CN103396484A - 一种检测四环素的单链抗体及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测四环素的单链抗体及其编码基因与应用。本发明提供的单链抗体，是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；所述重链可变区如序列表的序列１自Ｎ末端第1至118位氨基酸残基所示；所述轻链可变区如序列表的序列１自Ｎ末端第134至244位氨基酸残基所示。本发明克服了以往单克隆抗体制备的整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作的不足，提供一种新的基因工程单链抗体，应用该抗体，研制检测四环素的胶体金免疫试纸条，确定胶体金免疫试纸条试剂配方及生产工艺，用于检测四环素残留，具有简便、快速、廉价的特点，其应用具有广阔前景。

Description

一种检测四环素的单链抗体及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种检测四环素的单链抗体及其编码基因与应用。 

背景技术

四环素（Tetracycline，Tc）是四环素类抗生素的一种，由放线菌属产生。四环素为广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌、立克次氏体等均有抑菌作用，多用于立克次体、衣原体、支原体等非细菌性感染和布氏杆菌病，以及呼吸道、胆道、尿路及皮肤组织感染的治疗。用于畜禽生产，曾作为一种药物添加剂，用于防治肠道感染和促生长，但容易诱导耐药菌株和食品中药物残留。人们长期食用这种动物食品及其制品，会危及人类健康，其毒性反应主要表现在对胃、肠、肝脏的损害、过敏反应、二重感染、畸胎及严重肝损伤以及牙齿的染色。近年来随着动物疫病的不断增加和复杂化，四环素的使用日趋泛滥，使其在动物性食品中过量残留，己成为危及人类身体健康的公共卫生问题，并严重影响到贸易出口，从而受到国内外的普遍关注，已被列入《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部2002年235号公告）。因此，对动物性食品中残留的四环素进行特异、灵敏、快速的检测是非常必要的。  

现常用于四环素残留检测的方法主要有微生物法、仪器分析法和免疫分析法。微生物检测法虽然经济、操作简便，但在样本中有其他微生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限制；高效液相色谱分析法、气谱、气质联机法等单纯的仪器分析方法，虽然灵敏度高，但样本前处理及测定操作烦琐，费用高，不适宜于大量样本筛查。而免疫分析法具有操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点。  

目前，用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗体。制备单克隆抗体或多克隆抗体的整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作。单链抗体是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一个短肽链连接后融合表达出来的抗体片断，具有分子量小、特异性高、结合力强、易于利用基因工程技术操作等优点。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测四环素的单链抗体及其编码基因。 

本发明所提供的单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-118位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第134-244位氨基酸残基所示。  

上述单链抗体中，所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第119-133位氨基酸残基所示。  

所述编码基因为如下（1）、（2）、（3）、（4）或（5）所示：  

（1）所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5’末端起第1-354位核苷酸所示的DNA分子；  

（2）所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5’末端起第400-732位核苷酸所示的DNA分子； 

（3）所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的5’末端起第355-399位核苷酸所示的DNA分子；  

（4）序列表中序列2的5’末端起第1-732位核苷酸所示的DNA分子；  

（5）在严格条件下与（1）、（2）或（3）或（4）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。  

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌和表达盒也属于本发明的保护范围。 

单链抗体的制备方法，包括以下步骤： 

免疫原的制备：采用邻联甲苯胺法将载体蛋白与四环素偶联，合成免疫原和包被原； 

动物免疫注射：以6-8周龄雄性Balb/c小鼠为免疫动物，腹部皮下多点注射免疫或加强免疫； 

抗体的筛选：以pCANTAB5E为表达载体，得到鼠源免疫单链抗体库。用ELISA方法筛选得到带有特异性的抗四环素的单链抗体的噬菌体颗粒； 

抗体的制备：根据权利要求2所述单链抗体序列，合成序列表序列2自5’末端起第1-732位核苷酸所示基因，在pET32a中诱导表达，得到组氨酸标签（His-tag）的单链抗体蛋白。 

本发明的单链抗体（ScFv）是用基因工程方法将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段连接肽（Linker）连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中经济地大规模生产，从而使得免疫检测用抗体的生产变得非常容易、简便和经济，进而大大减少检测试剂的费用，比杂交瘤细胞培养得到单抗的方法要简单得多。 

本发明还提供了所制备的单链抗体在检测动物性食品中四环素残留的应用。 

所述胶体金垫包被有胶体金标记的单链抗体； 

所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有四环素半抗原与载体蛋白的偶联物； 

所述质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体； 

所述四环素半抗原为盐酸四环素。 

以单链抗体为核心试剂制备检测四环素胶体金免疫试纸条，确定免疫胶体金试纸条中各种试剂的配方以及生产工艺，对试纸条性能进行鉴定，并确定了检测样品的前处理方法。 

本发明的有益效果是：通过基因工程技术产生的四环素单链抗体，能够大量生产，可用于制备检测四环素的胶体金试纸条，具有灵敏度高、特异性强和操作简便的特点，适合于对大量样品的筛检，应用前景十分广阔。 

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。 

图1为Tc-BSA紫外鉴定图谱。 

图2为四环素间接竞争ELISA标准曲线，其中A为四环素重链与轻链基因PCR扩增示意图，1为轻链基因PCR扩增产物；2为重链基因PCR扩增产物；M为100bp DNA Ladder Marker。B为四环素单链抗体全长基因PCR扩增示意图。1为四环素单链抗体全长基因PCR扩增产物；M为100bp DNA Ladder Marker。 

图3为基因PCR扩增示意图，其中M为λDNA HindⅢ Marker；1、2、3、4、5分别代表5个不同的阳性菌株DNA酶切结果；M0为DL2000 DNA Marker。 

图4表达特异性单链抗体的代表性阳性菌株质粒酶切鉴定图，其中M为蛋白质相对分子量Marker；ScFvTc为纯化的pET32a-ScFvTc ( BL21)诱导表达产物 沉淀；32a为pET32a ( BL21)诱导表达产物。 

图5特异性四环素单链抗体的Western blot检测结果。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。  

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。  

实施例一  抗体的制备  

A．人工免疫抗原和包被抗原的合成 

人工免疫抗原和包被抗原的合成采用邻联甲苯胺（O-tolidine）法，制备方法如下。 

（1）将250mg 3,3'-二甲基联苯胺（O-tolidine）溶解于45mL冰冷的HCL溶液（0.2M）中，避光条件下向该溶液中逐滴加入5 mL 2.5M的NaNO₂溶液，置于4℃，避光反应1h； 

（2）称取50mg四环素，100mg牛血清白蛋白（BSA）溶解于5mL的硼砂缓冲液中（0.05M，pH8.5）； 

（3）取（1）溶液2.5mL逐滴加入（2）中，避光反应2h； 

（4）将（3）得到的反应产物在4℃条件下用PBS缓冲液（0.01M，pH7.4）透析3天，所得溶液高速离心30 min，收集上清，冻存于-20℃备用，所得四环素的免疫原记为Tc-BSA； 

（5）对BSA蛋白标准品及透析后的免疫原Tc-BSA用紫外分析仪在220nm-400nm之间进行紫外扫描，从图1的结果可判定偶联成功，偶联比为9:1；同样方法制备包被原，所称取四环素与卵清白蛋白（OVA）分别为20mg与80mg，所制得的包被原记为Tc-OVA，其偶联比为16：1。 

B．动物免疫 

采用6-8周龄雄性Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原是Tc-BSA，每次免疫剂量为50μg/只小鼠，腹部皮下多点注射，每2周免疫1次，共免疫三次。首次免疫使用等量弗氏完全佐剂乳化抗原，以后均使用等量弗氏不完全佐剂乳化抗原。 

C．免疫血清效价测定 

以上免疫鼠在第三次免疫后，眼眶静脉采血，用间接ELISA法和间接竞争ELISA方法测定血清抗体效价[2]。选取血清效价较高的小鼠进行加强免疫，免 疫剂量为100μg/只，免疫三天后取小鼠脾脏进行下一步实验。 

D．抗体的筛选  

（1）设计鼠源抗体重链及轻链可变区的扩增引物[3]及(Gly4Ser)3形式的连接肽，并在Linker两端根据重链及轻链的序列分别添加互补序列。 

（2）取上述Balb/c小鼠的脾细胞，Trizol一步法提取脾细胞总RNA，纯化得到mRNA，再逆转录得到cDNA。 

（3）以cDNA为模板分别扩增得到重链可变区（VH）、轻链可变区（VL）基因，结果如图2A所示，经叠加延伸聚合酶链式反应（Overlap-PCR）将VH、VL基因随机拼接为单链抗体基因（ScFv），结果如图2B所示。 

（4）将ScFv与载体pCANTAB5E连接得pCANTAB5E-ScFv，并转化大肠杆菌TG1，得到鼠源免疫单链抗体库。 

（5）以微孔法进行筛选，将完全抗原Tc-OVA包被于96孔板中，借助抗原抗体特异性结合及噬菌体侵染扩增，经过6轮“吸附-洗脱-扩增”循环，实现对单链抗体的富集筛选（表1）。 

表1 噬菌体抗体库的亲和富集效果 

（6）在最后一轮富集后，随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。 

（7）提取代表性阳性菌株的质粒DNA，酶切鉴定方法进行验证，结果如图3所示。 

（8）对阳性菌株进行重复试验，确定稳定性最好的阳性菌株pCANTAB5E-ScFvTc。 

（9）提取稳定性最高的阳性菌株pCANTAB5E-ScFvTc的质粒DNA，序列测定得到其相应的核苷酸序列（序列表中序列2）。  

该单链抗体由重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连接组成。该抗体的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第1-118位氨基酸残基为重链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第134-244位氨基酸残基为轻链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第119-133位氨基酸残基为短肽序列。 

该单链抗体的编码基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5’末端起第 1-354位核苷酸编码重链可变区，自序列2的5’末端起第400-732位核苷酸编码轻链可变区，自序列2的5’末端起第355-399位核苷酸编码短肽。 

E．抗体的制备 

表达载体pET32a购自德国NOVAGEN公司；大肠杆菌BL21购自德国NOVACEN公司；蛋白纯化用HisLinkTM Protein Purification Resin购自美国Promega公司，产品目录号为V8823。  

重组菌制备：利用DNA重组技术制备单链抗体的表达载体。 

（1）合成序列表中序列2自5’末端起第1-732位核苷酸所示基因，并在两端引入酶切位点Xba I和Not I，合成载体为pUCm-ScFvTc。 

（2）限制性内切酶Xba I和Not I双酶切pUCm-ScFvTc，回收目的基因片段。 

（3）限制性内切酶Xba I和Not I双酶切表达载体pET32a，回收载体大片段。 

（4）连接目的基因与载体片段，连接产物转化大肠杆菌，筛选培养，挑取单克隆。 

（5）将单克隆接种入液体培养基进一步培养，提取质粒，酶切和测序验证，结果测得的序列如序列2自5’末端起第1-732位核苷酸所示，表明重组载体中基因插入方向和序列均正确，将阳性重组载体记作重组表达载体pET32a-ScFvTc。  

（6）采用氯化钙法将重组表达载体pET32a-ScFvTc转化大肠杆菌BL21，抗性筛选，经菌液PCR及质粒酶切验证，得到含有重组表达载体pET32a-ScFvTc的重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌pET32a-ScFvTc ( BL21)。   

2×YT培养液的组成：由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水组成，每1L 2×YT培养液中胰蛋白胨的浓度为1.6％、酵母提取物的浓度为1％、NaCl的浓度 为0.5％；各百分含量均为质量百分含量。  

含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×YT培养液是按照如下方法得到的：向2×YT培养液中添加氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨苄青霉素在溶液中的终浓度为100μg·mL^-1，使氯霉素在溶液中的终浓度为34μg·mL^-1，使葡萄糖在溶液中的终浓度为1％；各百分含量均为质量百分含量。 

重组菌发酵：利用蛋白诱导表达技术结合生物工程发酵技术获得重组大肠杆菌pET32a-ScFvTc ( BL21)的表达产物，即单链抗体粗制液； 

（1）将重组大肠杆菌pET32a-ScFvTc ( BL21)的单个阳性菌落接种至含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×YT培养液中；  

（2）37℃振摇，至培养体系A₆₀₀为0.6时，收集细菌并重悬于2mL LB液体培养基中，按1：20的体积比将菌悬液接种至50 mL含相同浓度抗生素的LB液体培养基中（酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，氨苄青霉素100μg·mL^-1，氯霉素34μg·mL^-1）； 

（3）37℃振摇，至培养体系的A₆₀₀为0.6时，加IPTG（0.7mM）诱导； 

（4）30℃振摇2.5h后停止培养， 4℃，5000r·min^-1，离心10min，收获细菌； 

1）用洗涤液（20 mM Tris、0.15 M NaCl，pH 8.0）洗涤1次，加溶菌液（20mM Tris、1% Triton X-100、250 μM PMSF、终浓度20mg·mL^-1溶菌酶，pH8.0），30℃放置15min； 

（6）冰水浴超声处理菌液10s，停10s，反复3次，至细胞不再粘稠； 

（7）4℃， 12000 r·min^-1，离心20min，分别收集上清及沉淀； 

（4）将沉淀用结合缓冲液Ⅰ（20mM Tris、0.5 M NaCl、5 mM咪唑，pH8.0）洗涤一次，4℃， 12000 r·min^-1，离心20min，弃上清； 

（9）沉淀悬于结合缓冲液Ⅱ（20mM Tris、0.5M NaCl、5mM咪唑、6M尿素，pH 8.0）中，4℃，12000g离心20min，收集上清； 

（10）0.45μm滤膜过滤上清，收集滤液，得到抗体的粗制液。 

纯化：利用表达载体上带有的组氨酸标签（His-tag）标记通过亲和层析纯化单链抗体蛋白。 

（1）将HisLinkTM Protein Purification Resin装柱，以10倍柱体积的结合缓冲液（100mM HEPES、10mM咪唑、500mM NaCl，pH7.5）平衡纯化柱； 

（2）取抗体的粗制液上样，然后用5倍柱体积的洗涤液（100mM HEPES、100mM咪唑，pH7.5）洗脱杂蛋白； 

（3）用10倍柱体积的洗脱液（100mM HEPES、250mmol咪唑，pH7.5）洗脱目标蛋白，收集洗脱液，透析，得到纯化的抗体。  

蛋白验证：Western blot印迹检测纯化抗体的特异性。 

（1）收集上述纯化产物，进行12％SDS-PAGE电泳； 

（2）按照BioRad仪器说明书要求将电泳条带转印到NC膜上； 

（3）5%脱脂奶封闭NC膜后，与HRP标记的盐酸四环素（HRP-TC）杂交； 

（4）DAB显色，检测发光条带。 

HRP标记的盐酸四环素购自山东绿都生物科技有限公司；产品编号LD018。 

实施例中同时以空载体pET32a的大肠杆菌BL21菌为阴性对照，按照上述方法进行表达、纯化和Western blot检测。  

Western blot检测结果表明：实施例中得到的蛋白具有与盐酸四环素结合的功能，蛋白的分子量约为28kD，与预期的蛋白分子量一致，而对照组没有检测到任何与盐酸四环素结合的蛋白条带，结果如图4所示。表明目的蛋白为与盐酸四环素结合的抗体。 

实施例二 抗体的功能检测  

A. 检测抗体特异性 

采用间接竞争ELISA法进行，步骤为： 

(3)包被：用0.1M，pH9.6碳酸钠缓冲液将实施例一中制备得到的包被原（Tc-OVA）溶解，使其浓度为1μg·mL^-1，向酶标板中加入包被液100μL/孔，37℃温育2h； 

(4)（2）洗涤：倾去包被液，用 PBST溶液（PBS，含0.05％Tween20，pH7.4）洗涤3次，250μL每孔，每次30s，甩干孔中液体；  

（3）封闭：每孔中加入200μL 2％BSA封闭液，37℃温育2h； 

（4）洗涤同上； 

（5）向孔中加入纯化单链抗体溶液，同时加入不同浓度的盐酸四环素标准品溶液（浓度分别为0 ng·mL^-1、1 ng·mL^-1、1.5 ng·mL^-1、3 ng·mL^-1、5 ng·mL^-1、10 ng·mL^-1、15 ng·mL^-1、30 ng·mL ^-1、50 ng·mL^-1），各50μL每孔，37℃孵育1 h； 

（6）洗涤同上； 

（7）酶标二抗：加入HRP标记的鼠抗HIS标签单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育1 h；洗涤同上；  

（8）显色：每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色10min； 

（9）终止反应：加入2M硫酸终止显色反应，每孔50μL，并在酶标仪读取OD₄₅₀，重复测定3次，得出盐酸四环素各浓度的标准品溶液的吸光度值（B），以吸光度值（B）除以零标准品吸光度值（B₀）再乘以100%，得到百分吸光度值，以盐酸四环素标准品浓度的对数为X 轴，百分吸光率为Y 轴，绘制标准曲线，得出本发明中抗体的50%的抑制率浓度（IC₅₀）为2.23 ng·mL^-1，回归方程为y = -0.4854x + 0.6681，R²为0.9929，结果见图5。 

B．检测抗体的亲和常数 

取定量的一定稀释度的抗体，分别加入逐渐增加的抗原里，可使抗体的结合达到饱和，以结合部分（B）为纵坐标，抗原浓度（mol/L）为横坐标绘制饱和曲线，求出抗体饱和程度为50％时的游离抗原浓度，其倒数即为该抗体在此稀释度下的亲和常数。 结果表明抗体的亲和常数为4.69×10⁸L/mol。 

C．药物交叉反应率 

采用间接竞争性ELISA法进行测定，参试物为金霉素、土霉素、强力霉素、链霉素、卡那霉素、青霉素、庆大霉素、诺氟沙星，以制备抗体对四环素的IC₅₀与对竞争物的IC₅₀之比的百分数为其交叉反应率（CR %）。制备抗体与所选不同类参试物交叉反应率均小于1%，结果见表2。 

表2制备抗体药物交叉反应率 

实施例三 检测盐酸四环素的胶体金方法建立及应用举例 

本实施例是本发明的抗体在制备检测盐酸四环素残留的胶体金试纸条中的应用举例，主要应用于检测盐酸四环素的残留。 

A．胶体金的制备 

采用柠檬酸三钠改良法制备胶体金，准确称取1g氯金酸，溶解到100mL的超纯水中，避光4℃保存，最终浓度1%。用容量瓶量取99mL超纯水，加入洗净的锥形瓶中，打开数显恒温搅拌电热套，调好温度与磁力搅拌子的转速，进行加热。至水沸腾后弃去，以使容器更加清洁，再按上述方法重新烧沸99mL超纯水，迅速加入1%的氯金酸溶液1mL，再加热5min，迅速加入1%柠檬酸三钠2.8mL，继续加热。颜色稳定后继续加热5min，倒出烧好的胶体金溶液，室温避光冷却，补充失水至原体积，加叠氮钠至终浓度0.01%，分装到灭菌容器中4℃避光保存。 

B. 金标抗体的制备 

取50mL胶体金，用0.1M K₂CO₃调pH至8.2，搅拌条件下逐滴加入纯化的抗盐酸四环素抗体，使抗体的浓度为0.2mg·mL^-1，充分混匀之后，静置30min，缓慢加入6mL 10%BSA，充分混匀，静置30min。然后在4℃，12000r·m^-1条件下离心 35min，弃上清，用 0.02M硼酸钠溶液重悬沉淀，重复离心1次，弃上清，用0.01M硼酸钠溶液（pH9.2，含5%蔗糖，1%BSA，0.5%Tween 20，0.2%PEG20000，0.02%叠氮钠）重悬沉淀至原体积1/10，制备得到四环素金标抗体液，转至棕色瓶 4℃保存备用。 

C. 胶体金免疫层析试纸的制备 

用0.01mol·L^-1，pH7.4的PBS液配制含1％BSA、5％蔗糖、1％Tween-20的金标结合垫处理液，将玻璃纤维膜放置于处理液中浸泡30min，37℃烘干后备用。用BioDot  XYZ3000试纸条三维喷点平台系统以2μL/cm将胶体金标记的四环素抗体点喷在玻璃纤维上，37℃干燥12h，即为金标垫。用BioDot XYZ3000试纸条三维喷点平台系统以1μL·cm^-1将盐酸四环素偶联抗原（Tc-OVA）（0.3mg·mL^-1）点喷在硝酸纤维素膜上，即为检测线；在离检测线5 mm处喷上 鼠抗HIS标签单克隆抗体（0.5mg·mL^-1），即为质控线，37℃干燥2h。取出一块PVC板，将喷有检测线和质控线的硝酸纤维素膜粘贴在中央区；分别将吸水纸和胶金垫粘贴于硝酸纤维素膜的上方和下方，两者之间重叠约2mm；再在胶金垫的下方粘贴玻璃纤维作为样本垫，组装成胶体金免疫层析试纸。 

D. 检测方法 

将试纸条放于干净平整的台面上，用滴管吸取待测样品溶液，滴加1～2滴于样品垫上，等待紫红色条带的出现，静置反应5-10分钟时读取测试结果，10分钟以后判定无效。结果判断为C线（质控线）显色，T线（检测线）不显色为阳性；C、T线均显色为阴性；C、T线均不显色则说明试纸条无效。 

E．检测方法应用举例  

检测样品为蜂蜜、肉、液态奶等。 

（1）所述待测样品为蜂蜜：取100μL蜂蜜加入样品管中，加入900μL 样品稀释液，涡流混合1min后，4000 r·min^-1离心5min，取上清作为待测样品溶液。 

（2）所述待测样品为肉：称取样品1g置于离心管中，加乙腈2mL，振荡10min，4000 r·min^-1离心5min；取上清液500μL，加正己烷1mL，涡流混合30S; 再加样本缓冲工作液 1mL，涡流混合1min，取下层液100μL与样本缓冲工作液100μL涡流混合后，取上清作为待测样品溶液。 

（3）所述待测样品为液态奶：离心脱脂，取100μL牛奶，加入900μL 样品稀释液，涡流混合30s，即得到待测样本溶液。或将所述待测样品直接作为待测样品溶液。 

Claims (7)

1.一种单链抗体，其特征在于，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表序列1自N末端起第1-118位氨基酸残基所示；所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列表序列1自N末端起第119-133位氨基酸残基所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表序列1自N末端起第134-244位氨基酸残基所示。

2.   权利要求1或2所述单链抗体的编码基因。

3.  根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因为如下（1）、（2）、（3）、（4）或（5）所示：

    （1）所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5’末端起第1-354位核苷酸所示的DNA分子；

    （2）所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5’末端起第400-732位核苷酸所示的DNA分子；

    （3）所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的5’末端起第355-399位核苷酸所示的DNA分子；

    （4）序列表中序列2的5’末端起第1-732位核苷酸所示的DNA分子；

    （5）在严格条件下与（1）、（2）或（3）或（4）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。

4.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌和表达盒。

5.根据权利要求1或2所述单链抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

免疫原的制备：采用邻联甲苯胺法将载体蛋白与四环素偶联，合成免疫原和包被原；

动物免疫注射：以6-8周龄雄性Balb/c小鼠为免疫动物，腹部皮下多点注射免疫或加强免疫；

抗体的筛选：以pCANTAB5E为表达载体，得到鼠源免疫单链抗体库；

用ELISA方法筛选得到带有特异性的抗四环素的单链抗体的噬菌体颗粒；

抗体的制备：根据权利要求2所述单链抗体序列，合成序列表序列2自5’末端起第1-732位核苷酸所示基因，在pET32a中诱导表达，得到组氨酸标签（His-tag）的单链抗体蛋白。

6.一种检测四环素的胶体金检测方法。

7.根据权利要求7所述的胶体金检测方法，其特征在于：

所述胶体金垫包被有胶体金标记的权利要求1或2所述单链抗体；

所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有权利要求6中所述四环素半抗原与载体蛋白的偶联物；

    所述质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体；

所述四环素半抗原为盐酸四环素。

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