KR20190031259A - 결합 단백질-소분자 콘주게이트의 ev-매개 전달 - Google Patents

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KR20190031259A
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Abstract

본 발명은 결합 단백질 및 소분자 제제, 통상 소분자 약물을 포함하는 단백질-약물 컨쥬게이트의 전달에 사용될 수 있는 결합 단백질을 포함하는 세포외 소포(EV)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 세포외 소포를 생산하는 방법, 뿐만 아니라 상기 세포외 소포의 약학적 조성물 및 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

결합 단백질-소분자 콘주게이트의 EV-매개 전달
본 발명은 결합 단백질 및 소분자 제제, 전형적으로 소분자 약물을 포함하는 단백질-약물 콘주게이트를 전달하기 위한 결합 단백질을 포함하는 세포외 소포(EV)에 관한 것이다.
세포외 소포(EV)는 표적 조직에서 수여자 세포에 그것의 내용물(주로 RNA, 단백질 및 지질)을 제시함으로써, 정상적인 생리학 및 병리학에서 세포 간 정보전달(communication)을 조정한다. 다양한 유형의 약리적 제제를 편입시키기 위한 EV의 변경이 수많은 맥락에서, 예를 들어 WO2013/084000(생물학적 치료제의 세포내 전달을 위한 엑소좀의 사용이 개시됨), 또는 WO2010/119256(엑소좀을 사용한 외인성 유전 물질의 전달이 기술됨)에서 탐구된 바 있다.
EV의 약물 전달 운반체로서의 유용성은 예를 들어 핵산 기반 약물, 예컨대 세포내 성분을 표적으로 하는 siRNA, 큰 단백질-기반 약물, 및 예를 들어 난용성 또는 독성이 큰 소분자 치료제의 경우에 의심할 여지가 없다. WO2011/097480에서도 상당히 탐구된 바 있는데, EV-매개된 소분자 약물 전달이 또한 예를 들어 EV의 약물 장입에 대한 전형적인 접근법을 나타낸다. WO2011/097480은 예를 들어 식물화학적(phytochemical) 소분자 제제 쿠르쿠민 및 레스베라트롤이 간단한 공동-배양 단계를 사용하여 EV로 장입하는 매우 용이한 방법에 대해 개시하고 있는데, 그 동안 정제된 EV 및 유리 약물(예를 들어, 쿠르쿠민)은 상기 약물의 EV로의 확산에 의존하여, 실온에서 함께 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중에 배양되게 된다. 비록 소분자 제제를 EV에 장입시키는 이와 같은 종래의 접근법이 상당히 편리하고 간단하지만, 특별히 효율적이지 않아서, 상기 소분자 제제의 상당한 폐기를 초래한다. 또한, 장입 과정은 제어하기 꽤 어려울 수 있다. 또한 다른 이들(예를 들어 Fuhrman 등, J. Control Rel., 2015)은 광활성 소분자 제제 포르피린의 경우에 장입 효율을 증가시키기 위한 방법으로, 사포닌과 같은 계면활성제를 사용하여, EV의 침투도를 평가한 바 있다.
최근 특허 출원(WO2015/120150)은 또한 다양한 유형의 항암 약물과 함께, 소분자 및 큰 생물약제 모두를 포괄하는 종양-유도 EV의 장입에 관한 것이다. 그러나, 당해 기술의 경우가 종종 그러하듯이, 엑소좀을 장입할 방법에 대한 정보가 거의 전무하며, 만약 이용가능한 방법이 있다고 하더라도 이들 방법은 소분자-운반 EV의 장입 및 실제 치료에의 적용에는 전혀 유용하지 않다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 목적은 후속적인 치료 적용을 위한 소분자 제제(전형적으로 소분자 약물 또는 진단제)의 EV로의 장입과 관련된 상기 확인된 문제를 극복하기 위한 것이다. 게다가, 본 발명은 당해기술에 존재하는 다른 기존 요구들, 예컨대 소분자 제제, 뿐만 아니라 소분자와 EV 상에 존재하는 결합 단백질 사이의 콘주게이트(본원에서 결합 단백질-소분자 콘주게이트 및 유사한 용어들로 칭함)를 표적화 및 통제가능한 방식으로 효과적으로 전달하고자 하는 필요성을 만족시키는 것이다.
본 발명은 치료적 및/또는 예방적 효과가 있는 소분자 제제, 또는 소분자 제제와 결합 단백질과의 조합물 중 어느 하나를 위해 EV를 전달 양식(delivery modality)으로 사용함으로써, 이들 및 기타 목적을 달성한다. 본 발명과 관련된 EV는 전형적으로 결합 단백질을 포함할 수 있는데, 이는 적어도 하나의 소분자 제제(예컨대, 소분자 약물)에 대한 상호작용 파트너(즉 결합제)로 작용하는 치료적 단백질(예컨대, 수용체)일 수 있다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 결합 단백질을 포함하는 EV에 관한 것으로, 소분자 제제가 상기 결합 단백질에 결합되는 것을 특징으로 한다. 상기 결합제 단백질은 몇 개의 상이한 역할들을 수행할 수 있다: 예를 들어 (i) 주로 그것에 부착된 소분자 제제를 운반하려고 의도된 담체 및/또는 전달 양식, (ⅱ) 상기 결합제 단백질-소분자 콘주게이트를 특정 위치로 운반하는 EV의 수송을 유도하는 표적 치료제, (ⅲ) 효능적 또는 길항적 효과를 나타낼 수 있는, 소분자의 부착을 통해 치료적으로 활성화 또는 불활성화되는 치료 활성 단백질, (ⅳ) 그것의 전달대상 소분자의 존재 또는 부재 하에 세포 및/또는 신체 변화 및 관련된 치료적 및/또는 예방적 효과에 작용하거나 또는 기여하는 신호전달 단백질일 수 있다. 상기 결합 단백질은 적합한 위치에 상기 소분자 제제를 방출함으로써 추가로 신체 및/또는 세포 작용 또는 활성 및 관련된 치료 효과에 기여하거나, 또는 그것에 결합된 소분자 제제를 유지시킴으로써 그와 같은 효과에 기여할 수 있다.
유리한 구현예에서, 상기 결합 단백질은 상기 결합 단백질과 EV 단백질을 포함하는 융합 단백질로, 이것은 상기 EV 표면 상에 상기 결합 단백질의 제어된 장입 및 제시를 가능하게 하기 위한 것이다. 그러나, EV의 자연 발생적인 결합 단백질 또는 EV에 왕복하도록 조작된 결합 단백질도 또한 본 발명의 범위에 포함되며, 상기 결합 단백질의 선택 및/또는 설계는 치료 대상 질환, 약리적 표적 및 상기 결합 단백질이 결합된 소분자 제제에 의해 큰 영향을 받는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 신호 전달을 조절하는 방법에 관한 것으로, 이것은 소분자 제제가 EV에 표시된 결합 단백질과 비-공유적으로 또는 공유적으로 상호작용하도록 허용하는 단계, 및 후속적으로 상기 수득된 결합 단백질-소분자 약물 콘주게이트, 상기 결합 단백질 자체, 및/또는 상기 결합 단백질에 결합된 소분자 제제를 특정 표적 및/또는 표적 위치에 노출시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 EV의 생산 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은 (a) EV 단백질과의 융합 단백질의 형태로 결합 단백질을 포함하는 EV를 제공하는 단계, 및 (b) 상기 결합 단백질을 소분자 제제에 노출시켜 상기 소분자 제제가 상기 결합 단백질과 상호작용 및 결합하도록 하는 단계를 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명은 또한 결합 단백질, 결합 단백질-소분자 콘주게이트, 및/또는 소분자를 전달하는 방법에 관한 것으로, 이것은 (a) 본 발명에 따른 EV를 제공하는 단계, 및 (b) 상기 결합 단백질, 상기 결합 단백질-소분자 콘주게이트, 및/또는 상기 소분자 제제(전형적으로, 소분자 약물)를 표적 위치에 전달하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 소분자 제제는 다양한 약물 제제 및/또는 진단제 범주에서 선택될 수 있는데, 예를 들어 항암제, 예컨대 독소루비신, 5-플루오로우라실, 또는 다른 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 시토신 아라비노시드, 프로테아솜 저해제 예컨대 보르테조밉, 또는 키나아제 저해제, 예컨대 이마티닙 또는 셀리시클립, 또는 NSAID류, 예컨대 나프록센, 아스피린, 또는 셀레콕십, 항생제 예컨대 헤라실린, 또는 혈압강하제, 예컨대 에날라프릴과 같은 ACE 저해제, ARBs, 예컨대 칸데사르탄에서 선택될 수 있다. 다양한 유형의 이종- 또는 동종- 이량체, 삼량체, 또는 다량체 소분자 제제는 또한 그와 같은 제제가 상기 결합 단백질과, 관심대상인 또 다른 단백질 또는 비-단백질 표적 분자 사이의 상호작용을 용이하게 할 수 있는 한, 본 발명의 범위에 속한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 소분자 약물을 표적 위치, 예컨대 표적 세포, 표적 세포 요소(예컨대, 세포질 또는 핵), 표적 조직, 표적 장기, 또는 임의의 표적 구획(이것은 또한 체액, 예를 들어 혈류 또는 뇌척수액을 포함할 수 있음)에 전달하는 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은 상기 표적 위치를, 결합 단백질과의 콘주게이트 형태 (하기 소분자가 결합 단백질에 결합되었다는 의미에서 콘주게이트)인 소분자, 또는 결합 단백질에서 EV로 방출되거나 또는 상기 EV로부터 방출된 소분자가 장입된 EV에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 소분자 약물의 약동학적 또는 약력학 프로파일을 변경하는 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은 문제의 소분자 EV 상에 및/또는 그 내부에 존재하는 결합 단백질에 장입하는 단계를 포함하되, 이 단계는 문제의 소분자 약물의 생체내 및 잠재적으로 또한 시험관내 특성을 조정하기 위한 것이다.
또는, 추가 양태에서, 본 발명은 결합 단백질-소분자 콘주게이트의 형태로 소분자를 운반하는 EV를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 실제로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적은 수의 EV를 포함할 뿐만 아니라, 사실상 큰 군집 EV도 포함한다. 그와 같은 조성물 중의 EV 농도는 많은 상이한 방식들로 표현될 수 있는데, 예를 들어 단위당(종종, 부피당) 또는 용량당 EV 단백질의 양, 단위당(종종 부피, 동물당, 체중 1kg당) 또는 용량당 EV 또는 입자 개수, 단위당 또는 용량당 소분자 약물의 농도 등으로 표현될 수 있다. 전형적으로, 이와 같은 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 사용하여, 생체내 및 또한 시험관내에서의 사용을 위해 제형화된다.
마지막으로, 본 발명은 또한 EV의 의료 용도 및 적용에 관한 것으로, 예를 들어 염증성 질환, 자가면역 질환, 암, 대사성 장애, 또는 임의의 적합한 질환 또는 장애의 치료, 진단, 예방 또는 모니터링에서, 또는 미용 또는 기타 비-질환 관련 적용을 위한 결합 단백질-소분자 콘주게이트를 포함한다.
도 1은 EV-장입된 APO가 그것의 기능을 유지시키거나 또는 심지어 증가시킴으로써, 다운스트림 예비-생존 FGF-2의 생산 증가를 초래하는 PKA 및 MARK 의존 신호전달을 유도함을 도시한다.
도 2는 ABL1 수용체 티로신 키나아제-이마티닙 콘주게이트를 운반하는 EV가 종양 중량를 감소시키고 생존율을 증가시킴을 도시한다.
도 3은 LPS-유도 급성 패혈증 모델에서 ABL1 수용체 티로신 키나아제-이마티닙 콘주게이트를 운반하는 EV의 효과를 설명한다.
도 4는 MCF7 유방암에 대한 MSC-유래 EV의 항암 효과를 도시하되, 상기 EV는 FKBP12 또는, FKBP12 및 CD63을 포함하는 융합 단백질 중 하나를 포함하는 결합 단백질-소분자 콘주게이트(FKBP12에 결합된 소분자 라파마이신을 운반함)를 포함한다.
도 5는 결합 단백질 CALCL [아드레노메둘린(AM)의 수용체]을 포함하는 EV 또는 EV 단백질 CD81에 융합된 CALCRL에 장입된 아드레노메둘린(AM)을 사용한, 3T3-L1 세포에서의 지방분해의 유도를 도시한다.
본 발명은 특히 신규한 방법, 단백질-소분자 콘주게이트의 전달을 위한 조성물, EV, 소분자, 단백질 생물작용 및/또는 EV의 용도를 기술한다. 또한, 본 발명은 EV 장입 방법, EV의 소분자 운반, 이와 같은 EV를 활용하는 다양한 방법, 치료적 유효량만큼 EV를 포함하는 약제학적 조성물, 및 본 발명에 따른 소분자-운반 EV의 의료 용도에 관한 것이다.
편의상 및 명료성을 위해, 본원에 사용된 특정 용어들이 수집되어 아래와 같이 기재되었다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 특징, 양태, 또는 대안들이 기재된 에 관하여 마쿠쉬 그룹의 용어로 기술된 경우, 당해 분야의 숙련가는 본 발명이 또한 그럼으로써 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 하위그룹의 구성원의 관점에서 기술되었음을 인식할 것이다. 상기 당해 기술의 숙련가는 본 발명이 또한 그럼으로써 마쿠쉬 그룹의 개별 구성원 또는 하위그룹의 구성원의 임의의 조합물의 관점에서 기술되었음을 추가로 이해할 것이다. 추가로 본 발명의 양태 및/또는 구현예 중 하나와 연결되어 기술된 구현예 및 특징들은 본 발명의 기타 모든 양태 및/또는 구현예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용됨을 유의해야 한다. 예를 들어, 소분자-운반 EV와 관련하여 기재된 다양한 소분자는 결합 단백질-소분자 약물 콘주게이트(전부 소분자 제제)를 EV에 장입시키는 방법의 맥락에서 또한 개시, 관련 및 포함되는 것으로 이해되어야 하고, 모든 결합 단백질은 또한 그것의 잠재적인 모든 상호작용 파트너를 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 게다가, 특정 양태와 관련하여 기재된 특정 구현예, 예를 들어 EV로 특정 의료 징후를 치료하는 것에 관한 양태와 관련하여 기술된 바와 같은 소분자-운반 EV의 투여 경로가 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것들과 같은 기타 양태 및/또는 구현예와 연관되어 자연스럽게 관련이 있을 것이다. 또한, 임의의 모든 특징들(예를 들어 마쿠쉬 그룹의 임의의 모든 구성원)이 임의의 모든 기타 특징들(예를 들어 임의의 마쿠쉬 그룹의 임의의 모든 구성원)과 자유롭게 조합될 수 있는데, 예를 들어, 본 발명의 요지에서 벗어나지 않으면서 임의의 결합 단백질은 임의의 소분자 제제와 조합될 수 있고, 또는 임의의 결합 단백질은 임의의 EV 단백질과 조합될 수 있다. 게다가, 본원의 교시가 EV 단독으로 지칭하거나 및/또는 별개의 천연 나노입자-유사 소포로서 지칭할 경우, 그와 같은 모든 교시는 복수의 EV 및 EV의 군집에 대해 동등하게 관련되며 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 일반적인 언급으로, 본 발명에 따른 소분자 제제, 결합 단백질, 표적화 모이어티, 세포 공급원, EV 단백질, 및 기타 모든 양태, 구현예 및 대안은 본 발명의 범위와 요지에서 벗어나지 않으면서 임의의 모든 가능한 조합으로 자유롭게 조합될 수 있다. 게다가, 본 발명의 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열(각각 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열)은, 임의의 주어진 분자가 그것과 관련된 기술적 효과를 발휘할 능력을 보유하는 한, 최초 폴리펩타이드에서 상당히 벗어날 수 있다. 그것의 생물학적 특성이 유지되는 한, 본원에 따른 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 서열과 비교하여 되도록 높은 서열 동일성(예를 들어 60%, 70%, 80%, 또는 예를 들어 90% 이상)이 바람직하기는 하나, 50%의 편차 (예를 들어 BLAST 또는 ClustalW를 사용하여 계산됨)이 있을 수 있다. 예를 들어 적어도 하나의 결합제 단백질 및 적어도 하나의 엑소좀 단백질의 조합물(융합)은 각각의 폴리펩타이드의 특정 분절이 대체되거나 및/또는 변형 되었을 수 있음을 시사하고, 이것은 핵심 특성(예를 들어 표적화 특성, 엑소좀의 표면으로의 이동, 치료적 활성, 소분자 제제에 결합 등)이 보존되는 한 천연 서열과의 편차가 상당할 수 있음을 의미한다. 따라서 자연적으로 유사한 논리가 그와 같은 폴리펩타이드의 폴리뉴클레오타이드 서열 인코딩에 적용된다.
용어들 "세포외 소포" 또는 "EV" 또는 "엑소좀"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 형태로 세포에서 수득 가능한 임의의 유형의 소포, 예를 들어 미세소포(예컨대, 세포의 원형질막에서 나온 임의의 소포), 엑소좀(예컨대, 엔도-리소좀 경로에서 유래된 임의의 소포), 세포자멸체(예컨대, 세포자멸적 세포에서 수득 가능), 극미립자(예컨대 혈소판에서 유래될 수 있음), 엑토좀(예컨대 혈청 중 중성구 및 단핵구에서 유래 가능), 프로스타토좀(예컨대, 전립선암 세포에서 수득 가능), 또는 카디오좀(예컨대, 심장 세포에서 유래 가능) 등을 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 상기 용어들은 또한 지질단백질 입자, 예컨대 LDL, VLDL, HDL 및 카일로마이크론 뿐만 아니라, 리포좀, 하이브리드 소포, 세포외 소포(EV) 모방체, 막 압출 또는 다른 기술을 통해 수득된 세포막-기반 소포를 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 본질적으로, 본 발명은 관심대상인 소분자의 전달 또는 운송 운반체로서 작용할 수 있는 임의의 유형의 지질-기반 구조(소포성 형태 또는 적합한 형태의 임의의 다른 유형)에 관한 것일 수 있다. EV의 의료 및 과학적 용도 및 적용을 기술 할 때, 본 발명은 정상적으로 복수의 EV, 즉 EV를 수천 개, 수백만 개, 수십억 개 또는 심지어 수조 개 포함할 수 있는 EV의 군집에 관한 것임이 숙련가에게 명백할 것이다. 하기의 실험 부문에서 볼 수 있듯이, EV는 부피 단위당(예를 들어, /mL) 농도, 예컨대 1010, 1011, 1015, 1018, 1025 개의 EV(종종 일명 "입자"라고도 함), 또는 이들보다 더 크거나 더 작거나 또는 이들 사이의 어느 숫자로 존재할 수 있다. 동일한 맥락에서, 예를 들어 특정 소분자를 포함하는 EV와 관련될 수 있는 용어 "군집"은 그와 같은 군집을 구성하는 본질적으로 유사한 복수의 독립체를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 다시 말하면, 개별적인 EV는 복수로 존재할 때 EV 군집을 구성한다.
따라서, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 발명은 정상적으로 결합 단백질에 결합된, 소분자를 포함하는 개별 EV 및 상기 소분자를 포함하는 EV를 포함하는 군집 모두에 관한 것이다. 생체내로 적용될 때 EV의 투약량은 당연히 치료 대상 질환, 투여 경로, 전달대상 소분자 등에 따라 상당히 달라질 수 있다.
용어 "소분자 제제" 또는 "소분자" 또는 "소분자 약물" 또는 "치료적 소분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 진단용으로, 그리고 또한 예컨대 결합 단백질의 활성 및/또는 결합 및/또는 위치를 조정 또는 변경하기 위해 사용될 수 있는 임의의 분자 제제에 관한 것으로 이해되어야 한다. 소분자 제제는 정상적으로 화학적 합성 수단을 통해 합성되지만, 또한, 예를 들어 천연 공급원에서의 정제를 통해 자연스럽게 유래되거나, 또는 임의의 다른 적당한 수단 또는 기술들의 조합을 통해 수득될 수 있다. "소분자"의 간략하고 비제한적인 정의는 본질적으로 임의의 방식으로 생물학적 과정을 규제하고, 영향을 주거나 또는 영향을 미칠 수 있는 분자량이 900g/mol(달톤) 미만인 임의의 유기 화합물이다. 본 발명의 목적에 맞게, 소분자는 실질적으로 900g/mol 초과, 예를 들어 1500g/mol, 3000g/mol, 또는 가끔은 그것보다 클 수 있다. 전반적으로, 분자량 및/또는 분자 크기는 소분자 제제를 구성하는 구성체들의 배우의 인자들을 규정하지 않는다. 사실상, 본 발명의 목적에 따라, EV 상에 표시된 결합 단백질에 의해 결합될 수 있는 임의의 제제가 "소분자 제제"로 간주된다. 이와 같이, 합성 및 천연 펩타이드, 천연 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA-기반 제제, 및 심지어 단백질은, 이들이 상기 결합 단백질에 의해 결합될 수 있는 한, 본 발명에 있어서 소분자 제제로 간주된다. 특정 구현예에서, 상기 소분자 제제는 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), CRISPR 가이드 RNA 가닥, mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 스플라이싱-변환 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA 분자의 임의의 다른 유형일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 소분자 제제는 펩타이드, 예컨대 수용체 리간드, 뉴로펩타이드, Aβ 저해제, 세포-침투 펩타이드(CPP), 엔도좀 탈출을 유도하는 펩타이드, 표적화 펩타이드, 또는 임의의 다른 적합한 펩타이드일 수 있다. 소분자가 종종 양호한 경구 생체이용률을 보이긴 하지만, 약동학적, 약력학, 및/또는 독성 또는 안정성의 이유로 많은 소분자 약물이 정맥내로 또는 일부 다른 투여 경로를 통해 주어질 필요가 있다. 소분자의 예에는 항암제, 예컨대 독소루비신, 다우노루비신, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 프로테아솜 저해제, 예컨대 보르테조밉, 또는 키나아제 저해제, 예컨대 이마티닙 또는 셀리시클립, NSAID류, 예컨대 나프록센, 아스피린, 또는 셀레콕십, 항생제 예컨대 헤라실린, 혈압강하제, 예컨대 ACE 저해제 예컨대 에날라프릴, ARBs, 예컨대 칸데사르탄, 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 siRNA, 스플라이싱-변환 RNA, 펩타이드, 헤테로이량체 또는 동종이량체 소분자 등이 포함된다. 본 발명은 당해 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이 본 발명의 요지에서 벗어나지 않으면서 본질적으로 임의의 다른 소분자에 자연스럽게 적용가능 하다.
용어들 "결합제 단백질, "결합 단백질", "결합제", "수용체 단백질" 및 유사한 용어들은 상호교환적으로 사용되고, 소분자 제제가 비-공유 또는 공유결합을 통해, 또는 공유 및 비-공유 상호작용의 조합을 통해, 부착될 수 있는 임의의 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드(즉, 아미노산의 서열을 포함하는 임의의 분자)에 관한 것으로 이해되어야 한다. 결합 단백질 및 소분자 제제의 조합물이 예컨대 "결합 단백질-소분자 콘주게이트" 또는 "결합 단백질-소분자 약물 콘주게이트" 또는 "결합 단백질-소분자 제제 콘주게이트", 또는 단지 "콘주게이트"라는 용어들을 사용하여 본원에 기재되었다. 결합 단백질은 몇 개의 상이한 역할을 수행할 수 있다: 이것은 예를 들어 (i) 주로 그것에 부착된 소분자 제제를 주로 운송하도록 의도된 담체 및/또는 전달 양식일 수 있고, (ⅱ) 결합제 단백질-소분자 콘주게이트를 특정 위치로 운반하는 EV이동을 지시하는 표적 치료제, (ⅲ) 소분자의 부착을 통해 치료적으로 활성 또는 불활성이 되는 치료차원의 활성 단백질(효능적 또는 길항적 효과를 보일 수 있음), (ⅳ) 전달대상 소분자와 함께 또는 그것 없이 세포 및/또는 신체 변화에 기여할 수 있고, 관련된 치료적 및/또는 예방적 효과를 보이는 신호전달 단백질, (v) 또 다른 단백질에 근접되었을 때 특정 반응을 수행하거나 또는 촉매화하는 단백질 등일 수 있다. 결합 단백질은 추가로 적합한 위치에서 소분자 제제를 방출함으로써 신체 및/또는 세포 작용 또는 활성 및 관련된 치료 효과에 기여하거나, 또는 그것에 결합된 소분자 제제를 보유함으로서, 그와 같은 효과에 기여할 수 있다. 첫 번째 경우의 예는, 결합 단백질이 EV로 매개된 전달 후 표적 세포 내부에 소분자 약물을 방출하는 경우인 반면, 두 번째 경우의 예는 종양으로의 항체-소분자 약물 콘주게이트의 전달이다. 비록 특정 사례에서 결합 단백질은 임의의 다른 종(예컨대, 비-제한적인 예를 사용하여, 결합 단백질이 Cas9와 같은 뉴클레아제, 박테리아 단백질인 경우)에서 수득 가능함이 당해기술의 숙련가에게 알려진 사실이지만, 전형적으로, 상기 결합 단백질은 인간에게서 기원된 것이다. 게다가, 결합 단백질은 원하는 효과(상기 효과는 전달, 치료적 활성, 표적화 등에 관련될 수 있음)가 유지되는 한, 반드시 전체로 존재할 필요가 없고, 하위단위, 도메인, 절단된 단백질, 그것의 유도체 또는 변이체의 형태로 존재할 수 있다. 결합 단백질은 EV 및/또는 EV 공급원 세포에서 자연 발생하거나, 또는 이들은 EV 단백질과의 융합 구성체를 통해 EV로 이동될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 단백질의 비-제한적인 예에는 GPCR류, 다클론성 및 단클론성 항체, 단일 사슬 가변성 단편(scFv), 인테그린, 효소 예컨대 티로신 키나아제(예를 들어 BTK 또는 Bcr-Abl 티로신 키나아제), 뉴클레아제 예컨대 Cas 및 Cas9, 프로테아제, 인테그라제, 포스파타제, 리가제, GTPase류, DNA-결합 및 RNA-결합 단백질 예컨대 Ago2, 다이서(Dicer), GW182, hnRNPAI, hnRNPA2B1, DDX4. ADAD1, DAZL, ELAVL4, IGF2BP3, SAMD4A, TDP43, FUS, FMR1, FXR1, FXR2, EIF4A1 -3, MS2 코트 단백질; 아로마타제 또는 에스테라제, 어댑터 단백질(예컨대 SH2 도메인), G-단백질류, GEF류, 칼모듈린, Ras, 탈린, 빈쿨린, 팍실린, Raf, 카스파제, 전사 인자, 예컨대 MyoD 및 Myf5, 종양 억제인자 예컨대 p53, 신경친화성 인자 예컨대 뇌-유래된 신경친화성 인자(BDNF) 및 신경 성장 인자, 신경전달물질 수용체, 도파민 수용체, 구조 단백질, 예컨대 디스트로핀, 우트로핀, 티틴, 네불린, 디스트로핀-관련된 단백질 예컨대 디스트로브레빈, 신트로핀, 신코일린, 데스민, 사르코글리칸, 디스트로글리칸, 사르코스판, 아그린 및/또는 푸쿠틴, 인터류킨, 예컨대 IL1 알파 및 베타, IL2, IL4, IL6, IL10, IL17, IL23, 및 다른 인터류킨 및 모든 인터류킨 수용체, 예컨대 IL2R, IL6R, gp130, IL10R, IL17R, IL23R, 인터페론(예컨대 INF 알파 및 베타) 및 인터페론 수용체, 종양 괴사 인자(TNFs) 예컨대 TNF 알파 및 베타 및 그것의 수용체, 아넥신, 예컨대 ANXA2 및 ANXA5, 신호 인식 입자 및 수용체 성분 예컨대 SRPB2 및 SRP54, 세포외 기질 성분 예컨대 COL1 A1 및 COL6A1, 용질 운반체 SLC25A5 및 SLC25A13, 리보솜 단백질 RPS27A 및 RPL7, 번역 신장 인자, 예컨대 EEF1A1 및 EEF1A2, 개시 인자 예컨대 EIF4A1 및 EIF4A2, GPI-고정된 단백질, 테트라스파닌 예컨대 CD63 및 CD81, 조직 인자, 성장 인자 및 그것의 수용체, 예컨대 EGF 및 EGFR, 및 상기 결합 단백질의 임의의 융합, 조합물, 하위단위, 유도체, 또는 도메인이 포함된다.
용어들 "EV 단백질", "엑소좀 단백질", "엑소좀 분류 도메인", "EV 분류 도메인", "EV 분류 단백질", "엑소좀 단백질", "엑소좀 폴리펩타이드", "EV 폴리펩타이드"등이 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이들이 적합한 소포성 구조, 즉 적합한 EV로 폴리펩타이드 구조체(전형적으로 EV 단백질을 비롯하여, 관심대상인 적어도 하나의 단백질을 포함함)를 운송하기 위해 이용될 수 있는 임의의 폴리펩타이드에 관한 것으로 이해되어야 한다. 더 구체적으로, 상기 용어들은 소포성 구조, 예컨대 엑소좀에 폴리펩타이드 구성체의 운송, 이동 또는 왕복이동을 가능하게 하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그와 같은 엑소좀 분류 도메인의 예는 예를 들어 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD1 38, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1 CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 및 이들의 임의의 조합물이되, 폴리펩타이드 구성체를 EV로 운송할 수 있는 수많은 다른 폴리펩타이드가 본 발명의 범위내에 속한다. 본 발명에 따른 EV 단백질은 전형적으로 인간에서 기원하며, 공공적으로 이용가능한 다양한 데이터베이스, 예컨대 Uniprot, RCSB 등에서 발견될 수 있다. EV 단백질은 다양한 다른 단백질 및/또는 단백질 도메인에 융합되어, 예를 들어 표면 표시를 향상시키고, 결합능을 증가시키며, 또는 특정 유형의 결합 단백질과 비-공유 방식의 상호작용을 가능하게 한다.
용어들 "공급원 세포" 또는 "EV 공급원 세포" 또는 "친계 세포" 또는 "세포 공급원" 또는 "EV-생산 세포" 또는 임의의 다른 유사한 용어는 적합한 세포 배양 조건 하에서, EV, 예를 들어 엑소좀을 생산할 수 있는 임의의 유형의 세포에 관한 것으로 이해될 수 있다. 그와 같은 조건들은 배양 시스템의 현탁액 세포 배양액 또는 부착 배양액 또는 임의의 다른 유형일 수 있다. 중공-섬유 생물반응기, 교반 탱크 생물반응기 및 생물반응기의 다른 유형은 상당히 적합한 세포 배양 기반시설을 대표한다. 본 발명에 따른 공급원 세포는 광범위한 세포 및 세포주, 예를 들어 간엽 또는 기질 세포 또는 섬유모세포(예를 들어 골수, 지방 조직, 워턴 젤리, 출산 전후 조직, 잇몸, 탯줄 혈액, 피부 조직 등), 양막 세포 및 더 구체적으로 다양한 조기 표식을 선택적으로 표현하는 양막 상피 세포, 골수 억제 세포에서 선택될 수 있다. 특정 관심대상인 세포주에는 인간 탯줄 내피 세포(HUVEC), 인간 배아 신장(HEK) 세포, 내피 세포주 예컨대 미세혈관 또는 림프 내피 세포, 연골세포, MSC, 기도 또는 폐포 상피 세포, 및 세포 공급원의 다양한 다른 비-제한적인 예에서 선택될 수 있다.
공급원 세포는 치료 대상 환자에게 본질적으로 동종이계, 자가조직, 또는 심지어 이종발생성일 수 있는데, 즉 상기 세포는 환자 자신에게서 유래되거나 또는 관련이 없는, 일치된 또는 일치되지 않은 공여체에서 유래될 수 있다. 특정 문맥에서, 동종이계 세포는 후방지원의 관점에서, 그와 같은 공급원이 재고 요법을 허용하기 때문에, 바람직할 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 결합 단백질을 포함하는 EV에 관한 것이되, 소분자 제제(예를 들어, 소분자 약물)이 상기 결합 단백질에 결합되어 있다. 전형적으로, 상기 소분자 제제는 비-공유결합/연결기를 통한 결합 단백질에 결합되지만, 상기 부착은 또한 공유 상호작용(들)에 기반할 수 있다. 비-공유 상호작용의 비-제한적인 예는 ABL1 수용체 티로신 키나아제 및 소분자 약물 이마티닙 사이의 부착일 수 있다. 결합 단백질 및 소분자 약물 사이의 공유 상호작용의 비-제한적인 예는 전형적으로 항체-약물 콘주게이트 중에 단클론성 항체 및 항암제를 연결하는 공유결합, 예를 들어 브렌툭시맙 및 모노메틸 아우리스타틴 E(브렌툭시맙-베도틴) 사이의 공유결합이다. 비록 유리하지만 소분자 약물, 결합 단백질 및/또는 단백질-약물 콘주게이트가 그것의 원하는 효과를 발현할 수 있는 한 결합 단백질에서 소분자 약물의 방출이 필수요건은 아니다. 방출가능한 공유결합의 적합한 비-제한적인 예에는 환원적 환경에서 환원을 겪을 수 있는 디설파이드 브릿지 및 티오에테르 결합, 예를 들어 프로테아제 및 다른 효소에 의해 절단될 수 있는 아미드 결합, 특정 생체내 조건 하에서 해리되는 바이오틴-스트렙타비딘 연결기 등이 포함된다. 그럼에도 불구하고 소분자 약물의 결합 단백질로의 공유 콘주게이션/연결을 위해 이용가능한 다중 전략이 존재하는데, 비-제한적인 예에는 예컨대 에스테르 결합, 아미드 결합, 디설파이드 결합, 티오에테르 결합, 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용, 말레이미드-NHS 반응을 통해 수득된 연결, EDC-NHS 반응을 통해 수득된 연결, 스테이플 연결(stapled linkage)(예를 들어 모든 탄화수소 스테이플) 및 다양한 다른 결합이 포함된다.
유리한 구현예에서, 결합 단백질은 EV 단백질에 자체 융합된 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 상기 언급된 바와 같이, 결합 단백질은 반드시 전체적으로 단백질일 필요는 없고, 천연 서열과 비교하여 하위단위, 도메인, 유도체, 절단, 또는 아미노산의 변형된 서열의 임의의 다른 유형일 수 있다. 그와 같은 변경의 한 예는 항체를 전체적으로 사용하는 대신에, 항체의 단일 사슬 단편 가변성(scFv) 도메인의 사용이다.
본 발명에 따른 결합 단백질은 본질적으로 본 발명에 따른 소분자와 결합할 수 있는 임의의 단백질이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 단백질의 일부 비제한적인 예에는 GPCR류, 다클론성 및 단클론성 항체, 단일 사슬 가변성 단편(scFv), 인테그린, 효소, 예컨대 티로신 키나아제, 뉴클레아제, 예컨대 Cas 및 Cas9, DNA-결합 또는 RNA-결합 단백질 또는 이것의 도메인, 프로테아제, 리가제, 이소머라제, 인테그라제, 포스파타제, GTPase류, 아로마타제 또는 에스테라제, 어댑터 단백질, 예컨대 SH2 도메인, G-단백질류, GEF류, 칼슘-결합 단백질, 예컨대 칼모듈린, Ras, 탈린, 빈쿨린, 팍실린, Raf, 카스파제, 전사 인자, 예컨대 MyoD 및 Myf5, 종양 억제인자, 예컨대 p53.p21, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7, 및 ST14, 신경친화성 인자, 예컨대 뇌-유래된 신경친화성 인자(BDNF) 및 신경 성장 인자, 구조 단백질, 예컨대 디스트로핀, 우트로핀, 티틴, 네불린, 디스트로핀-관련된 단백질 예컨대 디스트로브레빈, 신트로핀, 신코일린, 데스민, 사르코글리칸, 디스트로글리칸, 사르코스판, 아그린, 및/또는 푸쿠틴, 및 상기 결합 단백질 중 어떤 것의 모든 융합, 조합물, 하위단위, 유도체 또는 도메인이 포함된다.
항체의 형태인 결합 단백질은 비-제한적인 구현예에서 아바고보맙, 압식시맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아펠리무맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 알렘투주맙, 알리모쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아르시투모맙, 아셀리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙, 아토로리무마, 바피뉴주맙, 바실릭시마맙, 바비툭시맙, 벡투무맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비바투주맙 메르탄신, 블리나투모맙, 블로소주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데타이드, 카를루맙, 카투막소맙, cB 96-독소루비신 면역접합체, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 시아자키주, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코나투무맙, 콘시주맙, 크레네주맙, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다라투무맙, 뎀시주맙, 데노수맙, 데투모맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두필루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펀구맙, 엘델루맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에나바투주맙, 엔리모맙 페골, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피지투무맙, 플란보투맙, 폰톨리주맙, 포라이우맙, 포라비루맙, 프레솔리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 젬투주맙 오조가마이신, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 아이크루쿠맙, 이고보맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인플릭시맙, 인테투무맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가마이신, 이필리무맙, 이라투무맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리겔리주맙, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마슬리모맙, 아브릴리무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙 모타비주맙, 목세투무맙 파수독스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 납투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니보이우맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 오나투주맙, 온툭시주맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오티에르투주맙, 옥세이우맙, 오자네주맙, 오조라이주맙, 파기박시맙, 팔리바주맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 펨투무맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리톡사시맙, 프리투무맙, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데타이드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세톡사시맙, 세비루맙, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소네프시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 테피바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, 틸실리무맙, 틸드라키주맙, 티가투주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 토시투모맙, 벡사르, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투비루맙, 우블리툭시맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 반티크투맙, 바팔릭시맙, 바텔리주맙, 베도이이주맙 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼록식시맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙, 졸리모맙 아리톡스 중 임의의 하나 이상 및 이들의 임의의 조합물이 포함된다. 항체는 결합 단백질로 이용된 경우 여러 역할을 수행한다. 예를 들어, 항체는 (i) 관심대상인 세포, 조직 및/또는 기관에 표적화된 전달을 허용하고, (ⅱ) 고유한 치료적 활성을 가지며, (ⅲ) EV 표면에 부착된 경우, 이들은 시험관내 및 생체내에서 표적 세포에 전달될 수 있고, (ⅳ) 소분자 약물 [종종 세포 내의 또는 전신에서 세포외로 항체-약물 콘주게이트(ADC)를 지칭함]을 전달하는 것을 목적으로 하는 결합 단백질로 작용하고, 그리고 (v) 복수의 소분자 제제에 대해 여러 결합 부위를 제공할 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 소분자 약물은 본질적으로 약제학적으로 및/또는 약리적으로 및/또는 진단차원과 관련된 제제, 예를 들어 항암제, 세포증식저해제, 티로신 키나아제 저해제, 스타틴, NSAID류, 항생제, 항진균제, 항균제, 항기생충, 항-염증제, 항-섬유, 혈압강하제, 아로마타제 또는 에스테라제 저해제, 항콜린제, SSRI류, BKT 저해제, PPAR 효능제, HER 저해제, AKT 저해제, BCR-ABL 저해제, 신호 전달 저해제, 혈관신생 저해제, 합성효소 저해제, ALK 저해제, BRAF 저해제, MEK 저해제, PI3K 저해제, 네프릴라이신 저해제, 베타2-효능제, CRTH2 길항제, FXR 효능제, BACE 저해제, 스핑고신-1-포스페이트 수용체 조절물질, MARK 저해제, 헤지호그 신호전달 저해제, MDM2 길항제, LSD1 저해제, 락타마제 저해제, TLR 효능제, TLR 길항제, IDO 저해제, ERK 저해제, Chk1 저해제, 스플라이싱 조절, DNA 또는 RNA 삽입제, 혈관확장제, 단량체, 이종성 또는 동종성 중 하나인 이량체, 삼량체, 및/또는 다량체 소분자의 전체 공간에서 수득될 수 있다. 본 발명에 따른 소분자 약물의 다른 비제한적인 예에는, 예를 들어 에버롤리무스, 트라벡테딘, 아브락산, 파조파닙, 엔자스타우린, 반데타닙, FLT-3 저해제, VEGFR 저해제, EGFR TK 저해제, 아우로라 키나아제 저해제, PIK-1 모듈레이터, Bcl-2 저해제, HDAC 저해제, c-MET 저해제, PARP 저해제, Cdk 저해제, EGFR TK 저해제, IGFR-TK 저해제, 항-HGF 항체, PI3 키나아제 저해제, AKT 저해제, JAK/STAT 저해제, 체크포인트-1 또는 2 저해제, 국부 점착 키나아제 저해제, Map 키나아제 키나아제(mek) 저해제, 페메트렉세드, 에를로티닙, 다사타닙, 닐로티닙, 데카타닙, 파니투무맙, 암루비신, 오레고보맙, 놀라트렉세드, 바타불린, 오파투무맙, 자놀리무맙, 에도테카린, 테트란드린, 루비테칸, 테스밀리펜, 오블리메르센, 틸실리무맙, 이필리무맙, 고시폴, 실렌지타이드, 지마테칸, 루칸톤, 뉴라디압, 비테스판, 탈람파넬, 아트라센탄, 로미뎁신, 수니티닙, 5-플루오로우라실, 보리노스타트, 에토포시드, 젬시타빈, 독소루비신, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 빈크리스틴, 테모졸로마이드, 셀리시클립, 카페시타빈, 캄프토테신, PEG로 표지된 이리노테칸, 타목시펜, 토레미펜 시트레이트, 아나스트라졸, 엑세메스탄, 레트로졸, 바탈라닙, 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드 아세테이트, 트립토렐린 파모에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 랄록시펜, 바이칼루타마이드, 플루타미드, 닐루타마이드, 메게스트롤 아세테이트, 에를로티닙, 라파타닙, 카네르티닙, 로나파르닙, 티피파르닙, 아미포스틴, 수베로이 아나이드 하이드록삼산, 발프로산, 트리코스타틴 소라페닙, 안사크린, 아나그렐라이드, 블레오마이신, 부세렐린, 부설판, 카보플라틴, 카무스틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 에피루비신, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로르에타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타마이드, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 팔미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 트레티노인, 빈데신, 13-시스-레틴산, 페닐알라닌 머스타드, 우라실 머스타드, 에스트라무스틴, 알트레타민, 플록수리딘, 5-데오옥시우리딘, 시토신 아라비노시드, 6-머캅토퓨린, 데옥시코포르마이신, 칼시트리올, 발루비신, 미트라마이신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, 스쿠알라민, 엔도스타틴, 비탁신, 드롤록시펜, 아이독시펜, 스피로노락톤, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주맙, 데닐류킨 디프티톡스, 게피티닙, 보르테지밉, 파클리탁셀, 크레모포어 없는 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 B, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 피펜독시펜, 아르족시펜, 풀베스트란트, 아콜비펜, 라소폭시펜, 이독시펜, 토포테칸, 라파마이신, 템시롤리무스, 졸렌드로네이트, 프레드니손, 레날리도마이드, 젬투주맙, 하이드로코르티손, 덱스라족산, 알렘투주맙, 온갖 트랜스레티노산, 케토코나졸, 메게스트롤, 면역 글로불린, 질소 머스타드, 메틸프레드니솔론, 이브릿구모맙 티욱세탄, 안드로겐, 데시타빈, 헥사메틸멜라민, 벡사로텐, 토시투모맙, 삼산화 비소, 코르티손, 에디트로네이트, 미토탄, 사이클로스포린, 리포좀 다우노루비신, 에드위나-아스파라기나제, 스트론튬 89, 카소피탄트, 네투피탄트, NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론, 아프레피탄트, 디펜히드라민, 하이드록시진, 메토클로프라마이드, 로라제팜, 알프라졸람, 할로페리돌, 드로페리돌, 드로나비놀, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프로클로르퍼라진, 그라니세트론, 온단세트론, 돌라세트론, 트로피세트론, 페그필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파 및 다르베포에틴 알파, 그 중에서도 에파비린즈가 포함된다. 상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 당해 분야의 숙련가에게 명백하듯이, 본 발명의 요지에서 벗어남이 없이 다른 소분자에 또한 자연스럽게 적용가능하다.
상기 언급된 바와 같이, 결합 단백질은 유익하게는 결합 단백질 자체 및 적합한 EV 단백질 사이의 융합 단백질로서 EV 상에 발현된다. EV 단백질은 단백질 예컨대 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231 . CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, HC-I 또는 MHC-II 성분, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1 CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B 및 이들의 임의의 조합물을 포함하는 군에서 선택될 수 있고, 폴리펩타이드 구성체를 EV로 운송할 수 있는 수많은 다른 폴리펩타이드는 본 발명의 범위 내에 포함된다. EV 단백질은 전형적으로 인간에서 기원되고, 공공연하게 이용가능한 다양한 데이터베이스, 예컨대 Uniprot, RCSB 등에서 발견될 수 있다. EV 단백질은 예를 들어 표면 표시를 향상시키고, 결합능을 증가시키거나, 또는 비-공유 방식으로 특정 유형의 결합 단백질과의 상호작용을 가능하게 하기 위해, 다양한 다른 단백질 및/또는 단백질 도메인에 융합될 수 있다.
추가 구현예에서, 소분자 제제의 결합은 상기 결합 단백질을 치료적으로 활성되게 만들 수 있다. 이것의 비제한적인 예는 효능적 또는 길항적 소분자에 의한 결합 단백질로의 결합일 수 있는데, 이것은 예를 들어 신호전달을 가능하게 함으로써, 또는 신호전달을 억제함으로써, 상기 결합 단백질을 치료적으로 활성화되게 할 수 있다. 따라서, 이와 같은 특정한 경우에, 결합 단백질은 신호전달에 능숙한 경우 치료적으로 활성화될 수 있고, 신호전달에 능숙하지 못한 결합 단백질 또한 치료적으로 활성일 수 있는데, 예를 들어 특정 신호전달 경로를 방해함으로써 약리적 효과를 수행할 가능성이 있다. 치료적으로 활성화된 결합 단백질의 그 밖의 또 다른 비제한적인 예는 효소이되, 상기 효소적 활성은 선택적으로 소분자 제제 및 표적 둘 다의 존재를 필요로 한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 EV는 관심대상인 조직, 장기, 또는 세포 유형을 표적화함으로써 추가로 그것의 치료 잠재성을 향상시키기 위해 EV의 표면 상에 표시된 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 정상적으로 아미노산의 서열(예를 들어 파아지 디스플레이 또는 임의의 다른 유형의 스크리닝 방법론을 통해 확인될 수 있음)을 포함한다. 표적화 모이어티는 전형적으로 EV 공급원 세포의 유전자 조작을 통해 EV 표면 상에 표시되되, 표적화 모이어티 및 엑소좀 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV를 생산하기 위해 공급원 세포가 형질감염된다. 본 발명에 따른 EV 단백질에는 특히, CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c. CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD1 10, CD111, CD1 15, CD1 17, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1 A, VTI1 B, 및 이들의 임의의 조합물이 포함되되, 폴리펩타이드 구성체를 EV로 운송할 수 있는 수많은 다른 폴리펩타이드가 본 발명의 범위 내에 포함된다. EV 단백질은 전형적으로 인간에서 기원되고, 공공연하게 이용가능한 다양한 데이터베이스 예컨대 Uniprot, RCSB 등에서 발견될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 표적 위치에, (i) 소분자 약물, (ⅱ) 치료적으로 활성 형태이거나 또는, 예를 들어 표적과 접촉 시 치료적 활성화되도록 준비된 형태인 결합 단백질, 및/또는 (ⅲ) 결합제 단백질-소분자 약물 콘주게이트 중 적어도 하나를 전달하는 방법에 관한 것이다. 그와 같은 전달 방법은 본 발명에 따라 표적 세포, 표적 조직, 또는 표적 장기(유체 및 액체 예컨대 혈액, 담즙, 림프, 간질액, 뇌척수액 등이 포함될 수 있음)를 EV에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, EV는 그것의 표면에 발현된 표적화 모이어티를 포함할 수도 있고, 또는 천연 굴성 및 표적화가 필요할 수도 있고, 비표적화될 수도 있다. 표적 세포로 그리고 표적 세포 내부로의 전달이 상기 맥락에 따라 시험관내 및/또는 생체내에서 수행될 수 있다. 추가로, 본 발명은 소분자 약물, 또는 단백질-약물 콘주게이트의 약동학적 또는 약력학적 프로파일을 변경하는 방법에 관한 것이다. 이것은 문제의 소분자 제제 및 결합 단백질을 EV 내부로 또는 상부에 장입시킴으로써 달성되는데, 이것이 인자들 예컨대 흡착, 분포, 대사, 효소적 활성, 조직 침투, 청소능 등에 영향을 줄 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 신호 전달을 조정하는 방법에 관한 것으로, EV 상에 표시된 결합 단백질에 소분자 제제를 결합시키는 단계 및 결합 단백질과 소분자 제제를 포함하는 콘주게이트를 표적 신호전달 경로에 노출시키는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 EV를 생산하는 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은 임의의 적합한 EV-생산 세포, 예를 들어 MSCs, 섬유모세포, 면역 세포, HEK 세포, 또는 임의의 다른 적합한 세포 유형에서 수득된 EV를 사용하여 수행될 수 있다. 결합 단백질-약물 콘주게이트를 포함하는 EV를 생산하는 소위 외인성 방법은 (a) EV 단백질과 융합 단백질의 형태로 결합 단백질을 포함하는 EV를 제공하는 단계, 및 (b) 상기 결합 단백질을 소분자 제제에 노출시키는 단계(상기 소분자 제제의 상기 결합 단백질로의 비공유 또는 공유 결합을 가능하게 하기 위함)를 포함할 수 있다. 정상적으로, 상기 단계들에 앞서서 EV-생산 세포를 유전자적으로 변형시킴으로써, 표면 상에 결합 단백질을 표시한 EV를, 선택적으로 EV 폴리펩타이드, 예컨대 CD63, CB81, CD9, 또는 Lamp2b 또는 임의의 다른 적합한 EV 폴리펩타이드와의 융합 단백질의 형태로, 분비되게 하는 단계가 존재할 수 있다. EV의 분비 후, EV로 컨디셔닝된(conditioning)(즉, EV 함유) 배양 배지는 아래에 더 상세히 기재될 여러 가지의 방법을 사용하여 정제되고, 이어서 관심대상인 소분자 약물에 노출될 수 있다. 소분자 약물에 노출은 문제의 약물과 결합 단백질 사이의 상호작용을 가능하게 함으로써, 연결의 형성을 초래하고, 따라서 결합제 단백질-소분자 약물 콘주게이트의 생성을 초래한다.
추가 양태에서, 본 발명에 따른 EV 생산 방법은 소분자 약물과 함께 EV 결합 단백질의 내인성 장입을 포함할 수 있다. 그와 같은 방법은 (a) 결합 단백질을 선택적으로 EV 단백질과의 융합 단백질의 형태로 포함하는 EV 공급원 세포의 배양물과 함께 소분자 제제를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 후속적으로, EV 공급원 세포에 의해 생산된 EV가 수확되되, 상기 EV는 결합 단백질에 결합된 소분자 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질-소분자 콘주게이트를 포함하는 EV를 생산하는 방법은 EV 생산 세포를 유전자 변형시킴으로써, 어댑터 단백질을 포함하는 EV가 분비되게 하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로 EV 단백질에 융합될 수 있는 어댑터 단백질은 다양한 유형의 결합 단백질, 예를 들어 항체를 비-공유 결합으로 부착하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 비제한적인 예에서, 어댑터 단백질을 포함하는 EV의 생산 후, 제1 외인성 장입 단계가, 예를 들어 항체가 상기 EV에 결합되는 동안 수행될 수 있다. 후속적으로, 제2 외인성 장입 단계가 발생할 수 있되, 소분자 제제는 항체 또는 임의의 다른 결합 단백질에 부착될 수 있다. 선택적으로, 이들 두 차례 장입 단계는 소분자 제제가 미리 장입된 결합 단백질로 상기 EV를 코팅함으로써, 하나의 단일 단계로 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 결합 단백질-소분자 콘주게이트를 포함하는 EV를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 전형적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 제형화된 하나의 유형의 치료적 EV(즉, 결합 단백질 파트너와 조합된 특정 원하는 소분자(들)을 포함하는 EV의 군집)를 포함하되, 둘 이상의 유형의 EV 군집이 약제학적 조성물에 포함될 수 있는데, 예를 들어 병용 치료가 바람직한 경우에 그러하다. 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제는 임의의 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 운반체, 예를 들어 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 부형제, 담체, 용매 또는 캡슐화 물질을 포함하는 군에서 선택될 수 있고, 이것은 예를 들어 EV 군집을 현탁화, 그것의 활성 유지, 또는 하나의 장기, 또는 신체 부분에서 또 다른 장기, 또는 상기 신체의 부분으로(예를 들어 혈액에서 관심대상인 임의의 조직, 및/또는 장기 및/또는 신체부로) EV 군집을 운반 또는 운송하는 데 관여될 수 있다.
본 발명은 또한 결합 단백질-소분자-운반 EV의 미용 및 피부 적용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 증상 및 문제, 예컨대 건조 피부, 주름, 접힌 부분, 깊이 패인 주름, 및/또는 피부 주름을 향상 및/또는 경감시키기 위한, 적합한 EV를 포함하는 피부 케어 제품, 예컨대 크림, 로션, 겔, 에멀젼, 연고, 페이스트, 분말, 도찰제, 햇볕차단제, 샴푸 등에 관한 것이다. 일 구현예에서, 재생 특성을 갖는 적합한 EV-생산 세포 공급원(예를 들어 간엽 줄기 세포)에서 수득된 EV(관심 대상의 소분자를 포함)가 주름, 주름선, 접힌 부분, 깊게 패인 주름 및/또는 피부 주름을 미용적 또는 치료적으로 경감시키기 위해 화장 크림, 로션, 또는 겔에 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의약품에 사용하기 위한 본 발명에 따른 EV에 관한 것이다. 자연적으로, 본 발명에 따른 소분자를 포함하는 EV가 의약품에 사용된 경우, 사실상 정상적으로 EV의 군집이 사용되는 것이다. 환자에게 투여되는 EV의 용량은 EV에 장입된 소분자 약물의 양, 치료 또는 경감 대상인 질환 또는 증상, 투여 경로, 소분자 자체의 약리 작용, EV의 고유한 특성 뿐만 아니라 관련성의 다양한 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따른 EV 및 이들의 EV 군집은 따라서 예방적 및/또는 치료적 목적을 위해, 예를 들어 다양한 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 경감에 사용하기 위해, 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 EV가 적용될 수 있는 질환의 비제한적인 샘플에는 크론병, 궤양성 대장염, 강직 척추염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 전신 홍반성 낭창, 유육종증, 특발성 폐 섬유증, 건선, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체-관련 주기적 증후군(TRAPS), 인터류킨-1 수용체 길항제(DIRA)의 결핍, 자궁내막증, 자가면역 간염, 경피증, 근염, 뇌졸중, 급성 척수 손상, 혈관염, 비-알코올성 지방간염(NASH), 비알코올성 지방 간 질환(NAFLD), 섬유증, 길랑-바레 증후군, 급성 심근경색증, ARDS, 패혈증, 수막염, 뇌염, 간부전, 신부전, 심부전 또는 임의의 급성 또는 만성 장기 부전 및 관련된 기저 병인, 이식편대숙주병, 뒤센 근육 이상증, 베커 근육 이상증, 및 다른 근육 이영양증, 리소좀 축적 질환 예컨대 고셔병, 파브리 질환, MPS I, II(헌터 증후군), 및 III, 니만-피크병, 시스틴증, 폼페병 등, 신경퇴행성 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 다른 트리뉴클레오타이드 반복-관련 질환, 치매, ALS, 암에서 유도된 악액질, 식욕부진, 진성 당뇨병 유형 2 및 다양한 암이 포함된다. 사실상 모든 유형의 암은 본 발명과 관련된 표적 질환으로, 예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 맹장암, 성상교세포종, 소뇌 또는 뇌, 기저-세포 암종, 담도암, 방광암, 뼈 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌암, 뇌종양(소뇌 성상교세포종, 뇌 성상교세포종/악성 신경아교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각적 경로 및 시상하부 신경아교종), 유방암, 기관지 선종/암양종, 버킷 림프종, 유암종(소아기, 위장), 미공지된 1차 암종, 중추신경계 림프종, 소뇌 성상교세포종/악성 신경아교종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직형성 작은 원형 세포 종양, 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도암, 두개외 생식세포 종양, 고환외 생식세포 종양, 간외 담도암, 안암(안구내 흑색종, 망막모세포종), 담낭암, 위(위) 암, 위장 유암종, 위장 간질성 종양(GIST), 생식세포 종양(두개외, 고환외, 또는 난소), 임신성 융모성 종양, 신경아교종(뇌간의 신경아교종, 뇌 성상교세포종, 시각적 경로 및 시상하부 신경아교종), 위 암양종, 모발 세포 백혈병, 두경부 암, 심장 암, 간세포(간) 암, 호지킨 림프종, 하인두 암, 안구내 흑색종, 소도세포 암종(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암(신장 세포 암), 후두 암, 백혈병[(급성 림프아구성(또한, 소위 급성 림프구성 백혈병), 급성 골수(또한, 소위 급성 골수성 백혈병), 만성 림프구성(또한, 소위 만성 림프구성 백혈병), 만성 골수성(또한, 소위 만성 골수 백혈병], 모발 세포 백혈병)), 입술 및 경구, 공동 암, 지방육종, 간암(1차), 폐암(비-소세포, 소세포), 림프종, AIDS-관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨, 수모세포종, 머켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발성 전이성 편평상피 경부암, 구강암, 다중 내분비 신조직형성 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수성 백혈병, 만성 골수 백혈병(급성, 만성), 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두 암종, 신경교세포종, 구강암, 구강인두 암, 뼈의 골육종/악성 섬유질 조직구종, 난소암, 난소 상피성 암(표면 상피성-간질성 종양), 난소 생식세포 종양, 낮은 악성도의 잠재적 종양, 췌장암, 췌장 소도세포 암, 부갑상선암, 음경암, 인두 암, 크롬친화세포종, 송과체 성상교세포종, 송과체 종자세포종, 송과체아세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 샘종, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 직장암, 신장 세포 암종(신장암), 망막모세포종, 횡문근육종, 타액샘 암, 육종(종양 육종, 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁 육종의 유잉 계열), 세자리 증후군, 피부암(비흑색종, 흑색종), 소장 암, 편평상피 세포, 편평상피 목 암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 고환암, 인후두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관 의 이행 세포 암, 요도 암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및/또는 윌름스 종양이 포함된다.
본 발명에 따른 결합 단백질-소분자 EV는 다양한 상이한 투여 경로, 예를 들어 귓바퀴(귀), 볼, 결막, 피부, 치과, 전기-삼투, 자궁경내, 부비동내, 기관내, 장관, 경막외, 추가의-양막, 체외, 혈액투석, 침윤, 사이질, 복부내, 양막내, 동맥내, 관절내, 담도내, 기관지내, 혈액낭내, 심장내, 연골내, 꼬리내, 해면상내, 강내, 뇌내, 낭내, 각막내, 코로나내(치과), 관상동맥내, 음경 해면체내, 진피내, 디스크내, 도관내, 십이지장내, 경막내, 표피내, 식도내, 위내, 잇몸내, 회장내, 병소내, 관강내, 림프내, 수질내, 수막내, 근육내, 안구내, 난소내, 심막내, 복강내, 늑막내, 전립선내, 폐내, 부비강내, 척수내, 활막내, 힘줄내, 고환내, 척추강내, 흉내, 세뇨관내, 종양내, 고막내, 자궁내, 혈관내, 정맥내, 정맥내 볼러스, 정맥내 적가, 심실내, 방광내, 초자체내, 이온침투요법, 관개, 후두, 비강, 비위, 폐쇄성 드레싱 기술, 안과, 경구, 구강인두, 다른, 비경구, 경피, 관절주위의, 경막주위, 신경주위, 치주, 직장, 호흡(흡입), 안구뒤, 연조직, 지주막하, 결막하, 피하, 설하, 점막하, 국소, 경피, 경점막, 태반 경유, 경기관, 중이강, 요관, 요도, 및/또는 질 투여, 및/또는 상기 투여 경로들의 임의의 조합을 통해 인간 또는 동물 개체에 투여될 수 있는데, 이것은 전형적으로 치료 대상 질환 및/또는 소분자 약물 또는 EV 군집의 특징에 좌우된다.
본 발명의 방법은 또한, 수득한 EV의 수익율 또는 특성에 영향을 미치기 위해 EV 공급원 세포를, 혈청 기아, 저산소증, 바필로마이신, 또는 사이토카인 예컨대 TNF-알파 및/또는 IFN-감마에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. EV 생산 규모 및 타임 라인은 EV-생산 세포 또는 세포주에 따라 상당히 달라질 것이기 때문에, 당해 분야의 숙련가에 의해 조정될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 추가로 EV 정제 단계를 포함할 수 있는데, 여기서 EV는 액체 크로마토그래피(LC), 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 스핀 여과, 접선 유동 여과, 중공 섬유 여과, 원심분리, 면역침강, 유동장 분별화, 투석, 미세유체-기반 분리 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 기술들의 군에서 선택된 절차를 통해 정제된다. 유리한 구현예에서, EV의 정제는 여과 [바람직하게는 한외여과(UF), 접선 유동 여과 또는 중공 섬유 여과] 및 크기 배제 액체 크로마토그래피(LC)의 순차적인 조합을 사용하여 수행된다. 이와 같은 정제 단계들의 조합은 최적화된 정제를 초래하고, 이어서 우월한 치료적 활성을 유발시킨다. 또한, 일상적으로 엑소좀 정제에 이용되는 초원심분리(UC)와 비교하여, 순차적 여과-크로마토그래피는 상당히 더 빠르게 더 많은 제조 부피로 조정될 수 있다 (선행기술의 주를 이루는 현재의 UC 방법론의 유의미한 단점). 또 다른 유리한 정제 방법은 접선 유동 여과(TFF)로, 이것은 조정가능성 및 순도를 제공하고, 다른 유형의 정제 기술, 예컨대 여과와 함께 조합될 수 있다.
상기에 기재된 예시적 양태, 구현예, 대안 및 변형은 본 발명의 범위에서 벗어나고도 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 첨부된 실시예들에 의해 추가적으로 예시되는데, 이것도 또한 당연히 본 발명의 범위 및 요지를 벗어나지 않으면서 상당히 변형될 수 있다.
물질 및 방법
결합 단백질과 EV 단백질 [예컨대 CD81, CD63, CD9, 신테닌, 신데칸, 알릭스(Alix), CD133 등]을 포함하는 다양한 융합 단백질이 설계 및 평가된 바 있다. 전형적으로 합성에 의해 ORFs가 생성되었고, 포유동물 발현 벡터 pSF-CAG-Amp로 클로닝되었다. 간단히, 합성된 DNA 및 벡터 플라스미드가 제조자 지침(NEB)에 따라 효소 Notl 및 Sail로 소화되었다. 제조자의 지침(NEB)따라 T4 리가제를 사용하여, 제한효소 처리된 정제 DNA 단편이 서로 결찰되었다(ligate). 성공적인 결찰 이벤트 여부는 암피실린이 보충된 플레이트에서 박테리아 형질전환에 의해 선별되었다. 형질감염용 플라스미드를 제조자의 지침에 따라 'maxi-prep'에 의해 생성하였다.
대부분의 복제는 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 클로닝 키트(NEB, Inc.)를 사용하여 수행되었고, Sanger 서열분석(공급원 Bioscience)를 사용하여 확인되었다.
플라스미드가 NEB 5-알파 유능한 대장균 세포(NEB, Inc.)로 형질전환되고 제조자의 권고에 따라 진탕 배양기에서 밤새 성장되었다. 플라스미드는 제조자의 지침(Macherey-Nagel)에 따라 'maxi-prep' 키트를 사용하여 단리 및 정제되었다.
실험적 설계 및 검정에 따라서, 특정 경우에, 비-바이러스 일과성 형질감염 및 엑소좀 생산이 종래의 2D 세포 배양에서 수행된 반면, 다른 사례에서 바이러스로 매개된 형질도입이 이용되어 안정된 세포주가 형성되었는데, 이것은 전형적으로 배양된 상이한 유형의 생물반응기, 예컨대 중공-섬유 생물반응기 및 교반 탱크 생물반응기에서 배양되었다. 간결함을 위해, 단 몇 가지 실시예가 하기에 언급된다.
전형적으로 HEK293T 세포를 15cm 디쉬에 분주하고(1 디쉬당 9×106 개 세포), ATCC에 의해 권고된 바에 따라 혈청-함유 DMEM 중에 밤새 두었다. 다음날, 세포에 직접적으로 첨가된 지질 접합된(lipoplexed) DNA로 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 간단히, DNA 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 개별적으로 OptiMEM에서 5분 동안 인큐베이팅하고, 이어서 실온에서 20분 동안 둘을 함께 조합하였다. 지질 접합된 DNA 및 세포를 6시간 동안 함께 배양하고, 이어서 컨디셔닝된 배양 배지를 OptiMEM으로 옮겨 48시간 동안 두었다. 접시, 플라스크 및 다른 세포 배양 용기에서 평가된 다른 세포 및 세포주는 골수에서 유래된 간엽 기질 세포(BM-MSCs) 및 워턴 젤리에서 유래된 MSCs (Wharton's jelly, WJ-MSCs), 양막 세포, 섬유모세포, 다양한 내피 및 상피 세포 뿐만 아니라 다양한 면역 세포 및 세포주를 포함하였다.
안정된 세포주의 바이러스성 형질도입 및 창출의 경우에, 세포 공급원, 예컨대 BM-MSCs, WJ-MSC, 섬유모세포, 양막 세포, 섬유모세포, 다양한 내피 및 상피 세포는 전형적으로 렌티바이러스(LV)를 사용하여 바이러스-형질도입되었다. 전형적으로 감염 24시간 전에, 100.000개 세포(예를 들어 섬유모세포, MSCs 등) 또는 200.000개 세포(예를 들어 HEK293T)를 6-웰 플레이트에 플레이팅한다. LV 2uL와 선택적으로 폴리브렌(또는 헥사디메트린 브로마이드, 웰 상의 최종 농도가 8 ug/mL)을 첨가하고, 형질도입 24시간 후, 형질도입된 세포의 세포 배지를 신선한 완전 배지로 바꾼다. 형질도입 72시간 후, 퓨로마이신 선택(4-6 pg/ml)을 수행하고, 정상적으로 7일 동안 폴리펩타이드 구성체의 안정된 발현의 분석을 수행한다.
안정한 세포를 2D 배양액 또는 생물반응기, 전형적으로 중공-섬유 생물반응기 및 교반탱크 생물반응기 중 하나에서 배양하였고, 컨디셔닝된 배지를 후속적으로 엑소좀 제조를 위해 수집하였다. 다양한 제조 및 정제 단계를 수행하였다. 표준 작업흐름은 상청액의 사전 제거, 여과-기반 농축, 크로마토그래피-기반의 단백질 오염물질 제거, 및 시험관내 및/또는 생체내 검정을 위해 적합한 완충액에서 수득한 엑소좀 조성물의 선택적 제형화의 단계들을 포함한다.
검정 및 분석의 경우, 웨스턴 블랏을 사용하여 EV 중 결합 단백질(선택적으로 엑소좀 단백질에 융합됨)의 농후도를 평가하였다. 간단히, 제조자의 지침(Invitrogen, Novex PAGE 4-12% 겔)에 따라 SDS-PAGE를 수행하였고, 그럼으로써 1×1010 엑소좀 및 20㎍ 세포 용해물을 웰마다 로딩하였다. SDS-PAGE 겔에서 유래된 단백질을 제조자의 지침(Immobilon, Invitrogen)에 따라 PVDF 막에 전달하였다. 막들은 Odyssey 차단 완충액(Licor) 중에서 블로킹하였고, 공급자의 지침(1차 항체 -Abeam, 2차 항체 - Licor)에 따라 상기 결합 단백질 및 상기 엑소좀 단백질에 대한 항체로 탐색하였다. 분자 탐침은 680 및 800nm 파장에서 시각화하였다.
EV 크기 측정을 위해, 분석적 소프트웨어가 구비된 NanoSight 기기로 나노입자 추적 분석(NTA)을 수행하였다. 모든 기록을 위해, 13 또는 15의 카메라 수준을 사용하였고, 모든 사후-취득 설정을 위해 자동 기능을 사용하였다. 전자 현미경검사 및 형광 현미경검사를 빈번하게 사용하여 EV를 정량화 및 분석하였다.
여러 가지의 방법을 사용하여 EV를 단리 및 정제하였는데, 전형적으로 여과 예컨대 TFF 및 액체 크로마토그래피의 조합을 사용하였다. 전형적으로, EV-함유 배지를 수집하여 5분 동안 300g의 저속 회전시키고, 이어서 10분 동안 2000g 회전시켜 더 큰 입자 및 세포 잔해를 제거하였다. 그러고 나서, 상청액을 0.22pm 주사기 필터로 여과한 후, 상이한 정제 단계를 수행하였다. 100 kDa 컷오프 필터가 구비된 Vivaflow 50 R 접촉 유동(TFF) 디바이스(Sartorius) 또는 100 또는 300 kDa 컷오프 중공 섬유 필터가 구비된 KR2i TFF 시스템(SpectrumLabs)를 사용하여, 대량 부피를 정용여과(diafiltrated)하고 거의 20ml로 농축시켰다. AKTAprime 플러스 또는 AKTA Pure 25 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare Life Sciences)에 연결된 비드-용출 칼럼(HiScreen 또는 HiTrap Capto 코어 700 칼럼, GE Healthcare Life Sciences)에, 사전농축된 배지를 후속적으로 로딩시켰다. 칼럼 평형을 위한 유량 설정, 샘플 로딩 및 칼럼 원위치 세척 절차를 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 상기 샘플을 UV 흡광도 크로마토그램에 따라 수집하고, Amicon Ultra- 15 10 kDa 분자량 컷오프(cut-off) 스핀-필터(Millipore)를 사용하여 최종 부피 100㎕로 농축시킨 후, -80°C에서 추가로 다운스트림 분석을 하였다. 단백질 및 RNA 용출 프로파일을 평가하기 위해, 100 kDa 및 300 kDa 중공 섬유 필터를 사용하는 KR2i TFF 시스템으로 배지를 농축 및 정용 여과시키고, 샘플을 Tricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow(S4FF) 칼럼(GE Healthcare Life Sciences) 상에서 분석하였다. 결합 단백질을 포함하는 소분자 약물의 EV 상으로의 외인성 장입물을 적합한 기간 동안 공동 배양하였고, 이어서 이들 단계와 본질적으로 동일한 단계 또는 적어도 이의 일부분을 사용하여 다시 정제하였다.
실시예 1: 파킨슨병 치료를 위한 아포모르핀이 장입된 EV
도파민 수용체 D2를 발현시키는 내인성으로 MSC, 및 EV 단백질 CD63 및 도파민 수용체 D2를 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위해 유전자 조작된 MSC를 MSCGM 성장 배지에서 배양하였다. MSC-EV에 파킨슨병의 치료법을 위해 사용된 약물인 아포모르핀(APO)을 내인성으로 장입시키기 위해, MSG 배양 배지를 Opti-EM 배지로 대체하고, 2μM APO와 함께 12시간 동안 배양하였다. 그 후에, 컨디셔닝된 배지를 수집하고, 접선 유동 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 아포-EV(APO-EV)를 단리하였다. 외인성으로 MSC-EV에 APO를 장입시키기 위해, 미처리된 MSC에서 유래된 EV를 상기와 같이 단리한 후, 이어서 2시간 동안 2μM APO와 함께 배양하고 다시 단리하여, EV에 장입되지 않은 APO 분자를 제거하였다. EV로의 APO 장입은 EV 표면 상에서 도파민 수용체 D2와의 상호작용 [신호전달 컴피턴트(competent) 도파민 수용체의 예비 충전(precharging)을 유발시킴]에 의해 용이하게 된다.
유전자 변형 및 비변형된 MSC에서 수득된 아포-EV의 활성을 1차 성상교세포에서의 도파민 수용체 신호전달을 향상시키기 위해 시험하였다. 성상교세포를 무혈청 DMEM/F12 배지에서 배양하고, 2μM 유리 APO, 또는 APO-EV(내인성으로 또는 외인성으로 장임됨)로 0.5 또는 6시간 동안 처리하였다. 0.5시간의 시점에 성상교세포 세포 용해물에서 인산화된 단백질 키나아제 A(p-PKA) 및 인산화된 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(p-MAPK)의 수준을 측정함으로써 신호전달 활성을 평가하였고, 6시간의 시점에 성상교세포 컨디셔닝된 배지에서 섬유모세포 성장 인자 2(FGF-2)의 다운스트림 생산을 평가하였다. LI-COR 이미지형성 시스템을 사용하는 반-정량적 웨스턴 블랏팅에 의해, p-PKA, p-MAPK 및 FGF-2의 수준을 평가하였다.
실시예 2: 암 요법을 위한 EV 로의 이마티닙 장입
내인성으로 ABL1 수용체 티로신 키나아제를 발현시키는 MSCs, 및 EV 단백질 신테닌 및 ABL1 수용체 티로신 키나아제의 융합 단백질을 발현시키기 위해 유전자 조작된 MSCs를 MSCGM 성장 배지에서 배양하였다. 내인성으로 MSC-EV에 이마티닙(IMA)을 장입시키기 위해, MSG 배양 배지를 Opti-MEM 배지로 대체하고, 2mg IMA와 함께 배양하였다. 그 후에, 컨디셔닝된 배지를 수집하고 접선 유동 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 IMA-EV를 단리하였다. 외인성으로 MSC-EV에 IMA를 장입시키기 위해, 미처리된 MSCs에서 유래된 EV를 상기에서와 같이 단리하고, 이어서 2시간 동안 2mg IMA와 함께 배양하고, 다시 단리하여, EV에 장입되지 않은 IMA 분자를 제거하였다.
IMA는 그것의 ABL1에 대한 결합 및 후속적인 Bcr-Abl 수용체 티로신 키나아제 복합체의 안정화(이로써 IMA를 키나아제의 효율적인 저해제로 만듦) 덕분에 만성 골수성 백혈병(CML)의 요법에 사용되는 약물이다. EV로의 IMA 장입은 내인성으로, 또는 EV 단백질, 예컨대 신테닌의 도움으로, EV로 분류된 ABL1과의 상호작용에 의해 용이해 진다.
마우스에 KU812 세포 이종이식편을 접종하고, IMA의 동등한 1일 용량 50 mg/kg으로 유리 IMA 또는 IMA-EV를 복강내 처리한 후, 종양 중량 및 마우스 생존율을 측정함으로써, 누드 마우스에서 IMA-EV의 활성을 평가하였다.
실시예 3: 정맥내 LPS -유도된 패혈증을 예방하기 위한 EV 로의 이마티닙 장입
세포 배양, EV 장입 및 EV 단리를 실시예 2에서와 마찬가지로 수행하였으나, EV에 장입된 IMA의 활성을 정맥내 LPS로 유도된 급성 패혈증 모델에서 시험하였다. LPS 처리가 패혈성 쇼크 및 ARDS에 연루되는 고수준의 반응성 산소 종을 유도하는 것으로 알려져 있다. 카탈라제 활성을 증가시키는 IMA 기능은 DNA 손상을 저감시키고 전-염증 사이토카인 TNF-알파 및 IL-6의 생산을 저감시키는 것에 관련된 것이다.
마우스를 5 mg/kg LPS의 안와후 주사에 의해 LPS에 민감하게 만들었다. 매일 수행에 하루 앞서 IMA 및 EV-IMA 처리를 IMA 200 mg/kg/1일로 개시하고, 마우스 생존율을 모니터링하였다.
실시예 4. mTOR 활성을 억제하기 위한 EV 로의 라파마이신 장입
내인성으로 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제 FKBP12를 발현시키는 MSC (MSC-FKBP12) 및, EV 단백질 CD63 및 FKBP12 이소머라제를 포함하는 융합 단백질을 발현시키기 위한 유전자 조작된 MSC (MSC-CD63FKBP12)를, MSCGM 성장 배지에서 배양하였다. MSC-EV에 라파마이신 (FKBP12와 직접적으로 결합하는 분자)을 내인성으로 장입시키기 위해, MSG 배양 배지를 Opti-MEM 배지로 대체하고, 12시간 동안 20nM 라파마이신과 함께 배양하였다. 그 후에, 컨디셔닝된 배지를 수집하고, 라파마이신-EV를 접선 유동 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단리하였다. 외인성으로 MSC-EV에 라파마이신을 장입시키기 위해, 미처리된 MSC-FKBP12 및 MSC-CD63FKBP21 세포에서 유래된 EV를 상기에서와 같이 단리한 후, 2시간 동안 500nM 라파마이신과 함께 배양하고, 다시 단리하여 EV에 장입되지 않은 라파마이신 분자를 제거하였다. EV로의 라파마이신 장입은 EV에 장입된 FKBP12 이소머라제와의 상호작용 (FKBP-라파마이신 복합체가 mTOR 활성을 억제하는 수여자 세포로의 전달에 앞서 예비-충전(precharging)을 유발시킴)에 의해 용이하게 된다.
외인성 또는 내인성으로 라파마이신이 장입된 EV의 활성을 MCF7 유방암 세포에서 시험하였다. 10% FBS 및 항생제가 보충된 DMEM/F12 배지에서 배양된 MCF7 세포를 24-웰 조직 배양판에 분주하였다. 다음날, MCF7 세포를 라파마이신이 장입된 EV로, 라파마이신이 없는 비장입된 EV로 처리하거나, 또는 미처리된 채로 두었다. 처리 24 시간 후, MCF7 세포를 수확하고 K-LIS mTOR 활성 키트(Merck Millipore)를 사용하여 mTORC 활성에 대해 분석하였다.
실시예 5: 지방 세포에서 지방분해를 유도하기 위한 EV로의 아드레노메둘린 의 장입
아드레노메둘린(AM) CALCRL (AM에 대한 수용체)를 결합 단백질로서, 또는 CALCRL-CD81 융합 단백질을 사용하여 EV에 특이적으로 표적화된 결합 단백질로서 발현시키기 위해 유전자 조작된 MSC를 MSCGM 성장 배지에서 배양하였고, 이것은 EV로의 AM의 내인성 장입을 초래하였다. AM-장입된 EV를 단리하기 위해, MSG 배양 배지를 Opti-MEM 배지로 대체하고, 48시간 동안 배양하였다. 그 후에, 컨디셔닝된 배지를 수집하고, AM-장입된 EV를 접선 유동 여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단리하였다. AM이 장입된 EV의 지방분해 활성을 쥣과 3T3-L1 세포에서 시험하였다. 10% FBS 및 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 배양된 3T3-L1 세포를 12-웰 조직 배양판에 분주하고, 분화를 수행하고, 12시간 동안 혈청 결핍시키고, 유리 AM, AM이 장입된 EV, 또는 대조군으로 처리하였다. 제조자의 권고에 따라 유리 글리세롤 시약(Sigma)을 사용하여, 글리세롤 방출에서의 상대적 변화를 측정하였다.

Claims (14)

  1. 결합 단백질을 포함하는 세포외 소포(EV)로서, 적어도 하나의 소분자 제제가 상기 결합 단백질에 결합된 것을 특징으로 하는 세포외 소포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 단백질은 GPCR류, 다클론성 및 단클론성 항체, 단쇄 가변 절편(scFv), 지질단백질, 인테그린, 티로신 키나아제, DNA-결합 단백질, RNA-결합 단백질, 뉴클레아제, 리가아제, 프로테아제, 인테그라제, 이소머라제, 포스파타제, GTPase류, 아로마타제, 에스터라제, 어댑터 단백질, G-단백질류, GEF류, 사이토카인, 인터류킨 및 인터류킨 수용체, 인터페론 및 인터페론 수용체, 카스파제, 전사 인자, 신경 영양 인자 및 이들의 수용체, 성장 인자 및 이들의 수용체, 신호 인지 입자 및 수용체 요소, 세포외 기질 단백질, 막 관통 요소, 리보솜 단백질, 번역 신장 인자, 번역 개시 인자, GPI-고정 단백질, 조직 인자, 디스트로핀, 우트로핀, 디스트로브레빈, 및 이들의 어느 융합체, 조합물, 서브유닛, 유도체 또는 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포외 소포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 소분자 제제는 항암제, 세포증식 저해제, DNA 또는 RNA 삽입제(intercalator), 뉴클레오시드, 스플라이싱 조절자, 키나아제 저해제, 티로신 키나아제 저해제, 예컨대 BTK 저해제 또는 Bcr-Abl 저해제, 스타틴, NSAID류, 항생제, 항진균제, 항균제, 항염증제, 항-섬유화제, 항고혈압제, 혈관확장제, 호르몬 및 이들의 유사체, 아로마타제 저해제, 에스테라제 저해제, 항콜린제, SSRI류, BKT 저해제, PPAR 작용제, 도파민 작용제, HER 저해제, AKT 저해제, BCR-ABL 저해제, 신호전달 저해제, 사이토카인 저해제, ILs 및 ILR 저해제, TNF 및 TNFR 저해제, 혈관생성 저해제, 신타제 저해제, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 siRNA, mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 스플라이싱-전환 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 세포-침투 펩티드, ALK 저해제, BRAF 저해제, MEK 저해제, PI3K 저해제, 네프릴리신 저해제, 베타2-작용제, CRTH2 길항제, FXR 작용제, BACE 저해제, 스핑고신-1-포스페이트 수용체 조절자, MAPK 저해제, 헤지호그(Hedgehog) 신호 저해제, MDM2 길항제, LSD1 저해제, 락타마제 저해제, IDO 저해제, ERK 저해제, Chk1 저해제, 및 이들의 유도체, 서브유닛, 도메인 또는 조합물을 포함하는 군으로부터 선택되는 약물인, 세포외 소포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 소분자 제제는 선택적으로 결합 단백질이 치료 활성을 갖도록 만드는, 세포외 소포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 치료 활성을 갖는 결합 단백질은 신호-경쟁적이거나 또는 신호-비경쟁적(incompetent)인, 세포외 소포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 결합 단백질 일부 및 EV 단백질을 포함하는 융합 단백질인, 세포외 소포.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 EV 단백질이 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH 1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, 인터류킨 수용체, CD2, CD3 입실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1 CA, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8. SLIT2. STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 세포외 소포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적화 잔기를 추가로 포함하는, 세포외 소포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 의한 세포외 소포를 외인성으로 생산하는 방법으로서,
    a. 선택적으로 세포외 소포 단백질과의 융합 단백질 형태로 있는 결합 단백질을 포함하는 세포외 소포를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 세포외 소포를 소분자 제제에 노출시켜 상기 소분자 제제가 결합 단백질에 결합하도록 하는 단계;를 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 세포외 소포를 내인성으로 생산하는 방법으로서,
    a. 선택적으로 세포외 소포 단백질과의 융합 단백질 형태로 있는 결합 단백질 및 적어도 하나의 소분자 제제를 포함하는, 세포외 소포 공급원 세포를 배양하는 단계;
    b. 상기 세포외 소포 공급원 세포에 의해 생산된 세포외 소포를 수집하는 단계로서, 상기 세포외 소포들은 상기 결합 단백질에 결합된 소분자 제제를 포함하는 단계;를 포함하는 방법.
  11. 결합 단백질-소분자 컨쥬게이트, 결합 단백질, 및/또는 소분자 제제를 전달하는 방법으로서,
    a. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 의한 세포외 소포를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 세포외 소포를 표적 위치에 전달하는 단계;를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 표적 위치는 세포, 세포 또는 하위 세포 구획, 장기, 조직 및/또는 혈액, 담즙, 림프 또는 장액인, 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 의한 세포외 소포, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 의약 용도로 사용되는, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 의한 EV 또는 제13항에 의한 약학적 조성물.
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