CN109055319A - 抗c-反应蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体，所述抗体能与C‑反应蛋白特异性结合。本发明还涉及包括所述杂交瘤细胞株或单克隆抗体的试剂盒。本发明的单克隆抗体在抗体纯度、可重复性、抗体效价和稳定性方面均展现出很好的性能。

Description

抗C-反应蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗C-反应蛋白的单克隆抗体。

背景技术

C-反应蛋白(CRP)是相对分子质量为115～140KD的血清β球蛋白，因最早发现其和肺炎球菌的C多糖相结合而得名(1930年)，是由5个相同的亚单位以非共价键结合而成的环状五球体，由肝细胞合成，在人的血清、脑脊液、胸腹水等多种体液中均可测出。其他动物类的CRP与人CRP的氨基酸序列有惊人的相似性，因而，人们认为CRP是最保守的蛋白质，对物种的生存有重要意义。CRP半寿期约15h，正常人CRP的浓度很低(0.068～8.2mg/L)，但在组织损伤、急性感染发生后6～8h开始升高,24～48h达峰值，可达正常值的几百倍甚至上千倍，升高幅度与感染程度成正比，炎症治愈后浓度迅速下降，7～12天可恢复正常水平。CRP持续增高提示机体存在慢性炎症或自身免疫疾病，CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受病人的个体差异、机体状态和治疗药物的影响。

近年来研究证明，CRP与人类IgG1的重链第三恒定区(CH3)的氨基酸排列顺序非常相似，与补体C1和某些HLA抗原的氨基酸排列顺序也有相似之处。提示CRP与IgG、C1和HLA抗原具有共同起源。CRP具有与IgG和补体相似的调理和凝集作用，促进巨噬细胞的吞噬，刺激单核细胞表面的组织因子表达及其它免疫调节功能。CRP在炎症或组织损伤时皆可升高，但CRP与其他蛋白升高(2～3倍)不同，可升高100～1000倍，尽管为非特异性的，但对于细菌感染、各种炎症过程及组织坏死与损伤及其恢复期的筛检、监测、病情评估与疗效判断，都有重要的价值。

近年来，存在一些关于抗C-反应蛋白单克隆抗体的研究，但得到的抗C-反应蛋白单克隆抗体的系统性评价(如抗体纯度、可重复性、批间差、抗体效价、稳定性、检测特异性等)不理想，在用于免疫诊断抗体时存在不足，不太适于制备体外诊断试剂。

然而，筛选用于制备体外诊断试剂的单克隆抗体是一个复杂的过程，首先要获得很好的抗原，来制备足够多的抗体，然后对抗体进行系统的评价，获得具有临床相关性的候选抗体，再开发成检测试剂。其中，抗体纯度、可重复性、批间差、抗体效价、稳定性和临床效果等均是重要的评价因素，如抗体纯度直接保证了抗体的稳定性，纯度越高即包括各种蛋白酶在内的杂质越少；可重复性反应了本发明制备抗体工艺的稳定性，重复性越好，生产工艺越稳定；批次间差异始终是单克隆抗体无法回避的一个缺陷，其直接影响抗体本身功能性使用，批间差异明显最终的产品实现相对困难；抗体效价高低反映了一定浓度下与抗原反应的最低滴度，滴度越低效价越高；抗体的稳定性会直接影响最终结果的可靠性，而稳定性较差的抗体对保存条件、操作条件要求更高，从而降低了其作为诊断试剂的实用性及结果的可靠性，并不可避免地引起成本的上升；临床试验则用来说明抗体在诊断某种特定疾病时的效果。

因此，为了在体外诊断方面的应用，本领域急需系统性评价结果较佳，且适用于检测C-反应蛋白的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗C-反应蛋白单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株、含上述单克隆抗体或杂交瘤细胞株的试剂盒以及它们在检测C-反应蛋白中的用途。通过系统性评价，所述抗体在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒，尤其适合制备C-反应蛋白检测试剂盒。

为此，发明人进行了大量研究，通过天然CRP抗原免疫小鼠，细胞融合后经有限系数法克隆至少4次，直到达到单克隆，从得到的众多克隆中筛选到1株能稳定分泌抗体的新型杂交瘤细胞株(Hybridoma)，此杂交瘤细胞株记作杂交瘤细胞株20F8，并于2018年8月23日将其保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2018177，从而完成了本发明。

在第一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018177。

在第二个方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体能够与C-反应蛋白特异性结合。

在一个实施方式中，所述单克隆抗体在反复冻融、长期保存、热加速恶劣条件下具有更优的稳定性和可靠性。

在一个优选的实施方式中，所述单克隆抗体是由本发明的杂交瘤细胞株分泌的抗体。

在第三个方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的杂交瘤细胞株或单克隆抗体。

在一个具体实施方式中，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为荧光免疫试剂盒。

在另一个实施方式中，所述试剂盒为微流体芯片。

在第四个方面，提供了本发明的杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备试剂盒中的用途。

在一个实施方式中，所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒，优选的，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为荧光免疫试剂盒。

在另一个实施方式中，所述试剂盒是微流体芯片，优选的，所述微流体芯片是基于免疫检测的。

在一个实施方式中，所述试剂盒用于检测C-反应蛋白。

此外，还提供了本发明的杂交瘤细胞株或本发明的单克隆抗体在制备用于检测C-反应蛋白的试剂盒中的用途。

本发明的单克隆抗体的有益效果在于，

首先，其抗体纯度≥90％，满足产品特异性要求；

其次，其可重复性变异系数(CV)≤15％，可满足产品生产工艺稳定；

再次，其批间差异系数(CV)≤15％，可满足产品实现稳定；

同时，其抗体效价比体外诊断中通常使用的商购C-反应蛋白单克隆抗体相比高出很多，有着更佳的免疫效果；

然后，其具有比商购C-反应蛋白单克隆抗体更优的长期与热稳定性，也就是说延长了使用期限并能接受相对宽松的储存条件和操作条件们从而大大节约了成本；

最后，临床实验表明本发明的单克隆抗体可用于制备C-反应蛋白检测的荧光免疫试剂盒，检测灵敏度可达0.5mg/L，检测特异性可达100％。

也就是说，本发明的单克隆抗体在抗体纯度、可重复性、批间差、抗体效价、稳定性和检测效果等方面均展现出了很好的性能，从而本发明提供了一种经系统性评价可用于体外诊断且综合能力突出的抗C-反应蛋白单克隆抗体。

附图说明

图1示出了本发明的抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2的纯化后SDS-PAGE电泳图；

图2示出了本发明抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2的纯度检测SDS-PAGE电泳图；

图3示出了本发明抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2反复冻融后的纯度检测SDS-PAGE电泳图；

图4示出了本发明抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2热加速后的纯度检测SDS-PAGE电泳图；

图5示出了评价试剂与比对试剂的临床相关性；

图6示出了本发明抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2制备的试剂盒对于不同样本类型的检测结果；

图7示出了本发明抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2与两种商业化抗人C-反应蛋白单克隆抗体的抗体效价测定结果，其中横坐标为Log(稀释倍数)，纵坐标为OD₄₅₀。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术人员的一本理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

抗体

如本文所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、CDR移植抗体和抗体构建体，如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白；此外，还涉及重组地或合成地产生/合成的抗体。

在优选的实施方式中，抗体是指产生自保藏编号为CCTCC NO:C2018177的杂交瘤细胞株的抗体。

“抗体片段”通常包括亲代抗体的抗原结合区，轻链和/或重链可变区，一个或多个(如六个)CDR的至少一部分，其保留亲代抗体的至少一定的结合特异性。特别地，在本文中亲代抗体是指产生自保藏编号为CCTCC NO:C2018177的杂交瘤细胞株的抗体。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体分子；线性抗体；但链抗体分子，例如，sc-Fv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，当基于摩尔来表达活性时，片段保留至少50％的对C-反应蛋白的结合活性。优选地，和亲代抗体相比，片段保留至少60％、70％、80％、90％、95％或100％的对C-反应蛋白的结合活性。

优选的，抗体片段是指抗体的抗原结合区、轻链和重链可变区或六个CDR。

“抗体衍生物”指抗原包括抗体的保守氨基酸替代物(称为“保守变异体”)，它的生物学活性与亲代抗体相比基本不发生改变。

本发明提供了抗体的单克隆形式。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本上通知抗体的群体的抗体，即，除可能的可以少量存在的自然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。针对单抗原位点，单克隆抗体是高度特异的。单克隆抗体是有利的，因为它们可以通过杂交瘤细胞朱培养获得，并且基本上不受其他免疫球蛋白的污染。

试剂盒

本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如，试纸、含有各种测试所需试剂的试剂盒、微流体芯片等，可以按照本领域技术人员已知的标准步骤来制造试剂盒。

本发明的试剂盒根据需要可包括容器、芯片、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂和/或用于进行诊断/检测所需的其他材料、结构和/或试剂。

实施例中采用荧光免疫测定为例对本发明的试剂盒进行说明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于荧光免疫测定。

本发明的试剂盒包括产生自保藏编号为CCTCC NO:C2018177的杂交瘤细胞株的抗体，其可以以本领域常规的方式存在，例如，以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相载体上(例如，膜、板、珠、粒子(如磁粒子)等)，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。

由于运输及使用地点等客观因素，试剂盒往往需要适合在各类复杂环境中进行现场检测，因此，原料的稳定性是制约试剂盒结果的重要因素之一。如下文实施例11、实施例12中所示出的，本发明的抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2作为荧光免疫试剂盒的原料在极端条件下较常规抗C-反应蛋白单克隆抗体拥有更好的稳定性，从而使试剂盒的结果可靠性增强并变相地降低了成本。

本发明的抗体可以0.1～10μg/ml的浓度来使用，优选为1～5μg/ml，更优选为1.5μg/ml。

本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他材料包括但不限于，除本发明的抗体外的其他抗C-反应蛋白抗体、与C-反应蛋白抗体结合的抗原和/或C-反应蛋白。上述其他材料可以以本领域常规的方式存在，例如，以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相载体上(例如，膜、板、珠、粒子(如磁粒子)等)，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。

本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他结构包括但不限于用于取样结构、用于进行对照结构和/或用于观察检测过程或结构的结果。

本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他试剂包括但不限于洗涤剂、显色剂和/或终止剂。

在一个实施方式中，在本发明试剂盒中的抗体是可检测地标记的。可以使用本领域技术人员已知的任何标记物和标记方法。例如，在本发明中可以使用的标记物包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物，但本发明不限于此。

常用的标记物可包括酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素(如³²P或¹²⁵I)等、生物素、地高辛、胶态金属(如胶体金等)、荧光染料(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、化学发光化合物或生物发光化合物(如二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓等)。可以使用任何本领域众所周知的标记步骤，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等。

在一些实施方式中，用于进行诊断/检测所需的其他材料中的一种或多种也可以为可检测地标记的。

在一个优选的实施方式中，本发明的试剂盒是用于检测C-反应蛋白的试剂盒。

用途

本发明的抗C-反应蛋白抗体或杂交瘤细胞株可用于与C-反应蛋白的特异性反应相关的任何目的。优选的，本发明的抗体或杂交瘤细胞株可用于检测C-反应蛋白。

本发明的抗体或杂交瘤细胞株可对来源于人类的生物样品进行检测。

如本文中所使用的，“生物样品”是指精液、淋巴、血清、血浆、尿、滑液或脊髓液。在优选的实施方式中，生物样品是指血液、血清或血浆。

可以使用免疫测定的方法定量或定性检测C-反应蛋白的存在，所述免疫测定通常包括将生物样品与本发明的抗体和/或检测所需的其他材料一同孵育或依次接触，并通过多种本领域熟知的技术检测结合的抗原。

检测方法包括但不限于放射自显影、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应、放射性同位素法或非放射性同位素法等。这些方法尤其包括Western印迹、重叠测定、RIA(放射免疫测定)和IRMA(免疫放射免疫测定)、GIA(胶体金免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)、以及CLIA(化学发光免疫测定)。

下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，为可以通过商购获得的常规产品。

实施例1小鼠的免疫

将天然CRP抗原(桂林英美特生物技术有限公司，批号170106-S)用生理盐水稀释到2.0mg/ml，与TiterMax Gold Adjuvant(Sigma公司，货号T2684-1ML)等体积混合，并温和的涡流混匀，用1ml的移液器上下轻轻吹打5次，以每只BALB/c小鼠(成都达硕实验动物中心，6周龄雌性，2只)终体积50-100μL实施腿部肌肉注射，天然CRP抗原(25μg/只BALB/c小鼠)与佐剂现配现用。3周后(21天)按以上方法进行第二次免疫，2周后(第一次免疫后的35天)采其尾血，用ELISA间接法检测其血清中抗体效价，血清效价大于1：10⁶，即可用于细胞融合。

实施例2杂交瘤细胞系的制备

2-1饲养细胞的制备

以正常的12周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c取眼血拉颈处死，0.1％新洁尔灭浸泡1分钟，转入75％酒精浸泡1分钟，于超净台内用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射2mlRPMI1640培养液至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。用已加入20％新生牛血清、1％双抗的RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为2-5×10⁵个/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2培养。

2-2免疫脾细胞的制备

取实施例1中免疫血清效价达到1：10⁶的BALB/c小鼠摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，0.1％新洁尔灭浸泡1分钟，转入75％酒精浸泡1分钟，在超净台内，于无菌的平皿上掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换剪镊，用无菌剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml RPMI1640培养液的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml RPMI1640培养液的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏)，使脾细胞进入平皿中的RPMI1640培养液。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用RPMI1640培养液离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10mlRPMI1640培养液混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠1×10⁸-2.5×10⁸个脾细胞。

2-3骨髓瘤细胞的制备

融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤细胞株是至关重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少5天才可能恢复。在培养过程中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10％小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新分瓶培养。典型的倍增时间为14-16小时。小鼠骨髓瘤细胞(迈克生物股份有限公司于2010年11月5日冻存)悬液制备方法：于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合实验约需2-3瓶25cm²培养瓶培养的细胞进行准备)。融合当天，用玻璃滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管内。1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。加入30ml RPMI1640培养液，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml RPMI1640培养液，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％胎酚蓝作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml中，混匀，用血球计数板计数。细胞密度(个/ml)＝(4大格细胞总数÷4)×10⁴×稀释倍数。

2-4细胞融合及杂交瘤细胞株的选择性培养

将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞按总量1：6的比例混合于50ml离心管中，补加RPMI1640培养液至30ml，充分混匀。1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；置37℃水浴中预热。用1ml吸管在1分钟左右(最佳时间为45秒)加预热至40℃的50％PEG(PH 7.4)1ml，边加边轻轻晃动混匀。用玻璃滴管在90秒内加20-30ml预热至37℃的RPMI1640培养液；20-37℃静置10分钟。700r/min离心5-10分钟，弃上清。重悬于含有1％HAT与20％新生牛血清的RPMI1640培养液中，平均分装入10个96孔细胞培养板。37℃，5％CO2培养，次日补加含有1％HAT与20％新生牛血清的RPMI1640培养液至孔体积的90％。5天后用HAT培养基换出孔内1/2培养基，7天后再次换出孔内1/2培养基。

2-5阳性杂交瘤细胞株的筛选

用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释天然CRP抗原至5μg/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl，用于检测融合后细胞培养上清。放置于2-8℃冰箱中过夜，第二天弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，150μl/孔，37℃封闭2小时，拍干，真空封装待用。细胞融合后第九天，取细胞上清100μl于上述96孔酶标检测板中，37℃孵育40min，ELISA洗液洗板五次后加入10000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司生产，批号011816)100μL/孔，37℃孵育30min同上洗板后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育10min，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，多功能读数仪检测450nm吸收值。以融合时小鼠血清稀释至100倍为阳性对照，RPMI1640完全培养液作为阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，样本OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。

2-6阳性杂交瘤细胞株的克隆化

按照实施例2 2-1制备饲养细胞的方法铺板饲养细胞，制备阳性杂交瘤细胞株悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含1个细胞的稀释度，筛选阳性孔同实施例2 2-5连续克隆4次及以上，直至达到100％单克隆。

2-7阳性杂交瘤细胞株的冻存

将实施例2 2-6中克隆到100％的单克隆且间接法检测为阳性的细胞，转入24孔继续培养，待细胞长满80％时转入细胞瓶扩大培养后，待细胞长满细胞瓶80％时分瓶传代，传代的细胞生长至对数期时，用适量无血清RPMI-1640培养基分散细胞瓶内细胞，收集细胞悬液于锥形离心管中，记录细胞悬液体积V，取适量细胞悬液进行细胞计数，得到细胞悬液密度(个/ml)，其余1000rpm离心5min后弃上清液，根据细胞密度和离心前体积算出沉淀的细胞数，向细胞沉淀中加入适量冻存液调整细胞密度至4-8×10⁶个/ml(取适量进行计数确认，如果细胞数未在范围内，则重新离心按照细胞计数总量，重新加入适量冻存液，最终使细胞浓度在4-8×10⁶个/ml)，然后分装于无菌冻存管中，每只冻存管分装重悬细胞冻存液0.5ml。细胞融合获得13株能稳定分泌抗人C-反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，见下表1。其中，杂交瘤细胞株20F8-E7-F9所分泌的抗体在用于检测C-反应蛋白时效果最优，此杂交瘤细胞株记作杂交瘤细胞株20F8，于2018年8月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2018177。

表1筛选得到的稳定分泌抗C-反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株

杂交瘤细胞株	杂交瘤细胞株	杂交瘤细胞株
			3B11-D9-B5-F9-G6	3B10-G4-G7	7G12-F6-B6
8D6-C10-D10-G8	4A10-D4-B2	19B3-A1-F2
			1D5-B3-B8	2B5-F9-H12-D8	20F8-E7-F9
22D3-B8-F10-C3	4H5-A8-F10	3E5-B10-G4-F2
			4H6-E2-G5-F3-D6

实施例3单克隆抗体的制备

选12-14周健康的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.3-0.5ml佐剂(北京博奥龙免疫技术有限公司)，15天左右(12-18天)，然后注射杂交瘤细胞株，每只小鼠腹腔注射0.5～1×10⁶个杂交瘤细胞株。接种细胞9-12天后可产生腹水，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可拉颈处死小鼠，用滴管将腹水吸入15ml离心管中，一只小鼠可获1-5ml腹水。收集的腹水离心取上清，取小样放于-20℃以下冰箱保存备用。

实施例4单克隆抗体的纯化

将-20℃以下冻存抗C-反应蛋白单克隆抗体2腹水提前一天置于2-8℃冰箱中解冻过夜。第二天，将腹水混合，2-8℃、12000rpm离心20分钟，去油脂和沉淀，上清用MabLoading Buffer稀释5-10倍，再用0.22μm滤膜过滤。将上述滤后液上样5mL-mabselectsure介质，使用AKTA纯化仪，收集穿透。上样完成后用平衡液平衡层析柱至基线平稳，使用洗脱液洗脱目的蛋白，收集大于100mAu的洗脱峰，洗脱完成后层析柱用0.1M氢氧化钠进行清洗，然后保存层析柱。对洗脱的目的蛋白进行中和，每ml洗脱液滴加0.1ml中和液。混匀中和后，将蛋白置于5L透析液中透析，每两个小时换一次液，换液3次。将透析好的目的蛋白12000rpm离心20分钟，上清即为最终成品，并进行电泳(如图1所述)和BAC浓度测定。

实施例5单克隆抗体的浓度检测

根据需要检测样品的数量，配制适量BCA工作液(试剂A：试剂B＝50：1)(Thermo，货号：23225，批号：TC263599)，充分混匀，备用。稀释蛋白标准品，准备9个干净的1.5ml EP管，依次标记为A、B、C、D、E、F、G、H、I。按下表2稀释蛋白标准品：

表2蛋白校准品稀释

从A-I管中各取25μl加入到96孔酶标板中，抗体用20mM PBS缓冲液以2倍的稀释方式逐一稀释得到各稀释度抗体。分别在酶标板中加入各稀释度的抗体25μl，在各孔中加入200μLBCA工作液，避光37℃孵育30分钟。孵育完成后立即在酶标仪检测562nm吸光光度值。根据蛋白标准品测定数值制作出标准曲线，然后根据标准曲线计算出抗体的浓度。

实施例6单克隆抗体的纯度检测

组装好电泳玻璃板，配制下层12％的分离胶和上层5％的浓缩胶的SDS-PAGE胶。组装好凝胶电泳槽，加入适量的1×电泳缓冲液。在测定抗体浓度后，取少量抗体用20mM PBS稀释到大约1mg/ml浓度，取40μl稀释后的抗体加入10μl的5×样品缓冲液，混匀后煮沸10分钟，再以5000rpm离心10分钟，备用。去上清10μl上样，先以70V电泳至浓缩胶与分离胶分界线处(约15分钟)，以140V电泳直至溴酚蓝即将跑出凝胶停止电泳。电泳完成后，从电泳玻璃板上将SDS-PAGE胶剥离下来，放入染色液中，清洗玻璃板，晾干备用。先用考马斯亮蓝染液浸染SDS-PAGE胶30分钟，再用考马斯亮蓝脱色液将胶洗脱至背景无色(可适当热脱色)。用凝胶成像仪对PAGE胶进行拍照，通过软件对图像灰度进行分析，估算抗体纯度。检测抗体电泳图各条带的分子量和蛋白带型是否正确，电泳结果如图2所示。

实施例7杂交瘤细胞株上清效价检测

用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释天然CRP抗原(桂林英美特技术有限公司，批号170106-S)至5μg/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2-8℃过夜，第二天弃掉孔中液体，ELISA洗板机洗三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，150uμl/孔，37℃封闭2h弃液体，拍干，用于检测细胞培养上清、腹水及抗体效价。细胞上清效价检测，从第1孔至第10孔以0.01M pH7.2的PBS缓冲液2倍逐级稀释。第11孔以融合时小鼠血清稀释至100倍作阳性对照，第12孔以RPMI 1640完全培养液作阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，当OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为杂交瘤细胞株培养上清效价，此杂交瘤细胞株培养上清效价可达1：1024，见下表3。

表3杂交瘤细胞株上清效价结果

实施例8腹水效价检测

第1孔为原倍腹水，以0.01M pH7.2的PBS缓冲液从第2孔至第7孔10倍逐级稀释，从第8孔至第10孔以2倍逐级稀释。第11孔以融合时小鼠血清稀释至100倍作阳性对照，第12孔以RPMI 1640完全培养液作阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，当OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为腹水效价，此杂交瘤细胞株20F8所制备的抗C-反应蛋白单克隆抗体(记作抗C-反应蛋白单克隆抗体2)的腹水效价可达1:3.2×10⁶。

实施例9抗体效价检测

先将实施例4中制备的纯化后的抗体以0.01M pH7.2的PBS缓冲液统一稀释为1mg/ml，后再稀释100倍作为初始第1孔，从第2孔开始至第11孔做3倍逐级稀释。抗体效价判定标准：以log(稀释度)为横坐标，以OD值为纵坐标作曲线，曲线方程为y＝min+(max-min)/(1+10^((logEC50-x)×Hillslope))，采用sigmaplot软件拟合曲线，取效价＝10logEC50。结果显示抗C-反应蛋白单克隆抗体2效价为2.43×10⁴。以同样方法对照检测2种商业化抗人C-反应蛋白单克隆抗体B和C，通过拟合，B抗体中值效价为1：1.6×10⁴，C抗体中值效价为1：2.8×10³，低于本发明的杂交瘤细胞分泌的抗体。图7示出了效价测定结果。

实施例10试剂盒性能测定

(1)抗体的荧光微球标记

取3ml荧光微球，按稀释10倍的比例加入0.02M MES缓冲液27ml，再加入0.12mlEDC·HCL溶液(按1mg(微球):0.02mg(EDC)的量)，混匀后，转入100ml蓝盖试剂瓶中，置于摇床上(设置转速220转/分)匀速搅拌，避光活化20min。将活化后液体转入50ml离心管中，设置参考离心力17320g，设置温度15℃，离心20min，去掉上清液，保留沉淀。取6mg抗C-反应蛋白单克隆抗体2，用荧光标记缓冲液稀释至60ml，浓度为0.1mg/ml。转入500ml蓝盖试剂瓶中。用上述得到的液体复溶离心保留的沉淀，超声均匀后将液体转入500ml蓝盖试剂瓶中，置于摇床上(设置转速220转/分)匀速搅拌，常温避光标记2小时。快速加入等体积(即60ml)的终止液(终止液需提前恢复至室温)，继续搅拌反应30min。将反应后的液体转入50ml离心管内，设置参考离心力17320g，设置温度15℃，离心20min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀用30mL微球洗液复溶，确保完全复溶后，将液体转入50ml离心管中，设置参考离心力17320g，设置温度15℃，离心20min，去掉上清液，保留沉淀。沉淀用60ml标记稀释液复溶，超声均匀，确保完全复溶(备注：复溶体积为荧光微球标记前体积的20倍)。标记完后，取20μl标记复合物，加180μl纯化水混匀，使用分光光度计在波长600nm处测定OD值。于2-8℃以下避光贮存，效期为24个月。

(2)C-反应蛋白检测试剂盒的制备(荧光免疫层析法)

采用荧光免疫和侧向层析检测技术，按照双抗体夹心法原理进行检测。

将待测样本加入反应液混匀，样本中的CRP抗原和反应液中的荧光标记的抗C-反应蛋白单克隆抗体2结合形成抗原抗体夹心复合物，将混合样本滴加到检测卡加样孔中，在层析作用下沿着硝酸纤维素膜向前扩散，复合物被固定在检测线上的抗C-反应蛋白单克隆抗体1所捕获，层析膜上质控区包被有羊抗兔IgG多克隆抗体,可以直接和反应液中荧光标记的兔IgG结合。样本中的CRP抗原越多，检测线上积聚的荧光复合物越多，荧光复合物数量与荧光信号值呈相关性，经仪器测定即可得出样本中CRP的浓度。

(3)空白限的测定

用上述方法(2)中制备的检测试剂盒，同时检测三批抗C-反应蛋白单克隆抗体2，重复测定空白样本20次，计算其平均值和标准差SD，计算即为空白限，空白限应≤0.20mg/L。测定结果如下表4，测定结果显示三批试剂盒的空白限检测结果均满足产品技术要求。

表4空白限的测定结果

(4)准确度的测定

用上述方法(2)中制备的检测试剂盒，同时检测三批抗C-反应蛋白单克隆抗体2，取浓度为5.00mg/L(允许浓度偏差为±25％)的企业内部控制物，按说明书操作步骤进行测定，重复测定3次，计算每次测定值的相对偏差(Bi)，3次结果均符合产品技术要求，即判为合格。如果大于等于1次的结果不符合要求，应重新连续测试20次，并计算每次测定值的相对偏差(B)，如果大于等于19次测定的结果符合产品技术要求，即判为合格。计算公式为：

式中：B--相对偏差；xi—每次测定值；T--企业内部控制物标示值。

测定结果如下表5，测定结果显示三批试剂盒的准确度检测结果均满足产品技术要求。相对偏差在±20.0％范围内。

表5准确度测定结果

(5)线性的测定

用上述方法(2)中制备的检测试剂盒，同时检测三批抗C-反应蛋白单克隆抗体2，取接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度(x_i)，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限，按说明书操作步骤进行测定，对每一浓度的样本均重复测定3次，分别计算测定结果的均值(y_i)。以理论浓度(x_i)为自变量，以测定结果均值(y_i)为因变量求出线性回归方程，计算线性回归方程的相关系数r，结果应符合产品技术要求。测定结果如下表6，测定结果显示三批试剂的线性检测结果均满足产品技术要求。在0.50mg/L～150.00mg/L范围内，相关系数(r)≥0.990。

表6线性测定结果

(6)重复性的测定

用上述方法(2)中制备的检测试剂盒，同时检测三批抗C-反应蛋白单克隆抗体2，取浓度为3.00mg/L和60.00mg/L(允许浓度偏差为±25％)的企业内部控制物，按说明书操作步骤进行测定，重复测定10次，计算其平均值(M)、标准差(SD)和变异系数(CV)，CV应符合产品技术要求，批间变异系数(CV)应≤15.00％。计算公式为：

式中：

CV--变异系数；

SD--10次测定结果的标准差；

M--10次测定结果的测定均值。

测定结果如下表7，测定结果显示三批试剂盒的重复性检测结果均满足产品技术要求。

表7重复性测定结果

(7)批间差的测定

用上述方法(2)中制备的检测试剂盒，同时检测三批抗C-反应蛋白单克隆抗体2，取浓度为3.00mg/L(允许其浓度偏差为±25％)和60.00mg/L(允许其浓度偏差为±25％)的样本，各重复测定10次，计算30次测定结果的平均值(M)、标准差(SD)和批间变异系数(CV)。批间变异系数(CV)应≤15.00％。计算公式为：

式中：

CV--变异系数；

SD--30次测定结果的标准差；

M--30次测定结果的测定均值；

测定结果如下表8，测定结果显示三批试剂的批间差检测结果均满足产品技术要求。

表8批间差测定结果

实施例11反复冻融稳定性的检测

11-1反复冻融效价(特异性)检测

将上述其中两批抗体放于-20℃反复冻融0次、1次、2次、3次、4次、5次后用0.1MPBS稀释至1mg/ml，备用。用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释天然CRP抗原至5ug/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2-8℃过夜，第二天弃掉孔中液体，ELISA洗板机洗三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，150μl/孔，37℃封闭2h弃液体，拍干，将上述稀释至1mg/ml的单抗分别梯度稀释(第1孔20倍稀释，第2孔做10倍稀释，从第3孔至第11孔连续2倍梯度稀释稀释，12孔为阴性对照)后37℃孵育40min，倒掉上清，洗板4次，拍干加入10000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司生产，批号011816)100μL/孔37℃孵育30min后，倒掉上清，洗板4次，拍干，加入含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育10min，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，多功能读数仪检测450nm吸收值。检测结果如下表9，检测结果显示反复冻融0次和5次效价无明显差异，该抗体反复冻融稳定性较好。

表9反复冻融效价(特异性)检测结果

11-2反复冻融纯度检测

方法同实施例6，进行SDS-PAGE，结果如图3，从图中可以看出反复冻融0次和5次本发明抗体纯度无明显差异，反复冻融5次本发明抗体不降解。

11-3反复冻融后配成试剂盒准确度检测

方法同实施例10(4)，结果如下表10，结果显示反复冻融5次后，本发明抗体功能性仍能满足产品设计要求。

表10反复冻融后配成试剂盒准确度检测结果

实施例12热稳定性的检测

12-1效价检测

将上述三批抗体的前两批抗体37℃放置7天和14天。后用0.1MPBS稀释至1mg/ml，备用。方法同反复冻融效价检测，结果如下表11，结果显示将本发明抗体放置37℃0天和37℃14天，效价无明显差异。

表11

12-2纯度检测

方法同反复冻融纯度检测，结果如图4，从图中可以看出本发明抗体分别放置37℃0天和37℃14天，纯度无明显差异，本发明抗体热稳定性较好。

12-3 37℃加速后，配成试剂盒准确度检测

方法同反复冻融准确度检测，结果如下表12，结果显示本发明抗体分别放置37℃0天和37℃14天功能性仍能满足产品技术要求。

表12

实施例13临床试验

13-1相关性检测

用比对试剂超敏C-反应蛋白测定试剂盒(胶乳增强免疫透射比浊法)(迈克生物股份有限公司)简称胶乳比浊与评价试剂C-反应蛋白测定试剂盒(荧光免疫层析法)简称迈克POCT同时检测100例血浆样本，观察评价试剂(本发明的抗体试剂)与比对试剂的测定结果的相关性是否满足预期要求。比对结果如下表13和图5，表13显示评价试剂与比对试剂检测同一样本的结果，图5显示评价试剂与比对试剂的临床相关性，评价试剂检测临床样本与比对试剂具有临床等效性。

表13相关性检测结果

13-2不同样本类型检测

同时使用迈克POCT试剂(评价试剂)检测同一人的血清、血浆和全血33例，验证不同样本类型测定结果的一致性。(备注：检测结果单位mg/L)，检测结果如下表14和图6，可以看出评价试剂测定不同样本类型时检测结果一致性较好。

表14同一人的不同样本类型检测结果

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株20F8，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018177。

2.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌。

3.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者所述试剂盒是微流体芯片。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒为荧光免疫试剂盒。

6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备试剂盒中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的用途，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者所述试剂盒是微流体芯片；优选为荧光免疫试剂盒。

9.根据权利要求6所述的用途，所述试剂盒用于检测C-反应蛋白。

10.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于检测C-反应蛋白的试剂盒中的用途。