CN118085075B - 抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用。所述兔单克隆抗体为第一抗体或第二抗体，第一抗体轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；第二抗体轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13‑15所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明的单克隆抗体可以特异性识别和结合甲胎蛋白，抗体亲和力高、特异性好，以第一抗体和第二抗体配对建立的甲胎蛋白检测体系，具有特异性高、准确性好、抗干扰能力强、检测灵敏度高等优点。

Description

抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用。
背景技术
甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是一种血清糖基化蛋白，这种蛋白正常情况下在胎儿发育的过程中开放表达，主要由胎儿干细胞及卵黄囊合成，在胎儿的血液中具有较高浓度，出生2-3个月内逐渐由白蛋白替代。因此甲胎蛋白在成人血清中含量极低，一般不到20μg/L。甲胎蛋白是一种重要的细胞内信号分子，参与各种细胞过程，其中包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。AFP和PTEN的相互作用抑制PTEN对PI3K/AKT通路的抑制功能，导致肝癌细胞异常增殖。此外，AFP和半胱天冬酶-3的相互作用阻断了半胱天冬酶-3信号传导，从而抑制了凋亡信号通路。AFP也会竞争性地与类视黄酸受体(RAR)结合，抑制ATRA-RAR复合物的形成和RAR的核易位，上调存活蛋白的表达，下调GADD153、Fn14和GADD45a的表达，导致细胞凋亡减少。AFP还可以通过增加K19、EpCAM、MMP2/9和CXCR4等细胞迁移相关基因的表达来促进肝癌细胞迁移和侵袭。这些数据表明，AFP干扰正常的信号网络，并通过与不同的信号蛋白结合导致肿瘤发生。
甲胎蛋白与癌症及多种肿瘤的发生发展密切相关，因此临床上多将甲胎蛋白用于多种肿瘤的阳性检测指标。例如，当肝细胞发生癌变时，AFP由肝癌细胞再次分泌产生，约有70％的肝癌患者血清中甲胎蛋白会升高，因此甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性血清标志物，广泛用于肝癌的筛查、诊断、疗效评价和复发评估，是早期诊断原发性肝癌最敏感、最特异的指标，适用于大规模普查。另外，甲胎蛋白对于监测生殖系肿瘤如睾丸肿瘤发展及活动同样具有重要意义，在睾丸非精原细胞瘤的诊断和治疗效果评价中是较为敏感的指标。甲胎蛋白对于妇产科的生殖腺胚胎癌、卵巢内胚窦癌的诊断也具有较高的指导意义。此外，AFP中度升高也常见于酒精性肝硬化、急性肝炎以及HBsAg携带者。某些消化道癌也会出现AFP升高现象。孕妇血清或羊水AFP升高提示胎儿脊柱裂、无脑症、食管atresia或多胎，AFP降低(结合孕妇年龄)提示未出生的婴儿有Down’s综合征的危险性。基于AFP在多种疾病的临床诊断和监测方面所表现出的突出特性，其血清检测对早期临床诊断和长期治疗具有重要价值。
近年来，免疫检测如酶联免疫吸附(ELISA)法被开发并广泛用于定量测量血浆、血清、细胞裂解物和培养上清液以及组织样品中的甲胎蛋白水平，其核心技术是特异性识别AFP的抗体。但现阶段市面上的AFP体外ELISA试剂盒伴有抗体亲和力较低、检测灵敏度较差的缺点。因此，开发高亲和力和高特异性的单克隆抗体对于提高免疫检测AFP的特异性、准确度和灵敏度具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，为第一抗体或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)；其中：所述第一抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述第二抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.18-20所示。
进一步地，所述第一抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；其中：所述第一抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
进一步地，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述第二抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
本发明第三方面提供了一种重组载体或宿主细胞，包含编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体的核酸分子。
本发明第四方面提供了如上所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体或宿主细胞在制备免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒中的应用。
本发明第五方面提供了一种免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
进一步地，所述试剂盒为酶免疫分析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、酶联免疫斑点试剂盒、免疫组织化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫印迹试剂盒或流式细胞试剂盒。
进一步地，免疫检测样本包括血浆、血清、细胞裂解物、细胞培养液和组织样本中天然表达的甲胎蛋白以及重组表达的甲胎蛋白。
进一步地，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒，所述试剂盒包括所述第一抗体和所述第二抗体，其中，所述第一抗体为捕获抗体，经可检测标记偶联的所述第二抗体为检测抗体。
本发明的优点及积极效果为：
本发明制备得到具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以特异性识别和结合血浆、血清、细胞裂解物和细胞培养液以及组织样本中的天然甲胎蛋白以及重组表达的甲胎蛋白，具有亲和力高、特异性好等特点，且第一抗体和第二抗体分别识别和结合人AFP蛋白不同的抗原表位，以二者配对建立双抗夹心酶连免疫吸附检测体系，具有特异性高、准确性好、抗干扰能力强、检测灵敏度高等优点，检测人AFP蛋白的检测限低至0.001ng/mL，可实现检测样本中痕量人AFP蛋白的高精度检测，在AFP表达水平异常相关疾病的临床诊断、预后判断和疗效监测方面等具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为预先携带轻链恒定区和重链恒定区的pRB322载体图谱；
图2为本发明实施例1纯化所得兔单克隆抗体7B10和2B9的SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明实施例2兔单克隆抗体7B10与人甲胎蛋白结合的亲和力曲线图；
图4为本发明实施例2兔单克隆抗体2B9与人甲胎蛋白结合的亲和力曲线图；
图5为本发明实施例2兔单克隆抗体7B10和2B9的抗原决定簇识别曲线图；
图6为本发明实施例3基于兔单克隆抗体7B10和2B9建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的标准曲线；
图7为本发明实施例4基于兔单克隆抗体7B10和2B9建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的热稳定性检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情况下可以互换。
术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合人甲胎蛋白(AFP)蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，为第一抗体或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)；其中：所述第一抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第二抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQID NO.15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20所示。
抗体的互补决定区(CDR)是抗原结合部位，是整个抗体的核心序列，CDR序列的长度和氨基酸组成很大程度上决定了该抗体结合相应抗原的特异性和亲和力。本发明以商品化重组人甲胎蛋白(购自Lee Biosolutions，货号105-11)为免疫原免疫兔子，制备得到具备上述CDR序列的第一抗体和第二抗体可以特异性识别和结合血浆、血清、细胞裂解物和细胞培养液以及组织样本中的天然甲胎蛋白(AFP)以及重组表达的重组人AFP蛋白，具有结合抗原亲和力高、特异性好等特点，且这两个抗体可以识别人甲胎蛋白表面的不同抗原决定簇，由此能够用于开发双抗夹心法酶联免疫检测检测体系，以第一抗体作为捕获抗体、第二抗体作为检测抗体建立的双抗夹心酶联免疫吸附检测体系(双抗夹心ELISA)具有特异性高、准确性好、抗干扰能力强、检测灵敏度高等优点，检测人AFP蛋白的检测限低至0.001ng/mL，可实现检测样本中痕量人AFP蛋白的高精度检测，在AFP表达水平异常相关疾病的临床诊断、预后判断和疗效监测方面等具有良好的应用前景。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。所述第一抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述第二抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
可选地，本发明的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。所述第一抗体的轻链(L链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链(H链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述第二抗体的轻链(L链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链(H链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
核酸分子可以是DNA形式(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(例如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或是非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。
示例性地，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。所述第二抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，不同于前述示例的核酸分子同样可以编码得到第一抗体和第二抗体，因此，前述示例的核酸分子不应作为对本发明保护范围的限定。
核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
本发明另一实施例提供了一种重组载体或宿主细胞，包含用于编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体的核酸分子。
构建所述重组载体的出发载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
编码本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以分别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，编码本发明兔单克隆抗体的重链与轻链的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2处理。如果需要，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，以及显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转化如上所述载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再进行分离以得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，上述所述的重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明再一实施例提供了如上所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体或宿主细胞在制备免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒中的应用。
所述在制备免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
所述免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒的优势与如上所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
需要说明的是，第一抗体和第二抗体可以分别单独使用，也可以共同使用，或者配对使用。在免疫检测时，如分开使用或共同使用时，将第一抗体和/或第二抗体作为一抗或捕获抗体，将待检样本与第一抗体和/或第二抗体接触，之后检测一抗。在一些实施方案中，可以将第一抗体和/或第二抗体偶联可检测标记，通过分析可检测标记产生的可识别信号的变化来实现定性或定量检测AFP蛋白。在另一些实施方案中，不标记抗人AFP蛋白单克隆抗体(一抗或捕获抗体)，而将可检测标记偶联可结合第一抗体和/或第二抗体的二抗(检测抗体)或其他分子，例如，如果抗人AFP蛋白抗体是人IgG抗体，那么二抗可以是抗人IgG抗体，由此通过偶联有可检测标记的二抗特异性结合一抗以产生可识别信号的变化。如配对使用时，则将第一抗体或第二抗体其中之一作为一抗或捕获抗体，另一者作为二抗或检测抗体。
上述用于产生可识别信号变化的可检测标记包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
在较佳的实施方式中，免疫检测方法包括但不限于：酶免疫分析法(Enzymeimmunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)、流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等，因此，试剂盒可以是酶免疫分析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、酶联免疫斑点试剂盒、免疫组织化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫印迹试剂盒或流式细胞试剂盒。
在较佳的实施方式中，检测样本包括血浆、血清、细胞裂解物、细胞培养液和组织样本中天然表达的甲胎蛋白以及重组表达的甲胎蛋白。
基于第一抗体和第二抗体识别不同的抗原表位，上述所述的试剂盒优选为双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒，试剂盒包括如上所述的第一抗体和第二抗体，其中，捕获抗体为第一抗体，检测抗体为经可检测标记偶联的第二抗体。二者配对检测人AFP具有高的灵敏性、特异性和抗干扰能力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗人甲胎蛋白蛋白的兔单克隆抗体制备
本实施例采用商品化重组Human甲胎蛋白(AFP，购自Lee Biosolutions，货号105-11)为免疫原，免疫新西兰大白兔，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞培养，通过特定引物提取抗体对应的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的基因扩增产物，进一步构建到含有重链恒定区、轻链恒定区的表达载体上，之后转染细胞，获得含有兔单克隆抗体的上清，纯化，即得候选兔单克隆抗体，进一步通过亲和力测试和抗原表位鉴定等方法进行筛选，得到兔单克隆抗体7B10和兔单克隆抗体2B9。
对筛选出的抗体7B10和2B9分别进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，7B10和2B9的氨基酸和核苷酸序列分别见表1-2，兔单克隆抗体7B10和2B9的VL以及VH序列一致性分别为71％以及75％。以下为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，AA表示氨基端序列，DNA表示核苷酸序列。
表1本实施例单克隆抗体7B10涉及的序列信息汇总
表2本实施例单克隆抗体2B9涉及的序列信息汇总
兔单克隆抗体7B10和2B9的制备方法具体包括以下步骤：
1、动物免疫：以重组Human AFP蛋白免疫新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，血清按1：243000倍数稀释后用ELISA方法测定其针对Human AFP蛋白的血清效价，取OD(450-630)nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三至四天后取脾脏。
2、分离脾脏中B淋巴细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基(RPMI Medium 1640basic+1％ Pen Strep；RPMI 1640购自Gibco，货号C11875500BT；Pen Strep购自Gibco，货号15140-163)，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨，尽可能研磨彻底至整个脾脏组织接近于白色，研磨后的细胞会通过细胞筛网过滤至培养基中；用移液管吸取含有细胞的培养基至无菌的50mL离心管中，并吸取10mL培养基再次清洗一遍培养皿，将残余在培养皿中的细胞尽可能吸取至离心管中；室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，计时完成后加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞；加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
3、B淋巴细胞分选与培养：参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”，获得B淋巴细胞。
4、编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA鉴定出能够结合Human AFP蛋白的阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNATMMicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体VL和VH基因从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来，经测序确定序列。前述PCR反应体系如下：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(来自ABclonal自售自产，货号RK20717)和6.5μL H2O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
扩增VL和VH引物对(5'-3')核苷序列如下所示，F和R分别表示正向和反向引物：
VL-F：tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC(见SEQ ID NO.25)；
VL-R：cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG(见SEQ ID NO.26)；
VH-F：tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG(见SEQ ID NO.27)；
VH-R：gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG(见SEQ ID NO.28)。
5、兔单克隆抗体的生产和纯化：将兔单克隆抗体的重链、轻链基因分别装载在表达载体上。构建过程如下：将含兔单克隆抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物细胞表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，将上游含有信号的具有信号肽编码基因的VL和VH基因纯化后采取同源重组的方式，构建到表达载体pBR322的CL、CH基因的上游，经测序验证表达载体是否构建成功。所使用的哺乳动物表达载体pBR322预先携带CL和CH基因的表达图谱见图1，图中，pRB322 origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。
本实施例信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
将验证正确的含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，培养获得含有重组的识别人AFP蛋白的兔单克隆抗体的上清液。之后使用protein A亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出兔单克隆抗体，纯化方案按照protein A亲和凝胶树脂说明书操作，在此不再赘述。
纯化得到的抗体采用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，结果见图2，可见条带清晰、单一且蛋白大小在150kDa，无明显杂带、拖带，根据条带灰度值计算抗体7B10浓度为5.66mg/mL，抗体2B9浓度为2.24mg/mL，纯度均大于95％。所得抗体于-20℃保存备用。
实施例2兔单克隆抗体7B10和2B9的性能测试
1、抗体亲和力测定：使用Probe Life公司Gator生物分子相互作用分析仪对兔单克隆抗体7B10和2B9与人AFP蛋白亲和力进行精确测定，抗体7B10浓度为1μg/mL和抗体2B9的浓度为4μg/mL；分别将抗体固定在protein A探针上，然后针对抗体7B10和抗体2B9分别用150nM、70nM两个浓度的重组Human AFP蛋白结合，获得亲和力曲线，7B10和2B9的亲和力曲线分别见图3-4，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示结合时间，深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线。
表3兔单克隆抗体7B10和2B9的亲和力相关参数测定结果
兔单克隆抗体 Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M)
7B10 1.66×10-4 3.06×104 5.45×10-9
2B9 7.11×10-4 1.17×105 6.08×10-9
通过曲线拟合和计算得到的亲和力常数见表3，解离系数Koff用于表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数Kon用于表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和常数KD为Koff/Kon的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。由表3可知，兔单克隆抗体7B10和2B9与人AFP蛋白的亲和常数KD分别为5.45×10-9M和6.08×10-9M，抗体亲和力高。
2、抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司Gator生物分子相互作用分析仪对兔单克隆抗体7B10和2B9与人AFP蛋白结合的抗原识别表位进行鉴定。抗原为重组HumanAlpha-fetoprotein/AFP Protein(来自ABclonal，货号RP00243)，工作浓度为5μg/mL，抗体7B10和2B9的浓度为5μg/mL，测试结果见图5，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示抗体和蛋白结合的时间变化。
通过分析两种抗体之间的配对数据可知，在抗体7B10和人AFP蛋白结合后，抗体2B9仍旧能够结合人AFP蛋白，曲线进一步上升，表明结合在探针上的抗体浓度及厚度进一步增强，证明兔单克隆抗体7B10和2B9结合在AFP蛋白表面不同的部位，且结合位点相互不干扰，因此二者可作为双抗夹心法酶联免疫检测的配对抗体。
实施例3基于兔单克隆抗体7B10和2B9建立双抗夹心酶联免疫吸附方法
基于抗体7B10和2B9建立的双抗夹心酶联免疫吸附方法，具体包括以下步骤：
1)包被捕获抗体7B10：将抗体7B10用1×PBS稀释成1μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h；
2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
3)封闭：将E013封闭液(1×PBS中含2％ BSA、5％蔗糖、0.05％吐温和0.1％proclin300，pH 7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，于37℃烘0.5-2h，取出备用；
4)加蛋白：将人AFP蛋白用稀释液进行稀释，至浓度为：10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.15、0ng/mL，然后以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；
5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；
6)加检测抗体2B9：将用生物素标记的兔单克隆抗体2B9(2B9-biotin)稀释成0.0166μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；
其中，生物素标记抗体2B9处理方法包括：将抗体2B9配成1mg/mL的溶液，用DMSO将NHS-LC-biotin配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL的抗体2B9溶液，加入10μL60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μg500mM的Tris溶液(pH9.0)中止反应；最后加入大量pH7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡；
7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；
8)加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；
9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；
10)加TMB显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；
11)绘制标准曲线：孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在450nm和630nm下进行读数，用OD450nm减去OD630nm得到校正后的吸光度值，见表4；以人AFP蛋白浓度为横坐标，吸光度值的校正值Y1(Y1＝OD450nm-OD630nm)为纵坐标作图，使用Logistic曲线四参数拟合得到的曲线图如图6所示。
表4基于抗体7B10和2B9建立的双抗夹心酶联免疫吸附方法的标准曲线
以16个0孔平均值+2×SD代入标准拟合曲线，回算得到灵敏度(Sensitivity)，基于单克隆抗体7B10和2B9建立的双抗夹心酶联免疫检测方法的检测灵敏度为0.001ng/mL，即检测限可低至0.001ng/mL，具有灵敏度高、可靠性好的优势。
实施例4兔单克隆抗体7B10和2B9的热稳定检测
将包被好捕获抗体的酶标板、冻干的人AFP蛋白、100×浓缩的检测抗体形成的检测体系于-20℃和37℃放置7d，之后按照实施例3的双抗夹心酶联免疫吸附方法进行测试，测试统计结果见图7。
结果显示，在37℃破坏7d，抗体对稳定性变异系数为9.9％，小于15％，判定稳定性合格，说明抗体7B10和2B9形成的抗体对的稳定性较佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为第一抗体或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区；其中：
所述第一抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；
所述第二抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18-20所示。
2.根据权利要求1所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.7所示；
所述第二抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求1所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成轻链；其中：
所述第一抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述第二抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3任一项中所述的第一抗体和/或第二抗体。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述第二抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
6.一种重组载体或宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4-5任一项所述的核酸分子。
7.如权利要求1-3任一项所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体在制备免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒中的应用。
8.一种免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项中所述的第一抗体和/或第二抗体。
9.根据权利要求8所述的免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为酶免疫分析试剂盒、免疫组织化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫印迹试剂盒或流式细胞试剂盒；
免疫检测样本包括血浆、血清、细胞裂解物、细胞培养液和组织样本中天然表达的甲胎蛋白或重组表达的甲胎蛋白。
10.根据权利要求9所述的免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，所述酶免疫分析试剂盒为酶联免疫吸附试剂盒或酶联免疫斑点试剂盒。
11.根据权利要求10所述的免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒，所述双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒包括所述第一抗体和所述第二抗体，其中：
所述第一抗体为捕获抗体，经可检测标记偶联的所述第二抗体为检测抗体。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103502274A (zh) * 2011-03-03 2014-01-08 埃派斯进有限公司 抗-il-6受体抗体及其使用方法
CN103974721A (zh) * 2011-09-30 2014-08-06 中外制药株式会社 促进抗原消除的抗原结合分子

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230287088A1 (en) * 2020-08-06 2023-09-14 BioNTech SE Binding agents for coronavirus s protein

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103502274A (zh) * 2011-03-03 2014-01-08 埃派斯进有限公司 抗-il-6受体抗体及其使用方法
CN103974721A (zh) * 2011-09-30 2014-08-06 中外制药株式会社 促进抗原消除的抗原结合分子

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