通常根据Kabat的编号可能与实际序列中氨基酸残基的实际编号相对应或不对应。然而，通常可以说，根据Kabat的编号并且不考虑CDR中的氨基酸残基的数量，根据Kabat编号的位置1对应于FR1的开始，反之亦然，根据Kabat编号的位置36对应于FR2的开始，反之亦然，根据Kabat编号的位置66对应于FR3的开始，反之亦然，根据Kabat编号的位置103对应于FR4的开始，反之亦然]。

用于编号VH结构域的氨基酸残基的替代方法Chothia et al.(Nature 342，877-883(1989))描述的方法，所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”，所述方法也可以以类似的方式应用于来自骆驼科动物和纳米抗体的VHH结构域。然而，在本说明书，方面和附图中，除非另有说明，否则将遵循由Riechmann和Muyldermans适用于VHH结构域的根据Kabat的编号。

还应该注意的是，附图，任何序列表和实验部分/实施例仅用于进一步说明本发明，并且不应被解释或理解为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围，除非另有明确说明。

本发明的基于3c23的结合剂的描述。

通常，本发明提供的基于3c23的结合剂是包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO：1或87的序列相比的突变)的SEQ ID NO：1(参比A)和3c23(SEQ ID NO：87)的变体：

-89T；或

-89L与11V的组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；或

-11V与110K或110Q组合；或

-11V与112K或112Q组合。

特别地，在本发明提供的基于3c23的结合剂中：

位置11的氨基酸残基优选选自L或V；和

位置89的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和

位置110的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

使得(i)位置89是T；或(ii)位置89是L和位置11是V；或(iii)位置89是L，和位置110是K或Q；或(iv)位置89是L，和位置112是K或Q；或(v)位置89是L，和位置11是V，和位置110是K或Q；或(vi)位置89是L，和位置11是V，和位置112是K或Q；或(vii)位置11是V，和位置110是K或Q；或(vii)位置11是V，和位置112是K或Q。

基于3c23的结合剂是特别优选的，其中位置89为T或位置11为V且位置89为L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适当组合，并且特别是与110K或110Q突变组合)。甚至更优选的是基于3c23的结合剂，其中位置11是V并且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。

如本文进一步所述，为本发明的基于3c23的结构单元的本发明的P2X7受体结合剂优选具有与3c23和参比A中存在的CDR相同的组合(即CDR1，CDR2和CDR3)。

因此，本发明提供的基于3c23的结合剂优选包含以下CDR(根据Kabat惯例)：

-为氨基酸序列HYAMG(SEQ ID NO：2)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQ ID NO：3)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Kabat)。

或者，当根据Abm惯例给出CDR时，本发明提供的基于3c23的结合剂优选包含以下CDR：

-是氨基酸序列GRTFRHYAMG(SEQ ID NO：5)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AISSYGSTD(SEQ ID NO：6)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：7，其与SEQ ID NO：4相同)的CDR3(根据Abm)。

基于3c23的结合剂优选还具有：

-与SEQ ID NO：1的参考氨基酸序列(其中可能存在的任何C端延伸以及CDR不被考虑用于确定序列同一性的程度)的序列同一性定程度为至少85％，优选至少90％，更优选至少95％；和/或

-与SEQ ID NO：1的参考氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑上面列出的位置11,89,110或112的任何突变，其可以存在并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)。

关于本发明提供的基于3c23的结合剂的各个方面和优选方面，当涉及与SEQ IDNO：1的序列同一性程度和/或可存在于本发明的这种结合剂中(即与SEQ ID NO：1的序列相比较)的“氨基酸差异”的数目和种类时，应当指出的是，当(i)基于3c23的结合剂与SEQ IDNO：1的序列具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的序列同一性程度时(其中对于确定序列同一性程度，不考虑CDR，可能存在的任何C端延伸以及所涉及的特定方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变)；和/或当(ii)基于3c23的结合剂与SEQ ID NO：1的序列具有不超过7个，优选不超过5个，例如仅3，2或1个“氨基酸差异”时(同样，不考虑任何可能存在的C-末端延伸，并且不考虑所涉及的特定方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变)，那么这还包括除了所涉及的具体方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变以外与SEQ ID NO：1的序列没有氨基酸差异的序列)和可能存在的任何C端延伸。

因此，在本发明的一个具体方面，本发明提供的基于3c23的结合剂可以与SEQ IDNO：1(包括CDR，但不考虑本文公开的位置11,89,110和/或112处的突变或突变组合和/或可能存在的任何C-末端延伸)具有100％的序列同一性，和/或可以与SEQ ID NO：1没有氨基酸差异(即，除了或本文公开的位置11,89,110和/或112处的突变或突变组合和可能存在的任何C端延伸之外)。

当存在任何氨基酸差异时(即，除了涉及的本发明的特定方面所需的任何C端延伸和位置11,89,110和/或112处的突变之外)，这些氨基酸差异可以存在于CDR中和/或在框架区中，但它们优选仅存在于框架区中(如由Abm惯例所定义的，即不存在于根据Abm惯例定义的CDR中)，即使得由本发明提供的基于3c23的结合剂具有与SEQ ID NO：1中存在的CDR相同的CDR(根据Abm惯例定义)。

而且，当基于3c23的结合剂与SEQ ID NO：1的序列具有一个或多个氨基酸差异时(除了所涉及的特定方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变外)，则可能存在的这种突变/氨基酸差异(即与SEQ ID NO：1的序列相比)的一些具体但非限制性的例子是例如A14P，G60A，D73N，A74S，P79Y和/或K83R，或这些突变中的两个或更多个(以及直到并包括全部)的任何合适的组合，例如由特别优选的SEQ ID NO：136至143,154至161和169至176所描绘的。突变的其他实例是一个或多个合适的“人源化”取代(适当的组合)；例如参考WO2009/138519(或在WO 2009/138519中引用的现有技术)和WO 2008/020079(或在WO 2008/020079中引用的现有技术中)，以及来自WO 2008/020079的表A-3至A-8(其列出了可能的人源化取代)。

而且，当基于3c23的结合剂为单价形式或存在于和/或形成本发明多肽的N-末端部分时，则其优选在位置1包含D(即与参比A相比为E1D突变)。因此，另一方面，本发明涉及在其N-末端具有基于3c23的结合剂(其在本文中进一步描述)的本发明的多肽(其在本文中进一步描述)，其中所述3c23-基于结合剂的在第1位具有D，如例如SEQ ID NO：154至161和169至176。

此外，当3c23基结合剂为单价形式或存在于本发明多肽的C末端和/或形成本发明多肽的C末端时，其优选具有式(X)n的C末端延伸，其中n为1至10，优选1至5，例如1，2，3，4或5(并且优选1或2，例如1)；并且每个X是独立地选自天然存在的氨基酸残基的(优选天然存在的)氨基酸残基(尽管根据优选的一个方面，其不包含任何半胱氨酸残基)，并且优选独立地选自丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)，例如SEQ ID NO：169至176。

根据此类C-末端延伸X(n)的一些优选但非限制性实例，X和n可如本文进一步描述用于本发明的多肽。

当本发明提供的基于3c23的结合剂在位置110或112处含有突变(任选地与如本文所述的位置11和/或89处的突变组合)时，框架4的C端氨基酸残基(从位置109开始)可以如下：(i)如果不存在C端延伸：VTVKS(SEQ ID NO：72)，VTVQS(SEQ ID NO：73)，VKVSS(SEQ IDNO：74)或VQVSS(SEQ ID NO：75)；或(ii)如果不存在C端延伸：VTVKSX_(n)(SEQ ID NO：76)，VTVQSX(n)(SEQ ID NO：77)，VKVSSX(n)(SEQ ID NO：78)或VQVSSX_(n)(SEQ ID NO：79)，如VTVKSA(SEQ ID NO：80)，VTVQSA(SEQ ID NO：81)，VKVSSA(SEQ ID NO：82)或VQVSSA(SEQ IDNO：83)。当本发明提供的基于3c23的结合剂在位置110或112处不含突变(但仅如本文所述在位置11和/或89处具有突变)时，构架4的C端氨基酸残基(从位置109开始)通常是：(i)当不存在C端延伸时：VTVSS(SEQ ID NO：84)(如在SEQ ID NO：1的序列中)；或(ii)当存在C端延伸时：VTVSSX_(n)(SEQ ID NO：85)，如VTVSSA(SEQ ID NO：86)。在这些C-末端序列中，X和n如本文对C-末端延伸所定义。

因此，在第一方面，基于3c23的结合剂具有：

-为氨基酸序列HYAMG(SEQ ID NO：2)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQ ID NO：3)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

-与SEQ ID NO：1的氨基酸序列(其中可能存在的任何C-末端延伸以及CDR不被考虑用于确定序列同一性程度)具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的程度的序列同一性；

和/或具有：

-与SEQ ID NO：1的氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑任何以上列出的可能存在的位置11,89,110或112处的突变，并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；

并且任选地(即当以单价形式或当存在于本发明的多肽的C-末端时)具有：

-C端延伸(X)_n，其中n为1至10，优选1至5，例如1，2，3，4或5(并且优选1或2，如1)，并且每个X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选择，并且优选独立地选自丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；

和任选地(即当以单价形式或当存在于本发明多肽的N-末端时)在位置1具有D(即与SEQ ID NO：1相比的E1D突变)，

其中：

-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-基于3c23的结合剂的位置89处的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和

-基于3c23的结合剂的位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

-基于3c23的结合剂的位置112处的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

另一方面，基于3c23的结合剂具有：

-为氨基酸序列HYAMG(SEQ ID NO：2)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQ ID NO：3)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

和/或具有：

使得所述基于3c23的结合剂在所述位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO；1的氨基酸序列相比的突变)：

-89T；或

-89L与11V的组合；或

-89L与110K或110Q的组合；或

-89L与112K或112Q的组合；或

-89L与11V和110K或110Q的组合；或

-89L与11V和112K或112Q的组合；或

-11V与110K或110Q的组合；或

-11V与112K或112Q的组合。

如上所述，当基于3c23的结合剂存在于本发明多肽(如本文定义的)的C-末端时，基于3c23的结合剂(以及因此得到的本发明的多肽)优选如本文对于本发明的多肽所述和/或如WO2012/175741或PCT/EP2015/060643中所述的C-末端延伸X(n)。

如上所述，在本发明中，其中位置89是T或位置11是V且位置89是L的基于3c23的结合剂(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适当组合)和特别是与110K或110Q突变组合)是特别优选的。甚至更优选的是基于3c23的结合剂，其中位置11是V并且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。

因此，在一个优选的方面，基于3c23的结合剂具有：

-为氨基酸序列HYAMG(SEQ ID NO：2)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQ ID NO：3)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

和/或具有：

其中：

-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-基于3c23的结合剂的位置89处的氨基酸残基是T；和

-基于3c23的结合剂的位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q(并且优选T)；和

-基于3c23的结合剂的位置112氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q(并且优选S)。

在另一个优选的方面，基于3c23的结合剂具有：

-为氨基酸序列HYAMG(SEQ ID NO：2)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQ ID NO：3)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

和/或具有：

和任选地(即当以单价形式或当存在于本发明多肽的N-末端时)在位置1具有D(即与SEQ ID NO：1相比的ElD突变)，其中

-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基为V；和

-基于3c23的结合剂的位置89处的氨基酸残基是L；和

-基于3c23的结合剂的位置112氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q。

在一个具体但非限制性的方面，本发明提供的基于3c23的结合剂在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：1序列相比的突变)：

-11V与89L组合；或

-11V与110K或110Q组合；

-11V与112K或112Q组合；

-11V与89L和110K或110Q组合；或

-11V与89L和112K或112Q组合；

并且具有CDR(根据Kabat)并且与本文所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

在另一个具体但非限制性的方面，本发明提供的基于3c23的结合剂在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：1的序列相比的突变)：

-89L与11V组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；

-110K或110Q与11V组合；或

-110K或110Q与89L组合；或

-110K或110Q与11V和89L组合；

-112K或112Q与11V组合；或

-112K或112Q与89L组合；或

-112K或112Q与11V和89L组合；

另一方面，本发明提供的基于3c23的结合剂包含位置89处的T，并具有CDR(根据Kabat)并且与如本文所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

另一方面，本发明提供的基于3c23的结合剂包含位置11处的V和位置89处的L，并且具有CDR(根据Kabat)并且与如本文所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

如上所述，根据本文所述的方面由本发明提供的基于3c23的结合物优选进一步使得它们含有A14P突变，A74S突变和/或K83R突变的合适组合，优选这些突变中的任意两种的合适组合，例如这些突变的全部三种的组合(并且再次，当基于3c23的结合剂存在于本发明的多肽的N-末端时，也优选E1D突变)。

另一方面，基于3c23的结合剂具有：

-是氨基酸序列GRTFRHYAMG(SEQ ID NO：5)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AISSYGSTD(SEQ ID NO：6)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

其中

-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-基于3c23的结合剂的位置112氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

另一方面，基于3c23的结合剂具有：

-是氨基酸序列GRTFRHYAMG(SEQ ID NO：5)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AISSYGSTD(SEQ ID NO：6)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

使得所述基于3c23的结合剂在所述位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比的突变)：

-89T；或者

-89L与11V组合；或者

-89L与110K或110Q组合；或者

-89L与112K或112Q组合；或者

-89L与11V和110K或110Q组合；或者

-89L与11V和112K或112Q组合；或者

-11V与110K或110Q组合；或者

-11V与112K或112Q组合。

如上所述，当基于3c23的结合剂以单价形式使用和/或存在于本发明多肽(如本文定义的)的C术端时，基于3c23的结合剂(并且因此产生的多肽)优选具有C端延伸X(n)，该C端延伸可以如本文关于本发明的多肽所描述的和/或如WO2012/175741或PCT/EP2015/060643中所述。

如上所述，在本发明中，其中位置89是T或位置11是V且位置89是L的基于3c23的结合剂(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适当组合和特别是与110K或110Q突变组合)是特别优选的。甚至更优选的是基于3c23的结合剂，其中位置11是V并且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。

因此，在一个优选的方面，基于3c23的结合剂具有：

-是氨基酸序列GRTFRHYAMG(SEQ ID NO：5)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AISSYGSTD(SEQ ID NO：6)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

其中

-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-基于3c23的结合剂的位置89处的氨基酸残基是T；和

在另一个优选的方面，基于3c23的结合剂具有：

-是氨基酸序列GRTFRHYAMG(SEQ ID NO：5)的CDR1(根据Abm)：和

-是氨基酸序列AISSYGSTD(SEQ ID NO：6)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

其中：

-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基是V；和

-基于3c23的结合剂的位置89处的氨基酸残基是L；和

-基于3c23的结合剂的位置112处的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q。

在一个具体但非限制性的方面，本发明提供的基于3c23的结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：1序列相比的突变)：

-11V与89L组合；或

-11V与110K或110Q组合；

-11V与112K或112Q组合；

-11V与89L和110K或110Q组合；或

-11V与89L和112K或112Q组合；

并且具有CDR(根据Abm)并且与本文所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

-89L与11V组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；

-110K或110Q与11V组合；或

-110K或110Q与89L组合；或

-110K或110Q与11V和89L的组合；

-112K或112Q与11V组合；或

-112K或112Q与89L组合；或

-112K或112Q与11V和89L组合；

另一方面，本发明提供的基于3c23的结合剂在位置89包含T，并具有CDR(根据Abm)并且与本文所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

另一方面，本发明提供的基于3c23的结合剂包含位置11处的V和位置89处的L，并且具有CDR(根据Abm)并且与本文所述的SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

可以存在于本发明多肽中的基于3c23的结合剂的一些优选但非限制性实例在SEQID NO：15至42中给出，并且适当地包含一个或多个这些序列的本发明多肽形成本发明另外的方面(在每种情况下，当在多肽的N-末端处时，优选地在位置1处具有D，并且在多肽的C-末端处具有C-末端丙氨酸)。可以存在于本发明多肽中的一些特别优选的基于3c23的结合剂是SEQ ID NO：24,25,38和39的序列或其具有选自A14P，G60A，D73N，A74S，P79Y和/或K83R的一种或多种突变(的合适组合)，或这些突变的两个或更多个(并且直至并包括全部)的任何合适的组合的变体，例如由特别优选的SEQ ID NO：136至143描绘(再次，在每种情况下，优选在位于多肽的N端时在位置1处具有D，如SEQ ID NO：154至161，并且在位于多肽的C-端时具有C-末端丙氨酸，例如SEQ ID NO：169至176)。

本发明基于1c81的结合剂的描述

通常，本发明提供的基于1c81的结合剂是包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO：8序列相比的突变)的SEQ ID NO：8(参比B)和1c81(SEQ ID NO：88)的变体：

-89T；或

-89L与11V的组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；或

-11V与110K或110Q组合；或

-11V与112K或112Q组合。

具体而言，在本发明提供的基于1c81的结合剂中：

位置11的氨基酸残基优选选自L或V；和

位置89的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和

位置110的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

基于1c81的结合剂，其中位置89为T或位置11为V且位置89为L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适当组合，并且特别是与110K或110Q突变组合)是特别优选的。甚至更优选的是基于1c81的结合剂，其中位置11是V并且位置89是L，任选具有110K或110Q突变。

还如本文进一步描述的，为本发明的基于1c81的结构单元的本发明的P2X7受体结合剂优选具有与1c81和参比B中存在的CDR(即CDR1，CDR2和CDR3)相同的组合。

因此，本发明提供的基于1c81的结合剂优选包含以下CDR(根据Kabat惯例)：

-为氨基酸序列FSTSTMG(SEQ ID NO：9)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AIDWSDFNTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Kabat)。

或者，当根据Abm惯例给出CDR时，本发明提供的基于1c81的结合剂优选包含以下CDR：

-是氨基酸序列GRTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：12)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AIDWSDFNTY(SEQ ID NO：13)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：14，其与SEQ ID NO：11相同)的CDR3(根据Abm)。

上述优选的CDR与1c81(SEQ ID NO：88)和参比B(SEQ ID NO：8)中存在的相同。

存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂优选还具有：

-与SEQ ID NO：8的氨基酸序列(其中可能存在的任何C-末端延伸以及CDR不被考虑用于确定序列同一性程度)具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的程度的序列同一性；

和/或具有：

-与SEQ ID NO：8的氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑任何以上列出的可能存在的位置11,89,110或112处的突变，并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)。

关于本发明提供的基于1c81的结合物的各个方面和优选方面，当涉及与SEQ IDNO：8的序列同一性程度和/或可能存在于本发明的这种结合剂中的“氨基酸差异”的数目和种类时(即与SEQ ID NO：8的序列相比)，应当注意的是，当说到(i)基于1c81的结合剂与SEQID NO：8的序列具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％程度的序列同一性(其中可能存在的CDR，任何C端延伸以及涉及的特定方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变不被考虑用于确定序列同一性的程度)；和/或当(ii)基于1c81的结合剂与SEQ ID NO：8的序列具有不超过7个，优选不超过5个，例如仅3，2或1个“氨基酸差异”时(同样，不考虑任何可能存在的C-末端延伸，并且不考虑所涉及的特定方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变)，那么这还包括除了所涉及的特定方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变以外与SEQ ID NO：8的序列没有氨基酸差异)和可能存在的任何C端延伸。

因此，在本发明的一个具体方面，本发明提供的基于1c81的结合物可以与SEQ IDNO：8具有100％的序列同一性(包括CDR，但不考虑本文公开的位置11,89,110和/或112处的突变或突变组合和/或可能存在的任何C-末端延伸)和/或可以与SEQ ID NO：8没有氨基酸差异(即，除了或本文公开的位置11,89,110和/或112处的突变或突变组合和可能存在的任何C端延伸之外)。

当存在任何氨基酸差异时(即，除了涉及本发明的特定方面所需的位置11,89,110和/或112处的任何C端延伸和突变之外)，这些氨基酸差异可以存在于CDR中和/或在框架区中，但它们优选仅存在于框架区中(如由Abm惯例所定义的，即不存在于根据Abm惯例定义的CDR中)，即使得由本发明提供的基于1c81的结合物具有与SEQ ID NO：8中存在的CDR相同的CDR(根据Abm惯例定义)。

而且，当存在于根据本发明的任何方面的本发明的多肽中的基于1c81的结合剂与SEQ ID NO：8的序列具有一个或多个氨基酸差异(除了所涉及的具体方面所需的位置11,89,110和/或112处的突变外)时，那么可能存在的这种突变/氨基酸差异(即与SEQ ID NO：8的序列相比)的一些具体的但非限制性的例子是例如K10G，A14P，L82M，K83R，L45R，H72D，P74S，R75K和/或S77T，或者这些突变的两个或更多个(并且直至并包括全部)的任何合适的组合，例如SEQ ID NO：129至135，147至153和162至168所描述的，其中SEQ ID NO：134,152和167是特别优选的。其他突变的例子是一种或多种合适的“人源化”取代(的适当组合)；例如参考WO 2009/138519(或在WO 2009/138519中引用的现有技术)和WO 2008/020079(或在WO 2008/020079中引用的现有技术中)，以及来自WO 2008/020079的表A-3至A-8(其是显示可能的人源化取代的列表)。

而且，当基于1c81的结合剂为单价形式或存在于本发明多肽的N端部分和/或形成本发明多肽的N端部分时，则其优选在1位包含D(即与SEQ ID NO：8相比的E1D突变)。因此，另一方面，本发明涉及本发明的多肽(其在本文中进一步描述)，其在其N-末端具有基于1c81的结合剂(其在本文中进一步描述)，其中所述基于1c81的结合剂在位置1处具有D，例如如SEQ ID NO：147至153和162至168所示，其中SEQ ID NO：152和167是特别优选的。

当基于1c81的结合剂为单价形式或存在于和/或形成蛋白质，多肽或其存在的其他化合物或构建体的C-末端时(或者当它们在这样的蛋白质，多肽或其他化合物或构建体另外具有“暴露的”C-末端时，通常意味着ISV的C-末端不与恒定结构域(例如CH1结构域)缔合或连接；再次参考WO 2012/175741和PCT/EP2015/06043)，优选还具有式(X)_n的C端延伸，其中n为1至10，优选1至5，例如1，2，3，4或5(并且优选1或2，例如1)；并且每个X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选自天然存在的氨基酸残基(尽管根据优选的一个方面，其不包含任何半胱氨酸残基)，并且优选独立地选自丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)，例如SEQ ID NO：162-168所示，其中SEQ ID NO：167是特别优选的。

根据此类C-末端延伸X_(n)的一些优选但非限制性实例，X和n可如本文进一步描述用于本发明的多肽。

当本发明提供的基于1c81的结合物在位置110或112处含有突变(任选地与如本文所述的位置11和/或89处的突变组合)时，框架4的C-末端氨基酸残基(从位置109开始)可以如下：(i)如果不存在C端延伸：VTVKS(SEQ ID NO：72)，VTVQS(SEQ ID NO：73)，VKVSS(SEQID NO：74)或VQVSS(SEQ ID NO：75)；或(ii)如果存在C端延伸：VTVKSX_(n)(SEQ ID NO：76)，VTVQSX(n)(SEQ ID NO：77)，VKVSSX(n)(SEQ ID NO：78)或VQVSSX(n)(SEQ ID NO：79)，如VTVKSA(SEQ ID NO：80)，VTVQSA(SEQ ID NO：81)，VKVSSA(SEQ ID NO：82)或VQVSSA(SEQ IDNO：83)。当本发明提供的基于1c81的结合物在位置110或112处不含突变(但仅在本文所述的位置11和/或89处具有突变)时，构架4的C端氨基酸残基(从位置109开始)通常是：(i)当不存在C端延伸时：VTVSS(SEQ ID NO：84)(如在SEQ ID NO：1的序列中)；或(ii)当存在C端延伸时：VTVSSX_(n)(SEQ ID NO：85)，如VTVSSA(SEQ ID NO：86)。在这些C-末端序列中，X和n如本文对C-末端延伸所定义。

因此，在第一方面，基于1c81的结合剂具有：

-为氨基酸序列FSTSTMG(SEQ ID NO：9)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AIDWSDFNTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

和/或具有：

-与SEQ ID NO：8的氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑任何以上列出的可能存在的位置11,89,110或112处的突变，并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；

和任选地(即当以单价形式或当存在于本发明多肽的N-末端时)在位置1具有D(即与SEQ ID NO：8相比的E1D突变)，

其中：

-基于1c81的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-基于1c81的结合剂的位置89处的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和

-基于1c81的结合剂的位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

-基于1c81的结合剂的位置112处的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

另一方面，存在于本发明多肽中的基于1c81的结合物具有：

-为氨基酸序列FSTSTMG(SEQ ID NO：9)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AIDWSDFNTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

和/或具有：

使得所述基于3c23的结合剂在所述位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：8的氨基酸序列相比的突变)：

-89T；或

-89L与11V的组合；或

-89L与110K或110Q的组合；或

-89L与112K或112Q的组合；或

-89L与11V和110K或110Q的组合；或

-89L与11V和112K或112Q的组合；或

-11V与110K或110Q的组合；或

-11V与112K或112Q的组合。

如上所述，当存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂以单价形式使用和/或存在于本发明多肽(如本文定义的)的C-末端时，基于1c81的结合剂(以及因此得到的本发明的多肽)优选如本文对于本发明的多肽所述和/或如WO2012/175741或PCT/EP2015/060643中所述的C-末端延伸X(n)。

如上所述，在本发明中，其中位置89是T或位置11是V且位置89是L的基于1c81的结合剂(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适当组合)和特别是与110K或110Q突变组合)是特别优选的。甚至更优选的是基于1c81的结合剂，其中位置11是V并且位置89是L，任选地具有110K或110Q突变。

因此，在一个优选的方面，存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂具有：

-为氨基酸序列FSTSTMG(SEQ ID NO：9)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AIDWSDFNTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

和/或具有：

其中：

-基于1c81的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-基于1c81的结合剂的位置89处的氨基酸残基是T；和

-基于1c81的结合剂的位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q(并且优选T)；和

-基于1c81的结合剂的位置112氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q(并且优选S)。

在另一个优选的方面，存在于本发明多肽中的基于1c81的结合物具有：

-为氨基酸序列FSTSTMG(SEQ ID NO：9)的CDR1(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列AIDWSDFNTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)的CDR2(根据Kabat)；和

-为氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Kabat)；

并具有：

和/或具有：

和任选地(即当以单价形式或当存在于本发明多肽的N-末端时)在位置1具有D(即与SEQ ID NO：8相比的E1D突变)，其中

-基于1c81的结合剂的位置11处的氨基酸残基为V；和

-基于1c81的结合剂的位置89处的氨基酸残基是L；和

-基于1c81的结合剂的位置112氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q。

在一个具体但非限制性的方面，本发明提供的基于1c81的结合剂在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：8序列相比的突变)：

-11V与89L组合；或

-11V与110K或110Q组合；

-11V与112K或112Q组合；

-11V与89L和110K或110Q组合；或

-11V与89L和112K或112Q组合；

并且具有CDR(根据Kabat)并且与本文所述的SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

在另一个具体但非限制性的方面，本发明提供的基于1c81的结合剂在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：8的序列相比的突变)：

-89L与11V组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；

-110K或110Q与11V组合；或

-110K或110Q与89L组合；或

-110K或110Q与11V和89L组合；

-112K或112Q与11V组合；或

-112K或112Q与89L组合；或

-112K或112Q与11V和89L组合；

另一方面，本发明提供的基于1c81的结合剂包含位置89处的T，并具有CDR(根据Kabat)并且与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有如本文所述的总体程度的序列同一性。

另一方面，本发明提供的基于1c81的结合剂包含位置11处的V和位置89处的L，并具有CDR(根据Kabat)并且与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有如本文所述的总体程度的序列同一性。

如上所述，根据本文所述的方面，由本发明提供的基于1c81的结合剂可以包含K10G，A14P，L82M，K83R，L45R，H72D，P74S，R75K和/或S77T突变或两种或更多种(以及直到并包括全部)这些突变的任何适当组合(并且当基于1c81的结合剂是单价的或存在于本发明的化合物或多肽的N-末端时，也优选E1D突变)。

另一方面，存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂具有：

-是氨基酸序列GRTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：12)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AIDWSDFNTY(SEQ ID NO：13)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

-基于1c81的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选为L或V；和

-基于1c81的结合剂的位置112氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

另一方面，存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂具有：

-是氨基酸序列GRTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：12)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AIDWSDFNTY(SEQ ID NO：13)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

使得所述基于1c81的结合剂在所述位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：8的氨基酸序列相比的突变)：

-89T；或

-89L与11V组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；或

-11V与110K或110Q组合；或

-11V与112K或112Q组合。

如上所述，当存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂以单价形式使用和/或存在于本发明多肽(如本文定义的)的C-末端时，基于1c81的结合剂(以及因此得到的本发明的多肽)优选具有C端延伸X(n)，该C端延伸可以如本文对本发明提供的基于1c81的结合剂和/或如WO2012/175741或PCT/EP2015/060643中所述。

如上所述，在本发明中，其中位置89为T或位置11为V且位置89为L(任选地与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适当组合)的基于1c81的结合剂和特别是与110K或110Q突变组合)是特别优选的。甚至更优选的是基于1c81的结合剂，其中位置11是V并且位置89是L，任选具有110K或110Q突变。

-是氨基酸序列GRTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：12)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AIDWSDFNTY(SEQ ID NO：13)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

在其中

-基于1c81的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-基于1c81的结合剂的位置89处的氨基酸残基是T；和

-基于1c81的结合剂的位置112处的氨基酸残基优选适当地地选自S，K或Q(并且优选S)。

在一个优选的方面，存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂具有：

-是氨基酸序列GRTFSFSTSTMG(SEQ ID NO：12)的CDR1(根据Abm)；和

-是氨基酸序列AIDWSDFNTY(SEQ ID NO：13)的CDR2(根据Abm)；和

-是氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)的CDR3(根据Abm)；

并具有：

和/或具有：

其中：

-基于1c81的结合剂的位置11处的氨基酸残基是V；和

-基于1c81的结合剂的位置89处的氨基酸残基是L；和

-基于1c81的结合剂的位置112处的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q。

在一个具体但非限制性的方面，本发明提供的基于1c81的结合剂在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即，与SEQ ID NO：8的序列相比的突变)：

-11V与89L组合；或

-11V与110K或110Q组合；

-11V与112K或112Q组合；

-11V与89L和110K或110Q组合；或

-11V与89L和112K或112Q组合；

并且具有CDR(根据Abm)并且与本文所述的SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

-89L与11V组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；

-110K或110Q与11V组合；或

-110K或110Q与89L组合；或

-110K或110Q与11V和89L组合；

-112K或112Q与11V组合；或

-112K或112Q与89L组合；或

-112K或112Q与11V和89L组合；

另一方面，本发明提供的基于1c81的结合剂包含位置89处的T，并具有CDR(根据Abm)并且与如本文所述的SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

另一方面，本发明提供的基于1c81的结合物包含位置11处的V和位置89处的L，并且与如本文所述的SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有总体程度的序列同一性。

可以存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂的一些优选但非限制性实例在SEQID NO；43至70中给出，并且适合地包含一个或多个这些序列的本发明的多肽形成本发明的其他方面(在每种情况下，优选当在多肽的N-末端时具有位置1处的D且当位于多肽的C-末端时具有C-末端丙氨酸)。可以存在于本发明的多肽中的一些特别优选的1c81结合剂是SEQID NO：52,53,66或67的序列或其变体，所述变体具有选自K10G，A14P，L82M，K83R，L45R，H72D，P74S，R75K和/或S77T的一个或多个突变(合适组合)，例如SEQ ID NO：129至135所示，其中SEQ ID NO：134是特别优选的(同样，在每种情况下，优选在多肽的N-末端处在位置1处具有D，例如SEQ ID NO：147至153，其中SEQ ID NO：152是特别优选的，并且在多肽的C端末端具有C端丙氨酸，例如SEQ ID NO：162-168，特别优选SEQ ID NO：167)。

本发明的多肽

如上所述，在其它方面，本发明涉及包含本发明的至少一种(例如一种，两种或三种)P2X7受体结合剂或基本上由其组成的蛋白质，多肽，构建体，化合物或其他化学实体(也在本文中统称为“本发明的多肽”或“本发明的化合物”)。

这些抗P2X7受体多肽可以例如包含一个或多个(例如一个或两个)基于3c23的结构单元和/或一个或多个(例如一个或两个)基于1c81的结构单元，并且可以特别地包含一个，两个或三个(并且特别是两个)基于3c23的结构单元(并且不包括基于1c81的结构单元)或者包括一个，两个或三个(并且特别是两个)基于1c81的结构单元(并且不包括基于3c23的结构单元)或者可以是双互补位的，即包含一个或两个(并且特别是一个)基于3c23的结构单元和一个或两个(并且特别是一个)基于1c81的结构单元。

如上所述，本发明的多肽优选地也具有增加的半衰期(如本文所定义)，其中通常意指该多肽具有(如本文所定义的)半衰期，其比存在于本发明多肽中的单价基于3c23的结合剂的半衰期大至少2倍的，优选至少5倍，例如至少10倍或超过20倍，以及(如本文所定义的)半衰期，其比存在于本发明多肽中的单价基于1c81的结合剂的半衰期大至少2倍，优选至少5倍，例如至少10倍或大于20倍(如在人和/或合适的动物模型如小鼠或食蟹猴中测量)。

特别地，本发明的多肽优选具有至少1天，优选至少3天，更优选至少7天，例如至少10天的人受试者的半衰期(如本文所定义)。

为了提供具有这种(增加的)半衰期的本发明多肽，本发明的多肽优选含有结合血清白蛋白的ISVD，特别是血清白蛋白结合纳米抗体。

特别地，这样的结合血清白蛋白的ISVD或纳米抗体可以是例如EP 2139918，WO201I/006915，WO 2012/175400，WO 2014/111550中所述的针对人血清白蛋白的(单)结构域抗体或dAb，并且可以特别是如WO 2004/041865，WO 2006/122787，WO2012/175400或PCT/EP2015/060643中所述的血清白蛋白结合纳米抗体。特别优选的血清白蛋白结合ISVD是纳米抗体Alb-1(参见WO 2006/122787)或其人源化变体，例如Alb-8(WO 2006/122787，SEQ IDNO：62)，Alb-23(WO 2012/175400，SEQ ID NO：1)和Alb-1的其他人源化(并且优选还有序列优化的)变体和/或Alb-8或Alb-23的变体(或更一般地具有与Alb-1，Alb-8和Alb-23相同的CDR的ISVD)。可以存在于本发明多肽中的一些特别优选但非限制性血清白蛋白结合剂的氨基酸序列在图中以SEQ ID NO：89至92给出，其中SEQ ID NO：90至92是特别优选的。

同样，如上所述，当存在这样的血清白蛋白结合ISVD时，其序列中可以包含一个或多个减少先前存在的抗体结合的框架突变。特别地，当这样的血清白蛋白结合ISVD是纳米抗体或基本由VH结构域组成和/或来源于VH结构域的纳米抗体或(单)结构域抗体时，血清白蛋白结合ISVD可包含位置11,89,110和/或112处的氨基酸残基/突变(的合适的组合)，如PCT/EP2015/060643中所述的和/或基本上如本文对于本发明提供的P2X7结合剂所述。例如，PCT/EP2015/060643描述了Alb-1，Alb-8和Alb-23的多种变体，其含有减少可以用于本发明化合物的先前存在的抗体的结合的位置11,89,110和/或112处的氨基酸残基/突变。

再次，当这种血清白蛋白结合ISVD存在于本发明化合物的C-末端时，结合血清白蛋白的ISVD(结果，本发明化合物)优选具有C-末端延伸X(n)，该C端延伸可以如本文对本发明提供的和/或如WO2012/175741或PCT/EP2015/060643中所述的P2X7结合剂所述。此外，优选地，至少所述C端ISVD具有减少先前存在的抗体的结合的突变，例如在PCT/EP2015/060643中描述的位置11,89,110和/或112处的氨基酸残基/突变(的合适组合)。

虽然血清白蛋白结合ISVD的存在/使用是提供具有增加的半衰期的本发明多肽的优选方式，但增加本发明化合物的半衰期的其他手段(例如使用与血清白蛋白结合的其他结合结构域，使用ISVD与其他血清蛋白例如转铁蛋白或IgG的结合，聚乙二醇化，与人白蛋白或其合适片段的融合，或使用合适的血清白蛋白-结合肽)，尽管不太优选，也包括在本发明的范围内。

如上所述，本发明的多肽优选还具有C端延伸X(n)(如本文进一步描述的)，并且优选位置1(即在多肽的N端)的氨基酸残基是D。

在本发明的多肽中，P2X7结合剂(和血清白蛋白结合ISV，如果存在的话)可以彼此直接连接或通过一个或多个合适的接头连接。一些优选但非限制性的接头是9GS，15GS或35GS接头。

尽管不那么优选，但也不排除本发明的多肽除了一种或多种P2X7结合剂和血清白蛋白结合ISVD(如果存在)以外还可以含有一种或多种其他氨基酸序列，化学实体或部分。这些其他氨基酸序列，化学实体或部分可赋予本发明的(所得)化合物一种或多种期望的性质和/或可以以期望的方式改变本发明的(所得)化合物的性质，例如提供具有所需生物学和/或治疗活性的本发明化合物以改变或改善药代动力学和/或药效学性质，以将本发明化合物靶向特定细胞，组织或器官(包括癌细胞和癌症组织)，提供细胞毒性效应和/或用作可检测标签或标记。这些其他氨基酸序列，化学实体或部分的一些非限制性实例是：

-一个或多个针对除P2X7以外的治疗相关靶点的结合结构域或结合单位(即为了提供本发明化合物(除了是P2X7的双互补位外)是对P2X7和所述其它靶标的双特异性的)；和/或

-一个或多个结合结构域或结合单位，其提供增加的针对P2X7受体的特异性(通常，这些将能够结合P2X7受体，但通常本身基本上不对P2X7受体是功能性的)；和/或

-将本发明化合物靶向期望的细胞，组织或器官(例如癌细胞)的一个或多个结合结构域或结合单位；和/或

-有效载荷如细胞毒性有效载荷；和/或

-可检测的标签或标签，例如放射性标签或荧光标签；和/或

-可帮助固定，检测和/或纯化本发明化合物(例如HIS或FLAG3标签)的标签；和/或

-可以被功能化的标签，例如C端GGC或GGGC标签。

本发明的范围也不排除本发明的化合物还可含有(优选人)常规抗体的一个或多个部分或片段(如Fc部分或其功能片段或一个或多个恒定结构域)和/或来自仅骆驼重链的抗体(例如一个或多个恒定结构域)。

当本发明的多肽含有一个或多个另外的结合结构域或结合单位时(例如，如前面段落所述)，这些其他结合结构域或结合单位优选包含一个或多个ISVD，更优选是全部ISVD。例如但不限于，这些一个或多个另外的结合结构域或结合单位可以是一个或多个纳米抗体(包括VHH，人源化VHH和/或骆驼化VH如骆驼化人VH)，(单结构域)抗体是VH结构域或来自VH结构域，为VH结构域或基本上由VH结构域组成或衍生自VH结构域的dAb，或甚至是(单个)结构域抗体或为VL结构域或基本上由VL结构域组成的dAb。特别地，当存在时，这些一个或多个结合结构域或结合单位可以包含一个或多个纳米抗体，更特别是全部纳米抗体。

当本发明的多肽在其C-末端具有ISVD时(其C末端ISVD可以是P2X7结合剂，如前面段落中提到的结合血清白蛋白的ISVD或另一种ISVD)时，则本发明的多肽(即所述C端ISVD)优选具有如本文所述的C端延伸X(n)。

当除了一种或多种P2X7结合剂和血清白蛋白结合ISVD(如果存在)之外，本发明的多肽还包含任何其他ISVD(如在前面的段落中提及的)，并且其中这样的其他ISVD是纳米抗体或是ISVD，其基本上由VH序列组成和/或源自VH序列，那么根据本发明的优选方面，存在于本发明的多肽中的所述一种或多种(并优选全部)这种ISVD将包含在其序列内的一个或多个减少先前存在的抗体结合的框架突变。具体而言，根据本发明的这个方面，此类其他ISVD可以包含在PCT/EP2015/060643中描述和/或基本上如本文对P2X7所述的位置11,89,110和/或112处的氨基酸残基/突变(的适当组合)。在一个具体的方面，当本发明的多肽在其C-末端具有ISVD时(C末端ISVD可以是P2X7，前面段落中提到的血清白蛋白结合ISVD或另一种ISVD)，则在存在于C末端和/或形成C末端的所述ISVD具有这样的框架突变，其降低了先前存在的抗体的结合(并且所述C端ISVD优选也将具有如本文所述的C端延伸X(n))。

一方面，本发明涉及包含至少一种P2X7结合剂(如本文所述)和任选地一种或多种其他ISVD(例如血清白蛋白结合ISVD)的抗P2X7受体多肽，其中存在于所述多肽中的所有ISVD都含有以下氨基酸残基：

-位置11的氨基酸残基优选选自L或V；和

-位置89的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和

-位置110的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

-位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

另一方面，本发明涉及包含至少一种P2X7结合剂(如本文所述)和任选地一种或多种其他ISVD(例如血清白蛋白结合ISVD)的抗P2X7受体多肽，其中存在于所述多肽中的所有ISVD都含有以下氨基酸残基：

-89T；或

-89L与11V组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合；或

-11V与110K或110Q组合；或

-11V与112K或112Q组合。

-位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-位置89的氨基酸残基是T；和

-位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q(并且优选T)；和

-位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q(并且优选S)。

-位置11的氨基酸残基是V；和

-位置89的氨基酸残基是L；和

-位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

-位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或O。

-11V与89L组合；或

-11V与110K或110Q组合；

-11V与112K或112Q组合；

-11V与89L和110K或110Q组合；或

-11V与89L和112K或112Q组合。

-89L与11V组合；或

-89L与110K或110Q组合；或

-89L与112K或112Q组合；或

-89L与11V和110K或110Q组合；或

-89L与11V和112K或112Q组合。

-110K或110Q与11V组合；或

-110K或110Q与89L组合；或

-110K或110Q与11V和89L组合。

-112K或112Q与11V组合；或

-112K或112Q与89L组合；或

-112K或112Q与11V和89L组合。

另一方面，本发明涉及包含至少一种P2X7结合剂(如本文所述)和任选地一种或多种其他ISVD(例如血清白蛋白结合ISVD)的抗P2X7受体多肽，其中存在于所述多肽中的所有ISVD在位置89处含有T。

另一方面，本发明涉及包含至少一种P2X7结合剂(如本文所述)和任选地一种或多种其他ISVD(例如血清白蛋白结合ISVD)的抗P2X7受体多肽，其中存在于所述多肽中的所有ISVD在位置11包含V并且在位置89包含L。

同样，所有这些双互补位抗-P2X7受体多肽优选含有C端延伸X(n)(如本文所述)和位置1处的D，并且如本文进一步描述的可以包含血清白蛋白结合ISVD。

从本文的公开内容将清楚的是，由本发明提供的抗P2X7多肽可以具有不同的“形式”，即基本上是单价，二价或三价，可以是单特异性的，双特异性的，三特异性的等，并且可以是双互补位的(如在此定义并且例如在WO 08/020079中)。例如，本发明的化合物可以是：

-(基本上)单价的，即(基本上)包含本发明的单一P2X7受体结合剂。如上所述，当以单价形式使用时，本发明的P2X7受体结合剂优选具有如本文进一步描述的C端延伸X(n)。本发明的这种化合物也可以是半衰期延长的；

-可以(基本上)是二价或三价和单特异性的。本发明的这种化合物将包含两种或更多种针对P2X7受体的ISVD，其可以相同或不同，并且当不同时可以针对相同的表位或P2X7受体或针对P2X7受体上的不同表位(在后一种情况下，如此以提供本发明的双互补位或多互补位化合物)。本发明的这种化合物也可以是半衰期延长的；

-可以(基本上)是二价的，三价的(或多价的)和双特异性的或三特异性的(或多特异性的)。本发明的这种化合物将针对P2X7受体和至少一种其他靶标。如本文所述，所述其他靶标可以是例如另一种治疗相关靶标(即除P2X7受体以外)，以提供对于P2X7受体和所述其他治疗靶标双特异性的本发明化合物。所述另一种靶也可以是提供增加的半衰期的靶标(例如人血清白蛋白)，从而提供具有增加的半衰期的本发明化合物。如本文中还提到的，这样的其它靶标也可以允许本发明的化合物靶向特定的细胞，组织或器官)。也可以将这些方法/ISVD组合起来，例如提供对P2X7受体和至少一种其他治疗相关的靶标具有双特异性且半衰期延长的本发明化合物。

同样，这些多肽都优选如本文进一步描述的。

如本领域技术人员将清楚的，当本发明的化合物旨在用于局部使用时(即在皮肤上或在眼睛中)或例如意指在例如胃肠道中的某处具有(局部)治疗作用(胃肠道；即在口服给药或通过栓剂给药后)或在肺中(即在通过吸入给药后)或者以其他方式直接应用于其预期的作用位置(例如通过直接注射)，本发明的化合物通常不需要半衰期延长。而且，对于某些急性病症或适应症的治疗，可能优选不具有延长的半衰期。在这些情况下，使用本发明的单价化合物或不具有半衰期延长的本发明的另一种化合物(例如相对于P2X7受体为二价或双互补位的本发明化合物)。

此类本发明化合物的一些优选但非限制性实例在下表D-1中示意性地示出，并且这些中的每一个形成本发明的另一方面(还应当指出，当两种或更多种基于3c23的结合剂存在于本发明的多肽中时，它们可以相同或不同，并且当它们不同时，它们优选全部含有如本文所述的位置11,89,110和/或112处的突变(合适的组合)，以及优选地也具有与本文所述相同的CDR。当两种或更多种基于1C81的结合剂存在于本发明的多肽中时也是如此)。基于本文的公开内容，本领域技术人员将清楚没有半衰期延长的合适的本发明化合物的其它例子。本发明的双互补位多肽的一些优选实例将在下表E-1和E-2中给出。

表D-1：本发明的一些没有延长半衰期的ISVD的多肽的示意图。

如本领域技术人员将清楚的，当本发明的化合物打算用于全身施用和/或用于预防和/或治疗慢性疾病或病症时，通常优选所述本发明的化合物具有增加的半衰期(如本文所定义)，即与存在于本发明化合物中的P2X7受体结合剂相比较。更优选地，本发明的这种化合物将含有延长半寿期的ISVD，例如优选ISVD，特别是与人血清白蛋白结合的纳米抗体(如本文所述)。

本发明此类化合物的一些优选但非限制性实例在下表D-2中示意性地示出，并且这些中的每一个形成本发明的另一方面。基于本文的公开，本领域技术人员将了解具有半衰期延长的合适的本发明化合物的其他实例。通常，对于具有半衰期延长的本发明化合物而言，C-末端延伸的存在是非常优选的。

表D-2：具有半衰期延长的ISVD的本发明的一些本发明多肽的示意图。

图4A给出了作为通式[3c23]-[3c23]-[HLE]的本发明化合物的一些非限制性实例的SEQ ID NO：93至98。所使用的3c23结构单元携带L11V+V89L突变或V11V+V89L+T110K突变。血清白蛋白结合剂是SEQ ID NO：89或具有L11V+V89L突变或L11V+V89L+T110K突变的SEQ ID NO：89的白蛋白结合剂，所述突变降低了被先前存在的抗体的结合并且是优选的。接头分别是35GS和9GS接头。多肽在1位具有D并携带C-末端丙氨酸。图4A还给出了作为人源化的通式[3c23]-[3c23]-[HLE]的本发明化合物的非限制性实例的SEQ ID NO：144。

图4B给出了作为通式[1c81]-[1c81]-[HLE]的本发明化合物的一些非限制性实例的SEQ ID NO：99至104。使用的1c81结构单元携带L11V+V89L突变或V11V+V89L+T110K突变。血清白蛋白结合剂是SEQ ID NO：89或具有L11V+V89L突变或L11V+V89L+T110K突变的SEQID NO：89的白蛋白结合剂，所述突变降低了被先前存在的抗体的结合并且是优选的。接头分别是35GS和9GS接头。多肽在1位具有D并携带C-末端丙氨酸。图4B还给出了作为人源化的通式[1c81]-[1c81]-[HLE]的本发明化合物的非限制性实例的SEQ ID NO：145。

本发明提供的双互补位多肽

如上所述，在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了双互补位抗P2X7受体多肽。具体而言，本发明提供的双互补位抗-P2X7多肽包含至少一种(例如一种或两种)如本文所述的基于3c23的结合剂和至少一种(例如一种或两种)如本文所述的基于1c81的结合剂。

因此，另一方面，本发明涉及多肽(其优选为融合蛋白)，其包含如本文所述的至少一种(例如一种或两种)基于3c23的结合剂和至少一种(例如一种或两种)如本文所述的基于1c81的结合剂。

本发明提供的双互补位多肽可以具有增加的半衰期(如本文对于本发明的多肽一般描述的)并且为此目的可以包含血清-白蛋白结合ISVD(同样，如本文对本发明的多肽一般描述的)。

因此，另一方面，本发明涉及多肽(其优选为融合蛋白)，其包含如本文所述的至少一种(例如一种或两种)基于3c23的结合剂和至少一种(例如一种或两种)如本文所述的基于1c81的结合剂，其中所述多肽在人受试者中具有至少1天，优选至少3天，更优选至少7天，如至少10天的半衰期(如本文所定义)。

另一方面，本发明涉及多肽(其优选为融合蛋白)，其包含如本文所述的至少一种(例如一种或两种)基于3c23的结合剂和至少一种(例如一种或两种)如本文所述的基于1c81的结合剂和至少一种(并且优选一种)结合血清白蛋白的ISVD(并且特别是结合血清白蛋白的纳米抗体)。此外，所述多肽优选在人受试者中具有至少1天，优选至少3天，更优选至少7天，如至少10天的半衰期(如本文所定义)。

如上所述，本发明的双互补位多肽优选还具有C端延伸X(n)(如本文进一步描述的)并且优选在位置1(即多肽的N-端)的氨基酸残基是D。

在本发明的双互补位多肽中，基于3c23的结合剂和基于1c81的结合剂(和血清白蛋白结合ISV，如果存在的话)可以再次彼此直接连接或经由一个或多个合适的接头连接。一些优选但非限制性的接头是9GS，15GS或35GS接头。

尽管不那么优选，但也不排除本发明的多肽除了一种或多种基于3c23的结合剂，具有一种或多种基于1c81的结合剂和血清白蛋白结合ISVD(如果存在的话)之外还可以包含一种或多种其他氨基酸序列，化学实体或部分，如本文通常对本发明化合物描述的。此外，这些其他结合结构域或结合单位优选包含一个或多个ISVD，更优选全部是ISVD，并且当双互补位多肽在其C-末端具有ISVD时，则本发明的多肽(即所述C-末端ISVD)优选具有如本文所述的C末端延伸X(n)。同样，所有存在的ISVD将优选地在其序列内包含一个或多个框架突变，所述框架突变降低先前存在的抗体的结合，并且特别是在PCT/EP2015/060643所述和/或基本上如本文对于P2X7结合剂所述中，在位置11,89,110和/或112处的氨基酸残基/突变。而且，本发明的双互补位多肽优选在1位具有D。

在一个方面，本发明涉及包含至少一种3c23结合剂(如本文所述)和至少一种1c81结合剂(如本文所述)的双互补位抗P2X7受体多肽(该双特异性多肽如本文进一步描述的)，其中存在于所述多肽中的所有ISVD都含有以下氨基酸残基：

-位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-位置89的氨基酸残基优选适当地选自T，V或L；和

-位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

-位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q；

在另一个方面，本发明涉及包含至少一种3c23结合剂(如本文所述)和至少一种1c81结合剂(如本文所述)的双互补位抗P2X7受体多肽(该双特异性多肽如本文进一步描述的)，其中存在于所述多肽中的所有ISVD都含有以下氨基酸残基：

-89T；要么

-89L与11V组合；要么

-89L与110K或110Q组合；要么

-89L与112K或112Q组合；要么

-89L与11V和110K或110Q组合；要么

-89L与11V和112K或112Q组合；要么

-11V与110K或110Q组合；要么

-11V与112K或112Q组合。

-位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

-位置89的氨基酸残基是T；和

-位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q(并且优选S)。

-位置11的氨基酸残基是V；和

-位置89的氨基酸残基是L；和

-位置110处的氨基酸残基优选适当地选自T，K或Q；和

-位置112的氨基酸残基优选适当地选自S，K或Q。

-11V与89L组合；要么

-11V与110K或110Q组合；

-11V与112K或112Q组合；

-11V与89L和110K或110Q组合；要么

-11V与89L和112K或112Q组合。

-89L与11V组合；要么

-89L与110K或110Q组合；要么

-89L与112K或112Q组合；要么

-89L与11V和110K或110Q组合；要么

-89L与11V和112K或112Q组合。

-110K或110Q与11V组合；要么

-110K或110Q与89L组合；要么

-110K或110Q与11V和89L的组合。

-112K或112Q与11V组合；要么

-112K或112Q与89L组合；要么

-112K或112Q与11V和89L组合。

在另一个方面，本发明涉及包含至少一种3c23结合剂(如本文所述)和至少一种1c81结合剂(如本文所述)的双互补位抗P2X7受体多肽(该双特异性多肽如本文进一步描述的)，其中存在于所述多肽中的所有ISVD都在位置89含有T。

另一方面，本发明涉及包含至少一种3c23结合剂(如本文所述)和至少一种1c81结合剂(如本文所述)的双互补位抗P2X7受体多肽(该双特异性多肽如本文进一步描述的)，其中存在于所述多肽中的所有ISVD在位置11处含有V并且在位置89处含有L。

另一方面，本发明涉及包含至少一种3c23结合剂(如本文所述)和至少一种1c81结合剂(如本文所述)的双互补位抗P2X7受体多肽(该双特异性多肽如本文进一步描述的)，其中3c23结合剂适当地选自SEQ ID NO：15至42和136至143和169至176或其变体，所述变体具有选自A14P，G60A，D73N，A74S，P79Y和/或K83R的一个或多个突变(的适当组合)或这些突变中的两个或更多个(并且直到并包括全部)的任何合适的组合(再次，在每种情况下，优选在位于多肽N末端的位置1处具有D，例如SEQ ID NO：154到161，当在该多肽的C-末端时具有C-末端丙氨酸，例如SEQ ID NO：169-176，当在该多肽的C-末端时具有C-末端丙氨酸，并且其中1c81结合剂适合地选自SEQ ID NO：43至70和129至135或其变体，所述变体具有选自K10G，A14P，L82M，K83R，L45R，H72D，P74S，R75K和/或S77T的一个或多个突变(的合适组合)(再次在每种情况下，优选在多肽的N-末端时具有在位置1处的D，例如，SEQ ID NO 147至153，其中SEQ ID NO：152是特别优选的，并且在多肽的C-末端处具有C-末端丙氨酸，例如，SEQ ID NO：162-168，其中SEQ ID NO：167是特别优选的。

另一方面，本发明涉及包含至少一种3c23结合剂(如本文所述)和至少一种1c81结合剂(如本文所述)的双互补位抗P2X7受体多肽(该双特异性多肽如本文进一步描述的)，其中3c23结合剂适宜地选自SEQ ID NOs：24，25，38，39，136，137，138，139，140，141，142和143，或其变体，所述变体具有一种或多种选自A14P，G60A，D73N，A74S，P79Y和/或K83R的突变)(的合适组合)，或这些突变的两个或更多个(并且直至并包括全部)的任何合适组合(再次，在每种情况下，优选地当在多肽的N-末端时在位置1具有D，例如SEQ ID NO：154,155,156,157,158,159,160和161，并且当在多肽C-末端时具有C-末端丙氨酸，例如SEQ ID NO：169,170,171,172,173,174,175和176，并且其中1c81结合剂适合地选自SEQ ID NOs：52,53,66,67,129,130,131,132,133,134和135或其变体，所述变体具有选自K10G，A14P，L82M，K83R，L45R，H72D，P74S，R75K和/或S77T的一个或多个突变(的适当组合)(再次，在每种情况下，当在多肽N-末端时，优选在位置1处具有D，例如，SEQ ID NO：147,148,149,150,151,152和153，其中SEQ ID NO：152是特别优选的，并且当在多肽的C-末端时具有C-末端丙氨酸，例如，SEQ ID NO：162,163,164,165,166,167和168，其中SEQ ID NO：167是特别优选的)。

从本文的公开中将清楚的是，本发明的双互补位多肽可以具有不同的“形式”。例如但不限于，本发明的双互补位多肽可以：

-基本上由一种基于3c23的结合剂(如本文所述)和一种基于1c81的结合剂(如本文所述)组成；

-基本上由两种基于3c23的结合剂(如本文所述)和一种基于1c81的结合剂(如本文所述)组成；

-基本上由一种基于3c23的结合剂(如本文所述)和两种基于1c81的结合剂(如本文所述)组成；

-基本上由两种基于3c23的结合剂(如本文所述)和两种基于1c81的结合剂(如本文所述)组成；

-基本上由一种基于3c23的结合剂(如本文所述)，一种基于1c81的结合剂(如本文所述)和一种针对人血清白蛋白的ISVD(如本文所述)组成；

-基本上由两种基于3c23的结合剂(如本文所述)，一种基于1c81的结合剂(如本文所述)和一种针对人血清白蛋白的ISVD(如本文所述)组成；

-基本上由一种基于3c23的结合剂(如本文所述)，两种基于1c81的结合剂(如本文所述)和一种针对人血清白蛋白的ISVD(如本文所述)组成；要么

-基本上由两种基于3c23的结合剂(如本文所述)，两种基于1c81的结合剂(如本文所述)和一种针对人血清白蛋白的ISVD(如本文所述)组成。

基于本文的公开内容，本领域技术人员将清楚本发明的双互补位多肽的其他合适的形式。

如本领域技术人员将清楚的，当本发明的双互补位多肽旨在用于局部使用时(即在皮肤上或在眼睛中)或例如意味着在(例如)GI的某处具有(局部)治疗作用(即，在口服给药或栓剂给药后)或在肺中(即在通过吸入给药后)或其他意思是直接应用于其预期的作用位置(例如通过直接注射)，本发明的多肽通常不需要延长半衰期。在这些情况下，使用本发明的二价双特异性多肽或本发明的另一种没有半衰期延长的多肽可以是优选的。

本发明的没有半衰期延长的双互补位多肽的一些优选但非限制性实例在下表E-1中示意性地示出，并且这些中的每一个形成本发明的另一方面(同样，当两个或更多个基于3c23的结合剂存在于本发明的双互补位多肽中时，它们可以相同或不同，并且当它们不同时，它们优选全部含有如本文所述的位置11,89,110和/或112处的突变(的合适的组合)，并且优选也具有与本文所述相同的CDR。当在本发明的双互补位多肽中存在两种或更多种基于1C81的结合剂时，这同样适用)。基于本文的公开，本领域技术人员将清楚本发明的没有半衰期延长的合适双互补位多肽的其他实例。此外，这些多肽优选在1位具有D。

表E-1：不具有半衰期延长的ISVD的本发明的一些双互补位多肽的示意图。

如本领域技术人员将清楚的，当本发明的双互补位多肽打算全身施用和/或预防和/或治疗慢性疾病或病症时，通常优选本发明的所述双互补位多肽具有增加的半衰期(如本文所定义)，即与存在于本发明多肽中的基于1c81的结合剂相比。更优选地，本发明的这种双互补位多肽将包含延长半衰期的ISVD，例如优选ISVD，特别是与人血清白蛋白结合的纳米抗体(如本文所述)。

本发明的这种双互补位多肽的一些优选但非限制性实例在下表E-2中示意性地示出，并且这些中的每一个形成本发明的另一方面。基于本文的公开，本领域技术人员将了解具有半衰期延长的本发明合适的双互补位多肽的其他实例。通常，对于具有半衰期延长的本发明的双互补位多肽，C-末端延伸的存在是非常优选的。此外，这些多肽优选在1位具有D。

表E-2：具有半衰期延长的ISVD的本发明的一些双互补位多肽的示意图。

图4C给出了通式[3c23]-[1c81]-[HLE](SEQ ID NO：105至116)或[1c81]-[3c23]-[HLE](SEQ ID NOs：117至128)的本发明的双互补位化合物的一些非限制性实例SEQ IDNO：105至128。所使用的3c23和1c81结构单元L11V+V89L突变或V11V+V89L+T110K突变。血清白蛋白结合剂是SEQ ID NO：89或具有L11V+V89L突变或L11V+V89L+T110K突变的SEQ IDNO：89的白蛋白结合剂，所述突变降低了被先前存在的抗体的结合并且是优选的。接头分别是35GS和9GS接头。多肽在1位具有D并携带C-末端丙氨酸。图4C还给出了作为人源化的通式[3c23]-[1c81]-[HLE]的本发明的双互补位化合物的非限制性实例的SEQ ID NO：146。

本发明的其他方面

本发明还涉及编码如本文所述的本发明多肽的核苷酸序列或核酸。本发明还包括遗传构建体，其包括前述核苷酸序列或核酸以及本身已知的遗传构建体的一个或多个元件。遗传构建体可以是质粒或载体的形式。此外，这样的构建体可以大体上如Ablynx N.V.的公开的专利申请中所述，例如WO 2004/041862，WO 2006/122786，WO 2008/020079，WO2008/142164或WO 2009/068627中所述。

本发明还涉及含有此类核苷酸序列或核酸，和/或表达(或能够表达)本发明多肽的宿主或宿主细胞。同样，此类宿主细胞可以如Ablynx NV的公开的专利申请，例如WO2004/041862，WO 2006/122786，WO 2008/020079，WO 2008/142164或WO 2009/068627中所述。

本发明还涉及用于制备本发明多肽的方法，所述方法包括在使得所述宿主细胞产生或表达如本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或构建体的条件下培养或维持如本文所述的宿主细胞，并且任选地进一步包括分离如此产生的本发明的多肽。此外，可以如AblynxN.V.的已公开专利申请(例如WO 2004/041862，WO 2006/122786，WO 2008/020079，WO2008/142164或WO 2009/068627)中一般性描述的那样进行这些方法。

本发明还涉及包含至少一种本发明的多肽和任选的至少一种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂的药物组合物。这样的制剂，载体，赋形剂和稀释剂通常可以如在Ablynx NV的公开专利申请，例如WO 2004/041862，WO 2006/122786，WO 2008/020079，WO2008/142164或WO 2009/068627中所述。

然而，由于本发明优选的多肽具有增加的半衰期，它们优选施用于循环。因此，它们可以以允许本发明的多肽进入循环的任何合适的方式施用，例如通过注射或输注静脉内，或以任何其他合适的方式(包括口服施用，皮下施用，肌肉内施用，通过皮肤施用，鼻内施用，经由肺施用等)，其允许本发明的多肽进入循环。合适的方法和给药途径对于本领域技术人员将是清楚的，同样例如也来自Ablynx NV公开的专利申请的教导，诸如例如WO2004/041862，WO 2006/122786，WO 2008/020079，WO 2008/142164或WO 2009/068627。

因此，另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗可通过使用本发明的多肽来预防或治疗的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的本发明多肽和/或包含其的药物组合物。

在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，还通常包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病的进展，预防或减缓与疾病相关的一种或多种症状的发作，减轻和/或缓解与疾病相关的一种或多种症状，减少疾病的严重程度和/或持续时间和/或与其相关的任何症状和/或预防疾病的严重程度和/或与其相关的任何症状的进一步增加，预防，减少或逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及通常对正在治疗的患者有益的任何药理学作用。

待治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，更特别是人类。如本领域技术人员将清楚的是，待治疗的受试者将特别是患有本文提及的疾病和病症或处于其风险中。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于免疫疗法的方法，所述方法包括向患有本文提及的疾病和病症或处于风险中的患者施用药学活性量的本发明的多肽，和/或包含其的药物组合物。

根据适用于预防和/或治疗待预防或治疗的疾病或病症的治疗方案，施用本发明的多肽和/或包含其的组合物。临床医生通常能够根据因素诸如待预防或治疗的疾病或病症，待治疗的疾病的严重程度和/或其症状的严重程度，待使用的本发明的特定多肽，要使用的具体施用途径和药物制剂或组合物，患者的年龄，性别，体重，饮食，一般状况以及临床医生熟知的类似因素确定合适的治疗方案。

通常，治疗方案将包括以一种或多种药学有效量或剂量施用本发明的一种或多种多肽或一种或多种包含它们的组合物。再次基于上述因素，临床医生可以确定给药的具体量或剂量。

通常，为了预防和/或治疗本文提及的疾病和病症并取决于待治疗的具体疾病或病症，要使用的本发明多肽的效力和/或半衰期，具体施用途径以及所用的特定药物制剂或组合物，本发明的多肽通常将以每天每千克体重1克至0.01微克，优选0.1克至0.1微克每千克体重每天的量施用，例如每天每公斤体重约1,10,100或1000微克，连续(例如通过输注)，作为单次日剂量或在一天中的多次分剂量施用。临床医生通常能够根据本文提到的因素确定合适的日剂量。也将清楚的是，在特定情况下，临床医师可以选择偏离这些数量，例如基于上述因素和他的专家判断。关于待施用的量的一些指导可以从通过基本上相同的途径给予针对相同的靶标的可比较的常规抗体或抗体片段的通常施用量获得，考虑到亲和力/亲合力，功效，生物分布，半衰期和技术人员熟知的类似因素等方面的差异。

通常，在上述方法中，将使用本发明的单个多肽。然而，组合使用两种或更多种本发明的多肽在本发明的范围内。

本发明的多肽还可以与一种或多种其他药物活性化合物或成分组合使用，即作为联合治疗方案，其可以或不可以导致协同效应。同样，基于上述因素和他的专家判断，临床医生将能够选择这样的其他化合物或成分以及合适的联合治疗方案。

特别地，本发明的多肽可以与其他药学活性化合物或成分结合使用，所述其他药学活性化合物或成分是或可以用于预防和/或治疗可以用本发明的融合蛋白或构建体预防或治疗的疾病和病症并且由此可以或不可以获得协同效应。

正如临床医生所清楚的那样，根据本发明使用的治疗方案的有效性可以以涉及的疾病或病症的本身已知的任何方式来确定和/或遵循。临床医生也可以在适当的情况下或逐个情况下改变或修改特定的治疗方案，以达到期望的治疗效果，以避免，限制或减少不需要的副作用和/或者一方面在实现所需的治疗效果和另一方面避免，限制或减少不希望的副作用之间实现适当的平衡。

通常，将遵循治疗方案，直到达到所需的治疗效果和/或只要所需的治疗效果得以维持。再次，这可以由临床医生确定。

待治疗的受试者可以是任何温血动物，特别是哺乳动物，更特别是人类。如本领域技术人员将清楚的是，待治疗的受试者将特别是患有本文提及的疾病和病症或处于此风险中的人。

由于本发明的P2X7受体结合剂和化合物能够与P2X7受体结合，它们尤其可以用于预防和/或治疗与P2X7，P2X7受体或P2X7信号传导途径相关的疾病或病症和/或者可以通过调节P2X7信号传导途径来预防，治疗或缓解。这些包括但不限于诸如炎症性肠病(IBD)，类风湿性关节炎，骨关节炎，癌症，糖尿病，肾炎，神经性疼痛，癫痫，神经变性疾病如阿尔茨海默病和亨廷顿病，多发性硬化症和心血管疾病，包括中风和高血压，局部缺血以及本文所述的其他病症和疾病。具体而言，本发明的多肽和组合物可用于诊断，预防和治疗涉及P2X7介导的病症的疾病。

本发明的其它方面，实施方案，优点和应用将从本文的进一步描述中变得清楚。

现在将通过以下非限制性优选方面，实施例和附图进一步描述本发明，其中：

图1是表格，列出了本文将特别提及的一些氨基酸位置和根据一些替代编号系统(例如Aho和IMGT)的编号；

图2列出了本文提及的氨基酸序列；

-图3A显示参比A(SEQ ID NO：1)与3c23(SEQ ID NO：87)的序列和SEQ ID NO：15-42的基于3c23的结构单元的序列比对；

-图3B显示参考序列B(SEQ ID NO：8)与1c81(SEQ ID NO：88)和SEQ ID NO：43至70的基于1c81的结构单元的序列比对；

-图4给出了本发明的一些示例性多肽的氨基酸序列；

-图5显示了当测试来自人类健康受试者的96份血清样品与参比A和根据本发明的参比A的两种代表性变体(即分别是参比A+L11V+V89L+C-末端丙氨酸]和[参比A+L11V+V89L+T110K+C末端丙氨酸])的结合时，在实施例1中获得的两个对应的数据点图。每个点代表所测试的96个样品中的一个的结合水平。右侧小图和左侧小图显示的数据点相同；在右侧小图中，对于所测试的三种化合物(即参比A；参比A+L11V+V89L+114A；参比A+L11V+V89L+T110K+114A)的每一种化合物用每种单独样品测量的数据点分别用线连接(因此，当引入本发明的突变和C-末端丙氨酸时，线的下降给出了先前存在的抗体的结合程度降低的指示)；

-图6是列出了图4中所汇编的数据点的结合数据的表(3列给出标准化的PreAb结合水平(125秒时的RU)和2列给出与所用参比化合物相比PreAb结合减少的百分比)；

-图7显示了当测试来自人类健康受试者的96份血清样品与参比B和本发明参比B的两种代表性变体(即分别是[参比B+L11V+V89L+C末端丙氨酸]和[参比B+L11V+V89L+T110K+C末端丙氨酸])的结合时，在实施例2中获得的两个对应的数据点图。每个点代表所测试的96个样品中的一个的结合水平。右侧小图和左侧小图显示的数据点相同；在右侧小图中，对于所测试的三种化合物(即参比B；参比B+L11V+V89L+114A；参比B+L11V+V89L+T110K+114A)中的每一种化合物用每种单独样品测量的数据点分别用线连接(因此，当引入本发明的突变和C-末端丙氨酸时，线的下降给出了先前存在的抗体的结合程度降低的指示)；

-图8是列出图7中汇编的数据点的结合数据的表(分别是3列给出标准化的PreAb结合水平(125秒时的RU)和2列给出与所用参比化合物相比PreAb结合减少的百分比)。

-图9显示Hek-mP2X7细胞中抗-P2X7 1c81SO变体的ATP-介导的钙摄取的抑制。图A：在添加100nM和10nM浓度的变体后ATP直接测量的钙吸收。图B：以100nM浓度测试的变体随时间记录的钙摄取。

-图10.F024500016对照和强制氧化样品的完整质量LC-MS分析的UV 280nm色谱图的叠加。

-图11.F024500016对照和温度胁迫样品的完整质量LC-MS分析的UV 280nm色谱图的叠加。

实验部分

以下实验部分中使用的人类样品来自商业来源或人类志愿者(获得所有必要的同意和批准后)，并根据适用的法律和监管要求(包括但不限于医疗秘密和患者隐私的要求)使用。

在下面的实施例中，除非另外明确指出，使用ProteOn如下测定用于所测试的纳米抗体的样品中存在的先前存在的抗体的结合：

使用单克隆抗FLAG M2将纳米抗体捕获在血清白蛋白上或通过FLAG3标签捕获。

在使用ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories，Inc.)评估在人血清白蛋白(HSA)上捕获的纳米抗体上先前存在的抗体的情况下，使用PBS/吐温(磷酸缓冲盐水，pH7.4，0.005％吐温20)作为运行缓冲液，并且实验在25℃下进行。使用EDC/NHS(流速30μl/min)活化ProteOn GLC传感器芯片的配体泳道，并且在pH4.5的ProteOn乙酸盐缓冲液中以10μg/ml注射(流速100μl/min)HSA以使固定水平约为3200RU。固定后，用乙醇胺HCl(流速30μl/min)使表面失活。纳米抗体以45μl/分钟在HSA表面上注射2分钟以使得纳米抗体捕获水平为约200RU。含有先前存在抗体的样品以14,000rpm离心2分钟，上清液在PBS-Tween20(0.005％)中以1：10稀释，然后以45μl/分钟注射2分钟，随后进行400秒解离步骤。在每个循环后(即在新的纳米抗体捕获和血液样品注射步骤之前)，用45μl/min的2分钟注射HCl(100mM)再生HSA表面。用ProteOn Manager 3.1.0(Bio-Rad Laboratories，Inc.)进行传感图处理和数据分析。通过减去1)纳米抗体-HSA解离和2)与参考配体泳道的非特异性结合，在双重参考之后获得显示先前存在的抗体结合的传感图。通过在125秒(结合结束后5秒)设定报告点来确定先前存在的抗体的结合水平。相对于参照纳米抗体在125秒时的结合水平计算先前存在的抗体结合的减少百分比。

使用ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories，Inc.)评估在单克隆抗FLAG M2(Sigma)上捕获的FLAG-标记的纳米抗体上先前存在的抗体的结合情况下，使用PBS/吐温(磷酸盐缓冲盐水，pH7.4，0.005％吐温20)作为运行缓冲液，并且实验在25℃下进行。ProteOn GLC传感器芯片的配体泳道用EDC/NHS(流速30μl/min)活化，并且将抗FLAG M2mAb以10μg/ml注射到ProteOn乙酸盐缓冲液pH4.5(流速100μl/min)中以提供约4000RU的固定水平。固定后，用乙醇胺HCl(流速30μl/min)使表面失活。纳米抗体以45μl/分钟在抗FLAGM2表面上注射2分钟以产生大约100RU的纳米抗体捕获水平。为了减少血液样品与抗FLAGM2表面的非特异性结合，将100nM 3xFLAG肽(Sigma)加入到血液样品中。含有先前存在的抗体的样品以14,000rpm离心2分钟，上清液在PBS-Tween20(0.005％)中以1∶10稀释，然后以45μl/分钟注射2分钟，随后进行600秒解离步骤。在每个循环后(即在新的纳米抗体捕获和血液样品注射步骤之前)，以150μl/分钟用10秒注射甘氨酸pH1.5(10mM)再生抗FLAG M2表面。用ProteOn Manager 3.1.0(Bio-Rad Laboratories，Inc.)进行传感图处理和数据分析。通过减去1)纳米抗体-抗-FLAG M2解离和2)与参考配体泳道的非特异性结合，在双重参考之后获得显示先前存在的抗体结合的传感图。通过在125秒(结合结束后5秒)设定报告点来确定先前存在的抗体的结合水平。相对于参照纳米抗体在125秒时的结合水平计算先前存在的抗体结合的百分比减少。

实施例1：在参比A(SEQ ID NO：1)中引入本发明的突变导致先前存在的抗体的结合减少

对参比A(SEQ ID NO：1)和参比A的携带C端丙氨酸延伸和本发明的代表性突变的改进变体的两个代表性实例([参比A(L11V，V89L)-A]和[参比A(L11V，V89L，T110K)-A]，均用N端HIS6-FLAG3标签进行测试，参见SEQ ID NO：71)测试了来自健康的人类志愿者的96个血清样品中存在的先前存在的抗体的结合。使用FLAG-标签捕获化合物，并根据本实验部分的序言中给出的方案使用ProteOn测量结合。

结果如图5所示。图6列出了形成图5中数据点之一的每个样品的结果。

可以看出，对于所测试的96个样品中的大多数，引入根据本发明的突变导致先前存在的抗体结合减少，其中减少的程度通常取决于先前存在的抗体在每个样品都能够结合参比A的水平。

实施例2：在参比B(SEQ ID NO：8)中引入本发明的突变导致先前存在的抗体的结合减少。

对参比B(SEQ ID NO：8)和参比A的携带C端丙氨酸延伸和本发明的代表性突变的改进变体的两个代表性实例(([参比B(L11V，V89L)-A]和[参比B(L11V，V89L，T110K)-A]，均用N端HIS6-FLAG3标签进行测试，参见SEQ ID NO：71)测试了来自健康的人类志愿者的96个血清样品中存在的先前存在的抗体的结合。使用FLAG-标签捕获化合物，并根据本实验部分的序言中给出的方案使用ProteOn测量结合。

结果如图7所示。图8列出了形成图7中数据点之一的每个样品的结果。

可以看出，对于所测试的96个样品中的大多数，引入根据本发明的突变导致先前存在的抗体结合减少，其中减少的程度通常取决于先前存在的抗体在每个样品都能够结合参比A的程度。

实施例3：1c81的进一步序列优化。

在序列优化过程中，试图(1)敲除用于翻译后修饰(PTM)的位点；(2)人源化亲本纳米抗体；以及(3)敲除潜在的先前存在的抗体的表位。同时，纳米抗体的功能和生物物理特性应该优选保存或甚至改善。

在实施例2中已经鉴定并消除了潜在的先前存在的抗体的表位。在该实施例中，鉴定和阐述了用于人源化和潜在PTM的位点。

具体而言，为了人源化，使ISVD序列与人IGHV3-IGHJ种系共有序列更加同源。除了VHH“标志”残基之外，在ISVD和人类IGHV3-IGHJ种系共有序列之间不同的框架区中的特定氨基酸以这样的方式改变为人类对应物，所述方式使得蛋白质结构，活性和稳定性保持完整。为此，鉴于人类IGHV3-IGHJ种系共有序列，详细阐述了1c81的所有可能的排列。

在进一步序列优化的过程中，特别考虑的氨基酸残基是10G，14P，45R，72D，74S，75K，77T，82M，83R和108L。

3.1 稳定性

作为第一次评估，评估了作为无标记蛋白质产生的SO变体在大肠杆菌中的溶解度，尤其是通过肉眼检查和根据标准分光光度法测量在OD340nm处的聚集，详细阐述了在纯化过程的各个步骤期间(例如浓缩，冷冻/融化之后)的稳定性。值＞0.1的OD340nm指示可能的聚集。

纳米抗体通过亲和层析纯化并在Dulbecco′s PBS中重构。使用VivaSpin柱(MWCO5000，PES)浓缩浓度低于5mg/mL的样品。纳米抗体F024500044(WT)显示蛋白质损失和沉淀。使用低结合Durapore 0.22μ mPVDF膜(MilliPore)过滤样品。使用Trinean Dropsense测量过滤样品的浓度。样品储存在-20℃，解冻后进行离心步骤，并重新测量蛋白质浓度以评估冷冻/融化敏感性。

结果如表3.1所示

表3.1

得出结论：与野生型1c81相比，所有变体显示出改善的溶解性。然而，对于两种变体，观察到一些聚集，导致蛋白质的轻微损失。

3.2 功能性

接下来，评估了与野生型1c81相比，SO变体的功能性。具体而言，基本上根据WO2013/178783所述的方法在mP2X7-HEK细胞中评估对ATP介导的Ca²⁺流入的抑制。

简而言之，通过在装有用以维持37℃的恒定样品温度的红外灯的FACS-CantoII(BD)上通过实时流式细胞术监测P2X7的门控。HEK293-hP2X7细胞在37℃下用2μM Fluo-4钙指示剂(Invitrogen)加载20分钟，并洗涤两次。在存在或不存在单价纯化的纳米抗体(10nM或100nM)的情况下，将沉淀的细胞重悬于补充有Ca²⁺，Mg²⁺和0.1％BSA的PBS中。将细胞保持在冰上并在分析前在水浴中调节至37℃1分钟。加入ATP(Sigma-Aldrich)至终浓度5mM，记录细胞中Fluo-4摄取的平均荧光强度30分钟。

结果显示在图9中，图9显示Hek-mP2X7细胞中抗P2X7 1c81 SO变体的ATP-介导的钙摄取的抑制。图A：在添加ATP后100nM和10nM浓度的变体的直接测量的钙吸收。图B：以100nM浓度测试的变体随时间记录的钙摄取。

从结果可以得出结论，两个SO变体(#45和#50)在阻断P2X7时保持完全亲和力和功能性，与野生型1c81(#44)相似，而其他变体的结合亲和力变化，因为它们似乎在该测定中在30分钟的时间范围内不完全阻断ATP介导的钙流入。

3.3 稳定性测试

变体F024500050(#50)进行进一步的稳定性测试。特别是#50受到强制氧化和温度胁迫。

为了测试温度胁迫，将样品在升高的温度即25℃和40℃下储存4周，之后使用完整质量LC-MS和/或肽图LC-MS(Agilent 1290 Infinity UHPLC系统和Agilent Q-TOF质谱仪)分析样品。将结果与储存在-20℃的参考物质进行比较。

为了测试化学稳定性，将样品在黑暗中用H₂O₂(10mM终浓度)强制氧化3小时。此后，反应在室温下通过甲硫氨酸(112mM终浓度)淬灭1小时。如上所述分析样品用于测试温度样品。

在强制氧化设置中，样品没有表现出任何甲硫氨酸氧化(数据未显示)。

在表3.3中总结了贮存4周时对照和40℃温度胁迫样品的完整质量LC-MS分析结果。

表3.3.在F02450050对照和40℃温度胁迫样品的完整质量LC-MS分析中观察到的峰的概况：4周储存

总之，在强制氧化条件下，没有观察到M氧化。在施加温度胁迫条件下，通过完整质量分析观察到主要是焦谷氨酸形成。同样通过胰蛋白酶肽图分析，观察到主要是焦谷氨酸形成。另外，观察到小的，可忽略的异构化和脱酰胺化量。

#50中的突变E1D实际上消除了焦谷氨酸形成(数据未显示)。因此，优选的突变将是E1D(参见SEQ ID NO：147-153和162-168)。

3.4 结论

可以看出，变体F024500050是特别优选的，因为它在更高的蛋白质浓度下显示出改善的稳定性，同时保留了功能性。该变体F024500050可以与导致通过先前存在的抗体的结合减少的本发明的突变组合(参见实施例2)。优选的突变是L11V，V89L，T110K，Q108L和/或114A，以及E1D和/或N-端丙氨酸，优选所有这些突变。

实施例4：3c23的进一步序列优化。

类似于实施例3，分析序列3c23的序列优化。在实施例2中，鉴定并消除了潜在的先前存在的抗体的表位。

在这个实施例中，人源化和潜在PTM的位点被鉴定并进一步阐述。

4.1 稳定性测试

类似于实施例3.3，对变体F024500016(#16；SEQ ID NO：87)进行进一步的稳定性测试。特别是，#16受到强制氧化和温度胁迫。

图10给出了F024500016对照和强制氧化样品的完整质量色谱图。仅观察到前峰区域的非常小的增加，表明在该纳米抗体中不存在易于氧化的甲硫氨酸。

图11给出了F024500016对照和温度胁迫样品的完整质量色谱图。

在温度胁迫下，主要观察到焦谷氨酸形成。仅观察到非常少量的氧化，脱酰胺和完整的+12Da。

基于这些结果，E1D是优选的突变(参见例如SEQ ID NO：154至161和169至176)。

4.2 人源化

对于人源化，使ISVD序列与人IGHV3-IGHJ种系共有序列更加同源。除了VHH“标志”残基之外，在ISVD和人类IGHV3-IGHJ种系共有序列之间不同的框架区中的特定氨基酸以这样的方式改变为人类对应物，使得蛋白质结构，活性和稳定性保持完整。为此，鉴于人类IGHV3-IGHJ种系共有序列，阐述了3c23的所有可能的排列。

在进一步序列优化的过程中，特别考虑的氨基酸残基是：14P，60A，73N，74S，79Y和83R。各种排列由SEQ ID NO：136-143表示(并基于实施例4.1的结果，包括E1D的SEQ ID NO：154-161和169-176的结果)。

类似于实施例3.1和3.2，可以测试这些变体的稳定性和功能性。

在选择将显示稳定性和功能性的特别优选的序列变体后，可以将该变体与本发明的导致由先前存在的抗体结合减少的突变组合(参见实施例1)。优选的突变是L11V，V89L，T110K，Q108L和/或114A以及E1D和/或N-端丙氨酸，优选所有这些突变。

本申请通篇引用的所有参考文献(包括参考文献，授权专利，公开的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容，特别是对于上文提到的教导，在此明确地通过引用并入本文。

Claims

1.与P2X7受体结合的免疫球蛋白单可变结构域，其具有：

-CDR1，所述CDR1(根据Kabat)为氨基酸序列HYAMG(SEQ ID NO：2)；和

-CDR2，所述CDR2(根据Kabat)为氨基酸序列AISSYGSTDYGDSVKG(SEQ ID NO：3)；和

-CDR3，所述CDR3(根据Kabat)为氨基酸序列ADETLGAVPNFRLHEKYEYEY(SEQ ID NO：4)；

并具有：

和/或具有：

-与SEQ ID NO：1的氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑任何以上列出的可能存在的位置11，89，110或112处的突变，并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；

-C端延伸(X)_n，其中n为1至10，优选1至5，例如1，2，3，4或5(并且优选1或2，如1)，并且每个X是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选择，并且优选独立地选自由丙氨酸(A)，甘氨酸(G)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组；

和任选地(即当以单价形式或当存在于本发明多肽的N-末端时)在位置1具有D(即与SEQ ID NO：1相比的EID突变)，

其中：

-基于3c23的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

2.与P2X7受体结合的免疫球蛋白单可变结构域，其具有：

-CDR1，所述CDR1(根据Kabat)为氨基酸序列FSTSTMG(SEQ ID NO：9)；和

-CDR2，所述CDR2(根据Kabat)为氨基酸序列AIDWSDFNTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)；和

-CDR3，所述CDR3(根据Kabat)为氨基酸序列HSETRGGTRYFDRPSLYNY(SEQ ID NO：11)；

并具有：

和/或具有：

-与SEQ ID NO：8的氨基酸序列不超过7个，例如不超过5个，优选不超过3个，例如仅有3个，2个或1个“氨基酸差异”(如本文所定义的，并且不考虑任何以上列出的可能存在的位置11，89，110或112处的突变，并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在的话，可以存在于框架和/或CDR中，但优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)：

其中：

-基于1c81的结合剂的位置11处的氨基酸残基优选选自L或V；和

3.多肽，其包含至少一个权利要求1的免疫球蛋白单可变结构域和/或至少一个权利要求2的免疫球蛋白单可变结构域。

4.根据权利要求3的多肽，其包含至少一个权利要求1的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个权利要求2的免疫球蛋白单可变结构域。