JP2003508055A - ヘルペスγ34.5遺伝子発現の細胞特異的および/または腫瘍特異的プロモーター再標的化 - Google Patents
ヘルペスγ34.5遺伝子発現の細胞特異的および/または腫瘍特異的プロモーター再標的化Info
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Abstract
Description
る権利に関する陳述) 本発明の開発の間に実施された研究のすくなくとも一部は、国立癌研究所から
の助成金(助成金番号CA6924602)を利用した。米国政府は、本発明に
一定の権利を有する。
るヘルペスウイルス変異体に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍および特定
の細胞型に対して変異体ヘルペスウイルスベクターを再標的化するための、細胞
特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターの使用に関する。こ
の細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターを使用して、
ヘルペスガンマ(γ)34.5遺伝子の発現を駆動する。このヘルペスガンマ(
γ)34.5遺伝子の遺伝子産物は、感染した細胞における大量の子孫ウイルス
産生を担う。
、臨床的用途に所望されている。しかし、γ34.5遺伝子を欠損することはま
た、このウイルスが、腫瘍または任意の他の感染組織を殺傷する能力を減少させ
る。本発明は、細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーター
を使用し得る細胞における、ヘルペスウイルスの大量産生を可能にする。しかし
、プロモーターをオン(turn on)にし得ない細胞は、ウイルス複製を支
持せず、このようにして、それらの細胞およびその近隣の細胞が、活性かつ有害
なウイルスの感染および複製から免れ、従って、ヘルペスの毒力を所望される標
的細胞に対して再指向する。
び分化を調節する正常な制御機構が損なわれ、進行性の増殖が生じる。この制御
機構の欠損は、腫瘍を増大させ、そして身体の致命的領域の空間を占拠させる。
腫瘍が周辺組織に浸潤し、そして遠位に輸送(転移)される場合、この個体の死
を招く可能性がある。
約1,500人が癌で死亡すると予期される(Landisら,「Cancer
Statistics,1999」CA Canc.J Clin.49:8
−31(1999))。さらに、癌は、1〜14歳の年齢の小児の間で、事故に
次いで2番目の主要な死亡原因である。同書。従って、明らかに、新たな癌治療
の開発の必要性が存在する。
優先的に癌細胞を殺傷することである。いくつかの方法(外科手術、放射線療法
、および化学療法を含む)が、この目標に到達する試みにおいて使用されてきた
。
断、病期分類、および処置において主要な役割を果たしており、そして早期癌に
ついての主要な処置であり得る(Slapak,C.A.およびKufe,D.
W.,「Principles of Cancer Therapy」、Ha
rrison’s Principles of Internal Medi
cine,Fauci,A.S.ら編,第14版,McGraw−Hill C
os.,Inc.,New York,1998,524を参照のこと)。しか
し、外科手術は、特定の部位に限定された腫瘍を治療するに有効な方法であり得
るが、これらの腫瘍は、腫瘍の場の外側の微小転移性病態に起因して、切除によ
って治癒可能でない可能性がある。同書。一定レベルの転移を示す任意の癌が、
外科手術のみを通してでは、有効に治療され得ない。同書。
)形態の処置である。同書(525)。多くの正常細胞は、腫瘍性細胞よりも高
い細胞間修復能力を有し、それらを放射線の損傷に対して、より低感受性にする
。放射線療法は、照射による損傷に対する感受性における腫瘍性細胞と正常細胞
との間のこの差異、および正常細胞が分節的にのみ損傷を受けた場合に十分に機
能し続ける正常細胞の能力に依存する。同書。従って、放射線療法の成功は、放
射線療法に対する腫瘍周辺の組織の感受性に依存する。同書。放射線療法は、投
与部位に一部依存する副作用を付随する。この副作用には、疲労、局所的な皮膚
反応、悪心、および嘔吐が挙げられる。同書(526)。さらに、放射線療法は
、変異促進性、発癌性、および催奇形性であり、そして患者を、二次性腫瘍を発
達させる危険にさらし得る。同書。
l hyperthermia)(Salcman,M.ら,J Neuro−
Oncol.1:225−236(1983))、光放射線治療(Cheng,
M.K.ら,Surg.Neurol.25:423−435(1986))、
および組織内照射(Gutin,P.H.ら,J Neurosurgery
67:864−873(1987))が含まれる。不幸なことに、これらの治療
は、中程度の成功しか満たしていない。
用量の放射線療法を通して到達し得る身体の領域における腫瘍塊を減少させる方
法を提供する。しかし、副作用のより少ない、より有効な局所的治療が必要とさ
れる。さらに、これらの処置は、大半の癌患者において最終的に見出される、広
範に散在しているかまたは循環している腫瘍細胞の破壊には適用可能でない。腫
瘍細胞の蔓延に対抗するために、全身的な治療が使用される。
の主要な処置である(Slapak,C.A.およびKufe,D.W.,「P
rinciples of Cancer Therapy」、Harriso
n’s Principles of Internal Medicine,
Fauci,A.S.ら編,第14版,McGraw−Hill Cos.,I
nc.,New York,1998,527)。しかし、化学療法剤は、多く
の癌の型(多くの一般的な固形腫瘍を含む)を処置するためのその有効性が制限
されている。同書。この不全は、多くの腫瘍細胞の固有または獲得性の薬物耐性
に一部起因する。同書(533)。化学療法剤の使用に対する別の欠点は、その
重篤な副作用である。同書(532)。これらとしては、骨髄抑制、悪心、嘔吐
、毛髪喪失、および口内の潰瘍化が挙げられる。同書。明らかに、化学療法剤が
、同時に全身的毒性を回避しつつ、悪性腫瘍細胞を殺傷し得る有効性を増強する
ための新たなアプローチが必要である。
ト脳において生じる最も一般的な原発性悪性疾患である))が、現在の処置様相
に抗するということである。外科手術、化学療法、および放射線療法にも関わら
ず、多形性膠芽腫(最も一般的な神経膠腫)は、ほぼ一般的に致死的である(S
choenberg,Oncology of the Nervous Sy
stem,M.D.Walker編,Boston,Mass.,Martin
us Nijhoff(1983);Levinら,第46章、Cancer:
Principles and Practice of Oncology,
第2巻,第3版,De Vitaら編,Lippincott Press,P
hiladelphia(1989),1557−1611頁)。
悪性形態を構成する(Schoenberg,「The Epidemiolo
gy of Nervous System Tumors」、Oncolog
y of the Nervous System,Walker編,Cold
Spring Harbor Laboratory,Cold Sprin
g Harbor,N.Y.(1983))。現在の処置様相(外科手術、放射
線療法および/または化学療法)で仮定すると、この高い悪性度分類型の星状細
胞腫を有するヒトについて、5年の生存率は5%未満である(Mahaleyら
,Neurosurgery 71:826−836(1989);Schoe
nberg,Oncology of the Nervous System
,Walker編,Cold Spring Harbor Laborato
ry,Cold Spring Harbor,N.Y.(1983);Kim
ら,J.Neurosurg.74:27−37(1991),Daumas−
Duportら,Cancer 2:2152−2165(1988))。放射
線療法後に、膠芽腫は通常、局所的に再発する。Hochberg,F.H.ら
,Neurology 30:907−911(1980)。膠芽腫を有する個
体における神経学的機能不全および死亡は、腫瘍の局所的増殖に起因する。全身
的な転移は稀である。同書。この理由のために、全身的な方法ではなく局部的(
regional)な癌治療方法が、膠芽腫の処置に特に適切であり得る。
学療法剤に対して耐性である。多くの化学療法剤は、細胞周期活性(すなわち、
主に活性に周期運動中の細胞(cycling cell)に対して細胞傷害性
)である(Slapak,C.A.,およびKufe,D.W.,「Princ
iples of Cancer Therapy」、Harrison’s
Principles of Internal Medicine,Fauc
i,A.S.ら編,第14版,McGraw−Hill Cos.,Inc.,
New York,1998,527)。一般的に、化学療法は、少量の腫瘍負
荷(ここで、腫瘍の増殖比が最大である)を有する癌に対して最も有効である。
同書。膠芽腫瘍についての増殖比は、わずか30%であり、残りの70%の細胞
は、G0である休止期にある(G0における細胞は死滅であり得るか、または活性
な細胞周期に再エントリーし得る)(Yoshiiら,J.Neurosurg
.65:659−663(1986))。活性に分裂する30%の膠芽腫細胞が
、この腫瘍の致死的な進行に寄与するが、休止性の70%は、活性に増殖してい
る細胞を標的化する多くの化学療法剤に対するこれらの腫瘍の耐性を担う。
膠芽腫の処置における成功は限られていることが見出されている(Burger
ら,J Neurosurg.58:159−169(1983);Wowra
ら,Acta Neurochir.(Wien)99:104−108(19
89);Zamoranoら,Acta Neurochir.補遺(Wien
)46:90−93(1989))。膠芽腫の外科的処置は、腫瘍と周辺の実質
との間の明確な境界線の欠如によって、そして原発部位から伸長する白質路(t
ract)における腫瘍細胞の移動によって妨害され(Burgerら、J.N
eurosurg.58:159−169(1983))、これらがその完全な
除去を妨げている。急速に増殖している細胞を標的化する放射線療法は、膠芽腫
における低い増殖比によって、そして隣接する正常細胞の放射線感受性によって
、制限される(Wowraら,Acta Neurochir.(Wien)9
9:104−108(1989);Zamoranoら,Acta Neuro
chir.補遺(Wien)46:90−93(1989))。従って、脳腫瘍
を処置するための新たなアプローチが特に必要とされる。
、変異ウイルスを使用する。Chung,R.Y.およびChiocca,E.
A.,Surg.Oncol.Clin.N.Am.7:589−602(19
98)を参照のこと。
る:(1)変異誘発されたウイルスによる、直接的な細胞殺傷(腫瘍崩壊)(M
artuzaら,Science 252:854−856(1991);Mi
netaら,Nature Med 1:938−943(1995);Bov
iatsisら,Cancer Res.54:5745−5751(1994
);Kesariら,Lab.Invest.73:636−648(1995
);Chambersら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 9
2:1411−1415(1995);Lorence,R.M.ら,J.Na
tl.Cancer.Inst.86:1228−1233(1994);Bi
schoffら,Science 274:373−376(1996);Ro
driguezら,Cancer Res.57:2559−2563(199
7));および(2)導入遺伝子(この発現産物が化学療法剤を活性化する)を
送達するためのウイルスベクターの使用(Weiら,Human Gene T
herapy 5:969−978(1994);ChenおよびWaxman
,Cancer Res.55:581−589(1995);Moolten
,Cancer Gene Ther.1:279−287(1994);Fa
khraiら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 93.290
9−2914(1996);Rothら,Nature Med.2:985−
991(1996);Moolten,Cancer Res.46:5276
−5281(1986);Chenら,Proc.Natl.Acad Sci
.USA 91.3054−3057(1994))。
さない(replication−incompetent)ウイルスの使用に
焦点を当てていた。このストラテジーによって、ウイルスによる非腫瘍細胞への
損傷を予防することが期待された。このアプローチの主な制限は、これらの複製
能を有さないウイルスが、宿主細胞中に組み込まれ得、および/または複製し得
るために、ヘルパーウイルスを必要とすることであった。ウイルスによる腫瘍崩
壊アプローチの1つの例である、神経系腫瘍を処置するための複製欠損レトロウ
イルスの使用は、ウイルスを伝播させるために、プロデューサー細胞株の移植を
必要とする。これらのレトロウイルスは、その有効性が制限されている。なぜな
ら、各複製欠損レトロウイルス粒子は、単一の細胞にのみ進入し得、そしてその
後、他の細胞に生産的に感染し得ないからである。従って、これらは、プロデュ
ーサー細胞から離れて伝播し得ず、そしてインビボで、深部の多層化腫瘍に完全
には侵入し得ない(Markertら,Neurosurg.77:590(1
992);Ramら,Nature Medicine 3:1354−136
1(1997))。
が伝播するのを可能にしつつ、全身的感染を回避する試みにおける条件的複製(
replication−conditional)ウイルスの生成に焦点を当
てていた。条件的複製ウイルスは、活性に分裂している細胞(例えば、腫瘍細胞
)において優先的に複製するように設計される。従って、これらのウイルスは、
腫瘍崩壊のために腫瘍細胞を標的化するべきであり、そしてこれらの細胞におい
て複製するべきであり、その結果、ウイルスは他の腫瘍細胞に伝播し得る。
ストラテジーは、条件的複製性にさせるための、選択されたアデノウイルスまた
は単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)遺伝子の変異を使用していた(Ma
rtuza,R.L.ら,Science 252:854−856(1991
);Mineta,T.ら,Nature Med 1:938−943(19
95);Boviatsis,E.J.ら,Cancer Res.54:57
45−5751(1994);Kesari,S.ら,Lab.Invest.
73:636−648(1995);Chambers,R.ら,Proc.N
atl.Acad Sci.USA 92:1411−1415(1995);
Lorence,R.M.ら,J.Natl.Cancer.Inst.86:
1228−1233(1994);Bischoff,J.R.ら,Scien
ce 274:373−376(1996);Rodriguez,R.ら,C
ancer Res.57:2559−2563(1997))。例えば、E1
B−55Kdをコードする遺伝子において欠失を有するアデノウイルスは、p5
3欠損腫瘍細胞において選択的に複製することが示されている(Bischof
f,J.R.ら,前出)。
研究されている。第一は、核酸代謝に必要とされるウイルス遺伝子、例えば、チ
ミジンキナーゼ(Martuza,R.L.ら,Science 252:85
4−856(1991)),リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)(Gold
stein,D.J.&Weller,S.K.,J Virol.62:19
6−205(1988);Boviatsis,E.J.ら,Gene The
r.1:323−331(1994);Boviatsis,E.J.ら,Ca
ncer Res.54:5745−5751(1994);Mineta,T
.ら、Cancer Res.54:3363−3366(1994)),また
は、ウラシル−N−グリコシラーゼ(Pyles,R.B.およびThomps
on,R.I.,J Virol.68:4963−4972(1994))の
機能において欠損を有する有するウイルス変異体から構成される。
成される(Chambers,R.ら,Proc.Natl.Acad Sci
.USA 92:1411−1415(1995))。これらは、宿主タンパク
質合成の遮断の抑制を通して、感染細胞のウイルス放出量を著しく増大させるこ
とによって、毒性因子として機能する(Chou,J.ら,Science 2
50:1262−1266(1990);Chou,J.およびRoizman
,B.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 89:3266−3
270(1992))。
K変異体についてのガンシクロビルおよびアシクロビルに対する耐性(Mine
ta,T.ら,Cancer Res.54:3363−3366(1994)
)、野生型ウイルスとの単回の組換え事象による野生型への復帰変異の危険性、
および少なくとも特定の腫瘍細胞株におけるγ34.5変異体についての腫瘍崩
壊効力の減少(Kramm,C.M.ら,Hum.Gene Ther.8:2
057−2068(1997);Mohr.I.& Bluzman,Y.,E
MBO J 15:4759−4766(1996);Toda,M.ら,Hu
m.Gene Ther.9:2177−2185(1998))が含まれる。
イルスが開発された。これらは、変異体G207(Mineta,T.ら,Na
t.Med 1:938−943(1995);Martuzaらに対する米国
特許第5,585,096号(1996年12月17日付発行))、およびMG
H1(Kramm,C.M.ら,Hum.Gene Ther.8:2057−
2068(1997)(これは、γ34.5の両方のコピーの欠失およびRRの
挿入性変異を有する)を含む。
シラーゼ(UNG)変異体株3616UB(Pyles,R.B.ら,Hum.
Gene Ther.8:533−544(1997))である。これらの二重
変異体株は、直接的な頭蓋内注射に際して、神経毒性の著しい減少を示し、ガン
シクロビルに対する感受性を保持し、そして正常組織と比較して、腫瘍細胞にお
いて相対的に選択的な複製を示す。このような二重変異体HSV株は、欠損性の
γ34.5遺伝子を保持し、従って、正常組織に対してほとんど毒力を示さない
。これらは明らかに、腫瘍細胞に対して腫瘍崩壊効果を示すが、このような効果
は、インタクトなγ34.5遺伝子を有する変異体において観察されるよりも小
さい(Kramm,C.M.ら,Hum.Gene Ther.8:2057−
2068(1997);Qureshi,N.およびChiocca,E.A.
未公開データ)。他方で、インタクトなγ34.5遺伝子によって示される毒性
は、腫瘍崩壊剤としての後者のウイルスの潜在的な適用を減少させ得る。
送達であり、これによって、標的腫瘍細胞の表現型を遺伝的に改変して、腫瘍の
薬物感受性および応答性を増加させる。このアプローチは、さもなくば無害であ
る因子に対する感受性を付与するために、プロドラッグ活性化酵素をコードする
「化学的感作」または「自殺」遺伝子を悪性細胞に直接移動させることを包含す
る(Moolten,F.L.,Cancer Gene Therapy 1
:279−287(1994);Freeman,S.M.ら,Semin.O
ncol.23:31−45(1996);Deonarain,M.P.ら,
Gene Therapy 2:235−244(1995))。
究されてきている。1つの例において、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
(HSV−TK)と、プロドラッグガンシクロビルとの組合せは、癌遺伝子治療
におけるその可能な適用に関して当該分野における公知のプロトタイプのプロド
ラッグ/酵素活性化系を代表する。HSV−TKは、プロドラッグであるガンシ
クロビルをリン酸化し、そして活発に分裂する細胞におけるDNA鎖の終結およ
び細胞死ヌクレオシドアナログを生成する。HSV−TKで形質導入された腫瘍
細胞は、ガンシクロビルに対する感受性を獲得する。ガンシクロビルは、もとも
とウイルス感染の処置のために設計された臨床的に証明された薬剤である。Mo
olten,F.L.and Wells,J.M.,J.Natl.Canc
er Inst.82:297−300(1990);Ezzeddine,Z
.D.,et al.,New Biol.3:608−614(1991)。
学療法剤である5−フルオロウラシルに対しその形質転換の結果、抗真菌剤5−
フルオロシトシンに対して腫瘍細胞を感受性にさせることが示されたプロドラッ
グ/酵素活性化系である(Mullen,C.A.,et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 89:33−37(1992);Hub
er,B.E.,et al.,Cancer Res.53:4619462
6(1993);Mullen,C.A.,et al.,Cancer Re
s.54:1503−1506(1994))。
えば、以下を参照のこと:Caruso,M.,et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 90:7024−7028(1993);O
ldfield,E.,et al.,Hum.Gene Ther.4:39
(1993);Culver,K.,Clin.Chem 40:510(19
94);O’Malley,Jr.,B.W.,et al.,Cancer
Res.56:1737−1741(1996);Rainov,N.G.,e
t al.,Cancer Gene Therapy 3:99−106(1
996)。
Connors,Gene Ther.2:702−709(1995))。こ
れらには、細菌の酵素であるカルボキシペプチダーゼG2(これは、哺乳動物ホ
モログを有さず、そしてグルタミン酸部分の切断によって特定の合成マスタード
プロドラッグを活性化するために使用され、活性な細胞傷害性マスタード代謝物
を放出させ得る(Marais,R.,et al.,Cancer Res.
56:4735−4742(1996)))、およびE.coliニトロレダク
ターゼ(これは、プロドラッグCB1954および関連するマスタードプロドラ
ッグアナログを活性化する(Drabek,D.,et al.,Gene T
her.4:93−100(1997);Green,N.K.,et al.
,Cancer Gene Ther.4:229−238(1997))が挙
げられ、これらのいくつかは、CB1954よりも優れ得る(Friedlos
,F.et al.,J Med Chem 40 :1270−1275(1
997)))が含まれる。プロドラッグ活性化遺伝子治療に対するこれらのアプ
ローチの元にある原理は、腫瘍細胞集団の外来遺伝子での形質導入によって、そ
の細胞において、独特のプロドラッグ活性化能力、それゆえ、その遺伝子を発現
しない宿主細胞にはない化学感受性が付与されることである。
P」または「P450」)触媒モノオキシゲナーゼ反応を通じて活性化される癌
化学療法剤との組合わせたシトクロムP450に基づいて開発されてきている(
Chen,L.and Waxman,D.J.,Cancer Resear
ch 55:581−589(1995);Wei,M.X.,et al.,
Hum.Gene Ther.5:969−978(1994);米国特許第5
,688,773号、1997年11月18日発行)。上記のプロドラッグ活性
化戦略とは異なり、P450に基づくの薬物活性化戦略は、(細菌またはウイル
スに由来する遺伝子ではなく)哺乳動物薬物活性化遺伝子を利用し、そしてまた
、癌療法において広汎に使用される、確立した化学療法剤を利用する。
して細胞傷害性または細胞分裂抑止性である代謝物を生成することが知られてい
る。これらには、いくつかの一般に使用される癌化学療法剤が含まれる(例えば
、シクロホスファミド(CPA)、その異性体であるイフォスファミド(IFA
),ダカルバジン、プロカルバジン、チオテパ、エトポシド、2−アミノアント
ラセン、4−イポメアノール、およびタモキシフェン(LeBlanc,G.A
.and Waxman,D.J.,Drug Metab.Rev.20:3
95−439(1989);Ng,S.F.and Waxman D.J.,
Intl.J.Oncology 2:731−738(1993);Goep
tar,A.R.,et al.,Cancer Res.54:2411−2
418(1994);van Maanen,J.M.,et al.,Can
cer Res.47:4658−4662(1987);Dehal,S.S
.,et al.,Cancer Res.57:3402−3406(199
7);Rainov,N.G.,et al.,Human Gene The
rapy 9:1261−1273(1998))。
A活性化を示す肝臓P450酵素をコードするCYP2B1の形質導入によって
CPAまたはIFAに対して高度に耐性にされる(Clarke,L.and
Waxman,D.J.,Cancer Res.49:2344−2350(
1989);Weber,G.F.and Waxman,D.J.,Bioc
hem.Pharmacol.45:1685−1694(1993))。この
亢進された化学感受性は、インビトロおよび皮下齧歯類固形腫瘍モデルおよびヌ
ードマウスにおいて増殖させたヒト胸部腫瘍を用いたインビボの研究の両方で実
証されている。そして、これは、これらの動物における薬物活性化のための実質
肝関連能力の存在にもかかわらず、驚くほど有効である。(Chen,L.,e
t al.,Cancer Res.55:581−589(1995);Ch
en,L.,et al.,Cancer Res.56:1331−1340
(1996))。このP450に基づくのアプローチはまた、脳腫瘍の処置にお
ける遺伝子適用のために顕著な有用性を示す(Wei,M.X.,et al.
,Human Gene Ther.5:969−978(1994);Man
ome,Y.,et al.,Gene Therapy 3:513−52
0(1996);Chase,M.,et al.,Nature Biote
chnol.16:444−448(1998))。
の抗癌導入遺伝子もまた研究されており、これらには、サイトカイン遺伝子(腫
瘍に対する免疫防御を増強するため)(Blankenstein,T.,et
al.,J.Exp.Met.173:1047−1052(1991);C
olombo,M.P.,etal.,Cancer Metastasis
Rev.16:421−432(1997);Colombo,M.P.,et
al.,Immunol.Today 15:48−51(1994))、お
よび他の殺腫瘍性遺伝子(例えば、ジフテリア毒素(Coll−Fresno,
P.M.,et al.,Oncogene 14:243−247(1997
))、シュードモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子(tum
or vaccination gene)、癌抑制遺伝子、放射線感受性遺伝
子、アンチセンスRNA、およびリボザイム(Zaia,J.A.,et al
.,Ann.N.Y.Acad.Sci.660:95−106(1992))
。
モデルにおいて顕著な治療効果の証拠を提供してきているが、各々の方法は、固
有の限界という問題がある。ウイルスに基づくアプローチは腫瘍塊において広が
ったウイルスの広汎な複製に関する可能性を理論的には提供するものの、その効
果は、以下により制限される:ウイルス感染の効率;いくつかのウイルスベクタ
ーについてのヘルペスウイルスまたはプロデューサー細胞株の要件;他のウイル
スベクターについてウイルス変異体増殖を補完する細胞因子に関する腫瘍細胞異
種性(Sidranski et al.,355:846−847(1992
);Bigner et al,J.Neuropathol.Exp.Neu
rol.40:201−229(1981));ならびに抗ウイルス免疫応答。
入の効率は、ベクターの欠損特性により制限される。事実、陽性導入される細胞
の大部分は、ベクター接種の部位からいくつかの細胞層内で生じる(Nilav
er et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 21:9
8299833(1995);Muldoon et al.,Am.J.Pa
thol.147:1840−1851(1995);Ram Z.et al
.,J.Neurosurg.82,343A(abst.)(1995))。
さらに、プロデューサー細胞株が不必要であるかまたは自殺遺伝子/薬物組合せ
により殺傷されないウイルスベクター系についてでさえ、ウイルス複製は、使用
される薬物により阻害され得る。さらに、自殺遺伝子/薬物組合せがTK/GC
Vである場合、薬物が腫瘍細胞を殺傷する能力は、GCVはDNA複製のプロセ
スにおける細胞のみを標的とすることから、その細胞の細胞周期の段階によって
制限を受ける。従って、これらの複製欠損ベクターによって治療遺伝子送達が接
種部位から離れた腫瘍細胞に影響を与えることは、治療遺伝子がサイトカインま
たはCPA代謝物のような自由に拡散する抗癌剤を生成する場合においてでさえ
、ありそうもない。
胞集団について選択的毒力を達成する手段を提供する安全かつ効率のよいウイル
ス変異体についての必要性が継続して存在する。
ることによりウイルス腫瘍崩壊性について腫瘍性細胞を選択的に標的化し得るヘ
ルペスウイルス変異体を提供することによって、克服する。本発明のヘルペスウ
イルス変異体はまた、他の細胞集団もまた標的化し得る。
細胞周期調節されたB−mybプロモーターの転写制御下でRR/γ34.5二
重変異体株(MGH1)に再導入した。これらは、この新規な腫瘍崩壊性ウイル
ス(「Myb34.5」と呼ばれる)が野生型γ34.5遺伝子を有した単一の
RR変異体ウイルスと同じぐらい腫瘍崩壊性を保持したが、なおもγ34.5−
欠失変異体のものと類似する有利な毒性プロファイルを保持したことを実証した
。従って、これらの知見は、感染した細胞のタンパク質合成の遮断を妨害するこ
とを担うウイルス遺伝子の転写再標的化が選択的腫瘍崩壊性を達成するための道
筋を提供することを示す。従って、γ34.5の発現の転写再標的化は、腫瘍ま
たは他の標的化細胞集団について選択的毒力を達成する手段を提供する。
コードする遺伝子の両方のコピーにおいて欠失または不活化変異を含み、ここで
、γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーは細胞特異的プロモーターおよび/ま
たは腫瘍特異的プロモーターの転写制御下で再導入される。
内因性欠失または不活化変異が存在し得る。これらには、リボヌクレオチドレダ
クターゼ(RR)、またはより特定するとRRのラージサブユニットをコードす
る遺伝子における欠失が包含される。あるいは、RRをコードする遺伝子は、ス
モールサブユニット(UL40)をコードする。任意の他のヘルペスウイルス遺
伝子もまた欠失され得る(例えば、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルRNA
DNAグリコシラーゼ(UNG)またはdUTPaseなど)。これらのウイル
ス遺伝子が好ましい。なぜなら、これらの遺伝子の哺乳動物ホモログはしばしば
、腫瘍性細胞のようなE2Fの上昇したレベルを伴う細胞においてアップレギュ
レーションされており、従って欠失したウイルス酵素を補完し得、それによりこ
れらの細胞における選択的複製を促進するからである。
して細胞毒性であり得る導入遺伝子を送達し得る。例えば、この導入遺伝子は、
化学療法剤(例えば、HSV−TK、CDのような自殺遺伝子またはシトクロム
P450)を活性化し得るかまたは増強し得る。あるいは、その導入遺伝子は、
腫瘍免疫原性を増強するサイトカイン遺伝子(例えば、腫瘍壊死因子α(TNF
−α)、インターロイキン類(IL−2、IL−4)、インターフェロンγ、顆
粒球マクロファージ刺激因子(GM−CSF)、癌抑制遺伝子または当業者に公
知の他の任意の殺腫瘍性遺伝子(例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素
、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチセン
スRNAまたはリボザイム))であり得る。従って、この実施形態において、ヘ
ルペス変異体は、さらに、化学療法剤をその細胞傷害性形態に変換し得る遺伝子
産物をコードする導入遺伝子、サイトカイン遺伝子または他の任意の腫瘍殺傷遺
伝子を含む。この導入遺伝子は、もとのγ34.5欠失またはUL40の遺伝子
座のどこかに挿入され得る。
で、この導入遺伝子は、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をコードする。その
ような自殺遺伝子の特に好ましい例は、哺乳動物シトクロムP450である。よ
り特定すると、このシトクロムP450は、P450 2B1であり得、、また
はあるいは、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P45
0 2C8、P450 2C9、P450 2C11またはP450 3A4で
あり得る。P450 2B1は、特に好ましい。そのような自殺遺伝子が上記ウ
イルス変異体に存在する場合、活性化される化学療法剤は、オキサゾホリンクラ
スのメンバーである。特に、シクロホスファミド、イフォスファミド、N−メチ
ルシクロホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソウレア、ポリマー性シク
ロホスファミド、ポリマー性イフォスファミド、ポリマー性N−メチルシクロホ
スファミド、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソウレアである。
そのヘルペスウイルス変異体は、単純ヘルペスウイルスであり、そしてより特定
すると、その変異体は、単純ヘルペスウイルス(HSV)1型または2型である
。HSV−1は特に好ましい。
HSV−1から誘導され、そして以下を含む:(a)γ34.5をコードする遺
伝子の両方のコピーにおける欠失または不活化変異;および(b)γ34.5遺
伝子の発現を細胞型特異的および/または腫瘍特異的プロモーターが制御するよ
うな、その細胞型特異的および/または腫瘍特異的プロモーターの転写制御下で
の、そのγ34.5の少なくとも1つのコピーの挿入。
もまた、本発明のヘルペスウイルス変異体において存在し得る。ヘルペスRR、
TK、UNGまたはdUTPaseにおける欠失は、例示のヘルペスウイルス遺
伝子である。
ーは、腫瘍型特異的遺伝子発現および/または細胞型特異的な発現を制御する、
十分に特定された制御エレメントのいずれか1つであり得る。概説について、以
下を参照のこと:Miller,N.and Whelan,J.,Hum.G
ene Ther.8 :803−815(1997);Walther,W.
and Stein,U.,J.Mol.Med.74:379−392(19
96);Schnierle,B.S.and Groner,B.,Gene
Therapy 3:1069−1073(1996);Lan,K−H.,
etal.,CancerRes.57:4279−4284(1997);C
lary,B.M.,et al.,Cancer Gene Therapy
7:565−574(1998);Dachs,G.U.,et al.,O
ncol.Res.9:313−325(1997))。
DF3(MUC1)(これは、乳癌のほとんどにおいて過剰発現される)(Ab
e,M.and Kufe,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 90:282−286(1993);Manome,Y.,et al.
,Gene Ther.2:685,A051(1995);Chen,L.,
et al.,J.Clin.Invest.96:2775−2782(19
95));AFP(これは、肝細胞腫において過剰発現される)(Arbuth
not,P.,et al.,Hepatology 22:1788−179
6(1995);Ido,A.,et al.,Cancer Res.55:
3105−3109(1995));CEA(これは、結腸および肺癌において
過剰発現される)(Thompson,J.A.,et al.,J.Clin
.Lab.Anal.5:344−366(1991);Osaki,T.,e
t al.,Cancer Res.54:5258−5261(1994))
;PSA(これは、前立腺癌において過剰発現される)(Lundwall,A
.,Biochem.Biophys.Res.Commun.161:115
1−1156(1989));チロシナーゼ(これは、メラノーマにおいて過剰
発現される)(Vile,R.G.and Hart,I.R.,Cancer
Res.53:962−967(1993);Vile,R.G.and H
art,I.R.,Ann.Oncol 5(Suppl.4):S59−S6
5(1994);Hart,I.R.,et al.,Curr.Opin.O
ncol.6 :221−225(1994));およびc−erbB2(これ
は、乳癌、膵臓癌、卵巣癌または胃癌において過剰発現される)(Hollyw
ood,D,and Hurst,H.,EMBO J 12:2369−23
75(1993))。
記ヘルペスウイルス変異体の特に好ましい実施形態において、ウイルス変異体は
、Myb34.5である。
いて発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモー
ター(Kappelら、Blood 93:4282−4292(1999))
;膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター(Rayら、J
.Surg.Res.84:199−203(1999));視床下部の細胞に
おいて発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子(Albar
racinら、Endocrinology 140:2415−2421(1
999));破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタ
ロプロテイナーゼ9プロモーター(Munantら、J.Biol.Chem.
274:5588−5596(1999));骨細胞において発現される副甲状
腺ホルモンレセプター(Amizumaら、J.Clin.Invest.10
3:373−381(1999));ノルアドレナリン作動性ニューロンにおい
て発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター(Yangら、J.N
eurochem.71:1813−1826(1998))。
プロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法を提供し
、この方法は、この腫瘍性細胞にこのヘルペスウイルス変異体を感染させる工程
であって、このウイルス変異体は、以下の工程:(a)γ34.5をコードする
遺伝子における欠失または不活化変異;および(b)この腫瘍特異的プロモータ
ーの転写制御下でのこのγ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入を含み、
その結果、このプロモーターが、このγ34.5遺伝子の発現を駆動する、工程
;ならびに、この腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程、を包含する。
MUC1)(これは、大部分の乳癌において過剰発現される)(Abe,M.お
よびKufe,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:
282−286(1993);Manome,Y.ら、Gene Ther.2
:685,A051(1995);Chen,L.ら、J.Clin.Inve
st.96:2775−2782(1995));AFP(これは、ヘパトーム
において過剰発現される)(Arbuthnot,P.ら、Hepatolog
y 22:1788−1796(1995);Ido,A.ら、Cancer
Res.55:3105−3109(1995));CEA(これは、結腸癌お
よび肺癌において過剰発現される)(Thompson,J.A.ら、J.Cl
in.Lab.Anal.5:344−366(1991);Osaki,T.
ら、Cancer Res.54:5258−5261(1994)9;PSA
(これは、前立腺癌において過剰発現される)(Lundwall,A.、Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.161:1151−11
56(1989));チロシナーゼ(これは、黒色腫において過剰発現される)
(Vile,R.G.およびHart,I.R.、Cancer Res.53
:962−967(1993);Vile,R.G.およびHart,I.R.
、Ann.Oncol 5(補遺4):S59−S65(1994);Hart
,I.R.ら、Curr.Opin.Oncol.6:221−225(199
4));およびc−erbB2(これは、乳癌、膵臓癌、卵巣癌または胃癌にお
いて過剰発現される)(Hollywood,D.およびHurst,H.EM
BO J 12:2369−2375(1993))。
好ましい実施形態において、ウイルス変異体は、Myb34.5である。
、本発明の方法において使用されるヘルペスウイルス変異体に存在し得る。ヘル
ペスのRR、TK、UNGまたはdUTPaseにおける欠失が、例示的なヘル
ペスウイルス遺伝子である。
、この導入遺伝子が、自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子または任意の殺腫瘍性遺
伝子である、腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための上記方法を提供する。この導
入遺伝子が、自殺遺伝子である場合、次いで、この方法は、この自殺遺伝子によ
って活性化され得る化学療法剤をこの腫瘍性細胞に接触させる工程、およびこの
腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程をさらに包含する。好ましい自殺遺伝子は、
シトクロムP450である。P450 2B1が、特に好ましい。あるいは、そ
のコードされるシトクロムP450は、P450 2B6、P450 2A6、
P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11
、またはP450 3A4である。さらに、この化学療法剤は、好ましくは、オ
キサゾスフォリン(oxazosphorine)クラスのメンバー、特に、シ
クロホスファミド、イホスファミド、N−メチルシクロホスファミド、メチルク
ロロプロピルニトロソ尿素、ポリマー性シクロホスファミド、ポリマー性イホス
ファミド、ポリマー性N−メチルシクロホスファミド、またはポリマー性メチル
クロロプロピルニトロソ尿素である。
の細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を選択的に除去するため
の方法を提供し、この方法は、以下の工程:この標的細胞にこのヘルペスウイル
ス変異体を感染させる工程であって、このウイルス変異体は、(a)γ34.5
をコードする遺伝子における欠失または不活化変異;および(b)この細胞特異
的プロモーターの転写制御下でのこのγ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの
挿入を含み、その結果、このプロモーターが、このγ34.5遺伝子の発現を駆
動する、工程;ならびに、この標的細胞を選択的に除去する工程、を包含する。
いて発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモー
ター(Kappelら、Blood 93:4282−4292(1999))
;膵臓のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター(Rayら、J
.Surg.Res.84:199−203(1999));視床下部の細胞に
おいて発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子(Albar
racinら、Endocrinology 140:2415−2421(1
999));破骨細胞およびケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタ
ロプロテイナーゼ9プロモーター(Munantら、J.Biol.Chem.
274:5588−5596(1999));骨細胞において発現される副甲状
腺ホルモンレセプター(Amizumaら、J.Clin.Invest.10
3:373−381(1999));ノルアドレナリン作動性ニューロンにおい
て発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター(Yangら、J.N
eurochem.71:1813−1826(1998))。
、本発明の方法において使用されるヘルペスウイルス変異体に存在し得る。ヘル
ペスのRR、TK、UNGまたはdUTPaseにおける欠失が、例示的なヘル
ペスウイルス遺伝子である。
の新脈管形成が存在する状態(例えば、脳性モヤモヤ病)において、γ34.5
遺伝子発現を駆動するためのflk1レセプタープロモーターの使用は、この疾
患を引き起こす血管の選択的除去を可能にする。別の例は、高度の骨の再造形お
よび骨の除去が存在する状態(例えば、骨粗しょう症)において、γ34.5の
発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテイナーゼ9または副甲状腺ホルモ
ンレセプターの使用は、骨のさらなる再造形から骨の破骨細胞を除去する。
果を研究するために、例えば、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼプロモーターを
使用してノルアドレナリン作動性ニューロンを除去し得、次いで、動物発生に対
する効果を研究し得る。
あり、この組成物はまた、1以上の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。
しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示し、
例示目的のみで提供されることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精
神および範囲内での種々の変更および改変が、この詳細な説明から当業者に明ら
かとなるからである。
自殺遺伝子治療の組み合わせによる、腫瘍性細胞の選択的殺傷に関する。本発明
は、ヘルペスウイルス変異体、このヘルペスウイルス変異体を使用して腫瘍性細
胞を選択的に殺傷する方法、およびこのウイルス変異体を含む薬学的組成物を提
供する。本発明はまた、本発明のヘルペスウイルス変異体を使用して、標的細胞
集団を選択的に除去するための方法を提供する。
ーにおける欠失または不活化変異;および(b)腫瘍特異的プロモーターまたは
細胞特異的プロモーターの転写制御下でのこのγ34.5遺伝子の少なくとも1
コピーの挿入を有するように遺伝子操作され、その結果、このプロモーターが、
このγ34.5遺伝子の発現を駆動する、ヘルペスウイルス変異体を提供する。
このヘルペスウイルス変異体はまた、他のヘルペスウイルス遺伝子(例えば、R
R,TK、UNG、およびdUTPaseのような)における1以上のさらなる
欠失または変異を含み得る。このヘルペスウイルス変異体はまた、化学療法剤を
活性化する産物をコードする導入遺伝子、サイトカイン遺伝子または任意の他の
殺腫瘍性遺伝子を送達し得る。
から誘導され得る。本発明のウイルス変異体を誘導するために使用され得るヘル
ペスウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイル
ス、エプスタイン−バーウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルスおよび仮性狂犬病ウ
イルスが挙げられる。
、上記のような欠失または不活化変異を含む亜科ヘルペスウイルス科α(her
pesviridae alpha)の任意のメンバーが意図される。本発明の
好ましい実施形態は、HSV−1またはHSV−2を使用して、ヘルペスウイル
ス変異体を作製し、HSV−1が、最も好ましい。
ルスである。自然感染は、溶解性の複製サイクルを伴うか、または潜伏(通常、
末梢神経節において)を確立するかのいずれかであり、DNAは、エピソーム状
態で不明確に維持される。HSV−1は、153キロベース長の二本鎖の直鎖状
DNAゲノムを含み、McGeochによって完全に配列決定されている(Mc
Geochら、J.Gen.Virol.69:1531(1988);McG
eochら、Nucleic Acids Res 14:1727(1986
)lMcGeoch、J.Mol.Biol.181:1(1985);Per
ryおよびMcGeochら、J.Gen.Virol.69:2831(19
88))。DNA複製およびビリオン構築は、感染された細胞の核において生じ
る。感染後期で、コンカテマーウイルスDNAが、ゲノム長分子に切断され、こ
の分子がビリオンにパッケージングされる。CNSにおいて、単純ヘルペスウイ
ルスは、経ニューロン的に伝播し、その後、核へ軸索内輸送され(逆行的または
順行的のいずれか)、ここで、複製が生じる。
イルス感染への宿主細胞応答を妨げること、すなわち、アポトーシス様応答にお
ける宿主タンパク質合成遮断の誘因であることを示した(Chou,J.ら、S
cience 250:1262−1266(1990);Chou,J.およ
びRoizman,B.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9:3266−3270(1992);Chou,J.ら、Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 92:10516−10520(1995))。
類似した機能は、病原性ウイルスの間に広まっている(Cosentino,G
.P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9445−
9449(1995);Gale,M.,Jr.ら、Mol.Cell Bio
l.18:5208−5218(1998);Katze,M.G.ら、Tre
nds Microbiol.3:75−78(1995);Sharp,T.
V.ら、Nuc.Acids Res.21:4483−4490(1993)
)。
34.5は、ウイルスがマウスの中枢神経系(CNS)で広がることを可能にし
、そしてCNS複製において以前に関連付けられたHSVゲノムの領域をマップ
する(Markovitz,N.S.ら、J.Virol.71:5560−5
569(1997);Centifanto−Fitzgerald,Y.M.
ら、J.Esp.Med.155:475−489(1982))。これは、γ
34.5にコードされるタンパク質が、二本鎖RNA依存性キナーゼ(PKR)
を阻害する事実に起因し得る。二本鎖RNA分子への曝露(ウイルス感染によっ
て通常見出されるように)の際、PKRは、伸長開始因子eIF−2のαサブユ
ニットをリン酸化し、タンパク質合成の阻害を引き起こす(Chou,J.ら、
Science 250:1262−1266(1990);Chou,J.お
よびRoizman,B.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89:3266−3270(1992);Chou,J.ら、J.Virol.
68:8304−8311(1994))。γ34.5を発現し得ない変異を有
する神経細胞起源の細胞の感染は、ウイルス産生の結果として起こる限定を伴っ
て、細胞タンパク質合成の遮断を引き起こす。
、このようにして子孫のウイルスの産生を可能にする。γ34.5の非存在下に
おいて、細胞は死滅し、そして感染性HSVは、子孫のウイルスを産生し得ない
。従って、器官を通じたHSVの感染/増殖は、排除される。
γ34.5アプローチは、このプロモーターを使用し得る細胞中のウイルス産生
を可能にするが、このプロモーターを刺激し得ない細胞は、感染を伝播しない。
る欠失または不活性化変異を含み、ここで、γ34.5遺伝子の少なくとも1つ
のコピーは、細胞特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターの制御下で
再び導入される。
遺伝子)からの核酸の排除を意味することを意図する。
または変更の広い意味を意図し、ここで、この遺伝子の発現は、有意に減少され
るか、またはここで、遺伝子産物は、非機能的にされるか、または機能に対する
その能力は、有意に減少される。
ならびにこの遺伝子の調節領域(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)の
両方を含む。
子産物の発現を破壊する任意の方法、または(b)発現された遺伝子を非機能的
にする任意の方法。遺伝子の発現を破壊する多数の方法は公知であり、これらに
は、挿入、欠失および/または塩基の変更による、この遺伝子のコード領域また
はそのプロモーター配列の変更が挙げられる(Roizman,B.およびJe
nkins,F.J.,Science 229:1208−1214(198
5)を参照のこと)。
たは腫瘍特異的プロモーターは、γ34.5の発現を駆動するために使用される
。このプロモーターは、腫瘍型特異的遺伝子発現および/または細胞型特異的遺
伝子発現を制御する十分に特徴付けられた調節エレメントのうちの任意の1つで
あり得る。総説に関して、Miller,N.およびWhelan,J.、Hu
m.Gene Ther.8:803−815(1997);Walther,
W.およびStein,U.、J.Mol.Med.74:379−392(1
996);Schnierle,B.S.およびGroner,B.、Gene
Therapy 3:1069−1073(1996);Lan,K−H.ら
、Cancer Res.57:4279−4284(1997);Clary
,B.M.ら、Cancer Gene Therapy 7:565−574
(1998);Dachs,G.U.ら、Oncol.Res.9:313−3
25(1997)を参照のこと。
の上流を意味することを意図し、これは、RNAポリメラーゼを結合し、そして
酵素を正確な転写開始部位に対して指向する。
ーターが意図される。当業者は、「腫瘍特異的」プロモーターがまた、「細胞特
異的」プロモーターを考慮に入れ得ること(すなわち、腫瘍細胞に対して特異的
である)を理解する。しかし、明確にするために、本明細書中に使用される場合
、「細胞特異的プロモーター」は、他に示されない限り、腫瘍特異的プロモータ
ーを除外することを意図する。例示的な細胞特異的プロモーターとしては、以下
が挙げられる:内皮細胞で発現される血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター
(flkl)プロモーター(Kappelら、Blood 93:4282−4
292(1999));膵臓のベータ細胞で発現されるインスリンプロモーター
(Rayら、J.Surg.Res.84:199−203(1999));視
床下部の細胞で発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子(A
lbarracinら、Endocrinology 140:2415−24
21(1999));破骨細胞およびケラチノサイトで発現されるマトリクスメ
タロプロテアーゼ9プロモーター(Munantら、J.Biol.Chem.
274:5588−5596(1999));骨細胞で発現される副甲状腺ホル
モンレセプター(Amizumaら、J.Clin.Invest.103:3
73−381(1999));およびノルアドレナリン作動性ニューロンに発現
されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター(Yangら、J.Neur
ochem.71:1813−1826(1998))。
。他の細胞特異的プロモーターが、当業者に公知である。
らびに発生の間の器官中の選択集団の排除を研究するための動物モデルが挙げら
れる。この実施例の例示的な適用としては、以下が挙げられる: 1)有害細胞集団を排除するための処置選択:1つの例において、血管の豊富
な新脈管形成が存在する条件(例えば、脳のモヤモヤ病)において、γ34.5
遺伝子発現を駆動するためのflk1レセプタープロモーターの使用は、これら
の疾患を引き起こす血管の選択的排除を可能にする。
症)が存在する条件下において、γ34.5の発現を駆動するためのマトリクス
メタロプロテアーゼ9または甲状腺ホルモンレセプターの使用は、骨のさならる
リモデリングから骨の破骨細胞を排除する。
ロセスにおける細胞集団の排除効果を研究するために、例えば、ドパミン−β−
ヒドロキシラーゼプロモーターを使用して、ノルアドレナリン作動性ニューロン
を排除し、次いで、動物の発達に対する効果を研究し得る。
的に誘導されるかまたはより高いレベルで発現されるプロモーターを意図する。
本発明のヘルペスウイルス変異体に対する腫瘍標的化の特異性は、腫瘍特異的プ
ロモーターを使用して、原発性腫瘍部位またはその転移のいずれかにおいて、腫
瘍細胞中で形質転換された遺伝子の発現を選択的に活性化することによって達成
される(Miller,N.およびWhelan,J.、Hum.Gene T
her.8:803−815(1997);Walther,W.およびSte
in,U.,J.Mol.Med.74:379−392(1996);Sch
nierle,B.S.およびGroner,B.,Gene Therapy
3:1069−1073(1996);Lan,K−H.ら、Cancer
Res.57:4279−4284(1997);Dachs,G.U.ら、O
ncol.Res.9:313−325(1997))。
挙げられる:チロシナーゼ(黒色腫に対する標的化を可能にする)(Vile,
R.G.およびHart,I.R.、Cancer Res.53:962−9
67(1993);Vile,R.G.およびHart,I.R.、Ann.O
ncol 5(補遺4):S59−S65(1994);Hart,I.R.ら
、Curr.Opin.Oncol.6:221−225(1994));c−
erbB−2癌遺伝子(乳癌、膵臓癌、胃癌および卵巣癌を標的化する)(Ho
llywood,D.およびHurst,H.、EMBO J 12:2369
−2375(1993)); 癌胎児抗原(CEA)(結腸癌、膵臓癌および胃
癌を含む、肺および胃腸の悪性腫瘍を標的化する)(Thompson,J.A
.ら、J.Clin.Lab.Anal.5:344−366(1991);O
saki,T.ら、Cancer Res.54:5258−5261(199
4));DF3/MUC1(乳癌を標的化する)(Abe,M.およびKufe
,D.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:282−28
6(1993);Manome,Y.ら、Gene Ther.2:685,A
051(1995);Chen,L.ら、J.Clin.Invest.96:
2775−2782(1995));前立腺特異的抗原(PSA)(前立腺癌を
標的化する)(Lundwall,A.、Biochem.Biophys.R
es.Commun.161:1151−1156(1989));およびα−
フェトプロテイン(AFP)(肝細胞癌腫を標的化する)(Arbuthnot
,P.ら、Hepatology 22:1788−1796(1995);I
do,A.ら、Cancer Res.55:3105−3109(1995)
)。合成遺伝子調節システム(これは、転写制御および別の形態の調節された発
現を可能にする)の使用がまた、用いられ得る(Miller,N.およびWh
elan,J.、Hum.Gene Ther.8:803−815(1997
);Vile,R.G.、Semin.Cancer Biol.5:429−
436(1994);Hwang,J.J.ら、J.Virol.70:813
8−8141(1996);Massie,B.ら、J.Virol.72:2
289−2296(1998))。
、アップレギュレートされた遺伝子発現を伴う細胞は、そのような遺伝子のプロ
モーターエレメントを用いて標的化され得る。B−myb癌遺伝子、C−myb
癌遺伝子、c−myc癌遺伝子、c−kit癌遺伝子、およびc−erbB2癌
遺伝子は、これらの型のいくつかの代表的な例である。B−mybプロモーター
(Lyon,J.ら、Crit.Rev.Oncogenesis 5:373
−388(1994)を参照のこと)は、コンセンサスE2F結合部位を含み、
細胞周期が厳格に調節され、そして事実G0で抑制される(Lam,E.W.お
よびWatson,R.J.、EMBO J.12:2705−2713(19
93);Lam,E.W.ら、Gene 160:277−281(1995)
;Bennett,J.D.ら、Oncogene 13:1073−1082
(1996))。従って、B−mybプロモーターは、特に好ましい腫瘍特異的
プロモーターである。
見出される。そのようなプロモーターの例は、Clary,B.M.ら、Can
cer Gene Therapy 7:565−574(1998)の表1;
Spear,M.A.、Anticancer Research 18:32
23−3232(1998)の表I;Walther,W.およびStein,
U.、J.Mol.Med.74:379−392(1996)の表2;ならび
にDachs,G.U.ら、Oncol.Res.9:313−325(199
7)に見出され得る。
enBank配列データベースから入手可能である。
グは、上昇したレベルのE2Fによってアップレギュレートされる)、ただし、
最もこの好ましくは複製に必要とされる遺伝子中にさらなる変異を保有し得る。
って調節される(DeGregoriら、Mol.Cell.Biol.15:
4215−4224(1995);Lukasら、Mol.Cell.Biol
.16:1047−1057(1996);Dynlachtら、Genes
Dev.8:1772−1786(1994))。RR-ウイルス変異体は、新
生物性細胞において補体哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼ(mRR)の存
在に起因して、これらの細胞において選択的に複製すると仮説が立てられている
(GoldsteinおよびWeller、J.Virol.62:196−2
05(1988))。
グは、ウイルスの複製に必要とされる)の発現の増加を引き起こす。リボヌクレ
オチドレダクターゼ(mRR)に加えて、これらの遺伝子としては、チミジンキ
ナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、およびウラシルト
リホスファターゼ酵素(dUTPase)が挙げられる。これらの遺伝子の1つ
以上に変異を含むウイルスは、上昇したレベルの遊離E2Fを有する細胞におい
て、選択的に複製する。従って、本発明は、γ34.5における変異に加えて、
これらの遺伝子の1つ以上に変異を有するヘルペスウイルス変異体を含む。本発
明の好ましい実施形態において、この変異は、リボヌクレオチドレダクターゼ遺
伝子の中である。
l6、サイクリンD/cdk4、およびpRBを含む細胞周期調節転写カスケー
ドの初期メディエーターのようである(DeGregoriら、Mol.Cel
l.Biol.15:4215−4224(1995);Lukasら、Mol
.Cell.Biol.16:1047−1057(1996;Dynlach
tら、Genes Dev.8:1772−1786(1994))。従って、
このカスケードに関与する遺伝子における欠失は、増加したレベルのE2Fを導
き得、これによって、哺乳動物のRR、TK、UNGおよびdUTPaseのレ
ベルを増加する。例えば、p16、p21および/またはp27の発現に欠失を
有する細胞は、サイクリンD、サイクリンDキナーゼ4(Cdk4)および/ま
たはサイクリンDキナーゼ6(Cdk6)のレベルを増化し得、これは、次には
増加したpRBのリン酸化を導き得、それによってE2Fを遊離する。さらに、
pRB、p107および/またはp130、DP1、DP2、および/またはD
P3の発現に欠失を有する細胞はまた、増加したE2Fの遊離を導き得る。
し(Uekiら、Cancer Res.56:150−153(1996))
、従って、E2Fを遊離し、そして哺乳動物のRR、TK、UNG、およびdU
TPaseの転写を可能にする。さらに、他の癌抑制遺伝子または癌遺伝子にお
ける変化はまた、増加したレベルの遊離E2Fを導き得、それによって、哺乳動
物のRR、TK、UNG、およびdUTPaseのレベルを増加する。従って、
RR-ウイルス変異体、TK-ウイルス変異体、UNG-ウイルス変異体、および
dUTPase-ウイルス変異体は、腫瘍細胞の大きな割合を効果的に標的化し
得る(特に、「遊離」E2Fの増加を導くpl6/サイクリンD/pRB経路に
おける欠失を保有する場合)。
膚など)由来の腫瘍細胞は,上昇したレベルのRR、TK、UNG、およびdU
TPaseを導く上記の経路において変化を有し、従って、本発明のウイルス変
異体に対する標的である。例えば、神経膠腫瘍細胞株(ラット9L細胞、ヒトU
87細胞、およびヒトT98細胞)は、p16の不活性化変異(Van Mei
rら、Cancer Res.54:649−652(1994))、ならびに
上昇したレベルのmRRを保有する。従って、これらの細胞は、野生型KOS株
に近いレベルまでHSV−1由来のウイルス変異体rRp450の複製を補完し
得、一方、検出可能でないレベルのmRRである(かつ正常なp16経路を有す
る)ニューロンは、補完しなかった。
ターゼ)の任意のサブユニットまたは一部をコードする核酸を意図し、機能的で
あろうとまたは非機能的であろうと、この核酸が細胞で発現される場合、この部
分またはサブユニットが産生される。リボヌクレオチドレセプターダクターゼ(
RR)は、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒する、
DNA前駆体のデノボ合成における重要な酵素である。HSV−1は、2つの非
同一のサブユニットから構成される自分自身のRR(UL39およびUL40遺
伝子)をコードする(Duita,J.Gen.Virol.64:513(1
983))。ラージサブユニット(140k分子量)(ICP6と命名される)
は、スモールサブユニット(38k分子量)と密接に関連している。単純ヘルペ
スウイルスRRは、非分裂細胞における効率的なウイルス増殖に必要とされるこ
とが見出されているが、多数の分裂細胞では必要とされていない(Goldst
einおよびWeller,J.Virol.62:196(1988);Go
ldsteinおよびWeller,Virol.166:41(1988);
Jacobsonら、Virol.173:276(1989))。RRのスモ
ールサブユニットにおける変異はまた、RR活性および神経病原性の喪失を生じ
るが(Cameronら、J.Gne.Virol.69:2607(1988
))、特に好ましいのは、ラージサブユニットにおける変異である。
遺伝子の5’上流配列にマッピングされる(GoldsteinおよびWell
er,J.Virol.62:196(1988);SzeおよびHerman
,Virus Res.26:141(1992))。RRのスモールサブユニ
ットの転写開始部位(すなわち、UL40)は、ICP6のコード領域内に分類
される(McLauchlanおよびClements,J.Gen.Viro
l.64:997(1983);McGeochら、J.Gen.Virol.
69:1531(1988))。
SV−2由来のウイルス変異体は、本発明によって包含される。HSV−2は、
両方のRRサブユニットを含み;さらに、HSV−2 ICP10は、HSV−
1 ICP6に類似性である。Nilasら、Rroteins 1:376(
1986);McLaughlanおよびClements,EMBO J.2
:1953(1983);SwainおよびHalloway,J.Virol
.57:802(1986)。
異体との間の1つの差異は、アシクロビルおよびガンシクロビルに対する過感受
性である。当該分野で公知のTK-HSV−1変異体は、これらの抗ウイルス剤
に対して抵抗性であるため、これらの変異体は、全身感染または脳炎の事象の際
、除去するのが困難であり得る。対照的に、ウイルス脳炎の事象において、TK + ウイルス変異体(例えば、RR-−HSV変異体)は、抗ウイルス治療に対して
応答性である。
.5℃でウイルスDNAを合成する能力が損なわれる(Goldsteinおよ
びWeller,Virology 166:41(1988))。従って、こ
れらの変異体は、神経毒性が弱毒化され、そして、感染した宿主における熱の事
象において、より増殖しそうにない。このような特徴は、弱毒化された神経毒性
でなければららない治療ベクターに対して重要であり、そして、ウイルス脳炎の
事象の際、抗ウイルス治療を受け入れられる。
実証する。ウイルス変異体で処置された患者において、多数の宿主因子(熱、抗
ウイルス免疫応答)が、このウイルス変異体の増殖を阻害することが可能である
。これらの場合において、化学療法剤および導入遺伝子による活性化を使用した
処置(ウイルス変異体によって感染された細胞のための)が、補充的な抗癌処置
を提供することが予測される。
るか、またはその遺伝子産物が非機能的になるか、または機能に対するその能力
が有意に減少する、遺伝子に対する任意の変更をいう。用語「遺伝子」は、遺伝
子産物を含むコード領域およびその遺伝子についての調節領域(例えば、プロモ
ーターまたはエンハンサー)の両方を含む。このような変更は、遺伝子の非機能
的産物を付与するかまたは遺伝子の発現を減少し、その結果、ウイルス変異体は
、本発明の性質を有する。さらに、本発明は、目的の1つ以上の遺伝子における
1つ以上の変異を有する変異体を含む。従って、「a」は、1つ以上を意図する
。
る任意の方法;または(b)発現タンパク質を非機能的にする任意の方法を包含
する。遺伝子の発現を破壊することが公知の多数の方法は、挿入、欠失、および
/または塩基変化によって、遺伝子またはそのプロモーター配列のコード領域の
変更を含むことが公知である。(Roizman,B.およびJenkins,
F.J.,Science 229:1208−1214(1985)を参照の
こと)。欠失は、好ましい変異である。
該分野で公知である。一般的に、これらは、Ausubelら、16章、Cur
rent Protocols in Molecular Biology(
John WileyおよびSons,Inc.);Paolettiら、米国
特許第4,603,112号(1986年7月)を含む。ウイルス学的考慮はま
た、Coen、Virology,1990(第2版)Raven Press
123−150頁において、総説される。
5,096号(1996年12月);Roizmanら、米国特許第5,288
,641号(1994年2月);Roizman,B.およびJenkins,
F.J.Science 229:1208−1214(1985);John
sonら、J.Virol.66:2952(1992);Gage,P.J.
ら編、J.Virol.66:5509−5515(1992);Goldst
einおよびWeller,J.Virol.62:196−205(1988
),Coen,D.,第7章、Virology,1990(第2版)Rave
n Press;BreakefieldおよびDeLuca,The New
Biologist 3:203(1991);LeiおよびOlivo,B
ioEssays 15:547(1993);Gloriosoら、Semi
nars in Virology 3:265(1992);Chou、J.
およびRoizman,B.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
,89:3266−3270(1992)Shihら、Vaccines 85
,1985,Cold Spring Harbor Press,177−1
80頁;Kramm,C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057
−2068(1997);Glorioso,J.C.ら、Annu.Rev.
Microbiol.49:675−710(1995);Mocarskiら
、Cell 22:243(1980)において記載される。
NAのサザンブロットハイブリダイゼーション、ウイルスDNAの変異した領域
の配列決定、新しい(または失われた)制限エンドヌクレアーゼ部位の検出、リ
ボヌクレオチドレダクターゼ活性の酵素学的活性などの標準的な方法によって、
決定され得る(Huszar,D.およびBacchetti,S.,J.Vi
rol.37:580−598(1981))。変異したウイルス遺伝子(例え
ば、RR)の哺乳動物の相同体を欠く細胞については、ウイルスゲノムの遺伝子
変更は、(1)変異したウイルス相同体(例えば、RR)の抗体を使用する感染
した細胞タンパク質のウエスタンブロットまたはELISA分析によってか、ま
たは、(2)変異したウイルス相同体(例えば、RR)の転写についての感染し
た細胞のノーザンブロット分析によって、決定され得る(Jacobson,J
.G.ら、Virology 173:276−283(1989))。1つ以
上の遺伝子において変異したウイルス変異体は、変異誘発後に単離され得るか、
または、ウイルスゲノムと遺伝的に操作した配列との間の組換えを介して構築さ
れ得る。
子の発現が、非腫瘍性細胞において見出されるように、この産物の発現の基本レ
ベルよりも、より高いことを意図する。
が、非腫瘍性細胞に代表的に見出される量よりもより大きいことを意味する。
非腫瘍性細胞ではなく、腫瘍性細胞を主に標的にすることを意味する。
伝子変異によって)細胞を意味し、それによって、制御されていない増殖の可能
性を提供する。従って、「腫瘍性細胞」は、分裂細胞および非分裂細胞の両方を
含む。本発明の目的のために、腫瘍性細胞は、腫瘍、新生物、癌、肉腫、白血病
、リンパ腫などの細胞を含む。特に興味深いのは、中枢神経系腫瘍、特に、脳腫
瘍である。これらとしては、膠芽腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神
経線維腫、脳室上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫などが挙げられる。本発明
は、腫瘍学のために、末梢および脳における良性および悪性腫瘍性細胞の両方を
標的するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語末梢は、脳の
外側の体の他の全ての部分を意味することが意図される。従って、末梢腫瘍は、
脳の外側の体の部分における腫瘍を意味することが意図される。
ように、例えば、RR、TK、UNG、またはdUTPase))の発現を駆動
する腫瘍特異的または細胞特異的プロモーターを有することに加えて、本発明の
ウイルス変異体はまた、異種導入遺伝子を運搬する。
活性化可能である遺伝子産物をコードする遺伝子(例えば、HSV−TK、CD
、またはシトクロムP450)である。好ましい実施形態において、この自殺遺
伝子は、シトクロムP450遺伝子である。
産物が以前にそれに対して作用したよりも、より細胞傷害性を付与する化学療法
剤に対して作用する遺伝子産物を意味する。化学療法剤をその最も細胞傷害性形
態に変換するために、この遺伝子産物に加えて、他のタンパク質または因子が必
要であり得る。
遺伝子」は、発現の際に、この遺伝子産物を提供する核酸を意味する。
うに、本明細書中で使用される。
。
ッグから細胞傷害性形態へ活性され得る薬剤をいう。好ましくは、本発明におけ
る使用のための化学療法剤は、ウイルス変異体の複製を有意に阻害せず、これは
、ウイルス複製が、感染した細胞の死を導き、そして、ウイルスの他の細胞への
広がりを増幅させるのに十分なレベルで生じることを意味する。
50 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P4
50 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4などの哺乳動物シ
トクロムP450遺伝子を意味する。これらの遺伝子のそれぞれは、抗癌薬物シ
クロホスファミドおよびイホスファミドの活性化に関連しており(Clarke
ら、Cancer Res.49:2344−2350(1989);Chan
gら、CancerRes.53:5629−5637(1993);Webe
rおよびWaxman,Biochmical Pharmacology 4
5:1685−1694(1993))そして、これらの遺伝子のcDNA配列
はまた、公開されている(Nelsonら、DNA and Cell Bio
logy 12:1−51(1993)および本明細書中に記載された参考文献
;Yamanoら、Biochem.29:1322−1329(1990);
Yamanoら、Biochem.28:7340−7348(1989))。
さらに、シトクロムP450はまた、N−メチルシクロホスファミド(N−メチ
ルCPA)、メチルシクロプロピルニトロソウレア(MCPNU)、およびCP
A、イホスファミド、N−メチルCPA、およびMCPNUのポリマー形態を活
性化し得る。化学療法剤のポリマー形態は、Brem,Biomaterial
s,11:699−701(1990);BuahinおよびBrem,J.N
eurooncol 26:103−110(1995);Tamargoら、
Cancer Res.53:329−333(1993);ならびにLang
er,Ann.Biomed.Eng.23:101−111(1995)にお
いて考察される。
れる他の多数の抗癌薬物を使用して(LeBlancおよびWaxman、Dr
ug Metab.Rev.20:395−439(1989))、および、シ
トクロムP450 2B1、P450 2B6、P450 2A6、P450
2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP
450 3A4に相同な他の種(例えば、マウス、ウサギ、ハムスター、イヌな
ど)由来の薬物代謝シトクロムP450遺伝子(それらのcDNA配列は公知で
ある(Nelsonら、DNA and Cell Biology 12:1
−51(1993)))を使用して、本発明の方法を利用し得る。特に好ましい
実施形態では、チトクロームP450 2BIをコードする遺伝子が使用される
。
腫瘍崩壊および自殺遺伝子の送達によって腫瘍細胞を殺傷することを可能にする
ように、自殺遺伝子によって活性化される化学療法剤は、ウイルス変異体の複製
を有意に阻害するべきではない。化学療法剤またはその活性代謝産物が、代わり
にDNA架橋によってかまたはDNA修復を阻害することによって作用する、化
学療法剤/導入遺伝子の組み合わせの使用は、ウイルス変異体の複製を有意に阻
害しない。従って、このような化学療法剤/導入遺伝子の組み合わせが、本発明
のウイルス変異体および方法によって包含される。
ァミド、N−メチルシクロホスファミド、MCPNU、またはCPA、イホスフ
ァミド、N−メチルシクロホスファミドおよびMCPNUのポリマー形態と組み
合わせたシトクロムP450である。より好ましい化学療法剤/導入遺伝子の組
み合わせは、CPA/シトクロムP450 2B1である。
を含む:CB1954/E.coliニトロレダクターゼ(Friedlosら
、Gene Ther.5:105−112(1998);Greenら、Ca
ncer Gene Ther.4:229−238(1997));トポイソ
メラーゼIまたはIIインヒビター/エステラーゼ様活性を有する酵素(例えば
、CPT−11/カルボキシルエステラーゼ(Jansenら、Int.J.C
ancer 70:335−340(1997);Danksら、Cancer
Res.58:20−22(1998));4−イポメアノール/シトクロム
P450 4B1(Verschoyleら、Toxicol.Appl.Ph
armacol.123:193−198(1993));ならびに2−アミノ
アントラセン/シトクロムP450 4B1(Smithら、Biochem.
Pharmacol.50:1567−1575(1995))。
ク質合成またはウイルス複製を有意に阻害しない。この発見についての説明は、
これらの薬物の作用の型に存在し得る。CPAの活性代謝物、ホスファミドマス
タード(PM)は、細胞内DNAにおける鎖間および鎖内架橋を生成する。多数
のDNA鎖の切断が架橋部位で発生する場合、細胞内DNAに対する最大の細胞
傷害性は、通常、有糸分裂の間に達成される(Colvin、Cancer M
edicine.Hollandら編、1993.LeaおよびFabiger
,Philadelphia,733−734頁)。対照的に、非有糸分裂、架
橋ウイルスDNAは、広範な損傷から逃れ得、従って、細胞内DNAよりもより
簡単に修復され得る。
一例である。hrR3およびガンシクロビルの組み合わせが、ウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子によるガンシクロビルの変換に起因して有意な抗癌効果を提供す
ることが実証されているが(Boviatsisら、Cancer Res.
54: 5745−5751 (1994))、変換されたガンシクロビル分子
もまたウイルス複製を阻害する。この理由のために、TK/GCVの使用は、こ
の範例において好ましい選択ではないかもしれない。プロドラッグ活性化酵素(
例えば、HSV−TK)は、「偽」ヌクレオチドとして作用する抗癌代謝産物を
生成する。これは、DNA鎖の複製の未熟な終結を生じる。従って、これらのプ
ロドラッグ活性化酵素は、ウイルスDNAおよびゲノムDNAの両方の合成に影
響することが予想され、自殺遺伝子を含む本発明のヘルペスウイルス変異体にお
いて使用するために良好な選択ではない。
使用する別の利点は、これらの薬剤がG0の細胞に対してさえも有効であること
である。従って、これらの薬剤が腫瘍性細胞の殺傷において有効であるために、
標的化された細胞は、その薬物が投与された時点で活発に分裂する必要はない。
これは、大部分の細胞がG0期にある腫瘍について有意な利点である。
たは任意の一時点で腫瘍において増殖する細胞の相対的割合は、30%でしかな
く、残りの70%の細胞は、G0期にある。これらの腫瘍は、特に、活発に分裂
する細胞をのみ標的化する化学療法剤に対して耐性である。なぜなら、活発に分
裂する30%の膠芽腫細胞は、この腫瘍の致死的進行に寄与するが、この細胞の
70%は、G0期にあり、死亡するかもしれないし、または活動細胞周期に再進
入するかもしれない。Yoshiiら、J.Neurosurg.65:659
−663(1986)。従って、静止している70%が、活発に分裂している細
胞を標的化する化学療法剤に対するこれらの腫瘍の耐性の原因である。
方法は、条件的複製ウイルスまたは複製能を有さないウイルスの媒介する腫瘍崩
壊(oncolysis)単独に基づく治療を超える利点を提供する。これらの
治療は、ウイルス変異を補い得る細胞のみを標的化するからである。一方、本発
明のウイルス変異体は、導入遺伝子における複製、および溶解、導入遺伝子の発
現および活性化について高レベルのE2Fを伴う細胞(主に腫瘍性細胞)を標的
化するが、化学療法剤は、次いで周囲の腫瘍細胞に拡散し得る、活性な代謝産物
を提供する。これらの代謝産物は、それにより、G0期にある周囲の腫瘍細胞(
膠芽腫における細胞の70%)でさえも殺傷し得る。
ての原発性脳腫瘍のおよそ30%または50%を代表し、そして手術、化学療法
、および放射線療法にもかかわらず、ほとんど一般的に致死的である。
剤の局所活性化に起因して、本発明の方法は、同じ薬物濃度では、より腫瘍傷害
性となり、従って、正常細胞に対する傷害性を増大させることなく、より高い腫
瘍投与量とすることが可能である。さらに、全身腫瘍集団の化学療法処置もまた
、本発明の方法を用いることにより改善され得る。なぜなら、薬物のより低い用
量が、増大した効力によって可能であり得るからである。
法剤は、末梢における細胞または器官において活性化または活性状態への変換を
必要とするが、しかし、しばしば、活性(細胞傷害性)代謝産物は、血液脳関門
を横断し得ず、従って脳腫瘍に対して有効ではない。従って、本発明の方法は、
これらの化学療法剤による脳腫瘍の処置を可能にするべきである。1つのこのよ
うな化学療法剤は、CPAである。CPAは、中枢神経系新生物に対して大いに
有効でない。なぜなら、DNAアルキル化の細胞傷害性代謝産物へのそれの変換
は主として肝臓に制限され、そしてこれらの代謝産物は、血液脳関門を容易に横
断しないからである。しかし、本発明のウイルス変異体(チトクロームP450
遺伝子を保有するように操作され、そして脳腫瘍に適用される)の使用は、CP
Aの局所活性化を提供し得る。従って、好ましい実施形態では、チトクロームP
450遺伝子は、シクロホスファミド(CPA)の細胞傷害効果に対して中枢神
経腫瘍細胞を感作するために使用される。
は増強するサイトカインをコードし得る。Blankenstein, T.ら
、J. Exp. Med. 173: 1047−1052 (1991);
Colombo, M. P.ら、Cancer Metastasis R
ev. 16: 421−432 (1997); Colombo, M.
P.ら、Immunol. Today 15: 48−51 (1994))
を参照のこと。代表例としては、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターフェ
ロン−γ、インターロイキン(IL−2、IL−4)、または顆粒球マクロファ
ージコロニー刺激因子(GM−CSF))が挙げられる。
遺伝子(例えば、ジフテリア毒素(Coll Fresno, P. M.ら、
Oncogene 14: 243−247 (1997))、シュードモナス
毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子、アンチ
センスRNA、またはリボザイム(Zaia, J. A.ら、Ann. N.
Y Acad. Sci. 660: 95−106 (1992))をコー
ドし得る。
胞特異的プロモーター駆動発現を伴うヘルペスウイルス変異体は、化学療法剤を
その細胞傷害形態に変換し得る遺伝子産物をコードする導入遺伝子、または上述
したような任意の他の殺腫瘍導入遺伝子をさらに含む。導入遺伝子は、これが発
現される任意の位置でウイルスゲノム中に挿入され得る。導入遺伝子についてウ
イルスゲノムにおける好ましい位置は、もとのγ34.5欠失の遺伝子座である
か、またはヘルペスUL40遺伝子座のいずれでもある。
これらに限定されない:(i)腫瘍特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロ
モーターにより特徴付けられる新生物に罹患した非ヒト動物;(ii)腫瘍特異
的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターにより特徴付けられる新生物に
罹患したヒト;(iii)特定の細胞集団を根絶する必要のあるヒトまたは非ヒ
ト動物。
変異の蓄積によって)、それによって制御されない増殖能を提供する細胞が意図
される。この用語は、中枢神経系および末梢の両方における良性および悪性の両
方の腫瘍性細胞を含むことが意図される。本明細書中で使用されるように、用語
「末梢」は、脳または脊髄の外側の身体の他の全ての部分を意味することが意図
される。
白血病、リンパ腫などの細胞を包含する。特に興味深いのは、哺乳動物身体の任
意の器官または組織において生じ得る固形腫瘍である。
脳室上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫(neurofibrosarcom
a)、および髄芽細胞腫を包含する。
腫瘍について、MRI、CT、または他の画像化誘導定位技術(imaging
guided stereotactic techniques)が、ウイ
ルス接種を指示するために使用され得るか、またはウイルスが、開頭時に接種さ
れる。特定の細胞集団を根絶しようとする患者について、ベクターが、目的の組
織に接種される。
例えば、ウイルス変異体は、新生物増殖の部位でまたはその近傍に注入され得る
か、または血管内接種によって投与され得る。代表的には、ウイルス変異体は、
液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注入可能物として調製され得る;注入
前に液体に入れて溶液または懸濁液とするのに適切な固形形態もまた調製され得
る。調製物はまた、乳化され得る。活性成分は、好ましくは、薬学的に受容可能
であり、かつ活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば
、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそ
れらの組み合わせである。さらに、所望であれば、調製物は、少量の補助物質(
例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、アジュバントまたは免疫増強剤(こ
れは、ウイルス変異体の有効性を増強する)を含有し得る(Remington
’s Pharmaceutical Sciences,Gennaro,
A. R.ら編、Mack Publishing Co.,出版,第18版、
1990を参照のこと)。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール、植物油、および注射用有機エステル(例えば、オレイン酸エチ
ル)である。水性キャリアとしては、水、水溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒ
クル(例えば、塩化ナトリウム)、リンガーデキストロースなどが挙げられる。
静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充物(replenishers)を含む
。薬学的組成物のpHおよび種々の成分の正確な濃度の決定は、慣用的であり、
当業者の知識の範囲内である(Goodman and Gilman’s T
he Pharmacological Basis for Therape
utics, Gilman, A. G.ら編、Pergamon Pres
s,出版,第8版、1990を参照のこと)。 適切であるさらなる処方物は、経口処方物を包含する。経口処方物は、以下の
ような代表的な賦形剤を含む(例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース
、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、
炭酸マグネシウムなど)。経口組成物は、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方物
、または粉末の形態をとり得、そして10〜95%の活性成分、好ましくは25
〜70%の活性成分を含み得る。
される被験体、この被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される防
御の程度に依存する。投与されることが必要とされる活性成分の正確な量は、実
施者の判断に依存し、そして各個体に特有である。大部分では、ウイルスは、標
的細胞を感染および殺傷するのに治療的に有効な量で提供される。
モーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷するための方法を提供する。
この方法は、腫瘍性細胞にヘルペスウイルス変異体を感染させる工程、および腫
瘍性細胞を選択的に殺傷する工程を包含し、このウイルス変異体は、(a)γ3
4.5をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異;および(b)腫瘍
特異的プロモーターの転写制御下にある少なくとも1コピーのγ34.5遺伝子
の挿入であって、これによりこのプロモーターがγ34.5遺伝子の発現を駆動
する、挿入を含む。
5遺伝子に加えて、ヘルペスウイルス遺伝子の1つより多い特異的内因性欠失ま
たは不活性化変異が存在し得る。これらは、リボヌクレオチドレダクターゼ(R
R)をコードする遺伝子における欠失、またはより特定すると、RRの大きなサ
ブユニットを含む。あるいは、RRをコードする遺伝子は、スモールサブユニッ
トをコードする。任意の他のヘルペスウイルス遺伝子もまた欠失され得る。例え
ば、チミジンキナーゼ(TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、ま
たはdUTPase。これらのウイルス遺伝子は好ましい。なぜなら、これらの
遺伝子の哺乳動物ホモログが、しばしば、高レベルのE2Fを有する細胞(例え
ば、腫瘍性細胞)においてアップレギュレートされ、従って、欠失されたウイル
ス酵素を補い得、それによりそれらの細胞において選択的な複製を促進するから
である。
P、チロシナーゼ、およびPSAを包含する。腫瘍細胞はまた、特定の癌遺伝子
を過剰発現することが公知であり、従ってアップレギュレートされた遺伝子発現
を伴う細胞は、このような遺伝子のプロモーターエレメントを用いて標的化され
得る。B−myb、C−myb、c−myc、c−kit、およびc−erbB
2癌遺伝子は、これらのタイプのいくつかの代表的な例である。B−mybプロ
モーター(Lyon, J.ら、Crit. Rev. Oncogenesi
s 5: 373−388 (1994)を参照のこと)は、コンセンサスE2
F結合部位を含み、細胞の周期において厳密に調節され、そして実際、G0期で
は抑制される(Lam, E. W.およびWatson, R. J., E
MBO J. 12: 2705−2713 (1993); Lam, E.
W.ら、Gene 160: 277−281 (1995); Benne
tt, J. D.ら、Oncogene 13: 1073−1082 (1
996))。従って、B−mybプロモーターは、特に好ましい腫瘍特異的プロ
モーターである。本方法の特に好ましい実施形態では、本方法において使用され
るウイルス変異体は、Myb34.5である。
おいて用途を見出す。このようなプロモーターの例は、以下に見出され得る:C
lary, B. M.ら、Cancer Gene Therapy 7:
565−574 (1998)のTable 1; Spear,M. A.,
Anticancer Research 18: 3223−3232 (
1998)のTable I; Walther, W.およびStein,
U., J. Mol. Med. 74: 379−392 (1996)の
Table 2;およびDachs, G. U.,ら、Oncol. Res
.9: 313−325 (1997))。
GenBank Sequence Databaseから入手可能である。
。ここで、ヘルペスウイルス変異体が導入遺伝子をさらに含み、ここで導入遺伝
子は、自殺遺伝子、サイトカイン遺伝子、または任意の殺腫瘍性遺伝子である。
導入遺伝子が自殺遺伝子である場合、この方法は、腫瘍性細胞を、自殺遺伝子に
よって活性化され得る化学療法剤と接触させる工程および腫瘍性細胞を選択的に
殺傷する工程をさらに包含する。好ましい自殺遺伝子は、チトクロームP450
である。P450 2B1が特に好ましい。あるいは、コードされるチトクロー
ムP450は、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P4
50 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A
4である。さらに、化学療法剤は、好ましくは、オキサゾスフォリンクラスのメ
ンバーであり、特に、シクロホスファミド、イホスファミド、N−メチルシクロ
ホスファミド、メチルクロロプロピルニトロソウレア、ポリマー性シクロホスフ
ァミド、ポリマー性イホスファミド、ポリマー性N−メチルシクロホスファミド
、またはポリマー性メチルクロロプロピルニトロソウレアである。
る。ここで、この組成物は、1つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤もまた含み得
る。
細胞特異的プロモーターを過剰発現する標的細胞集団を特異的に排除するための
方法である。この方法は、この標的細胞をこのヘルペスウイルス変異体で感染す
る工程であって、このウイルス変異体は以下:(a)γ34.5をコードする遺
伝子における欠失および不活性化変異体;および(b)この細胞特異的プロモー
ターの転写制御下での少なくとも1つのコピーのこのγ34.5遺伝子の挿入で
あって、その結果、このプロモーターはこのγ34.5遺伝子の発現を駆動する
挿入;ならびに標的細胞集団を選択的に排除する工程を包含する。
における顕著な減少、ならびに、標的細胞の完全かまたはほぼ完全な排除を含む
ことが意図される。
.5に加えて、ヘルペスウイルス遺伝子の1より多い特異的内因性欠失または不
活性化変異体が存在し得る。これらは、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)
、またはより特定には、RRのラージサブユニットをコードする遺伝子における
欠失を含む。あるいは、RRをコードする遺伝子は、スモールサブユニットをコ
ードする。他の任意のヘルペスウイルス遺伝子(例えば、チミジンキナーゼ(T
K)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)またはdUTPaseなど)は
また、欠失され得る。
上皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター(Kappel
ら、Blood 93:4282−4292(1999));膵臓のベータ細胞
に発現されるインスリンプロモーター(Rayら、J.Surg.Res.84
:199−203(1999));視床下部の細胞に発現される性腺刺激ホルモ
ン放出ホルモンレセプター遺伝子(Albarracinら、Endocrin
ology 140:2415−2421(1999));破骨細胞およびケラ
チン生成細胞に発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモーター(M
unantら、J.Biol.Chem.274:5588−5596(199
9));骨細胞に発現される副甲状腺ホルモンレセプター(Amizumaら、
J.Clin.Invest.103:373−381(1999);ノルアド
レナリン作動性ニューロンに発現されるドパミンβヒドロキシラーゼプロモータ
ー(Yangら、J.Neurochem.71:1813−1826(199
8))。
管形成の存在する条件下(例えば、大脳のモヤモヤ病)において、γ34.5遺
伝子発現を駆動するためのflk1レセプタープロモーターの使用は、この疾患
を引き起こす血管の選択的排除を可能にする。別の例は、広範な骨再モデル化お
よび骨の排除が存在する条件下において(例えば、骨粗しょう症)、γ34.5
の発現を駆動するためのマトリクスメタロプロテイナーゼ9または副甲状腺ホル
モンレセプターの使用は、更なる骨の再モデル化から破骨細胞を排除する 2)発達プロセスを研究するため:発達プロセスにおける細胞集団の排除の効
果を研究するために、例えば、ドパミンβヒドロキシラーゼプロモーターを使用
してノルアドレナリン作動性ニューロンを排除し、次いで、動物の発達に対する
効果を研究し得る。
)によって媒介される細胞傷害性を顕著に減少する。腫瘍に対して細胞を溶解す
る毒力を標的するために、本発明者らは、Myb34.5と名付けられた単純ヘ
ルペスウイルス(HSV1)変異体を作製した。このウイルス変異体は、(UL
39またはリボヌクレオチドレダクターゼとしても公知の)ICP6における欠
失によって、γ34.5遺伝子(RL1)の2つの内因性コピーとして、そして
E2F応答性の細胞性B−mybプロモーターの制御下でのγ34.5の1つの
コピーの再誘導によって特徴付けられる。
ウイルスとして無毒性であり続けた。しかし、培養物中およびインビボの種々の
ヒト神経膠腫細胞に対するその腫瘍細胞崩壊性の効果は、野生型γ34.5遺伝
子を有する単一のICP6変異体株のそれと類似した。抗腫瘍効果および保持し
た神経弱毒化の組み合わせは、細胞周期調節プロモーターが腫瘍に対して標的H
SV−1毒力を標的するために使用され得、一方、γ34.5変異体の所望の神
経弱毒化表現型を維持する。
した。変異体ウイルスR3616(Chou,J.,ら、Science 25
0:1262−1266(1990))(両方のγ34.5座に1000bpの
BstEII−StuIの欠失を含む)は、B.Roizman博士(Univ
ersity of Chicago)によって親切にも提供された。変異体ウ
イルスhrR3(Goldstein,D.J.およびWeiner,S.K.
、J.Virol.62:196−205(1988))(S.Weller(
University of Connecticut)によって親切にも提供
された)は、UL39座に挿入されたE.coli lacZ cDNAを含む
。変異体ウイルスMGH1を、UL39座へのEscherichia col
i lacZ cDNAの挿入および両方のγ34.5座の欠失によって特徴付
け、そしてウイルス変異体R3616(Kramm,C.M.ら、Hum.Ge
ne Ther.8:2057−2068(1997))へのhrR3のICP
6−lacZ領域の再組換えによって構築した。ICP6(KOS起源、Gol
dstein,D.J.およびWeller,S.K.、J.Virol.62
:2970−2977(1988)を参照のこと)の2.3kbのXhoI領域
内にlacZ遺伝子を含むプラスミドpKK−BG3は、2.3kbのICP6
(UL39)遺伝子を含むプラスミドpKpX2と同様にS.Wellerによ
って提供された。γ34.5コード配列の全体を含むプラスミドpBGL34.
5は、Xandra BreakefieldおよびPeter Pechan
(MGH)によって提供された。B−mybプロモーターを、プラスミドpBG
L2myb(R.Watson博士(Ludwig Institute fo
r Cancer Research,UK)によって親切にも提供された)か
らのKpnI−HindIIIフラグメントとして摘出し、そしてγ34.5の
上流に指向性にクローニングした。
スミドを設計し、MGH1中のlacZ cDNAのその全体を置換し、そして
ICP6(UL39)配列のさらなる888ヌクレオチドを欠失した。特に、再
結合プラスミド(pKpX2−myb34.5)を以下のように操作した。全長
γ34.5cDNAをNcoI−SacIフラグメントとしてpBGL34.5
から抽出し、平滑末端化し、次いで、pBSKII(Stratagene,L
a Jolla,Calif)にサブクローニングしてプラスミドpBS34.
5を作製した。B−mybプロモーターを、pBGL2mybからKpnI−H
indIIIフラグメントとして抽出して、そしてpBS34.5にγ34.5
の上流に指向性にクローニングした。γ34.5生じた発現カセット(cDNA
の上流にB−mybプロモーターを含む)を、KpnI−XbaIフラグメント
として抽出し、平滑末端化し、次いで、pKpX2のNruI部位にサブクロー
ニングした。このプロセスを通じて、UL39内に介在するNruI−NruI
フラグメントを欠失した。次いで、生じたプラスミドpKpX2−myb34.
5を、ScaIで直線化し、そしてLipofectamine(Gibco,
Gaithersburg,MD)で種々のモル比にてVero細胞にMGH1
ウイルスDNAと共に同時トランスフェクトした。細胞病理学的効果が現れた場
合に、ウイルスの子孫をトランスフェクションの5〜7日後に回収した。ウイル
スの子孫は、3回の凍結融解を通じて細胞から再放出され、次いで、単層のVe
ro細胞上にプレートした。アガロースでこの単層を覆った後、5%二酸化炭素
を含む雰囲気下にて37℃でのインキュベーションを実施した。次いで、5−ブ
ロモー4−クロロ−3−インドイリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−ga
l)でプラークを染色した。染色されなかったプラークを、潜在的な組換え体と
して選択した。これらの単離体を、サザンブロット分析によって試験された遺伝
的同一性を有する前に、プラーク精製を3回行った。親株としてのMyb34.
5ならびにICP6座へ戻すlacZ cDNAの相同組換えおよびB−myb
/γ34.5発現カセットの欠失のためのプラスミドとしてのpKX−BG3を
使用することによって、Myb34.5復帰変異体(MybRevt)を操作し
た。
イナーゼK、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の反復を反復
して単離した。DNAを、適切な制限エンドヌクレアーゼ(New Engla
nd Biolabs,Beverly MA)で消化し、アガロース電気泳動
で分離し、そしてナイロン膜(Amersham Corp.,Arlingt
on Heights,Illinois)に転写した。プローブは、pKpX
2由来のHindIII−XbaIICP6フラグメント、pBSKγ34.5
由来のBstEII−BbsIフラグメント、およびpKX−BG3由来のLa
cZのBbsIフラグメントを含んだ。プローブ標識およびハイブリダイゼーシ
ョンを、ECL chemiluminescence system(Ame
rsham)を使用して、製造業者のプロトコールに従って実施した。
び1ml中10μgのストレプトマイシンを補填したDulbecco最小必須
培地(DMEM)中で5%二酸化炭素を含む雰囲気下にて37℃で培養した。宿
主タンパク質合成遮断研究を、ウイルス株で16時間細胞に感染させることによ
って実施した。次いで、細胞を、メチオニン不含培地中に10分間置き、次いで
、35[S]−メチオニン(New England Nuclear,Bost
on MA)を使用して90分間標識した。次いで、細胞をリン酸緩衝化生理食
塩水(PBS)(pH7)で洗浄し、可溶化し、SDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に転写し、そしてオートラジオグラフィー
に供した。タンパク質濃度を、市販のキット(Bio−Rad,Hercule
s CA)で計算した。感染した細胞ポリペプチド(ICP)を、以前に刊行さ
れた(Morse,L.S.ら、J.Virol.26:389−410(19
78))ように標識した。ヒト神経膠芽細胞株U87、U373、T98Gおよ
びU343;ラット神経膠肉腫9L細胞;ヒト神経芽腫SKNSH細胞およびV
ero(アフリカミドリザル)細胞を、American Type Cult
ure Collection(Manassas,VA)から得、そして10
%血清および抗生物質を補填したDMEMまたは最小α必須培地(Gibco)
で培養した。マウス胎仔線条体神経初代細胞(胎仔段階18)(M.Schwa
rzchild,Massachusetts General Hospit
al,Charlestown,MA)によって親切にも提供された)を、刊行
された手順(Schwarzschild,M.A.ら、J.Neurosci
.17:3455−3466(1997))を使用して単離した。
ty,Massachusetts General Hospital(MG
H)から得た。BALB/Cマウスを、Charles River Labo
ratories(Wilmington,MA)から得た。皮下の腫瘍を、無
胸腺症のマウス(9L神経膠肉腫細胞について1群あたり5動物、およびヒトU
87ΔEGFR神経膠腫細胞について1群あたり6動物)の脾腹への2×105
細胞を注射することによって得た。腫瘍移植後14日目(9Lについて)または
10日目(U87ΔEGFRについて)に、同様の腫瘍塊を有する動物を無作為
に隔離し、そして種々のウイルス株を100μl容積中に1容量あたり5×10 7 PFUで、1、3、5および7日目に腫瘍内に注射した。動物を33日目(9
Lについて)または34日目(U87ΔEGFRについて)に安楽死させた。腫
瘍塊を、以前(Wei,M.X.ら、Hum.Gene Ther.5:969
−978(1994))に記載されるように外部測径器で測定した。神経毒性の
実験について、BALB/Cマウスに、10μl容量のウイルスをストックの取
得し得る最大の力価までの異なる希釈で、右前葉(深さ3mm)に定位的に注射
した。動物を28日間毎日チェックした。動物の研究の全てを、Animal
CareのMGH Subcommitteeによって発行されるガイドライン
に従って実施した。ウイルス播種およびウイルスを保有する動物の世話を、認可
されたウイルスベクター室で実施した。
またはRRとしても公知の)座にB−mybプロモーター/γ34.5構築物を
再連結することによって構築した。MGH1(Kramm,C.M.ら、Hum
.Gene Ther.8:2057−2068(1997))を、γ34.5
欠失変異体R3616(Chou,J.ら、Science 250:1262
−1266(1990)のICP6座へのlacZ cDNAの再連結によって
作製した。図1Aは、Myb34.5のDNA構造の模式図を提供する。この構
造を、制限エンドヌクレアーゼマップ(データは示さず)、サザンブロットハイ
ブリダイゼーション(図1B〜1D)、そしてUL39とB−mybプロモータ
ー/γ34.5発現カセットとの間の連結の配列分析(データは示さず)によっ
て確認した。Myb34.5におけるlacZの欠失を示すために、XhoI消
化したMyb34.5DNAを、ICP6(図1B)またはlacZ(図1C)
の配列のいずれかを含むプローブとハイブリダイズした。予想通り、親ウイルス
であるMGH1は、ICP6プローブ(図1B)とハイブリダイズする9.0k
bのXhoI ICP6−lacZフラグメント(Kramm,C.M.ら、前
出)を含んだ。相同組換えは、lacZおよびさらなるICP6配列の欠失、な
らびにB−mybプロモーター/γ34.5配列の挿入を導いた。これは、My
b34.5DNA(図1B)における6.7kbフラグメントに対するICP6
プローブのハイブリダイゼーションによって明白である。lacZプローブでの
ハイブリダイゼーションは、Myb34.5から消化されたDNAにおけるハイ
ブリダイズするフラグメントの不存在、およびMGH1(図1C)から消化され
たDNAにおける期待された9.0kbのハイブリダイズするフラグメントの存
在を示した。Myb34.5がγ34.5遺伝子の再誘導を有することを確認す
るために、BamHI消化したウイルスDNAを、BstE11−Bbsγ34
.5フラグメント(欠失した領域の内部)とハイブリダイズした。これは、代表
的には野生型F株で観察される、ハイブリダイズするバンドのラダーを示した。
Chouら(1991)(前出)の研究において議論されるように、γ34.5
はBamHI SおよびPのフラグメントをマップし、500bpずつ増加する
バンドの特徴的なラダーを形成する。このラダーは、長い成分の独特の配列に隣
接する反復における多くのa配列が連続する。このラダーは、F株(図1Dのレ
ーン1)についてのサザンブロットにおいて観察され、ここで、最も上のハイブ
リダイズするバンドは、終端のBamHI SフラグメントとBamHI Pと
の融合によって形成されたBamHI SPフラグメントを示し、一方、最も下
のハイブリダイズするバンドは、BamHI Sフラグメントを示す(Chou
,J.らScience 250:1262−1266(1990)。
びMyb34.5Revtにおいて、全長γ34.5cDNAプローブがハイブ
リダイゼーションに利用される場合、分子サイズが約1kb(R3616におけ
るγ34.5の内部欠失のサイズ)だけ減少したハイブリダイズするバンドの同
様のラダーは期待された。実際に、Chouら(Chou,J.ら、Scien
ce 250:1262−1266(1990))の研究において、このハイブ
リダイゼーションパターンは、R3616について明白であり、Krammら(
Kramm,C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:2057−206
8(1997))の研究において、このハイブリダイゼーションパターンは、M
GH1について明白である。しかし、図1Dに示されたサザン分析について、R
3616、MGH1、Myb34.5およびMyb34.5Revtのγ34.
5遺伝子の1kb欠失フラグメントの内部である、BstEII−Bbsγ34
.5フラグメントを、プローブとして利用した。従って、MGH1(図1D、レ
ーン2)およびMyb34.5Revt(図1D、レーン4)についてハイブリ
ダイズするバンドは観察されず、一方、γ34.5遺伝子に対応する単一の5.
3kbのハイブリダイズするフラグメントが、Myb34.5について観察され
(図1D、レーン3)、ICP6座に再導入される。
あったことを示すために、復帰変異体(マーカーが奪還された)ウイルスをまた
操作し、そしてMybRevtと称した。これは、親株としてMyb34.5を
、そして組換えるプラスミドとして線状化pKX2−BG3を用いる、相同的組
換えにより達成した。このプラスミドは、lacZ/ICP6挿入を含み、そし
てMGH1中のICP6::lacZ融合領域の供給源であるhrR3を創出す
るために用いた(Kramm、C.M.ら、Hum.Gene Ther.8:
2057−2068(1997);Goldstein、D.J.&Welle
r、S.K.J.Virol.62:2970−2977(1988))。My
bRevt復帰変異体は、サザンハイブリダイゼーションで、ICP6(図1B
)、lacZ(図1C)、およびγ34.5(図1D)プローブに対するパター
ンを示し、これは、Myb34.5の親株であるMGH1により示されるそれと
同一であった。
ヒトSKNSH神経芽腫細胞を、種々のウイルス株で感染した。図2は、予期さ
れるように、MGH1および復帰変異体ウイルス(MybRevt)が、インタ
クトなγ34.5機能であるタンパク質合成の遮断からなる感染細胞応答(Ch
ou、J.1992、前述)を防げないことを示す。しかし、Myb34.5お
よびインタクトなγ34.5をもつその他の株(野生型FおよびhrR3)は、
感染細胞応答(タンパク質合成の遮断)を防ぎ、それ故ウイルスタンパク質産生
に至った。
は、γ34.5変異体HSV株の複製を制限することを先に注記された(Moh
r.I.およびBluzman、Y.、EMBO J.15:4759−576
6(1996))、U373膠芽腫の細胞株におけるウイルス複製の評価により
提供された。1.0のMOIで、5×105細胞を感染し、そして48時間後の
ウイルスアウトプットを回収した後、Myb34.5収率は、野生型F株のそれ
と類似であった(それぞれ、1.1×107PFU 対 5.0×107PFU)
。対照的に、MGH1(3.3×104PFU)またはMybRevt(3.4
×104PFU、3つの実験の平均)の収率は有意により少なかった。MGH1
またはMybRevtのそれとは対照的に、Myb34.5がこの非許容株中で
効率的に複製する能力は、Myb34.5中でコードされたγ34.5が機能的
であったことを示す。
であり、これは、インビトロおよびインビボの両方で評価され得る。Myb34
.5ウイルスが一次ニューロン培養で複製する能力は、F、hrR3、MGH1
、およびMybRevt株との比較で測定した。マウス胎児線条体ニューロンを
感染し、そしてウイルス収率をVero細胞(これは、効率的ウイルス複製にγ
34.5を必要としない)上のプラークアッセイにより評価した。野生型F株は
ニューロン中で活発な複製を示したが、Myb34.5を含むすべての変異体株
は、最小のウイルス複製を示した(表1を参照のこと)。
て先に記載のようにプレートに撒いた(Chase、M.ら、Nat.Biot
echnol.16:444−448(1998))。プレートに撒いて2日後
、細胞を、野生型(F株)および変異体ウイルス株を用い二重の実験において0
.1のMOIで感染した。感染の24時間後、細胞および上清液を回収し、そし
て凍結融解サイクルに供し、ウイルス粒子を遊離させた。ウイルスアウトプット
は、Vero細胞上のプラークアッセイにより決定した。標準偏差(SEM)を
括弧内に示す。4つのウイルス変異体株(hrR3、MGH1、Myb34.5
、およびMybRevt)は、グループ間で統計的に異ならなかった(t検定、
p>3)。
5の直接脳内接種は、このウイルスが、野生型HSVと比較して、顕著に神経弱
毒化されていることを示した。表2は、Myb34.5のLD50が、F株のそれ
より少なくとも3対数単位高く、2.7×107PFUであったことを示す。γ
34.5変異体(MGH1、R3616、およびMybRevt)は、良好に生
育せず、そして>109PFU/mlの力価の達成は、大スケール生産なくして
はなはだ高価である。これは、これらの実験においてこれらの変異体に対するL
D50を正確に推定する能力を制限する。比較目的のために、6匹のマウスのうち
1匹は、Myb34.5の107PFUを脳内に接種するときに死亡し、その一
方、同じ量のMGH1を接種したとき6匹のマウスは死亡しなかった。これらの
知見は、B−mybプロモーターの制御下のγ34.5の再導入が、最小の神経
毒性を生成したことを確認した。
ALB/C(Charles River Laboratories、Wil
mington、MA、PFUレベルあたり6匹の動物)の右半球中に定位的に
注射した。動物を、運動性について28日間毎日視察し、そしてLD50をPFU
で、比例距離モデルを用いて計算した。R3616およびMGH1についての二
重のアスタリスク(**)は、列挙された投与量で死滅がなかったことを示し、
これは、所定の注射容量でこれらの株について最高の達成可能なものであった。
これは、>109PFU/mlの力価が、工業的スケール生産なくして増殖する
Vero細胞中でこれらの変異体を用いて技術的に達成できなかったからであり
、そして脳内注射は、10μlの最大容量に制限されていた。三重のアスタリス
ク(***)は、平行する実験において、107PFUの投与量で6匹の動物あ
たり1匹が死亡したことを示す。急速に分割するVeroまたは腫瘍細胞中でM
yb34.5を用いて5×109〜1×1010PFU/mlの力価が達成された
ので、より正確なLD50が測定できた。
をさらに評価するために、一次ヒト線維芽細胞をプレートに撒き、そして細胞周
期を、20μMのロバスチン(これは、ヘルペスウイルス複製を妨害しないこと
が示されている(Schang、L.M.ら、J.Virol.72:5626
−5637(1998)))で休止させた。休止した一次線維芽細胞、MGH1
、Myb34.5、およびMybRevtは、単一RR変異体hrR3より1対
数単位(PFU)低いレベルで、F株と比較して、最小のウイルス複製を示した
(図3)。対照的に、血清の存在下で、hrR3およびMyb34.5は顕著な
複製の誘導を示し、その一方、MGH1およびMybRevtはそうではなかっ
た。これらの結果は:1)この非形質転換細胞型では効率的な複製にγ34.5
が必要であること、および2)B−mybプロモーター機能が周期運動中の細胞
におけるMyb34.5の効率的な複製を可能にすることを示唆する。Myb3
4.5が、hrR3のそれより、休止細胞 対 周期運動中の細胞におけるウイ
ルス子孫の産生においてより大きな差動(3 対 2対数単位)を示し、しかも
休止細胞におけるそのウイルス産生がγ34.5ウイルスのそれと同じであった
ことは注目され得る。
株(9L、U87、U87ΔEGFR、T98G、およびU343)を、偽感染
(ウイルスなし)またはF株、MGH1、Myb34.5、およびMybRev
tを含むウイルス株のパネルで感染した。48時間後生存細胞を計数し、そして
偽処理プレート上で生存する細胞のパーセントとして表した。ラット9L神経膠
腫細胞の公開されたデータ(Kramm、C.M.ら、Hum.Gene Th
er.8:2057−2068(1997))中、およびヒト神経膠腫細胞U3
43およびT98に関する未公開実験(Qureshi、N.およびChioc
ca、E.A.、未公開データ)中では、MGH1による腫瘍細胞死滅が、2つ
のヒト神経膠腫株について、R3616によるそれと類似であることが予備的に
示されており(表3)、そしてそれ故、後者の変異体は、さらなる分析から排除
された。
示したより大きいインビトロ腫瘍崩壊効率を示し、そしていくつかの腫瘍細胞株
についてその腫瘍崩壊効力は野生型ウイルスのそれに接近した(表3)。従って
これらの知見は、Myb34.5の腫瘍崩壊効果がγ34.5変異体ウイルス(
MGH1、MybRevt、およびR3616、それらの殺傷効力はMGH1の
それのほぼ2倍)のそれより大きかったことを示した。
ット(9L)神経膠腫由来細胞株を、5×105細胞/60mm直径プレートで
プレートに撒き、そして次に注記された株を用い0.1のMOIで感染した。腫
瘍崩壊効果は、感染48時間後の細胞生存により反映され、3重の非感染コント
ロールプレートからの生存細胞の数のパーセントとして表した。値は3重の実験
の平均を表す(括弧内はSEM)。Myb34.5 対 MGH1またはMyb
Revtによる腫瘍細胞の死滅における差は、統計的に有意あった。例えば、U
87神経膠腫細胞において、Pは0.001未満であった(Tukeyのペア多
重比較手順による分散の1方向分析)。 **R3616の死滅は、この特定のセットの実験には含めなかった。なぜなら
、それは、MHG1で観察されたそれと比較的類似であるからである。これは、
ラット9L神経膠腫についてKrammら(Kramm、C.M.ら、Hum.
Gene Ther.8:2057−2068(1997))、および本実験と
は異なる時点で実施された多くの先の未公開実験で示された。例えば、MGH1
またはR3616細胞を用い0.1のMOIで感染したヒトU343神経膠腫細
胞について、生存率は、2日目で、それぞれ54%および50%であった。MG
H1またはR3616を用い0.1のMOIで感染したヒトT98細胞について
、生存率はそれぞれ40%および38%であった。
中に、ラット9L神経膠腫(図4A)またはヒトU87dEGFR神経膠腫(図
4B)腫瘍を確立した後、各ウイルスを用いた腫瘍内接種を実施した。平均腫瘍
容積により評価したとき、9L腫瘍増殖は、コントロール動物と比較してMyb
34.5処理により顕著に低減し、hrR3処理後のそれと定量的に類似の阻害
であった(図4A)。通例の短縮形EFGレセプターを発現するヒト神経膠腫で
あるU87ΔEGFR(Nagane、M.ら、Cancer Res.56:
5079−5086(1996);Huang、H.S.ら、J.Biol.C
hem.272:2927−2935(1997);Nishikawa、R.
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7727−773
1(1994))に対し、すべての株は、顕著に増殖を阻害し、hrR3および
Myb34.5は、6のうち3で完全な退行を生じ、その一方、MGH1および
MybRevtは、6のうち2で退行を生じた(見える腫瘍はない、図4B)。
t) 対 γ34.5+ウイルス(hrR3およびMyb34.5)で処理され
たヒトU87ΔEGFR腫瘍の増殖に有意な差はなかったという結論に至り得る
が、34日時点における実際の腫瘍容積のレビューは、有意な差の存在を示す(
表4)。これらの結果は、それ故、Myb34.5のインビボ腫瘍崩壊効果が単
一RR変異体のそれと平行し、かつγ34.5変異体のそれより優れたことを示
した。
点からである。 b 処置群間の中央値における差は、統計的に異なった(P=0.004[ラン
クに関する分散のKruskal−Wallisの1方向分析])。
経膠腫細胞を、マウスにおける直接脳内接種に対する神経毒性の点から高い程度
の安全性を保持しながら、インビトロおよびインビボの両方で効率的に殺傷した
ことが示された。この株はまた、単一RR変異により特徴付けられるHSVで見
られる誘導に類似の、初期休止線維芽細胞中で最小の複製および周期運動中の細
胞中の複製の顕著な誘導を示した。腫瘍細胞において、それはまた、親の二重R
R/γ34.5変異体であるMGH1と比較して改善された腫瘍崩壊効力で活発
に複製した。これは、MGH1およびその他のγ34.5変異体が、感染細胞か
ら得られるより低いウイルス収率に起因して限られた効力を有し得る(Kram
m、C.M.ら、前述)ので、適切である。おそらく最も重要なことは、Myb
34.5が、MGH1またはその他のγ34.5変異体のように、神経弱毒化さ
れたまま、107PFUの脳内投与量でマウスちにおいてほとんど病原性を示さ
なかったことである。したがって、Myb34.5は、>107PFUのLD50
で、神経弱毒性の特徴を維持しながら、親の変異体MGH1、マーカー奪還復帰
変異体MybRevt、およびMGH1の親変異体R3616と比較して改良さ
れた腫瘍崩壊効力を示す。この値は、厳密な定量的比較が後者のグループの変異
体についてLD50を正確に決定することが技術的にできないことによって制限さ
れたが、γ34.5変異体で観察されたそれに定性的に類似している。
正常な細胞および組織に対して最小の副作用および毒性を示すウイルス変異体を
同定することである。この離れ業は、感染した正常細胞および腫瘍細胞に対して
最小の毒性を示す複製欠損ウイルスベクターを操作すること、およびこのベクタ
ーに、抗癌遺伝子を発現する能力を付与して、生物学的効果を果たすことによっ
て達成された(Moriuchi,S.ら,Cancer Res.58:57
31−5737(1998))。大きなヒト腫瘍塊に対する接種材料として適用
される場合、このようなベクターは、そのサイズに起因して十分に拡散せず、従
って、抗癌効果は、注射路に近接して位置づけられた細胞に制限される(Bob
o,R.H.ら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 91:20
76−2080(1994);Puumalainen,A.M.ら,Hum.
Gene.Ther.9:1769−1774(1998))。
比較的選択的な様式で複製する能力を維持し、一方で正常細胞ではその複製能力
を制限される、条件的複製(腫瘍崩壊性で複製制限的)ウイルス変異体を使用す
ることから構成される。従って、このようなウイルス変異体は、最初に感染した
腫瘍細胞から周辺の腫瘍細胞へと伝播し、このようにして、大量の分布および抗
癌効果の増強を達成する。しかし、これらの変異体に付随する毒性の増加が予期
され得る。条件的複製HSV−1に付随する潜在的毒性を最小化するために、内
因性γ34.5遺伝子の欠失は、齧歯類(Chou,J.ら,Science
250:1262−1266(1990);Markert,J.M.ら,Ne
urosurgery 32:597−603(1993);Markovit
z,N.S.ら,J.Virol.71:5560−5569 1997))お
よびAotusサル(Mineta,T.ら,Nat.Med 1:938−9
43(1995))での大脳内注射に際して、脳炎または髄膜炎の危険性を有意
に制限または排除することが示された。さらに、悪性脳腫瘍に冒されたヒトにお
けるフェーズI臨床試験において、この型の変異体は害の証拠を示さなかった(
Maruza,R.L.,個人通信)。
抗癌効果を制限するということである。公表された実験では、この制限が、イン
ビトロおよびインビボの両方において、ラット9L神経膠肉腫細胞について示さ
れた(Kramm,S.ら,Hum.Gene Ther.8:2057−20
68(1997))。本実施例において本発明者らは、5つのヒト神経膠腫細胞
株のパネルに対する、γ34.5機能欠失HSV変異体(MGH1およびMyb
Revt)によって媒介される殺傷を試験した(表2)。予期されたように、こ
れらの変異体は、野生型F株と比較して、その腫瘍崩壊性効力を比較的制限され
た。同様の知見はまた、R3616、MGH1の親株でもまた観察された(Qu
reshi,N.およびChiocca,E.A.,未公開データ)。しかし、
MGH1の腫瘍崩壊性効力は、B−mybプロモーター制御下での単一のγ34
.5遺伝子の挿入に際して、野生型F株で観察されたレベルに近接したレベルま
で回復した。
、R3616、または他のγ34.5変異体の注射よりも広範な腫瘍崩壊を生じ
ることが予期されるということである。
3)の効力と量的に類似することが見出されており、このことは、腫瘍細胞にお
けるγ34.5産物の活性な発現が、Myb34.5をγ34.5陽性表現型へ
と回復させることを示唆する。しかし、hrR3は単純な挿入変異体であるので
、Myb34.5は、潜伏性の既存のHSV感染またはその後のHSV感染の存
在下で、野生型へ組換え修復する傾向が低いという理論上の利点を提供する。相
同組換えを介したICP6遺伝子座の修復が生じ得るという見込みの低い事象に
おいてさえ、B−myb/γ34.5挿入物は切り出され、そしてR3616(
MGH1についての親ウイルス)のγ34.5欠失遺伝子型にMyb34.5を
回復させる。
染に対する宿主細胞応答を防止すること、すなわち、アポトーシス様応答におけ
る宿主タンパク質合成の遮断の誘発であることが示された(Chou,J.ら,
Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:10516−1052
0(1995);Chou,J.ら,Science 250:1262−12
66(1990);Chou,J.およびRoizman,B.,Proc.N
ad.Acad.Sci.USA 89:3266−3270(1992))。
同様の機能は、病原性ウイルスの間で広範に広がっている(Cosentino
,G.P.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:944
5−9449(1995);Gale,M.ら,Mol.Cell.Biol.
18:5208−5218(1998);Katze,M.G.,Trends
Microbiol.3.75−78(1995);Sharp,T.V.ら
,Nucleic Acids Res.21:4483−4490(1993
))。γ34.5は、Vero細胞における培養物でのウイルス増殖には必須で
はないが、マウス中枢神経系においてウイルスを伝播させ得(Kesari,S
.ら,J Gen.Virol.79:525−536(1998);Kesa
ri,S.ら、J Neurosci.16:5644−5653(1996)
;Markovitz,N.S.ら,J Virol.71:5560−−55
69(1997))、そしてCNS複製において以前に関連付けられたHSVゲ
ノムの領域にマッピングさせる(Centifanto−Fitzgerald
,Y.M.ら,J Exp.Med 155:475−489(1982);M
arkovitz,N.S.ら,J Virol.71.5560−−5569
(1997))。これは、γ34.5コードタンパク質が、二本鎖RNA依存性
キナーゼを阻害するという事実に起因し得る。二本鎖RNA分子への曝露に際し
て、ウイルス感染で通常見られるように、RNA依存性キナーゼは、延長開始因
子2のαサブユニットをリン酸化して、タンパク質合成の阻害を生じさせる(C
hou,J.ら,Science 250:1262−1266(1990);
Chou J.ら、J.Virol.68:8304−8311(1994);
Chou,J.およびRoizman,B.,Proc.Nad.Acad.S
ci.USA 89:3266−3270(1992))。γ34.5を発現し
得ない変異体を、ニューロン起源の細胞に感染させることは、細胞のタンパク質
合成の遮断を生じさせ、結果としてウイルス産生の制限を生じさせる。
4.5機能の回復を示すことであった。これは、MGH1およびMybRevt
での細胞の感染が、タンパク質合成の抑制を生じさせたが、タンパク質合成はM
yb34.5が感染性ウイルスであった場合には回復されたということを実証す
ることによってなされた。細胞周期に対するγ34.5機能の新規なB−myb
転写依存性についてのさらなる証拠が、ロバスタチン休止実験によって与えられ
た。これらは明らかに、増殖休止状態下において、B−myb転写活性が最小で
ある場合、Myb34.5の力価がMGH1およびMybRevtの力価と類似
しており、そして野生型F株およびhrR3株の力価とは異なることを示した。
しかし、細胞が血清刺激された場合、Myb34.5の力価は、3桁増加して、
F株およびhrR3で得られた力価に近づくが、γ34.5変異体(MGH1お
よびMybRevt)の力価は、わずかにのみ増加した。Myb34.5複製の
基底レベルが、休止細胞におけるhrR3のレベルよりも低く、そして量的には
RRγ34.5変異体MGH1のレベルにより類似していたことは注目に値した
。Myb34.5は、hrR3よりも高い倍率での、周期運動中の細胞における
複製誘導を示したが、MGH1およびMybRevtは、最小の誘導を示した。
このことは、Myb34.5構築物の効果が、リボヌクレオチドレダクターゼの
単純な補完効果に勝ることを示唆する。
複製を制限し、そして周期運動中の細胞に対してウイルス複製を再指向させると
いう仮定が確証された。従って、脳腫瘍治療の状況下では、Myb34.5は、
休止している細胞においては比較的低レベル(MGH1で観察されるレベルに類
似する)で複製するが、分裂中の脳腫瘍細胞の感染によって、ウイルス力価の顕
著な増加を生じさせ、このようにしてMGH1または他のγ34.5変異体を超
える治療的利点を与える。正常な脳細胞の感染は、γ34.5変異体で生じ得(
Kesari,S.ら,J.Gen.Virol.79:525−536(19
98);Kesari,S.ら,J Neurosci.16:5644−56
53)(1996);Markovitz,N.S.ら,J Virol.71
:5560−5569(1997))、そしてMyb34.5作用が休止してい
る感染神経細胞におけるこれらの変異体の作用を模擬することが予期される。実
際、本発明者らのインビトロおよびインビボ研究によって、培養ニューロンおよ
びマウスの脳におけるMyb34.5複製が、γ34.5変異体ウイルス(MG
H1、MybRevt、およびR3616)の複製と類似し、そして野生型F株
およびhrR3の複製とは異なることが示された。
5遺伝子による2つの内因性γ34.5遺伝子の置換に起因し、そして、内因性
HSV γ34.5プロモーターよりも弱く、かつその厳密な細胞周期調節の特
徴が、HSVゲノムの状況下では破壊されるプロモーター(B−myb)を使用
することによるということであり得る。この可能性を正式に排除することは、変
異体B−mybプロモーターでの広範なさらなる実験を必要とするが、本発明者
らは、現在の実験データに照らして、これは見込みが低いままであると考える。
この実験が真実である場合には、以下のことが予期される:(i)休止細胞にお
けるMyb34.5複製は、γ34.5欠失変異体の複製よりも高い(前者の変
異体における調節解除されたB−mybプロモーターによるγ34.5遺伝子の
低レベル発現が原因);(ii)Myb34.5に感染した神経芽細胞腫細胞に
おいて観察される宿主タンパク質合成の遮断の阻害(図2)は、FまたはhrR
3に感染した細胞において観察される阻害よりも、さほど明白ではない(内因性
HSVプロモーターによって駆動される2つのγ34.5遺伝子によって達成さ
れる強力な発現と比較して、より弱いプロモーターでの単一のγ34.5遺伝子
のより弱い発現が原因);(iii)U373細胞におけるMyb34.5の複
製(γ34.5変異体の厳しく制限された複製に対して公知(Mohr,I.お
よびGluzman,Y.,EMBO J.15:4759−4766(199
6)))はまた、FまたはhrR3の発現と比較した、Myb34.5における
弱いγ34.5遺伝子発現によって、幾分制限される;ならびに(iv)休止中
の細胞と周期運動中の細胞との間の複製における差異は、Myb34.5(調節
解除されたB−mybプロモーターによって駆動される1コピーのγ34.5を
発現する)についてよりもhrR3またはF株(内因性HSVプロモーターによ
って駆動される2コピーのγ34.5を発現する)について高い。
果について最も見込みある説明は、B−mybプロモーターが、HSVゲノムの
状況下においてさえ、比較的厳重な様式で調節を維持し、このようにして、休止
細胞においては、存在するにしても最小のγ34.5発現へと導き、そして周期
運動中の細胞および腫瘍細胞においては、インタクトなγ34.5機能を有する
ウイルス株で観察されるレベルと機能的に類似していると思われる発現レベルへ
と導くということである。
近年示された。このことは、HSV変異体に、ウイルス腫瘍崩壊機能のみならず
、さらなる抗癌効果を発現させることを可能にし、その治療的効果を増加させる
(Chase,M.ら,Nat.Biotechnol.16:444−448
(1998))。明らかに、Myb34.5はまた、抗癌遺伝子(例えば、プロ
ドラッグを活性化させる遺伝子)の付加のために適切な骨格を提供し得る。腫瘍
選択的なプロモーターが同定される場合、正常細胞に対して腫瘍細胞へとウイル
ス産生をさらに制限するために、γ34.5遺伝子または他の毒力遺伝子の発現
を制御するようにこれらを使用することは、比較的容易である。本明細書中に記
載したアプローチをまた使用して、細胞特異的プロモーターを用いることにより
、組織中の特定の細胞型に毒力を制限し得る。
中の細胞に厳密に制限され、そして実際に、G0において発現される(Lam,
E.W.およびWatson,R.J.,EMBO J.12:2705−27
13(1993);Lam,E.W.ら,Gene 160:277−281(
1995);Bennett,J.D.ら,Oncogene 13:1073
−1082(1996))。E2F応答性プロモーターを含む複製欠損アデノウ
イルスを用いて、休止ニューロン組織に対してのみならず、形質転換されていな
い正常な周期運動中の細胞に対しても相対的な、腫瘍特異的な遺伝子発現が示さ
れた(Parr,M.J.ら,Nat.Med 3:1145−1149(19
97))。E2Fを調節する、細胞周期調節p16/網膜芽細胞腫/cdk4経
路のいくつかの部分の変更は、ヒト神経膠腫ならびに多くの他の腫瘍型における
ほぼ普遍的な事象であるように思われ、そしてウイルス遺伝子産物の腫瘍特異的
発現を標的化するための優良な基質を提供する(He,J.ら,Cancer
Res.54:5804−5807(1994);Ueki,K.ら,Canc
er Res.56:150−153(1996))。
めに、アルブミンプロモーターを使用した)が記載された(Miyatake,
S.ら,J Virol.71:5124−5132(1997))。本報告に
おいて記載されたストラテジーからの主要な差異は、肝細胞特異的な代わりに腫
瘍特異的または細胞周期特異的と考えられ得るプロモーターを使用すること、お
よび必須の転写因子(例えば、ICP4)ではなく毒力(γ34.5)に直接関
係したHSV遺伝子を使用することである。膠芽腫の処置についての研究の下で
の多くのウイルスベクターとは対照的に、Myb34.5と称される例示された
ベクターは複製能を有し、そして標的化した毒力は、ウイルス複製および直接的
な腫瘍崩壊を調節することによって得られる。これに関して、Myb34.5は
新規な標的化された腫瘍崩壊性ヘルペスウイルスを表し、そして近年記載された
2つの腫瘍選択的な腫瘍崩壊性アデノウイルスおよびレオウイルスに加えられる
(Bischoff,J.R.ら,Science 274:373−376(
1996);Coffey,M.C.ら,Science 282:1332−
1334(1998))。E1B欠損アデノウイルスONYX−015は、腫瘍
細胞における効率的な複製のためのp53腫瘍抑制経路の変更に依存すると考え
られるが、この機構は近年、異議を唱えられている(Goodrum,F.D.
ら,J Virol.72:9479−9490(1998))。
ことが示された(Coffey,M.C.ら,前出)。Myb34.5は、pl
6/cdk4/RB/E2F経路の変更を利用し得、そして、複数の腫瘍の遺伝
的変更が異なるウイルス処置ストラテジーによって標的化され得る可能性に加え
られる。γ34.5遺伝子の発現を駆動するために細胞特異的プロモーターまた
は腫瘍特異的プロモーターを使用するストラテジーはまた、インビボにおいて選
択された細胞集団を排除するための手段として適切であり得る。最終的に、強力
な抗腫瘍効力と組み合わせて、安全性増加の知見は、Myb34.5が、悪性腫
瘍の処置のための優れた候補であることを示唆する。
の当業者に自明である、本発明を実施するための上記様式の改変は、添付の特許
請求の範囲の範囲内であることが意図される。
分野の当業者の技術レベルを示す。すべての刊行物および特許は、各個々の刊行
物または特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されると示された場合と
同程度に、本明細書中で参考として援用される。
分詳細に記載されたが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の範囲
内で実施され得ることは明らかである。
.5変異体)、およびMyb34.5の概略マップを示す。全ての株は、2つの
固有のセグメントであるULおよびUSを有する、代表的なHSVゲノムを含み
、このセグメントの各々には、それぞれ、逆方向反復セグメントabおよびca
が隣接する(McGeoch,D.J.ら、J.Gen.Virol.72:3
057−3075(1991))。固有のセグメントまたは反復セグメントのい
ずれかにおける局在に依存して、HSV遺伝子は、1コピーまたは2コピーで存
在する。黒ボックスは、ICP6内のBamHI部位へのLacZ挿入を示し(
Goldstein,D.J.およびWeller,S.K.、J.Virol
.62:2970−2977(1988))、一方、Δは、MGH1およびMy
b34.5におけるγ34.5内の欠失を示す(Kramm,C.M.ら、Hu
m.Gene Ther.8:2057−2068(1997))。斜線バーは
、ICP6遺伝子座内へのB−mybプロモーター−γ34.5構築物の組換え
を示す。
けを示す。ICP6に対する完全長プローブへのXhoI消化ウイルスDNAの
ハイブリダイゼーションは、MHG1(レーン2)およびMybRevt(レー
ン4)における完全長lacZ挿入を有するICP6遺伝子の、予測される9.
0kBフラグメントサイズを表す。Myb34.5(レーン3)において、B−
mybプロモーター/γ34.5カセットによる置換およびICP6のさらなる
欠失が存在し、6.7kBのバンドを与える。野生型F株由来のDNAは、レー
ン1にある。
H1(レーン2)およびMybRevt(レーン4)を有するフラグメントを表
す。Myb34.5(レーン3)へのハイブリダイゼーションは存在しない。
のBstEII−Bbフラグメントを示し、これは、BamHI消化Myb34
.5 DNA(レーン3)における5.3kBのフラグメントおよびF(レーン
1)におけるいくつかのバンドを明らかにするが、MGH1(レーン2)および
MybRevt(レーン4)のいずれにもハイブリダイズしない。
、電気泳動分離した感染細胞の溶解物のオートラジオグラフ像を示す。ヒト神経
芽細胞腫細胞(SK−N−SH)を、1×106細胞/100mmディッシュで
プレートした。24時間後、細胞を、3.0のMOIで感染させた。ウイルス感
染の15時間後、細胞を、メチオニンを含まない培地で手短に洗浄し、次いで、
60μCi S35−メチオニンを含む培地と共に90分間インキュベートした(
Toda,M.ら、Hum.Gene.Ther.9:177−2185(19
98))。標識後、細胞を収集し、SDSを含む緩衝液中に可溶化し、そして1
0%アクリルアミドゲル上で電気泳動した。次いで、ゲルをニトロセルロースに
転写しそしてオートラジオグラフィーに供した。感染細胞のポリペプチドを、M
orse,L.S.ら、J.Virol.26:389−410(1978)に
従って設計した。
におけるウイルス複製を示す棒グラフである。ヒト胚由来初代線維芽細胞(CR
L 7706)を、1×105細胞/60mmディッシュでプレートした。プレ
ーティング後48時間で、培地を、36時間、20μM ロバスタチンを含むD
MEMで置換した(斜線バー)。3連のプレートを計数し、そして種々の変異体
株を1.0の感染多重度(MOI)で感染させた(3連での実験)。感染後48
時間で、細胞および上清を回収し、凍結融解サイクルによってウイルスを遊離さ
せた。並行実験を、10%ウシ胎仔血清(黒バー)を含む培地中に維持させた細
胞を用いて行った。ウイルス力価(output)を、ベロ(Vero)細胞に
対するプラークアッセイによって決定し、log 10 PFU/1×105侵
入(input)ウイルスとして表す(値は、3連での実験の平均を表す)。試
験したウイルスについて、ロバスタチンでの力価は、血清を用いて得られた力価
よりも統計的に低い(スチューデントT検定値;F、p=0.027;hrR3
、p=0.001;MGH1、p=0.011;Myb34.5、p=0.00
1;MybRevt、p=0.003)。
実験において、ラット神経膠肉腫9L細胞(図4A)およびヒトU87ΔEGF
R神経膠腫細胞(図4B)を、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。14日後
(9L)または10日後(U87)に開始し(1日目)、ビヒクルまたは変異体
ウイルス株を、腫瘍に腫瘍内接種した。矢印は、ウイルス注射時(1、3、5、
7日目)を示し、一方、値は、1グループあたり5匹のマウス(9L)または1
グループあたり6匹のマウス(U87ΔEGFR)の平均を示す。図4Aにおい
て、腫瘍体積の差異は、12日目、18日目および33日目の時点で有意であっ
た(p<0.05、分散の一方向反復測定)。
実験において、ラット神経膠肉腫9L細胞(図4A)およびヒトU87ΔEGF
R神経膠腫細胞(図4B)を、ヌードマウスの側腹部に皮下移植した。14日後
(9L)または10日後(U87)に開始し(1日目)、ビヒクルまたは変異体
ウイルス株を、腫瘍に腫瘍内接種した。矢印は、ウイルス注射時(1、3、5、
7日目)を示し、一方、値は、1グループあたり5匹のマウス(9L)または1
グループあたり6匹のマウス(U87ΔEGFR)の平均を示す。図4Bにおい
て、腫瘍体積の差異は、18日目、27日目および34日目の時点で有意であっ
た(p<0.05、分散の一方向反復測定)。表4に示されるように、34日目
のみについては、p<0.005である。
Claims (32)
- 【請求項1】 ヘルペスウイルス変異体であって、以下: (a)γ34.5をコードする遺伝子の両方のコピーにおける欠失または不活
性化変異;ならびに (b)細胞特異的プロモーターおよび/または腫瘍特異的プロモーターの転写
制御下での少なくとも1コピーの該γ34.5遺伝子の挿入 を含む、ヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項2】 前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス1型である、
請求項1に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項3】 前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス2型である、
請求項1に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項4】 ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも1つのさらなる内因性
欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項1に記載のヘルペスウイルス変異
体。 - 【請求項5】 ヘルペスウイルス遺伝子の少なくとも1つのさらなる内因性
欠失または不活性化変異をさらに含む、請求項2に記載のヘルペスウイルス変異
体。 - 【請求項6】 ヘルペスウイルス遺伝子の前記内因性欠失または不活性化変
異が、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、チミジンキナーゼ(TK)、ウ
ラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、またはdUTPaseをコードする遺
伝子である、請求項5に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項7】 導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子の産物が腫瘍性細胞
に対して細胞傷害性である、請求項5に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項8】 前記導入遺伝子が、化学療法剤を活性化または増強し得る産
物、サイトカイン遺伝子、癌抑制遺伝子、または以下:ジフテリア毒素、シュー
ドモナス毒素、抗新脈管形成遺伝子、腫瘍ワクチン遺伝子、放射線感受性遺伝子
、アンチセンスRNA、もしくはリボザイムからなる群から選択される殺腫瘍性
遺伝子をコードする、請求項7に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項9】 前記導入遺伝子が、本来のγ34.5欠失においてか、また
はヘルペスUL40遺伝子座における任意の場所に挿入される、請求項8に記載
のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項10】 前記導入遺伝子が、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子を
コードする、請求項8に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項11】 前記自殺遺伝子が、哺乳動物シトクロムP450である、
請求項10に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項12】 前記哺乳動物シトクロムP450が、P450 2B1、
P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、
P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4である、請求
項11に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項13】 前記腫瘍特異的プロモーターが、DF3(MUC1);A
FP;CEA PSA;チロシナーゼ、B−myb、またはc−erbB2であ
る、請求項2に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項14】 前記腫瘍特異的プロモーターがB−mybである、請求項
13に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項15】 ヘルペスウイルス変異体Myb34.5。
- 【請求項16】 前記細胞特異的プロモーターが、内皮細胞において発現さ
れる血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター;膵臓
のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター;視床下部の細胞にお
いて発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子;破骨細胞およ
びケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモ
ーター;骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター;またはノルア
ドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼ
プロモーターである、請求項2に記載のヘルペスウイルス変異体。 - 【請求項17】 ヘルペスウイルス変異体を使用して、既知の腫瘍特異的プ
ロモーターを過剰発現する腫瘍性細胞を選択的に殺傷する方法であって、以下: 該腫瘍性細胞に該ヘルペスウイルス変異体を感染させる工程であって、該ウイ
ルス変異体が、以下: (a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異;お
よび (b)該腫瘍特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも1コピーの該
γ34.5遺伝子の挿入であって、その結果、該プロモーターが該γ34.5遺
伝子の発現を駆動する、挿入 を含む、工程;ならびに 該腫瘍性細胞を選択的に殺傷する工程 を包含する、方法。 - 【請求項18】 前記ヘルペスウイルス変異体が、ヘルペスウイルス遺伝子
の少なくとも1つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求
項17に記載の方法。 - 【請求項19】 ヘルペスウイルス遺伝子の前記さらなる内因性欠失または
不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、チミジンキナーゼ(
TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、またはdUTPaseをコ
ードする遺伝子における欠失または不活性化変異である、請求項18に記載の方
法。 - 【請求項20】 前記ウイルス変異体がMyb34.5である、請求項19
に記載の方法。 - 【請求項21】 請求項18に記載の方法であって、ここで前記ウイルス変
異体が、化学療法剤を活性化する自殺遺伝子をさらに含み、そして該方法が、該
化学療法剤を投与する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項22】 前記自殺遺伝子が、シトクロムP450をコードする、請
求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 前記シトクロムP450が、P450 2B1、P450 2B6、P450 2A6、P450 2C6、P450 2C8、P450 2C9、P450 2C11、またはP450 3A4からなる群から選択さ
れる、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 前記シトクロムP450がP450 2B1である、請求
項23に記載の方法。 - 【請求項25】 前記化学療法剤が、シクロホスファミドまたはイホスファ
ミドである、請求項23に記載の方法。 - 【請求項26】 前記ヘルペスウイルス変異体における前記腫瘍特異的プロ
モーターが、DF3(MUC1);AFP;CEA PSA;チロシナーゼ、B
−myb、またはc−erbB2である、請求項17に記載の方法。 - 【請求項27】 前記ヘルペスウイルス変異体における前記腫瘍特異的プロ
モーターがB−mybである、請求項26に記載の方法。 - 【請求項28】 前記ヘルペスウイルス変異体がMyb34.5である、請
求項27に記載の方法。 - 【請求項29】 ヘルペスウイルス変異体を使用して、既知の細胞特異的プ
ロモーターを過剰発現する標的細胞集団を選択的に排除する方法であって、以下
: 該標的細胞に該ヘルペスウイルス変異体を感染させる工程であって、該ウイル
ス変異体が、以下: (a)γ34.5をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異;お
よび (b)該細胞特異的プロモーターの転写制御下での少なくとも1コピーの該
γ34.5遺伝子の挿入であって、その結果、該プロモーターが該γ34.5遺
伝子の発現を駆動する、挿入 を含む、工程;ならびに 標的細胞集団を選択的に排除する工程 を包含する、方法。 - 【請求項30】 前記ヘルペスウイルス変異体が、ヘルペスウイルス遺伝子
の少なくとも1つのさらなる内因性欠失または不活性化変異をさらに含む、請求
項29に記載の方法。 - 【請求項31】 ヘルペスウイルス遺伝子の前記さらなる内因性欠失または
不活性化変異が、リボヌクレオチドレダクターゼ(RR)、チミジンキナーゼ(
TK)、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)、またはdUTPaseをコ
ードする遺伝子における欠失または不活性化変異である、請求項30に記載の方
法。 - 【請求項32】 前記細胞特異的プロモーターが、内皮細胞において発現さ
れる血管内皮増殖因子(VEGF)レセプター(flk1)プロモーター;膵臓
のベータ細胞において発現されるインスリンプロモーター;視床下部の細胞にお
いて発現される性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター遺伝子;破骨細胞およ
びケラチノサイトにおいて発現されるマトリクスメタロプロテイナーゼ9プロモ
ーター;骨細胞において発現される副甲状腺ホルモンレセプター;またはノルア
ドレナリン作動性ニューロンにおいて発現されるドパミンβ−ヒドロキシラーゼ
プロモーターである、請求項30に記載の方法。
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