TW202313695A - 抗ｂｔｎ３ａ抗體在製備用於治療腫瘤的藥物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於製藥領域。特別是關於誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化之分離的抗BTN3A抗體使用於治療有需要的人類受試者的腫瘤，其中藉由評估受試者的血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數來選擇用於以所述抗BTN3A抗體治療的受試者。

Description

抗BTN3A抗體在製備用於治療腫瘤的藥物的用途
本發明係關於醫藥領域。特別是關於使用活化的抗BTN3A抗體治療癌症疾病的方法。
周邊血液(peripheral blood)在技術上容易取得並處理，可長時間重複取用並且大多提供足夠的樣本體積。由於這些原因，周邊血液是在腫瘤病患的免疫群體監控(immune population monitoring)方面被高度利用的材料(Schnell et al, Biomedicines 2018, 6, 25)。相較之下，取用並表現型分析(phenotyping)浸潤腫瘤組織的不同免疫細胞在技術上仍具有挑戰(Maibach et al, 2020, Front Immunol 2020; 11:2105; Lara et al 2019, Nature, Scientific Reports 9:17589)。
考慮到免疫系統的高度多樣化、動態性，在周邊免疫細胞的表現型、功能以及代謝上的變化通常不被認為代表在腫瘤內發生的變化(Schnell et al, Biomedicines 2018, 6, 25；Maibach et al, 2020, Front Immunol 2020; 11:2105)。
此外，在不同免疫細胞群體的周邊血液中的頻率(frequency)或絕對計數(absolute count)與它們各自在腫瘤組織中的浸潤之間並沒有明確的相關性。這對於先天免疫細胞群體尤其如此，例如自然殺手細胞(NK cell)或γδ T細胞(gamma delta T cell)。
WO2020/025703揭露了一種抗BTN3A抗體(活化的抗BTN3A抗體)，其活化Vγ9Vδ2 T細胞的細胞溶解功能、細胞激素產生及/或增殖，從而可作為免疫治療劑以克服在癌症病患中觀察到的免疫抑制機制。
發明人如今提供證據證明在周邊血液中γδ T細胞的絕對計數與腫瘤組織中γδ T細胞的活化之間的相關性，從而提高基於周邊血液中γδ T細胞的絕對計數來選擇使用活化的抗BTN3A抗體治療的反應者之可能性。
發明人更首次提供證據證明抗BTN3A抗體與抗PD1抗體的聯合治療在具有頑抗性(refractory)或復發性(relapsed)腫瘤且先前曾接受過抗PD1抗體之免疫治療的病患中的臨床功效。
本發明的第一態樣是關於一種誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化之分離且活化的抗BTN3A抗體，用於治療有需要的人類受試者的腫瘤，其中已藉由評估在受試者中血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數，來選擇用於以抗BTN3A抗體治療的受試者。在具體實施例中，當基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於5000個細胞/毫升、10000個細胞/毫升或高於20000個細胞/毫升時，則選擇所述受試者進行所述治療。
本發明的另一態樣是關於一種誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化之分離且活化的抗BTN3A抗體，用於治療有需要的人類受試者的實質固態瘤(solid tumor)，其中已藉由評估在來自受試者的實質固態瘤活檢(biopsy)中的腫瘤基線Vγ9+ T細胞密度，來選擇用於以抗BTN3A抗體治療的受試者。在具體實施例中，當腫瘤基線Vγ9+ T細胞密度高於2、3、4、5、6、7、8、9或10個細胞/平方毫米(mm 2)時，則選擇所述受試者進行所述治療。
本發明也關於一種治療有需要的人類受試者的腫瘤的方法，其包含施用治療有效量之活化的抗BTN3A抗體，其中已藉由評估在受試者中血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數，來選擇用於所述活化的抗BTN3A抗體治療的人類受試者。
本發明也關於一種治療有需要的人類受試者的腫瘤的方法，其包含施用治療有效量之活化的抗BTN3A抗體，其中已藉由評估在受試者的腫瘤活檢中的基線Vγ9+ T細胞密度，來選擇所述人類受試者進行所述活化的抗BTN3A抗體治療。
另一態樣是針對一種選擇適於活化的抗BTN3A抗體治療的受試者的方法，此方法包含評估在受試者中血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數之步驟。
另一態樣是針對一種選擇適於活化的抗BTN3A抗體治療的受試者的方法，此方法包含評估在受試者的腫瘤活檢中的基線Vγ9+ T細胞密度之步驟。
本發明進一步關於一種治療有需要的人類受試者的腫瘤的方法，其包含配合施用治療有效量之誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化的抗BTN3A抗體與治療有效量之抗PD1/PDL1抗體，其中受試者在先前接受過抗PD1/PDL1治療後具有復發性或頑抗性腫瘤。
本文進一步揭露一種治療有需要的人類受試者的腫瘤的方法，其包含施用治療有效量之誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化的抗BTN3A抗體，其中所述腫瘤是選自由膀胱癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)以及頭頸部鱗狀上皮細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)組成之群組的實質固態瘤。
在較佳實施例中，活化的BTN3A抗體是如本文所述的mAb1或具有mAb1的6個CDR之mAb1的功能性變體。
為了使本發明可更容易理解，首先定義特定用語。其他定義闡述於實施方式中。
如本文所用，用語「BTN3A」具有在本技術領域中的一般含義。在具體實施例中，指的是包含SEQ ID NO:18的BTN3A1、SEQ ID NO:19的BTN3A2或SEQ ID NO:20的BTN3A3之人類BTN3A多肽。
如本文所用之用語「抗體」指的是免疫球蛋白分子與免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有會免疫專一性結合抗原的抗原結合位的分子。因此，用語抗體不僅包含完整的抗體分子，還包含抗體片段以及抗體的變體(包含衍生物)。
在囓齒動物以及靈長類動物的天然抗體中，兩條重鏈藉由雙硫鍵彼此連接，並且每條重鏈藉由雙硫鍵與輕鏈連接。輕鏈有兩種類型，λ (lambda)以及κ (kappa)。重鏈主要有五種類型(或同型)：IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE，其決定抗體分子的功能活性。各個鏈含有獨特的序列結構域。在典型的IgG抗體中，輕鏈包含兩個結構域，可變域(variable domain，VL)以及恆定域(constant domain，CL)。重鏈包含四個結構域，可變域(VH)以及三個恆定域(CH1、CH2以及CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)以及重鏈(VH)兩者的可變域決定對抗原的結合識別以及專一性。輕鏈(CL)與重鏈(CH)的恆定域賦予重要的生物性質，例如抗體鏈締合(association)、分泌、介胎盤移動(trans-placental mobility)、補體結合以及對Fc受體(FcR)的結合。
Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N端部分，並且由一條輕鏈與一條重鏈的可變部分組成。抗體的專一性在於抗體結合位與抗原決定位之間的結構互補性。抗體結合位由主要來自高度變異區或互補決定區(CDR)的殘基所組成。偶爾，來自非高度變異區或骨架區(framework region，FR)的殘基會參與抗體結合位，或影響整體結構域結構進而影響結合位。互補決定區(或CDR)指的是共同界定先天免疫球蛋白結合位的天然Fv區的結合親和力以及專一性之胺基酸序列。免疫球蛋白的輕鏈與重鏈各自具有三個CDR，分别命名為L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3以及H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原結合位通常包含六個CDR，包含來自各個重鏈與輕鏈可變域的CDR組。骨架區(FR)指的是介於CDR之間的胺基酸序列。因此，輕鏈與重鏈的可變域通常包含如下序列的4個骨架區以及3個CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
抗體可變域中的殘基一般是根據Kabat等人所設計的系統來編號。此系統是由Kabat等人於1987年在具有免疫學意義的蛋白質序列一書(美國衛生與公眾服務部，美國國立衛生研究院)所提出(Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE Publishing，下文稱為「Kabat等人」)。本說明書中使用此編號系統。Kabat的殘基命名並非總是直接對應於SEQ ID序列中胺基酸殘基的線性編號。實際的線性胺基酸序列可含有比嚴格的Kabat編號中更少或更多的胺基酸，對應於基本的可變域結構之無論是骨架區或是互補決定區的結構構件的縮短或插入。可藉由以「標準的」Kabat編號序列進行抗體序列中同源性殘基的比對來確定給定抗體的殘基的正確Kabat編號。根據Kabat編號系統，重鏈可變域的CDR位在第31-35號殘基(H-CDR1)、第50-65號殘基(H-CDR2)以及第95-102號殘基(H-CDR3)。根據Kabat編號系統，輕鏈可變域的CDR位在第24-34號殘基(L-CDR1)、第50-56號殘基(L-CDR2)以及第89-97號殘基(L-CDR3)。
如本文所用，抗BTN3A抗體是專一性結合BTN3A多肽的抗體。
如本文所用，用語「專一性結合」指的是抗體可檢測地結合呈現在抗原(如BTN3A多肽)上的抗原決定位(epitope)的能力。在一些實施例中，其旨在表示以下述半數有效濃度(50% effective concentration，EC50)結合至在周邊血骨髓細胞(peripheral blood marrow cell，PBMC)上表現的人類BTN3A的抗體，所述EC50較佳為低於50微克/毫升(μg/ml)，更佳為低於10 μg/ml，所述EC50由如以下示例所述之流式細胞術(flow cytometry)在結合分析中測得。在其它實施例中，其旨在表示以下述解離常數(dissociation constant，K D)結合至抗原(如BTN3A多肽)的抗體，所述K D為100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、100 pM或更低或是10 pM或更低，所述K D由如示例所述之多循環動力學分析(multicycle kinetics analysis)測得。
如本文所用，「分離的抗體」指的是實質上不含其它具有不同抗原專一性的抗體(例如專一性結合BTN3A之分離的抗體實質上不含與除BTN3A之外的其它抗原專一性結合的抗體)。然而，專一性結合BTN3A之分離的抗體可與其它抗原(如來自其它物種的相關BTN3A分子)具有交叉反應性。此外，分離的抗體可實質上不含其它細胞物質及/或化學物質。
如本文所用之用語「單株抗體」或「單株抗體組合物」指的是單一分子組合物的抗體分子的製劑。單株抗體組合物顯示出對特定抗原決定位的單一結合專一性以及親和力。
片語「識別抗原的抗體」以及「對抗原具有專一性的抗體」與用語「專一性結合抗原的抗體」在本文中可互換使用。
如本文所用，用語「Kassoc」或「Ka」旨在表示特定抗體抗原交互作用的締合速率(association rate)，而本文所用的用語「Kdis」或「Kd」旨在表示特定抗體抗原交互作用的解離速率(dissociation rate)。
如本文所用，用語「K D」旨在表示解離常數，其由Kd比Ka的比值(即Kd/Ka)獲得，並以莫耳濃度(M)表示。抗體的K D值可使用本領域習知的方法來確定。測定抗體的K D的方法是利用表面電漿子共振(surface plasmon resonance)，或利用生物感測器系統(如Biacore®系統)。
專一性可進一步藉由結合特定抗原對非專一性結合其他不相關分子(在此情況下，特定抗原為BTN3A多肽)之親和力/親合力(affinity/avidity)的比值來展現，例如約10:1、約20:1、約50:1、約100:1、10,000:1或更大。如本文所用，用語「親和力」意思是抗體對抗原決定位的結合的強度。
如本文所用，用語「活化的抗體」指的是能夠直接或間接誘發效應細胞的免疫功能的抗體。尤其，如本文所用，活化的抗BTN3A抗體具有至少誘發γδ T細胞活化的能力，通常是與BTN3A表現細胞共同培養的Vγ9Vδ2 T細胞，且EC50低於5 μg/ml，較佳為1 μg/ml或更低，所述EC50由如下方示例所述之去顆粒化(degranulation)分析中測得。
如本文所用，用語「受試者」包含任何人類或非人類動物。用語「非人類動物」包含所有脊椎動物，例如哺乳動物以及非哺乳動物，如非人類靈長類動物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。在較佳的實施例中，受試者為人類受試者。
如本文所用，用語「治療」指的是下述(1)及(2)之一或多者：(1)抑制疾病；例如抑制個體的疾病、狀況或失調，所述個體正經歷或展現出疾病、狀況或失調的病理或症狀(即阻止疾病的病理及/或症狀進一步發展)；(2)改善疾病；例如改善個體的疾病、狀況或失調，所述個體正經歷或展現出疾病、狀況或失調的病理或症狀(即逆轉病理及/或症狀)，如降低疾病的嚴重程度或者減少或減輕疾病的一或多種症狀。尤其，關於腫瘤的治療，用語「治療」可指的是抑制腫瘤的生長或減小腫瘤的大小。
如本文所用，「血液Vγ9Vδ2 T細胞計數」指的是在受試者的血液樣本的特定體積中循環的Vγ9Vδ2 T細胞的絕對數，其藉由與校準珠(calibration beads)相關的標準流式細胞術方法來確定，例如示例中所述。
如本文所用，「腫瘤Vγ9+ T細胞密度」指的是在受試者的腫瘤活檢的特定體積中每平方毫米的細胞數，其使用專一性結合Vγ9TCR的抗體(如單株抗體7B6)藉由免疫組織化學法來確定，例如示例中所述。
如本文所用，「聯合治療」、「共同施用」、「配合施用」或「伴隨施用」指的是至少兩種治療劑的配合施用，其中在有需要的同一受試者中，第一劑通常為活化的抗BTN3A抗體(如mAb1)，第一劑與第二劑同時施用或在時間間隔內施用第二劑，第二劑例如抗PD-1抗體(即吉舒達(pembrolizumab))，其中這些時間間隔使所組合的搭配可表現出治療疾病(例如癌症)的合作或協同效應。儘管這些遞送方法在本文所述的範圍內，但其並非旨在暗示治療劑必須同時施用且/或配製成一起遞送的製劑。活化的抗BTN3A抗體可與一或多種其他額外的療法或治療劑同時或優先或之後施用。此用語也有意涵蓋試劑不必通過相同施用途徑施用的治療方案。
需要活化的抗BTN3A抗體治療之受試者
活化的抗BTN3A抗體可活化Vγ9Vδ2 T細胞的細胞溶解功能、細胞激素產生及/或增殖，從而可使用於克服在癌症病患中觀察到的免疫抑制機制(WO2020/025703)。
如本文所用，用語「癌症」指的是具有自主生長能力的細胞之過度增殖與腫瘤疾病(neoplastic disease)狀態，即以快速增殖的細胞生長為特徵的異常狀態或狀況。過度增殖與腫瘤疾病狀態可分為病理性，即表徵或構成疾病狀態，或可分為非病理性，即偏離正常但與疾病狀態無關。無論組織病理類型或侵襲階段如何，此用語有意包含所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移組織或惡性轉化的細胞、組織或器官。
用語「癌症」或「腫瘤」包含各種器官系統的惡性腫瘤，例如影響肺、乳腺、甲狀腺、淋巴、胃腸道與生殖泌尿道，以及腺癌，其包含如大多數大腸癌、腎細胞癌、前列腺癌及/或睾丸腫瘤、肺的非小細胞癌、小腸癌以及食道癌之惡性腫瘤。
癌症可典型地分為實質固態瘤癌症(非血液系統惡性腫瘤)與血液系統惡性腫瘤。
血液系統惡性腫瘤的示例包含但不限於B細胞淋巴腫瘤、T細胞淋巴腫瘤、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、如瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(diffule large B cell lymphoma，DLBLC)之B-NHL、T-NHL、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma，SLL)、被套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、自然殺手細胞淋巴腫瘤(NK-cell lymphoid neoplasm)以及包含急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)之髓細胞系腫瘤(myeloid cell lineage neoplasm)。
非血液系統癌症的示例包含但不限於大腸直腸癌、乳癌、肺癌(如非小細胞肺癌)、腦癌、攝護腺癌、頭頸癌(如頭頸部鱗狀上皮細胞癌)、胰腺癌、膀胱癌、骨癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、口腔癌、食道癌、甲狀腺癌、腎癌、胃癌、睾丸癌、泌尿上皮癌(urothelial cancer)與皮膚癌(例如黑色素瘤)。
在具體實施例中，需要活化的抗BTN3A抗體治療的受試者具有復發性/頑抗性實質固態瘤。在更具體實施例中，受試者具有晚期復發性/頑抗性實質固態瘤。
在更具體實施例中，受試者在以下述抗PD1或抗PD-L1試劑治療之後具有復發性/頑抗性實質固態瘤，所述抗PD1或抗PD-L1試劑例如抗PD1或抗PD-L1抗體，通常為益伏(ipilimumab)、保疾伏(nivolumab)或吉舒達(pembrolizumab)。在更具體實施例中，在以抗PD1或抗PD-L1試劑治療之後具有復發性/頑抗性實質固態瘤的受試者也選自具有膀胱癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌及/或頭頸部鱗狀上皮細胞癌的受試者。
在可結合先前實施例的其他實施例中，需要活化的抗BTN3A抗體治療的受試者患有卵巢癌。
活化的抗BTN3A抗體治療
如本文所用，「活化的抗BTN3A抗體治療」係關於包含施用治療有效量的抗BTN3A抗體作為有效成分(active principle)的任何治療性處理，可選地與其他治療化合物結合使用。
此種活化的抗BTN3A抗體治療的較佳示例描述於WO2012/80351以及WO2020/025703。
在具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體可作為唯一的活性成分施用或者與例如用於預防或治療上述疾病的其他藥物配合施用。
在具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體可與抗腫瘤劑(anti-neoplastic agents)配合施用。
在其他具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體可與細胞療法(特別是γδ T細胞療法)配合施用。
在其他具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體可與免疫細胞激素(特別是IL-2、IL-15、IL-21、IL-12、GM-CSF)配合施用。
在其他具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體可與免疫治療藥物配合施用，例如免疫查核點抑製劑(特別是抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4、抗TIGIT、抗LAG-3、抗TIL-3抗體或其他抗PD1或抗PD-L1試劑)。
如本文所用，用語「細胞療法」指的是包含將至少治療有效量的細胞組合物體內施用於有需要的受試者的療法。施用於病患的細胞可為異體或自體。用語「γδ T細胞療法」指的是一種細胞療法，其中細胞組合物包含γδ T細胞，特別是Vγ9/Vδ2 T細胞，作為有效成分。在具體實施例中，此Vγ9/Vδ2 T細胞已用γδ T細胞促效劑離體擴增並/或活化。
細胞療法產品指的是為了治療目的而施用於病患的細胞組合物。此細胞療法產品包含治療有效劑量的細胞，以及可選的額外的賦形劑、佐劑或其他藥學上可接受的載體。
可與活化的抗BTN3A抗體(如下述的mAb1)配合施用的抗腫瘤劑之示例可包含但不限於烷化劑(例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、黴法蘭(melphalan)、亞硝基脲(nitrosureas)、帝盟多(temozolomide))、蒽環類(例如道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)、雙羥蒽醌(mitoxantrone)、戊柔比星(valrubicin))、紫杉烷類(例如紫杉醇(Paclitaxel)、剋癌易(Docetaxel))、埃博黴素(epothilones)、拓撲異構酶I抑製劑(例如抗癌妥(Irinotecan)或癌康定(Topotecan))、拓撲異構酶II抑製劑(例如滅必治(Etoposide)、替尼泊苷(teniposide)或他氟苷(Tafluposide))、核苷酸類似物與前驅物類似物(例如好佑定(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、截瘤達(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿嘧啶(flurouracil)、健仕(gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)或硫鳥嘌呤(Tioguanine))、肽類抗生素(例如卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)與奧沙利鉑(oxaliplatin))、類維生素A(例如視網酸(tretinoin)、阿利維A酸(alitretinoin)、貝沙羅汀(bexarotene))、長春花生物鹼及衍生物(例如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春醯胺(vindesine)、溫諾平(vinorelbine))、如激酶抑製劑之靶向治療劑(例如Ibrutinib、Idelalisib、Erlotinib、Gefitinib、Imatinib、Vemurafenib、Vismodegib)、蛋白酶體抑製劑(例如硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib))、組蛋白去乙醯化酶抑製劑(例如伏立諾他(Vorinostat)或羅米地辛(Romidepsin))。
可與活化的抗BTN3A抗體(如下述的mAb1)配合施用的免疫治療劑之示例可包含但不限於磷酸抗原(phosphoantigens)(例如唑來膦酸(zoledronic acid)或其他雙膦酸鹽(bisphosphonate))、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體與細胞激素(如介白素2 (IL-2) (Choudhry H et al, 2018, Biomed Res Int. 2018 May 6)、介白素15 (IL-15)( Patidar M et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2016 Oct;31:49-59)、介白素21 (IL-21) (Caccamo N. et al., PLoS One. 2012;7(7):e41940)或介白素33 (IL-33) (Duault C et al., J Immunol. 2016 Jan 1;196(1):493-502))，或它們的重組形式以及它們的衍生物，或能夠誘發淋巴細胞活性(例如增殖或細胞激素產生或代謝變化)的任何細胞激素。用語衍生物使用於可依賴聚乙二醇化的任何細胞激素修飾(例如與聚乙二醇(PEG)鏈的接合)、突變(例如胺基酸缺失、取代或插入)或與增效劑締合(例如與IgG1 Fc融合的IL15/IL15Ra複合物，其中IL-15經額外突變(asn72asp)，進一步增加生物活性，使此複合物成為IL-2以及IL-15Rβγ的超促效劑(Rhode PR et al, Cancer Immunol Res. 2016;4(1):49-60)) (Barroso-Sousa R et al, Curr Oncol Rep. 2018 Nov 15;21(1):1)。
用語「IL-2」具有一般意義，並且指的是人類介白素-2(human interleukin-2)。IL-2是人體自然免疫反應的一部分。IL-2主要藉由與IL-2受體結合來調節淋巴細胞活性。
用語「IL-15」具有一般意義，並且指的是人類介白素-15(human interleukin-15)。如同IL-2，IL-15結合至由IL-2/IL-15受體β鏈(CD122)以及共用γ鏈(gamma-C，CD132)組成的複合物並透過其發出訊號。IL-15調節T細胞以及自然殺手細胞的活化與增殖。
用語「IL-21」具有一般意義，並且指的是人類介白素-21(human interleukin-21)。IL-21具有多效性，包含但不限於增強自然殺手細胞以及CD8+T細胞的細胞毒性、調節漿細胞分化並且抑制Treg細胞。
用語「IL-33」具有一般意義，並且指的是人類介白素-33(human interleukin-33)。IL-33被認為是在受到組織壓力或損害時所釋放的警報蛋白(alarmin)，IL-33是IL-1家族的成員，並且與ST2受體結合。已知IL-33為T H1免疫細胞、自然殺手細胞、不變的自然殺手T細胞(invariant natural killer cell，iNKT cell)以及CD8 T淋巴細胞的有效刺激劑。
用語「PD-1」具有在本領域中的一般意義，並且指的是程序性死亡-1受體(programmed death-1 receptor)。用語「PD-1」亦指第I型跨膜蛋白(type I transmembrane protein)，其屬於下述受體的CD28-B7傳訊家族，所述受體包含CD28、細胞毒性T淋巴細胞相關的抗原4(CTLA-4)、誘導型共刺激物(inducible costimulator，ICOS)以及B淋巴細胞與T淋巴細胞弱化因子(BTLA)(Greenwald RJ et al., 2005, Annual Review of Immunology Vol 23 pp 515-548)。
用語「抗PD-1抗體」或「抗PD-L1試劑」具有在本領域的一般意義，並且指的是對PD-1或PD-L1分別具有結合親和力且對PD-1具有拮抗劑活性的抗體或其他結合化合物，即其抑制與PD-1有關的訊息傳遞級聯反應(cascade)並抑制PD-1配體結合(PD-L1；PD-L2)。此類抗PD-1抗體/試劑或抗PD-L1抗體/試劑分別以相比於其與受體(CD28；CTLA-4；ICOS；BTLA)的CD28-B7傳訊家族的其他亞型(sub-types)或同功型(isoforms)的相互作用更大的親和力與效價(potency)來優先使PD-1失去活性。用於決定化合物是否為PD-1拮抗劑的測試以及檢驗方法是本領域具通常知識者已知的，如描述於Shaabani S, et al (2015-2018). Expert Opin Ther Pat. 2018 Sep;28(9):665-678; Seliger, B. J. Clin. Med. 2019, 8, 2168。
此類抗PD1或抗PD-L1抗體的示例包含但不限於保疾伏(nivolumab)、吉舒達(pembrolizumab)、百穩益(avelumab)、抑癌寧(durvalumab)、西米普利(cemiplimab)或癌自禦(atezolizumab)。
在具體實施例中，「抗PD1/PD-L1治療」包含在有需要的受試者中施用治療有效量的抗PD-1或抗PD-L1試劑，特別是抗PD-1或抗PD-L1抗體。
此類抗CTLA4抗體的示例包含但不限於益伏(ipilimumab)。
在具體實施例中，「活化的抗BTN3A抗體治療」包含如上所定義的方法，包含共同施用(例如伴隨或依序)治療有效量的如本文定義的活化的抗BTN3A抗體以及至少一第二藥物物質，所述第二藥物物質是免疫治療劑(例如抗PD-1、抗PD-L1抗體或其他結合化合物)及/或細胞激素(如IL-2或IL-15)，或它們的衍生物(如上所示)。在具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體治療包含共同施用治療有效量的如本文所定義的抗BTN3A活化抗體以及治療有效量的抗PD-1或抗PD-L1試劑，如抗PD-1或抗PD-L1抗體。在其他具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體治療包含共同施用(例如伴隨或依序)治療有效量的如本文定義的活化的抗BTN3A抗體以及治療有效量的IL-2或IL-15或其衍生物、聚乙二醇化變體及超促效劑變體(如上所示)，任選地與抗PD1抗體組合(如吉舒達)。
在具體實施例中，將活化的抗BTN3A抗體配製成醫藥組合物。舉例來說，醫藥組合物可包含一或多個額外的賦形劑，包含緩沖劑、穩定劑、抗氧化劑、界面活性劑或鹽類。
根據實施例，包含活化的抗BTN3A抗體的醫藥組合物是水溶液，例如可注射製劑。根據具體實施例，包含活化的抗BTN3A抗體的醫藥組合物是用於輸注(infusion)的溶液。用於靜脈內或皮下施用的抗體製劑是本領域眾所周知的，並且例如描述於Razinkov et al. J Biomol Screen. 2015 Apr;20(4):468-83。
包含活化的抗BTN3A抗體的醫藥組合物可配製成各種濃度。舉例來說，此製劑可包含濃度為在0.1 μM與1 mM之間的活化的抗BTN3A抗體，更佳為在1 μM與500 μM之間、500 μM與1 mM之間、300 μM與700 μM之間、1 μM與200 μM之間、100 μM與200 μM之間、200 μM與300 μM之間、300 μM與400 μM之間、400 μM與500 μM之間、500 μM與600 μM之間、600 μM與700 μM之間、800 μM與900 μM或900 μM與1 mM之間。通常，此製劑包含濃度在300 μM與700 μM之間的活化的抗BTN3A抗體。
通常，活化的抗BTN3A抗體在人類病患中的治療劑量將落在每次施用為100 pg至700 mg(基於70公斤(kg)體重)的範圍中。舉例來說，最大治療劑量可落在每次施用為0.1 mg/kg至10 mg/kg的範圍中(例如在0.1 mg/kg與5 mg/kg之間或1 mg/kg與5 mg/kg之間或0.1 mg/kg與2 mg/kg之間)。可以理解的是，這樣的劑量可由腫瘤學家/醫師決定以不同的間隔施用；例如，可以每天、每週兩次、每週、每兩週、每三週或每月的頻率施用一劑量。
通常，在具體實施例中，所述活化的抗BTN3A抗體是以每劑在7 mg與200 mg之間的劑量通常每21天靜脈施用至少兩次。
舉例來說，作為單一療法，活化的抗BTN3A抗體(較佳為如下文所述的mAb1)用於靜脈內施用的合適劑量選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg以及200 mg。在其他具體實施例中，作為單一療法，活化的抗BTN3A抗體(較佳為mAb1)用於靜脈內施用的合適劑量選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg以及200 mg。在更具體實施例中，作為單一療法，活化的抗BTN3A抗體(較佳為mAb1)用於靜脈內施用的合適劑量選自每次施用為20 mg以及75 mg。
在具體實施例中，其中所述活化的抗BTN3A抗體與抗PD1或抗PD-L1抗體配合施用，活化的抗BTN3A抗體用於靜脈內施用的合適劑量選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg以及200 mg。抗PD1或抗PD-L1抗體可根據製造商批准的劑量施用。舉例來說，在本發明的方法之具體實施例中，吉舒達(Pembrolizumab)(KEYTRUDA)可與所述活化的抗BTN3A抗體(較佳為mAb1)配合施用，通常吉舒達是藉由靜脈輸注以200 mg的劑量施用並且mAb1以20 mg與70 mg之間的劑量施用。
在具體實施例中，根據本發明的方法使用之活化的抗BTN3A抗體(較佳為如下文所述的mAb1)以每劑介於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內施用至少兩次，較佳為第二劑在第一劑施用後至少15天施用，通常在約21天後。
較佳之活化的抗BTN3A抗體
在具體實施例中，根據本發明的本方法使用之活化的抗BTN3A抗體具有以下一或多個性質：
(i)其以10 nM或更小之K D與BTN3A結合，K D較佳為1 nM或更小，所述K D藉由SPR測得，例如以下示例中所述；
(ii)它以100 nM或更小的K D與食蟹猴(cynomolgus)之SEQ ID NO:21的BTN3A1、SEQ ID NO:22的BTN3A2及/或SEQ ID NO:23的BTN3A3交叉反應，K D較佳為10 nM或更少，所述K D藉由SPR測得，例如以下實施例中所述；
(iii)其以小於50 μg/ml之EC 50與人類PBMC結合，EC 50較佳為10 μg/ml或以下，所述EC 50由在下方示例中所述的流式細胞術量測中測得；
(iv)其在與BTN3A表現細胞的共同培養中誘發γδ-T 細胞活化，通常是Vγ9Vδ2 T細胞，且EC 50小於5 μg/ml，較佳為1 μg/ml或更低，所述EC 50由在下方示例所述之去顆粒化分析(degranulation assay)中測得。
在具體實施例中，於本發明的方法中使用之活化的抗BTN3A抗體是人源化抗體。通常，非人類抗體被人源化以降低對人類的免疫原性(immunogenicity)，同時具有至少與親代非人類抗體相同的親和力(或更高的親和力)。在具體實施例中，活化的抗BTN3A抗體是如WO2012/080351中揭露的親代抗體mAb 7.2的人源化抗體。其他示例包含如WO2012/080351中揭露的親代抗體mAb 20.1的人源化抗體。
一般而言，人源化抗體包含一或多個可變域，其中CDR(或其部分)是衍生自非人抗體(例如鼠類mAb 7.2或mAb 20.1)，並且骨架區(FR) (或其部分)衍生自有突變的鼠類抗體序列以降低免疫原性。
人源化抗體任選地也包含人類恆定區的至少一部分。
在具體實施例中，根據本發明之活化的抗BTN3A抗體是人源化沉默抗體(humanized silent antibody)，通常是人源化沉默IgG1或IgG4抗體。
如本文所用，用語「沉默抗體」指的是在結合測定中未展現出或展現出低的FcγR結合及/或Clq結合的抗體，如示例中所述。
在一實施例中，用語「無或低的FcγR及/或Clq結合」意思是沉默抗體展現出的FcγR及/或C1q結合至少低於50%(例如低於80%)之以野生型人類IgG1或IgG4同型的對應抗體觀察到的FcγR及/或C1q結合。
於本發明的方法中使用的較佳的抗體包含使用具有包含鼠類mAb 7.2抗體之以下6個CDR之重鏈以及輕鏈的抗體(也在WO2012/80769中揭露)。
mAb 7.2以及mAb 20.1的VH CDR1(也稱HCDR1)、VH CDR2(也稱HCDR2)、VH CDR3(也稱HCDR1)、VL CDR1(也稱LCDR1)、VL CDR2(也稱LCDR2)、VL CDR3(也稱HCDR3)的胺基酸序列揭示於表1中，CDR區係使用Kabat編號(Kabat et al., 1992，以下簡稱「Kabat等人」)描述。
為了便於閱讀，以下將CDR區分別稱為HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3。
表1：根據Kabat編號的鼠類mAb 7.2與mAb 20.1抗體之CDR區
原始抗體 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
mAb 7.2 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17
mAb 20.1 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31
較佳的抗體包含具有如表1中所揭露的mAb 7.2或mAb 20.1的6個CDR的人源化抗體。
在其他具體實施例中，本發明的方法包含使用如WO2012/80769中所揭露的有包含mAb 20.1抗體的CDR之重鏈與輕鏈的抗體。尤其，在更具體的實施例中，本發明的方法包含使用親代鼠類mAb 20.1的人源化抗體並且包含mAb 20.1抗體的CDR。
如在本發明的方法中使用的人源化抗體可包含對VH以及VL內的骨架殘基所做的修飾，以與相對應的鼠類抗體相比，通常與相對應的mAb 7.2或mAb 20.1的骨架區相比，更降低抗體的免疫原性。
在一具體實施例中，本發明的抗體是親代鼠類抗體mAb 7.2的人源化單株抗體，當與親代鼠類mAb 7.2的原始鼠類骨架區相比時，具有mAb 7.2的6個CDR並更包含至少以下在VH骨架區中的胺基酸突變：V5Q、V11L、K12V、R66K、S74F、I75S、E81Q、S82AR、R82B、R83T、D85E、T87S、L108S，以及至少以下在Vκ骨架區中的胺基酸突變：T5N、V15L、R18T、V19I、K42N、A43I、D70G、F73L、Q100G。
在另一具體實施例中，本發明的抗體是親代鼠類抗體mAb 7.2的人源化單株抗體，與mAb 7.2相比時包含至少以下在VH骨架區中的胺基酸突變：V5Q、V11L、K12V、R66K、S74F、I75S、E81Q、S82AR、R82B、R83T、D85E、T87S、L108S，以及當與親代鼠類mAb 7.2的原始鼠類骨架區相比時包含至少至少以下在Vκ骨架區中的胺基酸突變：T5N、V15L、R18T、V19I、K42N、A43I、D70G、F73L、Q100G。
在更佳的實施例中，本發明的方法包含使用選自由mAb1、mAb2、mAb3、mAb4以及mAb5組成的群組且包含可變重鏈及輕鏈胺基酸序列以及可選的人類恆定區(同型)之以下人源化重組抗體中的一者，如下方表2中所述：
表2：mAb1-mAb5的可變重鏈與輕鏈胺基酸序列
抗體 VH胺基酸序列 VL胺基酸序列 同型恆定區
mAb1 SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) SEQ ID NO:2 (Vk1 7.2) 沉默IgG1 L247F/L248E/P350S
mAb2 SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) SEQ ID NO:3 (Vk2 7.2) 沉默IgG1 L247F/L248E/P350S
mAb3 SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) SEQ ID NO:2 (Vk1 7.2) IgG4 S241P/L248E
mAb4 SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) SEQ ID NO:3 (Vk2 7.2) IgG4 S241P/L248E
mAb5 SEQ ID NO:24 (人源化VH mAb20.1) SEQ ID NO:25 (人源化VL mAb20.1) 沉默IgG1 L247F/L248E/P350S
用於產生mAb1至mAb4與mAb5的IgG1、IgG4以及其突變版IgG1 L247F/L248E/P350S及IgG4 S241P/L248E的恆定同型區的相對應的胺基酸及核苷酸編碼序列是本領域眾所周知的(Oganesyan et al., 2008; Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 64, 700–704; Reddy et al., 2000; J. Immunol. 164, 1925–1933)。在IgG中發現的C末端離胺酸可被自然切割，且這種修飾不會影響抗體的性質；因此，在mAb1至mAb4與mAb5的建構體中此殘基可額外被刪除。
mAb1、mAb2、mAb3、mAb4以及mAb5的全長輕鏈及重鏈以及相對應的編碼序列揭示於下方表3。
表3：全長重鏈及輕鏈以及DNA編碼序列
抗體 胺基酸序列 DNA編碼序列
mAb1 重鏈：SEQ ID NO:4 輕鏈：SEQ ID NO:6 重鏈：SEQ ID NO:8 輕鏈：SEQ ID NO:10
mAb2 重鏈：SEQ ID NO:4 輕鏈：SEQ ID NO:7 重鏈：SEQ ID NO:8 輕鏈：SEQ ID NO:11
mAb3 重鏈：SEQ ID NO:5 輕鏈：SEQ ID NO:6 重鏈：SEQ ID NO:9 輕鏈：SEQ ID NO:10
mAb4 重鏈：SEQ ID NO:5 輕鏈：SEQ ID NO:7 重鏈：SEQ ID NO:9 輕鏈：SEQ ID NO:11
mAb5 重鏈：SEQ ID NO:32 輕鏈：SEQ ID NO:33 -
在可與前述實施例組合的某些實施例中，本文提供的抗體是上述定義的抗體的抗體片段。
如本文所用，用語「抗體片段」包含維持抗原結合區的抗體的任何片段，其相對於BTN3A目標具有與原始抗體實質上相同的功能特性。
抗體片段包含但不限於Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、單抗體(Unibody)及scFv片段、雙抗體(diabodies)、單域(single domain)或奈米抗體(nanobodies)以及其他片段。
在具體實施例中，所述抗體片段是單價抗體，如scFv片段的Fab。
用語「雙抗體」指的是有兩個抗原結合位的小抗體片段，其中片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中連接輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。藉由使用短而無法使在同一鏈上的兩個結構域配對的接頭(linker)，這些結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位。
單域抗體是包含抗體的重鏈可變域的全部或部分或是輕鏈可變域的全部或部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體是人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；可見於如U.S. Patent No. 6,248,516 B1)。
抗體片段可藉由多種技術製成，包含但不限於完整抗體的蛋白水解消化(proteolytic digestion)以及如本文所述藉由重組宿主細胞產生。
活化的抗BTN3A抗體之製備方法
用於本發明方法之活化的抗BTN3A抗體可使用下述方法在宿主細胞轉染瘤(host cell transfectoma)中製備，例如使用如本領域眾所周知的重組DNA技術以及基因轉染方法的組合(Morrison, 1985 Science 229, 1202–1207)。
在一具體實施例中，根據本發明的選殖或表現載體包含mAb1、mAb2、mAb3、mAb4或mAb5中任一者的重鏈及輕鏈的編碼序列中的一者，其可操作地連接於合適的啟動子序列。
用於表現本發明的重組抗體之哺乳動物宿主細胞包含中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞，其包含具有DHFR可選擇標記(如描述於Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Cell. Biol. 2, 1304–1319)的dhfr-CHO細胞(如描述於Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4216–4220)、CHOK1 dhfr+細胞系、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞以及SP2細胞，例如GS CHO細胞系與GS XceedTM基因表達系統(Lonza)一起使用。當將編碼抗體基因的重組表現載體導入哺乳動物宿主細胞時，藉由將宿主細胞培養一段足以在宿主細胞中表現抗體與任選地將抗體的分泌至供宿主細胞生長的培養基中的時間來生產抗體。例如可使用標準蛋白質純化方法(Shukla et al., 2007, J. Chromatogr. B 848, 28-39)在其分泌後從培養基中回收與純化抗體。
在一具體的實施例中，本發明的宿主細胞是以表現載體轉染的宿主細胞，所述表現載體具有分別適合表現mAb1、mAb2、mAb3、mAb4以及mAb5的編碼序列，其可操作地連接於適合的啟動子序列。
舉例來說，使用至少包含分別編碼mAb1的重鏈與輕鏈的SEQ ID NO:8及10的核酸的宿主細胞，用於生產根據本發明的方法使用的抗體。
後續的宿主細胞接著可在合適的條件下進一步培養以表現並且產生活化的抗BTN3A抗體，所述抗BTN3A抗體通常分別選自由mAb1、mAb2、mAb3、mAb4及mAb5組成的群組。
或者，無細胞表現系統(cell free expression system)可用於生產任何活化的抗BTN3A抗體，例如mAb1、mAb2、mAb3、mAb4以及mAb5。通常，蛋白質或抗體的無細胞表現之方法已被描述(Stech et al., 2017, Sci. Rep. 7, 12030)。
評估血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數或Vγ9+ T細胞密度
本發明之方法能夠預測受試者對如上所述之活化的抗BTN3A抗體治療的反應程度。在某些實施例中，預測是基於對血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數的評估。在其他實施例中，預測是基於對來自病患的腫瘤的活檢之Vγ9+ T細胞密度的評估。在其他實施例中，預測是基於對血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數以及Vγ9+ T細胞密度兩者的評估。
如本文所用，用語「預測」指的是允許在治療之前以一定的概率程度(統計顯著性)決定對所述治療的反應程度的方法。因此，用語「預測」不一定有絕對的反應。相反的，其可包含允許決定相比於沒有進行選擇步驟的病患群體的平均概率有更高概率的病患成為反應者的反應。
如本文所用，「對活化的抗BTN3A抗體治療的反應」或同樣「對活化的抗BTN3A抗體治療的臨床反應」，是當藉由所述活化的抗BTN3A抗體治療進行治療的癌症的至少一種症狀在治療後與治療前所述症狀相比而有所減輕時觀察到。
如本文所用，用語「減少」或「增加」意思是控制值在統計上顯著減少或增加，較佳為控制值減少或增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少90%或至少99%。
根據本發明的方法的某些實施例，基於評估在治療前受試者的血液樣本的體積中所決定的血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數的表現，預測病患為反應者或非反應者。
根據本發明的方法的其他實施例，基於評估在治療前受試者的腫瘤活檢的體積中所決定的Vγ9+ T細胞密度的表現，預測病患為反應者或非反應者。
用語「反應者」在本文中意思與非反應者的受試者相比，對活化的抗BTN3A抗體治療顯示出或可能顯示出更好的臨床反應的病患。在實施例中，反應者是患有癌症的病患，其顯示出或可能顯示出腫瘤尺寸顯著減小，所述腫瘤尺寸例如藉由標準腫瘤評估(如用於實質固態瘤的RECIST、iRECIST或RECIL)或其他血液學適應症的標準反應評估(例如Cheson/IWG)來決定。
在本發明的某些方法中，已藉由評估受試者中血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數來選擇用於以所述抗BTN3A抗體治療的受試者。血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數愈高，對所述活化的抗BTN3A抗體治療的反應愈好。在本發明的其他方法中，已藉由評估受試者腫瘤活檢的腫瘤Vγ9+ T細胞密度來選擇用於以所述抗BTN3A抗體治療的受試者。腫瘤基線Vγ9+ T細胞密度愈高，對所述活化的抗BTN3A抗體治療的反應愈好。
發明人確實提供了使用血液基線γδ T細胞計數或腫瘤Vγ9+ T細胞密度作為預測標記以用於選擇活化的抗BTN3A抗體(通常是mAb1活化的抗BTN3A抗體)的反應者的臨床證據。
包括決定血液樣本中基線Vγ9Vδ2 T細胞計數的方法
在具體實施例中，本發明的方法包含決定在血液樣品中基線Vγ9Vδ2 T細胞計數的步驟，所述血液樣品由欲以活化的抗BTN3A抗體治療進行治療的受試者獲得。
如本文所用，血液樣品是藉由如真空採血管(vacutainer)之標準採血方法獲得。
可以藉由任何常規的免疫表型分析技術來達到決定血液樣本中γδ T細胞的數量。通常，常規/標準流式細胞術方法使用珠子進行校正。特定檢驗及其要件的適當條件對於本領域具通常知識者而言是眾所周知的。
此基線Vγ9Vδ2 T細胞計數的評估通常在初次施用活化的抗BTN3A抗體之前少於4天進行，較佳為少於48小時，更佳為少於24小時。
可預期高基線Vγ9Vδ2 T細胞計數預示更好的反應。然而，用於選擇適於治療的病患的確切的基線Vγ9Vδ2 T細胞計數可由具有通常知識者，尤其依據病患的臨床參數(如年齡、性別、先前的治療線(lines of treatment))、癌症診斷與所使用的方案(特別是如果使用所述活化的抗BTN3A抗體作為單一療法或與其他療法結合使用，通常是抗PD1或抗PD-L1療法)來決定。
在具體實施例中，如果基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於1000個細胞/毫升、2000個細胞/毫升、3000個細胞/毫升、4000個細胞/毫升、5000個細胞/毫升、6000個細胞/毫升、7000個細胞/毫升、8000個細胞/毫升、9000個細胞/毫升、10000個細胞/毫升、11000個細胞/毫升、12000個細胞/毫升、13000個細胞/毫升、14000個細胞/毫升、15000個細胞/毫升、16000個細胞/毫升、17000個細胞/毫升、18000個細胞/毫升、19000個細胞/毫升或高於20000個細胞/毫升，則選擇所述病患進行活化的抗BTN3A抗體治療。
在具體實施例中，受試者患有實質固態瘤，且若在受試者中基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於20000個細胞/毫升，則選擇所述受試者進行活化的抗BTN3A抗體治療(通常是mAb1治療，較佳為二次以上的注射，劑量為介於7 mg與200 mg之間)。
在具體實施例中，受試者患有卵巢癌，且若在受試者中基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於20000個細胞/毫升，則選擇所述受試者進行活化的抗BTN3A抗體治療(通常是mAb1治療，較佳為二次以上的注射，劑量為介於7 mg與200 mg之間)。
在具體實施例中，受試者患有頭頸部鱗狀上皮細胞癌，且若在受試者中基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於20000個細胞/毫升，則選擇所述受試者進行活化的抗BTN3A抗體治療(通常是mAb1治療，較佳為二次以上的注射，劑量為介於7 mg與200 mg之間)。
本發明也關於用於評估適於活化的抗BTN3A抗體治療的有需要的受試者的方法，所述方法包含決定所述受試者的血液樣本中的基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數，其中適於活化的抗BTN3A抗體治療之受試者的基線Vγ9Vδ2 T細胞計數高於某個參考值，通常設置在1000與20000個細胞/毫升之間。
包含決定在腫瘤活檢中Vγ9+ T細胞密度的方法
在具體實施例中，本發明的方法包含決定腫瘤活檢中Vγ9+ T細胞密度的步驟，所述腫瘤活檢自欲以活化的抗BTN3A抗體治療進行治療的所述受試者得到。
可以藉由任何常規的免疫表型技術來達到決定Vγ9+ T細胞密度。通常，使用專一性針對Vγ9+ TCR的單株抗體(如抗體7B6)在腫瘤活檢中藉由免疫組織化學來評估Vγ9+ T細胞密度，例如示例中所述。
此基線Vγ9+ T細胞密度的評估通常在初次施用活化的抗BTN3A抗體之前少於4天進行，較佳為少於48小時，更佳為少於24小時。
可預期高Vγ9+ T細胞密度預示更好的反應。然而，用於選擇適於治療的病患的確切的Vγ9+ T細胞密度可由具有通常知識者尤其依據病患的臨床參數(如年齡、性別、先前的治療線(lines of treatment))、癌症診斷與所使用的方案(特別是如果使用所述活化的抗BTN3A抗體作為單一療法或與其他療法結合使用，通常是抗PD1或抗PD-L1療法)來決定。
在具體實施例中，若來自受試者的腫瘤活檢中基線Vγ9+ T細胞密度高於1個細胞/平方毫米、2個細胞/平方毫米、3個細胞/平方毫米或4個細胞/平方毫米時，則選擇所述受試者進行活化的抗BTN3A抗體治療。
在具體實施例中，受試者患有實質固態瘤，且若受試者腫瘤活檢中基線Vγ9+ T細胞密度高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米，則選擇所述受試者進行活化的抗BTN3A抗體治療(通常是mAb1治療，較佳為二次以上的注射，劑量為介於7 mg與200 mg之間)。
在具體實施例中，受試者患有卵巢癌，且若受試者腫瘤活檢中基線Vγ9+ T細胞密度高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米，則選擇所述受試者進行活化的抗BTN3A抗體治療(通常是mAb1治療，較佳為二次以上的注射，劑量為介於7 mg與200 mg之間)。
在具體實施例中，受試者患有頭頸部鱗狀上皮細胞癌，且若受試者腫瘤活檢中基線Vγ9+ T細胞密度高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米，則選擇所述受試者進行活化的抗BTN3A抗體治療(通常是mAb1治療，較佳為二次以上的注射，劑量為介於7 mg與200 mg之間)。
本發明也關於用於評估適於活化的抗BTN3A抗體治療的有需要的受試者的方法，所述方法包含決定所述受試者的腫瘤活檢中的基線Vγ9+ T細胞密度，其中適於活化的抗BTN3A治療之受試者的基線Vγ9+ T細胞密度高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米。
本發明的方法之具體實施例
E1.一種誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化之分離且活化的抗BTN3A，用於治療有需要的人類受試者的腫瘤，其中已藉由(i)評估治療前受試者血液樣本中的血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數或(ii)評估治療前受試者腫瘤活檢中的基線Vγ9+ T細胞密度，來選擇用於以抗BTN3A抗體治療的受試者。
E2.根據E1使用之活化的抗BTN3A抗體，其中當(i)在血液樣本中所決定的基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於5000 個細胞/毫升、高於10000個細胞/毫升或高於20000個細胞/毫升或者(ii)在腫瘤活檢中所決定的基線Vγ9+ T細胞密度高於2個細胞/平方毫米、或高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米時，選擇所述受試者進行所述治療。
E3.根據E1或E2使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述受試者患有非血液系統癌症。
E4.根據E3使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述受試者患有下述癌症，所述癌症選自黑色素瘤、胰管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)、大腸直腸癌(colorectal cancer)、卵巢癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、攝護腺癌、肺癌(如非小細胞肺癌(NSCLC))、頭頸部鱗狀上皮細胞癌以及泌尿上皮癌(urothelial cancer)。
E5.根據E4使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述受試者患有頭頸部鱗狀上皮細胞癌(HNSCC)或卵巢癌。
E6.根據E1-E5中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述受試者具有復發性/頑抗性實質固態瘤。
E7.根據E1或E2使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述受試者患有血液系統惡性腫瘤。
E8.根據E7使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述受試者患有下述血液系統惡性腫瘤，所述血液系統惡性腫瘤選自B細胞淋巴腫瘤(B-cell lymphoid neoplasm)、T細胞淋巴腫瘤(T-cell lymphoid neoplasm)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、B-NHL、瀰漫性大型B細胞淋巴癌(diffule large B cell lymphoma，DLBLC)、T-NHL、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocyt ic leukemia，CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma，SLL)、被套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、自然殺手細胞淋巴腫瘤(NK-cell lymphoid neoplasm)以及包含急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)的髓細胞系腫瘤(myeloid cell lineage neoplasm)。
E9.根據E1-E8中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體與人類BTN3A多肽結合，且K D為10 nM或更小，K D較佳為5 nM或更小(如介於50 pM與5 nM之間)，所述K D由表面電漿子共振(SPR)測得。
E10.根據E1-E9中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體與食蟹猴的BTN3A交叉反應，且K D為100 nM或更小，K D較佳為10 nM或更少，所述K D藉由SPR測得。
E11A.根據E1-E10中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體體外誘發人類PBMC中Vγ9Vδ2 T細胞的活化，且EC 50低於0.1 mg/mL，較佳為0.01 mg/mL以下(如介於100 pg/mL與0.1 mg/mL之間)，所述EC 50由活化標記CD69的表面表現測得。
E11B.根據E1-E11A中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗體在與BTN3A表現細胞的共同培養中誘發Vγ9Vδ2 T細胞的活化，且EC 50小於5 mg/mL，較佳為1 mg/mL或以下(如介於100 ng/mL與5 mg/mL之間)，所述EC 50由去顆粒化分析中測得。
E12.根據E1-E11B中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:12的HCDR1、SEQ ID NO:13的HCDR2、SEQ ID NO:14的HCDR3、SEQ ID NO:15的LCDR1、SEQ ID NO:16的LCDR2以及SEQ ID NO:17的LCDR3。
E13.根據E1-E12中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體是人源化抗體。
E14.根據E1-E13中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含在VH骨架區中的至少以下胺基酸突變：V5Q、V11L、K12V、R66K、S74F、I75S、E81Q、S82AR、R82BS、R83T、D85E、T87S、L108S，以及在Vκ骨架區中的至少以下胺基酸突變：T5N、V15L、R18T、V19I、K42N、A43I、D70G、F73L、Q100G。
E15.根據E1-E14中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含突變或化學修飾的IgG1恆定區，其中當相較於具有野生型IgG1同型恆定區的相對應的抗體時，所述突變或化學修飾的IgG1恆定區不結合於Fcγ受體或降低與Fcγ受體的結合。
E16.根據E1-E15中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)以及SEQ ID NO：2的可變輕鏈(VL)。
E17.根據E1-E15中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)以及SEQ ID NO：3的可變輕鏈(VL)。
E18.根據E1-E17中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含沉默Fc區，通常為突變IgG1恆定區或突變IgG4恆定區。
E19.根據E18使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述突變IgG1恆定區為IgG1三重突變L247F、L248E與P350S。
E20.根據E18使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述突變IgG4恆定區是IgG4雙重突變S241P、L248E。
E21.根據E1-E17中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈以及SEQ ID NO:6的輕鏈。
E22.根據E1-E17中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈以及SEQ ID NO:7的輕鏈。
E23.根據E1-E17中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:5的重鏈以及SEQ ID NO:6的輕鏈。
E24.根據E1-E17中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:5的重鏈以及SEQ ID NO:7的輕鏈。
E25.根據E1-E24中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體與細胞激素配合施用。
E26.根據E25使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述細胞激素是IL2或IL15促效劑。
E27.根據E1-E26中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體與免疫治療劑配合施用。
E28.根據E27使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述免疫治療劑是抗PD1或抗PD-L1抗體。
E29.根據E28使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗PD1或抗PD-L1抗體選自保疾伏(nivolumab)、吉舒達(pembrolizumab)、百穩益(avelumab)、抑癌寧(durvalumab)、西米普利單抗(cemiplimab)或癌自禦(atezolizumab)，較佳為吉舒達。
E30.根據E27使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體與(i)抗PD1或抗PD-L1抗體及(ii)細胞激素配合施用，所述細胞激素例如IL2或IL15促效劑或其衍生物、其聚乙二醇化變體以及其超促效劑變體。
E31.根據E1-E30中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7 mg至200 mg之間。
E32.根據E1-E31中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體為mAb1，並且活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7 mg與200 mg之間。
E33.根據E1-E32中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體以每劑介於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內施用至少兩次，較佳為第二劑在第一劑施用後至少15天施用，通常在約21天後。
E34.根據E1-E33中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 mg或200 mg的劑量施用。
E35.根據E1-E34中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體為mAb1，並以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 mg或200 mg的劑量施用。
E36.根據E1-E34中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體為mAb1，並以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 mg或200 mg的劑量與抗PD1或抗PD-L1抗體(例如吉舒達)配合施用。
E37.根據E1-E34中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體為mAb1，並且所述受試者患有頭頸部鱗狀上皮細胞癌(HNSCC)或卵巢癌，當(i)在血液樣本中所決定之基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於5000個細胞/毫升、高於10000個細胞/毫升或高於20000個細胞/毫升時，或者(ii)在腫瘤活檢中所決定的基線Vγ9+ T細胞密度高於2個細胞/平方毫米、或高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米時，選擇受試者進行所述治療。
E38.一種用於治療在有需要的人類受試者的腫瘤的方法，其包含施用治療有效量之活化的抗BTN3A抗體，其中已藉由評估(i)來自血液樣本的血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數或(ii)來自受試者的腫瘤活檢的基線Vγ9+ T細胞密度，來選擇進行活化的抗BTN3A抗體治療的人類受試者。
E39.如E38所述的方法，其中當(i)基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於5000個細胞毫升、高於10000個細胞/毫升或高於20000個細胞/毫升或者(ii)在腫瘤活檢中所決定的基線Vγ9+ T細胞密度高於2個細胞/平方毫米、或高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米時，選擇所述受試者進行所述治療。
E40.如E38或E39所述的方法，其中所述受試者患有非血液系統癌症。
E41.如E40所述的方法，其中所述受試者患有下述癌症，所述癌症選自黑色素瘤、胰管腺癌(PDAC)、大腸直腸癌、卵巢癌、乳癌、膀胱癌、攝護腺癌、肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC))、頭頸部鱗狀上皮細胞癌以及泌尿上皮癌。
E42.如E40所述的方法，其中所述受試者患有頭頸部鱗狀上皮細胞癌(HNSCC)或卵巢癌。
E43.如E38-E42中任一項所述的方法，其中所述受試者具有復發性/頑抗性實質固態瘤。
E44.如E38-E43中任一項所述的方法，其中所述受試者是患有血液系統惡性腫瘤的受試者。
E45.如E44所述的方法，其中所述受試者患有下述血液系統惡性腫瘤，所述血液系統惡性腫瘤選自B細胞淋巴腫瘤、T細胞淋巴腫瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、B-NHL、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、T-NHL、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、自然殺手細胞淋巴腫瘤以及包含急性骨髓性白血病(AML)的髓細胞系腫瘤。
E46.如E38-E45中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與人類BTN3A多肽結合，且K D為10 nM或更小，K D較佳為5 nM或更小(如介於50 pM與5 nM之間)，所述K D由表面電漿子共振(SPR)測得。
E47.如E38-E46中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與食蟹猴的BTN3A交叉反應，且K D為100 nM或更小，K D較佳為10 nM或更小，所述K D藉由SPR測得。。
E48.如E38-E47中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體體外誘發人類PBMC中Vγ9Vδ2 T細胞的活化，且EC 50低於0.1 mg/mL，較佳為0.01 mg/mL以下(如介於100 pg/mL與0.1 mg/mL之間)，所述EC 50由活化標記CD69的表面表現測得。
E49.如E38-E48中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體在與BTN3A表現細胞的共同培養中誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化，且EC 50小於5mg/mL，較佳為1mg/mL或以下(如介於100 ng/mL與5 mg/mL之間)，所述EC 50由去顆粒化分析中測得。
E50.如E38-E49中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:12的HCDR1、SEQ ID NO:13的HCDR2、SEQ ID NO:14的HCDR3、SEQ ID NO:15的LCDR1、SEQ ID NO:16的LCDR2與SEQ ID NO:17的LCDR3。
E51.如E38-E50中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體是人源化抗體。
E52.如E51所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含在VH骨架區中的至少以下胺基酸突變：V5Q、V11L、K12V、R66K、S74F、I75S、E81Q、S82AR、R82BS、R83T、D85E、T87S、L108S，以及在Vκ骨架區中的至少以下胺基酸突變：T5N、V15L、R18T、V19I、K42N、A43I、D70G、F73L、Q100G。
E53.如E38-E51中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含突變或化學修飾的IgG1恆定區，其中當相較於具有野生型IgG1同型恆定區的相對應的抗體時，所述突變體或化學修飾的IgG1恆定區不結合於Fcγ受體或降低與Fcγ受體的結合。
E54.如E38-E53中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)以及SEQ ID NO:2的可變輕鏈(VL)。
E55.如E38-E53中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)以及SEQ ID NO:3的可變輕鏈(VL)。
E56.如E38-E55中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含沉默Fc區，通常為突變IgG1恆定區或突變IgG4恆定區。
E57.如E56所述的方法，其中所述突變IgG1恆定區是IgG1三重突變L247F、L248E與P350S。
E58.如E56所述的方法，其中所述突變IgG4恆定區是IgG4雙重突變S241P、L248E。
E59.如E38-E58中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：4的重鏈以及SEQ ID NO：6的輕鏈。
E60.如E38-E58中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：4的重鏈以及SEQ ID NO：7的輕鏈。
E61.如E38-E58中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：5的重鏈以及SEQ ID NO：6的輕鏈。
E62.如E38-E58中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：5的重鏈以及SEQ ID NO：7的輕鏈。
E63.如E38-E62中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與細胞激素配合施用。
E64.如E63所述的方法，其中所述細胞激素是IL2或IL15促效劑。
E65.如E38-E64中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與免疫治療劑配合施用。
E66.如E65所述的方法，其中所述免疫治療劑是抗PD1或抗PD-L1抗體。
E67.如E66所述的方法，其中所述抗PD1或抗PD-L1抗體選自保疾伏(nivolumab)、吉舒達(pembrolizumab)、百穩益(avelumab)、抑癌寧(durvalumab)、西米普利單抗(cemiplimab)或癌自禦(atezolizumab)，較佳為吉舒達。
E68.如E66所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與(i)抗PD1或抗PD-L1抗體及(ii)細胞激素配合施用，所述細胞激素例如IL2或IL15促效劑或其衍生物、其聚乙二醇化變體以及其超促效劑變體。
E69.如E38-E68中任一項所述的方法，其中活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7 mg至200 mg之間。
E70.如E69所述的方法，其中所述抗BTN3A抗體是mAb1，並且活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7 mg與200 mg之間。
E71.如E38-E70中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體以每劑介於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內施用至少兩次，較佳為第二劑在第一劑施用後至少15天施用，通常在約21天後。
E72.如E38-E71中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 m或200 mg的劑量施用。
E73.如E38-E72中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體為mAb1，其以每劑介於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內施用至少兩次，較佳為第二劑在第一劑施用後至少15天施用，通常在約21天後。
E74.如E38-E73中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體為mAb1，並以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 mg或200 mg的劑量施用。
E75.如E38-E74中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體為mAb1，並以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 mg或200 mg的劑量與抗PD1或抗PD-L1抗體(如吉舒達)配合施用。
E76.如E38-E75中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體為mAb1，並且所述受試者患有頭頸部鱗狀上皮細胞癌(HNSCC)或卵巢癌，當基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於5000個細胞/毫升、高於10000個細胞/毫升或高於20000個細胞/毫升時，選擇受試者進行所述治療。
E77.一種如本文所揭露之活化的抗BTN3A抗體在製備用於治療有需要的受試者的藥物之用途，其中藉由評估(i)所述受試者的血液樣本中血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數，如通篇說明書所述；或(ii)在所述受試者腫瘤活檢中所決定的基線Vγ9+ T細胞密度高於2個細胞/平方毫米、或高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米，如通篇說明書所述時，選擇受試者進行所述治療。
E78.一種決定適於以如本文所揭露之活化的抗BTN3A抗體治療的有需要的受試者的方法，所述方法包含評估(i)受試者的血液樣本中血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數，如通篇說明書所描述；或(ii)於受試者腫瘤活檢中所決定的基線Vγ9+ T細胞密度高於2個細胞/平方毫米、或高於3個細胞/平方毫米或高於4個細胞/平方毫米，如通篇說明書所述。
E79.一種誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化之分離且活化的抗BTN3A抗體，用於治療有需要的人類受試者的腫瘤，其中所述受試者在抗PD1或抗PD-L1治療後具有復發性或頑抗性腫瘤，並且對所述受試者配合施用治療有效劑量的抗PD1或抗PD-L1試劑與治療有效量的所述活化的抗BTN3A抗體。
E80.一種誘發Vγ9Vδ T細胞活化之分離的活化抗BTN3A抗體，其用於治療有需要的人類受試者之腫瘤，其中所述腫瘤特別是選自由膀胱癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌以及頭頸部鱗狀上皮細胞癌組成之群組的實質固態瘤。
E81.誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化的抗BTN3A抗體，用於治療血液系統惡性腫瘤，其中所述的血液系統惡性腫瘤選自瀰漫性大B細胞淋巴瘤與急性骨髓性白血病。
E82.根據E79使用之活化的抗BTN3A抗體，用於治療有需要的人類受試者中的腫瘤，其中所述腫瘤特別是選自由膀胱癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌以及頭頸部鱗狀上皮細胞癌組成之群組的實質固態瘤。
E83.根據E79-E82中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體與人類BTN3A多肽結合，且K D為10 nM或更小，K D較佳為5 nM或更小(如介於50 pM與5 nM之間)，所述K D由表面電漿子共振(SPR)測得。
E84.根據E79-E83中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體與食蟹猴的BTN3A交叉反應，且K D為100 nM或更小，K D較佳為10 nM或更少，所述K D藉由SPR測得。
E85.根據E79-E84中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體體外誘發人類PBMC中Vγ9Vδ2 T細胞的活化，且EC 50低於0.1 mg/mL，較佳為0.01 mg/mL以下(如介於100 pg/mL與0.1 mg/mL之間)，所述EC 50由活化標記CD69的表面表現測得。
E86.根據E79-E85中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗體在與BTN3A表現細胞的共同培養中誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化，且EC 50小於5 mg/mL，較佳為1 mg/mL以下(如介於100 ng/mL與5 mg/mL之間)，所述EC 50由去顆粒化分析中測得。
E87.根據E79-E86中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:12的HCDR1、SEQ ID NO:13的HCDR2、SEQ ID NO:14的HCDR3、SEQ ID NO:15的LCDR1、SEQ ID NO:16的LCDR2與SEQ ID NO:17的LCDR3。
E88.根據E79-E87中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體為人源化抗體。
E89.根據E79-E88中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含在VH骨架區中的至少以下胺基酸突變：V5Q、V11L、K12V、R66K、S74F、I75S、E81Q、S82AR、R82BS、R83T、D85E、T87S、L108S，以及在Vκ骨架區中的至少以下胺基酸突變：T5N、V15L、R18T、V19I、K42N、A43I、D70G、F73L、Q100G。
E90.根據E79-E89中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含突變或化學修飾的IgG1恆定區，其中當相較於具有野生型IgG1同型恆定區的相對應的抗體時，所述突變或化學修飾的IgG1恆定區不結合於Fcγ受體或降低與Fcγ受體的結合。
E91.根據E79-E90中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)與SEQ ID NO：2的可變輕鏈(VL)。
E92.根據E79-E90中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)與SEQ ID NO：3的可變輕鏈(VL)。
E93.根據E79-E92中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含沉默Fc區，通常為突變IgG1恆定區或突變IgG4恆定區。
E94.根據E93使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述突變IgG1恆定區是IgG1三重突變L247F、L248E與P350S。
E95.根據E79-E94中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈與SEQ ID NO:6的輕鏈。
E96.根據E79-E95中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈與SEQ ID NO:7的輕鏈。
E97.根據E79-E96中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:5的重鏈與SEQ ID NO:6的輕鏈。
E98.根據E79-E97中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:5的重鏈與SEQ ID NO:7的輕鏈。
E99.根據E79-E98中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體與細胞激素配合施用。
E100.根據E99使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述細胞激素是IL2或IL15促效劑。
E101.根據E80-E100中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體與免疫治療劑配合施用。
E102.根據E79-E101使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體與選自由抗PD1或抗PD-L1抗體組成的群組的免疫治療劑配合施用。
E103.根據E79-E102使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體與選自由保疾伏(nivolumab)、吉舒達(pembrolizumab)、百穩益(avelumab)、抑癌寧(durvalumab)、西米普利單抗(cemiplimab)或癌自禦(atezolizumab)(較佳為吉舒達)組成的群組之抗PD1或抗PD-L1抗體配合施用。
E104.根據E79-E103中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量為7 mg至200 mg以內，較佳為20mg至75mg以內。
E105.根據E79使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：4的重鏈與SEQ ID NO：6的輕鏈，並且所述活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量在7 mg與200 mg之間，較佳在20 mg與75 mg之間，其中受試者被施以治療有效量的吉舒達。
E106.根據E80使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈與SEQ ID NO:6的輕鏈，並且所述活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7 mg與200 mg之間，較佳在20 mg與75 mg之間。
E107.根據E79-E106中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體以每劑介於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內施用至少兩次，較佳為第二劑在第一劑施用後至少15天施用，通常在約21天後。
E108.根據E79-E107中任一項使用之活化的抗BTN3A抗體，其中所述活化的抗BTN3A抗體以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 mg或200 mg的劑量施用。
E109.一種用於治療在有需要的人類受試者的腫瘤的方法，其包含配合施用治療有效量之誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化的抗BTN3A抗體與治療有效量之抗PD1/PDL1抗體，其中受試者具有對抗PD1/PDL1治療有復發性或頑抗性的腫瘤。
E110.一種用於治療在有需要的人類受試者的腫瘤之方法，其中包含施用治療有效量之誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化的抗BTN3A抗體，其中所述腫瘤是選自由膀胱癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌以及頭頸部鱗狀上皮細胞癌組成之群組的實質固態瘤。
E111.一種用於治療在有需要的人類受試者的血液惡性腫瘤之方法，所述方法包含施用治療有效量之誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化的抗BTN3A抗體，其中所述血液系統惡性腫瘤選自瀰漫性大B細胞淋巴瘤與急性骨髓性白血病。
E112. 如E109所述的方法，其中所述腫瘤為實質固態瘤，特別選自由膀胱癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌以及轉移性腦癌的群組。
E113. 如E109-E112中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與人類BTN3A多肽結合，且K D為10 nM或更小，K D較佳為5 nM或更小(如介於50 pM與5 nM之間)，所述K D由表面電漿子共振(SPR)測得。
E114.如E109-E113中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與食蟹猴的BTN3A交叉反應，且K D為100 nM或更小，K D較佳為10 nM或更小，所述K D藉由SPR測得。
E115.如E109-E114中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體體外誘發人類PBMC中Vγ9Vδ2 T細胞的活化，且EC 50低於0.1 mg/mL，較佳為0.01 mg/mL以下(如介於100 pg/mL與0.1 mg/mL之間)，所述EC 50由活化標記CD69的表面表現測得。
E116.如E109-E115中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體在與BTN3A表現細胞的共同培養中誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化，且EC 50小於5mg/mL，較佳為1mg/mL或以下(如介於100 ng/mL與5 mg/mL之間)，所述EC 50由去顆粒化分析中測得。
E117.如E109-E116中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:12的HCDR1、SEQ ID NO:13的HCDR2、SEQ ID NO:14的HCDR3、SEQ ID NO:15的LCDR1，SEQ ID NO:16的LCDR2以及SEQ ID NO:17的LCDR3。
E118.如E109-E117中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體是人源化抗體。
E119.如E109-E118中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含在VH骨架區中的至少以下胺基酸突變：V5Q、V11L、K12V、R66K、S74F、I75S、E81Q、S82AR、R82BS、R83T、D85E、T87S、L108S，以及在Vκ骨架區中的至少以下胺基酸突變：T5N、V15L、R18T、V19I、K42N、A43I、D70G、F73L、Q100G。
E120.如E109-E119中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含突變或化學修飾的IgG1恆定區，其中當相較於具有野生型IgG1同型恆定區的相對應的抗體時，所述突變或化學修飾的IgG1恆定區不結合於Fcγ受體或降低與Fcγ受體的結合。
E121.如E109-E120中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)與SEQ ID NO:2的可變輕鏈(VL)。
E122.如E109-E120中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1的可變重鏈(VH)與SEQ ID NO:3的可變輕鏈(VL)。
E123.如E109-E122中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含沉默Fc區，通常是突變IgG1恆定區或突變IgG4恆定區。
E124.如E109-E123中任一項所述的方法，其中所述突變IgG1恆定區是IgG1三重突變L247F、L248E與P350S。
E125.如E109-E124中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：4的重鏈以及SEQ ID NO：6的輕鏈。
E126.如E109-E124中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：4的重鏈以及SEQ ID NO：7的輕鏈。
E127.如E109-E124中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：5的重鏈以及SEQ ID NO：6的輕鏈。
E128.如E109-E124中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO：5的重鏈以及SEQ ID NO：7的輕鏈。
E129.如E109-E128中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體與細胞激素配合施用。
E130.如E129所述的方法，其中所述細胞激素是IL2或IL15促效劑。
E131.如E109-E130中任一項所述的方法，其中所述抗BTN3A抗體與免疫治療劑配合施用。
E132.如E109-E131中任一項所述的方法，其中所述抗BTN3A抗體與選自由抗PD1或抗PD-L1抗體組成的群組的免疫治療劑配合施用。
E133.如E109-E132中任一項所述的方法，其中所述抗BTN3A抗體與抗PD1或抗PD-L1抗體配合施用，所述抗PD1或抗PD-L1抗體選自由保疾伏(nivolumab)、吉舒達(pembrolizumab)、百穩益(avelumab)、抑癌寧(durvalumab)、西米普利單抗 (cemiplimab)或癌自禦(atezolizumab)組成的群組，較佳為吉舒達。
E134.如E109-E133中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7 mg與200 mg之間，較佳在20 mg與75 mg之間。
E135.如E109-E112中任一項所述的方法，其中所述抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈與SEQ ID NO:6的輕鏈，並且所述活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量在7 mg與200 mg之間，較佳在20 mg與75 mg之間，其中受試者被施以治療有效量的吉舒達。
E136.如E109-E112中任一項所述的方法，其中所述抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈與SEQ ID NO:6的輕鏈，並且所述活化的抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7 mg與200 mg之間，較佳在20 mg與75 mg之間。
E137.如E109-E136中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體以每劑介於7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內施用至少兩次，較佳為第二劑在第一劑施用後至少15天施用，通常在約21天後。
E138.如E109-E137中任一項所述的方法，其中所述活化的抗BTN3A抗體以選自7 mg、10 mg、20 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、170 mg或200 mg的劑量施用。
E139.一種在有需要的受試者之腫瘤中增強免疫細胞浸潤的方法，所述方法包含施用有效量的如本文揭露之活化的抗BTN3A抗體，較佳為與有效量的抗PD1或抗PD-L1試劑配合施用，例如抗PD1抗體(如吉舒達)。
E140. 如E139所述的方法，其中所述免疫細胞包含Vγ9Vδ2 T細胞以及CD8+ T細胞。
示例
根據本發明使用之表徵活化的抗BTN3A抗體的方法
1.1結合親和力試驗：多循環動力學試驗(SPR)
可使用Biacore T200 (序號1909913)儀器運行Biacore T200評估軟體V2.0.1 (Uppsala, Sweden)對抗BTN3A抗體進行多循環動力學分析。
將純化的抗體在2% BSA/PBS中稀釋為濃度2 μg/ml。在每個循環開始時，每種抗體以約146.5 RU的密度(RL) (獲得最大約50 RU的RMax的理論值)被蛋白質A捕獲。捕穫後，在注入BTN3A1抗原(Sino Biological cat. no. 15973-H08H)之前使表面穩定。將BTN3A1以25 nM至0.78 nM的兩倍稀釋範圍內滴定在0.1% BSA/HBS-P+ (運行緩衝液)中。監測締合階段400秒，監測解離階段35分鐘(2100秒)。使用50 μl/min的流速以減少任何潛在的質量傳送效應(mass transfer effects)，獲得動力學數據。在各次循環結束時，利用兩次注入pH 1.5濃度10 mM的甘胺酸-氯化氫溶液進行蛋白質A表面的再生。對各個測試的抗體進行兩次空白(無BTN3A1)以及重複單一濃度的分析物，以檢查在動力學循環中分析物及表面的穩定性。從Fc2、Fc3與Fc4的訊號中減去來自參考頻道Fc1的訊號，以校正與參考表面的非專一性結合的差異。此外，各個Fc減去空白運行以校正任何與抗原無關的訊號變化(例如飄移(drift))。以總體最大密度(RMax)參數且無大量訊號(常數RI = 0 RU)使用一對一結合數學模型擬合傳感圖(Sensorgram)。
1.2藉由流式細胞術對人類PBMC的結合檢驗
根據本發明使用的抗BTN3A抗體也可以它們與人類PBMC的結合為特徵，所述人類PBMC分離自健康供給者的血液。使用Lymphoprep(Axis-shield, Dundee, UK)密度離心自膚色血球層(buffy coat)中分離出PBMC。然後將PBMC冷凍並儲存在-80°C或液態氮中直至需要。
以1x10 6個細胞/毫升的濃度將100 μl的細胞轉移至新的U形底的96孔盤的各個孔洞中，然後將孔盤離心並丟掉上清液。
於PBS 2 mM EDTA進行連續稀釋(serial dilution)，製備0.001 μg/ml至150 μg/ml的抗體。將人類PBMC重新懸浮在50 μl之連續製備的稀釋的測試抗體中。
在4°C黑暗中孵育30分鐘後，將盤離心並用150 μl/孔的PBS 2 mM EDTA清洗兩次，然後將孔中的內容物重新懸浮在50 μl之由山羊抗人類抗體(PE標記)以及Live/dead近紅外線著色劑(Live/dead near IR stain)組成的混合物中，其中在PBS 2 mM EDTA中山羊抗人類抗體(PE標記)稀釋1/100且Live/dead近紅外線著色劑稀釋1/500。
在4°C下黑暗中孵育15分鐘後，將盤離心並用150 μl/孔PBS 2 mM EDTA清洗一次，然後將孔重新懸浮在200 μl PBS 2 mM EDTA中。在BD LSR Fortessa細胞儀分析細胞。使用FlowJo軟體(Version 10, FlowJo, LLC, Ashland, USA)分析數據。
可以對食蟹猴PBMC以及Daudi Burkitt淋巴瘤細胞系進行相同的流程。
1.3體外功能功效：γδ-T細胞去顆粒作用試驗
試驗包含測量抗BTN3A抗體針對Daudi Burkitt 淋巴瘤細胞系在γδ -T細胞去顆粒化作用的活化或抑製效果(Harly et al., 2012)。藉由與唑來膦酸(zoledronic acid) (1 μM)以及IL2 (200 Ui/ml)一起培養11-13天，從健康供體的PBMC擴增γδ-T細胞。在第5天、第8天與之後每2天添加IL2。在培養開始時決定γδ-T細胞的百分比，並藉由流式細胞術評估培養時間直到其達到至少80%。然後將冷凍或新鮮的 γδ-T細胞使用於針對Daudi細胞系(E:T比為1:1)的去顆粒化分析，其中細胞在37°C下在10 μg/ml的7.2以及20.1人源化變體及其嵌合版的存在下共同培養4小時。藉由PMA (20 ng/ml)加上離子黴素(Ionomycin)(1μg/ml) 活化作為γδ-T細胞去顆粒化的陽性控制組，僅培養基作為陰性控制組。在4小時共同培養結束時，藉由流式細胞術分析細胞以評估對CD107a (LAMP-1，溶酶體相關膜蛋白-1) + CD107b (LAMP-2)呈陽性的γδ-T細胞的百分比。CD107在活化誘導的顆粒胞吐作用(granule exocytosis)後被移動到細胞表面，因此表面CD107的測量是識別最近去顆粒化的細胞毒性T細胞的敏感標記。
可以使用從病患分離的AML芽細胞(blasts)代替Daudi細胞作為目標細胞來進行相同的流程。
1.4藉由流式細胞術決定絕對血液基線γδ T細胞計數
為了評估γδ T細胞的絕對計數，將新鮮血液樣本(100 μl)與在PBS 1%胎牛血清(FBS)中製備的抗體混合物(cocktail)(50 μl)、校準珠(Calibration beads)(例如來自BD的Trucount珠)以及生存力標記混合。將樣品在黑暗中室溫下培養20分鐘。藉由加入2 mL之預熱的1x RBC裂解緩衝液(Biolegend #420302)，渦旋(vortexing)並進一步加入2 mL之1x RBC裂解緩衝液，然後在黑暗中室溫下培養15分鐘，藉此來裂解紅血球細胞(RBC)。在PBS 1% FBS中清洗後，將細胞沉澱物重新懸浮在300 μL的PBS 1% FBS中，並使用設置在BD FACS Diva軟體(v8.0)上的預定義應用程式在BD LSR Fortessa X-20上來獲得。使用以下公式對數據進行標準化：((MFI測試-MFI IC)/(MFI測試預劑量-MFI IC-預劑量)x100)。使用FlowJo軟體(v10.6)進行分析。
1.5決定腫瘤活檢中的Vγ9+ T細胞密度
為了評估腫瘤活檢中的Vγ9+ T細胞密度，在治療前以及治療後第28天收集來自病患的活檢樣本。在每個時間點，將一半的活檢包埋在石蠟(paraffin)中，另一半被快速冷凍成最佳切割溫度(OCT)化合物。由Veracyte (Marseille, France)在Bond RX Automatic Stainer (Leica Biosystems)上進行免疫組織化學，並使用Nanozoomer XR掃描儀(Hamamatsu)獲取圖像。簡而言之，將新鮮冷凍樣品的6 μm厚切片在室溫下於鋅福爾馬林固定劑(zinc formalin)中固定5分鐘，以5%人類血清培養30分鐘以封閉，並且用2 μg/mL之抗panBTN3A mAb(殖株20.1)或抗Vγ9TCR mAb(殖株7B6，Huang et al, Infection and Immunity 2008, pp 426-436)在室溫下染色45分鐘。使用Bond Polymer Refine RED檢測試劑盒(Leica Biosystems)揭示抗原-抗體結合。然後用蘇木精(hematoxylin)對組織切片進行複染。使用Veracyte的Brightplex在單個FFPE載玻片上對BTN3A2、BTN3A3、δTCR(殖株H-41)、CD3、CD4、FoxP3、Ki67、CD8、NKp46以及顆粒酶B進行多重免疫組織化學染色。簡而言之，將4 μm來自經石蠟包埋的活檢載玻片經過脫蠟處理，以抗源決定區恢復溶液I (Epitope Retrieval Solution I) (Leica Biosystems)處理20分鐘，然後用指定的mAb連續染色。使用MACH 2 HRP聚合物(Biocare)揭示抗原-抗體結合。然後用ImmPACT™ AMEC Red (Vector Lab)對組織切片進行染色，並用蘇木精複染。在各個染色循環之間，將載玻片用乙醇進行AMEC脫色，並且用變性溶液剝離抗體。在各個染色循環之間獲取圖像。
示例1：臨床研究-總結
首次在人體、兩部分、開放標籤試驗(open-label)的臨床研究，評估於晚期、復發性/頑抗性癌症病患中ICT01作為單一療法以及與免疫查核點抑製劑(ICI)組合的靜脈注射劑量之安全性、耐受性以及活性(EVICTION研究)。
研究藥物：ICT01；靶向人類嗜乳蛋白3A (BTN3A)且經基因工程處理以減少Fc效應物功能的人源化且活化的抗BTN3A免疫球蛋白(Ig)G1單株抗體(mAb)。
第一部分目的：
主要：表徵在晚期、復發性/頑抗性實質固態瘤或血液系統癌症病患中ICT01作為單一療法以及與吉舒達組合之靜脈內(IV)劑量的範圍之整體安全性以及耐受性特徵。
次要：
1.表徵對晚期、復發性/頑抗性實質固態瘤或血液系統癌症病患施用的IV ICT01的藥物動力學(PK)及藥效動力學(PD)。
2.決定ICT01作為單一療法以及與吉舒達配合的療效擴增族群試驗(expansion cohorts)(第二部分)之建議劑量。
3.表徵當施用於晚期、復發性/頑抗性實質固態瘤或血液系統癌症病患時，ICT01作為單一療法以及與吉舒達組合的IV劑量的範圍的初步抗腫瘤活性。
第二部分目標：
主要：表徵在晚期、復發性/頑抗性實質固態瘤或血液系統癌症病患中IV ICT01作為單一療法以及與吉舒達組合的初步抗腫瘤活性。
次要：
1.表徵在晚期、復發性/頑抗性實質固態瘤或血液系統癌症病患中IV ICT01作為單一療法以及與吉舒達組合的整體安全性以及耐受性。
2.表徵對晚期、復發性/頑抗性實質固態瘤或血液系統癌症病患施用的IV ICT01之PK與PD。
研究設計：
這是一項I/IIa期、首次人體、兩部分、開放標籤試驗的研究，以表徵ICT01的安全性、耐受性、PK、PD以及抗腫瘤活性。第一部分是將劑量遞增IV ICT01作為單一療法，每21天對晚期、復發性/頑抗性癌症病患施用(A組：混合性實質固態瘤；B組：晚期血液系統惡性腫瘤)。IV ICT01與吉舒達(抗PD-1；Keytruda®)的組合在C組(符合以吉舒達的治療但在治療期間沒有反應、進展或復發的腫瘤)進行評估。
第二部分是研究的擴增階段，其中對有兩種實質固態瘤適應症(D組與E組)或血液系統惡性腫瘤(F組)的額外病患使用在第一部分中確定的ICT01劑量進行治療，其作為單一療法已證明有良好的風險/效益特徵。G組是ICT01(最多2劑量的程度)與吉舒達的組合在單一適應症中的擴增。在開始此部分研究之前，通過實質上的修改在流程中更新第二部分中有關劑量與適應症的最終細節。
ICT01的施用途徑是IV輸注30分鐘以上
對C組中的所有病患使用劑量為每21天200 mg IV(其為批准的劑量)的Pembrolizumab (KEYTRUDA®)。根據製造商，不建議減少KEYTRUDA的劑量。如附錄Pembrolizumab (Keytruda®) pembrolizumab (Keytruda®) Summary of Product Characterisitcs中所述，不給或中斷KEYTRUDA以管理不良反應。
D組(卵巢癌)以及E組(頭頸部鱗狀上皮細胞癌(HNSCC))：ICT01的2個劑量程度為7 mg以及200 mg，其皆已被揭示為具有藥效動力學活性且安全。各個劑量組中每個適應症最多25位病患。在完成所有篩選評估並確認其適用性後，在第0天將病患以1:1的比例隨機分配成7 mg或200 mg之ICT01。
F組以及G組：在第二部分開始之前提交實質的修訂，以傳達各個組的選定病患群體以及ICT01劑量。
在3週的篩選期間評估病患的適用性。如第一部分收集活檢。在D組、E組以及F組中以IV ICT01作為單一療法每21天治療病患，或在G組中與吉舒達組合治療。
研究群體
第一部分的納入標準
以下標準必須在篩選期間及在基線進行檢查。必須滿足所有納入標準受試者才能包含在研究中：
1)男性或女性年齡≥18歲。
2)在進行任何與研究相關的篩查程序之前自願簽署書面知情同意書。
3)經組織學或細胞學證實診斷為晚期或復發性癌症的復發性/頑抗性病患，包含：
a. A組：膀胱、乳腺、大腸直腸、胃、黑色素瘤、卵巢、攝護腺以及PDAC。
b. B組：血液系統惡性腫瘤，包含急性髓細胞性白血病、急性淋巴細胞性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤以及濾泡性淋巴瘤。
c. C組：黑色素瘤、膀胱癌、頭頸部鱗狀上皮細胞癌以及非小細胞肺癌(吉舒達在美國與歐盟批准之適應症)。
4)願意接受基線以及研究中的腫瘤活檢。
5)美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)測得體能狀態(performance status) ≤ 1。
6)研究者評估的預期壽命 ＞ 3個月。
7)臨床實驗室
a.血液學 血紅蛋白≥ 8.5 g/dL (相等於5.28 mmol/L；依賴或不依賴輸血)； 只有A/C組： 血小板計數≥ 75 × 10 9/L; 淋巴球計數≥ 0.5 × 10 9/L; 絕對嗜中性球計數≥ 1.0 × 10 9/L;
b. 肝酵素: 天冬胺酸轉胺酶(AST)以及丙胺酸轉胺酶(ALT) ≤ 2.5 × 正常上限(ULN)(肝轉移時 ＜ 5 × ULN)。 膽紅素≤ 1.5 × ULN (肝轉移時＜ 2 × ULN)；
c.腎功能：血清肌酐＜ 1.5 × ULN，或血清肌酐≥ 1.5 × ULN時肌酸酐清除率≥ 50 mL/min (Cockcroft以及Gault)。
8)避孕措施
a.有生育潛力的婦女必須：
i.在首次施用研究藥物前1週內妊娠測試呈陰性。
ii.在研究期間與最後一劑研究藥物後至少5個月內持續且正確地使用高效率的生育控制方法。
iii)同意在研究期間與最後一劑研究藥物後至少5個月內不以幫助生殖目的捐贈卵子(卵子、卵母細胞)。
iv)同意在研究期間及最後一劑研究藥物後至少5個月內不計畫哺乳與懷孕。
b.性活躍之男性必須：
i.同意在研究期間及最後一劑研究藥物後至少5個月內使用帶有殺精子泡沫/凝膠/薄膜/乳膏/栓劑的保險套。
ii.同意在研究期間及最後一劑研究藥物後至少5個月內不捐贈精子。
iii.在研究期間或最後一劑研究藥物後5個月內沒有計劃生育孩子。
9)女性一定不能哺乳。
10)在實質固態瘤的反應評估標準(RECIST)/淋巴瘤的反應評估標準(RECIL)至少有1個可測量的病灶，或＞ 5%的骨髓芽細胞。
11)根據治療研究者的決定，病患必須沒有其疾病可用的護理標準。
12)ICT01聯合治療組(Combination arms)中的病患必須符合經批准的標有吉舒達的包裝中的資格標準，並滿足以下條件：
a.必不得為一線病患(即必須符合納入標準#11)。
b.必不得有任何間質性肺病史或正在進行的間質性肺病。
c.之前必須沒有接受過前部器官移植，包含同種異體幹細胞移植。
第二部分D組與E組：
13)替換納入標準#3：具有組織學或細胞學證實診斷為晚期或復發性癌症的復發性/頑抗性病患，包含：
a. D組：在先前的全身性含鉑治療失敗至少1次之持續性或復發性的上皮性卵巢癌、原發性輸卵管癌或原發性腹膜癌。
b. E組：在先前的全身治療至少失敗1次之轉移性或不可切除、復發性HNSCC。
14)替換納入標準#11：病患在參加此研究之前必須接受至少一種其癌症的治療線。
15)篩選期間血液的循環γ9δ2 T細胞計數≥ 20000個細胞/毫升。
統計分析
分析群體
安全群體包含所有接受過至少1劑ICT01或ICT01與吉舒達聯合治療且具有實質固態瘤、血液系統腫瘤的病患，並且組合治療病患的數據將分別分析。可評估療效的群體包含所有以至少2劑之(i) ICT01(治療時間超過1個月)或(ii) ICT01與吉舒達組合治療來治療且沒有任何可能導致療效評估偏移的流程偏差治療的病患，而意向治療(ITT)群體將用於探索性目的。對於第二部分，可評估療效的群體包含所有以8週抗腫瘤評估治療的病患(如RECIST)。
主要終點
第一部分，安全性與耐受性的主要終點將在此研究中藉由下述來評估：治療緊急不良事件(TEAE)、嚴重不良事件(SAE)、導致研究治療中止的TEAE，以及對臨床實驗室測試、生命體徵、心電圖(ECG)及體格檢查(第二部分中的關鍵次要終點)的臨床顯著發現。
第二部分，疾病控制率(DCR)包含根據RECIST、RECIL或根據血液系統惡性腫瘤的疾病專一性標準(如AML的Cheson/IWG標準)的臨床反應標準。DCR是完全反應/緩解(CR)+不完全恢復的CR (CRi)+部分反應/緩解(PR)+疾病穩定的總和。
次要終點
在第一部分中，根據RECIST、RECIL或根據血液學適應症中的疾病特定標準(如AML的Cheson/IWG標準)，初步的抗腫瘤活性終點是DCR以及客觀緩解率(objective response rate，ORR)。在實質固態瘤中免疫治療反應評估標準(iRECIST)被視為探索性的。
在第二部分中，根據RECIST、RECIL或根據血液系統惡性腫瘤的疾病專一性標準(如AML的Cheson/IWG標準)的客觀緩解率(ORR)。客觀緩解率是完全反應/緩解(CR)+不完全恢復的CR (CRi)+部分反應/緩解(PR)的總和。iRECIST是探索性的。
額外的次要終點包含安全性及耐受性、進展時間(TTP)以及無進展生存(PFS)。
在第一部分與第二部分中，以劑量程度計算ICT01 (包含C max、AUC、t 1/2、淨化值(clearance))的PK參數。同樣地，ICT01的PD活性(藉由劑量以及病患群體)包含來自γ9δ2 T細胞與在周邊血液的其他免疫細胞、周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及腫瘤活檢的基線計數及活化狀態的變化、循環細胞激素程度(包含IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17a與MCP-1)以及在腫瘤活檢與PBMC中PD-L1、PD-1以及其他免疫細胞標記的表現。
將來自腫瘤活檢的γδ T細胞與基線BTN3A表現，以及循環中BTN3A表現與基線γδ T細胞表徵並用作為PD及臨床反應分析的共同變量。
決定ICT0的活性劑量程度的主要PD活性量測是降低基線並增加循環γδ T細胞的活化，如由流式細胞術所測量。
示例2：使用γδ T細胞計數或Vγ9+ T細胞密度作為選擇反應者的預測標記的臨床證據。
材料以及方法
病患與臨床試驗
EVICTION (NCT04243499)是一項首次在人體、兩部分、開放標籤試驗的臨床研究以評估在晚期、復發性/頑抗性癌症的病患中ICT01 (來自鼠類mAb7.2的人源化抗體)作為單一療法以及與吉舒達組合使用的IV劑量的安全性、耐受性、藥物動力學、藥效動力學與抗腫瘤活性。成年病患必須未通過所有可用的癌症護理標準才能符合條件，並且在試驗期間未接受其他抗癌治療，但在試驗的聯合治療組中的患者除外。病患每3週接受一次ICT01(範圍：20 μg至200 mg)，並在多個時間點採集血液樣本以進行安全性量測、全血免疫表型分析以及血清細胞激素分析。
在基線以及第28天採集腫瘤活檢並且藉由免疫組織化學針對Vγ9Vδ2 T細胞與其他抗腫瘤免疫標記進行染色。
多重細胞激素試驗
根據製造商的說明，使用MSD(Mesoscale Discovery)平台測量血清細胞激素程度(IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、TNFα)。
流式細胞術分析
為了評估ICT01用劑後的目標佔用率(Target occupancy，TO)，將新鮮血液樣本(100 μl)與在PBS 1% FBS中配置的抗體混合物(50 μl)混合，所述抗體混合物含有抗CD45、抗CD3、抗CD19、抗BTN3A ICT01競爭性mAb (殖株20.1)、抗BTN3A ICT01非競爭性mAb (殖株103.2)以及生存力標記。平行使用第二種混合物，其中抗BTN3A被它們各自的同型控制組取代。將樣品在黑暗中室溫下培養20分鐘。藉由加入2 mL之預熱的1x RBC裂解緩衝液(Biolegend #420302)，渦旋並進一步加入2 mL之1x RBC裂解緩衝液，然後在黑暗中室溫下培養15分鐘，藉此來裂解紅血球細胞(RBC)。在PBS 1% FBS中清洗後，將細胞沉澱物重新懸浮在300 μL的PBS 1% FBS中，並使用設置在BD FACS Diva軟體(v8.0)上的預定義應用程式BD LSR Fortessa X-20上來獲得。使用以下公式對數據進行標準化：((MFI測試-MFI IC)/(MFI測試預劑量-MFI IC-預劑量)x100)。使用經過驗證的13色板以相同的程序進行免疫表型分析。使用FlowJo軟體(v10.6)進行分析。
免疫組織化學
在治療前以及治療後第28天收集來自EVICTION臨床試驗的活檢樣本。在每個時間點，一半的活檢被包埋在石蠟(paraffin)中，另一半被快速冷凍成最佳切割溫度化合物(OCT)中。由Veracyte (Marseille, France)在Bond RX Automatic Stainer (Leica Biosystems)上進行免疫組織化學，並使用Nanozoomer XR 掃描儀(Hamamatsu)獲取圖像。簡而言之，將新鮮冷凍樣品的6 μm厚切片在室溫下於鋅福爾馬林固定劑(zinc formalin)中固定5分鐘，與5%人類血清培養30分鐘以封閉，並且用2 μg/mL抗panBTN3A mAb (殖株20.1)或抗Vγ9TCR mAb(殖株7B6 , Huang et al, Infection and Immunity 2008, pp 426-436)在室溫下染色45分鐘。使用Bond Polymer Refine RED 檢測試劑盒(Leica Biosystems)揭示抗原-抗體結合。然後用蘇木精(hematoxylin)對組織切片進行複染。使用Veracyte的Brightplex在單個FFPE載玻片上對BTN3A2、BTN3A3、δ TCR(殖株H-41)、CD3、CD4、FoxP3、Ki67、CD8、NKp46以及顆粒酶B(Granzyme B)進行多重免疫組織化學染色。簡而言之，4 μm來自經石蠟包埋的活檢載玻片經過脫蠟處理，以抗源決定區恢復溶液I (Epitope Retrieval Solution I) (Leica Biosystems)處理20分鐘，然後用指定的mAb連續染色。使用MACH 2 HRP聚合物(Biocare)揭示抗原-抗體結合。然後用ImmPACT™ AMEC Red (Vector Lab)對組織切片進行染色，並用蘇木精複染。在各個染色循環之間，將載玻片用乙醇進行AMEC脫色，並且用變性溶液剝離抗體。在各個染色循環之間獲取圖像。
結果
1.基線γδ T細胞計數與介導周邊血液中CD8 T細胞、自然殺手細胞以及顆粒性白血球的活化的抗BTN3A抗體相關
在治療前(基線)以及ICT01輸注後30分鐘、1天、7天與21天，獲得來自EVICTION病患的血液樣本。進行免疫表型分析以評估顆粒性白血球、單核球、B細胞、自然殺手細胞以及T細胞(包含CD4與CD8 ab T細胞與Vγ9Vδ2 T細胞亞群)的絕對數量與頻率以及它們的活化狀態(CD69及/或PDL-1表面表現)。
在所有病患中，ICT01早在用劑後4小時就誘發Vγ9Vδ2 T細胞的數量與頻率下降。在接受0.07 mg至20 mg ICT01的病患中Vγ9Vδ2 T細胞程度在第7天與第21天之間逐漸恢復到靠近基線，而在施用劑量大於75 mg的病患中仍然保持非常低。CD69表面表現的評估揭示在大多數接受ICT01治療的病患中，在ICT01施用後，Vγ9Vδ2 T細胞具有活化的特徵。在接受≥ 7 mg ICT01的病患中，在用劑後30分鐘自然殺手細胞、常規γδ T細胞以及B細胞的數量持續減少，與一天過後的基線相比仍低，且在所有群組中在第7天恢復到接近基線。此降低與自然殺手細胞及CD8 T細胞之較低程度的活化特徵(如由CD69表面染色所評估)有關。此外，在施用≥ 7 mg ICT01的病患中始終觀察到顆粒性白血球上PDL-1表現增加。
當與本研究中評估的不同免疫亞群的基線數相關(Spearman rank)時，自然殺手細胞、CD8 T細胞以及顆粒性白血球的活化似乎與基線循環Vγ9Vδ2 T細胞數顯著相關，但與其他免疫區室無關，其表示ICT01介導的Vγ9Vδ2 T細胞活化的次要效應。
在來自EVICTION試驗的A組、B組與C組的55位病患中，ICT01後自然殺手細胞(CD69陽性)的活化與ICT01暴露以及基線Vγ9Vδ2 T細胞計數皆強烈相關(spearman r = 0.56，p＜0.0001) (請見圖1A)。
顆粒性白血球的活化(PD-L1陽性)也與ICT01暴露以及基線γ9δ2 T細胞計數皆強烈相關(spearman r = 0.55, p＜0.0001) (請見圖1B)。
2.基線γδ T細胞計數與抗BTN3A抗體介導的細胞激素的產生相關
使用MSD平台在EVICTION病患治療前與ICT01治療後30分鐘、4小時、1天、7天以及21天的血清中量化細胞激素的循環濃度。在ICT01施用後4小時觀察到大多數細胞激素的峰值濃度，但TNFa除外，其在ICT01施用後30分鐘觀察到峰值。
在ICT01施用後觀察到IFNγ、TNFa、IL-6、IL-8與IL-1b、IL-4、IL-13以及IL-12在基線循環γ9δ2 T細胞絕對計數與血清細胞激素濃度之間的強烈相關性。
在來自EVICTION試驗的A組、B組以及C組的75位病患中，ICT01施用後的前24小時中循環IFNγ程度的增加與ICT01暴露及基線γ9δ2 T細胞計數強烈相關(spearman r = 0.79，p＜0.0001)(請見圖1C)。
3.基線γδ T細胞計數與腫瘤中抗BTN3A抗體介導的免疫腫瘤浸潤以及活化有關
使用多重IHC結合數字病理學(Brightplex platform，HalioDX，Luminy，法國)與基因表現特徵(nCounter NanoString platform)在治療前以及治療後的腫瘤活檢中評估腫瘤免疫浸潤。
當比較治療後與治療前活檢中不同免疫細胞群體的密度的變化時，在治療後的活檢中在基線處具有最高的周邊血液Vγ9 T細胞絕對計數的病患傾向增加的免疫浸潤以及活化(見圖2A、2B、2C、2D與2E)。
這些結果藉由使用NanoString平台的基因表現分析得到確認。在基線處具有高基線Vγ9 T細胞計數的病患中觀察到在治療後的活檢中更高的免疫浸潤以及活化的明確趨勢(圖未示)。
4.基線γδ T細胞計數與腫瘤中的Vγ9+ T細胞密度相關
在治療前獲得來自EVICTION病患的血液樣本(基線)。進行免疫表型分析以評估Vγ9Vδ2 T細胞的絕對數量。使用IHC對新鮮冷凍切片結合數字病理學(HalioDX, Luminy, France)在預處理活檢中評估Vγ9TCR陽性T細胞密度。
觀察到在血液基線Vγ9T+細胞絕對計數以及在腫瘤活檢中的基線Vγ9+密度之間的相關性趨勢(Spearman r = 0.5126，p = 0.0027，n = 32) (請見圖3)，這表示在基線處，Vγ9腫瘤浸潤與血液中亞群的絕對計數有關。
示例3：有在抗PD1/PDL1治療後具有頑抗性或復發性腫瘤的病患中以ICT01結合抗PD1抗體治療之臨床證據。
1. ICT01使在EVICTION病患中的PD-1表現增加。
冷凍活檢的流式細胞術表示出在EVICTION的A組(圖4A)以及B組(圖4B)治療的癌症病患中，ICT01誘發的γ9δ2 T細胞活化會使PD-1的表面表現(描繪每劑量組的平均值)增加。
雙因子變異數分析(Two-way ANOVA)以及Holm-Šídák多重比較測試
2.ICT01/吉舒達治療後多個免疫細胞群體的活化與遷移
在EVICTION之C組中，流式細胞術分析表示出γ9δ2T細胞在用劑後快速遷移，且在所有測試劑量下觀察到幾乎100%的遷移，效應持續時間與劑量有關(絕對細胞數，圖5A左圖的基線百分比)，在24小時活性增加(圖5A右圖的CD69陽性百分比)。
在7 mg與更高劑量時觀察到對自然殺手細胞及CD8 T細胞的類似藥效動力學效應，在75 mg時觀察到峰值效應(分別為圖5B以及圖5C)。
儘管從血液中遷移出來的程度很小，但在所有劑量下皆觀察到顆粒性白血球的活化(圖5D)。
在治療30分鐘後觀察到對γ9δ2T細胞的峰值效應，而在治療24小時後觀察到對CD8以及自然殺手細胞的峰值效應。這些數據表示在γ9δ2T細胞活化後需要一個步驟來產生這些效應，我們已確定其為細胞激素介導的。
臨床活動
在EVICTION試驗的C組的遞增階段中，ICT01加上吉舒達的組合耐受性良好，沒有觀察到任何DLT或安全問題。
最常見的不良事件(TEAE)與個體研究結果(Individual Research Result，IRR)一致，其是對於吉舒達為充分描述的事件。沒有免疫相關的特別關注不良事件(AESI)被報告。
在施用後30分鐘內，在所有ICT01劑量下皆觀察到血液中γ9δ2T細胞的活化與遷移。此外，在劑量≥ 7 mg ICT01時觀察到血液中CD8 T細胞與自然殺手細胞的活化與遷移，且似乎是由活化的γ9δ2T細胞所釋放的IFNγ與TNFα來介導。周邊免疫活化藉由γδ、CD3以及CD8 T細胞浸潤腫瘤來反映。
在ICT01劑量低至2 mg時在多個不同實質固態瘤間觀察到這些CPI失敗病患的臨床反應，這表示作用的互補機制會導致抗腫瘤免疫反應增加。
示例4：用於實踐本發明的可用序列
表5：用於實施本發明之可用的胺基酸及核苷酸序列的簡要說明
SEQ ID NO: 種類 序列之描述
1 aa mAb 7.2的人源化重鏈可變區VH2
2 aa mAb 7.2的人源化輕鏈可變區Vκ1
3 aa mAb 7.2的人源化輕鏈可變區Vκ2
4 aa mAb 1及2 (VH2 7.2 沉默 IgG1)的全長重鏈
5 aa mAb 3及4 (VH2 7.2 沉默IgG4)的全長重鏈
6 aa mAb 1及3 (Vk1 7.2)的全長輕鏈
7 aa mAb 2及4 (Vk2 7.2)的全長輕鏈
8 nt mAb 1及2 (VH2 7.2 沉默IgG1)的全長重鏈
9 nt mAb 3及4 (VH2 7.2 沉默IgG4)的全長重鏈
10 nt mAb 1及3 (Vk1 7.2)的全長輕鏈
11 nt mAb 2及4 (Vk2 7.2)的全長輕鏈
12 aa mAb 7.2之1、2、3與4的HCDR1
13 aa mAb 7.2之1、2、3與4的HCDR2
14 aa mAb 7.2之1、2、3與4的HCDR3
15 aa mAb 7.2之1、2、3與4的LCDR1
16 aa mAb 7.2之1、2、3與4的LCDR2
17 aa mAb 7.2之1、2、3與4的LCDR3
18 aa 人類BTN3A1
19 aa 人類BTN3A2
20 aa 人類BTN3A3
21 aa 使用於重組蛋白生產的食蟹猴獼猴(Cynomolgus macaque) ( m. fascicularis) BTN3A1外域(ectodomain)
22 aa 使用於重組蛋白生產的食蟹猴獼猴(Cynomolgus macaque) ( m. fascicularis)  BTN3A2外域
23 aa 使用於重組蛋白生產的食蟹猴獼猴(Cynomolgus macaque) ( m. fascicularis)  BTN3A3外域
24 aa mAb 20.1的人源化重鏈可變域
25 aa mAb 20.1的人源化輕鏈可變域
26 aa HCDR1
27 aa HCDR2
28 aa HCDR3
29 aa LCDR1
30 aa LCDR2
31 aa LCDR3
32 aa 人源化mAb 20.1的全長重鏈
33 aa 人源化mAb 20.1的全長輕鏈
表6：用於實施本發明之可用的胺基酸與核苷酸序列的簡要描述。
SEQ ID NO: 特定胺基酸或核苷酸序列
1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSS
2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
8 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA
9 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAATGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA
10 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTACTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
11 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
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20  MKMASSLAFLLLNFHVSLFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIKWSDTKGENIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGGGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATEQEISLREKLQEELKWRKIQYMARGEKSLAYHEWKMALFKPADVILDPDTANAILLVSEDQRSVQRAEEPRDLPDNPERFEWRYCVLGCENFTSGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVERKKGWVKMTPENGYWTMGLTDGNKYRALTEPRTNLKLPEPPRKVGIFLDYETGEISFYNATDGSHIYTFPHASFSEPLYPVFRILTLEPTALTICPIPKEVESSPDPDLVPDHSLETPLTPGLANESGEPQAEVTSLLLPAHPGAEVSPSATTNQNHKLQARTEALY
21 MGSSLAFLLLSFHVCVLLLQLLMPHSAQFAVVGPPGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSNLRQVVNVYADGKEVEDRQSAAYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIDVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIRWSNDKGENIPAVEAPVFVDGVGLYAVAASVILRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTTSISIAG HHHHHH
22 MGSSLAFLLLNFHVSFFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDDIAAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDADFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPKIQWSNAKGQNIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGGSGESVSCIIRNSVLGLEKTASISIAD HHHHHH
23 MANFLAFLLLNFRVCLLLVQLLTPCSAQFAVLGPHGPILAMVGEDVDLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYSDGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNTKGQHIPAVKAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISITD HHHHHH
24 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYYLYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKSRATMTVDKSTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCSREDDYDGTPDAMDYWGQGTLVTVSS
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33 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINLWLSWYQQKPGKAPKLLIYRASNLHTGVPSRFSGSGSATDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGHSYPYTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
無
圖1：在EVICTION中，免疫活化以及IFNγ的產生與ICT01劑量以及基線循環Vγ9Vδ2 T細胞絕對計數皆有關。藉由流式細胞術評估病患血液中的基線Vγ9Vδ2 T細胞絕對數(每毫升血液)以及活化標記(CD69以及PD-L1，D0+24h)。由超靈敏PK測定法(ultra-sensitive PK assay)(Chimera Biotec, Germany)測定ICT01 Cmax。由市售試劑盒(MesoScale Discovery)測定循環細胞激素程度。IFNγ倍數變化定義為IFNγ AUC (使用時點D0、D+30min、D0+4h以及D+24h)與IFNγ基線AUC之間的比值。斯皮爾曼相關(Spearman correlation)。圖1A：CD69陽性自然殺手細胞的百分比(%)，圖1B：PD-L1陽性顆粒性白血球的百分比(%)，圖1C：IFNγ的倍數變化。
圖2：在EVICTION中，在ICT01後腫瘤免疫浸潤的增加及活化與基線γ9δ2 T細胞計數有關。圖2A：在施用ICT01之前病患血液中的基線Vγ9Vδ2 T細胞絕對數(每毫升血液)。圖2B：在從可得到良好品質的活檢對(biopsy pairs)之A組及C組的所有病患中藉由多重定量IHC (digital pathology, Veracyte, France)評估不同表現型的腫瘤細胞密度(個細胞/平方毫米)的Log10倍數變化(治療後vs治療前的活檢)。圖2C至圖2E：藉由多重定量IHC (digital pathology, Veracyte, France)評估不同表現型的腫瘤細胞密度(個細胞/平方毫米)的Log10倍數變化(治療後vs治療前的活檢)。根據基線Vγ9Vδ2 T細胞絕對數以20000個細胞/毫升將病患群體劃分。
圖3：在腫瘤中的Vγ9TCR+細胞與循環Vγ9Vδ2 T細胞計數有關。藉由數字病理學(digital pathology)、定量IHC (個細胞/平方毫米)評估基線Vγ9TCR+腫瘤細胞密度。在施用ICT01之前病患血液中的基線Vγ9Vδ2 T細胞絕對數(每毫升血液)。斯皮爾曼相關(Spearman correlation)。
圖4：在EVICTION的病患中ICT01使PD-1的表現增加。ICT01誘發的Vγ9Vδ2 T細胞的活化使在EVICTION的A組(圖4A)以及B組(圖4B)治療的癌症病患中的PD-1 (冷凍活檢的流式細胞術，每劑量組的平均值)的表面表現增加。雙因子變異數分析(Two-way ANOVA)以及Holm-Šídák's多重比較測試(multiple comparisons test)。
圖5：ICT01/吉舒達治療誘發多個免疫細胞群體的活化以及遷移。藉由流式細胞術在不同時點評估在病患的血液中基線絕對數(每毫升血液，基線的百分比)以及活化標記(CD69以及PD-L1，陽性的百分比)。圖5A：Vγ9Vδ2 T細胞，圖5B：自然殺手細胞，圖5C：CD8 T細胞，以及圖5D：顆粒性白血球(granulocytes)。
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Claims (20)

  1. 一種誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化之分離的抗BTN3A抗體於製備治療有需要的人類受試者的腫瘤之藥物的用途，其中藉由評估在該人類受試者中血液基線Vγ9Vδ2 T細胞計數來選擇用於以該抗BTN3A抗體治療的該人類受試者。
  2. 如請求項1所述之抗BTN3A抗體的用途，其中若基線循環Vγ9Vδ2 T細胞計數高於5000個細胞/毫升、10000個細胞/毫升或高於20000個細胞/毫升，則選擇該人類受試者。
  3. 如請求項1或2所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該人類受試者是具有一實質固態瘤(solid tumor)的受試者，該實質固態瘤通常選自黑色素瘤、胰管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)、大腸直腸癌(colorectal cancer)、卵巢癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、攝護腺癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)、頭頸部鱗狀上皮細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)以及泌尿上皮癌(urothelial cancer)。
  4. 如請求項1或2所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該人類受試者是具有血液系統惡性腫瘤(hematological malignancy)的受試者。
  5. 如請求項4所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該血液系統惡性腫瘤選自急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)及/或瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma)。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體與人類BTN3A多肽結合，且解離常數(dissociation constant，K D)為10 nM以下，該解離常數由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)測得。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體在體外誘發在人類周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中之Vγ9Vδ2 T細胞的活化，且半數有效濃度(50% effective concentration，EC 50)為0.1微克/毫升以下，該半數有效濃度由活化標記CD69的表面表現測得。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體在與BTN3A表現細胞共同培養中誘發Vγ9Vδ2 T細胞的活化，且半數有效濃度低於5微克/毫升，該半數有效濃度在去顆粒作用分析中測得。
  9. 如請求項1至8中任一項所述抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體包含一突變或化學修飾的IgG1恆定區，其中當相較於具有野生型IgG1同型恆定區之一相對應的抗體時，該突變或化學修飾的IgG1恆定區不結合於Fcγ受體或降低與Fcγ受體的結合。
  10. 如請求項9所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該突變IgG1恆定區是IgG1的三重突變L247F、L248E以及P350S。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:12的HCDR1、SEQ ID NO:13的HCDR2、SEQ ID NO:14的HCDR3、SEQ ID NO:15的LCDR1、SEQ ID NO:16的LCDR2、SEQ ID NO:17的LCDR3。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:1之可變重鏈多肽VH以及SEQ ID NO:2的可變輕鏈多肽VL。
  13. 如請求項1至11中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO: 4的全長重鏈以及SEQ ID NO:6的全長輕鏈。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體是與細胞激素配合施用，該細胞激素選自由IL-2、IL-15以及其聚乙二醇修飾變體組成的群組。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體是與抗PD1或抗PD-L1抗體配合施用。
  16. 如請求項15所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗PD1抗體是吉舒達(pembrolizumab)。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體是以每劑量在7毫克與200毫克之間的劑量靜脈注射施用至少兩次。
  18. 一種誘發Vγ9Vδ2 T細胞活化之分離的抗BTN3A抗體於製備治療有需要的人類受試者的腫瘤之藥物的用途，其中該人類受試者在抗PD1或抗PD-L1治療中具有復發性或頑抗性腫瘤，並且對該人類受試者配合施用治療有效量的抗PD1或抗PD-L1試劑與治療有效量的該抗BTN3A抗體。
  19. 如請求項18所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該腫瘤是一實質固態瘤。
  20. 如請求項18或19所述之抗BTN3A抗體的用途，其中該抗BTN3A抗體包含SEQ ID NO:4的重鏈以及SEQ ID NO:6的輕鏈，並且該抗BTN3A抗體每次施用的治療劑量是在7毫克與200毫克內，其中該人類受試者被施以治療有效量的吉舒達。
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