KR100701905B1 - 헤르페스 감마 34.5 유전자 발현을 재표적화하는 세포특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터 - Google Patents

헤르페스 감마 34.5 유전자 발현을 재표적화하는 세포특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤르페스 바이러스 돌연변이체와, 종양 세포 또는 다른 군의 표적 세포를 선택적으로 표적화하는 바이러스 돌연변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 돌연변이체는 헤르페스 γ34.5 유전자를 발현시키기 위해서 종양 특이적 및/또는 세포 특이적 프로모터를 사용함으로써 선택적으로 표적화할 수 있다.

Description

헤르페스 감마 34.5 유전자 발현을 재표적화하는 세포 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터{CELL-SPECIFIC AND/OR TUMOR-SPECIFIC PROMOTER RETARGETING OF HERPES GAMMA 34.5 GENE EXPRESSION}
연방-지원된 연구 및 개발하에서 이루어진 발명의 권리에 대한 언급
본 발명의 개발중 수행된 연구의 적어도 일부는 국립 암 학회, 승인번호 CA6924602의 보조금을 이용하였다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 일부 권리를 갖는다.
본 발명의 배경
본 발명의 분야
본 발명은 종양 세포 및/또는 기타 특정 세포군을 선택적으로 표적화할 수 있는 헤르페스 바이러스 돌연변이체에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 돌연변이 헤르페스 바이러스 벡터를 종양 및 특정 세포 유형을 향하여 재표적화시키는데 사용하는 세포 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터의 용도에 관한 것이다. 세포 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터는 헤르페스 감마(γ)34.5 유전자의 발현을 유도하는데 사용되며, 상기 유전자 생성물은 감염된 세포에서 자손 바이러스를 대량으로 생산하는 역할을 한다.
γ34.5 유전자를 갖지 않은 헤르페스 벡터는 잘 복제되지 않기 때문에, 이는 임상적 용도로 바람직하다. 그러나, γ34.5 유전자의 부재는 또한 바이러스가 종양 또는 임의의 다른 감염된 조직을 죽이는 능력을 감소시킨다. 본 발명은 세포- 및/또는 종양 특이적 프로모터를 사용할 수 있는 세포에서 헤르페스 바이러스를 대량으로 생성할 수 있게 한다. 그러나, 프로모터를 작동시킬 수 없는 세포는 바이러스 복제를 지속시키지 않으므로, 이들 및 이들의 주변 세포를 활성의 유해한 바이러스 감염 및 복제로부터 구하여, 헤르페스 독성을 목적하는 표적 세포 방향으로 향하게 할 수 있다.
관련 기술
A. 통상적 암 요법
신생물형성(neoplasia)이란 세포 성장 및 분화를 조절하는 정상 조절 메카니즘이 손상되어 성장을 진행시킴으로써 암이 발생하는 과정이다. 이러한 조절 메카니즘이 손상되면 종양이 커져서 신체의 생명 유지에 필요한 부분내의 공간을 차지하게 된다. 종양이 주위 조직을 침입하여 먼 지점으로 이동하면(전이) 개체는 죽게될 것이다.
1999년에 미국에서만 약 563,100명의 사람들 또는 매일 약 1,500명의 사람들이 암에 의하여 죽는 것으로 예상된다[Landis 등, "Cancer Statistics, 1999", CA Canc.J. Clin. 49:8-31(1999)]. 또한, 암은 1 내지 14세의 아이들의 사망 원인중 사고 다음의 주요 사망 원인이다[상기 문헌 참조]. 따라서, 새로운 암 요법의 개발이 요구된다.
1. 통상적 치료법의 일반적 한계
암 요법의 소정의 목적은 정상 세포에 유해한 영향을 주지 않으면서 우선적으로 암 세포를 죽이는 것이다. 일부 방법들은 이러한 목적을 달성하기 위한 시도로 외과 수술, 방사선 요법 및 화학 요법을 사용하여 왔다.
외과 수술은 첫번째로 이용되는 암 요법이고, 여전히 암의 진단, 시기결정 및 치료에 중요한 역할을 하고 있으며, 초기 암의 일차적인 치료법일 수 있다[참조, Slapak, C.A. 및 Kufe, D.W., "Principles of Cancer Therapy,", in Harrison's Principles of Internal Medicine, Fauci,A.S. 등, eds., 14판, McGraw-Hill Cos, Inc., New York, 1998, 524쪽]. 그러나, 이 수술은 특정 부위에 한정된 암을 치료하는 데는 효과적인 방법일 수 있지만, 종양 부위 밖에서의 미세전이 질병으로 인해 절제로 이들 종양을 치료할 수 없다[상기 문헌 참조]. 전이의 수준을 보여주는 임의의 암은 수술만으로는 효과적으로 치료될 수 없다[상기 문헌 참조].
방사선 요법은 국부화된 암의 제어를 위하여 사용되는 또다른 국부(비전신성) 치료 형태이다[상기 문헌 525쪽]. 다수의 정상 세포는 신생물 세포보다 세포간 치유 성능이 높으며, 이로 인해 방사선 손상에 덜 민감하게 된다. 방사선 요법은 방사선에 의한 손상에 대한 감수성(susceptibility)에 있어서 신생물 세포 및 정상 세포 간의 차이와, 정상 기관이 분절적으로만 손상된 경우 그 기능을 계속 유지할 수 있는 능력에 따라 달라진다[상기 문헌 참조]. 따라서, 방사선 요법의 성공은 종양 주위 조직의 방사선 요법에 대한 감성(sensitivity)에 따라 달라진다[상기 문헌 참조]. 방사선 요법은 투여 부위에 따라 부분적으로 달라지는 부작용, 예를 들면 피로, 국소 피부 반응, 오심 및 구토와 관련이 있다[상기 문헌 526쪽]. 또한, 방사선 요법은 돌연변이유발원, 암생성원 및 기형발생원이며, 환자에게 제2 종양의 발생 위험을 야기할 수 있다[상기 문헌 참조].
다른 유형의 국소 요법, 예를 들면 국소 온열 요법[Salcman, M. et al., J. Neuro-Oncol. 1:225-236(1983)], 광방사선 요법[Cheng, M.K., et al., Surg. Neurol. 25:423-435(1986)]. 및 간질 방사선[Gutin, P.H., et al., Neurosurgery 67:864-873(1987)]이 연구되어 왔다. 불행하게도, 이러한 요법들은 중간 수준의 성공을 보일 뿐이었다.
국소 치료법, 예를 들면 방사선 요법 및 외과술은 고용량의 방사선 요법 또는 외과적 기법을 통하여 접근할 수 있는 신체의 영역에서 종양 덩어리를 감소시키는 방법을 제공한다. 그러나, 부작용이 휠씬 적은 더욱 효과적인 국소 치료법이 요구된다. 또한, 이러한 치료법은 대부분의 암 환자에서 궁극적으로 발견되는 널리 산재하거나 순환하는 종양 세포의 붕괴에 적절하지 않다. 종양 세포의 산재를 저지하기 위하여 전신적 치료법이 사용된다.
이러한 전신적 치료법중 하나가 화학요법이다. 화학요법은 산재된 악성 종양을 위한 주요 치료법이다[Slapak, C.A. 및 Kufe, D. W., "Principles of Cancer Therapy", in Harrison's principles of Internal Medicine, Fauci, A.S., et al., eds, 14판, McGraw-Hill Cos., Inc, New York, 1998, 527]. 그러나, 화학요법제는 공통의 고형 종양을 다수 포함하는 다수의 암 유형을 치료하는 효능에 있어서 제한 이 있다[상기 문헌 참조]. 이러한 한계는 다수의 종양 세포의 본질적 또는 후천적 약물 내성에 부분적으로 기인한다[상기 문헌 참조, 533쪽]. 화학요법제의 용도에 대한 또다른 단점은 이들의 심각한 부작용이다[상기 문헌 참조, 532쪽]. 이것의 예로써 골수 억제, 오심, 구토, 머리카락 유실 및 입안 궤양을 들 수 있다[상기 문헌 참조]. 전신적 독성을 피하는 동시에 화학요법제가 악성 종양 세포를 죽일 수 있는 효능을 향상시키기 위하여 새로운 접근법이 필요하다는 것은 명백하다.
2. 중추신경계 종양에 의하여 제시되는 요구
암 치료에서의 또다른 문제는 암의 특정 유형, 예컨대 인간 뇌에서 발생하는 가장 통상적인 주요 악성 암인 신경교종에는 현행 치료 방식을 적용할 수 없다. 외과술, 화학요법 및 방사선 요법에도 불구하고, 가장 통상적인 신경교종인 다형성 교아종은 거의 보편적으로 치명적이다[Schoengerg, in Oncology of the Nervous System, M. D. Walker, ed., Boston, Mass, Marinus Nijhoff(1983); Levin et al., Chapter 46 in Cancer; Principles and Practice of Oncology, vol.2, 3판, De Vita et al., eds., Lippincott Press, Philadelphia(1989), 1557-1611쪽].
신경교종은 모든 1차 뇌 종양의 거의 40%를 나타내고, 다형성 교아종은 가장 악성인 형태를 구성한다[Schoengerg, "The Epidemiology of Nervous System Tumors," in Oncology of the Nervous System, Walker, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1983)]. 현행 치료 양식(외과술, 방사선 요법 및/또는 화학요법)을 적용한 경우, 높은 등급 유형의 성상세포종을 가진 사람의 경우 5년간의 생존률은 5% 이하이다[Mahaley et al., Neurosurgery 71:826-836 (1989); Schoengerg, in Oncology of the Nervous System, Walker, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1983); Kim et al., Neurosurg. 74:27-37(1991), Daumas-Duport et al., Cancer 2:2152-2165(1988)]. 방사선 요법으로 치료 후, 교아종은 통상 국부적으로 재발한다[Hochberg, F.H., et al., Neurology 30:907-911(1980)]. 교아종이 있는 개체에서 신경성 기능부전 및 사망은 종양의 국소적 성장에 기인한다. 전신 전이는 드물다[상기 문헌]. 이러한 이유로 인하여, 전신적 방법보다는 국부적 암 요법이 교아종의 치료에 특히 적절할 것이다.
또한, 교아종은 다수의 화학요법제에 내성이 있는데, 아마도 이러한 종양 유형의 증식 특성에 기인하는 것 같다. 다수의 화학요법제는 세포-주기-활성이다. 즉 활발한 순환(cycling) 세포에 일차적으로 세포 독성이 있다[Slapak, C.A., 및 Kufe, D.W., "Principles of Cancer Therapy," in Harrison's Principles of Internal Medicine, Fauci, A.S. 등, eds., 14 판, McGraw-Hill Cos., Inc., New York, 1998, 527]. 일반적으로, 화학요법은 종양의 성장비가 최대일때 소형 종양 적재물을 갖는 암에서 가장 효과적이다[상기 문헌]. 교아종 종양의 성장비는 단지 30%이고, 세포의 나머지 70%는 Go, 즉 휴지기에 있다(Go의 세포는 죽거나 또는 활성 세포주기로 재진입할 수 있다)[Yoshii 등, J.Neurosurg. 65:659-663(1986)]. 활발하게 분열되는 교아종 세포의 30%가 이러한 종양의 치사 과정에 기여하지만, 휴지기인 70%는 활발하게 증식하는 세포를 표적으로 하는 다수의 화학요법제에 대하여 이들 종양이 내성을 갖게 한다.
불행하게도, 외과술 및 방사선 요법과 같은 국부적 치료는 교아종의 치료에서 제한적으로 성공하였다[Burger et al., J. Neurosurg. 58: 159-169(1983); Wowra et al., Acta Neurochir. (Wein) 99: 104-108(1989); Zamorano et al., Acta Neurochir. Suppl. (Wien) 46:90-93(1989)]. 교아종의 외과적 치료는 종양과 주위 실질(paranchyma)간에 특징적 경계의 부족에 의하여, 또한 주요 부위로부터 뻗어나온 백색 물질관내 종양 세포의 이동에 의하여 방해된다[Burger et al., J. Neurosurg. 58:159-169(1983)]. 이는 완전한 제거를 불가능하게 한다. 빠르게 증식하는 세포를 표적화하는 방사선 치료는 교아종내 저 성장비와, 주변 정상 조직의 방사선 감성에 의하여 제한된다[Wowra et al., Acta Neurochir.(Wien) 99: 104-108(1989)]; Zamoramo et al., Acta Neurochir. Suppl.(Wien) 46:90-93(1989)]. 따라서, 새로운 접근법이 뇌종양의 치료에 특히 요구된다.
B. 바이러스를 사용한 암 요법의 비통상적 접근법
암 요법의 한 비통상적 접근법은 신생물 세포를 표적으로 하는 돌연변이된 바이러스를 이용한다[참조, Chung, R.Y. and Chiocca, E.A., Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7:589-602(1989)].
제안된 바이러스 암 요법은 2가지 특징적 접근을 포함한다:(1) 돌연변이된 바이러스에 의한 직접적 세포 사멸(종양세포붕괴: oncolysis)[Martuza et al., Science 252: 854-856(1991); Mineta et al., Nature Med 1:938-943(1995); Boviatsis et al., Cancer Res. 54: 5745-5751 (1994); Kesari, et al., Lab. Invest. 73: 636-648 (1995); Chambers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-1415(1995); Lorence, R.M. et al., J. Natl. Cancer. Inst. 86: 1228-1233(1994); Bischolff, et al., Science 274: 373-376(1996);Rodriguez et al., Cancer Res. 57: 2559-2563(1997)] 및 (2) 발현 생성물이 화학요법제를 활성화시키는 이식유전자(transgene)를 전달하는 바이러스 벡터의 사용[Wei et al., Human Gene Therapy 5: 969-978 (1994); Chen 및 Waxman, Cancer Res. 55:581-589(1995); Moolten, Cancer Gene Ther. 1: 279-287(1994); Fakhrai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2909-2914(1996); Roth et al., Nature Med. 2: 985-991(1996); Noolten, Cancer Res. 46:5276-5281(1986); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057(1994)].
1. 바이러스 종양세포붕괴
종양세포붕괴제로서 사용하기 위한 바이러스의 유전공학은 초기에는 복제-불능 바이러스의 사용에 초점을 맞추고 있었다. 이러한 전략은 비-종양 세포가 바이러스에 의하여 상해를 입는 것을 피하기 위한 것이었다. 상기 방법의 주요 한계는 상기 복제-불능 바이러스가 숙주 세포내에서 통합 및/또는 복제를 가능하게 하는 헬퍼 바이러스를 요구한다는 점이었다. 바이러스 종양세포붕괴 접근법의 일례로서, 신경계 종양의 치료를 위해 복제-결함 레트로바이러스를 사용하려면 바이러스를 증식시키기 위한 생산자 세포주를 이식해야 한다. 이 레트로바이러스는 효능에 제한을 받는다. 왜냐하면 각 복제-결함 레트로바이러스 입자가 단일 세포에만 들어갈 수 있고 이후 다른 것들을 생산적으로 감염시킬 수 없기 때문이다. 따라서, 이들은 생산자 세포로부터 멀리 증식할 수 없고, 생체내 깊숙한 다층 종양에 완전히 침투할 수 없다[Markert et al., Neurosurg. 77:590(1992); Ram et al., Nature Medicine 3: 1354-1361(1997)].
더욱 최근에는, 종양세포붕괴 바이러스의 유전 공학은 바이러스를 기타 종양 세포로 증식시키면서 전신 감염을 피하기 위하여 복제-조건적 바이러스의 생성에 초점을 두고 있다. 복제-조건적 바이러스는 종양 세포와 같은 활발하게 분열하는 세포에서 우선적으로 복제하도록 설계된다. 따라서, 이러한 바이러스는 종양세포붕괴를 위해 종양 세포를 표적화하여, 상기 세포내에서 복제되어 바이러스를 기타 종양 세포로 퍼트릴 수 있다.
항암제로서 복제-조건적 바이러스 돌연변이체를 작제하기 위한 일부 최근 전략은 선택된 아데노바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형(HSV-1) 유전자내 돌연변이를 이용하여 이들이 복제-조건적이 되도록 만드는 것이다[Martuza, R.L., et al., Science 252:854-856(1991); Mineta, T., et al., Nature Med 1: 938-943(1995); Boviatsis, E. J., et al., Cancer Res. 54:5745-5751(1994); Kesari, S., et al., Lab. Invest. 73:636-648(1995); Chambers R., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:1411-1415(1995); Lorence, R.M. et al., J. Natl. Cancer. Inst. 83:1228-1233 (1994); Bischoff, J.R., et al., Science 274: 373-376(1996); Rodriguez, R., et al., Cancer Res. 57: 2559-2563(1997)]. 예를 들면, E1B-55Kd를 암호화하는 유전자내 결실을 갖는 아데노바이러스는 p53-결핍 종양 세포내에서 선택적으로 복제하는 것으로 밝혀졌다[Bischoff, J.R., et al., 상기문 헌 참조].
단일 유전자내 복제-조건적 HSV 돌연변이체의 2가지 넓은 유형이 현재까지 연구되고 있다. 제1 유형은 티미딘 키나제[Martuza, R.L., et al., Science 252:854-856 (1991)], 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)[Goldstein, D.J. & Weller,S.K., J. Virol. 62:196-205 (1998); Boviatsis, E.J., et al., Gene Ther. 1:323-331(1994); Boviatsis, E. J., et al., Cancer Res. 54:5745-5751(1994); Mineta, T., et al., Cancer Res. 54:3363-3366 (1994))], 또는 우라실-N-글리코실라아제[Pyles,R.B. and Thompson,R.I., J.Virol. 68:4963-4972 (1994)]와 같이 핵산 대사를 위하여 필요한 바이러스 유전자의 기능에 결함이 있는 바이러스 돌연변이체로 구성된다.
제2 유형은 γ34.5 유전자의 기능에 결함이 있는 바이러스 돌연변이체로 구성된다[Chambers, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1411-1415 (1995)]. 이는 숙주 단백질 합성의 정지를 억제시켜 감염된 세포의 바이러스 버스트(burst) 크기를 상당히 증가시킴으로써 독성 인자로서 작용한다[Chou,J.,et al., Science 250:1262-1266 (1990);Chou,J.and Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992)].
이러한 단일 돌연변이 균주는, 예를 들면 TK 돌연변이체용 간시클로비르(ganciclovir) 및 아시클로비르(acyclovir)에 대한 내성[Mineta, T.,et al., Cancer Res. 54:3363-3366 (1994)], 야생형 바이러스와의 단일 재조합 사건에 의해 야생형으로 역위할 위험성 및 적어도 특정 종양 세포주내에서 γ34.5 돌연변이체에 대한 종양세포붕괴 효과의 감소[Kramm, C.M., et al., Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997); Mohr.I. & Bluzman, Y., EMBO J. 15:4759-4766 (1996); Toda, M., et al., Hum. Gene Ther. 9:2177-2185 (1998)]와 같은 일부 고유 한계를 갖는다.
야생형 재조합의 위험을 감소시키기 위한 노력으로, 다중 돌연변이된 HSV 바이러스가 개발되었다. 이것은 돌연변이체 G207[Mineta, T., et al., Nat. Med. 1:938-943 (1995); 미국 특허 제5,585,096호, 1996년 12월 17일 공고(Martuza et al.)], 및 γ34.5의 카피와 PR의 삽입 돌연변이 양자가 결실된 MGH1[Kramm, C.M., et al., Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)]을 포함한다.
또다른 다중 돌연변이된 HSV 바이러스는 γ34.5/우라실 DNA 글리코실라아제(UNG) 돌연변이체 균주 3616UB이다[Pyles, R.B., et al., Hum. Gene Ther. 8:533-544(1997)]. 이러한 이중 돌연변이 균주는 두개내 직접 주사시 신경독성이 상당히 감소되고, 간시클로비르에 대한 감성을 유지하며, 정상 조직에 비하여 종양 세포내에서 상대적으로 선택적인 복제를 나타낸다. 이러한 이중 돌연변이 HSV 균주는 결함성 γ34.5 유전자를 보유하므로, 정상 조직에 대한 독성을 거의 나타내지 않는다. 이들은 종양 세포에 대하여 종양세포붕괴 효과를 명백하게 보여주지만, 이러한 효과는 온전한 γ34.5 유전자를 가진 돌연변이체내에서 관찰된 것보다는 낮다[Kramm, C.M., et al., Hum. Gene Ther. 8:2057-2068 (1997); Qureshi, N. and Chiocca, E.A., 비공개 데이타]. 반면에, 온전한 γ34.5 유전자에 의하여 나타난 독성은 온전한 γ34.5 유전자를 보유한 돌연변이체 바이러스의 종양세포붕괴제로서 의 잠재적 유용성을 감소시킬 수 있다.
2. 항암 이식유전자의 바이러스 전달
바이러스성 암 요법에서 제2 접근법은 항암 이식유전자의 바이러스 전달로서, 이에 의하여 표적 종양 세포의 표현형이 종양의 약물 감성 및 반응성을 증가시키도록 유전적으로 변형된다. 이러한 방법은 다른 무해제에 대한 감성을 부여하기 위하여 프로드럭 활성화 효소를 암호화하는 "화학감작(chemosensitization)" 또는 "자살" 유전자를 악성 세포로 직접 전달하는 것을 포함한다[Moolten,F.L., Cancer Gene Therapy 1:279-287 (1994); Freeman, S.M., et al., Semin Oncol. 23:31-45 (1996); Deonarain, M.P., et al., Gene Therapy 2:235-244 (1995)].
일부 프로드럭 활성화 유전자는 암 유전자 요법에 적용하기 위해서 연구되어 왔다. 일례로서, 프로드럭 간시클로비르와 함께 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK)는 암 유전자 요법의 가능한 용도에 있어서 당업계에 공지된 원형 프로드럭/효소 활성화계를 제공한다. HSV-TK는 프로드럭 간시클로비르를 인산화시키고, 활발하게 분열하는 세포에서 DNA 사슬 종결 및 세포 사멸을 유도하는 뉴클레오시드 유사체를 생성한다. HSV-TK로 형질도입된 종양 세포는 바이러스 감염의 치료를 위하여 최초로 설계된 임상적으로 증명된 제제인 간시클로비르에 대한 감성을 획득하였다[Moolten, F.L. and Wells.J.M., J.Natl.Cancer Inst. 82:297-300 (1990); Ezzeddine, Z.D.,et al., New Biol. 3:608-614 (1991)].
제2 예로서, 박테리아 유전자 시토신 디아미나제(CD)는, 공지의 암 화학요법제인 5-플루오로우라실로의 변형의 결과로서 항진균제 5-플루오로시토신에 대하여 종양 세포를 감작시키는 것으로 알려진 프로드럭/효소 활성화계이다[Mullen,C.A.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:33-37 (1992); Huber, B.E.,et al., Cancer Res. 53:4619-4626 (1993); Mullen, C.A., et al., Cancer Res. 54:1503-1506 (1994)].
이러한 약물 감수성 유전자를 사용하는 최근 연구는 유망한 결과를 산출하였다. Caruso, M., et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90:7024-7028 (1993); Oldfield E., et al., Hum. Gene Ther. 4:39(1993); Culver,K., Clin. Chem 40:510 (1994); O'Malley,Jr., B.W., et al., Cancer Res. 56:1737-1741 (1996); Rainov, N.G., et al., Cancer Therapy 3:99-106 (1996) 참조.
몇가지 다른 프로드럭-활성화 효소계가 또한 연구되었다[(T.A. Connors, Gene Ther. 2:702-709 (1995)]. 이것은 포유류 상동체를 갖지 않고, 활성의 세포독성 머스타드 대사산물을 방출하도록 글루탐산 부분의 절단에 의하여 특정 합성 머스타드 프로드럭을 활성화시키는데 사용될 수 있는 박테리아 효소 카르복시펩티다아제 G2[Marais, R., et al., Cancer Res. 56: 4735-4742 (1996)]와, 프로드럭 CB1954 및 관련 머스타드 프로드럭 유사체를 활성화시키는 이.콜리 니트로 리덕타제[Drabek, D., et al., Gene Ther. 4:93-100 (1997); Green, N.K., et al., Cancer Gene Ther. 4:229-238 (1997)]를 포함한다. 머스타드 관련 프로드럭 유사체의 일부는 CB1954보다 우수할 수 있다[Friedlos, F. et al., J Med Chem 40:1270-1275(1997)]. 프로드럭 활성화 유전자 요법에 대한 이러한 접근법에서 강조하는 원칙은 외래 유전자를 종양 세포군에 형질도입하여 고유의 프로드럭 활성 성능을 부 여하므로서, 유전자를 발현하지 않는 숙주 세포에 부재하는 화학감성을 부여하는 것이다.
더욱 최근에, 약물 활성화/유전자 요법은 P450-촉매된 모노옥시제나제 반응을 통하여 활성화되는 암 화학요법제와 함께 시토크롬 P450 유전자("CYP" 또는 "P450")에 기초하여 개발되었다[Chen, L. and Waxman, D.J., Cancer Research 55:581-589 (1995); Wei, M.X., et al., Hum. Gene Ther. 5:969-978 (1994); 미국 특허 제5,688,773호, 1997년 11월 18일 공고]. 전술된 프로드럭 활성화 전략과 달리, P450-계 약물 활성화 전략은 (박테리아 또는 바이러스 유도된 유전자보다는) 포유류 약물 활성화 유전자를 이용하고 또한 암 요법에서 널리 사용되는 기존의 화학요법 약물을 이용한다.
다수의 항암 약물은 시토크롬 P450 효소에 의하여 산화되어 종양 세포에 대한 세포독성 또는 세포증식억제성(cytostatic)인 대사산물을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이들은 일부 통상적으로 사용되는 암 화학요법 약물, 예를 들면 시클로포스파미드(CPA), 이것의 이성체인 이포스파미드(IFA), 다카르바진, 프로카르바진, 티오-TEPA, 에토포시드, 2-아미노안트라센, 4-이포메아놀 및 타목시펜을 포함한다[Le Blanc, G.A. and Waxman, D.J., Drug Metab. Rev. 20:395-439 (1989); Ng, S.F. and Waxman D.J., Intl. J. Oncology 2:731-738 (1993); Goeptar. A.R., et al., Cancer Res. 54:2411-2418 (1994); van Maanen,J.M., et al., Cancer Res. 47:4658-4662 (1987); Dehal, S.S., et al., Cancer Res. 57:3402-3406 (1997); Rainov, N.G., et al., Human Gene Therapy 9:1261-1273 (1998)]
이러한 방법의 한 예로서, 종양 세포는 CYP2B1의 형질도입에 의하여 CPA 또는 IFA에 대한 고도의 감성을 갖게 되었다. 상기 CYP2B1은 높은 비율의 CPA와 IFA 활성을 나타내는 간 P450 효소를 암호화한다[Clarke, L. and Waxman, D.J., Cancer Res. 49:2344-2350 (1989); Weber, G.F. and Waxman, D.J., Biochem. Pharmacol. 45:1685-1694 (1993)]. 이러한 향상된 화학감성은, 생체내 누드 마우스에서 성장된 인간 유방 종양 및 피하 설치류 고형 종양 모델을 사용한 연구 및 시험관내 연구 모두에서 입증되었고, 마우스에서의 약물 활성을 위한 실질적 간-결합된 성능의 존재에도 불구하고 눈에 띄게 효과적이다[Chen, L., et al., Cancer Res. 55:581-589 (1995); Chen, L., et al., Cancer Res. 56:1331-1340 (1996)]. P450-계 접근법은 또한 뇌 종양의 치료시 유전자 요법의 응용을 위한 상당한 유용성을 보여준다[Wei, M.X., et al., Human Gene Ther. 5:969-978 (1994); Manome, Y., et al., Gene Therapy 3:513-520 (1996); Chase, M., et al., Nature Biotechnol. 16:444-448 (1998)].
프로드럭 활성화 또는 "자살" 유전자를 포함하는 이식유전자 이외에, 항암 이식유전자의 기타 유형, 예를 들면 (종양에 대하여 면역 방어를 증진시키는)시토킨 유전자[Blankenstein, T., et al., J. Exp. Med. l73:1047-1052 (1991); Colombo, M.P., et al., Cancer Metastasis Rev. 16:421-432 (1997); Colombo, M.P., et al., Immunol, Today 15:48-51 (1994)] 및 기타 종양 독소 유전자, 예컨대 디프테리아 독소[Coll-Fresno, P.M., et al., Oncogene 14:243-247 (1997)], 슈도모나스 독소, 항혈관형성 유전자, 종양 백신화 유전자, 종양 억제인자 유전자, 방사선 감성 유전자, 안티센스 RNA 및 리보자임[Zaia,J.A., et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 660:95-106 (1992)]을 연구하였다.
바이러스에 기초한 방법 및 유전자에 기초한 방법 모두 종양의 동물 모델에 상당한 치료 효과의 증거를 제공하였지만, 각 방법은 고유의 한계로 인하여 제한된다. 바이러스에 기초한 방법은 이론적으로는 종양 덩어리내 확산과 동시에 바이러스의 광범위한 복제에 대한 가능성을 제공하지만, 이것의 효과는 바이러스 감염의 효과; 일부 바이러스 벡터의 경우 헬퍼 바이러스 또는 생산자 세포주의 요구; 기타 바이러스 벡터를 위한 바이러스 돌연변이체 성장을 보조하는 세포성 인자(들)에 대한 종양 세포 이종성[Sidranski et al., 355:846-847 (1992); Bigner et al. J.Neuropathol. Exp. Neurol. 40: 201-229 (1981)]; 및 항바이러스 면역 반응에 의하여 제한된다.
지금까지 시험한 유전자에 기초한 방법에서, 종양 덩어리내 세포의 형질도입의 효능은 벡터의 결함 특성에 의하여 제한된다. 실제로, 양성적으로 형질도입된 세포의 대부분은 벡터 접종의 부위로부터 소수의 세포층내에서 발생한다[Nilaver et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 21:9829-9833 (1995); Muldoon et al., Am. J. Pathol. 147:1840-1851 (1995); Ram Z. et al., J. Neurosurg. 82, 343A (초록)(1995)]. 또한, 생산자 세포주가 불필요하거나, 또는 자살 유전자/약물 배합에 의하여 사멸되지 않는 바이러스 벡터계에서조차 바이러스 복제는 사용된 약물에 의하여 저해될 수 있다. 나아가, 자살 유전자/약물 배합이 TK/GCV인 경우, 종양 세포를 죽이는 약물의 능력은, DNA 복제의 과정에서 GCV가 세포만을 표적화하기 때문 에 세포의 세포 주기의 단계에 의하여 제한된다. 따라서, 이러한 복제-결함 벡터에 의한 치료 유전자 전달은, 치료 유전자가 시토킨 또는 CPA 대사산물과 같이 자유롭게 확산가능한 항암제를 생산하는 경우에도 접종 부위로부터 먼 종양 세포에 영향을 미칠 것 같지 않다.
따라서 정상 조직에 대한 독성은 결여되어 있으면서, 종양 또는 기타 표적화된 세포군에 대한 선택적 독성을 달성하기 위한 수단을 제공할 수 있는 안전하고 효과적인 바이러스 돌연변이체가 필요하다.
본 발명의 요약
따라서, 본 발명은 γ34.5 작용의 전사적 재표적화에 의하여 바이러스 종양세포붕괴를 위하여 선택적으로 신생물 세포를 표적화할 수 있는 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 제공함으로써 선행 기술의 단점을 극복한다. 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 또한 기타 세포군을 표적화할 수 있다.
구체적이지만 비제한적인 예로서, 본 발명자들은 세포-주기 조절된 세포성 B-myb 프로모터의 전사적 제어 하에 RR/γ34.5 이중 돌연변이 균주(MGH1)내로 γ34.5 유전자를 재도입하였다. 이러한 신규한 종양세포붕괴성 바이러스("Myb34.5"라고 명명)는 야생형 γ34.5 유전자를 보유하는 단일 RR 돌연변이체 바이러스와 같이 종양세포붕괴성이지만, γ34.5-결실 돌연변이체와 유사한 바람직한 독성 프로필을 보유한다는 것을 입증하였다. 따라서 이러한 발견은, 감염된 세포에서 단백질 합성이 중단되는 것을 방지하는 역할을 하는 바이러스 유전자를 전사적 재표적화하 여 선택적 종양세포붕괴를 달성하는 수단을 제공한다는 것을 보여준다. 따라서, γ34.5의 발현의 전사적 재표적화는 종양 또는 기타 표적화 세포군에 대한 선택적 독성을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 γ34.5를 암호화하는 유전자의 2개 카피에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다. 여기서, γ34.5 유전자의 하나 이상의 카피는 세포 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터의 전사적 제어하에 재도입된다.
물론, γ34.5 유전자 외에, 헤르페스 바이러스 유전자의 하나 이상의 특정한 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이가 존재할 수 있다. 이는 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR) 또는 더욱 구체적으로 RR의 대형 서브유닛을 암호화하는 유전자내 결실을 포함한다. 이와는 달리, RR을 암호화하는 유전자는 소형 서브유닛(UL40)을 암호화한다. 임의의 기타 헤르페스 바이러스 유전자, 예컨대 티미딘 키나제(TK), 우라실 DNA 글리코실라제(UNG) 또는 dUTPase가 또한 결실될 수 있다. 이러한 바이러스 유전자는, 이 유전자의 포유류 상동체가 신생물 세포와 같이 E2F 수준이 상승된 세포내에서 종종 상향 조절되어, 결실된 바이러스 효소를 보충할 수 있으므로 이들 세포에서의 선택적 복제를 촉진시키기 때문에 바람직하다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 헤르페스 돌연변이체는 그 생성물이 종양 세포에 세포독성일 수 있는 이식유전자를 전달할 수 있다. 예를 들면, 상기 이식유전자는 화학요법제(예, HSV-TK, CD 또는 시토크롬 P450과 같은 자살 유전자)를 활성화 또는 향상시킬 수 있는 생성물을 암호화한다. 또는, 상기 이식유전자는 종양 면 역원성(예, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터루킨(IL-2, IL-4), 인터페론-γ, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF))을 증강시키는 시토킨 유전자, 종양 억제인자 유전자, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 종양파괴 유전자, 예를 들면 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 항혈관형성 유전자, 종양 백신화 유전자, 방사선감성 유전자, 안티센스 RNA, 또는 리보자임)일 수 있다. 따라서, 본 구체예에서, 헤르페스 돌연변이체는 화학요법제를 그것의 세포독성 형태로 변형시킬 수 있는 유전자 생성물을 암호화하는 트래스 유전자, 시토킨 유전자 또는 임의의 다른 종양파괴 이식유전자를 추가로 포함한다. 상기 이식유전자는 최초의 γ34.5 결실에 삽입될 수 있으며 또는 UL40 유전자좌내 어디라도 삽입될 수 있다.
본 발명은 이식유전자가 화학요법제를 활성화시키는 자살 유전자를 암호화하는 상기한 헤르페스 바이러스 돌연변이체의 바람직한 구체예를 제공한다. 이러한 자살 유전자의 특히 바람직한 예는 포유류 시토크롬 P450이다. 더욱 구체적으로, 이러한 시토크롬 P450은 P450 2B1이고, 또는 대안적으로 P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 또는 P450 3A4일 수 있다. P450 2B1이 특히 바람직하다. 이러한 자살 유전자가 전술한 바이러스 돌연변이체에 존재한다면, 활성화될 수 있는 화학요법제는 옥사조스포린류의 일원이다. 특히, 상기 제제는 시클로포스파미드, 이포스파미드, N-메틸 시클로포스파미드, 메틸클로로프로필니트로소우레아, 시클로포스파미드 중합체, 이포스파미드 중합체, N-메틸시클로포스파미드 중합체, 메틸클로로프로필니트로소우레아 중합체일 것이다.
또한 본 발명은 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체의 구체예를 제공한다. 여기서, 상기 헤르페스 돌연변이체는 헤르페스 심플렉스 바이러스, 더욱 구체적으로 상기 돌연변이체는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1형 또는 2형이다. HSV-1이 특히 바람직하다.
본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 HSV-1로부터 유도되며, (a) γ34.5를 암호화하는 유전자의 2개 카피에서 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및 (b) 프로모터가 γ34.5 유전자의 발현을 유도하도록, 세포-유형 특이성 및/또는 종양 특이성 프로모터의 전사적 제어 하에 상기 γ34.5 유전자의 적어도 하나의 카피의 삽입을 포함한다.
γ34.5 외에, 기타 헤르페스 바이러스 유전자내 결실 또는 돌연변이가 또한 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체 내에 존재할 수 있다. 헤르페스 RR, TK, UNG 또는 dUTPase의 결실은 헤르페스 바이러스 유전자의 예이다.
이러한 구체예에서, 세포 특이적 프로모터 또는 종양 특이적 프로모터는 종양 유형 및/또는 세포 유형 특이적 유전자 발현을 조절하는 특성 규명이 잘된 조절 인자중의 임의의 하나일 수 있다, 참조예, Miller, N. 및 Whelan, J. Hum. Gene Ther. 8:803-815(1997); Walther, W. and Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392(1996); Schnierle, B.S. and Groner, B., Gene Therapy 3:1069-1073(1996); Lan, K-H., et al., Cancer Res. 57:4279-4284 (1997); Clary, B.M., et al., Cancer Gene Therapy 7:565-574 (1998); Dachs, G.U.,et al., Oncol. Res. 9:313-325 (1997)].
종양 특이적 프로모터의 대표적인 예는 DF3(MUC1)(대부분의 유방암에서 과발 현됨)[Ade, M. and Kufe, D., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:282-286 (1993); Manome, Y., et al., Gene Ther. 2:685, A051 (1995); Chen, L., et al., J. Clin Invest. 96:2775-2782 (1995)]; AFP(간암에서 과발현됨)[Arbuthnot, P., et al., Hepatology 22:1788-1796 (1995); Ido, A., et al., Cancer Res. 55:3105-3109 (1995)]; CEA(결장암 및 폐암에서 과발현됨)[Thompson, J.A.,et al., J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366(1991); Osaki, T., et al., Cancer Res. 54:5258-5261 (1994)]; PSA(전립선암에서 과발현됨)[Lundwall,A.,Biochem. Biophys. Res. Commun, 161:1151-1156 (1989)]; 티로시나제(흑색종에서 과발현됨)[Vile, R.G. and Hart, I.R., Cancer Res. 53:962-967 (1993); Vile, R.G. and Hart, I.R.,Ann.Oncol 5(Suppl.4):S59-S65 (1994); Hart, I.R., et al., Curr. Opin. Oncol. 6:221-225 (1994)]; 및 c-erbB2(유방암, 췌장암, 난소암 또는 위암에서 과발현됨)[Hollywood,D, and Hurst,H., EMBO J 12:2369-2375 (1993)]를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 종양 특이적 프로모터는 B-myb이다. 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체의 특히 바람직한 구체예에서, 바이러스 돌연변이체는 Myb34.5이다.
세포 특이적 프로모터의 예는 다음과 같다: 내피 세포에서 발현되는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체(flk1) 프로모터[Kappel et al. Blood 93: 4282-4292 (1999)]; 췌장의 베타 세포에서 발현되는 인슐린 프로모터[Ray et al., J. Surg. Res. 84: 199-203 (1999)]; 시상하부의 세포에서 발현되는 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 유전자[Albarracin et al., Endocrinology 140:2415-2421 (1999)]; 파골 세포와 각질세포에서 발현되는 기질 메탈로프로테인아제 9 프로모터[Munant et al., J. Biol. Chem. 274: 5588-5596 (1999)]; 골세포에서 발현되는 부갑상선 호르몬 수용체[Amizuma et al., J. Clin. Invest. 103: 373-381 (1999)]; 노르아드레날린성 뉴런에서 발현되는 도파민 베타-히드록실라아제 프로모터[Yang et al., J. Neurochem. 71:1813-1826 (1998)].
또한 본 발명은 (a) γ34.5를 암호화하는 유전자내 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및 (b) 프로모터가 γ34.5 유전자의 발현을 유도하도록, 종양 특이적 프로모터의 전사적 제어 하에 상기 γ34.5 유전자의 적어도 하나의 카피의 삽입을 포함하는 헤르페스 바이러스 돌연변이체로 신생물 세포를 감염시키는 단계 및 상기 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 단계를 포함하여, 전술한 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 사용하여 공지된 종양 특이적 프로모터가 과발현되는 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 방법을 제공한다..
종양 특이적 프로모터의 대표적 예는 다음과 같다: DF3(MUC1)(대부분의 유방암에서 과발현됨)[Abe,M. and Kufe, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:282-286 (1993); Manome, Y.,et al., Gene Ther. 2:685, A051 (1995); Chen, L., et al., J. Clin, Invest. 96:2775-2782 (1995)]; AFP(간암에서 과발현됨)[Arbuthnot, P., et al., Hepatology 22:1788-1796 (1995); Ido, A., et al., Cancer Res. 55:3105-3109 (1995)]; CEA(결장암 및 폐암에서 과발현됨)[Thompson, J.A., et al., J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366 (1991); Osaki, T., et al., Cancer Res. 54:5258-5261 (1994)]; PSA(전립선암에서 과발현됨)[Lundwall,A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:1151-1156(1989)]; 티로시나제(흑색종에서 과발현됨)[Vile, R.G. and Hart, I.R., Cancer Res. 53:962-967 (1993); Vile,R.G. and Hart, I.R., Ann. Oncol 5 (Suppl.4):S59-S65 (1994); Hart, I.R., et al., Curr. Opin Oncol. 6:221-225 (1994)]; 및 c-erbB2(유방암, 췌장암, 난소암 또는 위암에서 과발현됨)[Hollywood,D,and Hurst, H., EMBO J 12:2369-2375 (1993)].
종양 특이적 프로모터는 B-myb가 바람직하다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 바이러스 돌연변이체는 Myb34.5이다.
γ34.5 외에, 기타 헤르페스 바이러스 유전자의 결실 또는 돌연변이도 본 발명의 방법에 사용된 헤르페스 바이러스 돌연변이체에 존재할 수 있다. 헤르페스 RR, TK, UNG 또는 dUTPase에서의 결실은 예시적 헤르페스 바이러스 유전자이다.
또한, 본 발명은 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 상기 방법을 제공한다. 여기서, 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 이식유전자를 추가로 포함하고, 상기 이식유전자는 자살 유전자, 시토킨 유전자 또는 임의의 종양파괴 유전자이다. 이식유전자가 자살 유전자라면, 상기 방법은 상기 자살 유전자에 의하여 활성화될 수 있는 화학요법제와 신생물 세포를 접촉시키는 단계 및 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 자살 유전자는 시토크롬 P450이다. P450 2B1이 특히 바람직하다. 대안적으로, 암호화된 시토크롬 P450은 P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 또는 P450 3A4이다. 또한, 화학요법제는 옥사조포린류의 일원, 특히 시클로포스파미드, 이포스파미드, N-메틸 시클로포스파미드, 메틸클로로프로필니트로소우레아, 시클로포스파미드 중합체, 이 포스파미드 중합체, N-메틸 시클로포스파미드 중합체, 메틸클로로프로필니트로소우레아 중합체가 바람직하다.
본 발명의 또다른 구체예는 (a) γ34.5를 암호화하는 유전자내 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및 (b) 프로모터가 상기 γ34.5 유전자의 발현을 유도하도록, 상기 세포 특이적 프로모터의 전사적 제어 하에 상기 γ34.5 유전자의 적어도 하나의 카피의 삽입을 포함하는 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이로 상기 표적 세포를 감염시키는 단계 및 상기 표적 세포군을 선택적으로 죽이는 단계를 포함하여, 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 사용하여 공지의 세포 특이적 프로모터가 과발현되는 표적 세포군을 선택적으로 제거하는 방법이다.
세포 특이적 프모로터의 예는 다음과 같다: 내피 세포에서 발현되는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체(flk1) 프로모터[Kappel et al. Blood 93:4282-4292 (1999)]; 췌장의 베타 세포에서 발현되는 인슐린 프로모터[Ray et al. J. Surg. Res. 84:199-203 (1999)]; 시상하부의 세포에서 발현되는 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 유전자[Albarracin et al., Endocrinology 140:2415-2421 (1999)]; 파골세포와 각질세포에서 발현되는 기질 메탈로프로테인아제 9 프로모터[Munant et al., J. Biol. Chem. 274: 5588-5596 (1999)]; 골세포에서 발현되는 부갑상선 호르몬 수용체[Amizuma et al., J. Clin. Invest. 103: 373-381 (1999)]; 노르아드레날린성 뉴런에서 발현되는 도파민 베타-히드록실라아제 프로모터[Yang et al., J. Neurochem. 71: 1813-1826 (1998)].
γ34.5 외에, 기타 헤르페스 바이러스 유전자에서의 결실 또는 돌연변이가 본 발명의 방법에서 사용된 헤르페스 바이러스 돌연변이체에 존재할 수 있다. 헤르페스 RR, TK, UNG 또는 dUTPase에서의 결실은 예시적 헤르페스 바이러스 유전자이다.
이러한 구체예의 적용의 예는 다음과 같다:
1) 유해성 세포군을 제거하기 위한 치료 선택: 예를 들면 대뇌 모야-모야(Moya-Moya)병과 같은 과도한 혈관신생 상태에서, 감마 34.5 유전자 발현을 유도하는 flk1 수용체 프로모터를 사용하여 이 질병을 일으키는 혈관을 선택적으로 제거할 수 있다. 또다른 예로는, 골다공증과 같은 광범위한 골의 개조 및 뼈의 제거 상태에서 기질 메탈로프로테인아제 9 또는 부갑상선 호르몬 수용체를 사용하여 감마 34.5의 발현을 유도하면 파골세포에서 추가적인 뼈의 개조를 제거할 수 있다.
2) 발달 과정 연구: 세포군의 제거가 발달 과정에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 예컨대 도파민-베타-히드록실라아제 프로모터를 사용하여 노르아드레날린성 뉴런을 제거한 다음, 동물 발달에 미치는 영향을 연구할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 임의의 바이러스 돌연변이체를 함유하는 약학 조성물로서, 이 조성물은 또한 하나 이상의 약학적 허용 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 본 발명의 본질 및 범위내에서 다양한 변형 및 변화가 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하기 때문에, 상세한 설명 및 구체적 예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내지만 단지 예시의 목적으로 제시된 것이다.
도 1A-1D. 도 1A는 HSV 균주 F(야생형), MGH1(이중 RR(ICP6)/γ34.5 돌연변이체), 및 Myb34.5의 개략 지도를 도시한다. 모든 균주는 2개의 고유 단편, UL 및 US(각각 역방향 반복 인자 ab 및 ca가 측면에 인접)를 가진 전형적인 HSV 게놈을 포함한다[McGeoch, D.J., et al., J. Gen. Virol. 72:3057-3075 (1991)]. 고유 분절 또는 반복 분절 내의 위치에 따라 HSV 유전자가 하나 또는 두개의 카피내에 존재한다. 검정 박스는 ICP6내의 BamHI 부위로의 lacZ 삽입을 나타내며[Goldstein,D.J. & Weller,S.K., J.Virol. 62:2970-2977 (1988)], △는 MGH1 및 Myb34.5의 γ34.5내의 결실을 나타낸다[Kramm, C.M., et al., Hum. Gene Ther. 8: 2057-2068(1997)]. 사선은 ICP6 유전자좌 내로의 B-myb 프로모터-γ34.5 작제물의 재조합을 나타낸다.
도 1B는 서던 블롯 분석에 의하여 HSV 돌연변이체 Myb34.5의 특징을 나타낸다. ICP6에 대한 전장 프로브와 XhoI로 절단된 바이러스 DNA의 하이브리드화로 MHG1(레인 2)과 MybRevt(레인 4)에서 전장 lacZ이 삽입된 ICP6 유전자의 경우 예상되는 9.0 kB 단편 크기를 보여준다. Myb34.5(레인 3)에는 B-myb 프로모터/γ34.5 카셋트에 의한 치환이 존재하며, 6.7 kB 밴드를 나타내는 ICP6의 결실이 추가로 존재한다. 야생형 F 균주의 DNA는 레인 1에 있다.
도 1C는 lacZ 프로브와의 하이브리드화를 나타내고, MGH1(레인 2) 및 MybRevt(레인 4)를 갖는 단편을 보여준다. Myb34.5와의 하이브리드화는 나타나지 않는다(레인 3).
도 1D는 R3616과 MGH1의 결실된 영역의 내부에 있는 γ34.5의 BstEII-Bbs 단편을 나타낸다. 이는 BamHI 분해된 Myb34.5 DNA내 5.3 kB 단편(레인 3)과, F내 수개의 밴드를 보여준다(레인1). 그러나, MGH1(레인 2) 또는 MybRevt(레인 4)와 하이브리드화하지 않는다.
도 2는 돌연변이체 바이러스 균주에 의한 숙주 단백질 합성 중단의 저해를 입증하는 전기영동적으로 분리된 감염된 세포의 용해물의 방사선사진 이미지를 나타낸다. 인간 신경아세포종 세포(SK-N-SH)를 1×106 세포/100 mm 접시에 평판 배양하였다. 24 시간후 세포를 3.0의 MOI로 감염시켰다. 바이러스 감염 15 시간 후에, 세포를 메티오닌 무함유 배지로 간단하게 세척하고 60 μCi S35-메티오닌을 함유하는 배지로 90분 동안 항온처리하였다[Toda, M. et al, Hum. Gene. Ther. 9:2177-2185(1998)]. 표지한 후, 세포를 수거하고, SDS 함유 완충액에서 용해시키고, 10% 아크릴아미드겔 상에서 전기영동시켰다. 이 겔을 니트로셀룰로스로 이전하고 방사선사진 촬영하였다. 감염된 세포 폴리펩티드는 문헌[Morse, L.S., et al., J.Virol. 26:389-410(1978)]에 따라 설계하였다.
도 3은 정지세포 및 순환(cycling) 세포에서 바이러스 복제를 나타내는 막대 그래프이다. 인간 배아-유도된 일차 섬유아세포(CRL 7706)를 1×105 세포/60 mm 접시로 평판배양하였다. 평판 배양 48시간 후에, 36시간 동안 20 μM 로바스타틴 함유 DMEM으로 배지를 교체하였다(빗금 막대). 3중 평판을 계수하고 다양한 돌연변이 균주(3중 실험)를 사용하여 1.0의 다중 감염도(MOI)로 감염시켰다. 감염 48 시간 후 세포 및 상청액을 수거하고, 동결-해동 주기로 바이러스를 유리시켰다. 10% 태아 소 혈청을 함유하는 배지내에 남겨둔 세포를 사용하여 대등한 실험을 수행하였다(검은 막대). 바이러스 산출량은 베로(Vero) 세포상의 플라크 분석에 의하여 결정하였고, 로그 10 PFU/1×103 투입 바이러스(이 값은 3중 실험의 평균치를 반영)로서 나타난다. 로바스타틴 산출량은 시험된 바이러스에 대한 혈청을 사용하여 얻어진 것보다 통계적으로 낮았다(스튜던츠 t-테스트 수치: F, p=0.027, hrR3, p=0.001; MGH1, p=0.011; Myb34.5, p=0.001; MybRevt, p=0.003).
도 4A 및 4B는 Myb34.5에 의한 생체내 성장 저해를 도시한다. 유사한 실험에서, 래트 신경교육종 9L(도 4A) 및 인간 U87△EGFR 신경교종(도 4B) 세포를 누드 마우스의 측복부내 피하에 이식하였다. 시작일(1일)로부터 14일(9L) 및 10일(U87) 후, 비히클 또는 돌연변이 바이러스 균주를 종양내로 종양내 접종하였다. 화살표는 바이러스 주사 시기(1, 3, 5, 7일)를 나타내며, 수치는 그룹당 5마리 마우스(9L)의 평균 및 그룹당 6마리 마우스(U87△EGFR)의 평균이다.
도 4A에서, 종양 부피의 차이는 12, 18 및 33일 시점에서 유의적이었다(p<0.05, 변이의 일방 반복 측정). 도4B에서, 종양 부피의 차이는 18, 27 및 34일 시점에서 유의적이었다(p<0.05, 변이의 일방 반복 측정). 표 4에 제시된 바와 같이, 34일에는 p<0.005.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 바이러스 매개된 종양세포붕괴만으로, 또는 바이러스 매개된 종양세포붕괴 및 자살 유전자 요법의 병행에 의하여 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 것에 관한 것이다. 본 발명은 헤르페스 바이러스 돌연변이체, 이 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 사용하여 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 방법 및 상기 바이러스 돌연변이체를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 사용하여 표적 세포군을 선택적으로 제거하는 방법을 제공한다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 (a) γ34.5를 암호화하는 유전자의 2개 카피내 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및 (b) 프로모터가 γ34.5 유전자의 발현을 유도하도록, 종양 특이적 또는 세포 유형 특이적 프로모터의 전사적 제어 하에 γ34.5 유전자의 적어도 하나의 카피의 삽입을 갖도록 유전공학적으로 조작된 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 제공한다. 또한 헤르페스 돌연변이체는, 예컨대 RR, TK, UNG 및 dUTPase와 같은 기타 헤르페스 바이러스 유전자내 하나 이상의 추가적 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 또한 화학요법제, 시토킨 유전자 또는 임의의 기타 종양파괴 유전자를 활성화시키는 생성물을 암호화하는 이식유전자를 전달할 수 있다.
헤르페스 바이러스 돌연변이체의 고안
본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 헤르페스 바이러스의 몇가지 다른 유형으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 바이러스 돌연변이체를 유도하는데 사용될 수 있는 헤르페스 바이러스는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 시토메갈로 바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스 및 슈도라비에스 바이러스를 포함한다.
헤르페스 심플렉스 바이러스가 특히 관심의 대상이다. "헤르페스 심플렉스 바이러스"는 상술한 바와 같은 결실 또는 불활성화 돌연변이를 함유하는 아과(亞科) 헤르페스비리다에 알파(herpesviridae alpha)의 일원을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구체예는 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 작제하는데 HSV-1 또는 HSV-2를 사용하며, HSV-1이 가장 바람직하다.
HSV-1은 모든 척추동물 세포를 실질적으로 감염시킬 수 있는 인간 향신경성 바이러스이다. 자연 감염은 에피좀 상태로 DNA가 무한정 유지되는 통상 말초 신경절에서 용해, 복제 주기 또는 수립 잠복기가 뒤따른다. HSV-1은 153 킬로베이스인 이중가닥의 선형 DNA 게놈을 함유한다. 이는 McGeoch에 의하여 완전히 서열분석되었다[McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69: 1531 (1988); McGeoch et al., Nucleic Acids Res 14:1727 (1986); McGeoch et al., J. Mol. Biol. 181:1 (1985); Perry and McGeoch, J. Gen. Virol. 69:2831 (1988)]. DNA 복제 및 비리온 집합체는 감염된 세포의 핵에서 발생한다. 감염 후기에, 연쇄 바이러스 DNA는 게놈 길이 분자로 절단되어 비리온내로 포장된다. CNS에서 헤르페스 심플렉스 바이러스는 뉴런을 통하여 이동하여, 복제가 일어나는 핵으로, 전방 또는 후방으로, 축삭내 이동한다.
헤르페스 감마(γ) 34.5 유전자
공개된 결과는, 헤르페스 γ34.5 유전자의 하나 이상의 기능이 바이러스 감염에 대한 숙주 세포의 반응을 방해함을, 즉 세포고사(apoptosis)-유사 반응에서 숙주 단백질 합성 중단을 자극함을 보여주었다[Chou, J., et al., Science 250:1262-1266 (1990); Chou, J. and Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992); Chou, J., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:10516-10520 (1995)]. 유사한 기능이 병원성 바이러스에서 널리 발견된다[Cosentino, G.P.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9445-9449 (1995); Gale, M., Jr., et al., Mol. Cell Biol. l8:5208-5218 (1998); Katze, M.G., et al., Trends Microbiol. 3:75-78 (1995); Sharp, T.V., et al., Nuc. Acids Res. 21:4483-4490 (1993)].
γ34.5는 베로 세포내 배양물에서 바이러스 성장에 필수적이지 않지만, 바이러스가 마우스의 중추신경계(CNS)에 퍼질 수 있게 하고, CNS 복제에 이미 연루되어 있는 HSV 게놈 영역에 배치한다[Markovitz, N.S., et al., J. Virol. 71:5560-5569 (1997); Centifanto-Fitzgerald, Y.M., et al., J. Esp. Med. 155:475-489 (1982)]. 이는 γ34.5-암호화된 단백질이 이중가닥 RNA-의존성 키나제(PKR)를 저해한다는 사실에 기인할 수 있다. 바이러스 감염과 함께 통상적으로 나타나듯이, 이중가닥 RNA 분자에 노출시 PKR은 연장 개시 인자 eIF-2의 알파 서브유닛을 인산화시켜서, 단백질 합성을 저해한다[Chou, J., et al., Science 250:1262-1266 (1990); Chou, J. and Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992); Chou, J., et al., J.Virol. 68:8304-8311 (1994)]. γ34.5를 발현할 수 없는 돌연변이체를 사용하여 뉴런 기점의 세포를 감염시키면 세포성 단백질 합성이 중단되고 바이러스 생성이 제한되는 결과를 낳는다.
요약하자면, γ34.5의 존재하에서 HSV는 세포고사를 예방하여, 자손 바이러스의 생성을 가능하게 할 것이다. γ34.5의 부재시 세포는 죽고 감염성 HSV는 자손 바이러스를 생성할 수 없다. 따라서, 기관을 통한 HSV 감염/번식이 제거된다.
따라서, 본 발명의 종양 특이적 또는 세포 유형 특이적 프로모터/γ34.5 방법은 프로모터를 사용할 수 있는 세포내에서 바이러스의 생성을 가능하게 하지만, 프로모터를 작동시킬 수 없는 세포는 감염을 전파할 수 없을 것이다.
본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 γ34.5 유전자의 2개 카피내에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하며, 여기서 γ34.5 유전자의 적어도 한 카피는 세포 특이적 또는 종양 특이적 프로모터의 조절하에서 재도입된다.
본 명세서에서, 용어 "결실"은 γ34.5 유전자와 같은 유전자로부터 핵산을 제거하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "불활성화 돌연변이"는 유전자의 발현이 상당히 감소되거나, 또는 유전자 생성물이 비기능성이거나 이것의 기능이 상당히 감소된 유전자로의 돌연변이 또는 변형을 광범위하게 의미한다.
용어 "유전자"는 다른 지시가 없으면 유전자 생성물을 암호화하는 영역 뿐만 아니라 유전자를 위한 조절 영역, 예컨대 프로모터 또는 인헨서를 모두 포함한다.
이러한 변형을 달성하는 방법은 (a) 유전자 생성물의 발현을 방해하는 임의의 방법 또는 (b) 발현된 유전자를 비기능적으로 만드는 임의의 방법을 포함한다. 유전자의 발현을 방해하는 다수의 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 삽입, 결실 및/또는 염기 변화에 의한 유전자의 암호화 영역 또는 이것의 프로모터 서열의 변 형을 포함한다[참조, Roizman, B. and Jenkins, F.J., Science 229: 1208-1214 (1985)].
세포 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터
본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체에서, 세포 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터는 γ34.5의 발현을 유도하는데 사용된다. 프로모터는 종양 유형 및/또는 세포 유형 특이적 유전자 발현을 조절하는 잘 규명된 조절 인자중의 임의의 하나일 수 있다. 예컨대 Miller, N. and Whelan, J., Hum. Gene Ther. 8:803-815 (1997); Walther, W. and Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392 (1996); Schnierle, B.S. and Groner, B., Gene Therapy 3:1069-1073 (1996); Lan, K-H., et al., Cancer Res. 57:4279-4284 (1997); Clary, B.M., et al., Cancer Gene Therapy 7:565-574 (1998); Dachs, G.U., et al., Oncol. Res. 9:313-325 (1997) 참조.
"프로모터"는 통상 유전자 또는 오페론의 암호화 서열의 상류에 있는 DNA 영역을 의미하며, RNA 폴리머라아제와 결합하여 효소를 정확한 전사 개시 위치로 안내한다.
"세포 특이적 프로모터"는 특정 세포 유형에서 발현을 지시하는 프로모터를 의미한다. 당업자는 "종양 특이적" 프로모터가 "세포 특이적" 프로모터(즉, 종양 세포에 특이적)로서 간주될 수 있음을 알 것이다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같은 "세포 특이적 프로모터"는 다른 지시가 없으면 종양 특이적 프로모터를 제외하는 것이 명백하다. 세포 특이적 프로모터의 예는 내피 세포내에 발현되는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체(flk1) 프로모터[Kappel et al. Blood 93: 4282-4292 (1999)]; 췌장의 베타 세포에서 발현되는 인슐린 프로모터[Ray et al., J. Surg. Res. 84:199-203 (1999)]; 시상하부의 세포에서 발현되는 고나도트로핀-방출 호르몬 수용체 유전자[Albarracin et al., Endocrinology 140: 2415-2421 (1999)]; 파골세포와 각질세포에서 발현되는 기질 메탈로프로테인아제 9 프로모터[Munant et al., J. Biol. Chem. 274: 5588-5596 (1999)]; 골세포에서 발현되는 부갑상선 호르몬 수용체[Amizuma et al., J. Clin. Invest. 103:373-381 (1999)]; 노르아드레날린성 뉴런에서 발현되는 도파민 베타-히드록실라아제 프로모터[Yang et al., J. Neurochem. 71: 1813-1826 (1998)]를 포함한다.
또한, 세포-주기 조절된 프로모터는 세포 특이적 프로모터의 유형이다. 기타 세포 특이적 프로모터는 당업자에게 알려져 있다.
본 벡터의 구체예의 응용은 발달과정중 기관내 세포군의 선택적 제거를 연구하기 위한 동물 모델 뿐 아니라 기관내 유해한 세포군의 선택적 제거를 포함한다. 구체예 응용의 예시는 다음과 같다:
1) 유해한 세포군을 제거하기 위한 치료 선택: 일례로서, 예를 들면 대뇌 모야-모야병과 같은 과도한 혈관신생 상태에서, 감마 34.5 유전자 발현을 유도하는 flk1 수용체 프로모터를 사용하면 이 질병을 일으키는 혈관을 선택적으로 제거할 수 있다.
또다른 예로는, 골다공증과 같은 광범위한 골의 개조 및 뼈의 제거 상태에서 기질 메탈로프로테인아제 9 또는 갑상선 호르몬 수용체를 사용하여 감마 34.5의 발현을 유도하면 파골 세포에서 추가적인 뼈 개조를 제거할 수 있다.
2) 발달 과정중에 기관내 세포군의 선택적 제거의 효과 연구: 예를 들면 세포군의 제거가 발달 과정에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 예컨대 도파민-베타-히드록실라아제 프로모터를 사용하여 노르아드레날린성 뉴런을 제거한 뒤, 동물 발달에 미치는 영향을 연구할 수 있다.
"종양 특이적 프로모터"는 정상 세포에서보다 표적 종양 세포에서 높은 수준으로 발현되거나 선택적으로 유도되는 프로모터를 의미한다. 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체에 대한 종양 표적화 특이성은 일차 종양 위치 또는 이것의 전이에서 종양 세포내 형질도입된 유전자의 발현을 선택적으로 활성화하는 종양 특이적 프로모터를 사용하여 달성된다[Miller,N. and Whelan, J., Hum. Gene Ther. 8:803-815 (1997); Walther, W. and Stein, U., J. Mol. Med. 74:379-392(1996); Schnierle, B.S. and Groner, B., Gene Therapy 3:1069-1073 (1996); Lan, K-H., et al., Cancer Res. 57:4279-4284 (1997); Dachs, G.U., et al., Oncol. Res. 9:313-325 (1997)].
종양 특이적 프로모터의 예는 티로시나제(흑색종을 표적화함)[Vile,R.G. and Hart, I.R., Cancer Res. 53:962-967 (1993); Vile, R.G. and Hart, I.R., Ann. Oncol 5 (Suppl. 4):S59-S65 (1994); Hart, I.R., et al., Curr. Opin. Oncol. 6:221-225 (1994))]; c-erbB-2 종양유전자(유방암, 췌장암, 위암 및 난소암을 표적화함)[Hollywood, D., and Hurst, H., EMBO J 12:2369-2375 (1993))]; 태아성암항원(CEA)(폐 악성종양 및 위장 악성 종양, 예컨대 결장암, 췌장암, 위암을 표적화함)[Thompson, J.A., et al., J.Clin. Lab. Anal. 5:344-366 (1991); Osaki, T., et al., Cancer Res. 54:5258-5261 (1994)]; DF3/MUC1(유방암을 표적화함)[Abe, M. and Kufe,D., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 90:282-286 (1993); Manome, Y., et al., Gene Ther. 2:685, A051 (1995); Chen, L., et al., J. Clin Invest. 96:2775-2782 (1995)]; 전립성 특이성 항원(PSA)(전립선암을 표적화함)[Lundwall,A., Biochem.Biophys.Res.Commun. 161:1151-1156 (1989)]; 및 알파-페토프로테인(AFP)(간암을 표적화함)[Arbuthnot, P., et al., Hepatology 22:1788-1796 (1995); Ido, A., et al., Cancer Res. 55:3105-3109 (1995)]를 암호화하는 유전자로부터 유도된 것을 포함한다. 전단 단계 조절 및 기타 형태의 조절 발현이 가능한 합성 유전자 조절계가 사용될 수 있다[Miller, N. and Whelan, J., Hum. Gene Ther. 8:803-815 (1997); Vile, R.G., Semin. Cancer Biol. 5:429-436(1994); Hwang,J.J.,et al., J. Virol. 70:8138-8141 (1996); Massie, B., et al., J. Virol. 72:2289-2296 (1998)].
또한, 종양 세포는 특정 종양유전자를 과발현시켜, 상향조절된 유전자 발현 세포가 상기 유전자의 프로모터 인자를 사용하여 표적화될 수 있음이 알려졌다. B-myb, C-myb, c-myc, c-kit, 및 c-erbB2 종양유전자는 상기 유형의 대표적 일부 예이다. 공통 E2F 결합 부위를 포함하는 B-myb 프로모터[참조, Lyon, J., et al., Crit. Rev. Oncogenesis 5:373-388 (1994)]는 순환 세포내에서 엄격히 조절되고, G0에서는 실제로 억제된다[Lam,E.W. and Watson, R.J., EMBO J. 12:2705-2713 (1993); Lam, E.W., et al., Gene 160:277-281 (1995); Bennett, J.D., et al., Oncogene 13:1073-1082 (1996)]. 따라서, B-myb 프로모터는 특히 바람직한 종양 특이적 프로모터이다.
특성이 규명된 프로모터를 보유한 임의의 암 종류는 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 Clary B.M. 등, Cancer Gene Therapy 7:565-574(1998)의 표 1; Spear, M.A., Anticancer Research 18:3223-3232(1998)의 표 I; Walther W. 및 Stein U., J.Mol.Med. 74:379-392(1996)의 표 2; 및 Dachs G.U. 등, Oncol.Res. 9:313-325(1997)에서 찾을 수 있다.
종양 특이적 프로모터의 유전자 서열은, 전부는 아니라도 대부분을 젠뱅크 서열 베이타베이스로부터 이용할 수 있다.
γ34.5 외에, 작제물 내에서의 기타 돌연변이/결실
본 발명의 바이러스 돌연변이체는 임의의 바이러스 유전자(들)에서의 추가적 돌연변이를 갖지만, 복제에 필요한 유전자내 돌연변이가 가장 바람직하다. 이것의 포유류 상동체는 상승된 수준의 E2F에 의하여 상향 조절된다.
예를 들면, 포유류 리보뉴클레오티드 리덕타제(mRR)는 세포 주기의 G1기 동안 상향 조절되고 이것의 전사는 "유리" E2F에 의하여 조절된다[DeGregori et al., Mol.Cell.Biol. 15:4215-4224(1995); Lukas et al., Mol.Cell.Biol. 16:1047-1057(1996); Dynlacht et al., Genes Dev. 8:1772-1786(1994)]. RR- 바이러스 돌연변이체는 이들 세포내에서 상보성 포유류 리보뉴클레오티드 리덕타제(mRR)의 존재에 기인하여 신생물 세포내에서 선택적으로 복제한다는 가설이 있다[Goldstein and Weller, J.Vriol. 62:196-205(1998)].
유리 E2F의 수준이 상승하면, 그 유전자의 바이러스 상동체가 바이러스 복제에 필요한 수개의 포유류 유전자의 발현이 상승된다. 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR) 외에, 이러한 유전자는 티미딘 키나제(TK), 우라실 DNA 글리코실라아제(UNG), 및 우라실-트리포스파타아제 효소(dUTPase)를 포함한다. 하나 또는 그 이상의 유전자내 돌연변이를 포함하는 바이러스는 유리 E2F의 수준이 상승한 세포내에서 선택적으로 복제할 것이다. 따라서, 본 발명은 γ34.5내 돌연변이 뿐만 아니라, 이들 유전자 중 하나 이상의 돌연변이를 갖는 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 돌연변이는 리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자 내에 존재한다.
E2F(E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5)는 p16, 사이클린 D/cdk4 및 pRB를 포함하는 세포 주기-조절된 전사 캐스케이드의 일차 매개체인 것으로 보인다[DeGregori et al., Mol. Cell. Biol. 15:4215-4224(1995);Lukas et al., Mol. Cell. Biol. 16:1047-1057(1996); Dynlacht et al., Genes Dev. 8: 1772-1786 (1994)]. 따라서, 상기 캐스케이드에 관여하는 유전자내 결함은 E2F 수준의 증가를 유도함으로써 포유류 RR, TK, UNG 및 dUTPase의 수준을 상승시킨다. 예를 들면, p16, p21 및/또는 p27의 발현에 결함을 가진 세포는 사이클린 D, 사이클린 D 키나제 4(Cdk4) 및/또는 사이클린 D 키나제 6(Cdk6)의 수준을 상승시킬 것이다. 이는 차례로 pRB 인산화의 증가를 유도함으로써 E2F를 방출시킨다. 또한, pRB, p107 및/또는 p130, DP1, DP2, 및/또는 DP3의 발현에 결함이 있는 세포는 E2F의 방출 증가를 유도할 수 있다.
대부분의 종양은 이러한 캐스케이드의 성분을 암호화하는 유전자의 불활성을 보유한다[Ueki et al., Cancer Res. 56: 150-153 (1996)]. 따라서, E2F를 방출하고 포유류 RR, TK, UNG 및 dUTPase의 전사를 가능하게 한다. 또한, 기타 종양 억제인자 유전자 또는 종양유전자내 변형은 유리 E2F 수준의 증가를 유도할 수 있으므로, 포유류 RR, TK, UNG 및 dUTPase의 수준을 증가시킨다. 따라서, RR-, TK-, UNG- 및 dUTPase- 바이러스 돌연변이체는, 특히 이들이 "유리" E2F의 증가를 유도하는 p16 /사이클린 D/pRB 경로에서 결함을 갖는 경우, 고비율(%)의 종양 세포를 효과적으로 표적화할 것이다.
또한, 다수의 상이한 기원(예, 폐, 유방, 전립선, 뇌, 간, 췌장, 피부 등)에서 유래한 종양 세포는 RR, TK, UNG 및 dUTPase의 수준 상승을 유도하는 상술한 경로에서 변형을 보유하므로, 본 발명의 바이러스 돌연변이체에 대한 표적이다. 예를 들면, 신경교종 종양 세포주(래트 9L, 인간 U87 및 인간 T98 세포)는 mRR의 수준 상승 뿐 아니라 p16[Van Meir et al., Cancer Res. 54: 649-652 (1994)]의 불활성화 돌연변이를 보유한다. 따라서, 이들 세포는 야생형 KOS 균주의 것과 가까운 수준으로 HSV-1 유도된 바이러스 돌연변이체 rRp450의 복제를 보충할 수 있지만, mRR의 수준이 검출되지 않는(그리고 정상 p16 경로를 가진) 뉴런은 그렇지 않았다.
"리보뉴클레오티드 리덕타제 유전자"는 효소 리보뉴클레오티드 리덕타제의 임의의 서브유닛 또는 일부를 암호화하는 핵산을 의미하므로, 이러한 핵산이 세포내에서 발현되는 경우, 기능성 또는 비기능성인 효소의 일부 또는 서브유닛이 생성 된다. 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)는 DNA 전구체의 신생 합성에서 중요한 효소로서, 리보뉴클레오티드의 데옥시리보뉴클레오티드로의 환원을 촉매한다. HSV-1은 2개의 동일하지 않은 서브유닛으로 구성된 그 자신의 RR(UL39 및 UL40 유전자)을 암호화한다[Duita,J. Gen. Virol. 64:513 (1983)]. ICP6으로 명명되는 대형 서브유닛(140k 분자량)은 소형 서브유닛(38k 분자량)과 단단히 회합되어 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 RR은 다수의 분열세포에서가 아니라 비분열 세포내에서 효과적인 바이러스 성장에 필요한 것으로 알려졌다[Goldstein and Weller, J. Virol. 62: 196 (1988); Goldstein and Weller, Virol. 166: 41 (1988); Jacobson et al., Virol. l73: 276 (1989)]. RR의 소형 서브유닛내 돌연변이는 RR 활성의 상실 및 신경병인성을 유도한다[Cameron et al., J. Gen. Virol. 69: 2607 (1988)]. 그러나, 대형 서브유닛내 돌연변이가 특히 바람직하다.
리보뉴클레오티드 리덕타제 ICP6의 프로모터 영역은 ICP6 구조 유전자의 5'상류 서열에 맵핑되었다[Goldstein and Weller, J. Virol. 62: 196 (1988); Sze and Herman, Virus Res. 26: 141 (1992)]. RR의 소형 서브유닛에 대한 전사 개시 부위, 즉 UL40은 ICP6의 암호화 영역에 속한다[McLauchlan and Clements, J.Gen. Virol. 64:997 (1983); McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69: 1531 (1988)].
HSV-1 게놈을 사용하여 본원에서 예시된 바이러스 돌연변이체에 기초한 HSV-2로부터 유래한 바이러스 돌연변이체는 본원 발명에 속한다. HSV-2는 2개의 RR 서브유닛 모두를 함유한다; 또한, HSV-2 ICP10은 HSV-1 ICP6과 유사하다. Nikas et al., Proteins 1:376 (1986); McLaughlan and Clements, EMBO J. 2: 1953 (1983); Swain and Halloway, J. Virol. 57:802 (1986).
리보뉴클레오티드 리덕타제 결핍(RR-)과 기타 헤르페스 심플렉스 바이러스 돌연변이체간의 한 차이점은 아실클로비르 및 간시클로비르에 대한 민감성에 있다. 당업계에 공지된 TK-1 HSV-1 돌연변이체는 이러한 항-바이러스제에 내성이 있기 때문에, 이러한 돌연변이체는 전신 감염 또는 뇌염의 사건에서 제거하기 어려울 수 있다. 대조적으로, 바이러스 뇌염 사건에서, RR-HSV 돌연변이체와 같은 TK+ 바이러스 돌연변이체는 항바이러스 요법에 반응성이 있다.
게다가, RR--HSV 돌연변이체는 감염을 일으켜 시험관내 39.5℃에서 바이러스 DNA를 합성하는 능력이 보충된다[Goldstein and Weller, Virology 166:41 (1988)]. 따라서, 이러한 돌연변이는 신경독성(neurovirulence)에 대하여 감독되고, 감염된 숙주내에서 발열시 거의 증식되지 않을 것이다. 상기 특징은 감독된 신경독성이고 바이러스 뇌염 사건에서 항바이러스 요법에 적합한 치료 벡터에서 중요하다.
RR- 바이러스 돌연변이체의 온도 감성은 본 발명의 바이러스 돌연변이체의 또다른 잇점을 보여준다. 바이러스 돌연변이체로 치료받은 환자에서, 다수의 숙주 인자(열, 항바이러스 면역 반응)는 바이러스 돌연변이체의 전파를 억제할 수 있다 이러한 경우에, (바이러스 돌연변이체에 의하여 감염된 세포에 대하여) 이식유전자에 의한 활성화 및 화학요법제를 이용한 치료가 보충적 항암 치료를 제공할 것으로 기대된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "돌연변이"는 유전자의 발현이 상당히 감소되거나, 또는 유전자 생성물이 비기능성이거나 또는 그 기능이 상당히 감소되는 유전자의 임의의 변형을 의미한다. 용어 "유전자"란 유전자에 대한 조절 영역, 예컨대 프로모터 또는 인헨서 뿐 아니라 유전자 생성물을 암호화하는 영역 모두를 포함한다. 이러한 변형은 유전자의 산물을 비기능성으로 만들거나 유전자의 발현을 감소시켜, 바이러스 돌연변이가 본 발명의 성질을 갖도록 한다. 또한, 본 발명은 목적하는 하나 이상의 유전자(들)에서 하나 이상의 돌연변이(들)를 가진 돌연변이체를 포함한다. 따라서, 단수로 표시되더라도 단수 또는 복수 모두를 의미한다.
상기 변형을 달성하는 방법은 다음과 같다: (a) 유전자의 산물의 발현을 방해하는 임의의 방법; 또는 (b) 발현된 단백질을 비기능성으로 만드는 임의의 방법. 유전자의 발현을 방해하는 것으로 공지된 다수의 방법은, 예컨대 삽입, 결실 및/또는 염기 변화에 의한 유전자의 암호화 영역 또는 이것의 프로모터 서열의 변형을 포함하며, 이는 공지되어 있다[Roizman, B. and Jenkins, F.J., Science 229: 1208-1214 (1985)]. 바람직한 돌연변이는 결실이다.
조작된 바이러스의 작제 방법 및 DNA 서열의 유전자 조작 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 이것은 문헌[Ausubel et al., Chapter 16 in Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Inc.); Paoletti et al., 미국 특허 제4,603,112호(1986년 7월)]을 포함한다. 또한 바이러스학적 고려는 문헌[Coen,in Virology, 1990(2nded.) Raven Press, pages 123-150]에서 재검토되었 다.
HSV-1 돌연변이체의 작제는, 예컨대 문헌[Martuza et al., 미국 특허 제5,585,096호(1996년 12월); Roizman et al., 미국 특허 제5,288,641호(1994년 2월); Roizman, B. and Jenkins, F.J., Science 229: 1208-1214 (1985); Johnson et al., J. Virol. 66: 2952 (1992); Gage,P.J., et al., J. Virol. 66: 5509-5515 (1992); Goldstein and Weller, J. Virol. 62: 196-205 (1988), Coen,D., Chapter 7, in Virology, 1990 (2nded.) Raven Press; Breakefield and DeLuca, The New Biologist 3: 203 (1991); Leib and Olivo, BioEssays 15: 547 (1993); Glorioso et al., Seminars in Virology 3: 265 (1992); Chou, J. and Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3266-3270 (1992); Shin et al., in Vaccines 85, 1985, Cold Spring Harbor Press, pages 177-180; Kramm, C. M., et al., Hum. Gene Ther. 8: 2057-2068 (1997)); Glorioso, J. C., et al., Annu. Rev. Microbiol. 49: 675-710 (1995); Mocarski et al., Cell 22: 243 (1980)]에 설명되어 있다.
바이러스 게놈의 유전자 변형은 제한 엔도뉴클레아제 분해된 바이러스 DNA의 서던 블롯 하이브리드화, 바이러스 DNA의 돌연변이된 영역의 서열분석, 신규(또는 유실된) 제한 엔도뉴클레아제 부위의 검출, 리보뉴클레오티드 리덕타제 활성에 대한 효소적 분석과 같은 표준 방법에 의하여 결정될 수 있다[Huszar, D. and Bacchetti, S., J. Virol. 37:580-598 (1981)]. RR과 같이 돌연변이된 바이러스 유 전자의 포유류 상동체가 부족한 세포에 있어서, 바이러스 게놈의 유전자 변형은 (1) RR과 같은 돌연변이된 바이러스 상동체인 항체로 감염된 세포 단백질의 웨스턴 블롯 또는 ELISA 분석 또는 (2) RR과 같은 돌연변이된 바이러스 상동체의 전사를 위한 감염된 세포의 노던 블롯 분석으로 결정할 수 있다[Jacobson,J.G., et al., Virology 173:276-283 (1989)]. 하나 이상의 유전자에서 돌연변이된 바이러스 돌연변이체는 돌연변이유발 후 분리하거나, 또는 바이러스 게놈과 유전자 조작된 서열간의 재조합을 통해 작제할 수 있다.
"상향 조절된"이란 상향 조절하고자 하는 유전자 산물을 암호화하는 유전자(들)의 발현이 정상 증식 세포에서 발견된 산물의 발현 기초 수준보다 높음을 의미한다.
"유리 E2F 수준의 상승"이란 세포내에서 이용가능한 비결합형 E2F의 양이 정상 증식 세포에서 통상적으로 발견되는 양보다 많음을 의미한다.
"신생물 세포를 선택적으로 죽이는"이란 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체가 정상증식 세포보다는 신생물 세포를 일차적으로 표적화함을 의미한다.
"신생물 세포"란 정상 성장 조절 메카니즘이 파괴되어(통상 유전자 돌연변이 축적으로 인하여) 비조절된 증식 가능성을 제공하는 세포를 의미한다. 따라서, "신생물 세포"는 분열 세포 및 비분열 세포 모두를 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 신생물 세포는 종양, 신생물, 암종, 육종, 백혈병, 림프종 등을 포함한다. 중추신경계 종양, 특히 뇌종양이 관심의 대상이다. 이것의 예로서 신경교아종, 성상세포종, 희돌기교종, 수막종, 신경섬유종, 뇌실상의종, 신경초종, 신경섬유육종 등을 포함한다. 본 발명은 주변부 및 뇌에서 양성 및 악성 신생물 세포 모두를 종양세포붕괴에 대한 표적으로서 사용할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 주변부는 뇌 바깥의 신체 모든 기타 부분을 의미하는 것이다. 따라서, 주변부 종양은 뇌 외부의 신체 일부에 존재하는 종양을 의미한다.
헤르페스 바이러스 돌연변이체에 의하여 운반되는 이식유전자
본 발명의 바이러스 돌연변이체는 헤르페스 γ34.5 유전자의 발현을 유도하는 종양 특이적 또는 세포 특이적 프로모터를 가질 뿐 아니라(가능하게는, 전술한 바와 같이 하나 이상의 부가의 돌연변이, 예컨대 RR, TK, UNG 또는 dUTPase), 이종성 이식유전자를 보유할 수 있다.
이식유전자는 자살 유전자, 즉, 화학요법제를 세포독성 형태로 활성화시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하는 유전자, 예를 들면 HSV-TK, CD, 시토크롬 P450일 수 있다. 바람직한 구체예로서, 자살 유전자는 시토크롬 P450 유전자이다.
"화학요법제를 세포독성 형태로 변형시킬 수 있는 유전자 산물"은 유전자 산물이 작용하기 전보다 화학요법제를 더욱 세포독성으로 만드는 작용을 하는 유전자 산물을 의미한다. 화학요법제를 최대의 세포독성 형태로 변형시키기 위하여 이러한 유전자 산물에 더하여 기타 단백질 또는 인자가 요구될 수 있다.
"화학요법제를 세포독성 형태로 변형시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하는 이식유전자"는 발현시 유전자 산물을 제공하는 핵산을 의미한다.
본원에서 "세포독성"은 세포 사멸의 야기 또는 유도를 의미한다.
"유전자 산물"은 특정 유전자에 의하여 암호화되는 단백질을 널리 일컫는다.
"화학요법제"는 이상증식의 치료에 사용될 수 있는 제제 및 프로드럭을 세포독성 형태로 활성화시킬 수 있는 제제를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 화학요법제는 바이러스 돌연변이체의 복제를 유의수준으로 저해하지 못하는데, 이는 바이러스 복제가 감염된 세포의 사멸을 유도하여 바이러스가 기타 세포로 증식할 수 있는 충분한 수준에서 발생됨을 의미한다
용어 "시토크롬 P450을 암호화하는 유전자"는 포유류 시토크롬 P450 유전자, 예를 들면 P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 또는 P450 3A4를 의미한다. 상기 유전자 각각은 항암제 시클로포스파미드 및 이포스파미드의 활성화와 관련되어 있다[Clarke et al., Cancer Res. 49:2344-2350 (1989); Chang et al., Cancer Res. 53:5629-5637 (1993); Weber and Waxman, Biochemical Pharmacology 45:1685-1694 (1993))]. 또한 상기 유전자의 cDNA 서열은 공개되었다[Nelson et al., DNA and Cell Biology 12:1-51 (1993) 및 인용된 참조 문헌; Yamano et al., Biochem. 29:1322-1329 (1990); Yamano et al., Biochem. 28:7340-7348 (1989)]. 또한, 시트크롬 P450은 N-메틸 시클로포스파미드(N-메틸 CPA), 메틸클로로프로필니트로소우레아(MCPNU), 및 CPA 중합체 형태, 이포스파미드, N-메틸 CPA, 및 MCPNU를 활성화시킬 수 있다. 화학요법제의 중합체 형태는 문헌[Brem, Biomaterials, 11:699-701(1990); Buahin and Brem, J.Neurooncol 26:103-110 (1995); Tamargo et al., Cancer Res. 53: 329-333 (1993); and Langer, Ann. Biomed. Eng. 23: 101-111 (1995)]에 설명되어 있다.
당업자는 시토크롬 P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 또는 P450 3A4에 상동성이고 cDNA 서열이 공지된 기타 종(예, 마우스, 토끼, 햄스터, 개 등)에서 유래되는 약물-대사성 시토크롬 P450 유전자를 사용할 뿐 아니라[Nelson et al., DNA and Cell Biology 12:1-51 (1993)], 효소의 시토크롬 P450 계열의 일원에 의하여 활성화되는 다수의 기타 항암제를 사용하여[LeBlanc and Waxman, Drug Metab. Rev. 20:395-439(1989)] 본 발명의 방법을 이용할 수 있다. 특히 바람직한 구체예로서, 시토크롬 P450 2B1을 암호화하는 유전자가 사용된다.
헤르페스 바이러스 돌연변이체가 자살 유전자를 함유하는 경우, 자살유전자에 의하여 활성화되는 화학요법제는 바이러스 돌연변이체의 복제를 상당히 억제하지 못하므로, 바이러스 돌연변이체가 바이러스 종양세포붕괴 및 자살 유전자의 전달에 의하여 종양 세포를 죽이게 된다. 화학요법제 또는 이것의 활성 대사산물이 대신 DNA를 가교함으로써 또는 DNA 치유를 저해함으로써 작동하는 화학요법제/이식유전자 조합을 이용하면 바이러스 돌연변이체의 복제를 상당히 저해하지 못할 것이다. 따라서, 이러한 화학요법제/이식유전자 조합은 본 발명의 바이러스 돌연변이체 및 방법에 포함된다.
따라서, 바람직한 화학요법제/이식유전자 조합은 CPA, 이포스파미드, N-메틸 시클로포스파미드, MCPNU 또는 중합체형(CAP, 이포스파미드, N-메틸 시클로포스파미드 및 MCPNU)과 조합된 시토크롬 P450이다. 더욱 바람직한 화학요법제/이식유전자 조합은 CPA/시토크롬 P450 2B1이다.
본 발명에 사용하기 위한 기타 화학요법제/이식유전자 조합은 CB1954/이.콜 리 니트로리덕타제[Friedlos et al., Gene Ther. 5: 105-112 (1998); Green et al., Cancer Gene Ther. 4:229-238 (1997)]; 토포이소머라제 I 또는 II 저해제/에스테르유사 활성을 가진 효소, 예컨대 CPT-11/카르복실에스테라제[Jansen et al., Int. J. Cancer 70:335-340(1997); Danks et al., Cancer Res. 58: 20-22 (1998)]; 4-이포메아놀/시토크롬 P450 4B1[Verschoyle et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 123: 193-198 (1993)]; 및 2-아미노안트라센/시토크롬 P450 4B1[Smith et al., Biochem. Pharmacol. 50:1567-1575 (1995)]을 포함한다.
CPA와 같은 알킬화제의 사용은 항암효과를 제공하지만, 바이러스 단백질 합성 또는 바이러스 복제를 상당히 저해하지는 못한다. 상기 약물의 활성 방식으로 이러한 발견을 설명할 수 있을 것이다. CPA의 활성 대사산물, 포스포르아미드 머스타드(PM)는 세포성 DNA에서 가닥간 가교 및 가닥내 가교를 형성한다. 세포성 DNA에 대한 최대 세포독성은, 다중 DNA 가닥 분열이 가교 부위에서 발생되는 경우 유사분열중에 통상 이루어진다[Colvin, in Cancer Medicine, eds. Holland et al., 1993. Lea and Febiger, Philadelphia, pages 733-734]. 대조적으로, 비유사분열, 가교 바이러스 DNA는 광범위한 손상으로부터 보호될 수 있으며, 따라서 세포성 DNA보다 더 용이하게 복원될 수 있다.
간시클로비르는 화학요법제의 한 예로서, 활성시 바이러스 복제를 저해한다. hrR3 및 간시클로비르의 조합은 바이러스 티미딘 키나제 유전자에 의한 간시클로비르의 변형에 기인한 상당한 항암 효과를 제공하지만[Boviatsis et al., Cancer Res. 54:5745-5751 (1994)], 변형된 간시클로비르 분자는 또한 바이러스 복제를 저 해한다. 이러한 이유로 인하여, TK/GCV의 사용은 실례에서 바람직하게 선택될 수 없을 것이다. 프로드럭-활성 효소, 예를 들면 HSV-TK는 "거짓" 뉴클레오티드로서 작용하느 항암 대사산물을 생성하여, 복제성 DNA 가닥의 조기 종결을 야기한다. 따라서, 이러한 프로드럭-활성 효소는 바이러스 및 게놈 DNA 합성 모두에 영향을 줄 것으로 예상되며, 자살 유전자를 포함하는 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체내 사용하기 위해 선택하는 것은 바람직하지 않다.
그 작용 메카니즘이 DNA의 가교 또는 DNA 복원 저해 효소인 화학요법제를 사용하는 또다른 이점은, 이러한 제제가 G0에서의 세포에 대하여도 효과적이라는 점이다. 따라서, 신생물 세포를 죽이는데 효과적인 상기 제제에 대하여, 표적화된 세포는 약물이 투여되는 시점에 활발하게 분열할 수 없다. 이는 세포의 대다수가 G0인 종양을 위해 상당히 유리하다.
이러한 유형의 종양의 일례는 신경교아종이다. 신경교아종에 있어서, 임의의 한 시점에서 종양내 성장비 또는 상대적 세포 증식 비율은 약 30%이고, 세포의 나머지 70%는 G0에 존재한다. 이러한 종양은 활발하게 분열하는 세포만을 표적화하는 화학요법제에 특히 내성이 있으며, 그 이유는 활발하게 분열하는 신경교아종 세포의 30%가 상기 종양의 치사 과정에 기여하지만, 세포의 70%는 G0에 존재하므로, 죽거나 활성 세포주기로 재진입할 수 있기 때문이다[Yoshii et al., J. Neurosurg. 65:659-663 (1986)]. 따라서, 휴지 상태에 있는 70%가 활성 증식 세포를 표적화하는 화학요법제에 대한 상기 종양의 내성을 담당한다.
이러한 예는 본 발명의 또다른 이점을 보여준다. 본 발명의 바이러스 돌연변이체 및 본 발명의 방법은 바이러스 돌연변이를 보충할 수 있는 세포만을 표적화할 것이라는 점에서 복제-조건성 또는 복제-불능 바이러스 매개된 종양세포붕괴에 단독으로 기초한 치료법에 비하여 잇점을 제공한다. 반면에, 본 발명의 바이러스 돌연변이체는 복제 및 용해, 이식유전자의 발현 및 활성화를 위하여 E2F 수준이 상승된 세포(일차적으로 신생물 세포)를 표적화하지만, 화학요법제는 주변 종양 세포로 확산될 수 있는 활성 대사산물을 제공한다. 이러한 대사산물은 심지어 G0에서(교아종내 세포의 70%) 주변 종양 세포를 죽일 수 있다.
따라서, 본 발명은 신경교아종의 치료에서의 특정 용도를 발견하였다. 신경교아종은 모든 일차적 뇌종양의 약 30% 또는 50%를 차지하며, 외과수술, 화학요법 및 방사선 요법에도 불구하고 대개는 일반적으로 치명적이다.
헤르페스 바이러스 돌연변이체에 의하여 보유된 유전자의 유전자 산물에 의한 화학요법제의 국소 활성화에 기인하여, 본 발명의 방법은 동일한 약물 농도에서 높은 종양 독성을 나타내야 한다. 따라서, 정상 세포에 대한 독성의 증가없이 높은 종양 치사량을 나타내야 한다. 나아가, 전신 종양군의 화학요법 치료는, 효능 증가의 관점에서 약물의 소량 투여가 가능하기 때문에 본 발명의 방법을 사용함으로써 향상될 수 있다.
또한, 화학요법제의 국소 활성화는 또다른 이점을 제공한다. 일부 화학요법제는 활성화, 또는 주변부 기관 또는 세포내 활성 단계로의 전환을 요구한다. 그러 나, 종종 활성(세포독성) 대사산물은 혈뇌관문을 통과할 수 없어서, 뇌종양에 대하여 비효과적이다. 따라서, 본 발명의 방법은 이들 화학요법제로 뇌종양을 치료해야 한다. 이러한 화학요법제중 하나가 CPA이다. CPA는 중추신경계 신생물에 대하여 대개 비효율적이다. 이는 DNA-알킬화 세포독성 대사산물로의 전환이 일차적으로 간에 제한되고 이러한 대사산물은 혈뇌관문을 용이하게 통과하지 못하기 때문이다. 그러나, 시토크롬 P450 유전자를 보유하도록 조작되어 뇌종양에 적용되는 본 발명의 바이러스 돌연변이체의 사용은 CAP의 국소 활성화를 제공할 것이다. 따라서, 바람직한 구체예로서, 시토크롬 P450 유전자는 시클로포스파미드(CPA)의 세포독성 효과에 대하여 중추신경 종양 세포를 감작하는데 사용한다.
"자살 유전자" 외에, 이식유전자는 종양에 의해 유도되는 면역반응을 자극하거나 향상시키는 시토킨을 암호화할 수 있다. Blankenstein, T., et al., J. Exp. Med. 173:1047-1052 (1991); Colombo, M.P., et al., Cancer Metastasis Rev. 16:421-432 (1997); Colombo, M.P., et al., Immunol. Today 15:48-51 (1994) 참조. 대표적 예로는 종양 괴사 알파 인자(TNF-α), 인터페론-γ, 인터류킨(IL-2, IL-4) 또는 과립구-대식구 콜로니 자극인자(GM-CSF)를 포함한다.
이식유전자는 또한 종양 억제인자 유전자 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 종양파괴 유전자, 예를 들면 디프테리아 독소[Coll-Fresno, P.M., et al., Oncogene 14:243-247 (1997)], 슈도모나스 독소, 항혈관형성 유전자, 종양 백신화 유전자, 방사선감성 유전자, 안티센스 RNA 또는 리보자임[Zaia, J.A., et al., Ann. N.Y. Acad Sci. 660:95-106 (1992)]을 암호화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체예에서, γ34.5 유전자의 발현을 유도하는 종양 특이적 또는 세포 특이적 프로모터를 가진 헤르페스 바이러스 돌연변이체는, 전술한 바와 같이 화학요법제를 세포독성 형태로 전환시킬 수 있는 유전자 생성물을 암호화하는 이식유전자 또는 임의의 기타 종양파괴 이식유전자를 추가로 포함한다. 이식유전자는 발현될 임의의 위치에서 바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 이식유전자를 위한 바이러스 게놈내 바람직한 위치는 최초 γ34.5 결실의 유전자좌 또는 헤르페스 UL40 유전자좌내 임의의 위치이다.
헤르페스 바이러스 돌연변이체의 투여
본 발명에서 청구하고 있는 방법에 따른 치료를 위한 예시적 후보로는, (i) 종양 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 특징으로 하는 신생물이 있는 인간이 아닌 동물; (ii) 종양 특이적 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터를 특징으로 하는 신생물이 있는 인간; (iii) 특정 세포군의 제거가 필요한 인간 또는 인간이 아닌 동물 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"신생물 세포"란 정상 성장 조절 메카니즘이 파괴되어(통상적으로는 축적된 유전자 돌연변이에 의함), 조절되지 않는 증식 가능성이 있는 세포를 말한다. 이 용어는 중추 신경계 및 말초계에서 양성 및 악성 신생물 세포를 모두 포함한다. 본 명세서에 사용된 "말초"는 뇌 또는 척수 외의 신체의 다른 모든 부분을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 있어서, 신생물 세포는 종양, 신생물, 암종, 육종, 유두종, 백혈병, 림프종 등의 세포를 포함한다. 포유류 몸의 임의의 기관 또는 조직에서 발생할 수 있는 고형 종양이 특히 관심의 대상이 된다.
악성 뇌 종양으로는 성상세포종, 희돌기교종, 수막종, 신경섬유종, 신경교아종, 뇌실상의종, 신경초종, 신경섬유육종 및 수아종 등이 있다.
우선적으로, 치료는 직접 신생물내 접종으로 개시한다. 뇌의 종양의 경우, MRI, CT 또는 기타 이미징 가이드형 입체공간적 기법을 사용하여 직접 바이러스 접종하거나, 바이러스를 두개수술 시에 접종한다. 특정 세포군을 제거하고자 하는 환자의 경우, 벡터를 해당 조직내로 접종한다.
일반적으로, 해당 세포의 바이러스 감염 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 바이러스 돌연변이체를 신생물 성장 부위 또는 그 부근에서 숙주에 주사하거나, 또는 혈관내 접종하여 투여할 수 있다. 통상적으로, 바이러스 변형체는 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조한다. 주사 전에 액체 중에서 용액 또는 현탁액용으로 적절한 고체 형태를 준비할 수 있다. 제제를 유화시킬 수 있다. 활성 성분은 약학적으로 허용가능하고 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합하는 것이 좋다. 적절한 부형제로는, 예컨대 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이의 조합물 등이 있다. 또한, 필요에 따라 제제는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 바이러스 돌연변이체의 효과를 증진시키는 보조제 또는 면역강화제를 포함할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A.R. 등, eds., Mack Publishing Co., pub., 18th ed., 1990 참조). 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유 및 에틸올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르 등이 있다. 수성 담체로는 물, 수용액, 염수 용 액, 염화나트륨 등의 비경구용 부형제, 링커 덱스트로스 등이 있다. 정맥내 주사용 부형제로는 유체 및 영양소 보충제 등이 있다. 약학 조성물의 각종 성분의 pH와 정확한 농도를 결정하는 것은 일반적인 일이며, 당업자에게는 공지되어 있다(Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics, Gilman, A.G. et al., eds., Pergamon Press, pub., 8th ed., 1990 참조).
적절한 추가의 제제는 경구 제제를 포함한다. 경구 제제는, 예컨대 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 통상적인 부형제를 포함한다. 경구용 조성물은 정제, 환제, 캡슐, 지속형 방출 제제 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며, 활성 성분 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%를 함유할 수 있다.
바아러스 돌연변이체의 용량은, 치료하고자 하는 피험체, 피험체의 면역계가 항체를 합성하는 능력, 목적하는 보호 정도에 따라서 치료 회수와 양으로, 투여할 수 있다. 투여하고자 하는 필요한 활성 성분의 정확한 양은 전문의가 판단하며, 각 개체에 따라 달라진다. 대부분의 경우, 바이러스는 표적 세포를 감염시켜 죽이는데 치료학적으로 효과적인 양으로 제공된다.
신생물 세포를 선택적으로 죽이는 방법
본 발명은, (a) γ34.5를 암호화하는 유전자의 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및 (b) 프로모터가 γ34.5 유전자를 발현시키도록, 종양 특이적 프로모터의 전사적 제어하에 γ34.5 유전자의 하나 이상의 카피의 삽입을 포함하는 헤르페스 바이러스 돌연변이체로 신생물 세포를 감염시키는 단계; 및 신생물 세포를 선택적으 로 죽이는 단계를 포함하여 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 사용하여 공지된 종양 특이적 프로모터를 과발현하는 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 방법을 제공한다.
물론, 상기 방법에 사용된 헤르페스 바이러스 돌연변이체에는 γ34.5 유전자 외에 헤르페스 바이러스 유전자의 하나 이상의 특정 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이가 있을 수 있다. 이들은 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR), 또는 더욱 구체적으로는 RR의 거대 서브유닛을 암호화하는 유전자의 결실을 포함한다. 대안적으로, RR을 암호화하는 유전자는 작은 서브유닛을 암호화한다. 임의의 다른 헤르페스 바이러스 유전자, 예컨대 티미딘 키나제(TK), 우라실 DNA 글리코실라제(UNG) 또는 dUTPase가 결실될 수 있다. 이들 바이러스 유전자가 바람직한데, 그 이유는 이들 유전자의 포유류 상동체가 E2F의 수준이 상승된 세포(예, 신생물 세포)에서 상향 조절되는 일이 종종 있어서 결실된 바이러스 효소를 보충할 수 있고, 따라서 이들 세포에서 선택적 복제를 촉진한다.
종양 특이적 프로모터의 예는 전술한 바와 같으며, 예컨대 CEA, AFP, 티로시나제 및 PSA를 포함한다. 종양 세포는 특정 종양유전자를 과발현하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 그러한 유전자의 프로모터 성분을 사용하여 유전자 발현이 상향 조절된 세포를 표적화할 수 있다. B-myb, C-myb, c-myc, c-kit, 및 c-erb B2 종양유전자는 이들 종류의 대표적인 예이다. B-myb 프로모터(예컨대, Lyon J. 등, Crit. Rev. Oncogenesis 5:373-388 (1994) 참조)는 순환 세포에서 엄격하게 조절되며, 실제로 G0에서 억제된다(Lam E.W. 및 Watson R.J., EMBO J. 12:2705-2713 (1993); Lam E.W. 등 Gene 160:277-281(1995); Bennett, J.D., 등, Oncogene 13:1073-1082 (1996)). 따라서, B-myb 프로모터는 특히 바람직한 종양 특이적 프로모터이다. 이 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 이 방법에 사용된 바이러스 돌연변이체는 Myb 34.5이다.
특성이 규명된 프로모터를 보유한 임의의 암 종류는 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 Clary B.M. 등, Cancer Gene Therapy 7:565-574(1998)의 표 1; Spear, M.A., Anticancer Research 18:3223-3232(1998)의 표 I; Walther W. 및 Stein U., J.Mol.Med. 74:379-392(1996)의 표 2; 및 Dachs G.U. 등, Oncol.Res. 9:313-325(1997)에서 찾을 수 있다.
전술한 종양 특이적 프로모터의 유전자 서열은 전부는 아니라고 하더라도 그 대부분을 젠뱅크 서열 데이타베이스로부터 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 상기 방법을 제공하는데, 이 방법에서 헤르페스 바이러스 돌연변이체는 이식유전자(transgene)를 추가로 포함하고, 이식유전자는 자살 유전자, 시토킨 유전자 또는 이의 종양 파괴성 유전자이다. 이식유전자가 자살 유전자인 경우, 이 방법은 자살 유전자에 의해 활성화될 수 있는 화학요법제와 신생물 세포를 접촉시키는 단계와 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 자살 유전자는 시토크롬 P450이다. P450 2B1이 특히 바람직하다. 대안적으로 암호화된 시토크롬 P450은 P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11 또는 P450 3A4이다. 또한, 화학치료제는 바람직하게는 옥사조스포린류의 구성원, 특히 시클로포스파미드, 이포스파 미드, N-메틸 시클로포스파미드, 메틸클로로프로필니트로소우레아, 중합성 시클로포스파미드, 중합성 이포스파미드, 중합성 N-메틸 시클로포스파미드 또는 중합성 메틸클로로프로필니트로소우레아이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 전술한 바이러스 돌연변이체를 함유하는 약학 조성물이며, 이 조성물은 1종 이상의 약학적 허용 부형제를 포함할 수 있다.
표적 세포군을 선택적으로 제거하는 방법
본 발명의 또 다른 구체예는, (a) γ34.5를 암호화하는 유전자의 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및 (b) 프로모터가 γ34.5 유전자를 발현시키도록, 세포 특이적 프로모터의 전사적 제어하에 γ34.5 유전자의 하나 이상의 카피의 삽입을 포함하는 헤르페스 바이러스 돌연변이체로 표적 세포를 감염시키는 단계; 및 표적 세포군을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하여 본 발명의 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 사용하여 공지된 세포 특이적 프로모터를 과발현하는 표적 세포군을 선택적으로 제거하는 방법을 제공한다.
"표적 세포군을 선택적으로 제거하는"이란 비표적 세포에 대한 표적 세포의 수를 상당히 감소시키고, 표적 세포를 완전히 또는 거의 완전히 제거하는 것을 포함한다.
물론, 상기 방법에 사용된 헤르페스 바이러스 돌연변이체에서는 γ34.5 유전자 외에 헤르페스 바이러스 유전자의 하나 이상의 특정 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이가 있을 수 있다. 이들은 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR), 또는 더욱 구체적으로는 RR의 거대 서브유닛을 암호화하는 유전자의 결실을 포함한다. 대안적으 로, RR을 암호화하는 유전자는 작은 서브유닛을 암호화한다. 임의의 다른 헤르페스 바이러스 유전자, 예컨대 티미딘 키나제(TK), 우라실 DNA 글리코실라제(UNG) 또는 dUTPase가 결실될 수 있다.
세포 특이적 프로모터의 예는 다음과 같다: 내피 세포에서 발현되는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체(flk1) 프로모터(Kappel 등, Blood 93: 4282-4292(1999)); 췌장의 베타 세포에서 발현되는 인슐린 프로모터(Ray 등, J.Surg. Res. 84:199-203 (1999)); 시상 하부의 세포에서 발현되는 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체 유전자(Albarracin 등, Endocrinology 140:2415-2421(1999)); 파골세포 및 각질세포에서 발현되는 기질 메탈로프로테인아제 9 프로모터(Munant 등, J.Biol.Chem. 274:5588-5596 (1999)); 골(骨)세포에서 발현되는 부갑상선 호르몬 수용체(Amizuma 등, J.Clin.Invest. 103: 373-381(1999)); 노르아드레날린성 뉴런에서 발현되는 도파민 베타-히드록실라제 프로모터(Yang 등, J.Neurochem. 71: 1813-1826(1998)).
이러한 구체예의 응용예는 다음과 같다:
1) 유해한 세포군을 제거하기 위한 치료 선택: 예를 들어, 대뇌 모야-모야 질병과 같이 혈관의 왕성한 혈관신생이 있는 증상에서, γ34.5 유전자를 발현시키는 flk1 수용체 프로모터를 사용하면 이 질병을 유발하는 혈관을 선택적으로 제거할 수 있다. 또 다른 예로는 골다공증과 같이 광범위한 뼈 개조와 뼈 제거가 생기는 증상으로서, 기질 메탈로프로테인아제 9 또는 부갑상선 호르몬 수용체를 사용하여 감마 34.5를 발현시키면 뼈 파골세포의 추가의 뼈 개조를 없앨 수 있다.
2) 발육 과정 연구: 발육 과정에 대한 세포군의 제거 효과를 연구하기 위해서, 예를 들어 도파민-베타-히드록실라제 프로모터를 사용하여 노르아드레날린성 뉴런을 제거한 다음 동물 발육에 대한 효과를 연구할 수 있다.
다음 실시예는 예시를 위해 제공되는 것으로서, 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
도입
독성을 암호화하는 γ34.5 유전자가 결실되면 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)가 매개하는 세포독성이 현저히 감소된다. 세포용해성 독성을 종양으로 표적화시키기 위해서, 본 발명자들은 Myb34.5로 명명한 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV1) 돌연변이체를 만들었다. 이 바이러스 돌연변이체는 ICP6(UL39 또는 리보뉴클레오티드 리덕타제로서 알려짐)에서의 결실 및 γ34.5 유전자(RL1)의 2개의 내인성 카피의 결실과, E2F-반응성 세포 B-myb 프로모터의 조절 하에 γ34.5의 하나의 카피의 재도입을 특징으로 한다.
마우스에서 대뇌내 직접 접종시, Myb34.5는 γ34.5 돌연변이체 바이러스와 같은 비독성이다. 그러나, 배양물과 생체내에서 각종 인간 신경교 세포에 대한 종양세포붕괴성 효과는 야생형 γ34.5 유전자를 보유하는 단일 ICP6 돌연변이 균주의 것과 유사하였다. 항종양 효능과 유지된 신경약화의 조합은, γ34.5 돌연변이체의 바람직한 신경약화된 표현형을 유지하면서 세포 주기 조절된 프로모터를 사용하여 HSV-1 독성을 종양으로 표적화시킬 수 있다는 것을 제시한다.
방법 및 재료
플라스미드 및 바이러스- HSV 균주 F(야생형)는 ATCC(미국 버지니아주 마나싸스)로부터 얻었다. 돌연변이체 바이러스 R3616(Chou, J 등, Science 250: 1262-1266(1990))(2개의 γ34.5 위치 내에 1000 bp BstEII-StuI 결실을 포함함)는 시키고 대학의 B. Roizman 박사에게 얻었다. 돌연변이 바이러스 hrR3(Golodstein D.J. and Weiner, S.K., J.Virol. 62:196-205(1988))(코네티컷 대학의 S. Weller로부터 얻음)은 UL39 유전자내로 삽입된 이.콜리 lacZ cDNA를 포함한다. 돌연변이 바이러스 MGH1은 UL39 위치로의 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) lacZ cDNA의 삽입과 2개의 γ34.5 위치의 결실이 특징이며, hrR3의 ICP6-lacZ 영역을 바이러스 돌연변이체 R3616내로 재조합시켜 작제하였다(Kramm, C.M. 등, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068(1997)). ICP6의 2.3 kb XhoI 영역 내의 lacZ 유전자를 함유하는 플라스미드 pKX-BG3은, ICP6(UL39) 유전자의 2.3 kb를 함유하는 플라스미드 pKpX2와 같이 S.Weller로부터 얻었다. 전체 γ34.5 암호화 유전자를 포함하는 플라스미드 pBGL34.5는 크산드라 브레이크필드 앤드 피터 페칸(MGH)에서 얻었다. B-myb 프로모터는 플라스미드 pBGL2myb(영국 루드빅 암 연구 협회의 R.Watson 박사로부터 입수함)로부터 KpnI-HindIII 단편으로서 절제하고 γ34.5의 상류에 직접 클로닝하였다.
Myb34.5 및 Myb34.5 복귀 돌연변이체의 조작 - MGH1내로의 상동성 재조합에 의한 Myb34.5의 조작에 사용되는 플라스미드는 그 전체의 MGH1 내의 lacZ cDNA를 대체하고 ICP6(UL39) 서열의 추가의 888 뉴클레오티드를 결실시키도록 고안하였다. 구체적으로, 재조합 플라스미드(pKpX2-myb34.5)는 다음과 같이 조작하였다. 전장 γ34.5 cDNA는 pBGL34.5로부터 NcoI-Sacl 단편으로서 절제하였는데, 이는 평활 말단이었으며, 이를 pBSKII(미국 캘리포니아주 라졸라의 스트라타젠)내로 서브클로닝하여 플라스미드 pBS34.5를 형성하였다. B-myb 프로모터는 pBGL2myb로부터 KpnI-HindIII 단편으로서 절제하고, pBS34.5 내의 γ34.5의 상류에 직접 클로닝하였다. 그 결과 생긴 γ34.5 cDNA 상류의 B-myb 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 KpnI-XbaI 단편으로서 절제하였으며, 이는 평활 말단이고, 이어서 pKpX2의 NruI 부위 내로 서브클로닝하였다. 이 과정을 통해서, UL39 내의 개입되어 있는 NruI-NruI 단편을 결실시켰다. 생성된 플라스미드 pKpX2-myb34.5를 ScaI로 선형화시키고, 리포펙타민(미국 매릴랜드주 게티스버그 소재의 기브코)을 이용하여 각종 몰 농도에서 MGH1 바이러스 DNA와 함께 베로 세포내로 동시형질감염시켰다. 세포 변성 효과가 명백해지면 형질감염 5∼7일 후에 바이러스 자손을 수거하였다. 냉동-해동의 3회 사이클을 통해 자손을 세포로부터 방출시키고, 단층의 베로 세포 상에서 평판배양하였다. 아가로스로 단층을 덮은 후에, 5% 이산화탄소를 함유하는 대기 중 37℃에서 항온배양을 수행하였다. 그 다음 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드(X-Gal)로 플라크를 염색하였다. 무색의 플라크를 유효 재조합체로서 선택하였다. 이들 분리물에 대해 3라운드의 플라크 정제를 실시한 다음 서던 블롯 분석으로 유전자 동일성을 시험하였다. Myb34.5 복귀 돌연변이체(MybRevt)는, 모균주로서 Myb34.5와 ICP6 유전자좌내로 다시 lacZ cDNA를 상동성 재조합시키고 B-myb/γ34.5 발현 카세트를 결실시키기 위한 플라스미드로서 pKX-BG3를 사용하여 조작하였다.
서던 블롯 분석- SDS/프로테인아제 K로 감염된 베로 세포를 세포 용해시킨 후에 바이러스 DNA를 분리하고, 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전을 반복하였다. 적절한 제한 엔도뉴클레아제(미국 매사츄세츠주 비버리의 뉴 잉글랜드 바이오랩)로 DNA를 분해하고, 아가로스 전기 영동으로 분리한 다음, 나일론막(미국 일리노이주 애링톤 하이츠의 아머샴 코포레이션)으로 옮겼다. 프로브는 pKpX2 유래의 HindIII-Xbal ICP6 단편, pBSK γ34.5 유래의 BstEII-BbsI 단편 및 pKX-BG3 유래의 lacZ의 BbsI 단편을 포함하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 ECL 화학발광 시스템(아머샴)을 사용하여 프로브 라벨링과 하이브리드화를 실시하였다.
세포 배양물 연구 - 모든 세포는 10% 태아 소 혈청, 페니실린 100U/㎖ 및 스트렙토마이신 10 ㎍/㎖를 보충한 듈베코 최소 필수 배지(DMEM) 중에서 5% 이산화탄소를 함유하는 대기 하에 37℃에서 배양하였다. 숙주 단백질 합성 정지 연구는 16 시간 동안 바이러스 균주로 세포를 감염시켜 실시하였다. 메티오닌 무함유 배지 중에 10분 동안 세포를 놓고, 35[S]-메티오닌(미국 매사츄세츠주 보스톤의 뉴잉글랜드 뉴클리어)을 사용하여 90분 동안 표지하였다. 인산염 완충 염수(PBS) pH7로 세포를 세척하고, 용해시킨 다음, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하고, 니트로셀룰로스 막에 옮긴 후 방사선사진 촬영을 하였다. 시판 키트(미국 캘리포니아주 허큘레스의 바이오-라드)로 단백질 농도를 계산하였다. 앞서 개시한 바와 같이(Morse L.S. 등, J.Virol. 26-389-410(1978)), 감염된 세포 폴리펩티드(ICP)를 표지하였다. 인간 신경교아종 세포주 U87, U373, T98G 및 U343; 래트 신경교육종 9L 세포; 인간 신경아세포종 SKNSH 세포 및 베로(아프리카 그린 원숭이) 세포는 미 국 모식균 배양 수집소(미국 버지니아주 마나싸스 소재)로부터 얻었으며, 10% 혈청 및 항생제가 보충된 DMEM 또는 최소 알파 필수 배지(기브코)와 함께 배양하였다. 1차 마우스 태아 선조체 뉴런(배아 단계 18)(미국 매사츄세츠주 챨스타운 소재의 매사츄세츠 제너럴 호스피탈의 M. Schwarzchild로부터 입수)은 공개된 절차를 사용하여 분리하였다(Schwarzschild, M.A. 등, J.Neurosci. 17:3455-3455(1997)).
동물 연구 - 누드(nu/nu) 마우스는 매사츄세츠 제너럴 호스피탈(MGH)의 콕스 7 사육 시설로부터 입수하였다. BALB/C 마우스는 챨스 리버 래보러터리즈(미국 매사츄세츠주 윌밍톤 소재)로부터 입수하였다. 피하 종양은 무흉선 마우스의 측복부에 2 ×105 세포를 주사하여 얻었다(9L 신경교육종 세포의 경우 그룹당 5마리, 인간 U87ΔEGFR 신경교 세포의 경우 그룹당 6마리). 종양 이식 14일(9L의 경우) 또는 10일(U87ΔEGFR의 경우) 후에, 유사한 종양 부피를 갖는 동물을 무작위로 분류하고, 각종 바이러스 균주를 1일, 3일, 5일 및 7일째에 100 ㎕ 부피의 5×107 PFU/용량으로 종양내 주사하였다. 33일(9L의 경우) 또는 34일(U87ΔEGFR의 경우)째에 동물을 마취시켰다. 종양 부피는 전술한 바와 같이 외부 캘리퍼로 측정하였다(Wei M.X. 등, Hum. Gene Ther. 5:969-978(1994)). 신경독성 실험의 경우, BALB/C 마우스는 우측 전두엽(깊이 3 mm)에 다른 희석 농도, 최대 얻을 수 있는 최고 종균 역가로 바이러스 10 ㎕ 부피를 입체공간적으로 주사하였다. 28일 동안 매일 동물을 검사하였다. 모든 동물 연구는 동물 보호에 대한 MGH 보조위원회가 발행한 지침서에 따라 실시하였다. 바이러스 접종 및 바이러스 보유 동물 보호는 인가된 바이러스 벡터실 에서 실시하였다.
결과
Myb34.5의 유전자 공학 - 다중 돌연변이된 바이러스 Myb34.5는 B-myb 프로모터/γ34.5 작제물을 MGH1의 UL39(ICP6 또는 RR로 알려짐) 유전자좌로 재조합하여 작제하였다. MGH1(Kramm, C.M. 등, Hum. Gene Ther. 8:2507-2068(1997))은 lazZ cDNA를 γ34.5 결실 돌연변이체 R3616의 ICP6 유전자좌로 재조합하여 형성하였다(Chou J. 등, Science 250:1262-1266(1990)). 도 1A는 Myb34.5의 DNA 구조의 개략도를 제공한다. 이 구조는 UL39와 B-myb 프로모터/γ34.5 발현 카세트 사이의 접합부의 제한 엔도뉴클레아제 지도작성(데이타는 도시되지 않음), 서던 블롯 하이브리드화(도 1B 내지 1D) 및 서열 분석(데이타는 도시되지 않음)으로 확인하였다. Myb34.5의 lacZ의 결실을 확인하기 위해서, XhoI-분해된 Myb34.5 DNA를 ICP6(도 1B) 또는 lacZ 서열(도 1C) 함유 프로브와 하이브리드화시켰다. 예상한 대로, 어버이 바이러스인 MGH1은 ICP6 프로브에 하이브리드화하는 9.0 kb XhoI ICP-lacZ 단편(도 1B)(Kramm, C.M 등, 상기 문헌 참조)을 포함하였다. 상동성 재조합으로 lacZ 및 부가의 ICP6 서열이 결실되고 B-myb 프로모터/γ34.5 서열이 삽입되었다. 이는 ICP 프로브가 Myb34.5 DNA의 6.7 kb 단편에 하이브리드화하는 것으로 입증된다(도 1B). lacZ 프로브를 이용한 하이브리드화로 Myb34.5 유래의 분해된 DNA의 하이브리드화 단편의 부재 및 MGH1 유래의 분해된 DNA의 예상된 9.0 kb 하이브리드화 단편의 존재를 밝혀냈다(도 1C). Myb34.5가 γ34.5 유전자의 재도입을 보유하는지를 확인하기 위해서, BamHI-분해된 바이러스 DNA를 BstE11-Bbs γ34.5 단편(결실된 영역의 내부)과 하이브리드화시켰다. 이는 통상적으로 야생형 F 균주로 관찰되는 사다리 형태의 하이브리드화 밴드를 나타내었다. Chou 등의 문헌[1991, 상기 문헌 참조]의 연구에서 논의된 바와 같이, γ34.5는 BamHI S 및 SP 단편에서 맵핑되고, 500 bp 증분으로 특징적인 사다리 밴드를 형성하며, 이는 긴 성분의 고유 서열에 인접하는 반복부에서 다양한 수의 α서열의 결과이다. 이 사다리는 F 균주에 대한 서던 블롯에서 관찰되며(도 1D의 레인 1), 상부 하이브리드화 밴드는 BamHI P 단편과 말단 BamHI S 단편의 융합에 의해 형성된 BamHI SP를 나타내며, 하부의 하이브리드화 밴드는 BamHI S 단편을 나타낸다(Chou 등, Science 250:1262-1266(1990)).
R3616 및 이의 유도형 바이러스인 MGH1, Myb34.5 및 Myb34.5Revt에서, 전장 γ34.5 cDNA 프로브가 하이브리드화에 사용되는 경우 분자 크기가 약 1 kb씩 감소하는(R3616에서 γ34.5의 내부 결실의 크기) 유사한 사다리형 하이브리드화 밴드가 예상된다. 실제로 Chou 등의 연구(Chou J. 등, Science 250:1262-1266(1990))에서, 하이브리드화 패턴은 R3616를 나타내며, Kramm 등의 연구(Kramm C.M 등, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068(1997))에서, 하이브리드화 패턴은 MGH1을 나타낸다. 그러나, 도 1D에 도시된 서던 분석의 경우, R3616, MGH1, Myb34.5 및 Myb34.5Revt의 γ34.5 유전자의 1 kb 결실된 단편의 내부에 있는 BstEII-Bbs γ34.5 단편을 프로브로서 사용하였다. 따라서, MGH1(도 1D, 레인 2) 및 Myb34.5Revt(도 1D, 레인 4)에 대한 하이브리드화 밴드는 관찰되지 않으며, ICP6 유전자좌로 재도입된 γ34.5 유전자에 해당하는 Myb34.5(도 1D, 레인 3)에 대해서는 단일의 5.3 kb 하이브리드화 단편이 관찰된다.
Myb34.5의 변형된 표현형이 B-myb/γ34.5의 결과임을 입증하기 위해서, 복귀 돌연변이체(마커-구제) 바이러스를 조작하고 MbyRevt라고 명명하였다. 이는 어버이 균주로서 Myb34.5와 재조합 플라스미드로서 선형화된 pKX2-BG3을 이용한 상동성 재조합으로 얻었다. 이 플라스미드는 lacZ/ICP6 삽입체를 포함하였으며, MGH1의 ICP6::lacZ 융합 영역의 공급원인 hrR3을 형성하는데 사용하였다(Kramm C.M. 등, Hum. Gene. Ther. 8:2057-2068(1997); Goldstein D.J. & Weller S.K., J.Virol. 62:2970-2977(1988)). MbyRevt 복귀 돌연변이체는 ICP6(도 1B), lacZ(도 1C) 및 γ34.5(도 1D) 프로브에 대한 서던 하이브리드화 패턴은 Myb34.5의 모균주인 MGH1에 의해 나타나는 것과 동일하였다.
γ34.5의 기능적 발현 - Myb34.5가 기능적 γ34.5 단백질을 생성하는 것을 확인하기 위해서, 인간 SKNSH 신경아세포종 세포를 각종 바이러스 균주로 감염시켰다. 도 2는, 예상한 바와 같이 MGH1 및 복귀 돌연변이체 바이러스(MybRevt)가 단백질 합성 중단으로 구성된 감염된 세포 반응을 방지하지 못한다는 것을 보여주며, 이는 온전한 γ34.5 기능의 특징이다(Chou, J. 1992, 상기 문헌 참조). 그러나, Myb34.5와 온전한 γ34.5를 보유한 기타 균주(야생형 F 및 hrR3)는 감염된 세포 반응(단백질 합성의 중단)을 방지하여, 바이러스 단백질을 생산한다.
Myb34.5가 기능적 γ34.5 단백질을 발현하는 추가의 증거는, γ34.5 돌연변이체 HSV 균주의 복제를 제한하는 것으로 이미 알려진 U373 신경교아종 세포주에서 바이러스 복제를 평가하여 제공하였다(Mohr, I 및 Bluzman Y, EMBO J. 15:4759- 5766(1996)). MOI 1.0으로 5 ×105 세포를 감염시키고 48시간 후에 바이러스 생성물을 수거한 다음, Myb34.5 수율은 야생형 F 균주와 유사하였다(각각 1.1 ×107 PFU 대 5.0 ×107 PFU). 대조적으로, MGH1(3.3 ×104 PFU) 또는 MybRevt(3.4 ×107 PFU, 3중 실험의 평균)의 수율은 상당히 낮았다. 비침투성 세포주에서 효과적으로 복제하는 Myb34.5의 능력은, MGH1 또는 MybRevt와 대조적으로, Myb34.5의 암호화된 γ34.5가 기능적임을 제시한다.
신경독성 연구 - 임의의 복제 컴피턴트 HSV 균주의 하나의 중요한 특성은 시험관내 및 생체내에서 평가할 수 있는 수준의 신경독성이다. 1차 뉴런 배양물에서 복제하는 Myb34.5 바이러스의 능력은 F, hrR3, MGH1 및 MybRevt 균주와 비교하여 측정하였다. 쥐 태아 선조체 뉴런을 감염시키고, 베로 세포(효과적인 바이러스 복제에 γ34.5를 필요로 하지 않음) 상에서 플라크 분석으로 바이러스 수율을 평가하였다. 야생형 F 균주는 뉴런의 활발한 복제를 나타낸 반면, Myb34.5를 비롯한 모든 돌연변이체 균주는 최소 바이러스 복제를 나타내었다(표 1 참조).
1차 뉴론 배양물에서의 바이러스 복제*
HSV 균주 평균(SEM) 바이러스 생산량(PFU)
F(야생형) 1.0 ×107 (1.4 ×106)
hrR3 4.1 ×103(4.2 ×102)
MGH1 1.4 ×103(73)
Mybγ34.5 6.0 ×103(4.3 ×102)
MybRevt 1.5 ×103(74)
* 총 2.5 ×105 쥐 태아(18일) 선조체 뉴런을 수거하고 전술한 바와 같이 평판배양하였다(Chase, M 등, Nat. Biotechnol. 16:444-448(1998)). 평판 배양 2일 후에, 이중 실험으로 야생형(균주 F) 및 돌연변이체 바이러스 균주를 이용하여 MOI 0.1로 세포를 감염시켰다. 주사 24시간 후에, 세포 및 상청액을 수거하고, 냉동-해동 사이클을 실시하여 바이러스 입자를 유리시켰다. 바이러스 생산량은 베로 세포 상에서 플라크 분석으로 측정하였다. 표준 오차(SEM)는 괄호 안에 있다. 4가지 돌연변이체 바이러스 균주(hrR3, MGH1, Myb34.5 및 MybRevt)의 바이러스 생산량은 그룹 간에 통계학적인 차이를 나타내지 않았다(t-테스트, p>0.3)

생체내 세팅에서, BALB/C 마우스에 Myb34.5를 대뇌내 직접 접종하여 바이러스가 야생형 HSV와 비교하여 현저히 신경약화되었다는 것을 입증하였다. 표 2로부터 Myb34.5의 LD50이 2.7 ×105 PFU로서, F 균주(야생형)보다 로그 단위로 3 이상 크다. γ34.5 돌연변이체(MGH1, R3616 및 MybRevt)는 잘 성장하지 않지만, 대규모 생산 없이 >109 PFU/㎖의 역가를 달성할 수 없다. 이로 인해 이들 실험에서 돌연변이체에 대한 LD50을 정확하게 평가하는 능력이 제한된다. 비교를 위해서, Myb34.5의 107 PFU를 대뇌 접종하는 경우 6마리의 마우스 중 한 마리가 죽었지만, 동량의 MGH1을 접종한 경우 6마리의 마우스중 한 마리도 죽지 않았다. 이러한 발견으로부터 B-myb 프로모터의 제어 하에 γ34.5을 재도입하면 최소한의 신경독성을 산출한다는 것을 확인하였다.
마우스 내로 대뇌내 접종 후에 죽음을 유발하는 야생형 및 돌연변이 바이러스 균주의 상대적 능력*
접종물 내 바이러스 설명 LD50(PFU)
HSV-1(F) 야생형 1.0 ×104
hrR3 RR에서의 lacZ 삽입 1.3 ×106
R3616 γ34.5 돌연변이체 > 1 ×107 **
MGH1 γ34.5/RR 이중 돌연변이체 > 1 ×107 **
Myb34.5 RR/myb34.5 2.7 ×107 ***
혈청 무함유 배지 중 바이러스의 일련의 희석물(부피 10 ㎕)을 3주령 암컷 BALB/C 마우스(미국 매사츄세츠주 윌밍톤에 소재하는 찰스 리버 래보러터리즈, PFU 레벨당 6마리의 동물)의 우측 반구내로 입체공간적으로 주사하였다. 28일동안 매일 사망율에 대해 동물을 검사하고, LD50 (PFU)는 비례 거리 모델을 사용하여 계산하였다. R3616 및 MGH1에 대한 이중 별표(**)는 개시된 용량에서는 죽은 마우스가 없었음을 나타내는데, 이들 용량은 이들 균주의 경우 주어진 주사 부피에서 도달할 수 있는 최대 용량이다. 그 이유는 공업적 규모의 생산 없이 성장하는 베로 세포에서 이들 돌연변이체를 이용하여 >109 PFU/㎖ 역가를 기술적으로 얻을 수 없으며, 대뇌내 주사는 최대 10 ㎕의 부피로 제한되기 때문이다. 삼중 별표(***)는 유사 실험에서 6마리의 동물당 한 마리가 107 PFU의 용량에서 죽었다는 것을 나타낸다. 5 ×109 내지 1 ×1010 PFU/㎖의 역가를 급속하게 분열되는 베로 세포 또는 종양 세포에서 Myb34.5로 얻을 수 있기 때문에, 더욱 정확한 LD50을 측정할 수 있다.

정지 및 순환 세포에서의 γ34.5 유전자 발현의 조절 - 휴지 세포 대 순환 세포 중에서 Myb34.5의 작용을 추가로 평가하기 위해서, 1차 인간 섬유아세포를 평판배양하고, 헤르페스 바이러스 복제를 저해하지 않는 것으로 확인된 20 μM 로바스타틴으로 세포 주기를 정지시켰다(Schang L.M. 등, J.Virol. 72:5626-5637(1998)). 정지된 1차 섬유아세포에서, MGH1, Myb34.5 및 MybRevt는 단일 RR 돌연변이체 hrR3보다 1 로그 단위 낮은 수준에서 F 균주에 비하여 최소의 바이러스 복제를 나타내었다(도 3). 대조적으로, 혈청의 존재하에 hrR3 및 Myb34.5는 복제를 현저히 유도한 반면, MGH1 및 MybRevt는 그렇지 않았다. 이들 결과는 1) γ34.5가 형질전환되지 않은 세포 유형에서 효율적인 복제에 필요하다는 것과, 2) B-myb 프로모터는 순환 세포에서 Myb34.5의 효율적인 복제를 허용하는 기능을 한다는 것을 제시한다. Myb34.5는 hrR3보다 휴지 세포 대 순환 세포에서의 바이러스 자손의 생산에 상당한 차이를 나타내었으며(로그 단위로 3 대 2), 휴지 세포에서의 바이러스 생산은 γ34.5 돌연변이체 바이러스의 것과 동일하다는 것은 주목할 만하다.
종양세포붕괴 효과에 대한 비교 연구 - Myb34.5의 종양세포붕괴성 효과를 측정하기 위해서, 5가지의 상이한 신경교 세포주(9L, U87, U87ΔEGFR, T98G 및 U343)를 모의 감염시키거나(바이러스 없음) 또는 F 균주, MGH1, Myb34.5 및 MybRevt를 비롯한 바이러스 균주 패널로 감염시켰다. 48시간 후에 생존 세포를 계수하고, 모의 처리된 평판에서의 세포 생존율(%)로서 표현하였다. 래트 9L 신경교육종 세포의 공개된 연구(Kramm, C.M. 등, Hum.Gene Ther. 8:2057-2068 (1997)) 및 인간 신경교종 세포 U343 및 T98에 대한 미공개된 연구(Qureshi N. 및 Chiocca E.A., 미공개 데이타)에서, MGH1에 의한 종양 세포 사멸은 2종의 인간 신경교 세포주의 경우 R3616에 의한 것과 유사한 것으로 예비 시험에서 나타났으며(표 3), 따라서 R3616 돌연변이체는 추가의 분석을 하지 않았다.
시험된 모든 종양 세포주에서, Myb34.5는 모균주 MGH1에서보다 시험관내 종양세포붕괴 효과가 더 우수하며, 일부 종양 세포주의 경우 종양세포붕괴 효과가 야생형 바이러스와 비슷하였다(표 3). 이들 발견은 Myb34.5의 종양세포붕괴 효과가 γ34.5 돌연변이체 바이러스(MGH1, Myb34.5 및 R3616, 이들의 사멸 효과는 MGH1의 것과 유사함)보다 크다는 것을 보여주었다.
야생형 및 돌연변이 HSV 균주에 의한 시험관내 신경교종 세포 사멸*
세포주 HSV 균주로 감염시킨 후에 생존율(SEM)(%)
F MGH1** Myb34.5 MybRevt
U87 2.9(0.7) 52(2.0) 19.5(1.5) 51(2.5)
9L 23.7(1.7) 60(1.2) 29(1.4) 59.5(1.4)
U343 19(1.1) 35.7(1.6) 26.3(1.1) 32.3(3.0)
T98G 26.8(0.8) 38.5(1.0) 29.3(1.7) 40(1.2)
U87ΔEGFR 15(0.4) 48(0.3) 10(0.6) 50(0.7)
* 인간(U87MG, U343, T98G 및 U98ΔEGFR) 및 래트(9L) 신경교종 유도된 세포주를 60 mm 직경 평판에서 5 ×105 세포로 평판배양한 다음 기재된 균주를 이용하여 MOI 0.1로 감염시켰다. 종양세포붕괴 효과는 감염 48시간 후에 세포 생존을 반영하고, 3중의 비감염된 대조군 평판으로부터 생존 세포의 수의 비율(%)로서 표현한다. 이 값은 3중 실험의 평균(괄호 안해 SEM)을 나타낸다. Myb34.5 대비 MGH1 또는 MybRevt에 의한 종양 세포의 사멸에 있어서의 차이는 통계학적으로 유의적이었다. 예를 들어, U87 신경교 세포의 경우 P는 <0.001이었다(터어키 쌍방식의 복수 비교 절차를 이용한 변화의 한방향 분석). ** R3616에 대한 사멸은 특정 실험 세트에 포함시키지 않았는데, 그 이유는 MGH1에서 관찰되는 것과 비교적 유사하기 때문이다. 이는 래트 9L 신경교육종 세포에 대해서 뿐 아니라 본 실험과 상이한 시점에서 수행한 미공개된 이전의 다수의 실험에서 Kramm 등(Kramm C.M. 등,Hum. Gene Ther. 8:2057-2068(1997))에 의해 밝혀졌다. 예를 들어, MGH1 또는 R3616 세포로 MOI 0.1로 감염시킨 인간 U343 신경교 세포의 경우, 생존율은 2일째에 각각 54% 및 50%였다. MGH1 또는 R3616으로 MOI 0.1로 감염시킨 인간 T98 세포의 경우, 생존율은 각각 40% 및 38%였다.

생체내 항암 효과 - Myb34.5의 생체내 항암 효과를 측정하였다. 래트 9L 신경교육종(도 4A) 또는 인간 U87dEGFR 신경교종(도 4B) 종양을 무흉선 마우스의 측복부에 형성한 후에, 각 바이러스의 신생물내 접종을 실시하였다. 평균 종양 부피로 평가되는 바와 같이 9L 종양 성장은 대조군 동물과 비교하여 Myb34.5 처리로 상당히 감소하였으며, hrR3 처리 후와 정량적으로 유사한 억제를 나타내었다(도 4A). 공통의 절두된 EGF 수용체를 발현하는 인간 신경교종인 U87ΔEGFR의 경우(Nagane, M 등, Cancer Res. 56:5079-5086(1996); Huang, H.S. 등, J.Biol.Chem. 272:2927-2935(1997); Nishikawa R. 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:7727-7731(1994)), 모 든 균주는 성장을 상당히 억제하였으며, hrR3 및 Myb34.5는 6개 중 3개의 완전한 퇴행을 나타내는 반면 MGH1 및 MybRevt는 6개중 2개의 퇴행(내지 종양을 관찰할 수 없음, 도 4B)을 나타내었다.
도 4B의 피상적인 분석으로 γ34.5 돌연변이체(MGH1 및 MybRevt) 대비 γ34.5+ 바이러스(hrR3 및 Myb34.5)로 처리된 인간 U87ΔEGFR 종양의 성장에 있어서 유의적인 차이가 없다는 결론에 이르렀지만, 34일 시점에서 실제 종양 부피를 검사한 결과 상당한 차이가 있다는 것이 밝혀졌다(표 4). 따라서, 이들 결과는 Myb34.5의 종양세포붕괴 효과가 단일 RR 돌연변이체의 것과 유사하며, γ34.5 돌연변이체보다는 우수하다는 것을 보여주었다.
치료 후에 인간 U87ΔEGFR 종양의 부피a
동물 번호 처리 후 종양 부피(mm3)
모의 감염 바이러스 돌연변이체에 의한 감염
HrR3 MGH1 Myb34.5 MybRevt
1 11,880 0 3,960 4,000 221
2 19,530 32 0 0 561
3 15,592 15 0 132 0
4 10,626 0 1,300 0 3,420
5 10,584 0 1,914 0 3,344
6 15,620 3,366 900 405 0
평균값b 13,736 7.5 1,100 66 391
신뢰 범위 (25∼75%) 10,626-15,620 0-32 0-1,914 0-405 0-3,344
a 실험 절차의 세부 사항은 도 4에 대한 설명에 제시되어 있다. 결과는 34일 시점에서 얻은 것이다. b 치료군에서의 중앙값의 차이는 통계학적으로 차이가 있었다(P=0.004 [랭크에 대한 변수의 Kruskal-Wallis 한방향 분석]).

토의
본 실시예에서, 표적화된 이중 돌연변이체 HSV 균주 Myb34.5는 마우스의 직접적인 대뇌내 접종에 대한 신경독성의 측면에서 고도로 안전성을 유지하면서, 시험관내 및 생체내에서 악성 신경교종 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 확인하였다. 이 균주는 단일 RR 돌연변이를 특징으로 하는 HSV에서 관찰되는 유도와 유사하게, 1차 정지된 섬유아세포에서 최소의 복제와 순환 세포에서 현저한 복제 유도를 나타내었다. 종양 세포에서, 이 균주는 활발히 복제하였으며, 어버이 이중 RR/γ34.5 돌연변이체인 MGH1과 비교하여 종양세포붕괴성 효과가 개선되었다. 이는 감염된 세포로부터 얻은 바이러스 수율이 낮아서 MGH1 및 기타 γ34.5 돌연변이체의 효능이 제한되는 것과 관련이 있다(Kramm C.M. 등, 상기 문헌 참조). 아마도 가장 중요한 것은, MGH1 또는 기타 γ34.5 돌연변이체와 같이 Myb34.5가 107 PFU의 대뇌내 용량에서 마우스에게 거의 병원성이 되지 못하고 신경약화시킨다는 것을 확인한 것이다. 따라서, 어버이 돌연변이체 MGH1, 마커-구제형 복귀 돌연변이체 MybRevt 및 MGH1 어버이 돌연변이체 R3616과 비교하여 Myb34.5가, 신경약화 특성을 유지하면서 LD50 > 107 PFU의 개선된 종양세포붕괴성 효과를 나타낸다. 이 값은 γ34.5 돌연변이체에서 관찰된 것과 정성적으로 유사하지만, 나중 그룹의 돌연변이체에 대한 LD50을 정확하게 측정하는 기술적 능력이 없기 때문에 엄격한 정량적 비교는 제한되었다.
암 유전자 요법에서의 주요 목적은 상당한 항암 효과를 제공하면서, 동시에 정상 세포와 조직에 대한 부작용과 독성은 최소한으로 나타내는 바이러스 돌연변이체를 동정하는 것이다. 이러한 장점은 복제-결함 바이러스 벡터를 조작하여 얻었으는데, 이러한 벡터는 감염된 정상 세포와 종양 세포에 대한 최소의 독성을 나타내고 이들 세포에 생물학적 효과를 달성하기 위한 항암 유전자를 발현하는 능력을 부여해야 한다(Moriuchi S. 등, Cancer Res. 58:5731-5737(1998)). 이러한 벡터를 거대한 인간 종양 덩어리에 접종물로서 투여하는 경우, 벡터의 크기로 인해 확산되지 않으며, 따라서 주사 경로에 근접하여 위치한 세포로 항암 효과가 제한된다(Babo R.H. 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Puumalainen A.M 등, Hum. Gene. Ther. 9:1769-1774(1998)).
이러한 문제에 대한 한 가지 가능한 해결책은 정상 세포에서 복제하는 능력이 제한되어 있으면서 종양 세포 또는 유사분열 세포에서 비교적 선택적인 방식으로 복제하는 능력을 유지하는 복제-조건성(종양세포붕괴성, 복제-제한성) 바이러스 돌연변이체를 사용하는 것이다. 따라서, 이러한 바이러스 돌연변이체는 초기에 감염된 종양 세포로부터 주변 종양 세포로 전파되어, 널리 분포되고 개선된 항암 효과를 나타낸다. 그러나, 이들 돌연변이체를 이용한 경우 독성 증가를 예상해야 한다. 복제-조건성 HSV-1과 관련된 가능한 독성을 최소화하기 위해서, 내인성 γ34.5 유전자를 결실시키면 설치류(Chou J 등, Science 250:1262-1266(1990); Markert J.M. 등, Neurosurgery 32:597-603(1993); Markovitz N.S. 등, J.Virol. 71:5560-5569 (1997)) 및 아오투스(Aotus) 원숭이(Mineta T. 등, Nat.Med. 1:938-943(1995))에서의 대뇌내 주사시 뇌염 또는 수막염의 위험을 상당히 제한하거나 또 는 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 악성 뇌 종양이 있는 인간의 I기 임상 시험에서, 이러한 유형의 돌연변이체는 질병 효과의 증거를 나타내지 않았다(Maruza R.L., 개인적인 통신).
그러나, 내인성 γ34.5 기능을 완전히 제거하면 HSV의 항암 효과가 제한될 수 있다는 우려가 있다. 공개된 실험에서, 시험관내 및 생체내의 래트 9L 신경교육종 세포에서 이러한 제한이 발견되었다(Kramm S. 등, Hum. Gene Ther. 8:2057-2068(1997)). 본 실시예에서, 본 발명자들은 5가지 인간 신경교종 세포주의 패널에 대해 γ34.5 기능이 결실된 HSV 돌연변이체(MGH1 및 MybRevt)가 매개하는 사멸을 시험하였다(표 2). 예측한 바와 같이, 이들 돌연변이체는 야생형 F 균주와 비교하여 종양세포붕괴성 효과가 상당히 제한되어 있었다. 유사한 발견이 MGH1 어버이 균주인 R3616에서 관찰되었다(Qureshi, N 및 Chiocca, E.A., 미공개 데이타). 그러나, MGH1의 종양세포붕괴성 효과는, B-myb 프로모터 제어 하에 단일 γ34.5 유전자의 삽입시 야생형 F 균주에서 관찰되는 것과 유사한 수준으로 복귀되엇다.
이러한 결과의 중요성은 종양 내로 Myb34.5를 접종하면 종양 내로 MGH1, R3616 또는 기타 γ34.5 돌연변이체를 접종하는 것보다 더욱 강력한 종양세포붕괴가 일어날 것을 예상할 수 있다는 것이다.
실제로, 생체내 Myb34.5의 항종양 효과는 단일 RR 돌연변이체(hrR3)의 것과 정량적으로 유사한 것으로 밝혀졌으며, 이는 종양 세포에서 γ34.5 생성물의 활성 발현이 Myb 34.5를 γ34.5 양성 표현형으로 되돌린다는 것을 제안한다. 그러나, hrR3은 단순한 삽입 돌연변이체이기 때문에 Myb34.5는 잠재적으로 이미 존재하는 HSV 감염 또는 후속 HSV 감염의 존재하에 야생형으로 재조합 복원시키기가 쉽지 않다는 이론적 장점을 제공한다. 상동성 재조합을 통해 ICP6 유전자좌의 복원이 발생하는 있을 것 같지 않은 사건에서도, B-myb/γ34.5 삽입체를 절제하여 Myb34.5를 MGH1에 대한 어버이 바이러스인 R3616의 γ34.5 결실된 유전자형으로 다시만든다.
공개된 결과로부터 γ34.5의 하나 이상의 기능은 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 반응을 방해하는 것(즉, 고사와 유사한 반응으로 숙주 단백질 합성 중단을 촉발함)임을 입증하였다(Chou J. 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92: 10516-10520(1995); Chou J. 등, Science 250:1262-1266(1990); Chou J. 및 Roizman B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270(1992)). 병원성 바이러스 중에 유사한 기능이 보급되어 있다(Cosentino G.P. 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:9445-9449(1995); Gale M. 등, Mol.Cell.Biol. 18:5208-5218(1998); Katze M.G., Trends Microbiol. 3:75-78(1995); Sharp T.V. 등, Nucleic Acids Res. 21:4483-4490(1993)). γ34.5는 베로 세포에서 배양시 바이러스 성장에 불필요하지만, 마우스 중추 신경계에서 바이러스를 보급하게 할 수 있고(Kesari S. 등, J.Gen.Virol. 79:525-536(1998); Kesari S. 등, J.Neurosci. 16:5644-5653(1996); Markovitz N.S. 등, J.Virol. 71:5560-5569(1997)), CNS 복제와 이미 연루되어 있는 HSV 게놈 영역으로 배치한다(Centifanto-Fitzgerald Y.M. 등, J.Exp.Med. 155:475-489(1982); Markovitz N.S. 등, J.Virol. 71:5560-5569(1997)). 이는 γ-34.5가 암호화하는 단백질이 2본쇄 RNA 의존성 키나제를 억제한다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 2본쇄 RNA 분자에 노출시, 바이러스 감염에서 일반적으로 관찰되는 바와 같이, RNA 의존성 키나제는 신장 개시 인자 2의 알파 서브유닛을 인산화시켜 단백질 합성을 억제한다(Chou J. 등, Science 250:1262-1266(1990); Chou J. 등, J.Virol. 68:8304-8311(1994)); Chou J. 및 Roizman B., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:3266-3270(1992)). γ34.5를 발현할 수 없는 돌연변이체로 뉴런 기원의 세포를 감염시키면 세포 단백질 합성이 중단되어, 그 결과 바이러스 생성이 제한된다.
본 연구의 중요한 측면 중 하나는 B-myb 프로모터 전사 제어에 의해 γ34.5 기능의 회복을 보여주고자 한 것이었다. 이는, MGH1 및 MybRevt로 세포를 감염시키면 단백질 합성을 억제하는 반면, Myb34.5가 감염성 바이러스인 경우 단백질 합성이 복구되었다는 것을 입증함으로서 실시하였다. 세포 주기에 대한 γ34.5 기능의 신규 B-myb 전사 의존성에 대한 추가의 증거는 로바스타틴 정지 실험으로 제공되었다. 이들은 성장 정지 조건 하에서 B-myb 전사 활성이 최소인 경우, Myb34.5의 역가가 MGH1 및 MybRevt와 유사하였으며, 야생형 F 균주 및 hrR3와는 달랐다는 것을 명백히 보여준다. 그러나, 세포가 혈청 자극된 경우, Myb34.5 역가는 3 등급 증가하여 균주 F 및 hrR3에서 관찰되는 역가에 근접하였지만, γ34.5 돌연변이체(MGH1 및 MybRevt)의 역가는 약간만 증가하였다. Myb34.5 복제의 기본 수준은 휴지 세포에서 hrR3보다 낮았으며, RRγ34.5 돌연변이체 MGH1과 정량적으로 더욱 유사하였다는 것은 주목할만 하다. Myb34.5는 hrR3보다 순환 세포에서 복제를 더 높은 비율로 유도하는 반면, MGH1 및 MybRevt는 최소 유도를 나타내었는데, 이는 Myb34.5 작제물의 효과가 리보뉴클레오티드 리덕타제를 단순히 보충하는 효과를 능가한다는 것을 제시하는 것이다.
이들 결과는 B-myb 프로모터가 휴지 세포에서 바이러스 복제를 제한하고 바이러스 복제를 순환 세포로 재유도한다는 가설을 확인하는 것이다. 뇌 종양 요법 상황에서, Myb34.5는 휴지 상태인 세포에서 비교적 낮은 수준(MGH1에서 관찰되는 수준과 유사)으로 복제하지만, 분열하는 뇌 종양 세포에서의 감염은 바이러스 역가를 상당히 증가시켜, MGH1 또는 기타 γ34.5 돌연변이체를 능가하는 치료학적 장점을 제공한다. 정상 뇌 세포는 γ34.5 돌연변이체를 이용하여 감염시킬 수 있으며(Kesari S. 등, J.Gen.Virol. 79:525-536(1998); Kesari S. 등, J.Neurosci. 16:5644-5653(1996); Markovitz N.S. 등, J.Virol. 71:5560-5569(1997)), 휴지 상태의 감염된 신경 세포에서의 이들 돌연변이체를 모방하는 Myb34.5의 작용을 예상할 수 있다. 실제로, 시험관내 및 생체내 연구 결과 배양된 뉴런 및 마우스의 뇌에서의 Myb34.5 복제는 γ34.5 돌연변이체 바이러스(MGH1, MybRevt 및 R3616)와 유사하며, 야생형 F 균주 및 hrR3와는 다르다는 것을 보여준다.
대안적인 설명은, Myb34.5의 관찰된 효과가 2개의 내인성 γ34.5 유전자를 단일 γ34.5 유전자로 치환한 것과 내인성 HSV γ34.5 프로모터보다 약한 프로모터(B-myb)를 사용하는 것에 기인하는 것이며, 엄격한 세포 주기 조절의 특성은 HSV 게놈에서 파괴된다는 것이다. 이러한 가능성을 정식으로 배제하려면 B-myb 프로모터를 이용한 광범위한 추가의 실험이 필요하지만, 본 발명자들은 현재의 실험 데이타로부터 고려해보면 그럴 가능성은 없을 것 같다고 생각한다. 이러한 설명이 사실이라면, (i) Myb34.5의 돌연변이체에서 조절되지 않는 B-myb 프로모터에 의한 γ34.5 유전자의 발현 수준이 낮기 때문에 휴지 세포에서 Myb34.5 복제는 γ34.5 결실 돌연변이체에서보다 높고; (ii) 내인성 HSV 프로모터에 의해 유도되는 2개의 γ34.5 유전자에 의해 얻어지는 왕성한 발현과 비교하여 약한 프로모터를 이용한 단일 γ34.5 유전자의 발현은 낮기 때문에 F 또는 hrR3을 이용한 세포 감염에서 관찰되는 것보다 Myb34.5로 감염된 신경아세포종 세포에서 관찰되는 숙주 단백질 합성 중단의 억제(도 2)가 덜 심하며; (iii) γ34.5 돌연변이체의 복제를 엄격하게 제한하는 것으로 알려진(Mohr I 및 Gluzman Y., EMBO J. 15:4759-4766 (1996)) U373 세포에서의 Myb34.5 복제는 F 또는 hrR3와 비교하여 Myb34.5 내의 γ34.5 유전자의 약한 발현에 의해 다소 제한되고; (iv) 휴지 세포와 순환 세포 사이의 복제 차이는 Myb34.5(통제되지 않는 B-myb 프로모터에 의해 유도되는 γ34.5의 1개 카피를 발현함)의 경우보다 hrR3 또는 F 균주(내인성 HSV 프로모터에 의해 유도되는 γ34.5의 2개 카피를 발현함)의 경우 더 높다는 것을 예측할 수 있다.
이 실시예에서 실험 데이타는 전술한 예측과 일치하지 않는다. 관찰된 결과에 대한 가장 그렇듯한 설명은 B-myb 프로모터가 HSV 게놈에서도 비교적 엄격한 방식으로 조절되어, 휴지 세포에서 γ34.5의 발현이, 일어난다고 해도, 최소로 발생하고 완전한 γ34.5 기능을 갖는 바이러스 균주로 관찰한 것과 기능적으로 유사한 것으로 보이는 순환 및 종양 세포에서의 발현 수준으로 만든다는 것이다.
HSV 돌연변이체를 벡터로서 기능하도록 조작할 수 있다는 것이 최근 밝혀졌다. 이로써 돌연변이체는 바이러스 종양세포파괴 기능 뿐 아니라 추가의 항암 효과를 발현하며, 따라서 치료 효과가 증가된다(Chase M. 등, Nat.Biotechnol. 16:444-448(1998)). Myb34.5는 프로드럭을 활성화시키는 것과 같은 항암 유전자를 첨가하 기 위한 적절한 골격을 제공할 수 있는 것은 명백하다. 종양 선택적 프로모터가 확인됨에 따라, 이들을 비교적 쉽게 사용하여 γ34.5 유전자 또는 다른 독성 유전자의 발현을 제어하여 바이러스 생산을 종양 세포 대 정상 세포로 추가로 제한할 수 있다. 개시된 접근법은 세포 특이적 프로모터를 사용하여 조직내 특이적 세포 유형에 독성을 한정하는데 사용할 수 있다.
B-myc 프로모터는 공통 E2F 결합 부위를 포함하며, 순환 세포에서 엄격하게 조절되고, 실제로 G0에서 억제된다(Lam E.W. 및 Watson R.J., EMBO J. 12:2705-2713(1993); Lam E.H 등, Gene 160; 277-281(1995); Bennett J.D. 등, Oncogene 13:1073-1082(1996)). E2F 반응성 프로모터를 포함하는 복제 결함 아데노바이러스는, 휴지 뉴런 조직 뿐 아니라 형질전환되지 않은 정상 순환 세포에 관한 종양 특이적 유전자 발현을 확인하는데 사용되어 왔다(Parr M.J. 등, Nat.Med. 3:1145-1149(1997)). E2F를 조절하는 세포 주기 조절성 p16/망막아세포종/cdk4 경로의 일부의 변형이 인간 신경교종 뿐 아니라 여러 다른 종양 유형에서도 거의 보편적인 사건인 것으로 보이며, 바이러스 유전자 산물의 종양 특이적 발현을 표적화하기 위한 우수한 기질을 제공한다(He J. 등, Cancer Res. 54:5804-5807(1994); Ueki K. 등, Cancer Res. 56:150-153(1996)).
알부민 프로모터를 사용하여 간세포로의 ICP4의 발현을 조절하는 또 다른 HSV-1 돌연변이체가 개시되어 있다(Miyatake S. 등, J.Virol. 71:5124-5132(1997)). 본 보고서에 개시된 방법과의 주요 차이점은, 간세포 특이적 프로모 터 대신에 종양 또는 세포 주기 특이적인 프로모터를 사용한다는 것과, ICP4와 같이 필수 전사 인자보다는 독성(γ34.5)과 직접 관련된 HSV 유전자를 사용한다는 것이다. 신경교아종의 치료에 대한 연구에서 여러 바이러스 벡터와 대조적으로, Myb34.5로 명명한 대표적 바이러스는 복제 능력이 있고, 바이러스 복제 및 직접적인 종양세포붕괴를 조절하여 표적화된 독성이 얻어진다. 이러한 관점에서, Myb34.5는 신규하고, 표적화된 종양세포붕괴성 헤르페스 바이러스이며, 2가지의 최근 개시된 종양 선택적, 종양세포붕괴성 아데노바이러스와 레오바이러스에 부가할 수 있다(Bischoff J.R. 등, Science 274:373-376(1996); Coffey M.C. 등, Science 282:1332-1334(1998)). E1B 결함 아데노바이러스 ONYX-015는 종양 세포에서 효과적인 복제를 위해 p53 종양 억제제 경로를 변형시킨 것에 기초한 것으로 생각되지만, 최근까지도 이 기전이 해명되지 않고 있다(Goodrum F.D. 등, J.Virol. 72:9479-9490(1998)).
레오바이러스 균주는 활성화된 ras 경로를 이용하여 세포 내에서 선택적으로 복제하는 것으로 밝혀졌다(Coffey M.C. 등, 상기 문헌 참조). Myb34.5는 p16/cdk4/RB/E2F 경로 변형을 이용할 수 있으며, 복수의 종양 유전자 변형은 다른 바이러스 치러법에 의해 표적화될 수 있다는 가능성을 증가시킨다. γ34.5 유전자의 발현을 유도하는 세포 특이적 또는 종양 특이적 프로모터를 사용하는 전략은 생체내에서 선별된 세포군을 제거하는 수단으로서 적절할 수 있다. 마지막으로, 유효 항종양 효과와 함께 안전성이 증가된다는 발견은 Myb34.5가 악성 종양의 치료를 위한 우수한 후보임을 제시하는 것이다.
본 발명을 실시하는 전술한 방식의 변형은 의학 분야, 바이러스학, 분자 생물학, 면역학, 약리학 및/또는 관련 분야의 전문가들에게는 자명할 것이며, 이러한 변형은 다음 청구범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 언급한 모든 공개문헌 및 특허는 본 발명이 속하는 분야의 전문가의 기술 수준을 나타낸다. 모든 공개문헌 및 특허는, 각각의 공개문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 인용되었다고 지시한 바와 동일한 범위로 본 명세서에서 참고로 인용한다.
전술한 본 발명은 이해를 명확하게 할 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 세부사항을 기술하였지만, 첨부되는 청구범위 내에서 특정 변화예 및 변형예를 실시할 수 있음은 명백할 것이다.

Claims (32)

  1. (a) γ34.5를 암호화하는 유전자의 2개의 카피에서의 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및
    (b) 세포 특이적 프로모터, 종양 특이적 프로모터 또는 세포 특이적 및 종양 특이적 프로모터의 전사적 제어 하에 γ34.5 유전자의 하나 이상의 카피의 삽입
    을 포함하는 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형인 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 2형인 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  4. 제1항에 있어서, 헤르페스 바이러스 유전자의 하나 이상의 부가의 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이를 추가로 포함하는 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  5. 제2항에 있어서, 헤르페스 바이러스 유전자의 하나 이상의 부가의 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이를 추가로 포함하는 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌 연변이체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 유전자의 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이가 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR), 티미딘 키나제(TK), 우라실 DNA 글리코실라제(UNG) 또는 dUTPase를 암호화하는 유전자 내에 있는 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  7. 제5항에 있어서, 그 생성물이 신생물 세포에 대해 세포독성인 이식유전자(transgene)를 추가로 포함하는 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이식유전자가 화학요법제, 시토킨 유전자, 종양 억제 유전자, 또는 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 혈관형성억제 유전자, 종양 백신화 유전자, 방사선감성 유전자, 안티센스 RNA 또는 리보자임으로 구성된 군에서 선택되는 종양파괴성 유전자를 활성화 또는 증강시킬 수 있는 생성물을 암호화하는 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이식유전자가 본래의 γ34.5 결실 또는 헤르페스 UL40 유전자좌의 임의의 위치에서 삽입되는 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 이식유전자는 화학요법제를 활성화시키는 자살 유전자를 암호화하는 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 자살 유전자가 포유류 시토크롬 P450인 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 포유류 시토크롬 P450이 P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11, 또는 P450 3A4인 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  13. 제2항에 있어서, 상기 종양 특이적 프로모터가 DF3(MUC1), AFP, CEA, PSA, 티로시나제, B-myb 또는 c-erbB2인 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 종양 특이적 프로모터가 B-myb인 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  15. ICP6(UL39 또는 리보뉴클레오티드 리덕타제로서 알려짐)에서의 결실 및 γ34.5 유전자(RL1)의 2개의 내인성 카피의 결실과, E2F-반응성 세포 B-myb 프로모터의 조절 하에 γ34.5의 하나의 카피의 재도입을 특징으로 하는 헤르페스 바이러스 돌연변이체(Myb34.5).
  16. 제2항에 있어서, 상기 세포 특이적 프로모터는 내피 세포에서 발현되는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체(flk1) 프로모터; 췌장의 베타 세포에서 발현되는 인 슐린 프로모터; 시상 하부의 세포에서 발현되는 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체 유전자; 파골세포 및 각질세포에서 발현되는 기질 메탈로프로테인아제 9 프로모터; 골(骨)세포에서 발현되는 부갑상선 호르몬 수용체; 또는 노르아드레날린성 뉴런에서 발현되는 도파민 베타-히드록실라제 프로모터인 것이 특징인 헤르페스 바이러스 돌연변이체.
  17. (a) γ34.5를 암호화하는 유전자내 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및
    (b) 프로모터가 γ34.5 유전자의 발현을 유도하도록, 종양 특이적 프로모터의 전사적 제어하에 γ34.5 유전자의 하나 이상의 카피의 삽입
    을 포함하는 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 함유하는, 공지된 종양 특이적 프로모터를 과발현하는 신생물 세포를 선택적으로 죽이는 데 이용되는 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체가 헤르페스 바이러스 유전자의 하나 이상의 부가의 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이를 추가로 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 유전자의 부가의 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이가 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR), 티미딘 키나제(TK), 우라실 DNA 글리코실라제(UNG) 또는 dUTPase를 암호화하는 유전자 내에 있는 것이 특징인 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 바이러스 돌연변이체가 ICP6(UL39 또는 리보뉴클레오티드 리덕타제로서 알려짐)에서의 결실 및 γ34.5 유전자(RL1)의 2개의 내인성 카피의 결실과, E2F-반응성 세포 B-myb 프로모터의 조절 하에 γ34.5의 하나의 카피의 재도입을 특징으로 하는 것(Myb34.5)이 특징인 약학 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 돌연변이체가 화학요법제를 활성화시키는 자살 유전자를 추가로 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 자살 유전자가 시토크롬 P450을 암호화하는 것이 특징인 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 시토크롬 P450이 P450 2B1, P450 2B6, P450 2A6, P450 2C6, P450 2C8, P450 2C9, P450 2C11, 또는 P450 3A4로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 시토크롬 P450이 P450 2B1인 것이 특징인 약학 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 화학요법제가 시클로포스파미드 또는 이포스파미드인 것이 특징인 약학 조성물.
  26. 제17항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체 내의 상기 종양 특이적 프로모터가 DF3(MUC1), AFP, CEA, PSA, 티로시나제, B-myb 또는 c-erbB2인 것이 특징인 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체 내의 상기 종양 특이적 프로모터가 B-myb인 것이 특징인 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체가 ICP6(UL39 또는 리보뉴클레오티드 리덕타제로서 알려짐)에서의 결실 및 γ34.5 유전자(RL1)의 2개의 내인성 카피의 결실과, E2F-반응성 세포 B-myb 프로모터의 조절 하에 γ34.5의 하나의 카피의 재도입을 특징으로 하는 것(Myb34.5)이 특징인 약학 조성물.
  29. (a) γ34.5를 암호화하는 유전자내 결실 또는 불활성화 돌연변이; 및
    (b) 프로모터가 γ34.5 유전자의 발현을 유도하도록, 세포 특이적 프로모터의 전사적 제어 하에 γ34.5 유전자의 하나 이상의 카피의 삽입
    을 포함하는 헤르페스 바이러스 돌연변이체를 함유하는, 공지된 세포 특이적 프로모터를 과발현하는 표적 세포군을 선택적으로 제거하는 데 이용되는 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 돌연변이체가 헤르페스 바이러스 유전자의 하나 이상의 부가의 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이를 추가로 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스 유전자의 부가의 내인성 결실 또는 불활성화 돌연변이가 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR), 티미딘 키나제(TK), 우라실 DNA 글리코실라제(UNG) 또는 dUTPase를 암호화하는 유전자 내에 있는 것이 특징인 약학 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 세포 특이적 프로모터가 내피 세포에서 발현되는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체(flk1) 프로모터; 췌장의 베타 세포에서 발현되는 인슐린 프로모터; 시상 하부의 세포에서 발현되는 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체 유전자; 파골세포 및 각질세포에서 발현되는 기질 메탈로프로테인아제 9 프로모터; 골(骨)세포에서 발현되는 부갑상선 호르몬 수용체; 또는 노르아드레날린성 뉴런에서 발현되는 도파민 베타-히드록실라제 프로모터인 것이 특징인 약학 조성물.
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