KR20210084426A - 항-btn3a 항체 및 암 또는 감염성 질환의 치료에서 이들의 용도 - Google Patents

항-btn3a 항체 및 암 또는 감염성 질환의 치료에서 이들의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20210084426A
KR20210084426A KR1020217006171A KR20217006171A KR20210084426A KR 20210084426 A KR20210084426 A KR 20210084426A KR 1020217006171 A KR1020217006171 A KR 1020217006171A KR 20217006171 A KR20217006171 A KR 20217006171A KR 20210084426 A KR20210084426 A KR 20210084426A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
cells
btn3a
cell
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020217006171A
Other languages
English (en)
Inventor
알렘세게드 트루네
다니엘 올리브
크리스틴 파세로
오드 드 가사르트
Original Assignee
임체크 테라퓨틱스 에스에이에스
엥스띠뛰 쟝 빠올리 에 이렌느 깔메뜨
상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄 (씨엔알에스)
엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔 (인쎄름)
위니베르시떼 덱스-마르세이유
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 임체크 테라퓨틱스 에스에이에스, 엥스띠뛰 쟝 빠올리 에 이렌느 깔메뜨, 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄 (씨엔알에스), 엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔 (인쎄름), 위니베르시떼 덱스-마르세이유 filed Critical 임체크 테라퓨틱스 에스에이에스
Publication of KR20210084426A publication Critical patent/KR20210084426A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/58—Prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

인간화 항-BTN3A 항체 및 암 또는 감염성 질환의 치료에서의 이들의 용도
본 발명은 인간 BTN3A에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 암 및 감염성 질환의 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

항-BTN3A 항체 및 암 또는 감염성 질환의 치료에서 이들의 용도
이하 BTN3A에 특이적으로 결합하고, Vγ9/Vδ2 T 세포의 세포용해 기능을 활성화하는 항-BTN3A 활성화 항체가 개시된다. 이러한 항체는 특히 혈액암 또는 고형암과 같은 암 질환을 치료하는데 유용하다. 본 발명은 보다 구체적으로 상응하는 모 뮤린 항체 7.2, 또는 Fc-침묵된 인간 IgG1 또는 IgG4 불변 영역을 갖는 이들의 키메라 버전과 비교하여 동등하거나 개선된 특성을 갖는, 특이적 인간화 항-BTN3A 활성화 항체에 관한 것이다.
백혈구는 병원체로부터 신체를 보호하는데 관여하는 면역계의 세포이다. 이들 세포 중에서, 림프구, 단핵구, 및 수지상 세포가 언급될 수 있다. 단핵구는 혈류에서 다른 조직으로 이동하고, 조직에 상주하는 대식세포 또는 수지상 세포로 분화할 수 있다. 수지상 세포는 림프구를 활성화하는 항원 제시 세포(APC) 역할을 한다. 림프구 중, T 세포는 αβ T 세포 및 γδ T 세포로 나눌 수 있다. γδ T 세포의 서브세트인 Vγ9-Vδ2는 면역방어 시스템의 중요한 이펙터이다. 그들은 감염된 병원체 또는 비정상적인 세포를 직접 용해한다. 또한, 그들은 수지상 세포(DC)의 성숙뿐만 아니라 아이소타입 전환 및 면역글로불린 생산을 유도함으로써 면역 반응을 조절한다. 면역계의 중요한 세포 서브세트는 표면 수용체, 케모카인 및 사이토카인에 의해 엄격하게 조절된다.
T 세포의 프라이밍(priming)은 특수화된 세포의 관여와 화학주성 사이토카인의 분비에 의해 조절된다. 두 가지 신호 가설은 T 세포 활성화가 두 가지 시너지 사건의 결과라고 가정한다. 첫 번째는 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 처리된 항원과 복합체를 이루는 T 세포 수용체(TCR)와 주요조직적합성복합체(MHC) 간의 상호작용이다. 두 번째 사건은 CD28과 B7 분자를 포함하는 공동-자극 항원-독립적 신호이다. 공동-자극 신호의 결핍은 면역성 결핍(anergy)과 비-반응성을 유도하여, T 세포 증식, 사이토카인의 분비 및 세포독성 활성이 없는 결과를 초래한다. 이러한 경로의 연구는 자가면역 또는 림프 증식성 질환과 같은 병리적 사건의 유발에 대한 통찰력을 제공한다. B7 패밀리는 확장된 공동자극 분자 그룹이다(Coyle 및 Gutierrez-Ramos, 2001; Sharpe 및 Freeman, 2002). B7 패밀리에는 리간드 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)이 속한다: 이들 수용체는 T 세포 활성화를 유도하는 CD28, 및 CD28과 경쟁하고 억제 신호를 전달하는 CTLA-4(CD152)가 있다(Alegre et al., 2001에서 검토됨). T 세포 활성화의 음성 조절자로서 CD152의 중요한 역할은 CTLA-4 결핍 마우스에서 림프 증식성 질환의 발생에 의해 입증된다. CD152에 의해 발휘되는 억제 기능에 대한 중요한 발견은 T 세포 프라이밍 동안 천연 T 세포에 의한 증식 또는 사이토카인 생산에 대한 연구에서 비롯된다. 특히, CD152는 T-림프구 활성화 후 발현되며, PHA 자극 또는 Ag 선별 후 얻은 CTL 클론의 세포용해 기능을 억제한다. 수용체가 PD-1(CD279)인 B7-H1(PD-L1, CD274) 및 B7-DC(PD-L2, CD273)는 T-세포 증식 및 사이토카인 분비를 억제하는 것으로 입증되었다(Sharpe 및 Pauken, 2018에서 검토됨). 그 외에, 다른 연구들은 PD-L1 및 PD-L2 참여가 T 세포 증식 및 IL-10 또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 것으로 나타났다. B7-H2(ICOS-L), 최근에 확인된 B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7을 포함하는 T 세포의 표면에서 발현되는 B7 패밀리와 관련된 다른 분자들은 면역 기능의 체크포인트 조절자로서 연관되어 있다(Ni 및 Dong, 2017에서 검토됨).
Henry et al. (1999)는 부티로필린(BT)을 코딩하는 영역이 인간 염색체 6에 있는 MHC 클래스 I 영역의 텔로머 위치에 있음을 발견하였다. 특히, 그들은 Ig 슈퍼패밀리(IgSF) (Linsley et al., 1992; Williams 및 Barclay, 1988)에 속하는 새로운 공동-자극 분자 그룹(BT2.1, BT2.2, BT2.3, BT3.1, BT3.2 및 BT3.3)을 코딩하는 두 개의 유전자 Bt2 및 Bt3을 기술하고, 서열 유사성 분석에 의해 B7 패밀리와 관련된다: 특히 이들은 CD80 및 CD86의 세포외 도메인과 같은 Ig-V와 유사성을 나타낸다.
BT3 패밀리 구성원은 다른 이름으로 문헌에 나타난다: BT3.1은 BTF5(Ruddy et al., 1997), 또는 BTN3A1 (Rhodes et al., 2001), 또는 가장 최근에는 CD277 (Bensussan 및 Olive, 2005)이라고도 불린다; BT3.2는 BTF4(Ruddy et al., 1997), 또는 BTN3A2라고도 불린다; 그리고, 마지막으로 BT3.3은 BTF3(Ruddy et al., 1997) 또는 BTN3A3(Rhodes et al., 2001)라고도 나타난다. BT3은 두 개의 IgSF를 특징짓는 Ig-유사 세포외 도메인을 가지고 있다.
B7 유전자와 MHC 클래스 I 및 II 유전자는 공통의 조상 유전자를 가질 수 있고, T 세포 활성화와 같은 유사한 기능과 관련된 단백질을 암호화할 수 있다고 제안되어 왔다(Rhodes et al., 2001). BT3 분자는 T, B 및 NK 세포와 같은 면역세포, 단핵구와 수지상 세포뿐만 아니라 조혈모세포와 일부 종양성 세포주에서 발견되어 왔다. 다른 공동-자극 분자의 경우, 이들의 구조는 세 가지 도메인으로 특징지어진다: 리간드에 결합하기 위한 세포 외 도메인, 막 횡단 도메인 및 B30.2로 명명된 세포내 도메인은 아마도 세포 내 과산화물 농도의 조절에 관여한다. 지금까지 CD277의 리간드(들)는 아직 알려지지 않았다(Gu et al., 2015에서 검토됨).
현재까지, T 세포의 조절에 의존하는 다양한 치료 및 백신 전략이 제안되었다; CTLA-4, PD-1 및 PD-L1에 대한 몇몇 면역조절 항체는 이미 전세계 여러 규제 기관에서 임상 사용 승인을 받았다. 이러한 약물은 암 치료에서 주요 발전을 나타내지만, 현재 이용가능한 치료에 반응하지 않는 암 환자 집단의 상당 부분에 대해 충족되지 않은 의학적 요구가 여전히 남아 있다.
특허 WO 2012080351 A1, EP2651441A1, EP2946791A1, US20140322235, WO2012080769A1은 세포용해 기능, 사이토카인 생산 및 Vγ9 Vδ2 T 세포를 활성 또는 억제할 수 있는 BTN3A에 대한 다양한 항체를 참고한다. 그러나, 이러한 뮤린 항체는 치료적 적용에 적합하지 않다. 실제로, 인간 환자에 투여하기 위해, 현재 면역원성 반응을 피하기 위해 항체를 인간화하는 것이 필수적이다.
인간화는 종종 원래의 뮤린 항체와 동일한 수준의 효능을 유지하지 않고, 프레임워크 영역에서 아미노산을 변형해야 한다. 이는 CDR 영역에 바로 인접한 아미노산을 변형할 때 특히 그렇다(예를 들어, Queen 특허 US5,585,089 참조).
어려움에도 불구하고, 본 발명자들은 활성화 mAb 7.2의 특별한 인간화 항체를 선별했는데, 이는 mAb 7.2 모 항체의 유지된 기능적 특성과 인간에 대해 예측된 감소된 면역원성을 결합할 뿐만 아니라, 놀랍게도 세포주 생산의 개선된 수율, 모 뮤린 항체에 비해 높은 열 안정성, 및 산과 열 스트레스에 대한 강한 저항성과 같은 우수한 개발가능한 특성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 인간화 항체 mAb1은 시노몰구스 BTN3A에 유리하게 결합하고, 시노몰구스 영장류에서 최대 100 mg/kg/week의 투여량까지 잘 견디므로, 인간 치료에서 약물로 사용하기 위한 우수한 후보를 제공한다.
따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 가변 중쇄 폴리펩타이드 VH 및 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 가변 경쇄 폴리펩타이드 VL을 포함하는 분리된 항-BTN3A 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 인간화 항체이고, 특히 모 뮤린 항체와 관련하여 예측된 감소된 면역원성을 갖는다. 이러한 분리된 항-BTN3A 항체는 인간 BTN3A에 결합한다. 특히, 표면 플라즈몬 공명으로 측정된, 10 nM 이하의 KD, 바람직하게는 5 nM 이하의 KD를 갖는 인간 BTN3A에 결합한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 항체는, 탈과립화 분석에서 측정된 5 ㎍/ml 미만, 바람직하게는 1 ㎍/ml 이하의 EC50을 갖는 BTN3 발현 세포와의 공배양에서, γδ-T 세포, 전형적으로 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 유도한다. 결과적으로 상기 항체는 조직 기원과는 독립적으로 종양 표적 세포의 사멸을 유도한다.
특정 구현예에서, 상기 분리된 항-BTN3A 항체는 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 IgG1 불변 영역을 포함하고, 상기 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 IgG1 불변 영역은 야생형 IgG1 아이소타입 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교할 때 Fcγ 수용체에 대한 결합이 없거나 감소된 결합을 부여한다. 전형적으로, 상기 돌연변이 IgG1 불변 영역은 IgG1 삼중 돌연변이 L247F, L248E 및 P350S이다. 상기 분리된 항-BTN3A 항체의 예는 SEQ ID NO: 4의 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 경쇄를 포함하는 mAb1 또는 SEQ ID NO: 4의 중쇄 및 SEQ ID NO: 7의 경쇄를 포함하는 mAb2이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 상기 분리된 항-BTN3A 항체는 1가 포맷 항체, 바람직하게는 Fab 또는 scFv 항체로부터 선택된 1가 포맷 항체이다.
본 발명의 분리된 항-BTN3A 항체는 (i) 치료제 또는 (ii) 진단제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 암, 예를 들어 혈액암, 및 보다 구체적으로 림프종 또는 백혈병의 치료에 유용하다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 또한 고형 종양 및 보다 구체적으로 전립선암, 난소암 또는 자궁내막암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 감염성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 선택적으로 다른 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합되는 상기 기술된 항-BTN3A 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 기술한 바와 같은 항-BTN3A 항체를 포함하는 동결건조물 제제, 미리 충전된 주사기 또는 바이알에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 숙주세포, 전형적으로 CHO 숙주세포와 같은 포유류 숙주세포에서 상기 기술된 항-BTN3A 항체의 재조합 생산을 위한 발현 벡터에 관한 것이고, 상기 항-BTN3A 항체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 이러한 발현 벡터의 구현예는 적어도 본 명세서에 기술된 mAb1의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 포함한다.
또한, 본 명세서에는 하기를 포함하는 본 발명의 항-BTN3A 항체의 생산 방법이 개시된다: (i) 숙주세포에 의해 상기 항체의 발현을 위해 앞서 정의된 바와 같은 숙주세포를 배양하는 단계; 선택적으로 (ii) 상기 항체를 정제하는 단계; (iii) 항체를 회수하는 단계.
본 발명은 추가로 상기 정의된 바와 같은 항-BTN3A 항체의 VH 및 VL을 포함하는 Fab 또는 scFv를 포함하는 적어도 하나의 팔(arm)을 포함하는 이중 특이적 항체와 같은 다중 특이적 항체에 관한 것이다.
도 1: A. PBMC로부터 확장된 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 4시간동안 표시된 농도의 mAb1(또는 상응하는 아이소타입 대조군)과 함께 E:T 1:1 비율로 Daudi 세포주(버킷 림프종)와 공배양하였다. 세포를 CD107a 및 CD107b에 대한 항체로 염색하고, 양성 발현을 위한 게이트는 자극받지 않은 대조군을 기반으로 했다. 실험은 3명의 건강한 공여자를 대상으로 수행하였다. B. Daudi 세포를 지시된 농도의 mAb1(또는 상응하는 아이소타입 대조군)과 함께 37℃에서 1시간동안 전배양하였다. 광범위한 세척 후, mAb-펄스된 Daudi 세포를 Daudi에 대한 Caspase 3/7 활성을 측정하기 전에, 37℃에서 확장된 인간 Vγ9Vδ2 T 세포와 공배양하였다. A 및 B의 경우, GraphPad Prism 소프트웨어로부터 S자형 4PL 방정식을 사용하여 곡선 피팅을 얻었다. C. 이전에 (A) 및 (B)에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 Daudi 세포주와 비교하여 다른 종양 세포주(L-IPC: 췌장 관 선암, HT29: 결직장 선암, A549: 폐암)에 대해 10 μg/mL 로 사용된mAb1(및 상응하는 아이소타입 대조군)의 효능을 평가하였다.
도 2: Vγ9Vδ2 T-세포에 의해 살해당하는 mAb1-매개 BTN3A 발현 표적 세포.
A. 10,000 HL60-WT 또는 BTN3AKO 세포(급성 골수성 백혈병)를 증가하는 농도의 mAb1 (또는 관련 아이소타입 대조군 hIgG1) +/- rHuIL-2 (20 IU/ml)의 존재 하에서 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포(비율 E:T 1:1)와 함께 24시간 공-배양하였다. 세포 생존율은 ATP 수준을 검출하는 생물발광 분석을 사용하여 측정되었다.
B. 10,000 HL60-WT 세포를 증가하는 농도의 mAb1 (또는 관련 아이소타입 대조군 hIgG1) +/- rHuIL-2 (20 IU/ml)의 존재 하에서 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포(비율 E:T 1:1)와 함께 24시간 공-배양하였다. 세포 생존율은 매일 측정되었다.
C. 10,000 HL60-WT 세포를 증가하는 농도의 mAb1 + rHuIL-2 (20 IU/ml)의 존재 하에서 인간 PBMC로부터 분리된 신선한 Vγ9Vδ2 T 세포(비율 E:T 1:1 및 1:5)와 함께 4일동안 공-배양하였다. 세포 생존율은 매일 측정되었다. * 과신호(over signal)을 표시.
도 3: 상이한 조직 기원의 10,000개의 종양 세포를 다른 농도의 mAb1의 존재 하에서 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포(비율 E:T 1:1)와 함께 24시간 공-배양하였다. 세포 생존율은 ATP 수준을 검출하는 생물발광 분석을 사용하여 측정되었다. 생물발광 값이 표시되었다. 4개의 바는 왼쪽에서 오른쪽으로 나타내었다: (1) mAb 없음, (2) mAb1 0,1ug/ml, (3) mAb1 1uh/ml, (4) mAb1 10ug/ml
도 4: mAb1는 시노몰구스 원숭이 Vγ9Vδ2 T 세포의 확장 및 활성화를 촉진한다
A. 3마리의 시노몰구스 전혈을 적혈구 용해 버퍼로 처리하였다. 광범위한 세척 후, 세포를 200 IU/mL rHuIL-2 및 mAb1 (10 μg/mL)을 포함하는 배지에 1.5 M/mL로 두었다. Vγ9+ T 세포의 비율은 특정 항체를 사용하여, 0일, 3일, 6일, 8일 및 10일째에 유세포 분석으로 평가하였다. 그래프는 살아있는 세포들 사이에서 Vγ9+ T 세포 비율의 동역학을 보여주었다. 각 곡선은 개별 동물을 나타낸다.
B. 10일 확장 후, 각 동물의 세포를 배양 배지, mAb1 또는 아이소타입 대조군(10 μg/mL)의 존재 하에서, 표적 세포로 사용된 Daudi, K562 또는 Raji와 함께 4시간동안 공배양하고, 유세포 분석으로 탈과립(CD107a/b)에 대해 분석하였다.
도 5: ICT01 투여 후 지정된 시간에 수집된 시노몰구스 혈액 샘플을 항체의 특정 칵테일로 염색하여 T 세포 서브세트(CD4, CD8, Vγ9 T 세포, 조절 T 세포), B 세포, 단핵구, NK 세포, mDC, pDC 및 과립세포를 정량화하고, 유세포 분석으로 분석하였다. 상부 패널은 단일 투여 동물에 대한 CD3+ T 세포 중 Vγ9Vδ2 T 세포의 %를 나타내었다. 하부 패널은 반복 투여 동물에 대한 CD3+ T 세포 중 Vγ9Vδ2 T 세포의 %를 나타내었다. 데이터는 각 샘플링 상황 및 그룹에 대한 평균값 ±SD로 표시된다. 수직 점선은 ICT01 투여 시간을 나타냈다.
정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에 명시되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "BTN3A"는 당해분야에서 일반적인 의미를 갖는다. 특정 구현예에서, BTN3A는 SEQ ID NO: 18의 BTN3A1, SEQ ID NO: 19의 BTN3A2 또는 SEQ ID NO: 20의 BTN3A3을 포함하는 인간 BTN3A 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체(antibody)"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. 따라서, 용어 항체는 전체 항원 분자뿐만 아니라 항체 단편과 항체의 변이체(유도체 포함)도 포함한다.
설치류와 영장류의 천연 항체에서, 두 개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄와 연결된다. 경쇄는 람다(λ) 및 카파(κ)의 두 가지 타입이 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요한 중쇄 클래스(또는 아이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 사슬(chain)은 고유한 서열 도메인을 포함한다. 전형적인 IgG 항체에서, 경쇄는 2 개의 도메인, 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 가변 도메인(VH)과 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, 공통적으로 CH라고 함)을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(CL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역은 항체 사슬 결합, 분비, 태반경유(trans-placental) 이동성, 보체 결합, 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다.
Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정기 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 주로 초가변 또는 상보적 결정 영역(CDR)의 잔기로 구성된다. 때때로, 비초가변 또는 프레임워크 영역(FR)의 잔기는 항체 결합 부위에 참여하거나, 전반적인 도메인 구조 및 이에 따라 결합 부위에 영향을 미칠 수 있다. 상보적 결정 영역 또는 CDR은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 의미한다. 각각의 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L- CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3로 지정된 세 개의 CDR을 갖는다. 따라서, 항원-결합 부위는 전형적으로 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터 설정된 CDR을 포함한 6개의 CDR을 포함한다. 프레임워크 영역(FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 전형적으로 다음의 서열의 4개의 프레임워크 영역 및 3 개의 CDR을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
항체 가변 도메인의 잔기는 일반적으로 Kabat et al.에 의해 고안된 시스템에 따라 번호가 매겨진다. 이 시스템은 Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (Kabat et al., 1992, 이하 "Kabat et al.")에 제시되어 있다. 이 넘버링 시스템은 본 발명의 설명에서 사용된다. Kabat 잔기 지정(residue designation)은 SEQ ID 서열에서 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 항상 직접적으로 일치하지는 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 기본 가변 도메인 구조의, 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)에 관계없이, 구조적 구성요소의 단축 또는 삽입에 상응하는 정확한 Kabat 넘버링보다 적거나 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 정확한 Kabat 넘버링은 항체의 서열에서 상동성 잔기를 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 정렬함으로써 임의의 항체에 대해 결정될 수 있다. 중쇄 가변 도메인의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35(H-CDR1), 잔기 50-65(H-CDR2) 및 잔기 95-102(H-CDR3)에 위치할 수 있다. 경쇄 가변 도메인의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34(L-CDR1), 잔기 50-56(L-CDR2) 및 잔기 89-97(L-CDR3)에 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 항체 단편이고, 보다 바람직하게는 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 항체-결합 도메인을 포함하는 임의의 단백질이다. 항체 단편은, 이에 제한되는 것은 아니나, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디(diabody)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "특이성(specificity)"은 BTN3A와 같은 항원에서 제시된 에피토프에 검출 가능하게 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, 특이성은 말초혈액골수세포(PBMCs), 바람직하게는 실시예(표 4 참조)에서 측정된 바와 같이 50 ㎍/ml 미만, 보다 바람직하게는 10 ㎍/ml 미만의 EC50 를 갖는 말초혈액골수세포에서 발현되는 인간 BTN3A에 결합하는 항체를 의미하는 것으로 의도된다. 다른 구현예에서, 특이성은 실시예(표 4 참조)에서 측정된 SPR 측정에 의해 측정된 바와 같이, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 또는 10 pM 이하의 KD 를 갖는 항원 재조합 폴리펩타이드에 결합한다.
"BTN3A 이외의 항원과 교차-반응하는(cross-reacts with an antigen other than BTN3A)" 항체는 10nM 이하, 1 nM 이하, 또는 100 pM 이하의 KD 를 갖는 BTN3A 이외의 항원과 결합하는 항체를 의미하도록 의도된다. "특정 항원과 교차-반응하지 않는(does not cross-react with a particular antigen)" 항체는 100 nM 이상의 KD, 1μM 이상의 KD, 또는 10 μM 이상의 KD를 갖는 항원에 결합하는 항체를 의미하도록 의도된다. 특정 구현예에서, 항원과 교차-반응하지 않는 이러한 항체는 표준 결합 분석에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출 불가능한 결합을 나타낸다. 특정 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체, 예를 들어, mAb1은 예를 들어 Biacore 분석에서 측정된 바와 같이 SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO: 23 각각의 시노몰구스 BTN3A1, BTN3A2 및 BTN3A3과 교차-반응한다(표 21).
본 명세서에서 사용된 "분리된 항체(isolated antibody)"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체(예를 들어, BTN3A에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 BTN3A 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다)를 의미한다. 그러나, BTN3A에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 관련된 BTN3A 분자와 같은 다른 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단일클론항체(monoclonal antibody)" 또는 "단일클론항체 조성물(composition)"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 의미한다. 단일클론항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
"항원을 인식하는 항체(an antibody recognizing an antigen)" 및 "항원에 대한 특이성을 갖는 항체(an antibody having specificity for an antigen)"라는 문구는 본 명세서에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체(an antibody which binds specifically to an antigen)"의 용어와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 의미하도록 의도된 반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "KD"는 Kd 대 Ka (즉, Kd/Ka)의 비율로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 의미하도록 의도된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에서 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나, Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
특이성은 특이적 항원에 대한 결합 대 다른 관련 없는 분자에 대한 비특이적 결합에서, 예를 들어, 약 10:1, 약 20:1, 약 50:1, 약 100:1, 10.000:1 또는 그 이상의 비율의 친화도/결합도에 의해 추가로 나타낼 수 있다(이 경우 특이적 결합은 BTN3A 폴리펩타이드이다). 본 명세서에서 사용된 용어 "친화도(affinity)"는 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "결합도(avidity)"는 항체-항원 복합체의 전반적인 안정성 또는 강도의 정보적 측정을 의미한다. 결합도는 세 가지 주요 요소에 의해 제어된다: 항체 에피토프 친화도; 항원 또는 항체 모두의 원자가; 및 상호작용하는 부분의 구조적 배열. 궁극적으로 이러한 요소는 항체의 특이성, 즉 특정 항체가 정확한 항원 에피트프에 결합할 가능성을 정의한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성화 항체(activating antibody)"는 이펙터 세포의 면역 기능을 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있는 항체를 의미한다. 특히, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 활성화 항-BTN3A 항체는 이하 실시예에서 기술된 바와 같이 탈과립화 분석에서 측정된 5 ㎍/ml 미만, 바람직하게는 1 ㎍/ml 이하의 EC50을 갖는 BTN3A 발현 세포와의 공동-배양에서 적어도 γδ T 세포, 전형적으로 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 유도할 수 있는 능력을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개체(subject)"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물(nonhuman animal)"은 모든 척추동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유류 및 비-포유류를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "최적화된(optimized)"은 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 인간 세포에서 선호되는 코돈을 사용하여 뉴클레오타이드 서열이 아미노산 서열을 암호화하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 조작되어 시작 뉴클레오타이드 서열에 의해 원래 암호화된 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 한 많이 보유한다. 최적화된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열 또한 최적화된 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 두 서열 사이의 동일성 백분율은 갭(gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/총 위치의 수 X 100)의 함수이고, 이는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 한다. 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 이하 기술된 바와 같은, 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 PAM120 잔량(weight residue) 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 블로썸 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com 에서 사용가능함)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
또한, 두 뉴클레오타이드 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은, 예를 들어, 기본값으로 11의 단어 길이(W), 10의 기대값(E), M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 사용하는 핵산 서열의 비교를 사용하는 핵산 서열에 대한 BLASTN 프로그램과 같은 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
재조합 인간화 항-BTN3A 활성화 항체
본 발명의 항체는 선별된 인간화 재조합 항체 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5를 포함하고, 이는 하기 표 1에 기술된 바와 같은 이들의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열과 인간 불변 영역(아이소타입)에 의해 구조적으로 특징지어 진다:
표 1: mAb1-mAb6의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열
항체 VH 아미노산 서열 VL 아미노산 서열 아이소타입 불변 영역
mAb1 SEQ ID NO:1
(VH2 7.2)		 SEQ ID NO:2
(Vk1 7.2)		 침묵 IgG1
L247F/L248E/P350S
mAb2 SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) SEQ ID NO:3
(Vk2 7.2)		 침묵 IgG1
L247F/L248E/P350S
mAb3 20.1의 인간화 변이체 20.1의 인간화 변이체 침묵 IgG1L247F/L248E/P350S
mAb4 SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) SEQ ID NO:2
(Vk1 7.2)		 IgG4 S241P/L248E
mAb5 SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) SEQ ID NO:3
(Vk2 7.2)		 IgG4 S241P/L248E
mAb6 mAb3와 동일 mAb3와 동일 IgG4 S241P/L248E
mAb3 및 mAb6은 mAb 20.1를 의미하고, 비교예로 사용하기 위한, WO2012/080351에 개시된 또 다른 모 뮤린 항-BTN3A 항체의 인간화된 항체를 의미한다.
mAb1 내지 mAb6을 생산하기 위해 사용된 IgG1, IgG4 및 이들의 돌연변이 버전 IgG1 L247F/L248E/P350S 및 IgG4 S241P/L248E의 불변 아이소타입 영역의 서열을 코딩하는 상응하는 아미노산 및 뉴클레오타이드는 당업계에 잘 알려져 있다(Oganesyan et al., 2008; Reddy et al., 2000). IgG1에서 발견된 C-말단 라이신은 자연적으로 절단될 수 있고, 이 변형은 항체의 특성에 영향을 미치지 않는다; 따라서, 이 잔기는 mAb1 내지 mAb6의 구조체에서 추가로 결실될 수 있다.
mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5의 전장 경쇄와 중쇄 및 상응하는 코딩 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
표 2: 전장 중쇄 및 경쇄 DNA 코딩 서열
항체 아미노산 서열 DNA 코딩 서열
mAb1 중쇄: SEQ ID NO:4
경쇄: SEQ ID NO:6		 중쇄: SEQ ID NO:8
경쇄: SEQ ID NO:10
mAb2 중쇄: SEQ ID NO:4
경쇄: SEQ ID NO:7		 중쇄: SEQ ID NO:8
경쇄: SEQ ID NO:11
mAb4 중쇄: SEQ ID NO:5
경쇄: SEQ ID NO:6		 중쇄: SEQ ID NO:9
경쇄: SEQ ID NO:10
mAb5 중쇄: SEQ ID NO:5
경쇄: SEQ ID NO:7		 중쇄: SEQ ID NO:9
경쇄: SEQ ID NO:11
본 발명에 따른 일부 항체의 VH CDR1s (HCDR1이라고도 함), VH CDR2s (HCDR2라고도 함), VH CDR3s (HCDR1이라고도 함), VL CDR1s (LCDR1이라고도 함), VL CDR2s (LCDR2라고도 함), VL CDR3s (HCDR3라고도 함)의 아미노산 서열의 예는 표 3에 나타나있다.
표 3에서, 본 발명의 항체의 CDR 영역은 Kabat 넘버링을 사용하여 기술된다 (Kabat et al., 1992, 이하 "Kabat et al.").
읽기 쉽도록, CDR 영역을 이하 각각 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3이라 부른다.
표 3: Kabat 넘버링에 따른 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5 및 모 뮤린 mAbs 7.2 항체의 CDR 영역
기원 항체 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb 7.2
mAb1
mAb2
mAb4
mAb5
SEQ ID NO: 12
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 16
SEQ ID NO: 17
특정 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 상기 재조합 항-BTN3A 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(i) 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 바와 같이, SPR에 의해 측정된 10nM 이하의 KD, 바람직하게는 1nM 이하의 KD를 갖는 BTN3A에 결합한다;
(ii) 예를 들어 하기 실시예에서 기술된 바와 같이, SPR에 의해 측정된 100mM 이하의 KD, 바람직하게는 10nM 이하의 KD를 갖는 시노몰구스 BTN3A에 교차-반응한다;
(iii) 하기 실시예에서 기술된 바와 같이 유세포 분석에서 측정된 50 ㎍/ml 이하, 바람직하게는 10 ㎍/ml 이하의 EC50을 갖는 인간 PBMC에 결합한다;
(iv) 하기 실시예에서 기술된 바와 같이 탈과립화 분석에서 측정된 5 ㎍/ml 미만, 바람직하게는 1 ㎍/ml 이하의 EC50을 갖는 BTN3 발현 세포와의 공동-발현에서, γδ-T 세포, 전형적으로 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 유도한다.
이전 구현예와 조합될 수 있는 특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 상기 정의된 항체의 항체 단편이다.
항체 단편은, 이에 제한되는 것은 아니나, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 유니바디(unibody), 및 scFV 단편, 디아바디(diabody), 단일 도메인 또는 나노바디 및 다른 단편을 포함한다.
바람직하게, 항체 단편은 scFv 단편의 Fab와 같은 1가 항체이다.
용어 "디아바디(diabodies)"는 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)를 포함하는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미한다. 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬에 있는 두 개의 도메인 사이의 쌍을 허용함으로써, 도메인이 또 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어 두 개의 항원-결합 부위를 생성한다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 부분, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 부분을 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, U.S 특허 No. 6,248,516 B1 참조)이다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 분해 소화뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소시키는 한편, 모 비-인간 항체와 적어도 동일한 친화도(또는 우수한 친화도)를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 WO2012/080351에 개시된 모 항체 mAb 7.2의 인간화 항체이다. 비교예는 WO2012/080351에 개시된 모 항체 mAb 20.1의 인간화 항체를 포함한다.
일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하고, 여기서 CDR(또는 이들의 일부)은 비-인간 항체, 예를 들어, 뮤린 mAb 7.2로부터 유래되고, FR(또는 이들의 일부)은 면역원성을 감소시키기 위해 돌연변이된 뮤린 항체 서열로부터 유래된다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 재조합 항체는 인간화 침묵 항체, 전형적으로 인간화 침묵 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "침묵(silent)" 항체는 실시예에 기재된 것과 같은 결합 분석에서 측정된 바와 같이 FcγR 결합 및/또는 C1q 결합이 없거나 낮은 항체를 의미한다.
한 구현예에서, 용어 "FcγR 결합 및/또는 C1q 결합이 없거나 낮은(no or low FcγR and/or C1q binding)"은 침묵 항체가 FcγR 및/또는 C1q 결합이 적어도 50% 이하인 것, 예를 들어 야생형 인간 IgG1 또는 IgG4 아이소타입을 갖는 상응하는 항체로 관찰된 FcγR 및/또는 C1q 결합이 80% 이하로 나타내는 것을 의미한다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 항체는 VH 및 VL내의 프레임워크 잔기에 대한 변형을 포함하여, 상응하는 뮤린 항체 mAb 7.2에 비해 항체의 면역원성을 감소시킨다.
한 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 VH 프레임워크 영역에서 적어도 다음의 아미노산 돌연변이: V5Q; V11L; K12V; R66K; S74F; I75S; E81Q; S82AR; R82BS; R83T; D85E; T87S; L108S; 및 Vκ 프레임워크 영역에서 적어도 다음의 아미노산 돌연변이: T5N ; V15L ; R18T ; V19I ; K42N ; A43I ; D70G ; F73L ; Q100G를 포함하는, 모 뮤린 항체 mAb 7.2의 인간화 단일클론항체이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 모 뮤린 항체 mAb 7.2의 인간화 단일클론항체이고, mAb 7.2와 비교하여 VH 프레임워크에서 적어도 다음의 아미노산 돌연변이: V5Q; V11L; K12V; R66K; S74F; I75S; E81Q; S82AR; R82BS; R83T; D85E; T87S; L108S; 및 Vκ 프레임워크 영역에서 적어도 다음의 아미노산 돌연변이: T5N ; V15L ; R18T ; V19I ; K42N ; A43I ; S63T ; D70G ; F73L ; Q100G를 포함한다.
프레임워크 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여, 본 발명의 항체는 조작되어 Fc 영역 내에 변형을 포함할 수 있고, 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 변형되어 그의 글리코실화를 변경하고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경할 수 있다. 이들 구현예 각각은 아래에서 더 상세하게 설명된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아이소타입 불변 영역(isotype constant region)" 또는 "Fc 영역(Fc region)"은 상호교환적으로 사용되어 천연 서열 Fc 영역 및 가변 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의한다. 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 C226 또는 P230에서 IgG 항체의 카르복실-말단까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의되고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링 시스템을 따른다. Fc 영역의 C-말단 라이신(잔기 K447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 중에 제거되거나 재조합 구조체에서 결실된 그의 코돈에 상응하는 것이 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
한 특정 구현예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들면 증가하거나 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 Bodmer et al에 의해 U.S. 특허 5,677,425에서 추가로 상세하게 설명된다. CH1의 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수는 변경되어, 예를 들면 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가시키거나 감소시킨다.
또 다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 변이되어 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역으로 도입되어, 항체가 천연Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 대해 손상된 스타필로코커실 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록 한다. 이 접근법은 Ward et al.에 의해 U.S. 특허 6,165,745에서 추가로 상세하게 설명된다.
또 다른 구현예에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경되어, 항체의 이펙터 기능을 변경할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 대체할 수 있어 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력을 유지하도록 한다. 친화도가 변경되는 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 모두 Winter et al.의 U.S. 특허 5,624,821 및 5,648,260에 자세히 설명되어 있다.
또 다른 구현예에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있어 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 폐지된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 Idusogie et al.의 U.S. 특허 6,194,551에 자세히 설명되어 있다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경시킨다. 이 접근법은 Bodmer et al.에 의해 PCT 출원 WO 94/29351에서 추가로 설명된다.
다른 구현예에서, Fc 영역은 변경되어 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 매개 및/또는 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 감소시킨다. 감소된 이펙터 기능을 갖고, 특히 감소된 ADCC를 갖는 이러한 항체는 침묵 항체를 포함한다.
특정 구현예에서, IgG1 아이소타입의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 특정 구현예에서, IgG1 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어, 융합 폴리펩타이드의 능력을 감소하거나 제거하여 항체 의존성 세포독성(ADCC)를 매개 및/또는 Fcγ 수용체에 결합하는 침묵 IgG1 Fc가 사용된다.
특정 구현예에서, IgG4 아이소타입의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 특정 구현예에서, IgG4 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어, 융합 폴리펩타이드의 능력을 감소하거나 제거하여 항체 의존성 세포독성(ADCC)를 매개 및/또는 Fcγ 수용체에 결합하는 침묵 IgG4 Fc가 사용된다.
침묵된 이펙터 기능은 항체의 Fc 불변 부분에서의 돌연변이에 의해 얻을 수 있고, 당업계에 설명되어 있다''(Baudino et al., 2008; Strohl, 2009). 침묵 IgG1 항체의 예는 삼중 돌연변이 변이체 IgG1 L247F L248E P350S를 포함한다. 침묵 IgG4 항체의 예는 이중 돌연변이 변이체 IgG4 S241P L248E를 포함한다.
특정 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 314에서 글리코실화를 방지하는 침묵 Fc 돌연변이이다. 예를 들어, Fc 도메인은 위치 314에서 아스파라긴의 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 치환의 예는 N314를 글리신 또는 알라닌으로 대체하는 것이다.
여전히 또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 글리코실화된 항체는 만들어질 수 있다(즉, 항체에 글리코실화가 없음). 글리코실화는 변경되어, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co et al.에 의해 U.S. 특허 5,714,350 및 6,350,861에서 추가로 상세하게 기술된다.
본 발명에 의해 고려되는 본 발명의 항체의 또 다른 변형은 페길화(pegylation) 또는 헤실화(hesylation) 또는 관련 기술이다. 항체는 페길화되어, 예를 들어 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 항체의 페길화를 위해, 항체, 또는 이들의 단편은 전형적으로 하나 이상의 PEG 그룹이 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서, PEG의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체와 같은 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 반응한다. 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 폴리머)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)"은 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은 다른 단백질을 유도체화하는데 사용된 PEG의 임의의 형태를 포함하도록 의도된다. 특정 구현예에서, 페길화될 항체는 비글리코실화 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본 발명의 항체를 적용할 수 있다. 예를 들어, Nishimura et al.의 EP 0 154 316과 Ishikawa et al.의 EP 0 401 384를 참고한다.
또 다른 가능성은 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 영역을 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질에 결합할 수 있는 단백질과 융합하여 생성된 분자의 반감기를 증가시키는 것이다. 이러한 접근법은 예를 들어 Nygren et al., EP 0 486　525에서 기술된다.
특정 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 불변 도메인에 일반적으로 존재하는 C-말단 라이신은, 제조 또는 저장 중에 일반적으로 관찰되는 이러한 감소의 절단으로 인한 이질성을 감소시키도록 조작된다. 이러한 변형은 이러한 항체의 바람직한 기능을 인지할 수 있게 변경하지 않는 반면, 이러한 분자에 안정성의 이점을 부여한다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자
또한, 본 발명의 항-BTN3A 항체를 암호화하는 핵산 분자가 본 명세서에 개시된다. 가변 경쇄 및 중쇄 뉴클레오타이드 서열의 예는 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5 중 임의의 가변 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 암호화하고, 후자의 서열은 표 1 및 표 2로부터 쉽게 유래되며, 유전적 코드를 사용하는 것들이고, 선택적으로 숙주세포 종에 따라 코돈 편향을 고려하는 것들이다.
본 발명은 또한 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포주에서 단백질 발현을 위해 최적화된 후행 서열로부터 유래된 핵산 분자에 관한 것이다.
핵산은 전체 세포, 세포 용해물에 존재할 수 있거나, 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 기타(Ausubel et al., 1988) 등을 포함한 표준 기술에 의해 정제될 때 "분리(isolated)" 또는 "실질적으로 순수하게(rendered substantially pure)" 된다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 한 구현예에서, 핵산은 파지 디스플레이 벡터와 같은 벡터 또는 재조합 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, VH 및 VL 세그먼트를 암호화하는 DNA 단편을 얻으면, 이러한 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있어, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환할 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편(예를 들어, 표 1에서 정의된 바와 같은 VL 및 VH)은 또 다른 DNA 분자, 또는 항체 불변 영역 또는 유연한 링커와 같은 또 다른 단백질을 암호화하는 단편에 작동가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"은 두 개의 DNA 단편이 기능적 방식으로 연결되어, 예를 들어 두 개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임 내에 남아있거나, 또는 단백질이 목적하는 프로모터의 제어 하에 발현되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 작동가능하게 연결된 VH-암호화 DNA에 의해 전장 중쇄 유전자에서 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 또 다른 DNA 분자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있고(Kabat et al., 1992), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소타입, 예를 들어 인간 IgG1 아이소타입 중 선택된다. 다른 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG4 아이소타입, 예를 들어 인간 IgG4 아이소타입 중 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결됨으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자로)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있고(Kabat et al., 1992), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭으로 얻을 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFV 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편은 유연성 링커를 암호화하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3을 암호화하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, 유연한 링커에 의해 VH 및 VL 서열과 연결된 VL 및 VH 영역을 갖는 인접한 단일-사슬 단백질로 발현할 수 있다(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988; McCafferty et al., 1990).
단일클론항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체는, 예를 들어 당업계에 잘 알려진 것과 같은 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법(Morrison, 1985)을 조합 사용하여 숙주세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다.
예를 들어, 항체, 또는 이들의 항체 단편을 발현하기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA는 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술(예를 들어, 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 DNA 화학적 합성, PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻을 수 있고, DNA는 발현 벡터에 삽입되어 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"은 항체 유전자가 벡터에 연결되어 벡터 내 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하는 것을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 대조군 서열은 사용된 발현 숙주세포와 양립할 수 있도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로 두 유전자가 동일한 박현 벡터로 삽입될 수 있다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 무딘 말단 결찰)에 의해 발현 벡터로 삽입된다. 본 명세서에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 목적하는 아이소타입의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하는 발현 벡터에 그들을 삽입함으로써 임의의 항체 아이소타입의 전장 항체 유전자를 생성하여, VH 세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 세그먼트는 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 벡터 내로 클로닝되어 신호 펩타이드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임 내로 연결될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질의 신호 펩타이드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 더하여, 본 명세서에 개시된 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 운반한다. 용어 "조절 서열(regulatory sequence)"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어 Goeddel's 간행물 (Goeddel, 1990)에 개시되어 있다. 조절 서열의 선별을 포함한 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 포유류 숙주세포 발현에 대한 조절 서열은 거대세포바이러스(CMV), 유인원바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)), 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열은 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터와 같은 것이 사용될 수 있다. 더 나아가, 조절 요소는 SV40 초기 프로모터의 서열과 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복을 포함하는 SRa 프로모터 시스템과 같은 다양한 소스의 서열로 구성된다(Takebe et al., 1988).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주세포(예를 들어, 복제 기원) 및 선별가능한 마커 유전자의 복제를 조절하는 서열과 같은 추가 서열을 운반할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, U.S. 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017, 모두 Axel et al. 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주세포에서, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선별가능한 마커 유전자는 디하이드로엽산염 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선별/증폭이 있는 dhfr- 숙주세포에서 사용) 및 네오(neo) 유전자(G418 선별용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)은 표준 기술에 의해 숙주세포로 형질감염된다. 용어 "형질감염(transfection)"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주세포로 도입하는데 일반적으로 사용된 광범위한 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하도록 의도된다. 이론적으로는 원핵 또는 진핵 숙주세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것이 가능하다. 진핵세포, 예를 들어 포유류 숙주세포, 효모 또는 사상 진균에서 항체의 발현은 이러한 진핵세포, 및 특히 포유류 세포가 원핵세포보다 적절하게 접혀있고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문에 논의된다.
한 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5 중 임의의 하나의 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열을 포함한다.
본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 포유류 숙주세포는 DHFR 선별가능한 마커(Kaufman 및 Sharp, 1982에 설명됨), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포, dhfr- CHO 세포, 예를 들어 GS XceedTM 유전자 발현 시스템(Lonza)와 함께 CS CHO 세포주를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포에 도입될 때, 항체는 숙주세포에서 항체의 발현을 위한 충분한 시간동안 숙주세포를 배양함으로써 생성될 수 있고, 선택적으로, 숙주세포가 성장하는 배양 배지로 항체가 분비된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 분비된 후 예를 들어 배양 배지에서 회수 및 정제될 수 있다(Shukla et al., 2007).
한 특정 구현예에서, 본 발명의 숙주세포는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5 각각의 발현에 적합한 코딩 서열을 갖는 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포이다.
예를 들어, 본 발명은 mAb1의 중쇄 및 경쇄 각각을 암호화하는 SEQ ID NO: 8 및 10의 핵산을 적어도 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.
그 후 후자 숙주세포는 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5 각각으로 이루어진 군에서 선택된 본 발명의 항체의 발현과 생산에 적합한 조건 하에서 추가로 배양될 수 있다.
대안적으로, 무세포 발현 시스템은 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5 중 임의의 생산에 사용될 수 있다. 전형적으로, 단백질 또는 항체의 무세포 발현 방법은 이미 기술되어 있다(Stech et al., 2017).
면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 독소, 약물(예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성 독소와 같은 치료적 모이어티가 접합된 본 명세서에 개시된 항-BTN3A 항체, 또는 이들의 단편을 특징으로 한다. 이러한 접합체는 본 명세서에서 "면역접합체(immunoconjugate)"를 의미한다. 하나 이상의 세포 독소를 포함하는 면역접합체는 "면역 독소(immunotoxin)"를 의미한다. 세포 독소 또는 세포 독성제는 세포에 해로운(예를 들어, 사멸하는) 임의의 물질을 포함한다. 예는 탁손, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화 에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, t. 콜키친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1 - 디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동종체를 포함한다. 치료제는 또한, 예를 들어, 대사길항제(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 다카바진), 용제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로락슨부실, 메이팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II)(DDP) 시스플라틴, 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(기존명 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(기존명 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함된다.
세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커를 사용하여 본 발명의 항체에 접합될 수 있다. 세포독소를 항체에 접합하는데 사용된 링커 타입의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 하이드라존, 티오에테르, 에스터, 디설파이드 및 발린-시트룰린 링커와 같은 펩타이드-함유 링커를 포함한다. 링커는, 예를 들어 리소좀 구획 내에서 낮은 pH에 의한 절단에 민감하거나, 카텝신(예를 들어, 카텝신 B, C, D)와 같은 종양 세포에서 우선적으로 발현되는 프로테아제와 같은 프로테아제에 의한 절단에 민감한 것이 선택될 수 있다.
항체에 치료제를 접합하기 위한 세포독소 유형, 링커 및 방법에 대한 추가 논의는 항체 약물 접합체에 대한 리뷰인 Panowski et al., 2013을 참조한다.
본 발명의 항체는 또한 방사성 동위원소와 접합시켜 방사성 면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성 의약품을 생성할 수 있다. 진단적으로 또는 치료적으로 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 요오드131, 인듐111, 이트륨90, 및 루테튬177을 포함한다. 방사성 면역접합체의 제조 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다.
이중 특이적 또는 다중 특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-BTN3A 항체를 포함하는 이중 특이적 또는 다중 특이적 분자가 본 명세서에 추가로 개시된다. 항체는 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어 적어도 두 개의 다른 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중 특이적 분자를 생성한다. 항체는 실제로 유도체화되거나 하나 이상의 기능적 분자에 연결되어 두 개 이상의 다른 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 다중 특이적 분자를 생성한다; 이러한 다중 특이적 분자는 또한 본 명세서에서 사용된 용어 "이중 특이적 분자"에 포함되도록 의도된다. 이중 특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 이중 특이적 분자가 생성되도록 또 다른 항체, 항체 단편, 펩타이드 또는 결합 모방체와 같은 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 결합, 유전적 융합, 비공유 결합 등에 의해)되어 연결될 수 있다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 BTN3A, 예를 들어 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5 중 임의의 하나의 한 항원-결합 부분에 대한 제1 결합 특이성 및 두번째 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중 특이적 분자를 포함한다.
추가적으로, 이중 특이적 분자가 다중 특이적인 구현예에 대해, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더해 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본 명세서에 개시된 이중 특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 하나의 항체, 또는 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 유니바디 또는 단일 사슬 Fv를 포함하는 이들의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 다이머, 또는 Ladner et al. U.S. 특허 4,946,778에서 기술된 바와 같은 Fv 또는 단일 사슬 구조체와 같은 이들의 최소 단편일 수 있다.
본 명세서에 개시된 이중 특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 단일클론항체이다.
본 발명의 이중 특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구성 결합 특이성을 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 각각의 이중 특이적 분자의 이중-특이성은 개별적으로 생성된 다음, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제는 공유 접합을 위해 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-I-카르복실레이트(sulfo-SMCC)을 포함한다(Karpovsky et al., 1984; Liu et al., 1985). 또 다른 방법은 Brennan et al., 1985; Glennie et al., 1987; Paulus, 1985에 기술된 것을 포함한다.
대안적으로, 두 결합 특이성은 동일한 벡터에서 암호화되고 동일한 숙주세포에서 발현되고 조립될 수 있다. 이 방법은 이중 특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중 특이적 분자는 하나의 단일 사슬 항체와 결합 결정기, 또는 두 개의 결합 결정기를 포함하는 단일 사슬 이중 특이적 분자를 포함하는 단일 사슬 분자일 수 있다.
특정 표적에 대한 이중 특이적 분자의 결합은, 예를 들어 효소-결합면역흡착측정 분석(ELISA), 방사면역분석(REA), FACS 분석, 생물분석(예를 들어, 성장 억제 및 세포사멸), 또는 웨스턴블롯 분석에 의해 확인될 수 있다. 이러한 분석법 각각은 일반적으로 관심 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 사용하여 특정 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
본 발명의 항체는 또한 인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CARs)라고도 알려짐)를 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역은 스페이서를 통해 막 횡단 도메인(전형적으로 CD8 알파의 막 횡단 도메인) 및 TCR의 신호전달 엔도도메인(예를 들어, CD3 제타) 및 선택적으로, 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28)과 연결되고, T 세포의 표면에서 생산될 수 있다. 이러한 CAR는, 예를 들어 증식성 질환의 치료를 위한 양자 전이 치료에 사용될 수 있다.
약학 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 하나의 항체 또는 항체의 조합, 예를 들어, mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5로 이루어진 군에서 선택된 하나의 항체 또는 이들의 항체-결합 부분이 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화된 항체의 조합을 포함하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 상기 기술된 바와 같은 항체, 또는 면역접합체 또는 이중 특이적 분자의 하나 또는 조합(예를 들어, 둘 이상의 상이한)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 약학 조성물은 또한 병용 요법으로, 즉 다른 제제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 본 발명의 항-BTN3A 항체, 예를 들어, mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5로 이루어진 군에서 선택된 하나의 항체 또는 이들의 항원-결합 부위가 적어도 하나의 항바이러스제, 항염제 또는 또 다른 항증식제와 조합된 것을 포함할 수 있다. 병용 요법과 조합되어 사용될 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 항체의 용도에 대한 섹션에서 하기에 더욱 자세하게 기술된다.
본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 생리학적으로 적합한 임의 및 모든 용매, 분석매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 한 구현예에서, 담체는 피하 경로 또는 종양 내 주사에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중 특이적 분자는 물질에 코팅되어 화합물이 불활성화될 수 있는 산 작용 및 기타 자연 조건으로부터 화합물을 보호할 수 있다.
멸균 인산염-완충 식염수는 약제학적으로 허용가능한 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다(Remington and Gennaro, 1995). 제형은 하나 이상의 부형제, 방부제, 가용화제, 완충제, 알부민을 추가로 포함하여 바이알 표면의 단백질 손실 등을 방지할 수 있다.
약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 치료될 조건, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 달라진다.
본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
바람직하게, 약학 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함한다. 이들은 특히 등장성, 멸균, 식염수(모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 이러한 염의 조합)일 수 있거나, 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수를 첨가하면 주사가능한 용액의 구성이 가능한 건조, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 매개변수의 함수, 및 특히 사용된 투여 방식, 관련 병리학, 또는 대안적으로 목적하는 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다.
약학 조성물을 제조하기 위해, 항체의 유효량은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매체에서 용해되거나 분산될 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩 기름 또는 수용성 프로필렌 글리콜; 및 멸균된 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 파우더 또는 동결건조물을 포함한다. 모든 경우에서, 형태는 멸균되어야 하고, 쉽게 시린지 형태에서 배출될 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 보관 또는 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 방부제를 포함하여 미생물의 성장을 방지할 수 있다.
본 발명의 항체는 중성 또는 염 형태로 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 산 부가 염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)을 포함하고, 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산과 같은 유기산 등으로 형성된다. 자유 카르복실기로 형성된 염은 또한 예를 들어 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
담체는 또한, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우에서, 등장제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
멸균된 주사가능한 용액은 요구량의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 다양한 성분들과 함께 적당한 용매에 혼힙시킨 다음, 멸균 미소여과시킴으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 화합물을 기본 분산 매질과 상기 열거된 것 중에서 요구되는 기타 성분을 함유하는 멸균성 담체 내로 혼합함으로써 제조한다. 멸균된 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균성 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술로, 활성 성분의 분말과 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가 목적 성분을 생성한다.
DMSO를 용매로 사용하는 것이 매우 빠른 침투를 초래하여 작은 종양 영역에 고농도의 활성제를 전달하는 직접 주사를 위한 더 많은 또는 고농축 용액의 제조도 고려된다.
제형화시, 용액은 투여 제형과 양립 가능한 방식으로 치료적 유효량으로 투여될 것이다. 제형은 앞서 기술한 주사가능한 용액의 타입과 같은 다양한 투여 형태로 쉽게 투여되지만 약물 방출 캡슐 등이 또한 사용될 수 있다.
수용액에서의 비경구 투여의 경우, 예를 들어, 액체 희석액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 용액은 충분한 식염수 및 포도당으로 등장성이 되도록 해야 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 ml의 피하용해액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들어 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580 참조). 투여량의 일부 변화는 치료받는 대상의 증상에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여 책임자는, 어떤 경우에도, 개별 개체에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다.
본 발명의 항체는 치료적 혼합물 내 제형화되어 투여량 당 약 0.0001 내지 1.0 밀리그람, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그람, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 1.0 내지 약 10 밀리그람으로 포함될 수 있다. 다중 투여량이 또한 투여될 수 있다.
항체의 주입 또는 피하 주사를 위한 용액의 적합한 제형은 당업계에 설명되어 있고, 예를 들어 Cui et al (Drug Dev Ind Pharm 2017, 43(4): 519-530)에서 검토되었다.
정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구 투여에 대해 제제화된 화합물에 더하여, 다른 약제학적으로 허용가능한 형태는, 예를 들어 경구 투여용 정제 또는 다른 고형; 시간 방출 캡슐; 및 현재 사용되고 있는 다른 형태를 포함한다.
특정 구현예에서, 리포좀 및/또는 나노입자의 사용은 숙주세포 내로 항체를 도입하는데 고려된다. 리포좀 및/또는 나노입자의 형성 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 고분자 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자(약 0.1 μm 크기)는 일반적으로 생체 내에서 분해될 수 있는 고분자를 사용하여 설계된다. 이러한 요구를 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자는 본 발명에서 사용하기 위해 고려되고, 이러한 입자는 쉽게 제조될 수 있다.
리포좀은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되고, 동시에 다층라멜라 동심성 이중층 소포(다층라멜라 소포(MLV)라고도 함)를 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파 처리는 코어에 수용액을 포함하는, 직경이 200 내지 500 Å의 범위를 갖는 작은 유니라멜라 소포(SUV)를 형성한다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
본 발명의 항체의 용도 및 방법
본 발명의 항체는 시험관 내 및 생체 내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이러한 분자는 다양한 질환을 치료, 예방 또는 진단하기 위해, 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내, 또는 개체, 예를 들어 생체 내에서 배양 중인 세포에 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료하다(treat)" "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 (1) 질병을 억제하는 것; 예를 들어, 질병, 증상 또는 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질병, 증상 또는 질환을 억제하는 것(즉, 병리 및/또는 증상의 추가 발달을 저지함); (2) 질병을 개선하는 것; 예를 들어, 질병의 중증도를 감소시키거나 질병의 하나 이상의 증상을 감소 또는 완화시키는 것과 같이 질병, 증상 또는 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질병, 증상 또는 질환을 개선하는 것(즉, 병리 및/또는 증상을 반전하는 것)의 하나 이상을 의미한다. 특히, 종양 치료와 관련하여, 용어 "치료(treatment)"는 종양 성장의 억제, 또는 종양 크기의 감소를 의미할 수 있다.
본 발명의 항체는 항-BTN3A 활성화 항체이고, 세포용해 기능, 사이토카인 생산 및/또는 Vγ9 Vδ2 T 세포의 증식을 활성화할 수 있으며, 이에 따라 암 환자 및 면역 감염동안 관찰되는 면역억제 기작을 극복하는데 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "암(cancer)", 과증식성(hyperproliferative)" 및 "종양성(neoplastic)"은 자율성 증식, 즉, 빠르게 증식하는 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적 상태 또는 증상에 대한 능력을 갖는 세포를 의미한다. 과증식성 및 종양성 질병은 병리적, 즉 질병 상태를 특성화하거나 구성하는 것으로 분류될 수 있거나, 비-병리적, 즉 정상으로부터의 이탈이지만 질병 상태와 관련이 없는 것으로 분류될 수 있다. 이 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습 단계에 관계없이, 모든 유형의 암성 성장 또는 종양 발생 과정, 전이성 조직 또는 악성 형질전환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "암(cancer)" 또는 "신생물(neoplasms)"은 폐, 유방, 갑상선, 림프계, 위장관 및 비뇨 생식계에 영향을 미치는 것과 같은 다양한 기관계의 악성 종양뿐만 아니라, 대부분의 결장암, 신장암, 전립선암 및/또는 고환 종양, 비소세포폐암, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함하는 선암을 포함한다.
암의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL), B-NHL, T-NHL, 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 소형림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma, MCL), NK-세포 림프성 신생물 및 급성 골수성 백혈병을 포함한 골수세포 계통 신생물을 포함한다.
비-혈액암의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 결장암, 유방암, 폐암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 방광암, 대장암, 골암, 자궁경부암, 자궁암, 간암, 구강암, 식도암, 갑상선암, 신장암, 위암, 고환암 및 피부암을 포함한다.
만성 감염의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 만성 감염, 폐 감염, 하기도 감염, 기관지염, 인플루엔자, 폐렴 및 성병과 같은 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균 감염을 포함한다.
바이러스 감염의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 간염(HAV, HBV, HCV), 단순포진(HSV), 대상포진, HPV, 인플루엔자(Flu), 에이즈 및 에이즈 관련 증후군, 수두(바리셀라), 감기, 거대세포바이러스(CMV) 감염, 두창(바이올라), 콜로라도진드기열, 뎅기열, 에볼라 출혈열, 구제역, 라싸열, 홍역, 마르부르크 출혈열, 감염단핵구증, 볼거리, 노로바이러스, 소아마비, 진행성 다초점 백질뇌병증(PML), 광견병, 풍진, SARS, 바이러스성 뇌염, 바이러스성 위장염, 바이러스성 뇌수막염, 바이러스성 폐염, 웨스트 나일열 및 황열을 포함한다. 박테리아 감염의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 폐렴, 세균성 수막염, 콜레라, 디프테리아, 결핵, 탄저병, 보툴리눔독소증, 브루셀라병, 캠피로박테리아증, 발진티푸스, 임질, 리스테리아병, 라임병, 류마티스열, 백일해(Whooping Cough), 흑사병, 살모넬라증, 성홍열, 세균성 이질, 매독, 파상풍, 트라코마, 야토병, 장티푸스, 및 요로감염을 포함한다. 예는 또한 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 트로페리마 위플레(Tropheryma whipplei), 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 마이코박테리움 카네티(Mycobacterium canettii)에 의해 유발되는 박테리아성 감염을 포함한다.
기생충 감염의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 말라리아, 리슈마니아증, 트리파노소마증, 샤가스병, 크립토스포리디오시스증, 간질증, 필라리아증, 아메바성 감염, 지아디아증, 요충증, 주혈흡충증, 조충증, 톡소플라즈마증, 섬모충증 및 트리파노소마증을 포함한다. 진균 감염의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 칸디다증, 아스페르길루스증, 콕시디오이데스진균증, 크립토코커스증, 히스토플라즈마증 및 무좀을 포함한다.
따라서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에서 상기 개시된 질환 중 하나를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 개시된 바와 같은 치료학적 유효량의 항-BTN3A 항체, 전형적으로 mAb1, mAb2, mAb4 또는 mAb5 중 하나를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 개체는 BTN3A 발현 종양을 갖는 환자 중에서 선택되었다.
상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 항체는 단독 활성 성분으로서 또는 예를 들어 보조제와 결합된 상태로, 또는 다른 약물, 예를 들어 사이토카인, 항바이러스제, 항염제 또는 세포 독성, 항증식제, 화학 요법, 세포 치료제 제품(예를 들어, ηδ T 세포 조성물)에 대한 조합으로, 예를 들어, 상기 언급한 질병의 치료 또는 예방을 위해 투여될 수 있다.
예를 들어, 상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 항체는 세포 치료법, 특히 γδ T 세포 치료법, 화학요법, 항신생물제, 또는 면역치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포 치료법(cell therapy)"은 치료를 필요로 하는 개체에게 적어도 치료학적 유효량의 세포 조성물을 생체 내 투여하는 것을 포함하는 치료법을 의미한다. 환자에게 투여되는 세포는 동종 또는 자가세포일 수 있다. 용어 "γδ T 세포 치료법(γδ T cell therapy)"은 세포 조성물이 활성 원리로서 γδ T 세포, 특히 Vγ9/Vδ2 T 세포를 포함하는 세포 치료법을 의미한다.
세포 치료 제품은 치료 목적으로 상기 환자에게 투여되는 세포 조성물을 의미한다. 상기 세포 치료 제품은 치료학적 유효량의 세포 및 선택적으로 추가 부형제, 보조제 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
적합한 항종양제는 알킬화제(예를 들어, 시클로포스파마이드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 니트로소우레아, 테모졸로마이드), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토산트론, 발루비신), 탁산(예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀), 에포틸론, 토포이소머라아제 I 억제제(예를 들어, 이리노테칸 또는 토포테칸), 토포이소머라아제 II 억제제(예를 들어, 에토포시드, 테니포시드, 또는 타플루포시드), 뉴클레오타이드 유사체 및 전구체 유사체(예를 들어, 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 플루오루라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 또는 티오구아닌), 펩타이드 항생제(예를 들어, 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴), 레티노이드(예를 들어, 트레티노인, 알리트레티노인, 벡사로텐), 빈카 알칼로이드 및 유도체(예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 인산화효소 억제제(예를 들어, 이브루티닙, 이델라리시브, 엘로티닙, 게피티닙, 이매티닙, 베무라티닙, 비스모데깁), 단백질분해효소 억제제(예를 들어, 보르테조밉, 카필조밉), 히스톤 탈아세틸화효소 억제제(보리노스탓 또는 로미뎁신)을 제한없이 포함할 수 있다.
면역치료제의 예는 인 항원(예를 들어, 졸레드론산 또는 다른 비스포스네이트), 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체 및 사이토카인(예를 들어, 인터류킨 2(IL-2) (Choudhry H et al, 2018, Biomed Res Int. 2018 May 6), 인터류킨 15(IL-15) (Patidar M et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2016 Oct;31:49-59), 인터류킨 21(IL-21) (Caccamo N. et al., PLoS One. 2012;7(7):e41940), 또는 인터류킨 33(IL-33) (Duault C et al., J Immunol. 2016 Jan 1;196(1):493-502)), 또는 이들의 재조합 형태 및 이들의 유도체, 또는 림프구 활성(예를 들어, 증식 또는 사이토카인 생산 또는 대사 변화)을 유도할 수 있는 임의의 사이토카인을 제한없이 포함한다. 용어 유도체는 페길화(PEGylation)(예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 사슬에 대한 접합), 아미노산 결실, 치환 또는 삽입과 같은 돌연변이, 또는 강화제와의 결합(예를 들어, IgG1 Fc에 융합된 IL15/IL15Ra 복합체이고, 여기서 IL-15가 추가로 돌연변이(asn72asp)되어 생물학적 활성을 추가로 증가시켜 이 복합체를 IL-2 및 IL-15Rβγ 수퍼 효능제로 만든다(Rhode PR et al, Cancer Immunol Res. 2016;4(1):49-60))에 의존할 수 있는 임의의 사이토카인 변형을 위해 사용된다) (Barroso-Sousa R et al, Curr Oncol Rep. 2018 Nov 15;21(1):1).
용어 "IL-2"는 일반적인 의미를 가지며, 인간 인터류킨-2를 의미한다. IL-2는 신체의 자연 면역 반응의 일부이다. IL-2는 주로 IL-2 수용체에 결합함으로써 림프구 활성을 조절한다.
용어 "IL-15"는 일반적인 의미를 가지며, 인간 인터류킨-15를 의미한다. IL-2와 같이, IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 사슬(CD122)와 일반적인 감마 사슬(감마-C; CD132)로 구성된 복합체를 통해 결합하고 신호를 보낸다. IL-15는 T 및 자연 살해(NK) 세포의 활성화 및 증식을 조절한다.
용어 "IL-21"는 일반적인 의미를 가지며, 인간 인터류킨-21를 의미한다. IL-21은, 이에 제한되는 것은 아니나, NK 세포 및 CD8+ T 세포 세포독성을 증진하는 것, 플라즈마 세포 분화를 조절하는 것 및 Treg 세포를 억제하는 것을 포함하는 다발성 특성에 기인해왔다.
용어 "IL-33"은 일반적인 의미를 가지며, 인간 인터류킨-33을 의미한다. 조직 스트레스 또는 손상시 방출되는 알라민으로 간주되는 IL-33은 IL-1 패밀리의 구성원이고 ST2 수용체에 결합한다. IL-13은 TH1 면역세포, 자연살해(NK) 세포, iNKT 세포, 및 CD8 T 림프구의 효과적인 자극제로서 알려져 있다.
용어 "PD-1"은 당업계의 일반적인 의미를 가지며, 계획된 사멸-1 수용체을 의미한다. 용어 "PD-1"은 또한 CD28, 세포독성 T-림프구-관련 항원 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4), 유도성 공동자극제(inducible costimulator, ICOS), 및 B- 및 T-림프구 감쇠자(B- and T-lymphocyte attenuator, BTLA)를 포함하는 CD28-B7 신호전달 수용체 패밀리에 속하는 타입 I 막 횡단 단백질을 의미한다(Greenwald RJ et al., 2005, Riley JL et aL., 2005).
용어 "BTLA"는 당업계의 일반적인 의미를 가지며, B 림프구 및 T 림프구 감쇠자를 의미한다. 용어 "BTLA"는 또한 CD28, 세포독성 T-림프구-관련 항원 4(CTLA-4), 유도성 공동자극제(ICOS), 및 계획된 사멸-1 수용체(PD-1)을 포함하는 CD28-B7 신호전달 수용체 패밀리의 구성원인 CD272를 의미한다(Greenwald RJ et al., 2005, Riley JL et aL., 2005).
용어 "항-PD-1 항체(anti-PD1 antibody)" 또는 "항-PD-L1(anti-PD-L1)"은 당업계의 일반적인 의미를 가지며, 각각 PD-1 또는 PD-L1에 대한 결합 친화도 및 PD-1에 대한 길항제 활성을 갖는 항체를 의미하고, 즉, PD-1과 관련된 신호 전달 캐스케이드를 억제하고 PD-1 리간드 결합(PD-L1; PD-L2)을 억제한다. 이러한 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체는 CD28-B7 신호 전달 수용체 패밀리(CD28; CTLA-4; ICOS; BTLA)의 서브-타입 또는 아이소타입과의 상호작용보다 각각 더 큰 친화도 및 효능으로 PD-1을 우선적으로 비활성화시킨다. 화합물이 PD-1 길항제인지 여부를 결정하기 위한 테스트 및 분석은 Greenwald et al., 2005; Riley et al., 2005에 설명된 바와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.
이러한 항-PD1 또는 항-PDL1 항체의 예는 제한없이, 니볼루맙, 펨브로리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 세미플리맙, 또는 아테졸리주맙을 포함한다.
이러한 항-CTLA4 항체의 예는 제한없이, 이필리무밥을 포함한다.
용어 "항-BTLA 항체(anti-BTLA antibodies)"는 당업계의 일반적인 의미를 가지며, BTLA에 대한 결합 친화도 및 길항 활성을 갖는 항체를 의미하고, 즉 BTLA와 관련된 신호 전달 캐스케이드를 억제할 수 있다. 화합물이 BTLA 길항제인지 결정하기 위한 테스트 및 분석은 (Greenwald et al., 2005; Riley et al., 2005)에 기술된 바와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 항-BTLA 항체는 국제특허출원 WO2010/106051; WO2011/014438; WO2017/144668에서 설명된 것으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 항-BTLA 항체는 WO2010/106051에 개시된 바와 같은 CNCM 기탁번호 I-4123 하에 접근가능한 하이브리도마로부터 수득할 수 있는 BTLA 항체(BTLA8.2)이다.
일부 구현예에서, 항-BTLA 항체는 WO2011/014438에 개시된 4C7 mAb이다.
일부 구현예에서, 항-BTLA 항체는 WO2017/144668에 개시된 mAb 629.3 mAb 또는 이의 인간화 버전 또는 이들의 변이체이다.
전술한 바에 따르면, 본 발명은 또 다른 측면을 제공한다:
상기 정의된 방법은 공동-투여, 예를 들어 부수적으로 또는 순차적으로, 치료학적 유효량의 본 발명의 항-BTN3A 항체, 및 적어도 하나의 제2 약물 물질을 포함하고, 상기 제2 약물 물질은, 상기 표시된 것과 같은, 항바이러스제 또는 항증식제 또는 면역치료제(예를 들어, 항-PD-1, 항-PD-L1 항체), 또는 예를 들어 IL-2 또는 IL-15와 같은 사이토카인, 또는 세포 치료제 제품(예를 들어, γδ T 세포)이다.
한 구현예에서, 본 발명의 항체는 가용성 BTN3A 수준, 또는 BTN3A를 발현하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체와 BTN3A(예를 들어, 혈액 샘플에서 세포 표면 또는 가용성 BTN3A에서 발현됨) 간의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서 샘플(예를 들어, 시험관 내 샘플) 및 대조군 샘플을 항-BTN3A 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 BTN3A 간에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다. 예를 들어, ELISA 및 유세포 분석과 같은 당업계에 잘 알려진 표준 검출 방법은 본 발명의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 샘플 및 대조군 샘플을, 항체 또는 이의 일부와 BTN3A 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서, BTN3A에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 단백질, 또는 그의 항원 결합 영역과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 BTN3A(예를 들어, 인간 BTN3A 항원)의 존재를 검출하거나, BTN3A의 양을 측정하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 그 다음 복합체의 형성이 검출되고, 여기서 대조군 샘플에 비해 샘플 간의 복합체 형성의 차이는 샘플에 BTN3A가 존재함을 나타낸다.
또한 본 발명의 범위 내에는 본 명세서에 개시된 조성물(예를 들어, 인간화 항체, 접합된 항체 및 다중 특이적 분자) 및 사용 설명서로 구성된 키트가 있다. 키트는 적어도 하나의 추가 시약, 또는 하나 이상의 추가 항체 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 표지가 포함된다. 용어 표지는 키트에 또는 키트와 함께 제공되는 임의의 서면 또는 기록된 자료를 포함한다. 키트는 환자가 상기 정의된 바와 같이 항-BTN3A 항체에 반응할 그룹에 속하는지 여부를 진단하기 위한 도구를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 치료 전략은 인간 개체의 샘플로부터 분리된 Vγ9 Vδ2 T 세포를 선택적으로 확장 및/또는 활성화하는 제제로서 본 명세서에 개시된 인간화 항체의 용도를 기반으로 한다.
따라서 본 발명은 하기를 포함하는 치료를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다:
(a) Vγ9 Vδ2 T 세포를 포함하는 혈액 세포, 예를 들어, 개체의 혈액 샘플의 PBMC를 분리하는 단계,
(b) mAb1, 2, 4 및 5 중 어느 하나, 및 선택적으로 다른 종양 또는 보조 세포의 존재 하에 시험관 내 Vγ9 Vδ2 T 세포를 확장하는 단계,
(c) 확장된 Vγ9 Vδ2 T 세포를 수집하는 단계,
(d) 선택적으로, 확장된 Vγ9 Vδ2 T세포를 제형화하고, 치료학적 유효량의 상기 Vγ9 Vδ2 T 세포를 개체에게 투여하는 단계.
본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) Vγ9 Vδ2 T 세포를 선택적으로 확장하는 제제로서 본 발명에 개시된 인간화 항체(예를 들어, mAb1, mAb2, mAb4 또는 mAb5)의 용도에 관한 것이다. CAR γδ T 세포 및 이들의 입양 T 세포 암 면역치료법에서의 용도는 예를 들어 Mirzaei et al (Cancer Lett 2016, 380(2): 413-423)에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 전형적으로 암을 앓고 있는, 이들을 필요로 하는 개체에서 γδ T 세포 치료법에서 종양 세포의 강화제로서 생체 내 사용을 위한 항-BTN3A 항체에 관한 것이다.
본 명세서에서, 용어 γδ T 세포 치료법은 적어도 유효량의 γδ T 세포를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 치료법을 의미한다. 이러한 γδ T 세포는 동종 또는 자가세포일 수 있다. 특정 구현예에서, γδ T 세포는 특정 유전자의 결실 또는 녹-아웃 또는 삽입 또는 녹-인에 의해 유전적으로 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 γδ T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 γδ T 세포를 포함한다. γδ T 세포는 생체 외에서 확장 및/또는 정제되었을 수 있다. 대안적으로, γδ T 세포는 또한 또 다른 혈액세포, 및 예를 들어 면역계의 다른 세포를 포함하는 세포 조성물에 포함될 수 있다. γδ T 세포 치료법에 대한 참고를 위해, Pauza CD. et al, Front Immunol. 2018 Jun 8;9:1305. doi: 10.3389, Saudemont A. et al, Front Immunol. 2018 Feb 5;9:153. doi: 10.3389를 참고한다.
실제로, 임의의 특정 이론에 의해 얽매이지 않고, 본 발명의 항-BTN3A 항체의 제안된 작용 방식은 종양 세포의 표면에서 발현된 BTN3A에 대한 이들의 결합이 Vγ9Vδ2 T 세포 상의 그의 카운터-수용체로의 신호 전달을 허용하는 형태적 변화를 유발한다는 것이다.
따라서, 본 발명은 암, 예를 들어 혈액 악성종양, 특히 급성 골수성 백혈병과 같은 백혈병으로 고통받는 개체 및 종양 세포, 예를 들어 혈액 종양 세포를 갖는 개체의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
(i) 본 명세서에 개시된 바와 같은 유효량의 항-BTN3A 항체, 전형적으로 mAb1, mAb2, mAb4 또는 mAb5를 상기 개체에 투여하는 단계, 및,
(ii)　상기 개체에 유효량의 γδ T 세포를 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 유효량의 항-BTN3a 항체는 상기 종양 세포에 대한 상기 γδ T 세포 조성물에 의해 매개되는 항종양 세포 분해를 강화하는 능력을 갖는다.
본 발명은 추가로 고형 종양세포, 예를 들어 자궁암 세포를 갖는 암으로 고통받는 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
(i)　본 명세서에 개시된 바와 같은 유효량의 항-BTN3A 항체, 전형적으로 mAb1, mAb2, mAb4 또는 mAb5를 상기 개체에 투여하는 단계, 및,
(ii)　상기 개체에 유효량의 γδ T 세포를 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 유효량의 항-BTN3a 항체는 상기 종양 세포에 대한 상기 γδ T 세포 조성물에 의해 매개되는 항종양 세포 분해를 강화하는 능력을 갖는다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 CAR T 세포, 예를 들어, CAR γδ T 세포, 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간화 항체(예를 들어, mAb1, mAb2, mAb4 또는 mAb5)의 병용(동시 또는 순차적) 투여를 포함한다.
충분하게 기술된 본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 단지 예시일 뿐 추가적인 제한을 의미하는 것은 아니다.
실시예
인간화된 변이체의 선별
1. 인간화 전략의 설명
a. 복합 인간 서열? 가변 영역 서열의 설계
뮤린 7.2 및 20.1 항체 V 영역의 구조적 모델은 스위스 PDB에 의해 생산되었고, 항체의 결합 특성에 필수적일 가능성이 있는 V 영역에서 중요한 "구속(constraining)" 아미노산을 식별하기 위해 분석되었다. 많은 프레임워크 잔기와 함께 CDR 내에 포함된 대부분의 잔기(Kabat 및 Chothia 정의 모두를 사용하는)는 중요한 것으로 간주되었다. 상기 분석으로부터 7.2 및 20.1 항체의 복합 인간 서열(Composite Human sequences)이 생성되었다.
b. CD4+ T 세포 에피토프 회피
구조적 분석을 기반으로, 7.2 및 20.1 인간화 변이체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 서열 세그먼트의 대규모 예비 세트가 선별되고, 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에 결합하는 펩타이드의 인실리코 분석을 위한 iTope™ 기술(Perry et al., 2008)과 공지된 항체 서열-관련 T 세포 에피토프의 TCED™(Bryson et al., 2010)를 사용하여 분석하였다. 인간 MHC 클래스 II에 대한 중요한 비-인간 생식세포 결합제로 확인되거나 TCED™에 대한 상당한 히트를 기록한 서열 세그먼트는 폐기되었다. 이로 인해 세그먼트가 감소되었고, 세그먼트 간의 접합부가 잠재적인 T 세포 에피토프를 포함하지 않는지 확인하기 위해, 상기와 같이, 이들의 조합을 다시 분석하였다. 선별된 서열 세그먼트를 중요한 T 세포 에피토프가 없는 것으로 예측되는 완전한 V 영역 서열로 조립하였다. 몇몇 중쇄 및 경쇄 서열이 mAb 7.2 및 20.1에 대한 포유류 세포에서의 유전자 합성 및 발현을 위해 선택되었다.
2. 인간화 변이체 생성 및 예비 특성화
a. 인간화 변이체 플라스미드의 구축
7.2 및 20.1 인간화 변이체는 인간 IgG4(S241P, L248E) 중쇄 및 카파 경쇄에 대한 발현 벡터 시스템으로 클로닝하기 위해 측면 제한효소 부위로 합성되었다. 모든 구조체는 서열분석에 의해 확인되었다.
b. 항체의 발현
키메라 7.2 및 20.1 (VH0/Vκ0), 두 개의 대조군 조합(VH0/Vκ1, VH1/Vκ0) 및 인간화 중쇄 및 경쇄의 조합은 상응하는 내독소가 없는(endotoxin-free) DNA의 MaxCyte STX® 전기천공 시스템(MaxCyte Inc., Gaithersburg, USA)을 사용하여 FreeStyle™ CHO-S 세포(ThermoFisher, Loughborough, UK)를 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염은 OC-400 프로세싱 어셈블리를 사용하여 각 항체에 대해 수행하였다. 세포 회수 후, 세포를 8 mM의 L-글루타민(ThermoFisher, Loughborough, UK) 및 1 x 히포잔틴-티미딘(ThermoFisher, Loughborough, UK)을 함유하는 CD Opti-CHO 배지(ThermoFisher, Loughborough, UK)에 3 x106 cells/mL로 희석하였다. 형질감염 24시간 후, 배양 온도를 32℃로 낮추고, 1 mM의 소듐 부티레이트(Sigma, Dorset, UK)를 첨가하였다. 배양은 (시작 부피의)3.6%의 사료(2.5%의 CHO CD Efficient Feed A (ThermoFisher, Loughborough, UK), 0.5%의 이스톨레이트(BD Biosciences, Oxford, UK), 0.25 mM의 글루타맥스(ThermoFisher, Loughborough, UK) 및 2 g/L의 포도당(Sigma, Dorset, UK))을 첨가하여 매일 배양물을 공급하였다. IgG 상층액 역가(titer)는 IgG ELISA에 의해 모니터링되고, 형질감염은 상층액을 수확하기 전에 최대 15일 동안 배양되었다.
c. 예비 친화도 측정: BTN3A에 결합하는 인간화 변이체의 단일 사이클 동역학 분석
모든 7.2 및 20.1 복합 인간 항체™(Composite Human Antibody™) 변이체의 결합을 평가하고 BTN3A에 대한 가장 높은 친화도를 갖는 항체를 선별하기 위해, 단일 사이클 동역학 분석을 Biacore T200 평가 소프트웨어 V2.0.1(Uppsala, Sweden)을 실행하는 Biacore T200 (일련번호 1909913)을 사용하여 형질감염된 세포 배양의 상층액에 대해 수행하였다.
ELISA에 의해 적정된 상층액으로부터 얻은 농도에 기반하여, 항체를 최종 농도가2 μg/ml가 되도록 2% BSA/PBS로 희석하였다. 각 사이클이 시작될 때, 항체를 단백질 A 칩(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)의 Fc2, Fc3 및 Fc4에 로딩하였다. IgG를 10 μl/min의 유속에서 포획하여 ~ 146.5 RU의 고정화 수준(RL)을 제공하였고, 이론적 값으로 ~ 50 RU의 RMax를 얻었다. 그런 다음, 표면을 안정화시켰다. BTN3A1-His를 분석물(Sino Biological Cat. No. 15973-H08H)로 하여 60 μl/min 의 유속에서 단일 사이클 동역학(single cycle kinetic) 데이터를 얻어 임의의 잠재적인 물질 전달 효과를 최소화할 뿐만 아니라, HBS-P+(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 실행 버퍼로 사용하였다. 키메라 항체로 여러 번 반복하여 동역학 사이클동안 표면 및 분석물의 안정성을 확인하였다. 참조 표면에 대한 비-특이적 결합의 차이를 수정하기 위해 참조 채널 Fc1의 신호(항체 없음)를 Fc2, Fc3 및 Fc4의 신호에서 빼었다. 3 포인트, 1.56 nM 내지 25 nM의 BTN3A1의 4배 희석 범위를 각 농도 사이에서 재생하지 않고 사용하였다. 증가하는 농도의 BTN3A1의 3회 주사에 대한 결합 단계를 매회 240초동안 모니터링하고, 단일 해리 단계를 BTN3A1의 마지막 주사 후 2000초동안 측정하였다. 단백질 A 표면의 재생은 10 mM의 글라이신-HCL pH 1.5의 2번 주사 후 240초의 안정화 기간을 사용하여 수행되었다.
각 항체 블랭크 실행의 신호(CD277 없음)를 감산하여 안정성의 차이를 수정하였다. 단일 사이클 동역학은 모든 인간화 변이체가 BTN3A에 결합됨을 입증하였다.
d. 항체의 정제
Biacore에 의해 측정된 친화도뿐만 아니라 iTope™ 스코어 및 각각의 인간화 변이체의 인간성 백분율을 기반으로, 추가 분석을 위해 최상의 친화도 및 최상의 iTope™ 스코어를 갖는 7.2 및 20.1 인간화 변이체를 선별하였다.
키메라 버전 및 가장 보존적으로 인간화된 변이체(VH1/Vκ1)와 함께 선별된 인간화 변이체는 추가 분석 테스트를 위해 정제되었다. 항체를 단백질 A 세파로스(sepharose) 컬럼 상의 세포 배양 상층액에서 정제한 다음, 10 mM의 소듐 아세테이트, 100 mM의 NaCl, pH 5.5를 이동상 및 최종 제형 버퍼(formulation buffer)로 사용하여 크기배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 수행하였다. 샘플은 예측된 아미노산 서열을 기반으로 흡광계수(Ec(0.1%))를 사용하여 OD280nm로 정량화되었다.
항체는 2 μg의 각각의 항체를 겔에 로딩하여 SDS-PAGE로 분석되었고, 전형적인 항체의 프로파일에 해당하는 밴드가 관찰되었다.
e. 결합 특성의 검증: 인간화 및 키메라 7.2 및 20.1 mAb 간의 경쟁 ELISA 분석
정제된 변이체는 상응하는 뮤린 항체와 경쟁하면서 재조합 BTN3A1-His(Sino Biological cat. no. 15973-H08H)에 대한 결합에 대해 테스트되었다. 키메라 (VH0/V
Figure pct00001
0) 및 관련 없는 인간 IgG4(S241P, L248E)를 비교를 위해 각 플레이트에서 테스트하였다.
BTN3A1을 0.5 μg/ml가 되도록 1x PBS로 희석하였고, 100 μl/well을 밤새 4℃에서 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 1x PBS/0.05% Tween (PBS-T)으로 3회 세척하였고, 실온에서 1시간동안 200 μl의 2% milk/PBS로 차단하였다. 희석 96-웰 플레이트에서, 고정된 농도의 뮤린 항체 7.2 또는 20.1(최종 농도 0.15 μg/ml)를 동일한 부피로 4배 적정 시리즈의 테스트 항체(차단 버퍼에 희석된 80 μg/ml(최종 농도40 μg/ml)에서 시작)에 첨가하였다. Nunc ELISA 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 후, 100 μl의 뮤린/테스트 항체 혼합물을 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 배양한 후, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, 차단 버퍼에서 1:1000으로 희석된 100 μl의 항-마우스 Fc HRP-표지된 2차 항체(Sigma, Dorset, UK)를 실온에서 1시간동안 적용하여 결합된 뮤린 항체를 검출하였다. 발색을 위해, 커피를 PBS-T로 3회 세척한 후, 100 μl 의 TMB 기질을 첨가하고, 실온에서 5분동안 배양하였다. 100 μl 의 3.0 M 염산으로 반응을 중지시키고, 450 nm에서 Dynex 플레이트 판독기를 사용하여 즉시 판독하였다.
IC50 값을 각 변이체에 대해 계산하고, 상대적 IC50 값을 인간화 변이체의 IC50을 동일한 플레이트에서 분석된 키메라 항체의 IC50으로 나누어 계산하였다.
3. 인간화 후보의 선별
a. 다중-사이클 역동학 분석
경쟁ELISA 및 열안정성 평가에서 생성된 데이터를 기반으로, Biacore T200 평가 소프트웨어 V2.0.1(Uppsala, Sweden)을 실행하는Biacore T200(일련번호 1909913) 기기를 사용하여 VH0/Vκ0 키메라 항체와 함께 대부분의 인간화 7.2 및 20.1 변이체에 대해 다중-사이클 역동학 분석을 수행하였다.
정제된 항체를 2 μg/ml의 농도가 되도록 2 % BSA/PBS로 희석하였다. 각 사이클이 시작될 때, 각 항체를 ~146.5 RU(~50RU의 RMax를 얻기 위한 이론적 값)의 밀도(RL)에서 단백질 A 상에 포획하였다. 포획한 다음, BTN3A1 항원(Sino Biological cat. no. 15973-H08H)의 주입 전에 표면을 안정화시켰다. BTN3A1은 25 내지 0.78 nM의 2배 희석 범위에서 0.1% BSA/HBS-P+(실행 버퍼)로 적정되었다. 결합 단계는 400초동안 모니터링되었고, 해리 단계는 35분(2100 초)동안 모니터링되었다. 동역학 데이터는 잠재적인 물질 전달 효과를 최소화하기 위해 50 μl/min의 유속을 사용하여 얻었다. 단백질 A 표면의 재생은 각 사이클이 끝날 때 10mM의 글라이신-HCL pH 1.5의 두 개의 주사를 사용하여 수행되었다. 두 개의 블랭크(BTN3A1 없음) 및 분석물의 단일 농도의 반복을 각 테스트 항체에 대해 수행하여 동역학 사이클 동안 표면 및 분석물의 안정성을 확인하였다. 참조 채널 Fc1의 신호를 Fc2, Fc3 및 Fc4의 신호에서 빼서, 참조 표면에 대한 비-특이적 결합의 차이를 보정하였다. 추가적으로, 각 Fc에 대한 블랭크 실행을 빼서 드리프트와 같은 임의의 항원-독립적 신호 변화를 보정하였다. 센서그램은 글로벌 RMax를 갖고 벌크 신호가 없는 일대일 결합 수학적 모델을 사용하여 장착되었다(불변 RI = 0 RU).
b. 인간 PBMC에서 유세포 분석에 의한 결합 분석
7.2 및 20.1 인간화 항체는 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 인간 PBMC에 대한 결합에 대해 특성화되었다. PBMC는 Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, UK) 밀도 원심분리를 사용하여 버피 코트(buffy coats)에서 분리되었다. 그런 다음, PBMC를 냉동하고, 필요할 때까지 -80℃ 또는 액체 질소에 보관하였다.
1 x106 cells/ml의 100 μl의 세포를 새로운 U자형 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮긴 다음, 플레이트를 원심분리하고 상층액을 버렸다.
0.001 μg/ml 내지 150 μg/ml까지의 항체의 연속 희석은 PBS 2 mM EDTA에서 제조되었다. 인간 PBMC를 50 μl의 희석된 테스트 항체 적정 시리즈에 재현탁되었다.
어둠 속, 4℃에서 30분동안 배양한 후, 플레이트를 원심분리하고 150 μl/well의 PBS 2 mM의 EDTA로 2회 세척한 후, 웰을 1/100 희석된 염소 항-인간 항체(PE 표지) 및 PBS 2mM EDTA에서 1/500 희석된 생존/사멸 순수한(neat) IR로 구성된50 μl의 혼합물에 재현탁시켰다.
어둠 속, 4℃에서 15분동안 배양한 후, 플레이트를 원심분리하고 150 μl/well의 PBS 2 mM EDTA로 1회 세척한 다음, 웰을 200 μl PBS 2 mM EDTA에 재현탁시켰다. 세포를 BD LSR Fortessa 세포측정기로 분석하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어(Version 10, FlowJo, LLC, Ashland, USA)를 사용하여 분석하였다(데이터는 나타내지 않음).
샘플 프로토콜은 시노몰구스 PBMC 및 Daudi 버킷 림프종 세포주에서 수행되었다.
c. 시험관 내 기능적 효능: γδ-T 세포 세포 탈과립화 분석
이 분석은 Daudi 버킷 림프종 세포주에서 γδ -T 세포 탈과립화에 대한 7.2 및 20.1 인간화 변이체 및 이들의 키메라 버전의 활성화 또는 억제 효과를 측정하는 것으로 구성된다(Harly et al., 2012). 졸레드론산 (1 μM) 및 IL2 (200 Ui/ml)로 11-13일동안 배양함으로써 건강한 공여자의 PBMC로부터 γδ-T 세포를 확장시켰다. IL2를 5일, 8일 및 이후 2일마다 첨가하였다. γδ-T 세포의 백분율은 배양 개시시 결정되었고, 적어도 80%에 도달할 때까지 유세포 분석으로 배양 시간에 대해 평가되었다. 동결 또는 신선한 γδ-T 세포를 Daudi 세포주(E:T 비율 1:1)에 대한 탈과립화 분석에 사용하여, 세포를 10 μg/ml의 7.2 및 20.1 인간화 변이체 및 이들의 키메라 버전의 존재 하에서 37℃에서 4시간동안 공-배양하였다. PMA (20 ng/ml) 및 이오노마이신 (1μg/ml)에 의한 활성화는 γδ-T 세포 탈과립에 대한 양성 대조군으로 사용되었고, 배지만이 음성 대조군으로 사용되었다. 4시간 공-배양이 끝날 때, 세포를 유세포 분석으로 분석하여 CD107a(LAMP-1, 리소좀-관련 막 단백질-1) + CD107b (LAMP-2)에 대해 양성인 γδ-T 세포의 백분율을 평가하였다.
CD107은 활성화-유도 과립 세포 외 배출 후 세포 표면에 이동하므로, 표면 CD107의 측정은 최근 탈과립된 세포 용해 T 세포를 식별하기 위한 민감한 마커이다. 결과는 키메라 7.2 또는 20.1 항체의 탈과립화 분석에서 유사한 활성화 효과를 보인 테스트된 후보들 사이에 어떠한 유의한 변화도 나타내지 않았다.
Daudi 세포를 대체하여, 표적 세포로 환자로부터 분리된 AML 모세포를 사용하여 동일한 프로토콜을 수행하였다.
d. 열안정성 분석
선별된 7.2 및 20.1 복합 인간 항체? 변이체의 열안정성을 평가하기 위해, 용융 온도(단백질 도메인의 50%가 펼쳐지는 온도)가 형광-기반 열 이동 분석을 사용하여 결정되었다. 정제된 모든 인간화 항체, 및 키메라(VH0/Vκ0) 항체는 최종 농도가 0.1 mg/ml가 되도록 SYPRO® Orange (ThermoFisher, Loughborough, UK)가 포함된 제형 버퍼(10 mM의 소듐 아세테이트, 100 mM의 NaCl, pH 5.5)로 1:1000 희석되었고, StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(ThermoFisher, Loughborough, UK)에서 56분에 걸쳐 25℃ 내지 99℃로 온도구배를 적용시켰다. 10 mM의 소듐 아세테이트, 100 mM의 NaCl, pH 5.5를 음성 대조군으로 사용하였다. 용융 곡선은 단백질 열안정성 소프트웨어(버전 1.2)를 사용하여 분석되었다.
e. 인간화 후보의 선별
앞서 기술된 실험에 대해 얻은 모든 결과를 기반으로, 35개(7.2에 대해 생성된 15개의 인간화 변이체; 20.1에 대해 생성된 20개의 인간화 변이체) 중 3개의 변이체가 추가 특성화를 위해 선별되었다: 7.2 (VH2/Vk1), 7.2 (VH2/Vk2) 및 20.1 (VH3/Vk1).
mAb 7.2 및 20.1에 대해 상기 기술된 상이한 실험 결과는 3개의 변이체 및 이들의 키메라 버전에 대해 표 4 및 표 5에서 보고되었다.
표 4: 선별된 인간화 후보자는 뮤린 모 항체와 동일한 효능을 갖는다
후보 7.2 VH2/Vk1 7.2 VH2/Vk2 7.2 VH0/Vk0 20.1 VH3/Vk1 20.1
VH0/Vk0
Biacore 친화도
다중-사이클 동역학
(x10-10)
(KD, M)		 2.53 2.43 1.76 3.19 2.34
인간 PBMC에 대한 결합(EC50, μg/mL) 3.86 5.94 3.6 3.38 3.02
시노몰구스 PBMC에 대한 결합(EC50, μg/mL) 12.0 9.85 7.75 5.74 4.06
림프종(Daudi)에 대한 결합(EC50, μg/mL) 2.02 2.01 1.44 1.59 1.19
기능적 분석 (Daudi)(γδT 세포-기반, EC50, μg/mL) 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02
기능적 분석 (AML 민감성)(γδT 세포-기반, EC50, μg/mL) 0.21 0.19 0.12 0.15 0.05
기능적 분석(AML 저항성)(γδT 세포-기반, EC50, μg/mL) 0.73 0.64 0.42 0.32 0.18
표 5: 인간화 선별 후보 mAb 7.2와 VH2 및 Vk1 또는 Vk2 모두 뮤린 후보에 비해 높은 열 안정성을 갖는다
후보 7.2 VH2/Vk1 7.2 VH2/Vk2 7.2 VH0/Vk0
열안정성 (Tm2 mean)
(℃)		 77.1 77.3 72.5
인간화 과정은 예측된 감소된 면역원성을 갖는 다중 7.2 및 20.1 변이체의 생성으로 이어진다.
3개의 변이체(7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 및 20.1 VH3/VK1)의 선별된 세트는 기능적 분석에서 친화도, 결합 및 효과의 측면에서 이들의 키메라 버전과 동등한 특성을 보였다: 면역원성을 감소시키기 위해 변이체 서열에서 이루어진 변형은 항체 기능을 변경시키지 않았다.
놀랍게도, 선별된 인간화 변이체 7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2의 열안정성은 키메라 항체에 비해 개선되었고, 이러한 개선된 열안정성은 이 인간화 과정에서 예상치 못한 것이었다.
항체의 불변 영역: 침묵 Fc 단편의 비교
몇몇 Fc 부분은 항체의 이펙터 기능을 침묵시키거나 감소시키기 위해 테스트되었다. 상이한 Fcγ 수용체에 대한 이러한 Fc 단편의 결합은 Biacore를 사용하여 평가되었다; C1q 복합체에 대한 이들의 결합은 ELISA 분석에 의해 평가되었다.
1. Biacore를 사용하여 조작된 Fc 부분을 다른 Fcγ 수용체에 결합
상이한 Fcγ 수용체에 결합하는 키메라 항체 20.1의 상이한 아이소타입(IgG1, IgG1 [N314A], IgG1 [L247F, L248E P350S], IgG2, IgG4 [S241P] 및 IgG4 [S241P L248E])의 능력은 정제된 항체 및 단일 사이클 Biacore 분석을 사용하여 결정되었다. 인간 Fc 수용체, FcγRI, FcγRIIA (Arg167 다형성) 및 IIB, 및 FcγRIIIA (Phe176 다형성) 및 IIIB를 Sino Biological에서 얻었다.
Fcγ 수용체를 최종 농도가 0.5 또는 1.0 μg/ml가 되도록 HBS-P+(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)로 희석되었다. 각 사이클이 시작될 때, Fcγ 수용체를 항-His CM5 칩(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)의 Fc2, Fc3 및 Fc4에 로딩하였다. Fcγ 수용체를 유속 5 μl/min에서 포획하여 Fcγ 수용체의 분자량에 따른 30 내지 80 RU 사이의 고정화 수준을 제공하였다. 단일-사이클 역동학 데이터는 유속 30 μl/min에서 분석물로서 키메라 항체를 사용하여 얻어 임의의 잠재적인 물질 전달 효과를 최소화하였다. 참조 표면에 대한 비-특이적 결합의 차이를 수정하기 위해 참조 패널 Fc1의 신호(항체 없음)의 신호를 Fc2, Fc3, 및 Fc4의 신호에서 빼었다. 5 포인트, 3배 희석 범위는 예측된 친화도 차이로 인한 각각의 개벌 Fcγ 수용체에 대해 다양한 농도 범위를 갖는 각 키메라 항체에 대해 사용되었다. 각 블랭크 실행의 신호(항체 없음)를 빼서 표면 안정성 차이를 수정하였다. 증가하는 농도의 키메라 항체의 5회 주사 각각에 대한 결합 단계를 25 내지 180초동안 모니터링하고(Fcγ 수용체 리간드에 따름), 단일 해리 단계를 항체의 마지막 주사 후 25 내지 300초동안 측정하였다. 항-His 표면의 재생은 10 mM의 글라이신-HCL pH 1.5를 15초동안 각각 30 μl/min에서 2회 주사한 다음, 180초의 안정화 기간을 사용하여 수행되었다.
단일-사이클 운동상수는, 가능한 경우, 표준 1:1 분석 모델을 사용하여 결정된다. 강한 상호작용의 경우, 일반적으로 운동 실험을 통해 친화도를 결정하는 것이 더 적합했다. 그러나, 몇몇의 Fcγ 수용체의 경우, 상호작용이 매우 약하고, 이 시나리오에서, 데이터는 정상 상태 친화도 분석(특히 약하거나 중간 정도의 상호작용 측정에 적합함)을 사용하여 분석되었다. 키메라 항체와 Fcγ 수용체의 상호작용에 대한 센서그램을 얻었다(데이터는 나타내지 않음).
예측한대로, 고친화도 FcγRI 수용체는 변형되지 않은 IgG1 및 IgG4(S241P)에 우수한 친화도로 결합하였다. IgG2 및 IgG4(S241P, L248E)와 함께 변형된 IgG1 아이소타입은 FcγRI에 결합하지 못했다. 남아있는 Fcγ 수용체는 FcγRI에 비해 다른 키메라 항체에 대해 더 낮은 친화도 상호작용을 나타내었다. 예상한대로, 변형된 IgG1은 4개의 낮은 친화도 수용체 모두에 대해 가장 강한 결합을 보여준 반면, IgG1의 변형된 버전은 이러한 수용체에 현저하게 감소된 결합을 보여주었다. IgG2 및 IgG4(S241P)는 FcγRIIA 및 B에 대한 일부 결합을 보여주었으나, FcγRIIIA 및 B에 대한 한계 결합만을 보여주었다.
2. ELISA 분석에 의한 C1q 복합체에 대한 조작된 Fc 부분의 결합
키메라 항체 20.1은 보체 시스템을 활성화하는 능력을 결정하기 위해 C1q 복합체에 결합하기 위한 상이한 IgG 아이소타입으로 테스트되었다.
U자형 96-웰 플레이트에서, 상이한 아이소타입에서 정제된 키메라 20.1의 2.5배 희석 시리즈(10 μg/ml에서 0.04 μg/ml까지)를 2% BSA/DPBS에서 제조하였다. Nunc Immuno MaxiSorp 96 플랫 바텀 마이크로타이터 플레이트(ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK)를 이 적정 시리즈의 100 μl/well로 미리 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 플레이트를 PBST로 2회 세척하고, PBST로 5회 세척하기 전에 2% BSA/DPBS로 실온에서 1시간동안 차단시켰다. 2% BSA/PBS에서 5 μg/ml로 희석된 정제된 보체 단백질 C1q(Pathway Diagnostics Ltd, Dorking, UK)를 플레이트에 첨가하고(100 μl/well), 실온에서 1시간동안 배양하였다. PBST로 5회 세척한 후, C1q 복합체의 결합을 항-C1q-HRP(Abcam, Cambridge, UK) (100 μl/well, 2% BSA/DPBS에서 1:100으로 희석됨)으로 실온에서 1시간동안 검출하였다. PBST로 5회 세척 후, 결합을 TMB 기질(ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK)로 검출한 다음, 반응을 3 M HCl로 중단시키고, 흡광도를 Dynex Technologies MRX TC II 플레이트 판독기로 450 nm에서 판독하였으며, 결합 곡선을 플롯팅하였다.
예상한대로, 변형되지 않은 IgG1 아이소타입만 C1q에 대한 우수한 결합을 보였으며, 다른 아이소타입은 최소 또는 결합 없음을 나타냈다(데이터는 나타내지 않음).
3. 조작된 Fc 단편의 선별
Fcγ 수용체 및 C1q 복합체에 대한 모든 테스트된 아이소타입의 상대적 결합은 표 6에 설명되었다.
표 6 : Fcγ 수용체 및 C1q 복합체에 대한 모든 아이소타입의 상대적 결합
아이소타입 FcγRI FcγRIIa FcγRIIb FcγRIIIa FcγRIIIb C1q
IgG1
IgG1 WT ++++ ++ ++ ++ ++ ++++
IgG1 N314A ++ - - - - -
IgG1 L247F, L248E, P350S - + + +/- +/- -
IgG2
IgG2 WT - ++ + +/- +/- +/-
IgG4
IgG4 S241P ++++ ++ ++ +/- +/- -
IgG4 S241P, L248E - + ++ - +/- -
두 개의 조작된 IgG1 L247F, L248E, P350S 및 IgG4 S241P, L248E Fc 단편은 FcγI 수용체 및 C1q 복합체에 대한 결합의 총 손실을 보여주는 유일한 것이었다.
얻은 결과를 기반으로, 두 개의 조작된 IgG1 L247F, L248E, P350S 및 IgG4 S241P, L248E 아이소타입이 추가의 특성화를 위해 선별되었다.
6개의 인간화 항체 생성
3개의 선별된 인간화 변이체는 2개의 선별된 조작된 Fc 단편과 융합되도록 클로닝되었고, 6개의 상이한 후보를 생성하였다: mAb 1 내지 mAb 6.
표 1에 기술된 바와 같은 실시예 mAb1 내지 mAb6은 통상적인 항체 재조합 생산 및 정제 공정을 사용하여 생산될 수 있다.
예를 들어, 코딩 서열은 포유류 생산 세포주에서 재조합 발현을 위해 생산 벡터로 클로닝되었다.
다음 표 7 및 8은 본 발명을 실시하고 특히 본 발명의 뮤린 7.2 유래의 핵산, 발현 벡터 및 인간화 항체을 생산하는데 유용한 상세한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
표 7: 본 발명을 실시하기 위한 유용한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 간략한 설명
SEQ ID NO: 유형 서열의 설명
1 aa mAb 7.2의 인간화 중쇄 가변 영역 VH2
2 aa mAb 7.2의 인간화 경쇄 가변 영역 Vλ1
3 aa mAb 7.2의 인간화 경쇄 가변 영역 Vλ2
4 aa mAb 1 및 2의 전장 중쇄 (VH2 7.2 침묵 IgG1)
5 aa mAb 4 및 5의 전장 중쇄 (VH2 7.2 침묵 IgG4)
6 aa mAb 1 및 4의 전장 경쇄 (Vk1 7.2)
7 aa mAb 2 및 5의 전장 경쇄 (Vk2 7.2)
8 nt mAb 1 및 2의 전장 중쇄 (VH2 7.2 침묵 IgG1)
9 nt mAb 4 및 5의 전장 중쇄 (VH2 7.2 침묵 IgG4)
10 nt mAb 1 및 4의 전장 경쇄 (Vk1 7.2)
11 nt mAb 2 및 5의 전장 경쇄 (Vk2 7.2)
12 aa mAb 7.2, 1, 2, 4 및 5의 HCDR1
13 aa mAb 7.2, 1, 2, 4 및 5의 HCDR2
14 aa mAb 7.2, 1, 2, 4 및 5의 HCDR3
15 aa mAb 7.2, 1, 2, 4 및 5의 LCDR1
16 aa mAb 7.2, 1, 2, 4 및 5의 LCDR2
17 aa mAb 7.2, 1, 2, 4 및 5의 LCDR3
18 aa 인간 BTN3A1
19 aa 인간 BTN3A2
20 aa 인간 BTN3A3
21 aa 재조합 단백질 생산에 사용하기 위한 시노몰구스 마카쿠(Cynomolgus macaque) (m. fascicularis) BTN3A1 엑토도메인
22 aa 재조합 단백질 생산에 사용하기 위한 시노몰구스 마카쿠(Cynomolgus macaque) (m. fascicularis) BTN3A2 엑토도메인
23 aa 재조합 단백질 생산에 사용하기 위한 시노몰구스 마카쿠(Cynomolgus macaque) BTN3A3 엑토도메인
표 8: 본 발명을 실시하기 위한 유용한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 간략한 설명
SEQ ID NO: 이하 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 설명:
SEQ ID NO: 이하 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열의 설명:
1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSS
2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
8 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA
9 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAATGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA
10 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTACTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
11 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
12 RYYMY
13 EINPNNGGTKFNEKFKN
14 EDDYDGTPFAMDY
15 HASQNINVWLS
16 KASNLHT
17 QQGQTYPYT
18 MKMASFLAFLLLNFRVCLLLLQLLMPHSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHVDVKGYKDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNNKGENIPTVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTASISIADPFFRSAQRWIAALAGTLPVLLLLLGGAGYFLWQQQEEKKTQFRKKKREQELREMAWSTMKQEQSTRVKLLEELRWRSIQYASRGERHSAYNEWKKALFKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFNWHYCVLGCESFISGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGFWTMGLTDGNKYRTLTEPRTNLKLPKPPKKVGVFLDYETGDISFYNAVDGSHIHTFLDVSFSEALYPVFRILTLEPTALTICPA
19 MKMASSLAFLLLNFHVSLLLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNAKGENIPAVEAPVVADGVGLYEVAASVIMRGGSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPILLLLLAGASYFLWRQQKEITALSSEIESEQEMKEMGYAATEREISLRESLQEELKRKKIQYLTRGEESSSDTNKSA
20 MKMASSLAFLLLNFHVSLFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIKWSDTKGENIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGGGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATEQEISLREKLQEELKWRKIQYMARGEKSLAYHEWKMALFKPADVILDPDTANAILLVSEDQRSVQRAEEPRDLPDNPERFEWRYCVLGCENFTSGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVERKKGWVKMTPENGYWTMGLTDGNKYRALTEPRTNLKLPEPPRKVGIFLDYETGEISFYNATDGSHIYTFPHASFSEPLYPVFRILTLEPTALTICPIPKEVESSPDPDLVPDHSLETPLTPGLANESGEPQAEVTSLLLPAHPGAEVSPSATTNQNHKLQARTEALY
21 MGSSLAFLLLSFHVCVLLLQLLMPHSAQFAVVGPPGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSNLRQVVNVYADGKEVEDRQSAAYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIDVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIRWSNDKGENIPAVEAPVFVDGVGLYAVAASVILRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTTSISIAG HHHHHH
22 MGSSLAFLLLNFHVSFFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDDIAAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDADFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPKIQWSNAKGQNIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGGSGESVSCIIRNSVLGLEKTASISIAD HHHHHH
23 MANFLAFLLLNFRVCLLLVQLLTPCSAQFAVLGPHGPILAMVGEDVDLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYSDGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNTKGQHIPAVKAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISITD HHHHHH
6개의 인간화 변이체의 개발 가능성 특성
1. 세포주 생산
a. 발현 벡터 구축
중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자 서열은 벡터 내로 클로닝되었다. 유전자 시스템은 CHO 세포에서 항체를 발현하는데 사용되었다. 항체 발현은 EF1 알파 프로모터의 제어 하에 있었다. 발현 벡터는 주변 염색질의 침묵 효과로부터 이식 유전자를 보호하는 고유한 유전적 요소를 가지고 있다 (Girod et al., 2007). 전사는 최대 수준으로 유지되고, 이식 유전자의 삽입 부위와 무관하여 안정적이고 높은 수준의 단백질 발현을 초래하였다.
b. 세포주 개발
CHO 숙주 세포주는 미합중국 종균협회(American 124 Type Culture Collection, ATCC)의 CHO-K1 CCL-61 세포에서 유래되고, 화학적으로 정의된 BalanCD 성장 A 배양 배지 (Irvine Scientific)의 현탁액에서 성장하도록 조정되었다. 네온 형질감염 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 전기천공으로 세포를 형질감염시켰다.
c. ClonePix FL 장치를 사용한 단일-세포 클로닝
동일한 배지 (BalanCD Growth A, Irvine Scientific)는 형질감염, 단일-세포 클로닝 및 생산을 위한 기본 배지로서 사용되어 전체 과정에서 세포의 환경을 변함없이 유지하였다. 각 벡터의 형질감염 후, 퓨로마이신 선별 압력을 적용하여 안정한 풀을 생성하였다. 반고체 배지 (CloneMediaⓒ; Molecular Devices)에 희석된 세포를 두고, 플레이트를 가습 배양기에서 5% CO2와 함께 37℃로 배양하였다. 확장된 콜로니는 Molecular Devices의 ClonePix™ FL Imager을 사용하여 고르고, 96-웰 플레이트로 옮긴 다음, 처음 24-웰과 다음 6-웰 TC 플레이트에서 증식되었다.
d. 유가식 성능 평가
개별 클론의 성장 및 생산 성능을 125 ml의 쉐이크 플라스크에서 평가하여 Cell Boost7 A+7B feed (GE Healthcare, USA)를 사용하여 10일의 유가식 공정에서 세포 성장 성능 및 생산성 기준에 따라 최상의 클론을 선별하였다. 유가식 배양은 0.3 x 106 cells/ml의 세포 농도에서 시작되었다.
세포 성장 및 생산성에 대해 얻은 결과는 표 9에 요약되어 있다.
2. 제조 가능성 평가를 위한 샘플 준비
각 후보 항체는 정제된 CHO 세포 상층액 풀에서 단백질 A 포획에 의해 정제되었다: 테스트에 충분한 물질을 확보하기 위해 각 변이체에 대해 두 개의 풀이 필요했다. 단백질 농도는 UV 방법으로 모든 포획 후 샘플에 대해 결정되었다. 샘플 회수율 및 수율은 대부분의 샘플에서 80% 이상이었으며, 모든 변이체는 유사한 수율을 나타냈다. 이어서, 각 항체는 30 kDa MWCO 원심필터 유닛을 사용하여 25 mM 히스티딘, 125 mM NaCl, pH 6.0으로 유동 물질이 제형의 목표 pH에 도달할 때까지 버퍼 교환하였다. 교환 단계 동안, 임의의 변이체에 대한 교환 중 단백질 침전이나 느린 흐름의 지표는 없었다. 버퍼 교환 완료 후, 각 변이체 샘플의 농도를 제제 버퍼로 1.0 mg/mL로 조정하였고, 10% PS-80을 최종 농도 0.02% PS-80가 되도록 첨가하였다.
3. 열안정성 평가
테스트된 항체 변이체의 열 안정성을 평가하고 비교하기 위해 시차 주사 형광측정 분석을 수행하였다. 각 변이체는 세 번 분석하고, 관찰된 각 열 전이에 대한 평균 Tonset, Tagg 및 Tm 를 측정하였다(데이터는 나타내지 않음).
테스트된 모든 변이체에 대해 Tonset 및 Tm 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 모든 항체에 대해 결정된 Tm1 값은 61℃였고, Tonset 에 대해 결정된 값은 54 내지 55℃였다. Tagg 값은 71 내지 78℃ 범위의 콜로이드 안정성에 대한 플롯에 기반하여 결정되었다.
전반적으로, 4개의 선별된 변이체는 모두 유사한 열 안정성을 보여주었다: 관찰된 변화는 테스트된 항체 간의 열 안정성에서 큰 변화를 일으키지 않았다.
4. 강제 분해 연구
a. 교반
각 변이체에 대한 샘플은 실온에서 500 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에서 교반 스트레스를 처리하였다. 각 변이체에 대한 한 샘플을 24시간동안 교반하고, 다른 샘플을 48시간동안 교반하였다. 각 변이체의 한 바이알은 대조군으로서 실온에서 최대 48시간동안 보관되었다. 대조군에 비해 교반된 샘플에서 외관의 변화는 관찰되지 않았다: 모든 샘플은 투명하고, 무색이며 눈에 보이는 미립자가 없는 것으로 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 또한, UV 방법으로 측정한 총 단백질 함량에는 큰 변화가 없었다(데이터는 나타내지 않음).
변이체 패널의 안정성에 대한 교반 스트레스의 효과는 SEC, 환원된 CGE, 비-환원된 CGE, 및 iclEF 방법으로 평가되었다(데이터는 나타내지 않음). 테스트된 항체의 안정성에 큰 변화가 없고, 시간이 지남에 따라 분해물의 축적에 있어 눈에 띄는 추세가 실온에 보관된 교반 대조군 샘플과 교반 스트레스 샘플 간에 관찰되지 않았다.
실온에 보관된 교반 대조군 샘플과 교반 스트레스 샘플 간에 테스트된 항체의 안정성 및 시간이 지남에 따라 분해물의 축적에서 눈에 띄는 경향이 관찰되지 않았다. SEC 분석에서 결정된 메인 피크 %는 모든 대조군 및 교반 샘플의 경우 ≥ 99.2%이었다. R-CGE 분석에서, 주요 피크 %는 모든 대조군 및 교반 샘플에서 ≥ 98.5%이었다. NR-CGE 분석은 대조군과 스트레스를 받은 샘플 사이의 주요 피크 %에서 중요한 경향이나 변화가 없음을 보여주었다. 결론적으로, 모든 후보 변이체 간에 안정성의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
b. 동결-해동 스트레스
각 후보의 세 가지 샘플을 Eppendorf 튜브에 분주하고 동결-해동 스트레스를 가했다. 샘플을 -75±10°C에서 보관한 다음, 실온에서 해동하였다. 각 후보에 대한 하나의 샘플은 3회의 동결-해동 사이클; 또 다른 샘플은 6회 동결-해동 사이클; 및 세 번째 샘플은 10회 사이클를 거쳤다. 스트레스 처리된 모든 샘플은 투명하고, 무색이며, 눈에 보이는 미립자가 없는 것으로 관찰되었고(데이터는 나타내지 않음), UV 방법으로 결정된 총 단백질 함량에는 큰 변화가 없었다(데이터는 나타내지 않음).
변이체의 패널의 안정성에 대한 동결-해동 스트레스의 효과는 SEC, 환원된 CGE, 비-환원된 CGE, 및 iclEF 방법으로 평가되었다(데이터는 나타내지 않음). 동결-해동 스트레스는 SEC, R-CGE 및 NR-CGE 분석에 기반한 항체의 안정성에 영향을 미치지 않았다.
iclEF 분석은 테스트된 항체의 전하 이질성에서 눈에 띄는 변화를 나타냈다. 염기성 변이체의 농도가 일반 대조군과 비교하여 10X F/T 사이클에서 가장 낮은 염기성 변이체 농도로 연속적인 F/T 사이클에서 감소하였다. 유일한 예외는 변이체 IgG1 7.2 VH2/VK1으로, 염기성 변이체의 농도 감소가 모든 테스트된 F/T 사이클에 대해 동일한 수준이었다(표 9 참조). 변이체 mAb1, mAb2, 및 mAb3에서, 10X F/T 사이클 후에, 염기성 종은 각각 1.0, 1.3, 및 3.4% 감소하였다. 염기성 종의 농도 감소는 주요 피크 %의 증가와 관련이 있다. 변이체 mAb4, mAb5 및 mAb6에서, 염기성 종의 감소는 각각 4.8, 2.8 및 4.7% 감소하였다. 변이체 mAb4의 변화는 대부분 주요 피크 %의 증가와 관련있는 반면, 변이체 mAb5 및 mAb6의 변화는 주요 피크 % 및 산성 변이체 % 모두의 증가와 관련이 있었다.
전반적으로, 동결-해동 스트레스로 인한 변화에 대해 가장 높은 저항성이 변이체 mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2)에서 관찰되었다.
c. 산성 pH 스트레스
각 후보에 대한 샘플은 실온에서 산성 pH 스트레스가 처리되었다: 각 샘플은 HCl로 pH 3.5가 되도록 조정되었고, 실온에서 2시간, 4시간, 및 24시간동안 유지한 후 샘플을 1 M Tris, pH 7.0으로 중화시켰다. 모든 샘플은 투명하고, 무색이며, 눈에 보이는 미립자가 없는 것으로 관찰되었고(데이터는 나타내지 않음), UV 방법으로 측정한 단백질 농도에는 유의한 변화가 없었다(데이터는 나타내지 않음).
변이체의 패널에 대한 산성 pH 스트레스의 효과는 SEC, 환원된 CGE, 비-환원된 CGE, 및 iclEF 방법으로 평가되었다(데이터는 나타내지 않음). R-CGE 또는 NR-CGE 분석에 의한 48시간 RT 대조군과 비교하여 낮은 pH에 노출된 샘플의 경우 시간이 지남에 따른 분해물 축적의 중요한 변화가 검출되지 않았다. 전하 이질성 분석에서 산성 pH 스트레스를 받는 모든 샘플에서 염기성 변이체의 농도가 감소했지만, 시간이 지남에 따라 명확한 경향이 관찰되지는 않았다.
염기성 변이체의 감소에 대한 산성 스트레스의 전반적으로 가장 낮은 영향은 변이체 mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2)에 대해 관찰되었다. 이 결과는 동결-해동 연구에서 iclEF로 얻은 결과와 잘 일치하였다. SEC 분석에서, 모든 변이체는 주요 피크%의 감소와 관련된 산성 스트레스에 노출될 때 일부 응집체를 축적하는 것으로 관찰되었으나, 시간이 지남에 따라 명확한 경향이 관찰되지는 않았다. 일반적으로, 응집체의 축적은 IgG1 변이체에 비해 IgG4 변이체의 경우 약 9배 더 컸다. IgG1 변이체에 대한 응집체의 축적은 모든 산성 스트레스 샘플의 경우 0.3 내지 1.0%였고, IgG4 변이체의 경우 축적은 스트레스 샘플에서 4.3 내지 7.8%로 상당히 높았다(표 9 참조).
결론적으로, 산성 스트레스에 대한 가장 높은 내성은 변이체 mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2)에서 관찰되는 것으로 확인되었다.
d. 열 스트레스
각 변이체에 대한 샘플은 열 블록에서 50℃에서 3일, 1주, 및 2주동안 열 스트레스에 대해 처리된 다음, 2 - 8℃에서 보관된 일반 대조군 샘플 세트와 비교되었다. 샘플의 외관 테스트는 주기적으로 수행되었고, 상 분리, 불투명도의 변화, 또는 침전의 증거는 관찰되지 않았다. 모든 샘플은 모든 시점에서 투명하고, 무색이며, 눈에 보이는 입자성 물질이 없는 것으로 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 또한, UV 방법에 의해 측정된 단백질 농도에서 유의한 변화는 없었다(데이터는 나타내지 않음).
변이체 패널에 대한 열 스트레스의 효과는 SEC, R-CGE, NR-CGE 및 iclEF 방법에 의해 평가되었다. 이러한 결과는 모든 변이체가 열 스트레스에 취약하다는 것을 보여주었다.
SEC 분석에서, 응집체 농도 증가에 대한 명확한 추세가 테스트된 모든 변이체에 대한 시간 함수로서 관찰되었다. 유의하게 더 높은 응집체의 축적이 IgG1에 비해 IgG4 변이체에서 관찰되었다. 2주 후, 총 응집체 %의 증가는 IgG4 변이체의 경우 33.7 내지 44.7% 범위였으나, IgG1 변이체의 경우 13.0 내지 18.2% 범위였다(표 9 참조). 추가적으로, mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) 변이체는 대조군 mAb3 (IgG1 20.1 VH3/VK1) 보다 적은 응집체를 축적했다.
R-CGE 분석에서, 순도 감소(LC +HC의 %의 감소로 정의됨)에 대한 명확한 추세가 테스트된 모든 변이체에 대한 시간 함수로서 관찰되었으나, 그들 간의 안정성에서 유의한 차이점은 관찰되지 않았다. 샘플 분해의 수준은 테스트된 모든 항체에 대해 비슷했다. 유사하게, NR-CGE 데이터는 순도 감소(주요 피크의 감소로 정의됨)의 명확한 추세가 테스트된 모든 변이체에 대한 시간 함수로서 나타났다. IgG1과 비교하여 IgG4 변이체에서 유의하게 낮은 순도가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 2주 후, 순도 %는 IgG4 변이체의 경우 34.8 내지 41.7%로 감소되었으나, IgG1 변이체의 경우 20.0 내지 30.0%만 감소되었다(데이터는 나타내지 않음). 추가적으로, mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) 변이체는 mAb3 IgG1 20.1 VH3/VK1 보다 낮은 분해를 나타냈다. IgG1 항체의 경우, 주요 피크의 감소는 전면 주요 피크 불순물(단편)의 증가를 주로 동반했다. 그러나, IgG4 항체의 경우, 전면 주요 피크 불순물(단편) 및 후면 주요 피크 불순물(응집체) 모두의 축적이 주요 피크의 감소의 함수로서 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 IgG1에 비해 IgG4 항체의 경우에서 유의하게 더 높은 농도의 응집체가 관찰되었다.
IgG4 변이체에 대한 1-주 샘플은 iclEF로 분석하기에는 너무 분해되었고, 모든 변이체에 대한 2-주 샘플은 분석하기에 너무 분해되었다. 따라서, 3일 데이터만이 테스트된 항체들 간의 전하 이질성에서 변화를 평가하는데 사용되었다. 주요 피크%에 의해 측정된 순도의 차이는 IgG1 샘플의 경우 12.4 내지 14.4% 차이였고, IgG4 샘플의 경우 16.0 내지 16.6% 차이였다(데이터는 나타내지 안음).
전반적으로, 열 스트레스에 따른 분해가 IgG1 변이체에 비해 IgG4 변이체의 경우 더 큰 것으로 입증되었으며, 이는 모든 시점에서 관찰되었다. 분석은 mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) 변이체가 열 스트레스에 적어도 민감하다는 것을 나타냈고, 이 결과는 동결-해동 및 산성 pH 스트레스에서 얻은 데이터와 일치한다.
개발성 특성의 측면에서 가장 적합한 후보의 선별
세포주의 생산성과 관련하여, 최상의 결과는 인간화 변이체 mAb1 (7.2 VH2/VK1)에서 얻었으며, 생존 세포 밀도는 mAb1에 대해 10일째에 54 x 106 생존세포 / ml를 증가시켰다.
열 안정성 연구에서, 샘플은 DSF 분석에 의해 표준 매트릭스에서 평가되어 각 후보에 대한 Tonset, Tm 및 Tagg를 결정했다. Tonset 및 Tm1에서 변화는 관찰되지 않았고, Tagg는 모든 변이체의 경우 70℃보다 높았다. 결과는 mAb1, mAb2, mAb4 및 mAb5가 비슷한 열 안정성을 보여줌을 나타냈다.
강제 분해 연구에서, 샘플을 교반, 동결-해동, 산성 pH 및 열 스트레스에 노출시켰다. 결과는 후보자 변이체의 패널이 관련 스트레스 조건 하에서 다양한 범위에서 분해되기 쉽다는 것을 나타낸다:
● 어떤 분석 방법에서도 교반 스트레스에 대한 유의한 반응이 관찰되지 않았다.
● 동결-해동 스트레스에 대한 반응은 SEC 또는 CGE 방법으로 관찰되지 않았으나, iclEF 분석은 테스트된 변이체 간의 전하 이질성의 차이를 보여주고, mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) 변이체는 동결-해동 스트레스로 인한 변화에 의해 유발된 변화에 대해 가장 높은 저항성을 나타냈다.
● 산성 pH 스트레스에 대한 반응이 iclEF 및 SEC에 의해 관찰되었고, 여기서 모든 후보자는 노출시 일부 불순물을 축적하였다. mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) 및 mAb2(IgG1 7.2 VH2/VK2) 변이체는 산성 pH 스트레스에 대해 가장 높은 저항성을 나타냈다.
● 관찰된 가장 중요한 스트레스 반응은 50℃에서 샘플을 보관하는 것이다. SEC, NR-CGE, 및 iclEF 분석은 시간이 지남에 따라 샘플 순도가 감소하는 중요한 경향을 보였다. 관찰된 순도의 감소는 IgG1 변이체에 비해 IgG4 변이체에서 일관되게 더 컸다. IgG1 변이체의 그룹에서, mAb1 (7.2 VH2/VK1) 및 mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2)는 산성 열 스트레스에 대해 가장 높은 저항성을 나타냈다.
다양한 인간화된 후보자의 개발 가능성 결과는 하기 표 9에 요약되어 있다:
표 9 : mAb 인간화 후보자는 테스트된 다른 모든 인간화 변이체에 비해 더 높은 개발 가능한 특성을 가진다
명칭
 후보 풀 성장 (10 days / ml 에서 살아있는 세포 밀도) 및 생산성 (μg/ml) 동결-해동 스트레스 - 염기성 변이체1의 감소율 (3 사이클, 6 사이클 및 10 사이클) 산성 스트레스 - SEC 분석
(24 시간 후 pH 3.5에서 응집체의 증가율 %)		 열 스트레스 - SEC 분석
(50℃에서 2주 후 SEC 분석으로 측정한 Agg의 차이%)
mAb1 7.2 VH2/
VK1 IgG1		 54x106
550 ㎍/ml
 1.2
1.2
1.0		 0.2 13.9
mAb2 7.2 VH2/
VK2 IgG1		 30x106
330 ㎍/ml		 0.9
0.6
1.3		 0.8 13.1
mAb3 20.1 VH3/
VK1 IgG1		 n.d 2.1
2.0
3.4		 0.3 18.3
mAb4 7.2 VH2/
VK1 IgG4		 44x106
780 ㎍/ml		 1.9
1.9
3.0		 4.4 33.6
mAb5 7.2 VH2/VK2 IgG4 39x106
475 ㎍/ml		 1.6
1.8
2.8		 5.1 35.4
mAb6 20.1 VH3/
VK1 IgG4		 38 x106
430 ㎍/ml		 2.5
2.4
4.7		 6.3 44.6
1 염기성 변이체의 변화는 반올림되지 않은 결과를 기반으로 계산되었으며, 각 대조군 샘플에서 스트레스를 받은 샘플의 염기성 변이체 %를 뺐다.
결론적으로, mAb1 변이체는 개발 가능한 특성성 측면에서 가장 좋은 결과를 보였으며, 선도 후보로서 선별되었다.
1가 및 2가 분자로서 인간화 mAb 7.2의 기능적 특성
1. Fab 및 Fab 2 단편의 제조
a. F(ab') 2 생성을 위한 펩신 소화율
50% 슬러리에 고정된 펩신(Thermo Scientific kit, Cat. N°44988)을 5000g 2분에서 슬러리를 스핀 다운시킴으로써 소화 버퍼(20mM의 소듐아세테이트 pH 4.4)로 버퍼-교환하였다. 상층액을 버리고, 슬러리를 1mL 소화 버퍼에서 재현탁시킨 다음 5000g 2분에서 또 다른 스핀을 가했다. 이 단계는 추가로 4회 반복하였다(총 5회 수지 세척). 그 후 수지를 원래 슬러리 부피까지 소화 버퍼에 재현탁시켰다.
mAb4, mAb5 및 mAb6(7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 or 20.1 VH3/VK1 IgG4 변이체)는 5 또는 10 mL Zeba 스핀 컬럼(규모 의존적)을 사용하여 소화 버퍼로 버퍼-교환하고, 제조사의 프로토콜에 따라 Vivaspin 농축기(10,000 MWCO)를 사용하여 3 mg/mL로 농축시켰다.
3mg/mL에서 mAb 4, 5 및 6(이전에는 소화 버퍼로 교환된 버퍼)을 수지에 고정된 펩신과 혼합하고, 37℃ 회전에서 1.5 - 2 시간동안 배양하였다.
소화 혼합물은 5000g 2분에서 스핀 다운시켰다. 상층액을 제거하고, 적절한 실린지 및 0.22μm의 소형 필터(Merck, Millipore, Millex Cat n° SLGV004SL)를 사용하여 새로운 튜브로 여과하였다. 수지를 1 mL의 PBS로 세척하고, 5000g 1분에서 회전시켰다. 상층액을 제거하고, 여과하며, 이전의 상층액과 함께 모았다. 세척 단계를 반복했다.
소화되고 여과된 상층액을 이동상으로 10mM의 소듐 아세테이트, 100mM의 NaCl, pH 5.5를 사용하는 HiLoad 16/600 200 pg 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다. 용출된 F(ab')2 단편에 상응하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 멸균 여과하였다.
F(ab')2 단편을 SDS-PAGE, 분석 SEC 및 OD280nm 판독으로 분석하였다.
b. Fab 생성에 대한 파파인 소화율
50% 슬러리에 고정된 파파인 (Thermo Scientific kit, Cat. N° 20341)을 5000g 2분에서 슬러리를 스핀 다운시킴으로써 소화 버퍼(20 mM의 소듐포스페이트, 10 mM의 EDTA, 150 mM의 시스테인 pH 7.0)로 버퍼-교환하였다. 상층액을 버리고, 슬러리를 더 큰 부피의 소화 버퍼에 재현탁시킨 다음 5000g 2분에서 또 다른 스핀을 가했다. 이 단계는 추가로 4회 반복하였다(총 5회 수지 세척). 그 후 수지를 원래 슬러리 부피까지 소화 버퍼에 재현탁시켰다.
mAb 4, mAb 5 및 mAb 6 (7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 또는 20.1 VH3/VK1 IgG4 변이체)는 5 또는 10 mL Zeba 스핀 컬럼(규모 의존적)을 사용하여 소화 버퍼로 버퍼-교환하고, 제조사의 프로토콜에 따라 Vivaspin 농축기(10,000 MWCO)를 사용하여 3 mg/mL로 농축시켰다.
3mg/mL에서 mAb 4, 5 및 6(이전에는 소화 버퍼로 교환된 버퍼)을 수지에 고정된 파파인과 혼합하고, 37℃ 회전에서 42 시간동안 배양하였다.
소화 혼합물은 5000g 2분에서 스핀 다운시켰다. 상층액을 제거하고, 적절한 실린지 및 0.22μm의 소형 필터(Merck, Millipore, Millex Cat n° SLGV004SL)를 사용하여 새로운 튜브로 여과하였다. 수지를 PBS로 3회 세척하고, 5000g 1분에서 회전시키고, 상층액을 각 사이크에서 수집하고 모았다. 풀링된 분획은 적절한 실린지 및 0.22μm의 소형 필터를 사용하여 새로운 튜브로 여과되었다.
소화되고 여과된 상층액을 1xDPBS, pH 7.4로 먼저 버퍼-교환한 다음, 단백질 A 컬럼을 사용하여 먼저 정제하여 Fc 및 소화되지 않은 mAb를 제거하고, 이동상으로 10 mM의 소듐 아세테이트, 100 mM의 NaCl, pH 5.5의 크기-배제(SEC) 컬럼을 사용하여 연마 단계를 수행하였다. 용출된 F(ab')2 단편에 상응하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 멸균 여과하였다.
F(ab')2 단편을 SDS-PAGE, 분석 SEC 및 OD280nm 판독으로 분석하였다.
2. Biacore를 사용한 인간화 7.2 및 20.1 Fab, F(ab') 2 단편 및 IgG 포맷의 친화도 측정
다른 포맷(Fab, F(ab')2 및 IgG)에서 BTN3A1에 대한 선도 인간화 7.2 및 20.1 항체의 친화도를 평가하기 위해, Bioacore T200 제어 소프트웨어 V2.0.1 및 평가 소프트웨어 V3.0(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 실행하는 Biaocre T200 (일련번호. 1909913) 기기를 사용하여 단일 사이클 동역학 분석을 수행하였다. 모든 단일 사이클 동역학 실험은 0.1% BSA (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 함유하는 HBS-P+ 실행 버퍼 (pH 7.4)로 25℃에서 수행되었다
BTN3A His-태그된 항원(Sino Biological, Beijing, China)은 최종 농도가 0.4 μg/ml가 되도록 실행 버퍼에서 희석되었다. 각 사이클이 시작될 때, BTN3A1-His는 10 μl/min의 유속에서 표준 아민 화학 물질과 함께 His 포획 키트(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 사용하여 사전-커플링된 CM5 센서 칩의 Fc2 상에서 포획된다. ~34 RU, 16 RU 또는 11 RU의 고정화 수준(RL), ~ 50 RU의 RMax를 얻기 위한 다른 이론적 값은 분석물 Fab, F(ab')2 및 IgG 각각에 대해 사용되었다. 그런 다음, 표면을 안정화시켰다. 단일 사이클 역동학 데이터는 40 μl/min의 유속에서 정제된 샘플(Fab, F(ab')2 and IgG)로 얻어 임의의 잠재적인 전달 물질을 최소화하였다. 참조 표면에 대한 비-특이적 결합의 차이를 수정하기 위해 참조 채널 Fc1의 신호(항원 포획 없음)를 Fc2의 신호에서 뺐다. BTN3A1-His 블랭크 실행에 대한 신호(분석물 없음)를 감산하여 표면 안정성의 차이를 수정하였다. 증가하는 농도의 5회 주사에 대한 결합 단계를 매회 240초동안 모니터링하고 분석물의 마지막 주사 후 1400초동안 단일 해리 단계를 측정하였다. 칩 표면의 재생은 10 mM의 글라이신-HCL pH 1.5의 2회 주사 후 240초의 안정화 기간을 사용하여 수행되었다. 원시 센서그램은 Fab 샘플에 대한 1:1 모델과 분석 물질의 다른 원자가와 일치하는 F(ab')2 및 IgG 샘플에 대한 2가 분석 모델과 함께 장착되었다. 운동 상수는 각 변이체에 대해 계산되었다(표 10, 11 및 12 참조).
표 10 : 단일 사이클 역동학 IgG 분석
IgG (2가 피팅)
샘플 Ka1 (1/Ms) Ka2 (1/Ms) Kd 1 (1/s) Kd 2 (1/s) Rmax (RU) Chi² (RU²)
mAb 1 (7.2 VH2/VK1) 5.30 x 104 4.21 4.63 x 10-4 4.40 x 101 69.6 0.063
mAb 2 (7.2 VH2/VK2) 5.97 x 104 2.01 x 10-3 4.03 x 10-4 2.41 x 10-2 68.0 0.144
mAb 3 (20.1 VH3/VK1) 5.63 x 104 5.47 x 10-5 3.79 x 10-3 8.60 x 10-5 56.1 0.042
표 11 : 단일 사이클 역동학 F(ab')2 분석
F(ab')2 (2가 피팅)
샘플 Ka 1 (1/Ms) Ka 2 (1/Ms) Kd 1 (1/s) Kd 2 (1/s) Rmax (RU) Chi² (RU²)
7.2 VH2/VK1 F(ab')2 8.33 x 104 6.10 6.66 x 10-4 3.24 x 101 78.2 0.033
7.2 VH2/VK2 F(ab')2 1.46 x 105 3.40 3.94 x 10-4 5.46 x 101 58.9 0.126
20.1 VH3/VK1 F(ab')2 9.23 x 104 5.03 x 10-5 4.16 x 10-3 8.10 x 10-5 61.5 0.326
표 12 : 단일 사이클 역동학 Fab 분석
Fab (1:1 피팅)
샘플 Ka (1/Ms) Kd (1/S) KD (nM) Rmax (RU) Chi² (RU²)
7.2 VH2/VK1 Fab 1.98 x 105 6.39 x 10-4 3.22 66 0.114
7.2 VH2/VK2 Fab 2.22 x 105 6.69 x 10-4 3.01 61 0.091
20.1 VH3/VK1 Fab 1.76 x 106 3.57 x 10-2 20.30 55 1.330
3. 친화도 특성의 측면에서 최고 후보의 선별
20.1 및 7.2 인간화 변이체는 친화도 특성의 측면에서 상당한 차이를 보였다. 이러한 차이는 IgG 및 F(ab')2 포맷에서 관찰됐을 수 있으나, 그 차이는 Fab 단편에서 훨씬 더 크다: 실제로, 20.1은 20.30 nM의 평균 KD를 보인 반면, 7.2는 3.22 (VH2/VK1) 또는 3.01 (VH2/VK2)의 평균 KD를 보였다.
4. 1차 T 세포 및 다른 세포주에 대한 mAb1 결합력
다음으로, mAb1 결합력은 인간 1차 T 세포뿐만 아니라 BTN3A1, BTN3A2 또는 BTN3A3 아이소폼으로 개별적으로 재구성된 WT 및 BTN3A 녹-아웃을 포함한 다양한 세포주에 대해 유세포 분석으로 평가되었다(데이터는 나타내지 않음). EC50 값은 각 테스트 세포 타입에 대해 얻었고, 표 13에 요약되어 있다.
BTN3A KO 세포에서 얻은 데이터는 mAb1가 표적에 특이적으로 결합한다는 것을 명확하게 나타냈다. 또한, 개별 아이소폼으로 재구성한 결과, mAb1가 BTN3A1, BTN3A2, 및 BTN3A3을 유사한 결합도로 인식하는 것을 확인하였다. 다른 테스트된 모든 세포는 버킷 림프종 Daudi 세포주의 경우 9.6 nM에서 결직장 선암 세포주 HT29의 경우 112.3 nM까지의 EC50 값 범위로 mAb1 결합에 대해 양성으로 나타났다.
표 13: 인간 세포에 대한 mAb1 결합 친화도.
세포 설명 게이팅 EC 50
μg/mL
(+/-sem) 		EC 50 (x10 -9 M)
(+/-sem)
인간 HV PBMC 1차세포 (n=6) CD3+ 5.25 (+/-0.57) 34.9 (+/-3.8)
Daudi 버킷 림프종 (n=5) NA 1.44 (+/-0.16) 9.6 (+/-1.04)
L-IPC (PDAC087T) 췌장관 선암 (n=4) NA 26.26 (+/-4.4) 175.1 (+/-29.3)
HT29 결직장 선암 (n=3) NA 16.84 (+/-3.1) 112.3 (+/-20.6)
A549 폐암 (n=6) NA 6.53 (+/-1.8) 43.56 (+/-12.3)
HUVEC 내피세포 (n=2) NA 12.8 (+/-1.98) 85.2 (+/-13.2)
HEK293T WT 배아 신장 (n=3) NA 6.2 (+/-0.44) 41.3 (+/-2.95)
HEK293T BTN3KO 배아 신장; BTN3A1, A2, A3의 전체 녹-아웃 (n=3) NA NA NA
HEK293T BTN3KO+3A1-CFP 배아 신장; BTN3A1-CFP로 일시적으로 형질감염된 BTN3A1, A2, A3의 전체 녹-아웃 (n=4) CFP+ 2.4 (+/-0.34) 15.9 (+/-2.3)
HEK293T BTN3KO+3A2-CFP 배아 신장; BTN3A2-CFP로 일시적으로 형질감염된 BTN3A1, A2, A3의 전체 녹-아웃 (n=5) CFP+ 1.88 (+/-0.39) 12.5 (+/-2.6)
HEK293T BTN3KO+3A3-CFP 배아 신장; BTN3A3-CFP로 일시적으로 형질감염된 BTN3A1, A2, A3의 전체 녹-아웃 (n=5) CFP+ 1.75 (+/-0.11) 11.68 (+/-0.72)
NA: 해당없음
5. mAb1는 표적 외 결합이 없다
다른 비-BTN3A 분자에 대한 mAb1의 표적 외 결합 가능성은 Retrogenix 기술에 의해 평가되었다. 이 작업은 HEK293 세포(Retrogenix 플랫폼)의 표면에서 발현되는 >5000 인간 막 수용체 또는 분비된 단백질 발현을 포함하는 세포 어레이를 스크리닝하여 표적 외 결합의 부재를 입증하는 것을 목표로 하였다.
형질감염되지 않은 HEK293 세포 및 BTN3A1을 과발현하는 세포에 대한 mAb1의 결합 수준을 세포 고정 전 또는 후에 조사한 결과, 고정된 세포에서 5 ㎍/ml가 적합한 스크리닝 조건인 것으로 나타났다. 이 조건 하에서, mAb1은 인간 HEK293 세포에 대한 결합에 대해 스크리닝되었으며, 세포 표면 막 단백질 및 세포 표면-테더링된 분비 단백질로 구성된 5528개의 인간 단백질을 개별적으로 발현하였다. 이는 10개의 주요 히트를 드러냈다.
각각의 1차 히트는 2개의 대조군 수용체(CD20 및 EGFR)와 함께 재-발현되었고, 5 ㎍/ml의 아이소타입 대조군 항체, 및 다른 양성 및 음성 대조군 처리와 함께 재-테스트되었다. 5개의 비-특이적 히트를 제거한 후, 테스트 항체에 대해 5개의 특이적 상호작용이 남았다. 5개의 특이적 히트 모두 BTN3A와 관련이 있다: BTN3A1의 2 개의 아이소폼, BTN3A2의 2 개의 아이소폼 및 BTN3A3의 아이소폼.
이 연구 결과는, mAb1에 대한 표적 외(off-target) 상호작용이 확인되지 않았고, 이는 BTN3A 에피토프에 대해 mAb1의 높은 특이성이 나타난다는 것이다.
6. mAb1는 Vη9Vδ2 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸을 매개한다
원래, 마우스 항-BTN3A mAb는 Vγ9Vδ2 T 세포에 의한 BTN3A 인식을 유발하는 것으로 나타났으며, 활성화를 매개하여 (i) 인간 PBMC에서 특정 서브세트의 증식, (ii) 사이토카인 생성(IFNγ 및 TNFα), 및 (iii) 감염 또는 형질전환된 표적 세포의 세포 용해(예를 들어, By Perforin, granzymes, TRAIL) (Harly et al, Blood, 2012 & Benyamine, A. et al. 2016, Oncoimmunology 5, e1146843)를 유도한다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, mAb1의 제안된 메커니즘 작용은 종양 표적 세포의 표면에서 발현된 BTN3A에 대한 결합이 Vγ9Vδ2 T 세포의 카운터-수용체에 신호를 보내는 형태 변화를 유발한다는 것이다. 항-BTN3A 항체의 활성은 rHuIL-2 (200UI/mL) 및 아미노비스포스포네이트 (Zometa, 1 μM)의 존재 하에서, 종양 세포주(표적)와 건강한 공여자의 PBMC에서 10 내지 14일동안 미리 확장된 1차 인간 Vγ9Vδ2 T 세포(이펙터)의 공-배양을 기반으로 하는 시험관 내 분석을 사용하여 일상적으로 평가되었다. 확장 단계가 끝나면, Vγ9Vδ2 T 세포의 순도를 유세포 분석으로 평가하고, 이러한 세포를 다음 사용을 위해 동결시켰다. 실험 전날, 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포를 해동하고, 200 UI/mL rHuIL-2와 밤새 배양하여 시험관 내 생존을 유지하였다. 공-배양 후, Vγ9Vδ2 T 세포 활성화는 γδ T 세포에서 CD107a/b 발현의 유세포 분석 검출, 또는 표적 세포 사멸의 척도로 Caspase3/7 활성화를 정량화하여 모니터링된다.
먼저, 3명의 상이한 건강한 공여자 PBMC로부터 확장된 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 mAb1의 농도를 증가시키면서 Daudi 세포주 (ATCC-CCL213; 버킷 림프종)와 공-배양하였다. 4시간 후, 세포를 유세포 분석으로 CD107a/b의 Vγ9Vδ2 T 세포에 대해 분석하였다. 결과는 평균 0.89 nM (+/-0.39)의 EC50 를 갖는 CD107a/b를 발현하는 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율에서 농도 관련 증가를 보여주었다(도 1A). 동시에, 본 발명자들은 mAb1-펄스된 Daudi 세포에 대한 Vγ9Vδ2 T 세포 세포용해 활성을 평가하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, mAb1은 0.35 nM의 EC50으로 농도 의존적 방식으로 표적 세포의 세포사멸을 유도하였다. 추가적으로, Vγ9Vδ2 T 세포 활성화(CD107a/b; 도 1C 상단 패널) 및 종양 세포 용해(Casp3/7; 도 1C 하단 패널)를 다른 조직 기원의 종양 세포주를 사용하여 테스트하고, Daudi 세포와 비교하였다. 결과는 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화, 및 후속 종양 세포 용해가 L-IPC(췌장관 선암종), A549(폐암 상피세포) 및 HT29(결직장 선암) 세포주에 결합하는 mAb1에 의해 유도됨을 보여주었다.
7. mAb1는 조직 기원에 관계없이, 인간 세포주를 발현하는 다양한 BTN3A의 Vη9Vδ2 T-세포 사멸을 향상시킨다
a. 재료 & 방법.
종양 세포 배양
HL-60은 인간 급성 전골수성 백혈병에서 유래한 인간 전골수모 세포주이다. Daudi는 버킷 림프종에서 유래한 인간 B 림프모 세포주이다. Jurkat은 급성 T 세포 백혈병 세포주이다.
HT-29 및 HCT116 는 결직장 선암에서 유래한 인간 상피세포이다.
PC3 및 DU145는 전립선암으로부터 유래되었다(각각 전이성 부위, 뼈 및 뇌).
SUM159 및 MDA-MB-231 은 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포주이다.
HL60, Daudi, Jurkat, DU145 및 MDA-MB-231 세포를 RPMI Glutamax, 10% FBS; 1 mM 소듐 피루베이트, 37℃/5% CO2에서 배양하였다. PC3 및 HT-29를 DMEM 10% FBS, 1mM 소듐 피루베이트, 37℃/5% CO2에서 배양하였다. HCT116를 McCoy 5a 배지 10% SVF에서 배양하였다. SUM159를 배지 F12 Nut Mix 1X+ Glutamax, 5% SVF, 하이드로코르티손 2mg/ml, 인슐린 휴마로그 2mg/ml 및 비-필수-아미노-산에서 배양하였다.
시험관 내 Vγ9Vδ2 T-세포 확장.
말초혈액단핵세포(PBMC)는 Etablissement Franηais du Sang Provence Alpes Cote d'Azur (France)에서 얻은 말초 혈액의 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되었다. Vγ9Vδ2 T 세포를 확장하기 위해, 50.106개의 PBMC가 rHuIL-2 (200UI/mL) 및 아미노비스포스포네이트(Zoledronate, 1 μM)의 존재 하에서, 10 내지 14일동안 75 cm2 플라스크의 10% FBS 및 1% 소듐 피루베이트가 보충된 RPMI1640에서 1.5x106 cells/ml로 재현탁되었다. 5일부터, rHuIL-2를 2 또는 3일마다 갱신하였고, 세포를 1x106/ml로 유지하였다. 확장 단계가 끝날 때 Vγ9Vδ2 T 세포의 순도를 유세포 분석으로 평가하고, Vγ9Vδ2 T 세포의 수가 살아있는 세포의 80%에 도달하면 이들 세포를 향후 사용을 위해 FBS 20% DMSO에서 동결하였다.
인간 PBMC로부터 Vγ9Vδ2 T-세포 정제.
신선한 인간 PBMC를 PBS + 2% FBS + 1mM EDTA에서 50.106 cells/ml로 재현탁하였다. Vγ9Vδ2 를 제조사의 지시에 따라 EasySep™ Human Gamma/Delta T Cell 분리 키트 (Stemcell # 19255)을 사용하여 분리하였다. 절차가 끝나면 유세포 분석으로 세포 순도를 측정하였다. 살아있는 CD3+ Vg9+ 세포는 80% 이상이었다.
Vγ9Vδ2 T-세포 사멸 분석.
10,000개의 확장된 또는 새로운 Vγ9Vδ2 T 세포를 96웰 플레이트에서 종양 세포주와 함께 RPMI 1640 + glutamax, 10% FBS + 1mM NaPy에서 표시된 비율(E:T 1:1 또는 1:5)의 비율로 mAb1 또는 관련 아이소타입 대조군의 존재 하에서 공-배양하였다. 공-배양에 첨가되었을 때, rHuIL-2는 20 IU/ml로 사용되었다. 지정된 시간 후, ATP는 살아있는 세포의 수에 비례하는 발광 신호를 생성하는 Glo 시약(Promega # G7572)을 사용하여 측정되었다.
b. 결과
Vγ9Vδ2 T 세포와 공-배양시 사멸을 모니터링하기 위해, 표적 세포의 caspase 3/7 염색을 기반으로 하는 방법 외에도, 본 발명자들은 대사 활성 세포의 지표인 존재하는 ATP의 정량화를 기반으로 배양에서 생존 가능한 세포의 수에 대한 평가를 기반으로 보완적인 접근 방식을 개발하였다.
이 분석을 통해, 본 발명자들은 mAb1 또는 관련 아이소타입 대조군 +/-rHuIL-2 (20 IU/ml)의 존재 하에서 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포(비율 E:T 1:1)와 공-배양한 후 24시간동안 급성 골수성 백혈병 세포주 HL60-WT, 또는 - BTN3A-KO의 생존을 모니터링하였다(도 A). 결과는 활성화된 Vγ9Vδ2 T 세포에 의한 표적 종양 세포의 효율적인 BTN3A 의존적 사멸을 나타내는 mAb1의 존재 하에 HL60-WT 생존의 농도 의존적 감소를 보였다. 유사한 실험이 시험관 내 확장되거나 새로 분리된 Vγ9Vδ2 T-세포로 수행되었고(도 B 및 C, 각각), 세포 생존율이 4일동안 측정되었다.
도 B는 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포가 농도 의존적 방식으로 HL6-WT 증식을 제어했음을 보여주었다. rHu-IL2의 첨가는 1차 T 세포의 생체 외 배양에 필요한 생존 신호를 제공함으로써 시간이 지남에 따라 이펙터 세포 사멸 능력을 향상시켰다. 유사한 결과가 인간 PBMC에서 분리된 신선한 Vγ9Vδ2 T 세포에서 얻어졌으며, 1:1 및 1:5의 E:T 비율에서 HL60-WT와 함께 4일 동안 공-배양되었다. 이러한 결과는 개별 Vγ9Vδ2 T 세포가 mAb1 매개 활성시 여러 종양 표적을 반복적으로 참여시키고 죽이는 능력을 나타낸다(도 2C).
다음으로, 본 발명자들은 이 분석을 사용하여 다양한 조직 기원(결장, 유방, 전립선, T 림프종 및 버킷 림프종)에서 유래한 BTN3A 발현 세포주에 대한 mAb1 매개 Vγ9Vδ2 T 세포 사멸활성을 모니터링하였다. HT29, PC3, DU145, MDA-MB-231, HCT116, SUM159, Jurkat 및 Daudi 세포를 증가하는 mAb1 농도의 존재 하에서 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포와 함께 밤새 공-배양하고, 세포 생존율을 측정하였다. mAb1이 조직 기원에 관계없이 인간 세포주를 발현하는 광범위한 BTN3A의 Vg9Vd2 T 세포 사멸을 향상시키는 결과를 확인하였다(Erreur　! Source du renvoi introuvable. 및 도면).
표 15: 10,000개의 종양 세포를 상이한 농도의 mAb1 존재 하에 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포(비율 E:T 1:1)와 함께 24시간동안 공-배양하였다. 세포 생존율은 ATP 수준을 검출하는 생물발광 분석을 사용하여 측정되었다. 생물발광 값 x 105가 표시되었다.
No mAb mAb1 0,1ug/ml mAb1 1ug/ml mAb1 10ug/ml
종양 세포주 조직 기원 Donor A Donor B Donor A Donor B Donor A Donor B Donor A Donor B
HT29 결장 68,0 55,1 67,6 58,1 54,2 49,2 41,0 40,0
PC3 전립선 86,2 73,5 83,3 68,5 48,6 49,7 36,8 38,0
DU145 전립선 75,7 69,6 65,1 64,4 33,6 41,8 22,1 26,8
MDA-MB-231 유방 66,5 59,8 68,2 59,8 57,6 54,7 43,4 44,4
HCT116 결장 114,1 102,7 102,9 96,3 63,6 68,3 53,4 59,4
SUM159 유방 84,7 90,8 54,1 58,5 20,7 25,2 16,4 19,2
Jurkat T 림프종 26,8 26,4 3,7 4,1 2,6 9,7 4,1 1,6
Daudi 버킷 림프종 17,3 9,7 6,2 5,0 7,2 5,3 6,0 6,1
8. mAb1는 인간 AML 세포주가 이식된 마우스 모델에서 Vγ9Vδ2 T 세포 치료법을 개선한다.
mAb1 표적 BTN3A가 설치류에서 발현되지 않고, VgγVδ2 T 세포 하위 집단이 영장류에 특이적이기 때문에, VgγVδ2 T 세포 항-종양 활성의 개념에 대한 실험적 증거는 일반적으로 BTN3A를 발현하는 인간 종양 세포주가 접목되고, 건강한 인간 공여자로부터 VgγVδ2 T 세포로 입양 전달된 면역 손상 NSG 마우스에서 테스트된다(이러한 재구성에서 Vγ9Vδ2 T 세포는 종양 세포주에 동종이다). 이러한 모델은 광범위한 고형 악성종양뿐만 아니라 혈액 악성 종양에서 Vγ9Vδ2 T 세포의 항종양 치료 잠재력을 검증하는데 널리 사용되었다(Pauza, C. D. et al. 2018, Immunol. 9).
또한, 인간 Vγ9Vδ2 T 세포를 받은 마우스에 투여된 뮤린 항-인간 BTN3A 항체인 m20.1은 NSG를 보유한 AML 마우스의 혈액 및 골수에서, 동물 생존을 향상시키고 백혈병 부담을 감소시키는 것으로 설명되었다(benyamine et al 2016, see above). 이 모델에서, m20.1은 RLI, rHuIL-15/IL-15Rα 융합 단백질과 함께 주입되어, 항종양 림프구 서브세트를 확장하고 마우스의 생존율을 향상시켜 전달된 인간 Vγ9Vδ2 T 세포보다 나은 항종양 활성을 유도하였다.
생체 내 마우스 모델에서 mAb1의 효능에 대한 추가 특성화를 위해, 본 발명자들은 mAb1과 결합된 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 전달의 잠재력을 조사하여 종양 성장을 지연시키고 NSG를 보유한 AML 마우스에서 동물 생존을 개선시켰다.
a. U937 모델.
건강한 6-8 주령 암컷 마우스(n=30)는 Gertner-Dardenne, J. et al. 2012. J. Immunol. 188, 4701-4708에 설명된 대로, 0일째에 0.2x106 루시퍼라제 형질도입된-U937 세포를 받았다. 1일째에, 종양 부하를 생물발광 이미징을 사용하여 평가하고, 마우스를 6개 그룹으로 무작위로 할당하여 1일째에 시험관 내 확장된 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 단독 또는 항-BTN3A mAb1 또는 관련 아이소타입 대조군 (10 mg/kg, 200ug/mice)과 결합하여 정맥 주사하였다. 처리는 7일째에 반복하였다. 그룹 2 및 4에서, 항체는 또한 4일 및 10일째에 투여되었다. rHuIL-15/rHuIL15-Rα 복합체가 Vγ9Vδ2 T 세포의 증식을 가능하게 하므로(J. Immunol. (2006) 177, 6072-608), 이러한 복합체는 Vγ9Vδ2 T 세포와 함께 투여되었다.
모든 그룹은 표 16에 기술되어 있다.
hIL-15/IL-15R-Fc 복합체를 주사(마우스 당 0.2ug hIL-15+1.2ug IL-15R-Fc) 전 30분동안 실온(RT)에서 사전-복합체화하였고, 주사 이전에 Vγ9Vδ2 T 세포와 혼합하였다. 각 주사에 대한 최종 부피는 100 μl이었다. 처리 mAb는 Vγ9Vδ2 T 세포 생착 4시간 전에 주사되었다.
우리의 결과는 Vγ9Vδ2 T 세포와 rHuIL-15/rHuIL15-R주입이 종양 부담을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 이 효과는 훨씬 더 두드러졌고, 항-BTN3A mAb1이 Vγ9Vδ2 T 세포와 함께 첨가되었을 때 생존의 유의미한 증가와 관련이 있었다(표 16 및 표 17). 중요한 것은, 이러한 매우 공격적인 마우스 모델(U937 종양이 있는 NSC 마우스에서 10 mg/kg)에 사용된, 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 가장 효과적인 약물 중 하나인 시타라빈(Ara-C)은 인간 Vγ9Vδ2 T 세포 전달에 결합된 mAb1으로 관찰된 바와 같이, 2 내지 3일동안 마우스 생존(~10%)을 개선하였다.
이러한 데이터는 생체 내 Vγ9Vδ2 T 세포 면역치료법과 결합된 항-BTN3A mAb에 의해 발휘되는 강력한 항-백혈병 효과를 강조한다.
표 16: U937 AML 마우스 모델: 그룹 설명.
그룹 1일 4일 7일 10일
1 없음 없음 없음 없음
2 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a
+hIgG1 (10mg/kg)		 hIgG1 (10mg/kg) Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a
+hIgG1 (10mg/kg)		 hIgG1 (10mg/kg)
3 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a+mAb1 (10mg/kg) 없음 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a
+mAb1 (10mg/kg)		 없음
4 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a+mAb1 (10mg/kg) mAb1 (10mg/kg) Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a
+mAb1 (10mg/kg)		 mAb1 (10mg/kg)
5 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a+mIgG1 (10mg/kg) 없음 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a
+mIgG1 (10mg/kg)		 없음
6 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a
+m20.1 (10mg/kg)		 없음 Vγ9Vδ2 T 세포 (3x106 cells) +IL-15a
+m20.1 (10mg/kg)		 없음
a　: rHu-IL-15/rHu-IL-15Rα 복합체.
표 17: 항-BTN3A (mAb1) 활성화 mAb는 AML 이종 이식 모델에서 생체 내 항-백혈병 활성을 갖는다. U937 모델의 생물발광 데이터.
　 마우스 1일 7일 14일 19일
그룹 1
PBS 		1 1.10E+03 8.33E+04 1.06E+07 사망
2 7.04E+03 2.50E+05 6.14E+07 사망
3 7.57E+03 8.40E+04 2.41E+07 사망
4 9.23E+03 2.55E+05 6.48E+07 사망
5 1.37E+04 1.36E+05 3.58E+07 사망
　 　평균 7.73E+03 1.62E+05 3.93E+07 NA
그룹 2
LTγδ+
hIgG1 (1일, 4일, 7일, 10일)
　 		1 3.24E+03 1.48E+04 5.23E+06 1.82E+08
2 5.61E+03 1.39E+05 3.23E+07 사망
3 8.76E+03 3.44E+04 1.60E+07 2.23E+08
4 9.87E+03 2.61E+04 1.66E+07 사망
5 1.03E+04 2.90E+05 3.14E+07 3.19E+08
　평균 7.56E+03 1.01E+05 2.03E+07 NA
그룹 3
LTγδ+
mAb1 (1일, 7일)
　 		1 3.38E+03 5.38E+03 1.89E+06 1.87E+08
2 5.22E+03 3.68E+04 3.95E+06 2.04E+08
3 7.49E+03 8.44E+04 1.23E+07 1.05E+08
4 7.73E+03 6.67E+04 4.93E+06 1.79E+08
5 1.29E+04 1.55E+04 5.32E+06 8.47E+07
　평균 7.34E+03 4.18E+04 5.68E+06 1.52E+08
그룹 4
LTγδ+
mAb1 (1일, 4일, 7일, 10일)
　 		1 4.08E+03 1.32E+03 2.14E+06 8.98E+07
2 5.17E+03 7.58E+04 1.55E+06 1.79E+08
3 9.21E+03 2.82E+04 6.82E+06 1.24E+08
4 8.97E+03 4.00E+04 6.38E+06 1.91E+08
5 1.00E+04 4.02E+04 3.65E+06 9.26E+07
　평균 7.49E+03 3.71E+04 4.11E+06 1.35E+08
그룹 5
LTηδ+
mIgG1 (1일, 7일)
　 		1 4.15E+03 4.01E+04 2.96E+06 1.19E+08
2 4.53E+03 7.96E+04 4.91E+06 2.40E+08
3 9.72E+03 1.66E+05 1.46E+07 2.97E+08
4 8.92E+03 6.36E+04 1.35E+07 1.47E+08
5 1.02E+04 3.97E+04 1.39E+07 1.91E+08
　평균 7.50E+03 7.78E+04 9.97E+06 1.99E+08
그룹 6
LTηδ+
m20.1 (1일, 7일) 		1 4.34E+03 8.51E+04 3.55E+06 1.57E+08
2 4.42E+03 3.05E+04 4.28E+06 1.87E+08
3 8.66E+03 6.62E+04 4.24E+06 5.55E+07
4 8.90E+03 3.05E+04 2.49E+06 7.32E+07
5 1.17E+04 1.62E+04 1.73E+06 9.61E+07
평균 7.60E+03 4.57E+04 3.26E+06 1.14E+08
표 18: 항-BTN3A (mAb1) 활성화 mAb는 AML 이종 이식 모델에서 항-백혈병 활성을 갖는다. U937 세포주 생착 후 생존.
　 마우스 사망일 　 마우스 사망일
그룹 1
PBS 		1 18 그룹 4
LTγδ+
mAb1 (1일, 4일, 7일, 10일) 		1 20
2 18 2 22
3 19 3 23
4 19 4 23
5 19 5 24
　 평균값 19 　 평균값 23
그룹 2
LTγδ+
hIgG1 (1일, 4일, 7일, 10일) 		1 20 그룹 5
LTγδ+
mIgG1 (1일, 7일) 		1 20
2 20 2 20
3 21 3 21
4 21 4 21
5 22 5 22
　 평균값 21 　 평균값 21
그룹 3
LTγδ+
mAb1 (1일, 7일) 		1 21 그룹 6
LTγδ+
m20.1 (1일, 7일) 		1 23
2 21 2 24
3 22 3 24
4 24 4 24
5 24 5 24
　 평균값 22 　 평균값 24
b. MOLM14 모델.
AraC 내성 인간 AML 유래 세포주인 MOLM14에 대한 mAb1의 생체 내 효능은 인간 종양 세포주, 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포가 이식된 NSC 마우스를 사용하여 이종이식 모델에서 평가되었다. 이 연구의 목표는 종양 성장 및 마우스 생존에 대한 mAb1과 조합되어 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 반복된 iv 주사에 대한 효과를 확인하는 것이었다.
6 내지 8주령 암컷 NSC 마우스를 0일째에 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 (iv) 루시퍼라제(luc2)를 발현하는 MOLM14 (CVCL_7916) 세포를 100 μl의 부피로 마우스 당 0.2x106 주사하였다. 내독소가 없는 루시페린(30 mg/kg)을 첨가한 후, 생물발광 분석을 PhotonIMAGER (Biospace Lab)를 사용하여 0일에 수행하고, 마우스를 생물발광 신호의 강도를 기준으로 7마리의 균일한 그룹에서 무작위화하였다. 3x106의 인간 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포 및 hIL-15/IL-15R 복합체를 1일, 8일, 15일, 22일 및 29일째에 iv 주사하였다. mAb1 또는 hIgG1을 1일, 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일, 26일 및 29째일에 iv 주사하였다.
다른 실험군은 표 19에 요약되어 있다.
hIL-15/IL-15R-Fc 복합체를 주사(마우스 당 0.2ug hIL-15+1.2ug IL-15R-Fc) 전 30분동안 실온(RT)에서 사전-복합체화하였고, 주사 이전에 Vγ9Vδ2 T 세포와 혼합하였다. 각 주사에 대한 최종 부피는 100 μl이었다. 처리 mAb는 Vγ9Vδ2 T 세포 생착 4시간 전에 주사되었다.
MOLM14 세포에 의해 방출된 생물발광 신호는 종양 성장을 추적하기 위해 세포 주입한 후 0일, 7일, 14일, 21일 및 28일 후에 측정되었다. 혈액 샘플링은 19일째에 수행하여 유세포 분석에 의해 순환하는 MOLM14 세포의 수를 평가하였다. 염색 전에 적혈구 용해를 수행하였다. mCD45+ 뮤린 세포를 분석에서 제외하였고, MOLM14 종양 세포를 이들의 GFP 발현으로 검출하였다. 수집은 LSRII SORP 세포측정기(Becton Dickinson)에서 수행되었고, 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 질병의 증상(상당한 체중 감소, 주름진 털, 구부러진 등, 쇠약 및 이동성 감소)에 대한 마우스의 매일 모니터링은 고통의 징후가 있는 주사된 동물의 사망 시간을 결정하였다.
표 20에 나타난 바와 같이, 관련없는 대조군 아이소타입(hIgG1)이 주입된 Vγ9Vδ2 T 세포는 종양 성장을 유의하게 제어하지 않았다. 대조적으로, 낮은 생물발광 신호에서 나타난 바와 같이, 종양 성장은 항-BTN3A mAb1이 인간 Vγ9Vδ2 T 세포와 함께 순차적으로 투여될 때 강하게 감소되었다. 또한 결과는 프로토콜의 19일째에 순환하는 모세포의 수(말초 혈액에서 유세포 분석에 의해 평가됨)의 상당한 감소를 보여주었다(표 20). 중요한 것은, 종양 성장에서 항-BTN3A mAb-의존적 감소가 마우스 생존에서 45%의 현저한 개선을 이끈다는 것이다(각 아이소타입의 대조군과 비교하여)(표 22).
표 19: MOLM14 마우스 모델: 그룹 설명
그룹 동물의 수 7일 및 14일에서의 처리
1 6 PBS
2 7 Vg9Vd2 T 세포 (3x106 cells) + IL15/IL15R-Fc + hIgG1 (10mg/kg)
3 7 Vg9Vd2 T 세포 (3x106 cells) + IL15/IL15R-Fc + mAb1 (10mg/kg)
표 20: MOLM14 마우스 모델: 종양 세포 생착 0일, 7일, 14일, 21일 및 28일 후 생물발광 측정.
　 마우스 0일 7일 14일 21일 28일
그룹 1
PBS
　 		1 5.1E+03 3.1E+04 1.1E+06 8.0E+06 죽음
2 1.4E+04 1.1E+04 2.5E+05 2.2E+06 죽음
3 8.0E+03 3.1E+04 1.6E+06 8.8E+06 죽음
4 7.2E+03 2.5E+04 7.4E+05 2.6E+06 죽음
5 7.7E+03 1.6E+04 4.5E+05 1.6E+06 죽음
6 4.0E+03 2.5E+04 1.6E+06 1.5E+07 2.4E+07
평균 7.59E+03 2.32E+04 9.57E+05 6.36E+06 NA
그룹 2
LTγδ+
hIgG1
　 		1 9.5E+03 2.0E+04 7.4E+05 4.0E+06 1.0E+07
2 1.3E+04 5.6E+03 5.9E+05 3.1E+06 죽음
3 7.7E+03 1.4E+04 6.0E+05 2.7E+06 죽음
4 3.1E+03 4.5E+03 1.6E+05 5.6E+06 7.4E+06
5 1.0E+04 1.2E+04 4.7E+05 5.5E+06 1.3E+07
6 6.4E+03 3.1E+04 7.2E+05 2.8E+06 죽음
7 8.8E+03 3.8E+03 2.1E+05 1.3E+06 5.4E+06
평균 8.45E+03 1.29E+04 4.97E+05 3.59E+06 NA
그룹 2
LTγδ+
mAb1 		1 1.2E+04 3.0E+03 1.1E+04 8.6E+04 1.4E+06
2 3.9E+03 2.0E+03 2.0E+04 2.3E+04 2.0E+05
3 1.1E+04 3.4E+03 1.2E+05 2.6E+05 2.0E+06
4 1.2E+04 2.6E+03 7.0E+03 1.7E+04 1.5E+05
5 5.7E+03 1.9E+03 1.4E+04 1.0E+05 5.2E+05
6 4.6E+03 1.3E+03 1.8E+04 2.6E+05 3.5E+06
7 5.1E+03 1.3E+03 1.2E+04 1.2E+05 2.2E+05
평균 7.76E+03 2.19E+03 2.88E+04 1.24E+05 1.13E+06
표 21: MOLM14 마우스 모델: 프로토콜 19일에서 순환 폭발의 수. 데이터는 세포의 수/혈액의 ul로 나타내었다.
마우스 19일
그룹 1
PBS
1 6.1
2 3
3 4.2
4 7.1
5 1.7
6 13.1
그룹 2
LTγδ+
hIgG1
1 1.2
2 1.1
3 3.3
4 1.3
5 4
6 0.9
7 0.5
그룹 2
LTγδ+
mAb1 		1 0
2 0
3 0.02
4 0
5 0
6 0.02
7 0
표 22: MOLM14 마우스 모델: 동물 생존. 각 동물의 사망일은 각 그룹의 평균 생존율과 함께 표시된다.
　 마우스 사망일
그룹 1
PBS
　 		1 23
2 26
3 27
4 27
5 28
6 31
평균값 27
그룹 2
LTγδ+
hIgG1
　 		1 27
2 27
3 27
4 29
5 30
6 30
7 31
평균값 29
그룹 3
LTγδ+
mAb1
　 		1 39
2 40
3 41
4 42
5 43
6 43
7 46
평균값 42
9. mAb1는 인간 난소암 세포주 SKOV-3이 이식된 마우스 고형 종양 모델에서 Vγ9Vδ2 T 세포 치료법을 개선한다.
a. 재료 & 방법.
시험관 내 Vγ9Vδ2 T-세포 확장.
동종 인간 Vγ9Vδ2 T 림프구는 Etablissment Franηais du Sang (EFS, Nantes, France)에서 제공한 건강한 공여자의 혈액 샘플로부터 얻은 말초혈액단핵세포(PBMC)와 Ficoll 밀도 원심분리(Eurobio, Les Ulis, France) 후에 증폭되었다. 먼저, 말초 동종 인간 Vγ9Vδ2 T 림프구의 특정 확장을 위해, PBMC를 10%의 열-불활성화된 송아지 태아 혈청, 2 mM의 L-글루타민, 10 mg/mL의 스트렙토마이신, 100 IU/mL의 페니실린(모두 Gibco), 및 100 IU/mL의 재조합 인간 IL-2(PROLEUKIN, Novartis, Bale, Suisse)이 보충된 RPMI 배지에서 Innate Pharma (Marseille, France)에 의해 친절하게 제공된, 3 μM의 브로모하이드린 피로포스페이트(BrHPP)와 함께 배양하였다. 4일 후, 배양물에 300 IU/mL의 IL-2를 보충하였다. 21일째에, 유세포 분석으로 순도를 측정하였다(순도> 90%). 순수한 인간 Vγ9Vδ2 T 림프구를 영양 세포(혼합 및 35 Gy 조사된 엡스테인-바 바이러스 형질전환된 B 림프구 및 PBMC) 및 10%의 열-불활성화된 송아지 태아 혈청, 2 mM의 L-글루타민, 10 mg/mL의 스트렙토마이신, 100 IU/mL의 페니실린(모두 Gibco), 및 300 IU/mL의 재조합 인간 IL-2(Norvatis)를 사용하여 추가로 확장시켰다. 3주 후, 휴지된 생체 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 림프구를 생체 내 실험에 사용하였다.
마우스 모델
0일째에, 6-8 주령 NSG 마우스에 100 μL 부피의 멸균 PBS에서 마우스 당 루시퍼라제를 발현하는 1x106 SKOV-3 세포(난소암 세포주, SKOV-3-luc-D3, Perkin Elmer, Waltham, MA)를 복강 내 (ip) 주사하였다. 7일 후, 마우스를 6 내지 6 마리의 균질한 그룹으로 무작위화하였다. 7일 및 14일째에, mAb 또는 관련 아이소타입 대조군(hIgG1)의 마우스 당 200 μg의 mAb 처리를 100 μL의 멸균된 PBS에서 주사하였다. 또한, 4시간 후, 5x106의 인간 시험관 내 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포를 마우스 당 100μL의 멸균된 PBS에서 ip 주사하였다.
SKOV-3 세포에 의해 방출되는 생물발광 신호는 종양 성장을 추적하기 위해 종양 세포 이식 후 16일, 23일 및 30일 후에 측정되었다. Biospace Imager(Biospace Lab, Nesles-la-Vallee, France)를 사용하여 이소퓨란 2%로 마취된 마우스에 1,5 mg의 D-루시페린(Interchim, San Diego, CA)을 ip 주사한 지 8분 후에 생물발광 이미지가 실현되었다. 마우스가 초기 체중의 10%를 잃었을 때 실험적 종점에 도달하였다.
b. 결과
난소암에 대한 mAb1의 생체 내 효능은 인간 난소암 세포주 SKOV-3, 및 인간 Vγ9Vδ2 T 세포가 이식된 NSC 마우스를 사용하여 이종 이식 모델에서 평가되었다. 이 연구의 목표는 종양 성장 및 마우스 생존에 대한 mAb1과 조합되어 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 2회 ip 주사에 대한 효과를 확인하는 것이었다.
NSG 마우스는 0일째에 SKOV3으로 복강 내(ip) 주사되었다. 7일 후, 마우스는 처리에 따라 균일한 그룹으로 무작위화되었다. 그룹은 표 23에 설명되어 있다:
표 23: 난소암 마우스 모델: 그룹 설명
그룹 동물의 수 7일 및 14일에서의 처리
1 5 PBS
2 6 Vη9Vδ2 T 세포 (5x106 cells) +hIgG1 (10mg/kg)
3 6 Vη9Vδ2 T 세포 (5x106 cells) +mAb1 (10mg/kg)
결과는 mAb1과 함께 전달된 인간 Vγ9Vδ2 T 세포가 종양 성장을 상당히 지연시켜(표 24) 동물 생존의 상당한 개선을 이끄는 것으로 나타났다(표 25). 참고로, 이 효과는 IL-2 또는 IL-15와 같은 전- Vγ9Vδ2 T 생존 사이토카인의 부재에서 관찰되었다.
표 24: 난소암 마우스 모델: 종양 세포 생착 16, 23 및 30일 후 생물발광 측정.
　 마우스 16일 23일 30일
그룹 1
PBS 		1 87220 죽음 죽음
2 48486 92643 죽음
3 89032 89930 죽음
4 74242 121010 죽음
5 82132 128390 죽음
　 평균 7.62E+04 1.08E+05 NA
그룹 2
LTγδ+
hIgG1 		1 32060 70953 죽음
2 82703 166009 죽음
3 23049 51909 150537
4 85130 147390 죽음
5 18053 45097 죽음
6 41732 76461 죽음
　 　　평균 4.71E+04 9.30E+04 NA
그룹 2
LTγδ+
mAb1 		1 43000 42420 80574
2 20706 43670 63418
3 6891 47150 70070
4 11845 48139 36820
5 22958 29131 74111
6 12725 19767 죽음
평균 1.97E+04 3.84E+04 6.50E+04
표 25: 난소암 마우스 모델: 동물 생존. 각 동물의 사망일은 각 그룹의 평균 생존율과 함께 표시된다.
　 마우스 사망일
그룹 1
PBS 		1 20
2 23
3 23
4 23
5 28
　 평균값 23
그룹 2
LTγδ+
hIgG1 		1 23
2 23
3 28
4 28
5 28
6 35
　 평균값 28
그룹 3
LTγδ+
mAb1 		1 28
2 35
3 35
4 35
5 35
6 39
　 평균값 35
10. 시노몰구스 원숭이 Vγ9Vδ2 T-세포에서의 생체 내 효과
설치류에서 BTN3A 및 Vγ9Vδ2 T 서브세트가 없고, 시험관 내 및 생체 내 Pag-매개 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 시노몰구스에서 문서화한 이전 데이터를 기반으로 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)가 mAb1의 비임상 안전 평가를 위한 유일한 관련 종으로 선택되었다.
a. 재료 & 방법
Biacore
mAb1은 Biacore T200(일련번호 1909913) 기기를 사용하여 Biacore 다중 사이클 동역학 분석을 통해 재조합 인간 또는 시노몰구스 BTN3A1, BTN3A2 및 BTN3A3 단백질(SEQ ID NO 21, 22 및 23 각각)에 대한 결합에 대해 평가되었다. mAb1을 2% BSA/PBS로 2 μg/ml의 농도로 희석하였다. 각 사이클이 시작될 때, 항체를 ~ 150 RU(~ 50 RU의 RMax를 얻기 위한 이론적 값)의 밀도(RL)에서 단백질 A 표면에 포획하였다. 포획한 다음, BTN3A 항원을 주입하기 전에 표면을 안정화시켰다. BTN3A는 25 내지 0.78 nM의 2배 희석 범위에서 0.1% BSA/HBS-P+(실행 버퍼)에서 적정되었다. 결합 단계는 420초동안 모니터링되었고, 해리 단계는 2000초동안 모니터링되었다. 운동 데이터는 50 μl/min의 유속을 사용하여 얻어 임의의 잠재적 물질 전달 효과를 최소화하였다. 얻은 데이터는 1:1 결합 모델을 사용하여 장착하였다.
ELISA
인간 및 시노몰구스 BTN3A1에 대한 mAb1의 겉보기 친화도는 ELISA에 의해 테스트된다. 간단히 말해서, 표적에 대한 mAb1의 결합은 인산염 버퍼(1x PBS)에서 1 μg/ml로 플레이트에 고정된 재조합 BTN3A1을 사용하여 평가된 다음, 블록 버퍼(2% 밀크/PBS)로 포화 단계를 수행하였다. mAb1을 0.00122 내지 20 μg/ml의 4배 희석 범위에서 블록 버퍼로 적정하였다. 2차 항체(염소 항-인간 Igκ 사슬, HRP 접합된 항체, Millipore AP502P, 블록 버퍼에서 1:4000으로 희석) 및 TMB 용액을 검출을 위해 사용하였다. 겉보기 친화도는 EC50%(신호 안정기의 50%를 얻기 위해 필요한 항체 농도)로 표현되었다.
인간 및 시노몰구스 CD3+ 세포에 대한 mAb1의 결합력.
적혈구 용해 후, 인간 또는 시노몰구스 PBL을 30분동안 4℃에서 mAb1 또는 아이소타입 대조군의 증가된 농도로 배양하고, 2회 세척하고, 염소 항-인간-IgG -PE 접합된 2차 항체(eBioscience™ #12-4998-82)로 염색하였다. 2회 세척 후, 세포를 항-CD3-PC3 mAb(BD Bioscience #557749) 및 생존/사멸 시약(Life Technology # L10119)으로 염색하였다. 세척 후, 세포를 200 μL 유동 버퍼에 재현탁시켰다. 세포를 Cytoflex 세포측정기 (Beckman Coulter)에서 분석되었다. 데이터를 살아있는 CD3+ 집단에 게이팅된 FlowJo 소프트웨어(Version 10, FlowJo, LLC, Ashland, USA)를 사용하여 분석하였다. PE 채널의 MFI 값을 계산하고 농도에 대해 플롯하였다. 곡선 피팅은 GraphPad Prism 소프트웨어의 시그모이드 4PL 방정식을 사용하여 얻었다.
인간 및 시노몰구스 순환 세포에서의 BTN3A 표면 발현.
백혈구에서의 BTN3A 표면 발현을 위해, 100ul의 시노몰구스 및 인간 전혈을 96 웰 특이적 항체 칵테일(Aqua live Dead 시약, CD20-V450, CD8-BV605, CD4-BV650, Vg9 TCR-FITC, 항-BTN3A-PE (클론 20.1) (또는 아이소타입 대조군용 mIgG1-PE), CD3-PeCy7, CD45-AF700 및 CD14-APC-H7) 와 함께 플레이트에 두고, 빛으로부터 보호된 RT에서 15분동안 배양하였다. 그 다음, 적혈구를 제조사에 지시에 따라 900ul의 용해 시약(BD Bioscience #349202)으로 용해하였다. 세포를 세척하고, 다중 매개변수 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. 적혈구 세포 및 혈소판에서의 BTN3A 표면 발현을 위해, 100ul의 시노몰구스 또는 인간 전혈을 100 ul의 PBS로 희석하고, 항체의 특정 칵테일(Aqua live dead, CD41-APC, CD45-AF700 및 항-BTN3A (클론 20.1) (또는 아이소타입 대조군용 mIgG1-PE))과 함께 15분동안 빛으로부터 보호된 RT에서 배양하였다. 세척 후, 세포를 다중 매개변수 유세포 분석을 이용하여 분석하였다. BTN3A 표면 발현의 상대적 정량화를 얻기 위해, 제조사의 지시에 따라 규격 비드(Calibrating bead, CellQuant Calibrator Biocytex #7208) 및 염소 항-마우스 IgG(H+L)-PE를 병렬로 사용하였다. 모든 세포 서브세트에 대해, PE 채널의 MFI가 항-BTN3A 및 아이소타입 대조군에 대해 보고되었다. 항-BTN3A 염색의 MFI에서 아이소타입 대조군의 MFI를 빼서 분석을 수행하고, 상대적 표면 발현은 규격 비드로 얻은 표준 곡선에 기반하여 계산하였다.
시노몰구스 Vγ9Vδ2 T 세포 시험관 내 확장 및 활성화.
3 마리의 시노몰구스 전혈을 적혈구 용해 버퍼로 처리하였다. 광범위한 세척 후, 백혈구를 rHuIL-2 (200IU/ml) 및 mAb1 (10ug/ml)의 존재 하에서 6 웰 플레이트에 1.5M/ml의 RPMI 10% SVF로 두었다. rHuIL-2를 6일 및 8일에 첨가하여 인간 PBMC와 함께 사용되는 일반적인 세포 확장 프로토콜을 모방하고, 기능 분석을 수행하기에 충분한 수의 세포를 얻기 위해 Vγ9Vδ2 T 세포 장기 시험관 내 생존을 개선했다. Vγ9+ T 세포의 비율은 특정 항체의 칵테일 및 유세포 분석(CD3-PC7 BD Bioscience #557749, Vg9 TCR-FITC clone 7A5 Invitrogen # TCR2720, Live Dead Near IR ThermoFisher #L10119)을 사용하여 0일, 6일, 8일 및 10일째에 평가되었다.
10일째에, 확장된 Vγ9Vδ2 T 세포를 계수하고, 1:1의 E:T 비율로 인간 종양 세포주와 공배양하였다. 100,000개의 표적 종양 세포주(Raji, DAUDI 및 K562)를 96 웰 플레이트에서 양성 대조군으로 사용된 mAb1 또는 hIgG1 아이소타입 대조군(10ug/ml) 또는 PMA (20ng/ml)/이오노마이신 (1ug/ml)의 존재 하에서 100,000개의 시노몰구스 Vγ9Vδ2 T 세포와 혼합하였다. Vγ9Vδ2 T-세포 탈과립화는 CD107a/b (BD bioscience #555800) 염색 및 유세포 분석을 사용하여 4시간 후 모니터링되었다.
시노몰구스 원숭이 생체 내 연구
생활 연구
4 내지 6년령, 3 내지 5 kg, 베트남 출신의 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)가 이 연구에서 사용되었다. 모든 동물들은 GLP 동물 시설에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 유지되고 사용되었다. 사육 보건(breeder health) 절차로서, 모든 동물들은 결핵 검사를 받았으며, 예방 치료는 사육 기록에 기록되었다. 도착 후, 적어도 2주의 기간동안 연구 절차에 동물을 적응시켰다. 질병에 대한 임상 평가 및 검사가 수행되었다. 동물 건강 평가는 연구에 대한 모든 동물의 적합성을 확인하기 위해 투여 전 단계가 시작되기 전에 수의사가 수행하였다.
단식하지 않은 동물의 피부를 소독한 후 mAb1을 정맥 내로 투여하였다(의자로 억제, 15분 이상 주입). 그룹 1, 4 및 5의 동물은 1, 8, 15 및 22일에 투약되었다. 그룹 2 및 3의 동물은 1일에 1회 투약되었다.
약물동태학
시노몰구스 원숭이 혈청의 mAb1의 정량화를 위해 적격한 약물동태학적 분석이 개발되었다. 간단히 말하면, mAb1은 분광광도법에 의해 ELISA를 사용하여 정량화되었다. 스트렙트아비딘이 미리 코팅된 플레이트가 사용되어 인간 IgG-Fc PK 비오틴 접합체를 포획하였다. mAb1은 플레이트의 표면에서 포획되고 결합된 분석물은 과산화 효소 표지된 항-종 항체인 염소 항-인간 IgG-HRP (Fc 특이적) 항체를 사용하여 검출되었다. 정량화의 표적 범위는 순수한 혈청에서 90 ng/mL 내지 10000 ng/mL이었다.
면역표현법
혈액 샘플 (1.0 mL)을 모든 동물로부터 전완요측정맥(vena cephalica antebrachia) 또는 복재정맥(vena saphena)에서 Li-헤파린 튜브로 채취하였다. 면역표현법은 특정 단일클론항체의 칵테일로 수행되었다. 상대적인 세포 수(림프구/백혈구의 백분율)의 분석이 수행되었다. 총 과립세포/림프구/백혈구 수는 같은 날 혈액 분석기에 의해 측정되었고, 절대 수 계산에 사용되었다. 림프구 하위 집단의 절대 수는 상대 수로부터 계산되었다.
수용체 점유
혈액 샘플 (400 μL)은 모든 동물로부터 전완요측정맥 또는 복재정맥에서 Li-헤파린 튜브로 채취하였다. CD3+ T-세포 및 CD19+ B 세포에 대한 총 표면 BTN3A 발현을 결정하기 위해 ICT01의 과잉과 함께 전배양된 세포 상의 BTN3A(클론 103.2)에 비-경쟁적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하였다. 유리 BTN3A 결합 부위의 검출을 위해, CD3+ T-세포 및 CD19+ B 세포에서 형광염료 표지 항-BTN3A 항체(mAb1)의 결합을 억제하는 표지되지 않은 mAb1과 BTN3A의 경쟁적 결합이 사용되었다. mAb1에 의해 차단된 BTN3A의 양에 따라, 접합된-mAb1의 평균 형광 강도(MFI)가 기하 평균이 감소함에 따라 측정되었다. 결과적으로, 아이소타입 항체의 염색 강도에 가까운 Ab7.2의 염색 강도는 완전한 포화를 나타낸다.
b. 결과
mAb1는 시노몰구스 BTN3A에 결합한다.
공개 데이터베이스에서 3개의 BTN3A 아이소폼 유전자의 차등 식별이 불가했기 때문에, 관련 프라이머를 설계하기 위해 막 횡단 도메인에 가까운 고도로 보존된 cDNA 서열을 사용하여, ImCheck는 시노몰구스 PBMC로부터 분리된 cDNA에 대해 표적 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 서열분석은 시노몰구스 BTN3A1, BTN3A2 및 BTN3A3에 대한 엑토도메인 서열을 식별할 수 있었다. 6xHis 태그에 융합된 시노몰구스 BTN3A1, BTN3A2 및 BTN3A3 아이소폼의 재조합 엑토도메인은 이들 서열(SEQ ID NO 21, 22 및 23)에 기반하여 CHO 세포에서 생산되었다.
재조합 단백질은 BIAcore 및 ELISA에 의해 결합함으로써 mAb1에 대해 테스트되었다(표 26). BIAcore 결과는 mAb1이 3개의 시노몰구스 재조합 BTN3A1, BTN3A2 및 BTN3A3에 유리하게 결합하는 것으로 나타났지만, BTN3A1 아이소폼에 대해 더 낮은 친화도를 나타냈다. ELISA는 BTN3A1 아이소폼에 대해 수행되었다. 흥미롭게도, 표 26은 재조합 인간 또는 시노몰구스 BTN3A1에 결합하는 mAb1에 대한 비교가능한 EC50을 보여준다.
표 26: 인간 및 시노몰구스 BTN3A 재조합 단백질에 결합하는 mAb1
단백질 태그 K D (M) - BIAcore (MCK) EC 50 (M) - ELISA
인간 BTN3A1 (Sino biological # 15973-H08H) C-ter His 0.408E-9 0.93E-9
CynoBTN3A1 C-ter-His 83.8E-09 1.33E-9
CynoBTN3A2 C-ter His 5.97E-09 nd
CynoBTN3A3 C-ter His 2.67E-09 nd
nd: 측정되지 않음
동시에, 시노몰구스 PBMC에 결합하는 mAb1은 유세포분석에 의해 평가되었다. 시노몰구스 CD3+ T 세포에 결합하는 mAb1의 평균 EC50은 인간 CD3+ T 세포의 EC50과 비슷했다(표 27). 시노몰구스 전혈 대 인간의 건강한 공여자 전혈의 상이한 면역세포 하위 집단에 대한 표적 발현은 PE-접합된 항-BTN3A mAb (클론 20.1)와 인간 및 시노몰구스 세포 표면 마커에 대해 알려진 교차-반응성을 갖는 표현형 항체 패널을 함께 사용하여 다중매개변수 유세포분석에 의해 다루어졌다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 BTN3A가 두 종 모두에서 말초혈액 세포 집단의 넓은 패널에서 발현된다는 것을 보여주지만, 분명하게는, 시노몰구스에서 일반적으로 더 낮은 발현이 관찰되었다.
표 27: 인간 및 시노몰구스 CD3+ T 세포에 결합하는 mAb1
세포 기원 설명 게이팅 EC 50 (μg/mL)
(+/-sem) 		EC 50 (x10 -9 M)
(+/-sem)
인간 HV PBMCs EFS Marseille 1차 (n=6) CD3+ 5.25 (+/-0.57) 34.9 (+/-3.8)
시노몰구스 PBMCs Covance Munster 1차 (n=6) CD3+ 7.02 (+/-0.89) 46.79 (+/-5.94)
mAb1는 시험관 내 시노몰구스 Vη9Vδ2 T-세포 확장과 활성을 촉진한다.
다음으로, mAb1의 기능적 활성이 시험관 내 시노몰구스 Vγ9Vδ2 T 세포에 대해 평가되었다. 먼저, mAb1이 10일동안 시노몰구스 PBMC와 함께 배양될 때 시노몰구스 Vγ9Vδ2 T 세포 확장이 촉진되는지 평가하였다. 도 4A에 나타난 것과 같이, mAb1은 테스트된 모든 3마리 동물에서 Vγ9Vδ2 T 세포 확장을 촉진하였다; 이 집단은 10일 후 60%에 도달했고, 인간 세포에서 관찰된 수준과 비슷하다. 10일 확장 후, 세포를 mAb1의 존재 하에 표적 세포로 사용된 Daudi, K562 및 Raji 세포주와 함께 4시간동안 공배양하고, 유세포분석에 의해 CD107a/b에 대해 분석하였다. 이 실험은 mAb1이 모든 3가지 종양 세포주와 공배양되었을 때 유의한 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 유도하였음을 보여주었다(도 4B).
결론적으로, 이 결과는 (i) mAb1이 인간 세포에 대해 유사한 결합도로 시노몰구스 세포에 결합하고; (ii) BTN3A가 인간 및 시노몰구스에서 동일한 혈액세포에서 발현되지만, 후자의 종에서 더 낮은 발현 수준이 관찰되었으며; (iii) mAb1이 시노몰구스 원숭이 PBMC에서 Vγ9Vδ2 T 세포 서브세트 확장을 촉진하고, 확장된 세포가 mAb1-펄스된 종양 표적세포에 대해 반응함을 보여준다.
mAb1는 생체 내 시노몰구스 Vγ9Vδ2 T-세포 구획에 영향을 미친다.
생체 내 연구는 mAb1의 단일 또는 반복 정맥 주입된 4 내지 6년령의 건강한 암컷 시노몰구스 원숭이를 대상으로 수행된다(표 28).
정맥 내 투여 경로는 의도된 인간 치료 경로이기 때문에 선택되었다. 엇갈리게 증가하는(staggered escalating) 용량 설계에 따라 동물을 mAb1로 처리하였다.
표 28: mAb1 PK/PD/내약성 연구 설계
그룹 테스트 항목 투여량
(mg/kg)		 주간 주사 횟수 동물의 수와 성별
1 mAb1 0.1-1-10-100 4 (오름차순 투여량) 1F (감시 동물)
2 1 1 3F
3 10 1 2F
4 10 4 2F
5 100 4 2F
다음의 종점(endpoint)이 평가되었다: 임상 징후, 체중, 임상 병리(혈액학, 임상화학 및 응고), 말초혈액 백혈구 집단에 대한 면역표현법, 활성화/증식/분화 마커, 약물동태학 및 약력학 (순환하는 T 및 B 세포에 대한 BTN3A 수용체 점유).
모든 동물은 mAb1의 1회 또는 4회 반복 15분 주입 후, 연구 29일째에 예정된 부검까지 살아남았다. 체중이나 음식 섭취에 대한 테스트 항목 관련 효과는 발견되지 않았다. 임상 징후는 실험실 주거 환경에서 시노몰구스 원숭이에서 보여진 관찰과 일치했으며, 따라서 테스트 항목에 기인하지 않았다.
약물동태학
mAb1은 0.1 내지 100 mg/kg의 용량 범위에 걸쳐 정맥 내(IV) 투여 후 대략적인 용량-비례 약물동태학적 행동을 보였고(데이터는 나타내지 않음), 표적-매개 제거가 없는 경우 IgG mAb의 긴 제거 반감기를 보였다. 4회 투여에 대해 10 또는 100 mg/kg/week로 반복 투여한 후(데이터는 나타내지 않음), 처리 기간 동안 모든 동물에서 노출이 유지되었으며, 4주 처리 기간 동안 축적되는 것을 최소화하였다. 점증하는 주간 투여 요법에서 1 및 10 mg/kg IV의 투여 후 감시 동물에 대한 약물동태학적 프로파일은 mAb1에 대한 ADA의 형성의 결과일 수 있는 주간 투여 간격이 끝날 무렵에 증가된 제거에 대한 일부 증거를 보여주었다; 100 mg/kg의 마지막 IV 투여 후 제거가 증가했다는 증거는 없었다.
수용체 점유 (RO)
BTN3A 발현 프로파일 및 혈액 내 세포 집단 표현에 따라, mAb1 RO는 CD3+ T 세포 및 CD20+ B 세포에서 측정되었다.
결과는 BTN3A가 CD3+ T 세포와 CD20+ B 세포 모두에서 mAb1 주사 후 빠르게 점유됨을 보여주었다(데이터는 나타내지 않음). 100 mg/kg의 mAb1의 반복된 투여는 매주 투여 간격 내내 완전한 수용체 점유를 위해 필요한 것으로 나타났다.
면역표현법
각 투여 후 선택된 시점에서, mAb1을 투여받은 동물의 혈액을 특정 mAb의 칵테일로 염색하여 T 세포 서브세트(CD4, CD8, Vg9 T 세포, 조절 T 세포), B 세포, 단핵구, NK 세포, mDC, pDC 및 과립구 및 관련 활성화 마커(CD69, CD86, CD95, 그란자임 B, Ki67)를 정량화하고, 유세포 분석으로 분석하였다. 분석은 동시에 채취한 혈액 샘플에서 결정된 총 림프구/백혈구 수에서 외삽된 절대 세포 수 와 함께 각 집단에 대한 상대 세포 수(림프구/백혈구의 백분율 )를 포함하고, 혈액 세포계수기를 사용하여 분석하였다.
이 광범위한 분석의 주요 관찰내용은 다음과 같다:
Vδ9+ T 세포(CD3+ 중 %)는 mAb1을 투여받은 모든 동물에서 투여 후 현저하게 감소하고 단일 투여 동물에서 점진적으로 회복되었다. 이 효과는 CD4 및 CD8 α
Figure pct00002
T 세포에서 관찰되지 않았기 때문에 특이적인 것으로 보이며, 원숭이와 인간의 CD3 참여자 중 이중-특이적 항체에 대해 관찰된 바와 같이 조직에서 γδ T 세포 활성화 및 경계화를 시사하였다. (Smith et al., 2015 Sci Rep. 2015 Dec 11;5:17943. doi: 10.1038/srep17943). 결과는 도 5에 나타내었다.
이 연구는 IV 경로로 투여할 때, mAb1이 최대 100 mg/kg/week 용량에서 잘 견디는 것을 보여주었다. 더욱이, T 세포 서브세트 중, Vγ9Vδ2 T 세포는 mAb1에 의해 특이적이고 유의하게 영향을 받는다.
참고문헌
Alegre, M.-L., Frauwirth, K.A., and Thompson, C.B. (2001). T-cell regulation by CD28 and CTLA-4. Nat. Rev. Immunol. 1, 220-228.
Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., and Struhl, K. (1988). Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons).
Baudino, L., Shinohara, Y., Nimmerjahn, F., Furukawa, J.-I., Nakata, M., Mart
Figure pct00003
nez-Soria, E., Petry, F., Ravetch, J.V., Nishimura, S.-I., and Izui, S. (2008). Crucial Role of Aspartic Acid at Position 265 in the CH2 Domain for Murine IgG2a and IgG2b Fc-Associated Effector Functions. J. Immunol. 181, 6664-6669.
Bensussan, A., and Olive, D. (2005). T-cell: Section report. Cell. Immunol. 236, 3-5.
Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee, S.M., Lee, T., Pope, S.H., Riordan, G.S., and Whitlow, M. (1988). Single-chain antigen-binding proteins. Science 242, 423-426.
Brennan, M., Davison, P.F., and Paulus, H. (1985). Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. Science 229, 81-83.
Bryson, C.J., Jones, T.D., and Baker, M.P. (2010). Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins. BioDrugs 24, 1-8.
Chapoval, A.I., Ni, J., Lau, J.S., Wilcox, R.A., Flies, D.B., Liu, D., Dong, H., Sica, G.L., Zhu, G., Tamada, K., et al. (2001). B7-H3: A costimulatory molecule for T cell activation and IFN-γ production. Nat. Immunol. 2, 269-274.
Collins, M., Ling, V., and Carreno, B.M. (2005). The B7 family of immune-regulatory ligands. Genome Biol. 6, 223.
Coyle, A.J., and Gutierrez-Ramos, J.C. (2001). The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulating T cell function. Nat. Immunol. 2, 203-209.
Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., and Chen, L. (1999). B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369.
Freeman, G.J., Long, A.J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L.J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne, M.C., et al. (2000). Engagement of the Pd-1 Immunoinhibitory Receptor by a Novel B7 Family Member Leads to Negative Regulation of Lymphocyte Activation. J. Exp. Med. 192, 1027-1034.
Glennie, M.J., McBride, H.M., Worth, A.T., and Stevenson, G.T. (1987). Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)2 antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments. J. Immunol. 139, 2367-2375.
Goeddel, D.V. (1990). [1] Systems for heterologous gene expression. In Methods in Enzymology, (Academic Press), pp. 3-7.
Gu, S., Nawrocka, W., and Adams, E.J. (2015). Sensing of Pyrophosphate Metabolites by Vγ9Vδ2 T Cells. Front. Immunol. 5.
Harly, C., Guillaume, Y., Nedellec, S., Peigne, C.-M., Monkkonen, H., Monkkonen, J., Li, J., Kuball, J., Adams, E.J., Netzer, S., et al. (2012). Key implication of CD277/butyrophilin-3 (BTN3A) in cellular stress sensing by a major human γδ T-cell subset. Blood 120, 2269-2279.
Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotn
Figure pct00004
, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E., and Crea, R. (1988). Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 5879-5883.
Kabat, E.A., Wu, T.T., Foeller, C., Perry, H.M., and Gottesman, K.S. (1992). Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE Publishing).
Karpovsky, B., Titus, J.A., Stephany, D.A., and Segal, D.M. (1984). Production of target-specific effector cells using hetero-cross-linked aggregates containing anti-target cell and anti-Fc gamma receptor antibodies. J. Exp. Med. 160, 1686-1701.
Kaufman, R.J., and Sharp, P.A. (1982). Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: analysis of signals utilized for efficient expression. Mol. Cell. Biol. 2, 1304-1319.
Khattri, R., Auger, J.A., Griffin, M.D., Sharpe, A.H., and Bluestone, J.A. (1999). Lymphoproliferative Disorder in CTLA-4 Knockout Mice Is Characterized by CD28-Regulated Activation of Th2 Responses. J. Immunol. 162, 5784-5791.
Klocke, K., Sakaguchi, S., Holmdahl, R., and Wing, K. (2016). Induction of autoimmune disease by deletion of CTLA-4 in mice in adulthood. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E2383-E2392.
Latchman, Y., Wood, C.R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A.J., Brown, J.A., Nunes, R., et al. (2001). PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat. Immunol. 2, 261-268.
Linsley, P.S., Greene, J.L., Tan, P., Bradshaw, J., Ledbetter, J.A., Anasetti, C., and Damle, N.K. (1992). Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T lymphocytes. J. Exp. Med. 176, 1595-1604.
Liu, M.A., Kranz, D.M., Kurnick, J.T., Boyle, L.A., Levy, R., and Eisen, H.N. (1985). Heteroantibody duplexes target cells for lysis by cytotoxic T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 8648-8652.
McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G., and Chiswell, D.J. (1990). Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348, 552-554.
Morrison, S.L. (1985). Transfectomas provide novel chimeric antibodies. Science 229, 1202-1207.
Ni, L., and Dong, C. (2017). New B7 Family Checkpoints in Human Cancers. Mol. Cancer Ther. 16, 1203-1211.
Oganesyan, V., Gao, C., Shirinian, L., Wu, H., and Dall'Acqua, W.F. (2008). Structural characterization of a human Fc fragment engineered for lack of effector functions. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 64, 700-704.
Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., and Junutula, J.R. (2013). Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. MAbs 6, 34-45.
Paulus, H. (1985). Preparation and biomedical applications of bispecific antibodies. Behring Inst. Mitt. 118-132.
Perry, L.C.A., Jones, T.D., and Baker, M.P. (2008). New approaches to prediction of immune responses to therapeutic proteins during preclinical development. Drugs RD 9, 385-396.
Reddy, M.P., Kinney, C.A.S., Chaikin, M.A., Payne, A., Fishman-Lobell, J., Tsui, P., Monte, P.R.D., Doyle, M.L., Brigham-Burke, M.R., Anderson, D., et al. (2000). Elimination of Fc Receptor-Dependent Effector Functions of a Modified IgG4 Monoclonal Antibody to Human CD4. J. Immunol. 164, 1925-1933.
Remington, J.P., and Gennaro, A.R. (1995). Remington: the science and practice of pharmacy (Easton, PA: Mack Publishing).
Rhodes, D.A., Stammers, M., Malcherek, G., Beck, S., and Trowsdale, J. (2001). The Cluster of BTN Genes in the Extended Major Histocompatibility Complex. Genomics 71, 351-362.
Ruddy, D.A., Kronmal, G.S., Lee, V.K., Mintier, G.A., Quintana, L., Domingo, R., Meyer, N.C., Irrinki, A., McClelland, E.E., Fullan, A., et al. (1997). A 1.1-Mb Transcript Map of the Hereditary Hemochromatosis Locus. Genome Res. 7, 441-456.
Saverino, D., Tenca, C., Zarcone, D., Merlo, A., Megiovanni, A.M., Valle, M.T., Manca, F., Grossi, C.E., and Ciccone, E. (1999). CTLA-4 (CD152) Inhibits the Specific Lysis Mediated by Human Cytolytic T Lymphocytes in a Clonally Distributed Fashion. J. Immunol. 162, 651-658.
Sharpe, A.H., and Freeman, G.J. (2002). The B7-CD28 superfamily. Nat. Rev. Immunol. 2, 116-126.
Sharpe, A.H., and Pauken, K.E. (2018). The diverse functions of the PD1 inhibitory pathway. Nat. Rev. Immunol. 18, 153-167.
Shukla, A.A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., and Low, D. (2007). Downstream processing of monoclonal antibodies―Application of platform approaches. J. Chromatogr. B 848, 28-39.
Stech, M., Nikolaeva, O., Thoring, L., St
Figure pct00005
cklein, W.F.M., W
Figure pct00006
stenhagen, D.A., Hust, M., D
Figure pct00007
bel, S., and Kubick, S. (2017). Cell-free synthesis of functional antibodies using a coupled in vitro transcription-translation system based on CHO cell lysates. Sci. Rep. 7, 12030.
Strohl, W.R. (2009). Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 685-691.
Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Hoy, P., Yokota, K., Arai, K., Yoshida, M., and Arai, N. (1988). SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Mol. Cell. Biol. 8, 466-472.
Tseng, S.-Y., Otsuji, M., Gorski, K., Huang, X., Slansky, J.E., Pai, S.I., Shalabi, A., Shin, T., Pardoll, D.M., and Tsuchiya, H. (2001). B7-Dc, a New Dendritic Cell Molecule with Potent Costimulatory Properties for T Cells. J. Exp. Med. 193, 839-846.
Urlaub, G., and Chasin, L.A. (1980). Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4216-4220.
Williams, A.F., and Barclay, A.N. (1988). The immunoglobulin superfamily--domains for cell surface recognition. Annu. Rev. Immunol. 6, 381-405.
SEQUENCE LISTING <110> IMCHECK THERAPEUTICS <120> Anti-BTN3A antibodies and their use in treating cancer or infectious disorders <130> BEP180083 EP <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Glu Asp Asp Tyr Asp Gly Thr Pro Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Glu Asp Asp Tyr Asp Gly Thr Pro Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly 450 <210> 5 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Glu Asp Asp Tyr Asp Gly Thr Pro Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 8 <211> 1356 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 caggtccaac tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta catcttcacc agatactata tgtattgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta acaatggtgg tactaagttc 180 aatgagaagt tcaagaacag ggccacactg actgtagaca aatccatcag cacagcatac 240 atggagctca gcaggctgag atctgacgac acggcggtct attattgttc aagagaggat 300 gattacgacg ggaccccctt tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaattcgag 720 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcctccat cgagaaaacc 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080 gaagagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggttga 1356 <210> 9 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 caggtccaac tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta catcttcacc agatactata tgtattgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta acaatggtgg tactaagttc 180 aatgagaagt tcaagaacag ggccacactg actgtagaca aatccatcag cacagcatac 240 atggagctca gcaggctgag atctgacgac acggcggtct attattgttc aagagaggat 300 gattacgacg ggaccccctt tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaatgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcga ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggttga 1347 <210> 10 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gacatccaga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat ccgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttat cttggtacca gcagaaacca 120 ggaaaagccc ctaaactctt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180 agatttactg gcagtggatc tggaacagat ttcacattca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaactt atccatacac gttcggacag 300 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 11 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gacatccaga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat ccgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttat cttggtacca gcagaaacca 120 ggaaaagccc ctaaactctt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180 agatttagtg gcagtggatc tggaacagat ttcacattca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaactt atccatacac gttcggacag 300 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Asp Asp Tyr Asp Gly Thr Pro Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 18 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Lys Met Ala Ser Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Asn Phe Arg Val 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Met Pro His Ser Ala Gln Phe Ser 20 25 30 Val Leu Gly Pro Ser Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Ala 35 40 45 Asp Leu Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu 50 55 60 Leu Lys Trp Val Ser Ser Ser Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Gly Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Pro Tyr Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Ser Ile Leu Arg Asp Gly Ile Thr Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg 100 105 110 Ile His Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe 115 120 125 Gln Asp Gly Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Ser Asp Leu His Val Asp Val Lys Gly Tyr Lys Asp Gly 145 150 155 160 Gly Ile His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Gln 165 170 175 Ile Gln Trp Ser Asn Asn Lys Gly Glu Asn Ile Pro Thr Val Glu Ala 180 185 190 Pro Val Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr Ala Val Ala Ala Ser Val 195 200 205 Ile Met Arg Gly Ser Ser Gly Glu Gly Val Ser Cys Thr Ile Arg Ser 210 215 220 Ser Leu Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser Ile Ser Ile Ala Asp Pro 225 230 235 240 Phe Phe Arg Ser Ala Gln Arg Trp Ile Ala Ala Leu Ala Gly Thr Leu 245 250 255 Pro Val Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly Ala Gly Tyr Phe Leu Trp Gln 260 265 270 Gln Gln Glu Glu Lys Lys Thr Gln Phe Arg Lys Lys Lys Arg Glu Gln 275 280 285 Glu Leu Arg Glu Met Ala Trp Ser Thr Met Lys Gln Glu Gln Ser Thr 290 295 300 Arg Val Lys Leu Leu Glu Glu Leu Arg Trp Arg Ser Ile Gln Tyr Ala 305 310 315 320 Ser Arg Gly Glu Arg His Ser Ala Tyr Asn Glu Trp Lys Lys Ala Leu 325 330 335 Phe Lys Pro Ala Asp Val Ile Leu Asp Pro Lys Thr Ala Asn Pro Ile 340 345 350 Leu Leu Val Ser Glu Asp Gln Arg Ser Val Gln Arg Ala Lys Glu Pro 355 360 365 Gln Asp Leu Pro Asp Asn Pro Glu Arg Phe Asn Trp His Tyr Cys Val 370 375 380 Leu Gly Cys Glu Ser Phe Ile Ser Gly Arg His Tyr Trp Glu Val Glu 385 390 395 400 Val Gly Asp Arg Lys Glu Trp His Ile Gly Val Cys Ser Lys Asn Val 405 410 415 Gln Arg Lys Gly Trp Val Lys Met Thr Pro Glu Asn Gly Phe Trp Thr 420 425 430 Met Gly Leu Thr Asp Gly Asn Lys Tyr Arg Thr Leu Thr Glu Pro Arg 435 440 445 Thr Asn Leu Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys Lys Val Gly Val Phe Leu 450 455 460 Asp Tyr Glu Thr Gly Asp Ile Ser Phe Tyr Asn Ala Val Asp Gly Ser 465 470 475 480 His Ile His Thr Phe Leu Asp Val Ser Phe Ser Glu Ala Leu Tyr Pro 485 490 495 Val Phe Arg Ile Leu Thr Leu Glu Pro Thr Ala Leu Thr Ile Cys Pro 500 505 510 Ala <210> 19 <211> 334 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Lys Met Ala Ser Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Asn Phe His Val 1 5 10 15 Ser Leu Leu Leu Val Gln Leu Leu Thr Pro Cys Ser Ala Gln Phe Ser 20 25 30 Val Leu Gly Pro Ser Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Ala 35 40 45 Asp Leu Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu 50 55 60 Leu Lys Trp Val Ser Ser Ser Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Gly Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Pro Tyr Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Ser Ile Leu Arg Asp Gly Ile Thr Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg 100 105 110 Ile His Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe 115 120 125 Gln Asp Gly Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Ser Asn Leu His Val Glu Val Lys Gly Tyr Glu Asp Gly 145 150 155 160 Gly Ile His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Gln 165 170 175 Ile Gln Trp Ser Asn Ala Lys Gly Glu Asn Ile Pro Ala Val Glu Ala 180 185 190 Pro Val Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr Glu Val Ala Ala Ser Val 195 200 205 Ile Met Arg Gly Gly Ser Gly Glu Gly Val Ser Cys Ile Ile Arg Asn 210 215 220 Ser Leu Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser Ile Ser Ile Ala Asp Pro 225 230 235 240 Phe Phe Arg Ser Ala Gln Pro Trp Ile Ala Ala Leu Ala Gly Thr Leu 245 250 255 Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Leu Trp Arg 260 265 270 Gln Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu Ser Ser Glu Ile Glu Ser Glu Gln 275 280 285 Glu Met Lys Glu Met Gly Tyr Ala Ala Thr Glu Arg Glu Ile Ser Leu 290 295 300 Arg Glu Ser Leu Gln Glu Glu Leu Lys Arg Lys Lys Ile Gln Tyr Leu 305 310 315 320 Thr Arg Gly Glu Glu Ser Ser Ser Asp Thr Asn Lys Ser Ala 325 330 <210> 20 <211> 584 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Lys Met Ala Ser Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Asn Phe His Val 1 5 10 15 Ser Leu Phe Leu Val Gln Leu Leu Thr Pro Cys Ser Ala Gln Phe Ser 20 25 30 Val Leu Gly Pro Ser Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Ala 35 40 45 Asp Leu Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu 50 55 60 Leu Arg Trp Val Ser Ser Ser Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Gly Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Pro Tyr Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Ser Ile Leu Arg Asp Gly Ile Thr Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg 100 105 110 Ile His Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe 115 120 125 Gln Asp Gly Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Ser Asp Leu His Ile Glu Val Lys Gly Tyr Glu Asp Gly 145 150 155 160 Gly Ile His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Gln 165 170 175 Ile Lys Trp Ser Asp Thr Lys Gly Glu Asn Ile Pro Ala Val Glu Ala 180 185 190 Pro Val Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr Ala Val Ala Ala Ser Val 195 200 205 Ile Met Arg Gly Ser Ser Gly Gly Gly Val Ser Cys Ile Ile Arg Asn 210 215 220 Ser Leu Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser Ile Ser Ile Ala Asp Pro 225 230 235 240 Phe Phe Arg Ser Ala Gln Pro Trp Ile Ala Ala Leu Ala Gly Thr Leu 245 250 255 Pro Ile Ser Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ser Tyr Phe Leu Trp Arg 260 265 270 Gln Gln Lys Glu Lys Ile Ala Leu Ser Arg Glu Thr Glu Arg Glu Arg 275 280 285 Glu Met Lys Glu Met Gly Tyr Ala Ala Thr Glu Gln Glu Ile Ser Leu 290 295 300 Arg Glu Lys Leu Gln Glu Glu Leu Lys Trp Arg Lys Ile Gln Tyr Met 305 310 315 320 Ala Arg Gly Glu Lys Ser Leu Ala Tyr His Glu Trp Lys Met Ala Leu 325 330 335 Phe Lys Pro Ala Asp Val Ile Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn Ala Ile 340 345 350 Leu Leu Val Ser Glu Asp Gln Arg Ser Val Gln Arg Ala Glu Glu Pro 355 360 365 Arg Asp Leu Pro Asp Asn Pro Glu Arg Phe Glu Trp Arg Tyr Cys Val 370 375 380 Leu Gly Cys Glu Asn Phe Thr Ser Gly Arg His Tyr Trp Glu Val Glu 385 390 395 400 Val Gly Asp Arg Lys Glu Trp His Ile Gly Val Cys Ser Lys Asn Val 405 410 415 Glu Arg Lys Lys Gly Trp Val Lys Met Thr Pro Glu Asn Gly Tyr Trp 420 425 430 Thr Met Gly Leu Thr Asp Gly Asn Lys Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Pro 435 440 445 Arg Thr Asn Leu Lys Leu Pro Glu Pro Pro Arg Lys Val Gly Ile Phe 450 455 460 Leu Asp Tyr Glu Thr Gly Glu Ile Ser Phe Tyr Asn Ala Thr Asp Gly 465 470 475 480 Ser His Ile Tyr Thr Phe Pro His Ala Ser Phe Ser Glu Pro Leu Tyr 485 490 495 Pro Val Phe Arg Ile Leu Thr Leu Glu Pro Thr Ala Leu Thr Ile Cys 500 505 510 Pro Ile Pro Lys Glu Val Glu Ser Ser Pro Asp Pro Asp Leu Val Pro 515 520 525 Asp His Ser Leu Glu Thr Pro Leu Thr Pro Gly Leu Ala Asn Glu Ser 530 535 540 Gly Glu Pro Gln Ala Glu Val Thr Ser Leu Leu Leu Pro Ala His Pro 545 550 555 560 Gly Ala Glu Val Ser Pro Ser Ala Thr Thr Asn Gln Asn His Lys Leu 565 570 575 Gln Ala Arg Thr Glu Ala Leu Tyr 580 <210> 21 <211> 243 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 21 Met Gly Ser Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Ser Phe His Val Cys Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Leu Leu Met Pro His Ser Ala Gln Phe Ala Val Val 20 25 30 Gly Pro Pro Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu Leu Arg 50 55 60 Trp Val Ser Ser Asn Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ala Asp Gly 65 70 75 80 Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Ala Tyr Arg Gly Arg Thr Ser 85 90 95 Ile Leu Arg Asp Gly Ile Thr Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg Ile His 100 105 110 Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe Gln Asp 115 120 125 Gly Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Ser Asp Leu His Ile Asp Val Lys Gly Tyr Glu Asp Gly Gly Ile 145 150 155 160 His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Gln Ile Arg 165 170 175 Trp Ser Asn Asp Lys Gly Glu Asn Ile Pro Ala Val Glu Ala Pro Val 180 185 190 Phe Val Asp Gly Val Gly Leu Tyr Ala Val Ala Ala Ser Val Ile Leu 195 200 205 Arg Gly Ser Ser Gly Glu Gly Val Ser Cys Thr Ile Arg Ser Ser Leu 210 215 220 Leu Gly Leu Glu Lys Thr Thr Ser Ile Ser Ile Ala Gly His His His 225 230 235 240 His His His <210> 22 <211> 243 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 22 Met Gly Ser Ser Leu Ala Phe Leu Leu Leu Asn Phe His Val Ser Phe 1 5 10 15 Phe Leu Val Gln Leu Leu Thr Pro Cys Ser Ala Gln Phe Ser Val Leu 20 25 30 Gly Pro Ser Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu Leu Arg 50 55 60 Trp Val Ser Ser Ser Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ala Asp Gly 65 70 75 80 Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Pro Tyr Arg Gly Arg Thr Ser 85 90 95 Ile Leu Arg Asp Asp Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg Ile His 100 105 110 Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe Gln Asp 115 120 125 Ala Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Ser Asn Leu His Val Glu Val Lys Gly Tyr Glu Asp Gly Gly Ile 145 150 155 160 His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Lys Ile Gln 165 170 175 Trp Ser Asn Ala Lys Gly Gln Asn Ile Pro Ala Val Glu Ala Pro Val 180 185 190 Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr Ala Val Ala Ala Ser Val Ile Met 195 200 205 Arg Gly Gly Ser Gly Glu Ser Val Ser Cys Ile Ile Arg Asn Ser Val 210 215 220 Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser Ile Ser Ile Ala Asp His His His 225 230 235 240 His His His <210> 23 <211> 243 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 23 Met Ala Asn Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Asn Phe Arg Val Cys Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Gln Leu Leu Thr Pro Cys Ser Ala Gln Phe Ala Val Leu 20 25 30 Gly Pro His Gly Pro Ile Leu Ala Met Val Gly Glu Asp Val Asp Leu 35 40 45 Pro Cys His Leu Phe Pro Thr Met Ser Ala Glu Thr Met Glu Leu Arg 50 55 60 Trp Val Ser Ser Ser Leu Arg Gln Val Val Asn Val Tyr Ser Asp Gly 65 70 75 80 Lys Glu Val Glu Asp Arg Gln Ser Ala Pro Tyr Arg Gly Arg Thr Ser 85 90 95 Ile Leu Arg Asp Gly Ile Thr Ala Gly Lys Ala Ala Leu Arg Ile His 100 105 110 Asn Val Thr Ala Ser Asp Ser Gly Lys Tyr Leu Cys Tyr Phe Gln Asp 115 120 125 Gly Asp Phe Tyr Glu Lys Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Ser Asp Leu His Ile Glu Val Lys Gly Tyr Glu Asp Gly Gly Ile 145 150 155 160 His Leu Glu Cys Arg Ser Thr Gly Trp Tyr Pro Gln Pro Gln Ile Gln 165 170 175 Trp Ser Asn Thr Lys Gly Gln His Ile Pro Ala Val Lys Ala Pro Val 180 185 190 Val Ala Asp Gly Val Gly Leu Tyr Ala Val Ala Ala Ser Val Ile Met 195 200 205 Arg Gly Ser Ser Gly Glu Gly Val Ser Cys Ile Ile Arg Asn Ser Leu 210 215 220 Leu Gly Leu Glu Lys Thr Ala Ser Ile Ser Ile Thr Asp His His His 225 230 235 240 His His His

Claims (15)

  1. SEQ ID NO: 1의 가변 중쇄 폴리펩타이드 VH 및 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 가변 경쇄 폴리펩타이드 VL을 포함하는 분리된 항-BTN3A 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 BTN3A 폴리펩타이드와 결합하는 분리된 항-BTN3A 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 KD가 10 nM 이하, 바람직하게는 KD가 5 nM 이하인 인간 BTN3A 폴리펩타이드와 결합하는 분리된 항-BTN3A 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 탈과립화 분석에서 측정된 EC50이 5 ㎍/ml 미만, 바람직하게는 1 ㎍/ml 이하인 BTN3 발현 세포와의 공-배양에서 Vγ9Vδ2-T 세포의 활성화를 유도하는 분리된 항-BTN3A 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 IgG1 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 IgG1 불변 영역은 야생형 IgG1 아이소타입 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교할 때 Fcη 수용체에 대해 없거나 감소된 결합을 부여하는 분리된 항-BTN3A 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 돌연변이 IgG1 불변 영역은 IgG1 삼중 돌연변이 L247F, L248E 및 P350S인 분리된 항-BTN3A 항체.
  7. 제1항 내지 제6항에 있어서, mAb1은 SEQ ID NO: 4의 중쇄 및 SEQ ID NO: 6의 경쇄를 포함하는 분리된 항-BTN3A 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 치료 또는 (ii) 진단을 위한 것인 분리된 항-BTN3A 항체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위해, 선택적으로 다른 활성 성분, 예를 들어 항-PD1 또는 항-PD-L1 항체, 또는 IL-2 또는 IL-1와 같은 사이토카인, 또는 이들의 페길화된 변이체와 조합되는 분리된 항-BTN3A 항체.
  10. 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합된 항-BTN3A 항체를 포함하고, 선택적으로 다른 활성 성분, 예를 들어 항-PD1 또는 항-PD-L1 항체, 또는 IL-2 또는 IL-15와 같은 사이토카인을 포함하는 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항-BTN3A 항체를 포함하는 동결건조물 제제, 미리-충전된 실린지 또는 바이알.
  12. 상기 항-BTN3A 항체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 숙주세포에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항-BTN3A 항체의 재조합 생산을 위한 발현 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 제7항에서 정의된 mAb1의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  14. 제12항 또는 제13항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 하기를 포함하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-BTN3A 항체의 생산 방법: (i) 숙주세포에 의해 상기 항체의 발현을 위한 제17항의 숙주세포를 배양하는 단계; 선택적으로 (ii) 상기 항체를 정제하는 단계; (iii) 항체를 회수하는 단계.
KR1020217006171A 2018-08-01 2019-07-31 항-btn3a 항체 및 암 또는 감염성 질환의 치료에서 이들의 용도 KR20210084426A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18306050.8 2018-08-01
EP18306050 2018-08-01
EP19153992.3 2019-01-28
EP19153992 2019-01-28
PCT/EP2019/070693 WO2020025703A1 (en) 2018-08-01 2019-07-31 Anti-btn3a antibodies and their use in treating cancer or infectious disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210084426A true KR20210084426A (ko) 2021-07-07

Family

ID=67470408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217006171A KR20210084426A (ko) 2018-08-01 2019-07-31 항-btn3a 항체 및 암 또는 감염성 질환의 치료에서 이들의 용도

Country Status (14)

Country Link
US (3) US11987631B2 (ko)
EP (1) EP3830119A1 (ko)
JP (2) JP7401166B2 (ko)
KR (1) KR20210084426A (ko)
CN (2) CN113286819B (ko)
AU (1) AU2019312831A1 (ko)
BR (1) BR112021001776A2 (ko)
CA (1) CA3107933A1 (ko)
CL (1) CL2021000258A1 (ko)
IL (1) IL280563B2 (ko)
MX (1) MX2021001268A (ko)
SG (1) SG11202101038SA (ko)
WO (1) WO2020025703A1 (ko)
ZA (1) ZA202100819B (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018067525A2 (pt) * 2016-02-26 2019-02-05 Centre Nat Rech Scient anticorpos tendo especificidade para o btla e seus usos
JP7401166B2 (ja) * 2018-08-01 2023-12-19 イムチェック セラピューティクス エスエーエス 抗ｂｔｎ３ａ抗体及びがん又は感染性障害の処置におけるその使用
TW202313695A (zh) 2021-09-15 2023-04-01 法商感應檢查療法公司 抗ｂｔｎ３ａ抗體在製備用於治療腫瘤的藥物的用途
WO2023052541A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Imcheck Therapeutics Combination of an anti-btn3a activating antibody and an il-2 agonist for use in therapy
MX2024005190A (es) 2021-10-27 2024-07-24 Imcheck Therapeutics Metodos para el tratamiento de trastornos infecciosos.
WO2023161457A1 (en) 2022-02-27 2023-08-31 Evobright Gmbh Bispecific antibodies against cd277 and a tumor-antigen
WO2024074498A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Imcheck Therapeutics Combination of a btn3a activating antibody, a bcl2 inhibitor and hypomethylating agent for use in treating cancer
WO2024175699A1 (en) 2023-02-23 2024-08-29 Imcheck Therapeutics Combination of btn3a activating antibody and immune checkpoint inhibitors

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CN101370830A (zh) * 2005-09-26 2009-02-18 米德列斯公司 抗cd70的人单克隆抗体
WO2010106051A1 (en) 2009-03-17 2010-09-23 Universite De La Mediterranee Btla antibodies and uses thereof
KR20120090037A (ko) 2009-07-31 2012-08-16 메다렉스, 인코포레이티드 Ｂｔｌａ에 대한 완전 인간 항체
WO2011027349A1 (en) 2009-09-06 2011-03-10 Protab Ltd. Humanized antibodies specific for hsp65-derived peptide-6 methods and uses thereof
KR101695056B1 (ko) 2010-07-15 2017-01-10 애드헤론 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 카드헤린-11의 ec1 도메인을 표적으로 하는 인간화 항체 및 관련 조성물 및 방법
US20150353643A1 (en) * 2013-09-24 2015-12-10 Universite De La Mediterranee - Aix-Marseille Ii Anti-cd277 antibodies and uses thereof
WO2012080769A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-cd277 antibodies and uses thereof
TWI734975B (zh) 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
RU2756247C2 (ru) * 2014-11-17 2021-09-28 Эдисет Био, Инк. Генетически модифицированные гамма дельта т-клетки
BR112018067525A2 (pt) 2016-02-26 2019-02-05 Centre Nat Rech Scient anticorpos tendo especificidade para o btla e seus usos
JP7401166B2 (ja) * 2018-08-01 2023-12-19 イムチェック セラピューティクス エスエーエス 抗ｂｔｎ３ａ抗体及びがん又は感染性障害の処置におけるその使用
TW202313695A (zh) * 2021-09-15 2023-04-01 法商感應檢查療法公司 抗ｂｔｎ３ａ抗體在製備用於治療腫瘤的藥物的用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP3830119A1 (en) 2021-06-09
ZA202100819B (en) 2022-09-28
IL280563A (en) 2021-03-25
IL280563B1 (en) 2024-06-01
US20230322932A1 (en) 2023-10-12
US20220112289A1 (en) 2022-04-14
CN113286819B (zh) 2024-05-24
MX2021001268A (es) 2021-09-08
US20230272080A1 (en) 2023-08-31
US11987631B2 (en) 2024-05-21
IL280563B2 (en) 2024-10-01
CN118459590A (zh) 2024-08-09
AU2019312831A1 (en) 2021-02-18
JP7401166B2 (ja) 2023-12-19
CL2021000258A1 (es) 2021-07-02
SG11202101038SA (en) 2021-02-25
US11945871B2 (en) 2024-04-02
CN113286819A (zh) 2021-08-20
WO2020025703A1 (en) 2020-02-06
JP2024028834A (ja) 2024-03-05
BR112021001776A2 (pt) 2021-05-04
JP2021533204A (ja) 2021-12-02
CA3107933A1 (en) 2020-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210084426A (ko) 항-btn3a 항체 및 암 또는 감염성 질환의 치료에서 이들의 용도
US20230406932A1 (en) Antibodies that modulate a biological activity expressed by a cell
CN113045669B (zh) 用于肿瘤治疗之方法及抗体组成物
US20240150468A1 (en) Pd-l1-specific antibodies and methods of using the same
AU2021203876A1 (en) Anti-CD3 antibodies, activatable anti-CD3 antibodies, multispecific anti-CD3 antibodies, multispecific activatable anti-CD3 antibodies, and methods of using the same
KR20200061402A (ko) 항-cd38 항체 및 항-cd3 및 항-cd28 항체와의 조합
KR102344620B1 (ko) 항-cd137 항체
KR102037541B1 (ko) 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
JP2020015753A (ja) Ｐｄ１および／またはｌａｇ３結合性物質
JP2020515239A (ja) 抗ｉｃｏｓアゴニスト抗体およびそれらの使用
KR20200131286A (ko) 종양 특이적 세포 고갈에 대한 항-cd25
KR20170089881A (ko) Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
US20230357407A1 (en) Bispecific anti pd1-anti tim3 antibodies
KR20230170805A (ko) St2 항원 결합 단백질
US20220220215A1 (en) Binding molecules
KR20200083598A (ko) 이뮤노글로불린-유사 전사체 3 (ilt3)에 대해 특이적인 항체 및 그의 용도
KR20240017912A (ko) 항-ccr8 항체 및 이의 용도
CN113698492A (zh) 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
US20230235090A1 (en) Bispecific antibody and use thereof
KR20240017090A (ko) 항-pd-1 항체와의 조합을 위한 항-cd137 항체
RU2800726C2 (ru) Антитела против btn3a и их применение при лечении рака или инфекционных заболеваний
KR102432046B1 (ko) 항-pd-l1 항체와의 조합을 위한 항-cd137 항체
US20220289846A1 (en) Antibodies to human programmed death receptor pd-1
WO2023052541A1 (en) Combination of an anti-btn3a activating antibody and an il-2 agonist for use in therapy