BR112021001776A2 - anticorpos anti-btn3a e seu uso no tratamento de câncer ou distúrbios infecciosos - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-BTN3A E SEU USO NO TRATAMENTO DE CÂNCER OU DISTÚRBIOS INFECCIOSOS. A presente invenção se refere a anticorpos humanizados que se ligam especificamente ao BTN3A humano e seu uso no tratamento de câncer e distúrbios infecciosos.

Description

ANTICORPOS ANTI-BTN3A E SEU USO NO TRATAMENTO DE CÂNCER OU

DISTÚRBIOS INFECCIOSOS

[001] A seguir são revelados anticorpos ativadores anti-BTN3A que se ligam especificamente a BTN3A e ativam a função citolítica das células T Vγ9/Vδ2. Esses anticorpos são úteis, em particular, no tratamento de distúrbios cancerígenos, como câncer no sangue ou tumores sólidos. A invenção se refere mais especificamente a anticorpos ativadores anti-BTN3A humanizados específicos, com propriedades equivalentes ou melhoradas em comparação com os anticorpos 7.2 murinos parentais correspondentes, ou suas versões quiméricas com regiões constantes de IgG1 ou IgG4 humana silenciada por Fc. Antecedentes

[002] Os glóbulos brancos são células do sistema imunológico envolvidas na defesa do corpo contra patógenos. Dentre essas células, podem ser citados linfócitos, monócitos e células dendríticas. Os monócitos podem migrar a partir da corrente sanguínea para outros tecidos e se diferenciar em macrófagos residentes no tecido ou células dendríticas. As células dendríticas desempenham um papel como células apresentadoras de antígenos (APC) que ativam os linfócitos. Entre os linfócitos, as células T podem ser divididas em células T αβ e células T γδ. Vγ9-Vδ2, um subconjunto de células T γδ, são importantes efetores do sistema de defesa imune. Elas lisam diretamente células infectadas por patógenos ou células anormais. Além disso, eles regulam as respostas imunológicas ao induzir a maturação de célula dendrítica (DC), bem como a troca de isótopo e a produção de imunoglobulinas. Este importante subconjunto de células do sistema imunológico é rigidamente regulado por receptores de superfície, quimiocinas e citocinas.

[003] A preparação de células T é modulada pelo envolvimento de células especializadas e secreção de citocinas quimiotáticas. A hipótese de dois sinais postula que a ativação de célula T é o resultado de dois eventos sinérgicos.

O primeiro é a interação entre os receptores de célula T (TCR) e o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em complexo com o antígeno processado na superfície das células apresentadoras de antígeno (APC). O segundo evento é um sinal co-estimulador independente de antígeno envolvendo as moléculas CD28 e B7. A falta de sinais co-estimuladores induz anergia e não responsividade, resultando na ausência de proliferação de células T, secreção de citocinas e atividades citotóxicas.

O estudo dessas vias fornece esclarecimentos sobre o disparo de eventos patológicos, como distúrbios autoimunes ou linfoproliferativos.

A família B7 é um grupo extenso de moléculas co-estimuladoras (Coyle e Gutierrez-Ramos, 2001; Sharpe e Freeman, 2002). À família B7 pertencem os ligantes B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86): seus receptores são CD28, o que leva à ativação de células T, e CTLA-4 (CD152), que compete com CD28 e transduz um sinal inibitório (revisado em Alegre et al., 2001). O papel crítico do CD152 como um regulador negativo da ativação das células T é demonstrado pela ocorrência de distúrbios linfoproliferativos em camundongos deficientes em CTLA-4. Descobertas importantes sobre a função inibitória exercida pelo CD152 vêm de estudos sobre proliferação ou produção de citocina por linfócitos T naive durante a preparação de células T.

Em particular, CD152 é expresso após ativação de linfócitos T e inibe as funções citolíticas de clones de CTL obtidos após estimulação de PHA ou seleção de Ag.

B7-H1 (PD-L1, CD274) e B7-DC (PD-L2, CD273), cujo receptor é PD-1 (CD279), provou inibir a proliferação de células T e secreção de citocinas (revisado em Sharpe e Pauken, 2018 ) Senão, diferentes estudos mostraram que o envolvimento de PD-L1 e PD-L2 aumenta a proliferação de células T e a produção de IL-10 ou IFN-γ.

Outras moléculas relacionadas à família B7 expressaram na superfície das células T, incluindo B7- H2 (ICOS-L), as mais recentemente identificadas B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 e

B7-H7 também foram implicadas como reguladoras de ponto de verificação da função imunológica (revisado em Ni e Dong, 2017).

[004] Henry et al. (1999) descobriram que a região que codifica para a butirofilina (BT) está localizada em uma posição telomérica da região de MHC de classe I no cromossomo 6 humano. Em particular, eles descreveram dois genes Bt2 e Bt3, que codificam para um novo grupo de moléculas co-estimuladoras (BT2.1, BT2.2, BT2.3, BT3.1, BT3.2 e BT3.3) pertencentes à superfamília Ig (IgSF) (Linsley et al., 1992; Williams e Barclay, 1988), e relacionados à família B7 por análise de similaridade de sequência: em particular, eles mostram semelhança com os domínios extracelulares de tipo Ig-V de CD80 e CD86.

[005] Os membros da família BT3 aparecem na literatura com nomes diferentes: BT3.1 também é denominado BTF5 (Ruddy et al., 1997), ou BTN3A1 (Rhodes et al., 2001), ou mais recentemente CD277 (Bensussan e Olive, 2005); BT3.2 também é chamado de BTF4 (Ruddy et al., 1997) ou BTN3A2; e, finalmente, BT3.3 aparece também como BTF3 (Ruddy et al., 1997) ou BTN3A3 (Rhodes et al., 2001). BT3 tem dois domínios extracelulares de tipo Ig que caracterizam o IgSF.

[006] Foi proposto que os genes B7 e os genes MHC de classe I e II podem ter um gene ancestral comum e codificar para proteínas envolvidas em funções semelhantes, como ativação de células T (Rhodes et al., 2001). Moléculas BT3 foram encontradas em células imunes, como células T, B e NK, monócitos e células dendríticas, bem como precursores hematopoiéticos e algumas linhagens celulares neoplásicas. Quanto à outras moléculas coestimuladoras, sua estrutura é caracterizada por três domínios: um domínio extracelular para ligar o ligante, um domínio de transmembrana e um domínio intracelular designado B30.2, que está presumivelmente envolvido na regulação das concentrações de superóxido intracelular. Até agora, o(s) ligante(s) de CD277 ainda é(são) desconhecido(s) (revisado em Gu et al., 2015).

[007] Até a data, foram propostas várias estratégias terapêuticas e de vacinas que dependem da modulação de células T; vários anticorpos imunomoduladores para CTLA-4, PD-1 e PD-L1 já foram aprovados para uso clínico por múltiplas agências regulatórias em todo o mundo. Embora esses fármacos representem grandes avanços na terapia do câncer, ainda permanecem necessidades médicas não atendidas para grande parte das populações de pacientes de câncer que não respondem aos tratamentos atualmente disponíveis.

[008] As patentes WO 2012080351 A1, EP2651441A1, EP2946791A1, US20140322235, WO2012080769A1 referem-se a vários anticorpos contra BTN3A capazes de ativar ou inibir a função citolítica, produção de citocinas e proliferação de células T Vγ9 Vδ2. No entanto, esses anticorpos murinos não eram adequados para aplicação terapêutica. De fato, para administração em pacientes humanos, é hoje obrigatório humanizar anticorpos para evitar reações imunogênicas.

[009] A humanização frequentemente requer a modificação de aminoácidos nas regiões de arcabouço sem certeza de manter a potência ao mesmo nível dos anticorpos murinos originais. Isto é especialmente verdadeiro quando se modifica aminoácidos imediatamente adjacentes às regiões CDR (vide, por exemplo, a patente Queen US5,585,089).

[010] Apesar da dificuldade, os inventores selecionaram agora anticorpos humanizados especiais dos mAbs de ativação 7.2, que não só combinam propriedades funcionais mantidas dos anticorpos parentais mAbs 7.2 com imunogenicidade diminuída prevista para humanos, mas também surpreendentemente exibem propriedades de capacidade de desenvolvimento superiores, como um rendimento melhorado na produção de linhagem celular,

uma maior estabilidade térmica em comparação com o anticorpo murino parental e forte resistência a estresse por calor e ácido. Além disso, o anticorpo humanizado mAb1 da presente invenção se liga vantajosamente a Cinomolgo BTN3A e é bem tolerado até doses de 100 mg/kg/semana em primatas Cinomolgo, proporcionando assim um excelente candidato para uso como um fármaco em terapias humanas. Sumário

[011] A presente invenção, portanto, refere-se a um anticorpo anti-BTN3A isolado compreendendo um polipeptídeo VH de cadeia pesada variável da SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo VL de cadeia leve variável da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 3. Esses anticorpos são anticorpos humanizados, em particular com imunogenicidade diminuída prevista em relação ao seu anticorpo murino parental. Esse anticorpo anti-BTN3A isolado se liga ao BTN3A humano. Em particular, se liga ao BTN3A humano com um KD de 10 nM ou menos, preferencialmente com um KD de 5 nM ou menos conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície.

[012] Em modalidades específicas, o referido anticorpo de acordo com a presente invenção induz a ativação de Células T γδ, normalmente Células T Vγ9Vδ2, em co-cultura com células que expressam BTN3, com um EC50 abaixo de 5 μg/mL, preferencialmente de 1 μg/mL ou abaixo, conforme medido em um ensaio de degranulação. Consequentemente, o referido anticorpo induz a morte de células alvo de tumor, independentemente da sua origem nos tecidos.

[013] Em modalidades específicas, o referido anticorpo anti-BTN3A isolado compreende uma região constante de IgG1 mutante ou quimicamente modificada, em que a referida região constante de IgG1 mutante ou quimicamente modificada confere nenhuma ou ligação diminuída a receptores Fcγ quando comparado a um anticorpo correspondente com a região constante de isotipo de IgG1 de tipo selvagem. Normalmente, a referida região constante de IgG1 mutante é IgG1 mutante triplo L247F L248E e P350S. Exemplos do referido anticorpo anti-BTN3A isolado são mAb1 compreendendo uma cadeia pesada da SEQ ID NO:4 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:6, ou mAb2 compreendendo uma cadeia pesada da SEQ ID NO:4 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:7.

[014] Em outras modalidades, o referido anticorpo anti-BTN3A isolado da presente invenção é um anticorpo de formato monovalente, preferencialmente selecionado a partir de anticorpos Fab ou scFv.

[015] O anticorpo anti-BTN3A isolado da presente invenção pode ser usado (i) como um terapêutico ou (ii) como um diagnóstico. Por exemplo, eles são úteis no tratamento de um câncer, por exemplo, um câncer hematológico e, mais especificamente, um linfoma ou leucemia. Em outras modalidades, eles também podem ser usados no tratamento de tumores sólidos e, mais especificamente, câncer de próstata, ovário ou endometrial. Alternativamente, eles podem ser usados no tratamento de distúrbios infecciosos.

[016] A invenção refere-se adicionalmente a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-BTN3A conforme descrito acima, em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável, opcionalmente compreendendo outros princípios ativos.

[017] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma formulação liofilizada, uma seringa pré-preenchida ou um frasco compreendendo um anticorpo anti-BTN3A conforme descrito acima.

[018] A invenção refere-se adicionalmente a um vetor de expressão para a produção recombinante de um anticorpo anti-BTN3A conforme descrito acima em uma célula hospedeira, normalmente uma célula hospedeira de mamífero,

tal como célula hospedeira CHO, compreendendo pelo menos um ácido nucleico que codifica o referido anticorpo anti-BTN3A. Uma modalidade de tal vetor de expressão compreende pelo menos os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves de mAb1, conforme revelado na presente invenção. A célula hospedeira compreendendo tais vetores de expressão também é descrita na presente invenção.

[019] Também é revelado na presente invenção um processo para a produção de um anticorpo anti-BTN3A da presente invenção, compreendendo: (i) cultivar a célula hospedeira conforme definido acima para expressão do referido anticorpo pela célula hospedeira; opcionalmente (ii) purificar o referido anticorpo; (iii) recuperar o anticorpo.

[020] A invenção refere-se adicionalmente a anticorpos multiespecíficos, tais como anticorpos biespecíficos, compreendendo pelo menos um braço compreendendo um Fab ou scFv incluindo o VH e VL dos anticorpos anti-BTN3A conforme definido acima. Descrição Detalhada Definições

[021] A fim de que a presente invenção seja mais prontamente compreendida, certos termos são definidos primeiro. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.

[022] Conforme usado na presente invenção, o termo "BTN3A" tem seu significado geral na técnica. Em modalidades específicas, refere-se a polipeptídeos BTN3A humanos incluindo BTN3A1 da SEQ ID NO:18, BTN3A2 da SEQ ID NO:19 ou BTN3A3 da SEQ ID NO:20.

[023] O termo "anticorpo", conforme usado na presente invenção, refere- se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que se liga de maneira imunoespecífica a um antígeno. Como tal, o termo anticorpo abrange não apenas moléculas de anticorpo inteiras, mas também fragmentos de anticorpos, bem como variantes (incluindo derivados) de anticorpos.

[024] Em anticorpos naturais de roedores e primatas, duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por ligações dissulfeto e cada cadeia pesada está ligada a uma cadeia leve por uma ligação dissulfeto. Existem dois tipos de cadeias leves, lambda (λ) e kappa (κ) existem cinco classes principais de cadeia pesada (ou isotipos) que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadeia contém domínios de sequência distintos. Em anticorpos IgG típicos, a cadeia leve inclui dois domínios, um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). A cadeia pesada inclui quatro domínios, um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3, referidos coletivamente como CH). As regiões variáveis das cadeias leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento de ligação e a especificidade para o antígeno. Os domínios da região constante das cadeias leve (CL) e pesada (CH) conferem propriedades biológicas importantes, como associação da cadeia de anticorpo, secreção, mobilidade transplacentária, ligação de complemento e ligação aos receptores Fc (FcR).

[025] O fragmento Fv é a parte N-terminal do fragmento Fab de uma imunoglobulina e consiste nas porções variáveis de uma cadeia leve e uma cadeia pesada. A especificidade do anticorpo reside na complementaridade estrutural entre o sítio de combinação do anticorpo e o determinante antigênico. Os sítios de combinação de anticorpos são constituídos por resíduos que são principalmente das regiões hipervariáveis ou determinantes de complementaridade (CDRs). Ocasionalmente, os resíduos de regiões não hipervariáveis ou de arcabouço (FR) podem participar no sítio de ligação de anticorpo ou influenciar a estrutura de domínio geral e, portanto, o sítio de combinação. As Regiões Determinantes de Complementaridade ou CDRs referem-se a sequências de aminoácidos que, em conjunto, definem a afinidade de ligação e a especificidade da região Fv natural de um sítio de ligação de imunoglobulina nativa. As cadeias leve e pesada de uma imunoglobulina têm, cada uma, três CDRs, designados L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 e H-CDR1, H-CDR2, H- CDR3, respectivamente. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, inclui normalmente seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDRs de cada uma de uma região V de cadeia pesada e leve. As Regiões De arcabouço (FRs) referem- se à sequências de aminoácidos interpostas entre CDRs. Por conseguinte, as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas normalmente compreendem 4 regiões de arcabouço e 3 CDRs da seguinte sequência: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4.

[026] Os resíduos em domínios variáveis de anticorpo são convencionalmente numerados de acordo com um sistema desenvolvido por Kabat et al. Este sistema é estabelecido em Kabat et al., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, NIH, EUA (Kabat et al., 1992, doravante “Kabat et al.”). Este sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo. As designações de resíduos de Kabat nem sempre correspondem diretamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos nas sequências SEQ ID. A sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos do que na numeração de Kabat estrita correspondendo a um encurtamento de, ou inserção em, um componente estrutural, seja a região determinante de complementaridade (CDR) ou de arcabouço, da estrutura básica de domínio variável. A numeração correta de resíduos de Kabat pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão". As CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão localizadas nos resíduos 31 a 35 (H-CDR1), nos resíduos 50 a 65 (H-CDR2) e nos resíduos 95 a 102 (H-CDR3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As CDRs do domínio variável da cadeia leve estão localizadas nos resíduos 24 a 34 (L-CDR1), nos resíduos 50 a 56 (L-CDR2) e nos resíduos 89 a 97 (L-CDR3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[027] Em modalidades específicas, um anticorpo fornecido na presente invenção é um fragmento de anticorpo e, mais particularmente, qualquer proteína incluindo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo, conforme revelado na presente invenção. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 e diacorpos.

[028] Conforme usado na presente invenção, o termo "especificidade" refere-se à capacidade de um anticorpo se ligar de maneira detectável a um epítopo apresentado em um antígeno, como um BTN3A. Em algumas modalidades, destina-se a se referir a um anticorpo que se liga a BTN3A humano conforme expresso em células de medula de sangue periférico (PBMCs), preferencialmente com um EC50 abaixo de 50 μg/mL e mais preferencialmente abaixo de 10 μg/mL conforme determinado nos Exemplos (vide Tabela 4). Em outras modalidades, se liga a um polipeptídeo recombinante de antígeno com um KD de 100nM ou menos, 10nM ou menos, 1nM ou menos, 100pM ou menos, ou 10pM ou menos, conforme medido por medições de SPR conforme determinado nos Exemplos (vide Tabela 4).

[029] Um anticorpo que "apresenta reação cruzada com um antígeno diferente de BTN3A" se destina a se referir a um anticorpo que se liga a esse antígeno diferente de BTN3A com um KD de 10 nM ou menos, 1 nM ou menos, ou 100 pM ou menos. Um anticorpo que "não apresenta reação cruzada com um antígeno específico" destina-se a se referir a um anticorpo que se liga a esse antígeno, com um KD de 100 nM ou superior, ou um KD de 1 μM ou superior, ou um KD de 10 μM ou superior. Em certas modalidades, tais anticorpos que não apresentam reação cruzada com o antígeno exibem ligação essencialmente indetectável contra essas proteínas em ensaios de ligação padrão. Na modalidade específica, o anticorpo humanizado da presente invenção, por exemplo, mAb1, apresenta reação cruzada com Cinomolgo BTN3A1, BTN3A2 e BTN3A3 da SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23 respectivamente, por exemplo, conforme medido no ensaio Biacore (vide Tabela 21).

[030] Um "anticorpo isolado", conforme usado na presente invenção, refere-se a um anticorpo substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a BTN3A é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos diferentes de BTN3A). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a BTN3A pode, entretanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos, tais como moléculas de BTN3A relacionadas provenientes de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.

[031] O termo "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", conforme usados na presente invenção, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpos de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma única ligação de especificidade e afinidade por um epítopo em particular.

[032] As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo tendo especificidade para um antígeno" são usadas de maneira intercambiável na presente invenção com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

[033] O termo "Kassoc" ou "Ka", conforme usado na presente invenção, destina-se a se referir à taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, ao passo que o termo "Kdis" ou "Kd", conforme usado na presente invenção, destina-se a se referir à taxa de dissociação de uma interação particular anticorpo-antígeno.

[034] O termo "KD", conforme usado na presente invenção, destina-se a referir-se à constante de dissociação, a qual é obtida a partir da razão de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expresso como uma concentração molar (M). Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados usando métodos amplamente estabelecidos na técnica. Um método para determinar o KD de um anticorpo é usando ressonância plasmônica de superfície ou usando um sistema biossensor, tal como um sistema Biacore®.

[035] A especificidade pode ser exibida adicionalmente, por exemplo, por uma razão de cerca de 10:1, cerca de 20:1, cerca de 50:1, cerca de 100:1,

10.000:1 ou superior de afinidade/avidez na ligação ao antígeno específico versus ligação não específica a outras moléculas irrelevantes (neste caso, o antígeno específico é um polipeptídeo BTN3A). O termo "afinidade", conforme usado na presente invenção, significa a força da ligação de um anticorpo a um epítopo.

[036] Conforme usado na presente invenção, o termo "Avidez" refere-se a uma medida informativa da estabilidade ou força geral do complexo anticorpo- antígeno. É controlado por três fatores principais: afinidade do epítopo do anticorpo; a valência do antígeno e do anticorpo; e o arranjo estrutural das partes interagentes. Em última análise, esses fatores definem a especificidade do anticorpo, ou seja, a probabilidade de que o anticorpo particular esteja se ligando a um epítopo de antígeno preciso.

[037] Conforme usado na presente invenção, o termo "anticorpo de ativação" refere-se a um anticorpo capaz de induzir direta ou indiretamente funções imunes de células efetoras. Em particular, conforme usado na presente invenção, um anticorpo anti-BTN3A de ativação tem pelo menos a capacidade de induzir a ativação de células T γδ, normalmente Células T Vγ9Vδ2, em co- cultura com células que expressam BTN3, com um EC50 abaixo de 5 μg/mL, preferencialmente de 1 μg/mL ou menos, conforme medido em um ensaio de degranulação conforme descrito nos Exemplos abaixo.

[038] Conforme usado na presente invenção, o termo "individuo" inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[039] Conforme usado na presente invenção, o termo "otimizado" significa que uma sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos usando códons que são preferidos na célula de produção ou organismo, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeos otimizada é manipulada para reter completamente ou tanto quanto possível a sequência de aminoácidos originalmente codificada pela sequência de nucleotídeos de partida. As sequências de aminoácidos codificadas por sequências de nucleotídeos otimizadas também são referidas como otimizadas.

[040] Conforme usado na presente invenção, a identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100), tendo em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzido para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da identidade percentual entre duas sequências podem ser alcançadas usando um algoritmo matemático, conforme descrito abaixo.

[041] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Alternativamente, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970), que foi incorporado ao programa de GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250 e uma peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[042] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos de nucleotídeos também pode ser determinada usando, por exemplo, algoritmos como o programa BLASTN para sequências de ácido nucleico usando como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, e uma comparação de ambas as fitas. Anticorpos ativadores de anti-BTN3A humanizados recombinantes

[043] Os anticorpos da invenção incluem os anticorpos recombinantes humanizados selecionados mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5, que são estruturalmente caracterizados por suas sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve variáveis e regiões constantes humanas (isotipos), conforme descrito na Tabela 1 abaixo: Tabela 1: Sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve variáveis de mAb1-mAb6

VH VL Região constante de Anticorpo Sequência de Sequência de isotipo aminoácidos aminoácidos SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 lgG1 silencioso mAb1 (VH2 7.2) (Vk1 7.2) L247F/L248E/P350S SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 lgG1 silencioso mAb2 (VH2 7.2) (Vk2 7.2) L247F/L248E/P350S Variante Variante IgG1 silencioso mAb3 humanizada de humanizada de L247F/L248E/P350S

20.1 20.1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 IgG4 S241P/L248E mAb4 (VH2 7.2) (Vk1 7.2) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 IgG4 S241P/L248E mAb5 (VH2 7.2) (Vk2 7.2) mAb6 Igual a mAb3 Igual a mAb3 IgG4 S241P/L248E

[044] mAb3 e mAb6 são anticorpos humanizados de outro anticorpo anti- BTN3A murino parental, referido como mAb 20.1 e descrito em WO2012/080351, para uso como exemplos comparativos.

[045] A sequência de codificação de aminoácido e nucleotídeo correspondente das regiões de isotipos constantes de IgG1, IgG4 e suas versões mutantes de IgG1 L247F/L248E/P350S e IgG4 S241P/L248E usadas para gerar mAb1 a mAb6 são bem conhecidas na técnica (Oganesyan et al, 2008; Reddy et al., 2000). A lisina C-terminal encontrada em IgG pode ser naturalmente clivada e esta modificação não afeta as propriedades do anticorpo; assim, este resíduo pode ser adicionalmente eliminado nos construtos de mAb1 a mAb6.

[046] As cadeias leves e pesadas de comprimento total e as sequências de codificação correspondentes de mAb1, mAb2, mAb4 e mAb 5 são mostradas na

Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Sequências codificantes de DNA de cadeia pesada e leve inteiras Anticorpo Sequência de aminoácidos Sequência de codificação de DNA Cadeia Pesada: SEQ ID NO:4 Cadeia Pesada: SEQ ID NO:8 mAb1 Cadeia Leve: SEQ ID NO:6 Cadeia Leve: SEQ ID NO:10 Cadeia Pesada: SEQ ID NO:4 Cadeia Pesada: SEQ ID NO:8 mAb2 Cadeia Leve: SEQ ID NO:7 Cadeia Leve: SEQ ID NO:11 Cadeia Pesada: SEQ ID NO:5 Cadeia Pesada: SEQ ID NO:9 mAb4 Cadeia Leve: SEQ ID NO:6 Cadeia Leve: SEQ ID NO:10 Cadeia Pesada: SEQ ID NO:5 Cadeia Pesada: SEQ ID NO:9 mAb5 Cadeia Leve: SEQ ID NO:7 Cadeia Leve: SEQ ID NO:11

[047] Exemplos das sequências de aminoácidos dos VH CDR1s (também chamados de HCDR1), VH CDR2s (também chamados de HCDR2), VH CDR3s (também chamados de HCDR1), VL CDR1s (também chamados de LCDR1), VL CDR2s (também chamados de LCDR2), VL CDR3s (também chamado de HCDR3) de alguns anticorpos de acordo com a invenção são mostrados na Tabela 3.

[048] Na Tabela 3, as regiões CDR dos anticorpos da presente invenção são delineadas usando a numeração de Kabat (Kabat et al., 1992, doravante “Kabat et al.”).

[049] Para facilitar a leitura, as regiões de CDR são designadas doravante HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 respectivamente. Tabela 3: Regiões CDR de mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5 e anticorpo mAbs

7.2 murino parental de acordo com a numeração de Kabat Anticorpo HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 original mAb 7.2 mAb1

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID mAb2 NO: 12 NO: 13 NO: 14 NO: 15 NO: 16 NO: 17 mAb4 mAb5

[050] Em uma modalidade específica, o referido anticorpo anti-BTN3A recombinante conforme definido acima tem uma ou mais das seguintes propriedades: (i) se liga a BTN3A com um KD de 10 nM ou menos, preferencialmente com um KD de 1 nM ou menos, conforme medido por SPR, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos abaixo; (ii) Apresenta reação cruzada com o BTN3A de cinomolgo com um KD de 100nM ou menos, preferencialmente com um KD de 10 nM ou menos, conforme medido por SPR, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos abaixo; (iii) se liga a PBMCs humano com um EC50 de 50 μg/mL ou menos, preferencialmente de 10 μg/mL ou menos, conforme medido em um ensaio de citometria de fluxo como descrito nos Exemplos abaixo; (iv) induz a ativação de Células T γδ, normalmente Células T Vγ9Vδ2, em co- cultura com células que expressam BTN3, com um EC50 abaixo de 5 μg/mL, preferencialmente de 1μg/mL ou menos, conforme medido em um ensaio de desgranulação conforme descrito nos Exemplos abaixo.

[051] Em certas modalidades que podem ser combinadas com as modalidades anteriores, um anticorpo fornecido aqui é um fragmento de anticorpo dos anticorpos definidos acima.

[052] Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, unicorpo e fragmentos scFv, diacorpos, domínio único ou nanocorpos e outros fragmentos.

[053] Preferencialmente, é um anticorpo monovalente, como um Fab de fragmentos scFv.

[054] O termo “diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Ao usar um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno.

[055] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpos que compreendem a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, Patente dos EUA Nº 6,248,516 B1).

[056] Os fragmentos de anticorpo podem ser feitos por várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção por células hospedeiras recombinantes conforme descrito na presente invenção.

[057] O anticorpo da presente invenção é um anticorpo humanizado. Normalmente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora tenha pelo menos a mesma afinidade (ou afinidade superior) do anticorpo não humano parental. Em modalidades preferidas, os anticorpos da presente invenção são anticorpos humanizados do anticorpo parental mAb 7.2, conforme revelado em WO2012/080351. Os exemplos comparativos incluem anticorpos humanizados do anticorpo parental mAb 20.1 conforme revelado em WO2012/080351.

[058] Em geral, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais, CDRs, (ou porções dos mesmos) são derivados a partir de um anticorpo não humano, por exemplo, o mAbs 7.2 murino, e FRs (ou porções das mesmas) são derivados a partir das sequências de anticorpo murino com mutações para reduzir a imunogenicidade. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana.

[059] Preferencialmente, o anticorpo recombinante de acordo com a invenção é um anticorpo silencioso humanizado, normalmente um anticorpo IgG1 ou IgG4 silencioso humanizado.

[060] Conforme usado na presente invenção, o termo anticorpo "silencioso" refere-se a um anticorpo que exibe nenhuma ou baixa ligação de FcγR e/ou ligação de C1q conforme medido em ensaios de ligação, tais como aqueles descritos nos Exemplos.

[061] Em uma modalidade, o termo "nenhuma ou baixa ligação de FcγR e/ou C1q" significa que o anticorpo silencioso exibe uma ligação de FcγR e/ou C1q que é pelo menos abaixo de 50%, por exemplo, abaixo de 80% da ligação de FcγR e/ou C1q que é observada com o anticorpo correspondente com o isotipo de IgG1 ou IgG4 humano de tipo selvagem. Arcabouço ou manipulação de Fc

[062] Os anticorpos da invenção incluem modificações feitas nos resíduos de arcabouço dentro de VH e VL, para diminuir a imunogenicidade do anticorpo em comparação com os anticorpos murinos correspondentes mAb 7.2.

[063] Em uma modalidade específica, o anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal humanizado do anticorpo murino parental mAb 7.2, incluindo pelo menos as seguintes mutações de aminoácidos nas regiões de arcabouço de VH: V5Q; V11L; K12V; R66K; S74F; I75S; E81Q; S82AR; R82BS; R83T; D85E; T87S; L108S; e pelo menos as seguintes mutações de aminoácidos nas regiões de arcabouço Vκ: T5N; V15L; R18T; V19I; K42N; A43I; D70G; F73L; Q100G.

[064] Em outra modalidade específica, o anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal humanizado do anticorpo murino parental mAb 7.2,

incluindo pelo menos as seguintes mutações de aminoácidos nas regiões de arcabouço VH em comparação com o mAb 7.2: V5Q; V11L; K12V; R66K; S74F; I75S; E81Q; S82AR; R82BS; R83T; D85E; T87S; L108S; e pelo menos as seguintes mutações de aminoácidos nas regiões de arcabouço Vκ: T5N; V15L; R18T; V19I; K42N; A43I; S63T; D70G; F73L; Q100G.

[065] Além das modificações feitas nas regiões de arcabouço, os anticorpos da invenção podem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, normalmente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação de receptor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno.

[066] Adicionalmente, um anticorpo da invenção pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais frações químicas podem ser anexadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em detalhes adicionais abaixo.

[067] Conforme usado na presente invenção, o termo "região constante de isotipo" ou "região Fc" é usado indistintamente para definir a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a região Fc de sequência nativa e as regiões Fc variantes. A região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida como compreendendo o resíduo de aminoácido da posição C226 ou de P230 até o C-terminalarboxila do anticorpo IgG em que a numeração está de acordo com o sistema de numeração EU. A lisina C-terminal (resíduo K447) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo ou seu códon correspondente deletado nas construções recombinantes. Por conseguinte, uma composição de anticorpos da invenção pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos de K447 removidos, populações de anticorpos com nenhum resíduo de K447 removido e populações de anticorpos tendo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo de K447.

[068] Em uma modalidade específica, a região de dobradiça de CH1 é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Patente dos EUA Nº 5,677,425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[069] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc de modo que o anticorpo tenha a ligação de proteína A Estafilocócica (SpA) prejudicada em relação à ligação de SpA de domínio de dobradiça Fc nativa. Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais na Patente dos EUA Nº 6,165,745 por Ward et al.

[070] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada ao substituir pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retenha a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais nas Patentes dos EUA Nº. 5,624,821 e 5,648,260, ambas por Winter et al.

[071] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha a ligação de C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida ou abolida. Esta abordagem é descrita em detalhes adicionais nas Patentes dos EUA Nº 6,194,551 por Idusogie et al.

[072] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados para, desse modo, alterar a capacidade do anticorpo de corrigir o complemento. Esta abordagem é descrita posteriormente na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

[073] Em outras modalidades, a região Fc é modificada para diminuir a capacidade do anticorpo de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para diminuir a afinidade do anticorpo para um receptor Fcγ ao modificar um ou mais aminoácidos. Esses anticorpos com funções efetoras diminuídas e, em particular, ADCC diminuída incluem anticorpos silenciosos.

[074] Em certas modalidades, o domínio Fc do isotipo IgG1 é usado. Em algumas modalidades específicas, uma variante mutante do fragmento IgG1 Fc é usada, por exemplo, um IgG1 Fc silencioso que reduz ou elimina a capacidade do polipeptídeo de fusão para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para se ligar a um receptor Fcγ.

[075] Em certas modalidades, o domínio Fc do isotipo IgG4 é usado. Em algumas modalidades específicas, uma variante mutante do fragmento IgG4 Fc é usada, por exemplo, um IgG4 Fc silencioso que reduz ou elimina a capacidade do polipeptídeo de fusão para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para se ligar a um receptor Fcγ.

[076] As funções efetoras silenciadas podem ser obtidas por mutação na parte constante Fc dos anticorpos e foram descritas na Técnica (Baudino et al.,

2008; Strohl, 2009). Exemplos de anticorpos IgG1 silenciosos compreendem a variante mutante tripla de IgG1 L247F L248E P350S. Exemplos de anticorpos IgG4 silenciosos compreendem a variante mutante dupla IgG4 S241P L248E.

[077] Em certas modalidades, o domínio Fc é um mutante Fc silencioso que evita a glicosilação na posição 314 do domínio Fc. Por exemplo, o domínio Fc contém uma substituição de aminoácido de asparagina na posição 314. Um exemplo de tal substituição de aminoácidos é a substituição de N314 por uma glicina ou uma alanina.

[078] Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Essas modificações de carboidratos podem ser alcançadas, por exemplo, alterando um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas, que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicolisação de estrutura de região variável para desse modo eliminarem glicolisação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Tal abordagem é descrita adicionalmente nas Patentes dos EUA Nº 5,714,350 e 6,350,861 por Co et al.

[079] Outra modificação dos anticorpos na presente invenção que é contemplada pela presente invenção é a peguilação ou hesilação ou tecnologias relacionadas. Um anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo ou fragmento do mesmo normalmente está reagindo com polietilenoglicol (PEG), tal como um derivado de aldeído ou éster reativo de PEG, nas condições em que um ou mais grupos de PEG se torna anexo ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme usado na presente invenção, o termo "polietilenoglicol" destina-se a englobar qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcoxi- ou ariloxi-polietilenoglicol ou polietilenoglicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Os métodos para peguilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Vide, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

[080] Uma outra possibilidade é uma fusão de pelo menos a região de ligação do antígeno do anticorpo da invenção de proteínas capazes de se ligar às proteínas do soro, tal albumina de soro humano, para aumentar a meia-vida da molécula resultante. Tal abordagem é, por exemplo, descrita em Nygren et al., EP 0 486 525.

[081] Em certas modalidades, a lisina C-terminal comumente presente em domínios constantes de cadeia pesada de IgG humana é manipulada para reduzir a heterogeneidade devido à clivagem desta redução comumente observada durante a fabricação ou armazenamento. Tais modificações não alteram perceptivelmente as funções desejáveis desses anticorpos, enquanto conferem o benefício de estabilidade a essas moléculas. Moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos da invenção

[082] Também são reveladas na presente invenção as moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos anti-BTN3A da presente invenção. Exemplos de sequências de nucleotídeos da cadeia leve e da cadeia pesada variáveis são aquelas que codificam as sequências de aminoácidos de cadeia leve e de cadeia pesada variáveis de qualquer um de mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5, as últimas sequências sendo facilmente derivadas da Tabela 1 e Tabela 2, e usando o código genético e, opcionalmente, levando em consideração o viés de uso de códon dependendo da espécie de célula hospedeira.

[083] A presente invenção também se refere a moléculas de ácido nucleico que derivam das últimas sequências que foram otimizadas para a expressão de proteína em células de mamíferos, por exemplo, linhagens celulares CHO.

[084] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado de células, ou podem ser ácidos nucleicos em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica (Ausubel et al., 1988). Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. Em uma modalidade, o ácido nucleico pode estar presente em um vetor, como um vetor de exibição de fago, ou em um vetor de plasmídeo recombinante.

[085] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando técnicas de biologia molecular padrão. Uma vez que fragmentos de DNA que codificam, por exemplo, segmentos de VH e VL são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ser ainda manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab ou um gene scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH (por exemplo VL e VH conforme definido na Tabela 1) está operacionalmente ligado a outra molécula de DNA ou a um fragmento que codifica outra proteína, como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo

"operacionalmente ligado", conforme utilizado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de uma maneira funcional, por exemplo, de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem no quadro, ou de modo que a proteína seja expressa sob o controle de um promotor desejado.

[086] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ao ligar operacionalmente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (Kabat et al., 1992) e os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada é selecionada entre os isotipos de IgG1, por exemplo, o isotipo de IgG1 humano. Em outras modalidades, a região constante da cadeia pesada é selecionada entre os isotipos de IgG4, por exemplo, o isotipo de IgG4 humano. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operacionalmente ligado a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CH1 de cadeia pesada.

[087] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como em um gene de cadeia leve Fab) ao ligar operacionalmente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante da cadeia leve humana são conhecidas na técnica (Kabat et al., 1992) e os fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.

[088] Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH e VL são operacionalmente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de modo que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexível (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988; McCafferty et al., 1990). Geração de transfectomas produtores de anticorpos monoclonais

[089] Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de genes como é bem conhecido na técnica (Morrison, 1985).

[090] Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, os DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento total podem ser obtidos por biologia molecular padrão ou técnicas de bioquímica (por exemplo, síntese química de DNA, amplificação por PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de modo que os genes sejam operacionalmente ligados a sequências de controle transcricional e translacional. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado a um vetor de modo que as sequências de controle transcricional e translacional dentro do vetor sirvam a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais normalmente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega se nenhum sítio de restrição estiver presente). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos descritos na presente invenção podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpo, inserindo-os em vetores de expressão que já codificam as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve do isotipo desejado, de modo que o segmento VH está operacionalmente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento VL está operacionalmente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modo que o peptídeo sinal seja ligado na estrutura ao terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína não imunoglobulina).

[091] Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinante revelados na presente invenção carregam sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Essas sequências regulatórias são descritas, por exemplo, na publicação de Goeddel (Goeddel, 1990). Será apreciado por técnicos no assunto que o projeto do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. As sequências regulatórias para a expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteínas em células de mamíferos, como promotores e/ou reforçadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o adenovírus principal promotor tardio (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, podem ser utilizadas sequências regulatórias não virais, tais como o promotor de ubiquitina ou o promotor de P-globina. Além disso, elementos reguladores compostos por sequências de diferentes fontes, como o sistema de promotor de SRa, que contém sequências do promotor inicial de SV40 e a longa repetição terminal do vírus da leucemia de células T humanas tipo 1 (Takebe et al., 1988).

[092] Além dos genes de cadeia de anticorpos e sequências regulatórias, os vetores de expressão recombinantes da presente invenção podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, as Patentes dos EUA Nº 4,399,216, 4,634,665 e 5,179,017, todas por Axel et al.). Por exemplo, normalmente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis incluem o gene diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

[093] Para a expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) de expressão que codificam as cadeias pesadas e leves são transfectados em uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e semelhantes. É teoricamente possível expressar os anticorpos da presente invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. A expressão de anticorpos em células eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, leveduras ou fungos filamentosos, é discutida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamíferos, são mais propensas do que células procarióticas a montar e secretar um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo.

[094] Em uma modalidade específica, um vetor de clonagem ou expressão de acordo com a invenção compreende uma das sequências de codificação das cadeias pesadas e leves de qualquer um de mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5 operacionalmente ligado a sequências promotoras adequadas.

[095] Células hospedeiras de mamífero para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO), incluindo células dhfr- CHO (descritas em Urlaub e Chasin, 1980) usadas com um marcador selecionável de DHFR (conforme descrito em Kaufman e Sharp, 1982), linhagens celulares CHOK1 dhfr+, células de mieloma NSO, células COS e células SP2, por exemplo linhagens celulares GS CHO juntamente com o sistema de expressão de gene GS XceedTM (Lonza). Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos ao cultivar as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para a expressão do anticorpo nas células hospedeiras e, opcionalmente, secreção do anticorpo para o meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados e purificados, por exemplo, a partir do meio de cultura após sua secreção, usando métodos de purificação de proteínas padrão (Shukla et al.,

2007).

[096] Em uma modalidade específica, a célula hospedeira da invenção é uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão tendo as sequências de codificação adequadas para a expressão de mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5, respectivamente, operacionalmente ligado a sequências promotoras adequadas.

[097] Por exemplo, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo pelo menos os ácidos nucleicos da SEQ ID NO:8 e 10 que codificam respectivamente as cadeias pesada e leve de mAb1.

[098] As últimas células hospedeiras podem então ser cultivadas adicionalmente em condições adequadas para a expressão e produção de um anticorpo da invenção selecionado a partir do grupo que consiste em mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5, respectivamente.

[099] Alternativamente, os sistemas de expressão livre de células podem ser usados para a produção de qualquer um de mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5. Tipicamente, os métodos de expressão sem células de proteínas ou anticorpos já estão descritos (Stech et al., 2017). Imunoconjugados

[0100] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta um anticorpo anti-BTN3A conforme revelado na presente invenção, ou um fragmento do mesmo, conjugado a uma fração terapêutica, como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Esses conjugados são referidos na presente invenção como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para (por exemplo, mata) células. Os exemplos incluem táxon, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina,

vinblastina, t. colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Os agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de ablação (por exemplo, mecloretamina, tioepa cloraxnbucil, meifalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina, antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) bleaomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), monometil auristatina E e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[0101] As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da presente invenção usando tecnologia de ligante disponível na técnica. Exemplos de tipos de ligantes que foram usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, mas não estão limitados a hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e ligantes contendo peptídeo, tais como ligante valina-citrulina. Um ligante pode ser escolhido que é, por exemplo, suscetível à clivagem por baixo pH dentro do compartimento lisossomal ou suscetível à clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas em tecido tumoral, como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).

[0102] Para uma discussão adicional sobre os tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugar agentes terapêuticos a anticorpos, vide também Panowski et al., 2013 para uma revisão sobre conjugados de fármacos de anticorpos.

[0103] Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados a um isótopo radioativo para gerar radiofármacos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para uso em diagnóstico ou terapeuticamente incluem, mas não estão limitados a iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. O método para a preparação de radioimunconjugados é estabelecido na técnica. Moléculas biespecíficas ou multiespecíficas

[0104] Em outro aspecto, é revelado adicionalmente na presente invenção moléculas biespecíficas ou multiespecíficas compreendendo um anticorpo anti- BTN3A da presente invenção. Um anticorpo pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação diferentes ou moléculas alvo. O anticorpo pode de fato ser derivatizado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas também se destinam a ser abrangidas pelo termo "molécula biespecífica" como usado na presente invenção. Para criar uma molécula biespecífica, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que resulta uma molécula biespecífica.

[0105] Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para BTN3A, por exemplo, uma porção de ligação ao antígeno de qualquer um de mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo.

[0106] Além disso, para a modalidade em que a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode incluir adicionalmente uma terceira especificidade de ligação, além do primeiro e segundo epítopos alvo.

[0107] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas conforme reveladas na presente invenção compreendem como especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, unicorpo ou uma cadeia única Fv. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou um construto de cadeia única, conforme descrito em Ladner et al. Patente dos EUA Nº 4,946,778.

[0108] Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas reveladas na presente invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

[0109] As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por meio da conjugação das especificidades de ligação do constituinte, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, em seguida, conjugada entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação podem ser usados para a conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil- tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o- fenilenodimaleimida (oPDM), N- succinimidil-3- (2-piridilditio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohaxano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (Karpovsky et al., 1984; Liu et al., 1985). Outros métodos incluem aqueles descritos em Brennan et al., 1985; Glennie et al., 1987; Paulus, 1985.

[0110] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F (ab')2 ou ligante x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação.

[0111] A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento e apoptose) ou ensaio de Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteína-anticorpo de interesse particular ao empregar um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

[0112] Os anticorpos da presente invenção também podem ser usados para preparar o receptor de células T artificiais (também conhecido como receptores de células T quiméricos ou receptores de antígenos quiméricos (CARs)). Por exemplo, as regiões variáveis de anticorpos podem ser usadas para formar um Fab ou scFv que está ligado por meio de um espaçador a um domínio transmembranar (normalmente o domínio transmembranar de CD8 alfa) e um endodomínio de sinalização de um TCR (por exemplo CD3 zeta), e, opcionalmente, um domínio de sinalização coestimulador (por exemplo de 4- 1BB ou CD28) e pode ser produzido na superfície das células T. Tais CARs podem ser usados na terapia de transferência adotiva, por exemplo, para tratar distúrbios proliferativos. Composições Farmacêuticas

[0113] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição,

por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos revelados na presente invenção, por exemplo, um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5 ou suas porções de ligação ao antígeno, formuladas juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas conforme descrito acima.

[0114] As composições farmacêuticas reveladas na presente invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-BTN3A da presente invenção, por exemplo, um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5 ou suas porções de ligação ao antígeno, combinado com pelo menos um antiviral, anti-inflamatório ou outro agente antiproliferativo. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação são descritos em mais detalhes abaixo na seção sobre os usos dos anticorpos da invenção.

[0115] Conforme usado na presente invenção, "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. O carreador deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Em uma modalidade, o carreador deve ser adequado para via subcutânea ou injeção intratumoral. Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido com um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[0116] A solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um carreador farmaceuticamente aceitável. Outros carreadores adequados são bem conhecidos aos técnicos no assunto. (Remington e Gennaro, 1995) As formulações podem incluir adicionalmente um ou mais excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albumina para evitar a perda de proteína nas superfícies dos frascos, etc.

[0117] A forma das composições farmacêuticas, a via de administração, a dosagem e o regime dependem naturalmente da condição a ser tratada, da gravidade da doença, da idade, peso e sexo do paciente, etc.

[0118] As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para administração tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intraocular e semelhantes.

[0119] Preferencialmente, as composições farmacêuticas contêm veículos, que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação capaz de ser injetada. Estas podem ser em particular soluções salinas isotônicas e estéreis (fosfato monossódico ou dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e semelhantes ou misturas de tais sais), ou composições secas, especialmente liofilizadas que após adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou soro fisiológico, permite a constituição de soluções injetáveis.

[0120] As doses utilizadas para a administração podem ser adaptadas em função de vários parâmetros e, em particular, como uma função do modo de administração utilizado, da patologia relevante ou, alternativamente, da duração desejada do tratamento.

[0121] Para preparar composições farmacêuticas, uma quantidade eficaz do anticorpo pode ser dissolvida ou dispersa em um carreador farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso.

[0122] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis; formulações incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propilenoglicol aquoso; e pós estéreis ou liofilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e flexível na medida em que siringabilidade fácil existe. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos.

[0123] Soluções dos compostos ativos como sais de base ou farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água devidamente misturada com um surfactante, tais como hidroxipropilcelulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições normais de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de micro- organismos.

[0124] Um anticorpo da invenção pode ser formulado em uma composição em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos de aminoácidos livres da proteína) e os quais são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, clorídrico ou ácidos fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico e afins. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e afins.

[0125] O carreador também pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol,

propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e afins), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção dos tamanhos de partículas requeridos em caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e afins. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes de atraso da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0126] Soluções injetáveis estéreis são preparadas, incorporando os compostos ativos na quantidade exigida no solvente apropriada com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização do filtrado. Em geral, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são técnicas de secagem a vácuo e liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução esterilizada previamente filtrada dos mesmos.

[0127] A preparação de soluções mais, ou altamente concentradas para injeção direta também é contemplada, onde o uso de DMSO como solvente é visionado para resultar em penetração extremamente rápida, oferecendo altas concentrações dos agentes ativos para uma área de tumor pequena.

[0128] Sobre formulação, soluções serão administradas de forma compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que é terapeuticamente eficaz. As formulações são administradas facilmente em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descrito acima, mas as cápsulas de liberação de fármaco e afins pode também ser empregados.

[0129] Para a administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, caso necessário, e o líquido diluente processado primeiro isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração por via intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Nesta conexão, meios aquosos estéreis, os quais podem ser empregados serão conhecidos aos técnicos no assunto à luz da presente invenção. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em 1 mL de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 mL de fluido hipodermoclise ou injetada no sítio da infusão, proposto (vide, por exemplo, "Remington Pharmaceutical Sciences" 15ª edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá, necessariamente, dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. O responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a dose adequada para o indivíduo.

[0130] Os anticorpos da invenção podem ser formulados dentro de uma mistura terapêutica para compreender cerca de 0,0001 a 1,0 miligramas, cerca de 0,001 a 0,1 miligramas, cerca de 0,1 a 1,0 ou mesmo 1,0 a cerca de 10 miligramas por dose. Também podem ser administradas doses múltiplas.

[0131] A formulação adequada para solução para infusão ou injeção subcutânea de anticorpos foi descrita na técnica e, por exemplo, é revisada em Cui et al (Drug Dev Ind Pharm 2017, 43 (4): 519-530)

[0132] Além dos compostos formulados para administração parenteral, tais como a injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral; cápsulas de liberação por tempo; e qualquer outra forma usada atualmente.

[0133] Em certas modalidades, o uso de lipossomas e/ou nanopartículas é contemplado para a introdução de anticorpos nas células hospedeiras. A formação e o uso de lipossomas e/ou nanopartículas são conhecidos por técnicos no assunto.

[0134] Nanocápsulas, em geral, podem sequestrar compostos de forma estável e reprodutível. Para evitar efeitos colaterais devido a sobrecarga intracelular de polímeros, tais partículas ultrafinas (tamanho em torno de 0,1 µm) geralmente são projetadas usando polímeros capazes de serem degradado in vivo. Nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis que atendem a esses requisitos são contempladas para uso na presente invenção e tais partículas podem ser facilmente feitas.

[0135] Lipossomas são formados a partir de fosfolipídios que são dispersos em um meio aquoso e espontaneamente formam vesículas multilamelares de bicamada concêntricas (também denominadas vesículas multilamelares (MLVs)). MLVs, em geral, têm diâmetros de 25 nm a 4 µm. Sonicação de MLVs resulta na formação de vesículas pequenas unilamelares (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 Å, contendo uma solução aquosa no núcleo. As características físicas de lipossomas dependem de pH, força iônica e presença de cátions divalentes. Usos e métodos dos anticorpos da invenção

[0136] Os anticorpos da presente invenção têm utilidades diagnósticas e terapêuticas in vitro e in vivo. Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas a células em cultura, por exemplo in vitro, ex vivo ou in vivo, ou em um indivíduo, por exemplo in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios.

[0137] Conforme usado na presente invenção, o termo “tratar”, “tratando” ou “tratamento” refere-se a um ou mais de (1) inibir a doença; por exemplo, inibir uma doença, condição ou distúrbio em um indivíduo que está experimentando ou exibindo a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, interromper o desenvolvimento adicional da patologia e/ou sintomatologia); e (2) melhorar a doença; por exemplo, melhorar uma doença, condição ou distúrbio em um indivíduo que está experimentando ou exibindo a patologia ou sintomatologia da doença, condição ou distúrbio (isto é, reverter a patologia e/ou sintomatologia), como diminuir a gravidade da doença ou reduzir ou aliviar um ou mais sintomas da doença. Em particular, com referência ao tratamento de um tumor, o termo "tratamento" pode se referir à inibição do crescimento do tumor ou à redução do tamanho do tumor.

[0138] Os anticorpos da invenção são anticorpos ativadores anti-BTN3A e podem ativar a função citolítica, produção de citocinas e/ou proliferação de células T Vγ9 Vδ2 e, assim, podem ser usados para superar os mecanismos imunossupressores observados em pacientes com câncer e durante infecções crônicas.

[0139] Conforme usado na presente invenção, os termos "câncer", "hiperproliferativo" e "neoplásico" referem-se a células tendo capacidade para crescimento autónomo, isto é, um estado ou condição anormal caracterizada por crescimento celular em proliferação rápida. Os estados de doença hiperproliferativos e neoplásicos podem ser categorizados como patológicos, isto é, caracterizando ou constituindo um estado de doença, ou podem ser categorizados como não patológicos, isto é, um desvio do normal, mas não associado a um estado de doença. O termo pretende incluir todos os tipos de crescimentos cancerosos ou processos oncogênicos, tecidos metastáticos ou células, tecidos ou órgãos transformados de forma maligna, independentemente do tipo histopatológico ou estágio de invasão.

[0140] Os termos "câncer" ou "neoplasias" incluem malignidades de vários sistemas de órgãos, como afetando o pulmão, mama, tireoide, linfoide, trato gastrointestinal e genito-urinário, bem como adenocarcinomas que incluem malignidades, como a maioria dos cânceres de cólon, carcinoma renal-celular, câncer de próstata e/ou tumores testiculares, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer do intestino delgado e câncer do esôfago.

[0141] Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a malignidades hematológicas, tais como neoplasia linfoide de células B, neoplasia linfoide de células T, linfoma não Hodgkin (NHL), B-NHL, T-NHL, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de células do manto (MCL), neoplasia linfoide de células NK e neoplasia de linhagem de células mieloides incluindo leucemia mieloide aguda.

[0142] Exemplos de cânceres não hematológicos incluem, mas não estão limitados a câncer de cólon, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cérebro, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer ósseo, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer oral, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer de rim, câncer de estômago, câncer de testículo e câncer de pele.

[0143] Exemplos de infecções crônicas incluem, mas não estão limitados a infecções virais, bacterianas, parasitárias ou fúngicas, como hepatite crônica, infecções pulmonares, infecções do trato respiratório inferior, bronquite, gripe, pneumonia e doenças sexualmente transmissíveis.

[0144] Exemplos de infecções virais incluem, mas não estão limitados a, hepatite (HAV, HBV, HCV), herpes simplex (HSV), herpes zoster, HPV, influenza

(gripe), AIDS e complexo relacionado à AIDS, catapora (varicela), resfriado comum, infecção por citomegalovírus (CMV), varíola (varíola), febre do carrapato do Colorado, dengue, febre hemorrágica ebola, doença de mão, pé e boca, febre de lassa, sarampo, febre hemorrágica de marburg, mononucleose infecciosa, caxumba, norovírus, poliomielite, leucencefalopatia multifocal progressiva (PML), raiva, rubéola, SARS, encefalite viral, gastroenterite viral, meningite viral, pneumonia viral, doença do Nilo Ocidental e febre amarela. Exemplos de infecções bacterianas incluem, mas não estão limitados a pneumonia, meningite bacteriana, cólera, difteria, tuberculose, antraz, botulismo, brucelose, campilobacteriose, tifo, gonorréia, listeriose, doença de Lyme, febre reumática, coqueluche (tosse convulsa), peste, salmonelose, escarlatina, shigelose, sífilis, tétano, tracoma, tularemia, febre tifóide e infecções do trato urinário. Os exemplos também incluem infecções bacterianas causadas por Coxiella burnetii, Brucella abortus, Tropheryma whipplei, Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium canettii.

[0145] Exemplos de infecções parasitárias incluem, mas não estão limitados a malária, leishmaniose, tripanossomíase, doença de chagas, criptosporidiose, fasciolíase, filariose, infecções amebianas, giardíase, enterobíase, esquistossomose, teníase, toxoplasmose, triquinelose e tripanossomose. Exemplos de infecções fúngicas incluem, mas não estão limitados a candidíase, aspergilose, coccidioidomicose, criptococose, histoplasmose e tinea pedis.

[0146] Por conseguinte, a invenção refere-se a um método para tratar um dos distúrbios revelados acima, em um indivíduo em necessidade do mesmo, o referido método compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpos anti-BTN3A conforme revelado acima, normalmente, um de mAb1, mAb2, mAb4 ou mAb5.

[0147] Em certas modalidades, o referido indivíduo foi selecionado entre pacientes com tumores que expressam BTN3A.

[0148] Os anticorpos para uso conforme revelado acima podem ser administrados como o único princípio ativo ou em conjunto com, por exemplo, como um adjuvante ou em combinação com outros fármacos, por exemplo, citocinas, antivirais, agentes anti-inflamatórios ou citotóxicos, anti- proliferativos, quimioterapia ou agentes antitumorais, produto de terapia celular (por exemplo composição de célula T γδ), por exemplo, para o tratamento ou prevenção das doenças mencionadas acima.

[0149] Por exemplo, os anticorpos para uso conforme revelado acima podem ser usados em combinação com terapia celular, em particular terapia de célula T γδ, quimioterapia, agentes antineoplásicos ou agentes imunoterapêuticos.

[0150] Conforme usado na presente invenção, o termo "terapia celular" refere-se a uma terapia que compreende a administração in vivo de pelo menos uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição celular a um indivíduo em necessidade da mesma. As células administradas ao paciente podem ser alogênicas ou autólogas. O termo “terapia de células T γδ” refere-se a uma terapia de células em que a composição de células inclui, como princípio ativo, células T γδ, em particular células T Vγ9/Vδ2.

[0151] Um produto de terapia celular refere-se à composição celular que é administrada ao referido paciente para fins terapêuticos. O referido produto de terapia celular inclui uma dose terapeuticamente eficaz de células e, opcionalmente, excipientes adicionais, adjuvantes ou outros carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[0152] Agentes antineoplásicos adequados podem incluir, sem limitação, agentes alquilantes (tais como ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucila,

melfalano, nitrosuréias, temozolomida), antraciclinas (tais como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrúbica, idarubicina, mitoxantrona, valrubicina), taxanos (tais como Paclitaxel, Docetaxel) epotilonas, inibidores da Topoisomerase I (tais como Irinotecan ou Topotecan), inibidores de Topoisomerase II (tais como Etoposídeo, Tenipósido ou Tafluposídeo), análogos de nucleotídeos e análogos de precursores (tais como azacitidina, azatioprina, capecitabina, citarabina, fluoracil, gemcitabina, hidroxiureia, mercaptopurina, metotrexato ou Tioguanina), antibióticos peptídicos (tais como carboplatina, cisplatina e oxaliplatina), retinoides (tais como tretinoína, alitretinoína, bexaroteno), alcalóides de vinca e derivados (tais como vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), terapias direcionadas, tais como inibidores de quinase (tais como Ibrutinibe, Idelalisibe, Erlotinibe, Gefitinibe, Imatinibe, Vemurafenibe, Vismodegibe), inibidores de proteassoma (tais como bortezomibe, carfilzomibe), inibidores de histona desacetilase (tais como Vorinostat ou Romidepsin).

[0153] Exemplos de agentes imunoterapêuticos incluem, sem limitação, fosfoantígenos (por exemplo, ácido zoledrônico ou outros bifosfonatos), anticorpos anti-PD-1, anticorpos anti-PD-L1, anticorpos anti-BTLA, anticorpos anti-CTLA-4 e citocinas (como a interleucina 2 (IL-2) (Choudhry H et al., 2018, Biomed Res Int. 2018 6 de maio), interleucina 15 (IL-15) (Patidar M et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2016 Out; 31: 49-59), interleucina 21 (IL-21) (Caccamo N. et al., PLoS One. 2012; 7(7): e41940), ou interleucina 33 (IL-33) (Duault C et al., J Immunol. 2016 Jan 1; 196(1):493-502)), ou suas formas recombinantes e seus derivados, ou quaisquer citocinas capazes de induzir a atividade de linfócitos (por exemplo, proliferação ou produção de citocinas ou alterações metabólicas). O termo derivado é usado para quaisquer modificações de citocinas que podem contar com PEGuilação (por exemplo, conjugação com cadeias de polietilenoglicol (PEG)), mutação, como deleção de aminoácidos,

substituição ou inserção, ou associação com agentes potencializadores (por exemplo, complexos IL15/IL15Ra fundidos a um IgG1 Fc, em que IL-15 está adicionalmente mutado (asn72asp) que aumenta adicionalmente a atividade biológica, tornando este complexo um superagonista IL-2 e IL-15Rβγ (Rhode PR et al, Cancer Immunol Res. 2016; 4 (1): 49-60)) (Barroso-Sousa R et al, Curr Oncol Rep. 15 de novembro de 2018; 21 (1): 1).

[0154] O termo “IL-2” tem seu significado geral e refere-se à interleucina-2 humana. A IL-2 faz parte da resposta imunológica natural do corpo. A IL-2 regula principalmente a atividade dos linfócitos pela ligação aos receptores de IL-2.

[0155] O termo “IL-15” tem seu significado geral e refere-se à interleucina- 15 humana. Como a IL-2, a IL-15 se liga a e sinaliza através de um complexo composto pela cadeia beta de receptor IL-2/IL-15 (CD122) e a cadeia gama comum (gama-C, CD132). A IL-15 regula a ativação e proliferação de células T e células natural killer (NK).

[0156] O termo “IL-21” tem seu significado geral e refere-se à interleucina- 21 humana. A IL-21 foi atribuída a propriedades pleiotrópicas, incluindo, mas não se limitando a, aumento da citotoxicidade das células NK e das células T CD8+, modulação da diferenciação das células plasmáticas e inibição das células Treg.

[0157] O termo “IL-33” tem seu significado geral e refere-se à interleucina- 33 humana. A IL-33, considerada uma alarmina liberada mediante a estresse ou dano tecidual, é membro da família da IL-1 e se liga ao receptor ST2. A IL-33 é conhecida como um estimulador eficaz das células imunes TH1, células natural killer (NK), células iNKT e linfócitos T CD8.

[0158] O termo "PD-1" tem seu significado geral na técnica e refere-se ao receptor de morte programada-1. O termo "PD-1" também refere-se a uma proteína transmembranar tipo I, pertencente à família de receptores de sinalização CD28-B7 que inclui CD28, antígeno associado a linfócitos T citotóxicos

4 (CTLA-4), coestimulador induzível (ICOS), e atenuador de linfócitos B e T (BTLA) (Greenwald RJ et al., 2005, Riley JL et al., 2005).

[0159] O termo "BTLA" tem seu significado geral na técnica e refere-se a atenuador de linfócitos B e T. O termo "BTLA" também refere-se a CD272, um membro da família de receptores de sinalização CD28-B7 que inclui CD28, antígeno associado a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4), coestimulador induzível (ICOS) e receptor de morte programada-1 (PD-1) (Greenwald RJ et al., 2005, Riley JL et al., 2005).

[0160] O termo "anticorpo anti-PD-1" ou "anti-PD-L1" tem seu significado geral na técnica e refere-se a um anticorpo com afinidade de ligação para PD-1 ou PD-L1, respectivamente, e atividade antagonista para PD-1, isto é, ele inibe a cascata de transdução de sinal relacionada ao PD-1 e inibe a ligação do ligante PD-1 (PD-L1; PD-L2). Tal anticorpo anti-PD-1 ou anticorpo anti-PD-L1 inativa preferencialmente PD-1 com uma maior afinidade e potência, respectivamente, do que sua interação com os outros subtipos ou isoformas da família de receptores de sinalização CD28-B7 (CD28; CTLA-4; ICOS; BTLA). Os testes e ensaios para determinar se um composto é um antagonista de PD-1 são bem conhecidos pelos técnicos no assunto, como descrito em Greenwald et al., 2005; Riley et al., 2005.

[0161] Exemplos de tal anticorpo anti-PD1 ou anti-PDL1 incluem, sem limitação, nivolumabe, pembrolizumabe, avelumabe, durvalumabe, cemiplimabe ou atezolizumabe.

[0162] Exemplos de tal anticorpo anti-CTLA4 incluem, sem limitação, ipilimumabe.

[0163] O termo "anticorpos anti-BTLA" tem seu significado geral na técnica e refere-se a anticorpos que possuem afinidade de ligação e atividade antagonista ao BTLA, isto é, podem inibir a cascata de transdução de sinal relacionada ao BTLA. Os testes e ensaios para determinar se um composto é um antagonista de BTLA são bem conhecidos pelo técnico no assunto, tal como descrito em (Greenwald et al., 2005; Riley et al., 2005).

[0164] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-BTLA são selecionados a partir daqueles descritos no Pedido de Patente Internacional WO2010/106051; WO2011/014438; WO2017/144668.

[0165] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BTLA é o anticorpo BTLA (BTLA8.2) que pode ser obtido a partir do hibridoma acessível sob o número de depósito CNCM I-4123, conforme revelado em WO2010/106051.

[0166] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BTLA é o mAb 4C7 revelado em WO2011/014438.

[0167] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-BTLA é o mAb 629.3 mAb revelado em WO2017/144668, ou sua versão humanizada ou variante do mesmo.

[0168] De acordo com o que precede, a presente invenção fornece ainda um aspecto adicional:

[0169] Um método, conforme definido acima, compreendendo a coadministração, por exemplo, concomitantemente ou em sequência, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-BTN3A da invenção, e pelo menos um segundo fármaco, o referido segundo fármaco sendo um agente antiviral ou antiproliferativo ou agentes imunoterapêuticos (como anticorpos anti-PD-1, anti-PD-L1) ou citocinas, por exemplo, IL-2 ou IL-15, ou um produto de terapia celular (como células T γδ), por exemplo conforme indicado acima.

[0170] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar níveis de BTN3A solúvel ou níveis de células que expressam BTN3A. Isso pode ser alcançado, por exemplo, ao contatar uma amostra (tal como uma amostra in vitro) e uma amostra de controle com o anticorpo anti-BTN3A sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e BTN3A (conforme expresso na superfície das células ou BTN3A solúvel, por exemplo, em uma amostra de sangue). Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e BTN3A são detectados e comparados na amostra e no controle. Por exemplo, métodos de detecção padrão, bem conhecidos na técnica, tais como ELISA e ensaios de citometria de fluxo, podem ser realizados usando as composições da invenção.

[0171] Por conseguinte, em um aspecto, a invenção fornece adicionalmente métodos para detectar a presença de BTN3A (por exemplo, antígeno BTN3A humano) em uma amostra, ou medir a quantidade de BTN3A, compreendendo o contato da amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo ou proteína da invenção, ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a BTN3A, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e BTN3A. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação do complexo entre a amostra em comparação com a amostra de controle é indicativa da presença de BTN3A na amostra.

[0172] Também dentro do escopo da presente invenção estão os kits que consistem nas composições (por exemplo, anticorpos humanizados, anticorpos conjugados e moléculas multiespecíficas) revelados na presente invenção e instruções de uso. O kit pode conter adicionalmente pelo menos um reagente adicional ou um ou mais anticorpos ou proteínas adicionais. Os kits tipicamente incluem um rótulo indicando o uso pretendido do conteúdo do kit. O termo rótulo inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido com o kit ou que de outra forma acompanha o kit. O kit pode compreender, adicionalmente, ferramentas para diagnosticar se um paciente pertence a um grupo que responderá a um tratamento de anticorpo anti-BTN3A, conforme definido acima.

[0173] Outra estratégia terapêutica é baseada na utilização dos anticorpos humanizados revelados na presente invenção como agentes que expandem e/ou ativam seletivamente células T Vγ9 Vδ2 isoladas de uma amostra de um indivíduo humano.

[0174] A invenção, portanto, refere-se a um método para tratar um indivíduo em necessidade da mesma, compreendendo: a) isolar células sanguíneas compreendendo células T Vγ9 Vδ2, por exemplo PBMCs de uma amostra de sangue de um indivíduo, b) expandir células T Vγ9 Vδ2 in vitro na presença de qualquer um dos mAbs 1, 2, 4 e 5 e, opcionalmente, outro tumor ou células acessórias, c) coletar as células T Vγ9 Vδ2 expandidas, d) opcionalmente, formular as células T Vγ9 Vδ2 expandidas e administrar uma quantidade terapeuticamente eficiente das referidas células T Vγ9 Vδ2 ao indivíduo.

[0175] A invenção refere-se adicionalmente ao uso dos anticorpos humanizados revelados na presente invenção (tais como mAb1, mAb2, mAb4 ou mAb5) como agentes que expandem seletivamente as células T Vγ9 Vδ2 do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR). Células T γδ CAR e seu uso na imunoterapia de câncer de células T adotivas são descritos, por exemplo, em Mirzaei et al (Cancer Lett 2016, 380 (2): 413-423).

[0176] A invenção também se refere aos anticorpos anti-BTN3A para uso in vivo como agente potencializador de células tumorais em uma terapia com células T γδ em um indivíduo em necessidade da mesma, normalmente sofrendo de câncer.

[0177] Conforme usado na presente invenção, o termo terapia com células T γδ refere-se a uma terapia que compreende a administração a um indivíduo em necessidade de pelo menos uma quantidade eficaz de células T γδ. Tais células T γδ podem ser alogênicas ou autólogas. Em modalidades específicas, as células T γδ podem ser geneticamente manipuladas por deleção ou knock-out ou inserção ou knock-in de genes específicos. Em modalidades específicas, as referidas células T γδ incluem células T γδ que expressam receptor de antígeno quimérico. As células T γδ podem ter sido expandidas e/ou purificadas ex vivo. Alternativamente, as células T γδ também podem estar compreendidas em uma composição de célula compreendendo outras células sanguíneas e, por exemplo, outras células do sistema imunológico. Para referências sobre terapia com células T γδ, vide Pauza CD. et al., Front Immunol. 8 de junho de 2018; 9: 1305. doi: 10.3389, Saudemont A. et al, Front Immunol. 5 de fevereiro de 2018; 9: 153. doi: 10.3389.

[0178] De fato, sem estar vinculado por qualquer teoria particular, um modo de ação proposto dos anticorpos anti-BTN3A da presente invenção é que sua ligação a BTN3A expressa na superfície de uma célula tumoral desencadeia uma mudança conformacional que permite sua sinalização para seu contador- receptor em células T Vγ9Vδ2.

[0179] A invenção, portanto, refere-se a um método de tratamento de um indivíduo que sofre de câncer, por exemplo, malignidades hematológicas, em particular, leucemias, como leucemia mieloide aguda, e tendo células tumorais, por exemplo células tumorais do sangue, o referido método compreendendo: (i) administrar no referido indivíduo uma quantidade eficaz de anticorpos anti-BTN3A conforme revelado na presente invenção, normalmente mAb1, mAb2, mAb4 ou mAb5, e, (ii) administrar uma quantidade eficaz de composição de células T γδ no referido indivíduo, em que a referida quantidade eficaz de anticorpos anti-BTN3A tem a capacidade de potenciar a citólise antitumoral mediada pela referida composição de célula T γδ contra as referidas células tumorais.

[0180] A invenção refere-se ainda a um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer com células de tumor sólido, por exemplo, células de câncer de ovário, o referido método compreendendo: (i) administrar no referido indivíduo uma quantidade eficaz de anticorpos anti-BTN3A conforme revelado na presente invenção, normalmente mAb1, mAb2, mAb4 ou mAb5, e, (ii) administrar uma quantidade eficaz de composição de células T γδ no referido indivíduo, em que a referida quantidade eficaz de anticorpos anti-BTN3A tem a capacidade de potenciar a citólise antitumoral mediada pela referida composição de célula T γδ contra as referidas células tumorais.

[0181] A invenção também se refere a um método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo, o referido método compreendendo a administração combinada (simultânea ou sequencial) de células T CAR, por exemplo células T γδ CAR, e um anticorpo humanizado conforme revelado na presente invenção (tal como mAb1, mAb2, mAb4 ou mAb5).

[0182] A invenção que foi totalmente descrita é agora ilustrada pelos seguintes exemplos, os quais são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. Descrição das Figuras

[0183] Figura 1: A. Células T Vγ9Vδ2 humanas expandidas de PBMCs foram co-cultivadas com linhagem celular Daudi (linfoma de Burkitt) na razão E:T 1:1 com as concentrações indicadas de mAb1 (ou o controle de isotipo correspondente) durante 4 horas. As células foram coradas com anticorpos para CD107a e CD107b e as portas para expressão positiva foram baseadas em controles não estimulados. A experiência foi realizada com 3 doadores saudáveis. B. As células Daudi foram pré-incubadas durante 1 hora a 37°C com as concentrações indicadas de mAb1 (ou o controle de isotipo correspondente). Após lavagens extensas, células Daudi pulsadas com mAb foram co-cultivadas durante 4 horas com células T Vγ9Vδ2 humanas expandidas a 37 °C antes de medir a atividade da Caspase 3/7 em Daudi. Para A e B, o ajuste das curvas foi obtido usando a equação sigmoidal 4PL do software GraphPad Prism. C. O mesmo protocolo foi usado conforme descrito anteriormente em (A) e (B) para avaliar a eficácia mAb1 (e o controle de isotipo correspondente) usado a 10 µg/mL em outras linhagens celulares tumorais (L-IPC: Adenocarcinoma Ductal Pancreático, HT29: Adenocarcinoma colorretal, A549: Carcinoma de pulmão) em comparação com a linhagem celular de Daudi.

[0184] Figura 2: mAb1 medeia BTN3A expressando morte de células alvo por células T V9V2. A. 10.000 células HL60-WT ou BTN3AKO (leucemia mieloide aguda) foram co-cultivadas 24 horas com células T Vγ9Vδ2 expandidas in-vitro (razão E:T 1:1) na presença de concentração crescente de mAb1 (ou hIgG1 de controle de isotipo relevante) +/- rHuIL-2 (20 IU/mL). A viabilidade celular foi medida usando um ensaio bioluminescente que detecta os níveis de ATP. B. 10.000 células HL60-WT foram co-cultivadas por 4 dias com células T V9V2 expandidas in-vitro (proporção E: T 1: 1) na presença de concentração crescente de mAb1 (ou hIgG1 de controle de isotipo relevante) +/- rHuIL-2 (20 IU/mL). A viabilidade celular foi medida todos os dias. C. 10.000 células HL60-WT foram co-cultivadas durante 4 dias com células T Vγ9Vδ2 frescas isoladas de PBMC humano (proporção E:T 1:1 e 1:5) na presença de concentração crescente de mAb1 rHuIL-2 (20 UI/mL). A viabilidade celular foi medida todos os dias.* marca sobre o sinal.

[0185] Figura 3: 10.000 células tumorais de origem de tecidos diferentes foram co-cultivadas por 24 horas com células T V9V2 expandidas in vitro (razão E:T 1:1) na presença de diferentes concentrações de mAb1. A viabilidade celular foi medida usando um ensaio bioluminescente que detecta os níveis de ATP. Os valores de bioluminescência são indicados. As 4 barras referem-se a, da esquerda para a direita: (1) Sem mAb, (2) mAb1 0,1ug/mL, (3) mAb1 1uh/mL, (4) mAb1 10ug/mL

[0186] Figura 4: mAb1 Promove Expansão e Ativação de Células T Vγ9Vδ2 de Macaco Cinomolgo A. O sangue total de Cinomolgo de 3 animais foi tratado com tampão de hemólise. Após lavagens extensas, as células foram plaqueadas a 1,5 M/mL em meio contendo 200 IU/mL de rHuIL-2 e mAb1 (10 µg/mL). A porcentagem de células T Vγ9+ foi avaliada por citometria de fluxo no dia 0, 3, 6, 8 e 10 usando um anticorpo específico. O gráfico mostra a cinética da porcentagem de células T Vγ9 entre as células vivas. Cada curva representa um animal individual. B. Após 10 dias de expansão, as células de cada animal foram co-cultivadas por 4 horas com Daudi, K562 ou Raji usados como células alvo (razão E:T 1:1) na presença de meio de cultura, mAb1 ou controle de isotipo (10 µg/mL) e analisado para desgranulação (CD107a/b) por citometria de fluxo.

[0187] Figura 5: Amostras de sangue de Cinomolgo coletadas nos momentos indicados após a dosagem de ICT01 foram coradas com coquetel específico de anticorpos para quantificar subconjuntos de células T (células T CD4, CD8, Vγ9, células T reguladoras), células B, monócitos, células NK, mDCs, pDCs e granulócitos e analisado por citometria de fluxo. O painel superior mostrou a % de células T V9V2 entre as células T CD3 para animais de dose única. O painel inferior mostrou a% de células T V9V2 entre as células T CD3+ para animais de dose repetida. Os dados são apresentados como valores médios

± DP para cada ocasião e grupo de amostragem. As linhas pontilhadas verticais indicam o tempo de dosagem de ICT01.

EXEMPLOS Seleção de variantes humanizadas

1. Descrição das estratégias de humanização a. Projeto de Sequências de Região Variável de Composto de Anticorpo Humano™

[0188] Modelos estruturais das regiões V de anticorpo 7.2 e 20.1 murino foram produzidos usando Swiss PDB e analisados a fim de identificar aminoácidos "restritivos" importantes nas regiões V que eram provavelmente essenciais para as propriedades de ligação dos anticorpos. A maioria dos resíduos contidos nos CDRs (usando as definições de Kabat e Chothia) juntamente com uma série de resíduos de estrutura foram considerados importantes. A partir da análise acima, as sequências Humanas Compósitas de anticorpos 7.2 e 20.1 foram criadas. b. Prevenção de Epítopos de Células T CD4+

[0189] Com base na análise estrutural, um grande conjunto preliminar de segmentos de sequência que poderiam ser usados para criar variantes humanizadas 7.2 e 20.1 foram selecionados e analisados usando a tecnologia iTope™ para análise in silico de ligação de peptídeo a alelos de MHC de classe II humanos (Perry et al., 2008), e usando o TCED™ de epítopos de células T relacionados à sequência de anticorpos conhecidos (Bryson et al., 2010). Os segmentos de sequência que foram identificados como ligantes de linha germinativa não humana significativos para MHC classe II humana ou que pontuaram acertos significativos contra o TCED™ foram descartados. Isso resultou em um conjunto reduzido de segmentos, e combinações destes foram novamente analisadas, conforme acima, para garantir que as junções entre os segmentos não contivessem epítopos de células T potenciais. Os segmentos de sequência selecionados foram montados em sequências completas da região V previstas para serem desprovidas de epítopos de células T significativos. Várias cadeias pesadas e sequências de cadeias leves foram então escolhidas para a síntese e expressão de genes em células de mamíferos para mAbs 7.2 e 20.1.

2. Geração de variantes humanizadas e caracterização preliminar a. Construção de variantes de plasmídeos humanizados

[0190] As variantes humanizadas 7.2 e 20.1 foram sintetizadas com sítios de enzimas de restrição de flanqueamento para clonagem em um sistema de vetor de expressão para cadeias pesadas e leves kappa de IgG4 humana (S241P, L248E). Todos os construtos foram confirmados por sequenciação. b. Expressão de Anticorpos

[0191] 7.2 e 20.1 quiméricos (VH0/Vκ0), duas combinações de controle (VH0/Vκ1, VH1/Vκ0) e combinações de cadeias pesadas e leves humanizadas foram transitoriamente transfectadas em células CHO-S FreeStyle™ (ThermoFisher, Loughborough, Reino Unido) usando um MaxCyte Sistema de eletroporação STX® (MaxCyte Inc., Gaithersburg, EUA) a partir do DNA livre de endotoxina correspondente. As transfecções foram conduzidas para cada anticorpo usando montagens de processamento OC-400. Após a recuperação das células, as células foram diluídas para 3 x106 células/mL em meio CD Opti- CHO (ThermoFisher, Loughborough, UK) contendo 8 mM de L-Glutamina (ThermoFisher, Loughborough, UK) e 1 x Hipoxantina-Timidina (ThermoFisher, Loughborough, Reino Unido). 24 horas após a transfecção, a temperatura da cultura foi reduzida para 32 °C e foi adicionado butirato de sódio de 1 mM (Sigma, Dorset, Reino Unido). As culturas foram alimentadas diariamente pela adição de 3,6% (do volume inicial) de alimentação (2,5% CHO CD Efficient Feed A (ThermoFisher, Loughborough, UK), 0,5% de Yeastolate (BD Biosciences,

Oxford, UK), 0,25 mM de Glutamax (ThermoFisher, Loughborough, UK) e 2 g/L Glicose (Sigma, Dorset, UK)). Os títulos do sobrenadante de IgG foram monitorados por IgG ELISA e as transfecções foram cultivadas por até 14 dias antes da colheita dos sobrenadantes. c. Medição de afinidade preliminar: análise cinética de ciclo único de variantes humanizadas que se ligam a BTN3A

[0192] A fim de avaliar a ligação de todas as variantes de Anticorpo Humano Compósito™ e para selecionar anticorpos com a maior afinidade para BTN3A, a análise cinética de ciclo único foi realizada em sobrenadantes de cultura de células transfectadas usando um Biacore T200 (número de série 1909913) que executa o Software de Avaliação Biacore T200 V2.0.1 (Uppsala, Suécia).

[0193] Os anticorpos foram diluídos em BSA/PBS 2% para uma concentração final de 2 μg/mL com base nas concentrações obtidas a partir do sobrenadante titulado por ELISA. No início de cada ciclo, os anticorpos foram carregados em Fc2, Fc3 e Fc4 do chip de Proteína A (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). As IgGs foram capturadas a uma vazão de 10 µL/min para dar um nível de imobilização (RL) de ~ 146,5 RU, o valor teórico para obter RMax de ~ 50 RU. A superfície foi então deixada estabilizar. Os dados cinéticos de ciclo único foram obtidos com BTN3A1-His como analito (Sino Biological Cat. No. 15973- H08H) a uma vazão de 60 µL/min para minimizar quaisquer efeitos potenciais de transferência de massa, bem como usando HBS-P (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) como tampão de corrida. Múltiplas repetições com o anticorpo quimérico foram realizadas para verificar a estabilidade da superfície e analito ao longo dos ciclos cinéticos. O sinal a partir do canal de referência Fc1 (sem anticorpo) foi subtraído daquele de Fc2, Fc3 e Fc4 para corrigir as diferenças na ligação não específica para a superfície de referência. Foi usado um intervalo de diluição de três pontos e quatro vezes de 1,56 nM a 25 nM de BTN3A1 sem regeneração entre cada concentração. A fase de associação para as três injeções de concentrações crescentes de BTN3A1 foi monitorada por 240 segundos cada vez, e uma única fase de dissociação foi medida por 2000 segundos após a última injeção de BTN3A1. A regeneração da superfície do da Proteína A foi conduzida usando duas injeções de glicina-HCL a 10 mM pH 1,5 seguido por um período de estabilização de 240 segundos.

[0194] O sinal de cada ensaio em branco de anticorpo (sem CD277) foi subtraído para corrigir as diferenças na estabilidade da superfície. A cinética de ciclo único demonstrou que todas as variantes humanizadas se ligaram ao BTN3A. d. Purificação de anticorpos

[0195] Com base nas afinidades calculadas pelo Biacore, bem como a pontuação do iTope™ e a porcentagem de humanidade de cada variante humanizada, variantes humanizadas 7.2 e 20.1 com as melhores afinidades e as melhores pontuações do iTope™ foram selecionadas para análise posterior.

[0196] As variantes humanizadas selecionadas juntamente com sua versão quimérica e a variante mais conservadoramente humanizada (VH1/Vκ1) foram submetidas a purificação para teste de ensaio adicional. Os anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura de célula em colunas de sefarose de Proteína A seguido por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) usando acetato de sódio a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 5,5 como fase móvel e tampão de formulação final. As amostras foram quantificadas por OD280nm usando um coeficiente de extinção (Ec (0,1%)) com base na sequência de aminoácidos prevista.

[0197] Os anticorpos foram analisados usando SDS-PAGE carregando 2 µg de cada anticorpo no gel e as bandas correspondentes ao perfil de um anticorpo típico foram observadas.

e. Validação de propriedades de ligação: análise de ELISA de competição entre mAbs 7.2 e 20.1 humanizados e quiméricos

[0198] Variantes purificadas foram testadas quanto à sua ligação a BTN3A1- His recombinante (Sino Biological cat. Nº 15973-H08H) enquanto competiam contra o anticorpo murino correspondente. IgG4 humano quimérico (VH0/Vκ0) e irrelevante (S241P, L248E) foram testados em cada placa para comparação.

[0199] BTN3A1 foi diluído em 1x PBS para 0,5 µg/mL e 100 µL/poço foi revestido durante a noite a 4°C em uma placa de ELISA de 96 poços. No dia seguinte, a placa foi lavada 3x com 1x PBS/0,05% Tween (PBS-T) e bloqueada com 200 µL de 2% leite/PBS durante uma hora à temperatura ambiente. Em uma placa de diluição de 96 poços, uma concentração fixa de anticorpos murinos 7.2 ou 20.1 (concentração final de 0,15 µg/mL) foi adicionada em volume igual a uma série de titulação de quatro vezes do anticorpo de teste (começando em 80 µg/mL (40 µg/mL de concentração final) diluída em tampão de bloqueio). Depois de lavar a placa Nunc ELISA 3x com PBS-T, 100 µL de mistura murina/anticorpo de teste foram adicionados à placa de ELISA. Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, a placa foi lavada 3x com PBS-T e 100 µL de anticorpo secundário marcado com Fc HRP anti-camundongo (Sigma, Dorset, Reino Unido) diluído 1:1000 em tampão de bloqueio foi aplicado por uma hora em temperatura ambiente para detectar o anticorpo murino ligado. Para o desenvolvimento de cor, a placa foi lavada 3x com PBS-T, após 100 µL de substrato TMB terem sido adicionados e incubados por cinco minutos em temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 100 µL de ácido clorídrico de 3,0 M e a absorbância foi lida imediatamente usando um leitor de placas Dynex a 450 nm.

[0200] Os valores de IC50 foram calculados para cada variante e os valores de IC50 relativos foram calculados dividindo o IC50 da variante humanizada pelo do anticorpo quimérico testado na mesma placa.

3. Seleção dos candidatos humanizados a. Análise cinética multi-ciclo

[0201] Com base nos dados gerados a partir de ELISA de competição e avaliação de estabilidade térmica, a análise cinética multiciclo foi desempenhada na maioria das variantes 7.2 e 20.1 humanizadas juntamente com o anticorpo quimérico VH0/Vκ0 usando um instrumento Biacore T200 (número de série 1909913) executando Biacore T200 Evaluation Software V2.0.1 (Uppsala, Suécia).

[0202] Os anticorpos purificados foram diluídos para uma concentração de 2 μg/mL em BSA/PBS a 2%. No início de cada ciclo, cada anticorpo foi capturado na proteína A a uma densidade (RL) de ~ 146,5 RU (valor teórico para obter um RMax de ~ 50 RU). Após a captura, a superfície foi deixada estabilizar antes da injeção do antígeno BTN3A1 (Sino Biological cat. Nº 15973-H08H). BTN3A1 foi titulado em 0,1% de BSA/HBS-P+ (tampão de corrida) em uma faixa de diluição de duas vezes de 25 a 0,78 nM. A fase de associação foi monitorada por 400 segundos e a fase de dissociação por 35 minutos (2100 segundos). Os dados cinéticos foram obtidos usando uma vazão de 50 µL/min para minimizar quaisquer efeitos potenciais de transferência de massa. A regeneração da superfície da Proteína A foi conduzida usando duas injeções de glicina-HCL a 10 mM pH 1,5 no final de cada ciclo. Duas execuções em branco (sem BTN3A1) e uma repetição de uma única concentração do analito foram desempenhadas para cada anticorpo testado para verificar a estabilidade da superfície e do analito ao longo dos ciclos cinéticos. O sinal a partir do canal de referência Fc1 foi subtraído daquele de Fc2, Fc3 e Fc4 para corrigir as diferenças na ligação não específica para uma superfície de referência. Adicionalmente, as execuções em branco foram subtraídas para cada Fc para corrigir qualquer variação de sinal independente do antígeno, como deriva. Os sensogramas foram ajustados usando um modelo matemático de ligação um-para-um com um parâmetro RMax global e nenhum sinal em massa (RI constante = 0 RU). b. Ensaio de ligação por citometria de fluxo em PBMCs humanos

[0203] As variantes humanizadas 7.2 e 20.1 foram caracterizadas por sua ligação a PBMCs humanos, isolados do sangue de doadores saudáveis. PBMCs foram isolados de camadas leucoplaquetárias usando centrifugação de densidade Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, Reino Unido). PBMCs foram então congelados e armazenados a -80°C ou em nitrogênio líquido até serem requeridos.

[0204] 100 µL de células a 1 x106 células/mL foram transferidas para cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em forma de U fresca, e em seguida a placa foi centrifugada e o sobrenadante descartado.

[0205] Uma diluição em série dos anticorpos, 0,001 µg/mL a 150 µg/mL foi preparada em PBS com EDTA a 2 mM. PBMCs humanos foram ressuspensos em 50 µL da série de titulação de anticorpo de teste diluída preparada.

[0206] Após incubação por 30 minutos a 4 °C no escuro, a placa foi centrifugada e lavada duas vezes com 150 µL/poço de PBS com EDTA a 2 mM e em seguida os poços foram ressuspensos em 50 µL de uma mistura composta de anticorpo anti-humano de cabra (PE marcado) diluído 1/100 e IR puro diluído vivo/morto 1/500 em PBS com EDTA a 2 mM.

[0207] Após incubação por 15 minutos a 4 °C no escuro, a placa foi centrifugada e lavada uma vez com 150 µL/poço de PBS com EDTA a 2mM e em seguida os poços foram ressuspensos em 200 µL de PBS com EDTA a 2mM. As células foram analisadas em um Citômetro BD LSR Fortessa. Os dados foram analisados usando um software FlowJo (Versão 10, FlowJo, LLC, Ashland, EUA) (dados não mostrados).

[0208] O mesmo protocolo foi realizado em PBMCs de Cinomolgo e na linhagem celular de linfoma de Daudi Burkitt. c. Eficácia funcional in vitro: ensaio de degranulação de células T γδ

[0209] O ensaio consiste em medir o efeito de ativação ou inibição de variantes humanizadas 7.2 e 20.1 e suas versões quiméricas na degranulação de células γδ-T contra a linhagem celular de linfoma de Daudi Burkitt (Harly et al., 2012). As células γδ-T foram expandidas a partir de PBMCs de doadores saudáveis por cultura com ácido zoledrônico (1 µM) e IL2 (200 Ui/mL) por 11-13 dias. IL2 é adicionado no dia 5, dia 8 e a cada 2 dias depois disso. A porcentagem de células T γδ foi determinada no início da cultura e avaliada quanto ao tempo de cultivo por citometria de fluxo até atingir pelo menos 80%. Células T γδ congeladas ou frescas foram então usadas em ensaios de degranulação contra a linhagem celular Daudi (razão E:T de 1:1), em que as células são co-cultivadas por 4 horas a 37 °C na presença de 10 µg/mL das variantes humanizadas 7.2 e

20.1 e suas versões quiméricas. A ativação por PMA (20 ng/mL) mais ionomicina (1 µg/mL) serviu como controle positivo para a degranulação de células T γδ e somente o meio como controle negativo. No final da co-incubação de 4 horas, as células foram analisadas por citometria de fluxo para avaliar a porcentagem de células T γδ positivas para CD107a (LAMP-1, proteína de membrana associada ao lisossoma-1) + CD107b (LAMP-2). CD107 é mobilizada para a superfície celular após a exocitose do grânulo induzida por ativação, portanto, a medição da superfície CD107 é um marcador sensível para identificar células T citolíticas recentemente degranuladas. Os resultados não mostraram variações significativas entre os candidatos testados, que mostraram efeito ativador semelhante no ensaio de desgranulação como anticorpo quimérico 7.2 ou 20.1.

[0210] O mesmo protocolo foi realizado usando blastos de AML isolados de pacientes como células-alvo, no lugar de células de Daudi.

d. Análise de termostabilidade

[0211] De modo a avaliar a termoestabilidade das variantes 7.2 e 20.1 de Composite Human Antibody™ selecionadas, as temperaturas de fusão (a temperatura na qual 50% de um domínio de proteína é desdobrado) foram determinadas usando um ensaio de deslocamento térmico baseado em fluorescência.

[0212] Todos os anticorpos humanizados purificados e os anticorpos quiméricos (VH0/Vκ0) foram diluídos para uma concentração final de 0,1 mg/mL em tampão de formulação (acetato de sódio a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 5,5) contendo SYPRO® Orange (ThermoFisher, Loughborough, Reino Unido) a uma diluição de 1 em 1000 e submetido a um gradiente de temperatura de 25 °C a 99 °C em um sistema de PCR em tempo real StepOnePlus (ThermoFisher, Loughborough, Reino Unido) durante um período de 56 minutos. Acetato de sódio a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 5,5 foi usado como um controle negativo. As curvas de fusão foram analisadas usando software de termoestabilidade de proteínas (versão 1.2). e. Seleção de candidatos humanizados

[0213] Com base em todos os resultados obtidos para os experimentos descritos acima, 3 variantes de 35 (15 variantes humanizadas geradas para 7.2; 20 variantes humanizadas geradas para 20.1) foram selecionadas para caracterização adicional: 7.2 (VH2/Vk1), 7.2 (VH2/Vk2) e 20.1 (VH3/Vk1).

[0214] Os resultados dos diferentes experimentos descritos acima para os mAbs 7.2 e 20.1 são relatados na Tabela 4 e Tabela 5 para as 3 variantes e suas versões quiméricas. Tabela 4: Os candidatos humanizados selecionados têm a mesma potência que os anticorpos parentais murinos

7.2 7.2 7.2 20.1 20.1 Candidato VH2/Vk1 VH2/Vk2 VH0/Vk0 VH3/Vk1 VH0/Vk0

Cinética Multi-Ciclo de Afinidade de Biacore 2,53 2,43 1,76 3,19 2,34 (x10-10) (KD, M) Ligação em PBMC humano 3,86 5,94 3,6 3,38 3,02 (EC50, µg/mL) Ligação ao Cino PBMC 12,0 9,85 7,75 5,74 4,06 (EC50, µg/mL) Ligação ao linfoma (Daudi) 2,02 2,01 1,44 1,59 1,19 (EC50, µg/mL) Ensaio funcional (Daudi) 0,03 0,03 0,02 0,02 0,02 (baseado em célula T γδ, EC50, µg/mL) Ensaio funcional (sensível à AML) 0,21 0,19 0,12 0,15 0,05 (baseado em célula T γδ, EC50, µg/mL) Ensaio funcional (resistente à AML) 0,73 0,64 0,42 0,32 0,18 (baseado em célula T γδ, EC50, µg/mL) Tabela 5: Os candidatos humanizados selecionados mAb7.2 com VH2 e Vk1 ou Vk2 têm termoestabilidade mais alta em comparação com o candidato murino Candidato 7.2 VH2/Vk1 7.2 VH2/Vk2 7.2 VH0/Vk0 Termostabilidade (Tm2 média) 77,1 77,3 72,5 (°C)

[0215] O processo de humanização leva à geração de múltiplas variantes

7.2 e 20.1 com imunogenicidade reduzida prevista.

[0216] O conjunto selecionado das três variantes (7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 e 20.1 VH3/VK1) apresentou propriedades equivalentes a sua versão quimérica em termos de afinidade, ligação e eficácia em ensaios funcionais: as modificações feitas nas sequências de variantes para reduzir a imunogenicidade não alterou as funções dos anticorpos.

[0217] Surpreendentemente, a termoestabilidade das variantes humanizadas selecionadas 7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 foi melhorada em comparação com os anticorpos quiméricos, e essa termoestabilidade melhorada foi inesperada neste processo de humanização. Região constante do anticorpo: comparação de fragmentos Fc silenciosos

[0218] Várias porções Fc foram testadas para silenciar ou reduzir a função efetora dos anticorpos. A ligação destes fragmentos Fc aos diferentes receptores Fcγ foi avaliada usando Biacore; a sua ligação ao complexo C1q foi avaliada por ensaio ELISA.

1. Ligação da porção Fc manipulada aos diferentes receptores Fcγ usando Biacore

[0219] A habilidade de diferentes isotipos (IgG1, IgG1 [N314A], IgG1 [L247F, L248E P350S], IgG2, IgG4 [S241P] e IgG4 [S241P L248E]) do anticorpo quimérico

20.1 de se ligar a diferentes receptores Fcγ foi determinada usando anticorpos purificados e análise Biacore de ciclo único. Os receptores Fc humanos, FcγRI, FcγRIIA (polimorfismo Arg167) e IIB, e FcγRIIIA (polimorfismo Phe176) e IIIB foram obtidos a partir da Sino Biological.

[0220] Os receptores Fcγ foram diluídos em HBS-P+ (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) para uma concentração final de 0,5 ou 1,0 μg/mL. No início de cada ciclo, os receptores Fcγ foram carregados em Fc2, Fc3 e Fc4 de um chip anti-His CM5 (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Os receptores Fcγ foram capturados a uma vazão de 5 µL/min para dar um nível de imobilização entre 30 e 180 RU dependendo do peso molecular do receptor Fcγ. A superfície foi então deixada estabilizar. Os dados de cinética de ciclo único foram obtidos usando os anticorpos quiméricos como o analito a uma vazão de 30 µL/min para minimizar quaisquer efeitos potenciais de transferência de massa. O sinal a partir do canal de referência Fc1 foi subtraído daquele de Fc2, Fc3 e Fc4 para corrigir as diferenças na ligação não específica para a superfície de referência. Um intervalo de diluição de três vezes e cinco pontos foi usado para cada anticorpo quimérico com este intervalo de concentração variando para cada receptor Fcγ individual devido às diferenças esperadas na afinidade. O sinal de cada execução em branco de anticorpo (sem Anticorpo) foi subtraído para corrigir as diferenças na estabilidade da superfície. A fase de associação para cada uma das cinco injeções de concentrações crescentes de anticorpo quimérico foi monitorada por entre 25 e 180 segundos (dependendo do ligante do receptor Fcγ) e uma única fase de dissociação foi medida entre 25 e 300 segundos após a última injeção de anticorpo. A regeneração da superfície anti-His foi conduzida usando duas injeções de glicina-HCL a 10 mM pH 1,5 por 15 segundos cada a 30 µL/min seguido por um período de estabilização de 180 segundos.

[0221] Constantes cinéticas de ciclo único foram determinadas sempre que possível usando o modelo de análise padrão 1:1. Para interações fortes, foi geralmente mais adequado determinar a afinidade via experimentos cinéticos. No entanto, para vários receptores Fcγ, a interação é muito fraca e, neste cenário, os dados foram analisados usando análise de afinidade em estado estacionário (que é particularmente adequada para medição de interações fracas a moderadas). Sensogramas para as interações dos receptores Fcγ com os anticorpos quiméricos foram obtidos (dados não mostrados).

[0222] Como esperado, o receptor FcγRI de alta afinidade ligou-se com boa afinidade a IgG1 e IgG4 não modificados (S241P). Os isotipos IgG1 modificados, juntamente com IgG2 e IgG4 (S241P, L248E), falharam em se ligar a FcγRI. Os receptores Fcγ restantes mostraram interações de afinidade muito mais baixas para os diferentes anticorpos quiméricos em comparação com o FcγRI. Como esperado, o IgG1 não modificado mostrou a ligação mais forte a todos os quatro receptores de afinidade mais baixa, enquanto as versões modificadas de IgG1 mostraram ligação significativamente reduzida a esses receptores. IgG2 e IgG4 (S241P) demonstraram alguma ligação a FcγRIIA e B, mas apenas ligação marginal a FcγRIIIA e B.

2. Ligação da porção Fc manipulada ao complexo C1q por ensaio de ELISA

[0223] O anticorpo quimérico 20.1 foi testado como diferentes isotipos de IgG para ligação ao complexo C1q para determinar sua capacidade de ativar o sistema complementar.

[0224] Em uma placa de 96 poços com fundo em U, uma série de diluição de 2,5 vezes (de 10 µg/mL a 0,04 µg/mL) de quimérico purificado 20.1 em diferentes isotipos foi preparada em BSA/DPBS a 2%. Placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços Nunc Immuno MaxiSorp (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) foram pré-revestidas com 100 µL/poço desta série de titulação e incubadas durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, a placa foi lavada duas vezes com PBST e bloqueada durante uma hora à temperatura ambiente com BSA/DPBS a 2% antes de lavar cinco vezes com PBST. A proteína de complemento purificada C1q (Pathway Diagnostics Ltd, Dorking, Reino Unido), diluída para 5 μg/mL em BSA/PBS a 2%, foi adicionada à placa (100 µL/poço) e incubada por uma hora à temperatura ambiente. Depois de lavar cinco vezes com PBST, a ligação do complexo C1q foi detectada com um anti-C1q-HRP (Abcam, Cambridge, Reino Unido) (100 µL/poço, diluído 1 em 100 em BSA/DPBS a 2%) durante uma hora à temperatura ambiente. Depois de lavar cinco vezes com PBST, a ligação foi detectada com substrato TMB (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Reino Unido) e em seguida a reação foi interrompida com HCl a 3M, absorbância lida a 450 nm em um leitor de placa MRX TC II da Dynex Technologies e as curvas de ligação traçadas.

[0225] Como esperado, apenas o isotipo IgG1 não modificado mostrou boa ligação a C1q com outros isotipos mostrando de ligação mínima a nenhuma ligação (dados não mostrados).

3. Seleção dos fragmentos Fc manipulados

[0226] A ligação relativa de todos os isotipos testados em receptores Fcγ e no complexo C1q são descritos na Tabela 6. Tabela 6: Ligação relativa de todos os isotipos em receptores Fcγ e complexo C1q Isotipo FcγRI FcγRIIa FcγRIIb FcγRIIIa FcγRIIIb C1q IgG1 IgG1 WT ++++ ++ ++ ++ ++ ++++ IgG1 N314A ++ - - - - - IgG1 L247F, L248E, P350S - + + +/- +/- - IgG2 IgG2 WT - ++ + +/- +/- +/- IgG4 IgG4 S241P ++++ ++ ++ +/- +/- - IgG4 S241P, L248E - + ++ - +/- -

[0227] Os dois fragmentos Fc manipulados de IgG1 L247F, L248E, P350S e IgG4 S241P, L248E foram os únicos a mostrar uma perda total de ligação no receptor FcγI e no complexo C1q.

[0228] Com base nos resultados obtidos, os dois isotipos manipulados IgG1 L247F, L248E, P350S e IgG4 S241P, L248E foram selecionados para caracterização posterior. Geração de 6 anticorpos humanizados

[0229] As 3 variantes humanizadas selecionadas foram clonadas para serem fundidas com os dois fragmentos Fc manipulados selecionados, levando à geração de 6 candidatos diferentes: mAb 1 a mAb 6.

[0230] Os Exemplos mAb1 a mAb6 conforme descrito na Tabela 1 podem ser produzidos usando processos convencionais de produção e purificação de anticorpos recombinantes.

[0231] Por exemplo, as sequências de codificação foram clonadas em um vetor de produção para expressão recombinante em linhagens celulares de produção de mamíferos.

[0232] As seguintes Tabelas 7 e 8 fornecem sequências detalhadas de aminoácidos e nucleotídeos úteis para praticar a invenção e, em particular, para produzir os ácidos nucleicos, vetores de expressão e anticorpos humanizados derivados do 7.2 murino da presente invenção. Tabela 7: Breve descrição de sequências de aminoácidos e nucleotídeos úteis para a prática da invenção SEQ ID NO: Tipo Descrição da sequência 1 aa Região variável de cadeia pesada humanizada VH2 de mAb 7.2 2 aa Região variável de cadeia leve humanizada Vκ1 de mAb 7.2 3 aa Região variável de cadeia leve humanizada Vκ2 de mAb 7.2 4 aa Cadeia pesada de comprimento total de mAbs 1 e 2 (VH2 7.2 IgG1 silencioso) 5 aa Cadeia pesada de comprimento total de mAbs 4 e 5 (VH2 7.2 IgG4 silencioso) 6 aa Cadeia leve de comprimento total de mAbs 1 e 4 (Vk1 7.2) 7 aa Cadeia leve de comprimento total de mAbs 2 e 5 (Vk2 7.2) 8 nt Cadeia pesada de comprimento total de mAbs 1 e 2 (VH2 7.2 IgG1 silencioso) 9 nt Cadeia pesada de comprimento total de mAbs 4 e 5 (VH2 7.2 IgG4 silencioso) 10 nt Cadeia leve de comprimento total de mAbs 1 e 4 (Vk1 7.2) 11 nt Cadeia leve de comprimento total de mAbs 2 e 5 (Vk2 7.2) 12 aa HCDR1 de mAb 7.2, 1, 2, 4 e 5

13 aa HCDR2 de mAb 7.2, 1, 2, 4 e 5 14 aa HCDR3 de mAb 7.2, 1, 2, 4 e 5 15 aa LCDR1 de mAb 7.2, 1, 2, 4 e 5 16 aa LCDR2 de mAb 7.2, 1, 2, 4 e 5 17 aa LCDR3 de mAb 7.2, 1, 2, 4 e 5 18 aa BTN3A1 humano 19 aa BTN3A2 humano 20 aa BTN3A3 humano 21 aa Ectodomínio de BTN3A1 de Macaco Cinomolgo (m. fascicularis) usado para produção de proteína recombinante 22 aa Ectodomínio de BTN3A2 de Macaco Cinomolgo (m. fascicularis) usado para produção de proteína recombinante 23 aa Ectodomínio de BTN3A3 de Macaco Cinomolgo (m. fascicularis) usado para produção de proteína recombinante Tabela 8: Breve descrição de sequências de aminoácidos e nucleotídeos úteis para a prática da invenção SEQ ID NO: Descreve a sequência de aminoácidos ou nucleotídeos abaixo: SEQ ID NO: Descreve a sequência de aminoácidos ou nucleotídeos abaixo: 1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPN

NGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMD

YWGQGTLVTVSS 2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHT

GVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK 3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHT

GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK 4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPN

NGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS CDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS

PG 5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPN

NGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHT

GVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD

STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHT

GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD

STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 8 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGG GTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAA CAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTG TAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGAC GACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTT GCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACC AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGC ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCC ATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCC

CTGTCTCCGGGTTGA 9 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGG GTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAA CAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTG TAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGAC GACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTT GCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACC AAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGT GTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAATGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAA GGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGC ACCTGAGTTCGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGG AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAG GCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCT

GGGTTGA 10 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGA

GTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACC AGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGC ACACAGGCGTCCCATCAAGATTTACTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACAT TCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGG GTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGA ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCA AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCC

ATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 11 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGA

GTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACC AGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGC ACACAGGCGTCCCATCAAGATTTAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACAT TCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGG GTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGA ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCA AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCC

ATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 12 RYYMY 13 EINPNNGGTKFNEKFKN 14 EDDYDGTPFAMDY 15 HASQNINVWLS 16 KASNLHT 17 QQGQTYPYT 18 MKMASFLAFLLLNFRVCLLLLQLLMPHSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFP

TMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAAL RIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHVDVKGYKDGGIHLECRS TGWYPQPQIQWSNNKGENIPTVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCTIR SSLLGLEKTASISIADPFFRSAQRWIAALAGTLPVLLLLLGGAGYFLWQQQEEKKTQF RKKKREQELREMAWSTMKQEQSTRVKLLEELRWRSIQYASRGERHSAYNEWKKAL FKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFNWHYCVLGCESFISG RHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGFWTMGLTDGNKYRTLT EPRTNLKLPKPPKKVGVFLDYETGDISFYNAVDGSHIHTFLDVSFSEALYPVFRILTLEP

TALTICPA 19 MKMASSLAFLLLNFHVSLLLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPT

MSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRI HNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRST GWYPQPQIQWSNAKGENIPAVEAPVVADGVGLYEVAASVIMRGGSGEGVSCIIRN SLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPILLLLLAGASYFLWRQQKEITALSSEIE

SEQEMKEMGYAATEREISLRESLQEELKRKKIQYLTRGEESSSDTNKSA 20 MKMASSLAFLLLNFHVSLFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPT

MSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRI HNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTG WYPQPQIKWSDTKGENIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGGGVSCIIRNSL LGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETER EREMKEMGYAATEQEISLREKLQEELKWRKIQYMARGEKSLAYHEWKMALFKPAD VILDPDTANAILLVSEDQRSVQRAEEPRDLPDNPERFEWRYCVLGCENFTSGRHYW EVEVGDRKEWHIGVCSKNVERKKGWVKMTPENGYWTMGLTDGNKYRALTEPRT NLKLPEPPRKVGIFLDYETGEISFYNATDGSHIYTFPHASFSEPLYPVFRILTLEPTALTI CPIPKEVESSPDPDLVPDHSLETPLTPGLANESGEPQAEVTSLLLPAHPGAEVSPSAT

TNQNHKLQARTEALY 21 MGSSLAFLLLSFHVCVLLLQLLMPHSAQFAVVGPPGPILAMVGEDADLPCHLFPTM

SAETMELRWVSSNLRQVVNVYADGKEVEDRQSAAYRGRTSILRDGITAGKAALRIH NVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIDVKGYEDGGIHLECRSTG WYPQPQIRWSNDKGENIPAVEAPVFVDGVGLYAVAASVILRGSSGEGVSCTIRSSLL

GLEKTTSISIAG HHHHHH 22 MGSSLAFLLLNFHVSFFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMS

AETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDDIAAGKAALRIHN VTASDSGKYLCYFQDADFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGW YPQPKIQWSNAKGQNIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGGSGESVSCIIRNSVL

GLEKTASISIAD HHHHHH 23 MANFLAFLLLNFRVCLLLVQLLTPCSAQFAVLGPHGPILAMVGEDVDLPCHLFPTM

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GLEKTASISITD HHHHHH Propriedades de desenvolvimento das 6 variantes humanizadas

1. Geração de linhagens celulares a. Construção de vetor de expressão

[0233] As sequências de genes que codificam as cadeias pesadas e cadeias leves foram clonadas no vetor. O sistema genético foi usado para expressar os anticorpos em células de CHO. A expressão de anticorpos estava sob o controle do promotor EF1 alfa. Os vetores de expressão carregam elementos genéticos únicos que protegem o transgene dos efeitos silenciadores da cromatina circundante (Girod et al., 2007). A transcrição é mantida em um nível máximo e é independente do sítio de integração do transgene, resultando em expressão de proteína estável e de alto nível.

b. Desenvolvimento de linhagens celulares

[0234] A linhagem celular hospedeira de CHO é derivada de células CHO-K1 CCL-61 da American 124 Type Culture Collection (ATCC) e foi adaptada para crescer em suspensão no meio de cultura de BalanCD Growth A quimicamente definido (Irvine Scientific). As células foram transfectadas por eletroporação usando o sistema de transfecção Neon (Invitrogen). c. Clonagem de célula única usando dispositivo ClonePix FL.

[0235] O mesmo meio (BalanCD Growth A, Irvine Scientific) foi usado como meio basal para transfecção, clonagem de célula única e produção, a fim de manter o ambiente das células inalterado durante todo o procedimento. Após a transfecção de cada vetor, a pressão de seleção de puromicina foi aplicada para gerar os agrupamentos estáveis. As células diluídas foram semeadas em meio semissólido (CloneMedia©; Molecular Devices) e as placas foram incubadas a 37 °C com 5% de CO2, em uma incubadora umidificada. As colônias expandidas foram colhidas usando o Imageador ClonePix™ FL da Molecular Devices e transferidas para placas de 96 poços, em seguida, expandidas em placas de TC de 24 poços e depois de 6 poços. d. Avaliação de desempenho de batelada alimentada

[0236] O crescimento e o desempenho de produção de clones individuais foram avaliados em frascos de agitação de 125 mL para selecionar os melhores clones pelos critérios de desempenho e produtividade do crescimento celular em um processo de batelada alimentada de 10 dias usando alimentação Cell Boost7 A+7B (GE Healthcare, EUA). As culturas em batelada alimentada foram iniciadas em concentrações de células de 0,3 x 106 células/mL.

[0237] Os resultados obtidos para o crescimento celular e produtividade são resumidos na Tabela 9.

2. Preparação de amostras para avaliação de fabricabilidade

[0238] Cada anticorpo candidato foi purificado por captura de proteína A de agrupamentos de sobrenadantes de células de CHO clarificadas: dois agrupamentos foram necessários para cada variante para garantir material suficiente para teste. A concentração de proteína foi determinada para todas as amostras pós-captura pelo método UV. A recuperação da amostra e os rendimentos foram maiores que 80% para a maioria das amostras e todas as variantes mostraram rendimentos similares. Cada anticorpo foi então trocado por tampão em Histidina a 25 mM, NaCl a 125 mM, pH 6,0 usando unidades de filtro centrífugo MWCO de 30 kDa até que o material de fluxo direto atingiu o pH alvo para a formulação. Durante a etapa de troca, não houve indicadores de precipitação de proteína ou fluxo lento durante a troca por qualquer uma das variantes. Após a conclusão da troca por tampão, a concentração de cada amostra variante foi ajustada para 1,0 mg/mL com tampão de formulação e PS- 80 a 10% foi adicionado a uma concentração final de PS-80 a 0,02%.

3. Avaliação da estabilidade térmica

[0239] A análise de fluorimetria de varredura diferencial foi desempenhada para avaliar e comparar as estabilidades térmicas da variante de anticorpo testada. Cada variante foi analisada em triplicata e as Tinício, Tagg e Tm médias foram determinadas para cada transição térmica observada (dados não mostrados).

[0240] Nenhuma diferença significativa foi observada entre valores de Tinício e Tm obtidos para todas as variantes testadas. O valor de Tm1 determinado para todos os anticorpos foi de 61 °C, e os valores determinados para Tinício foram de 54 a 55 °C para todos os anticorpos. Os valores determinados de T agg com base nos gráficos de estabilidade coloidal variaram de 71 a 78 °C.

[0241] No geral, todas as 4 variantes selecionadas demonstram estabilidade térmica comparável: as variações observadas não levam a mudanças significativas na estabilidade térmica entre os anticorpos testados.

4. Estudos de Degradação Forçada a. Agitação

[0242] As amostras para cada variante foram submetidas a estresse de agitação em um agitador orbital ajustado para 500 rpm à temperatura ambiente. Uma amostra para cada variante foi agitada por 24 horas e outra amostra por 48 horas. Um frasco de cada variante foi armazenado em temperatura ambiente por até 48 horas como controle. Nenhuma mudança na aparência foi observada para as amostras agitadas em comparação com os controles: todas as amostras foram observadas como límpidas, incolores e livres de partículas visíveis (dados não mostrados). Além disso, não houve alteração significativa no teor de proteína total, conforme determinado pelo método UV (dados não mostrados).

[0243] Os efeitos do estresse de agitação sobre a estabilidade do painel de variantes foram avaliados por métodos de SEC, CGE reduzido, CGE não reduzido e icIEF (dados não mostrados). Não foram observadas mudanças significativas na estabilidade dos anticorpos testados nem tendências discerníveis ao longo do tempo no acúmulo de degradantes entre as amostras de controle de agitação armazenadas em temperatura ambiente e as amostras de estresse de agitação. A % do pico principal determinado na análise de SEC foi ≥ 99,2% para todas as amostras de controle e agitação. Na análise de R-CGE, a % do pico principal foi ≥ 98,5% para todas as amostras de controle e agitação. A análise de NR-CGE não revelou tendências ou alterações significativas na % de pico principal entre os controles e as amostras estressadas. Em conclusão, nenhuma diferença significativa na estabilidade foi observada entre todas as variantes candidatas. b. Estresse de Congelamento-Descongelamento

[0244] Três amostras de cada candidato foram aliquotadas em tubos Eppendorf e submetidas a estresse de congelamento e descongelamento. As amostras foram armazenadas a -75 ± 10 °C e depois descongeladas à temperatura ambiente. Uma amostra para cada candidato foi submetida a 3 ciclos de congelamento-descongelamento; outra a 6 ciclos de congelamento- descongelamento; e uma terceira amostra a 10 ciclos. Todas as amostras estressadas foram observadas como límpidas, incolores e livres de partículas visíveis (dados não mostrados), e não houve mudança significativa no teor de proteína total conforme determinado pelo método UV (dados não mostrados).

[0245] Os efeitos do estresse de congelamento-descongelamento na estabilidade do painel de variantes foram avaliados por métodos de SEC, CGE reduzido, CGE não reduzido e icIEF (dados não mostrados). O estresse de congelamento-descongelamento não teve impacto na estabilidade dos anticorpos com base na análise de SEC, R-CGE e NR-CGE.

[0246] A análise icIEF revelou mudanças perceptíveis na heterogeneidade de carga dos anticorpos testados. A concentração de variantes básicas diminuiu em ciclos F/T sucessivos, com a concentração mais baixa de variantes básicas em ciclos de 10X F/T em comparação com os controles gerais. A única exceção foi a variante IgG1 7.2 VH2/VK1, para a qual a diminuição na concentração de variantes básicas foi no mesmo nível para todos os ciclos F/T testados (vide Tabela 9) Nas variantes mAb1, mAb2 e mAb3, após ciclos de 10X F/T, as espécies básicas diminuíram em 1,0, 1,3 e 3,4%, respectivamente. A diminuição na concentração das espécies básicas está relacionada a um aumento na % do pico principal. Nas variantes mAb4, mAb5 e mAb6 a diminuição nas espécies básicas é de 4,8, 2,8 e 4,7%, respectivamente. A mudança na variante mAb4 está principalmente relacionada a um aumento de % do pico principal, enquanto as mudanças na variante mAb5 e mAb6 estão relacionadas a aumentos na % do pico principal e na % de variante ácida.

[0247] No geral, foi determinado que a maior resistência a alterações do estresse de congelamento-descongelamento foi observada para as variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2). c. Estresse de pH ácido

[0248] As amostras de cada candidato foram submetidas a estresse de pH ácido à temperatura ambiente: cada amostra foi ajustada com HCl a pH 3,5 e mantida à temperatura ambiente por 2 horas, 4 horas e 24 horas após as amostras serem neutralizadas com 1 M Tris, pH 7,0. Todas as amostras estressadas foram observadas como límpidas, incolores e livres de partículas visíveis (dados não mostrados), e não houve mudança significativa na concentração de proteína como determinado pelo método UV (dados não mostrados).

[0249] Os efeitos do estresse de pH ácido na estabilidade do painel de variantes foram avaliados por métodos de SEC, CGE reduzido, CGE não reduzido e icIEF (dados não mostrados). Nenhuma mudança significativa no acúmulo de degradantes foi detectada ao longo do tempo para amostras expostas a baixo pH em comparação com o controle de RT de 48 horas por análise de R-CGE ou NR-CGE. Na análise de heterogeneidade de carga, a concentração de variantes básicas diminuiu em todas as amostras submetidas a estresse de pH ácido, no entanto, nenhuma tendência clara foi observada ao longo do tempo.

[0250] O menor impacto geral do estresse ácido na redução de variantes básicas foi observado para as variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1

7.2 VH2/VK2). Este resultado está de acordo com os resultados obtidos pelo icIEF no estudo de congelamento-descongelamento. Na análise de SEC, todas as variantes foram observadas como acumulando alguns agregados após a exposição ao estresse ácido, que estava relacionado a uma diminuição da % de pico principal, no entanto, nenhuma tendência clara foi observada ao longo do tempo. Em geral, a acumulação de agregados foi cerca de 9 vezes maior para as variantes de IgG4 em comparação com as variantes de IgG1. O acúmulo de agregados para as variantes de IgG1 foi de 0,3 a 1,0% para todas as amostras de estresse ácido, e para as variantes de IgG4 o acúmulo foi de 4,3 a 7,8% para as amostras de estresse, o que é significativamente mais alto (vide Tabela 9)

[0251] Em conclusão, foi determinado que a resistência mais alta ao estresse ácido foi observada para as variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2). d. Estresse por calor

[0252] As amostras para cada variante foram submetidas a estresse por calor em um bloco de calor a 50 °C por 3 dias, 1 semana e 2 semanas e, em seguida, comparadas com o conjunto de amostras de controle geral armazenadas a 2 - 8 °C. O teste de aparência das amostras foi realizado periodicamente e não houve evidência observada de separação de fases, mudança na opacidade ou precipitação. Todas as amostras foram observadas como límpidas, incolores e livres de partículas visíveis em todos os pontos de tempo (dados não mostrados). Além disso, não houve alteração significativa na concentração de proteína, conforme determinado pelo método UV (dados não mostrados).

[0253] Os efeitos do estresse por calor no painel de variantes foram avaliados por métodos de SEC, R-CGE, NR-CGE e icIEF. Os resultados revelaram que todas as variantes eram suscetíveis ao estresse por calor.

[0254] Na análise de SEC, tendências claras para o aumento da concentração de agregados foram observadas em função do tempo para todas as variantes testadas. Um acúmulo significativamente maior de agregados foi observado para variantes de IgG4 em comparação com IgG1. Após duas semanas, o aumento da % total de agregados variou de 33,7 a 44,7% para as variantes de IgG4, mas apenas 13,0 a 18,2% para as variantes de IgG1 (vide

Tabela 9) Além disso, as variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) acumularam menos agregado do que o mAb3 de controle (IgG1 20.1 VH3/VK1).

[0255] Na análise de R-CGE, tendências claras para diminuição da pureza (definida como a diminuição da % de LC +HC) foram observadas em função do tempo para todas as variantes testadas, no entanto, não houve diferenças significativas observadas na estabilidade entre elas. O nível de degradação das amostras foi comparável para todos os anticorpos testados (dados não mostrados). Da mesma forma, os dados de NR-CGE revelaram tendências claras para a diminuição da pureza (definida como a diminuição do pico principal) em função do tempo para todas as variantes testadas. Pureza significativamente inferior foi observada para variantes de IgG4 em comparação com IgG1 (dados não mostrados). Após duas semanas a % de pureza diminuiu de 34,8 a 41,7% para as variantes de IgG4, mas apenas 20,0 a 30,0% para as variantes de IgG1 (dados não mostrados) Adicionalmente, as variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) exibiram degradação inferior à de mAb3 IgG1 20.1 VH3/VK1. Para os anticorpos IgG1, a redução no pico principal foi principalmente acompanhada por um aumento das impurezas do pico principal frontal (fragmentos). Para anticorpos IgG4, no entanto, a acumulação de ambas as impurezas do pico principal frontal (fragmentos) e do pico principal posterior (agregados) foi observada em função da diminuição do pico principal (dados não mostrados). Este resultado está de acordo com os dados de SEC, onde a concentração significativamente mais alta de agregados foi observada para anticorpos IgG4 em comparação com IgG1.

[0256] As amostras de 1 semana para as variantes de IgG4 estavam muito degradadas para análise por icIEF, e as amostras de 2 semanas para todas as variantes estavam muito degradadas para análise. Portanto, apenas dados de 3 dias foram usados para avaliar as mudanças na heterogeneidade de carga entre os anticorpos testados. A diferença na pureza determinada pela % do pico principal foi de 12,4 a 14,4% de diferença para as amostras de IgG1 e de 16,0 a 16,6% para as amostras de IgG4 (dados não mostrados).

[0257] No geral, foi demonstrado que a degradação após estresse por calor foi maior para as variantes de IgG4 em comparação com as variantes de IgG1, e isso foi observado em todos os pontos de tempo. A análise indica que as variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) são as menos suscetíveis ao estresse por calor e este resultado é consistente com os dados obtidos para estresse de congelamento-descongelamento e pH ácido. Seleção do melhor candidato em termos de propriedades de capacidade de desenvolvimento

[0258] Em relação à produtividade em linhagens celulares, os melhores resultados foram obtidos com a variante humanizada mAb1 (7.2 VH2/VK1), com densidade de células viáveis aumentando 54 x 106 células viáveis/mL em 10 dias para mAb1.

[0259] No estudo de estabilidade térmica, as amostras foram avaliadas na matriz padrão por análise de DSF para determinar Tinício, Tm e Tagg para cada candidato. Nenhuma variação em Tinício e Tm1 foi observada, e Tagg foi superior a 70 °C para todas as variantes. Os resultados indicam que mAb1, mAb2, mAb4 e mAb5 demonstram estabilidade térmica comparável.

[0260] No estudo de degradação forçada, as amostras foram expostas a estresse por agitação, congelamento-descongelamento, pH ácido e calor. Os resultados indicam que o painel de variantes candidatas foi suscetível à degradação em extensões variáveis sob condições de estresse relevantes: • Nenhuma resposta significativa ao estresse de agitação foi observada por qualquer um dos métodos analíticos.

• Nenhuma resposta significativa ao estresse de congelamento- descongelamento foi observada pelos métodos de SEC ou CGE, no entanto a análise icIEF revelou diferenças na heterogeneidade de carga entre as variantes testadas e mostrou que as variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) exibiram a maior resistência às mudanças causadas pelo estresse de congelamento-descongelamento. • Uma resposta ao estresse de pH ácido foi observada por icIEF e SEC, em que todos os candidatos acumularam algumas impurezas após a exposição. As variantes mAb1 (IgG1 7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) exibiram a maior resistência ao estresse de pH ácido. • A resposta ao estresse mais significativa observada foi ao armazenamento da amostra a 50 °C. As análises de SEC, NR-CGE e icIEF revelaram uma tendência significativa de redução da pureza da amostra ao longo do tempo. A diminuição observada na pureza foi consistentemente maior para as variantes de IgG4 em comparação com as variantes de IgG1. No grupo das variantes de IgG1, (7.2 VH2/VK1) e mAb2 (IgG1 7.2 VH2/VK2) exibiram a mais alta resistência ao estresse por calor ácido.

[0261] Os resultados das propriedades de capacidade de desenvolvimento dos diferentes candidatos humanizados estão resumidos na Tabela 9 abaixo: Tabela 9: o candidato humanizado mAb1 tem propriedades de capacidade de desenvolvimento mais altas em comparação com todas as outras variantes humanizadas testadas

Candidato Nome Crescimento Estresse de Estresse Estresse térmico do congelamento- ácido - - análise de SEC agrupamento descongelamento análise de (Diferença em % (densidade de - diminuição da % SEC de agregados células viáveis de variantes (aumento medida pela a 10 dias/mL) e básicas1 (3 ciclos, na % de análise de SEC produtividade 6 ciclos e 10 agregados após 2 semanas (µg/mL) ciclos) em pH 3,5 a 50°C) após 24h) mAb1 7.2 VH2/ 54x106 1,2 0,2 13,9 VK1 IgG1 550 μg/mL 1,2 1,0 mAb2 7.2 VH2/ 30x106 0,9 0,8 13,1 VK2 IgG1 330 μg/mL 0,6 1,3 mAb3 20.1 n.d 2,1 0,3 18,3 VH3/ 2,0 VK1 IgG1 3,4 mAb4 7.2 VH2/ 44x106 1,9 4,4 33,6 VK1 IgG4 780 μg/mL 1,9 3,0 mAb5 7.2 39x106 1,6 5,1 35,4 VH2/VK2 475μg/mL 1,8 IgG4 2,8 mAb6 20.1 38x106 2,5 6,3 44,6 VH3/ 430μg/mL 2,4 VK1 IgG4 4,7 1 A alteração na % de variantes básicas foi calculada com base em resultados não arredondados, subtraindo a % de variantes básicas das amostras estressadas a partir da respectiva amostra de controle.

[0262] Como conclusão, a variante mAb1 apresentou os melhores resultados em termos de capacidade de desenvolvimento e foi selecionada como a candidata principal. Propriedades funcionais de variantes humanizadas de mAb 7.2 como moléculas monovalentes e bivalentes

1. Preparação de fragmentos de Fab e Fab2 a. Digestão de pepsina para geração de F(ab')2

[0263] Pepsina imobilizada em pasta fluida de 50% (kit Thermo Scientific, Cat. Nº 44988) foi trocado por tampão em tampão de digestão (acetato de sódio a 20 Mm pH 4,4) por rotação da pasta a 5000 g por 2 min. O sobrenadante foi descartado e a pasta fluida ressuspensa em tampão de digestão de 1 mL seguido por outra rotação a 5000g por 2min. Esta etapa foi repetida mais quatro vezes (cinco lavagens de resina no total). A resina foi então ressuspensa em tampão de digestão até o volume da pasta fluida original.

[0264] mAb 4, mAb 5 e mAb 6 (variantes de IgG4 7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 ou 20.1 VH3/VK1) foram trocados por tampão em tampão de digestão usando 5 ou 10 mL de coluna de rotação Zeba (dependente de escala) e concentrados em 3 mg/mL usando o concentrador Vivaspin (10.000 MWCO) de acordo com o protocolo do fabricante.

[0265] Os mAbs 4, 5 e 6 a 3 mg/mL (previamente trocados por tampão em tampão de digestão) foram misturados com pepsina imobilizada na resina e incubados a 37 °C rotacionando, 1,5 - 2 horas.

[0266] As misturas de digestão foram rotacionadas a 5000g por 2min. Os sobrenadantes foram removidos e filtrados em um tubo novo usando uma seringa apropriada e um pequeno filtro de 0,22µm (Merck Millipore, Millex Cat N° SLGV004SL). As resinas foram lavadas com PBS DE 1mL, rotacionadas a 5000g por 1min. Os sobrenadantes foram removidos, filtrados e combinados com os sobrenadantes anteriores. A etapa de lavagem foi repetida.

[0267] Os sobrenadantes digeridos e filtrados foram purificados usando coluna de exclusão de tamanho HiLoad 16/600 200 pg usando acetato de sódio a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 5,5 como uma fase móvel. As frações correspondentes ao fragmento de F(ab')2 eluído são agrupados, concentrados e esterilizados por filtração.

[0268] Os fragmentos de F(ab ')2 foram analisados por SDS-PAGE, SEC analítica e leitura de OD280nm. b. Digestão de papaína para geração de Fab

[0269] Papaína imobilizada em 50% de pasta fluída (kit Thermo Scientific, cat. Nº 20341) foi trocado por tampão em tampão de digestão (Fosfato de Sódio a 20 mM, EDTA a 10 mM, Cisteína a 150 mM pH 7,0) rotacionando a pasta fluida a 5000 g por 2 min. O sobrenadante foi descartado e a pasta fluida ressuspensa em um volume maior de tampão de digestão seguido por outra rotação a 5000g por 2 min. Esta etapa foi repetida mais quatro vezes (cinco lavagens de resina no total). A resina foi então ressuspensa em tampão de digestão até o volume da pasta fluida original.

[0270] mAb 4, mAb 5 e mAb 6 (variantes de IgG4 7.2 VH2/VK1, 7.2 VH2/VK2 ou 20.1 VH3/VK1) foram trocados por tampão em tampão de digestão usando 5 ou 10 mL de coluna de rotação Zeba (dependente de escala) e concentrados em 3 mg/mL usando o concentrador Vivaspin (10.000 MWCO) de acordo com o protocolo do fabricante.

[0271] Os mAbs 4, 5 e 6 a 3 mg/mL (previamente trocados por tampão em tampão de digestão) foram misturados com papaína imobilizada na resina e incubados a 37 °C rotacionando, 42 horas.

[0272] As misturas de digestão foram rotacionadas a 5000g por 2min. Os sobrenadantes foram removidos e filtrados em um tubo novo usando uma seringa apropriada e um pequeno filtro de 0,22µm (Merck Millipore, Millex Cat

N° SLGV004SL). As resinas foram lavadas três vezes com PBS, rotacionadas a 5000g por 1min, recolhendo e reunindo em cada ciclo o sobrenadante. As frações reunidas foram então filtradas em um tubo novo usando uma seringa apropriada e um filtro pequeno de 0,22 µm.

[0273] Os sobrenadantes digeridos e filtrados foram primeiramente trocados por tampão em 1xDPBS, pH 7,4, e então primeiramente purificados usando coluna de proteína A para remover Fc e mAbs não digeridos, seguido pela etapa de polimento usando coluna de exclusão por tamanho (SEC) com acetato de sódio a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 5,5 como fase móvel. As frações correspondentes aos fragmentos de Fab eluídos foram reunidos, concentrados e esterilizados por filtração.

[0274] Os fragmentos de Fab foram analisados por SDS-PAGE, SEC analítica e leitura de OD280nm.

2. Medição de afinidade de fragmentos Fab, F(ab')2 humanizados 7.2 e

20.1 e formato de IgG usando Biacore

[0275] A fim de avaliar a afinidade de anticorpos 7.2 e 20.1 condutores humanizados para BTN3A1 em seus diferentes formatos (Fab, F(ab') 2 e IgG), a análise cinética de ciclo único foi desempenhada usando um instrumento Biacore T200 (número de série 1909913) executando o Software de controle Biacore T200 V2.0.1 e software de avaliação V3.0 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Todas os experimentos cinéticos de ciclo único foram realizados a 25 °C com tampão de corrida HBS-P+ (pH 7,4) contendo BSA a 0,1% (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido).

[0276] O antígeno marcado com BTN3A1 His (Sino Biological, Pequim, China) foi diluído em tampão de corrida a uma concentração final de 0,4 μg/mL. No início de cada ciclo, BTN3A1-His foi capturado em Fc2 do chip sensor CM5 pré-acoplado usando um kit de captura His (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino

Unido) com química de amina padrão a uma vazão de 10 µL/min.

Um nível de imobilização (RL) de ~34 RU, 16 RU ou 11 RU, os diferentes valores teóricos para obter um RMax de ~50 RU foram usados para os analitos Fab, F(ab') 2 e IgG, respectivamente.

A superfície foi então deixada estabilizar.

Os dados cinéticos de ciclo único foram obtidos com as amostras purificadas (Fab, F(ab') 2 e IgG) a uma vazão de 40 µL/min para minimizar quaisquer efeitos potenciais de transferência de massa.

O sinal a partir do canal de referência Fc1 foi (nenhuma captura de antígeno) subtraído a partir de Fc2 para corrigir as diferenças na ligação não específica para a superfície de referência.

O sinal de cada execução em branco de BTN3A1-His (nenhum CD277) foi subtraído para corrigir as diferenças na estabilidade da superfície.

A fase de associação para as cinco injeções de concentrações crescentes foi monitorada por 240 segundos cada vez, e uma única fase de dissociação foi medida por 1400 segundos após a última injeção de analito.

A regeneração da superfície do chip foi conduzida usando duas injeções de glicina-HCL a 10 mM pH 1,5 seguido por um período de estabilização de 240 segundos.

Sensogramas brutos foram ajustados com um modelo 1:1 para amostras de Fab e com um modelo de analito bivalente para amostras de F(ab')2 e IgG de acordo com as diferentes valências dos analitos.

As constantes cinéticas foram calculadas para cada variante (vide Tabelas 10, 11 e 12) Tabela 10: Análise de IgG cinético de ciclo único IgG (ajuste bivalente)

Amostra Ka1 (1/Ms) Ka2 (1/Ms) Kd1 (1/s) Kd2 (1/s) Rmax (RU) Chi² (RU²)

mAb 1 (7.2 5,30 x 104 4,21 4,63 x 10-4 4,40 x 101 69,6 0,063 VH2/VK1)

mAb 2 (7.2 5,97 x 104 2,01 x 10-3 4,03 x 10-4 2,41 x 10-2 68,0 0,144 VH2/VK2)

mAb 3 (20.1 5,63 x 104 5,47 x 10-5 3,79 x 10-3 8,60 x 10-5 56,1 0,042 VH3/VK1) Tabela 11: Análise de cinética de ciclo único F(ab')2 F(ab')2 (ajuste bivalente) Amostra Ka1 (1/Ms) Ka2 (1/Ms) Kd1 (1/s) Kd2 (1/s) Rmax (RU) Chi² (RU²)

7.2 VH2/VK1 8,33 x 104 6,10 6,66 x 10-4 3,24 x 101 78,2 0,033 F(ab')2

7.2 VH2/VK2 1,46 x 105 3,40 3,94 x 10-4 5,46 x 101 58,9 0,126 F(ab')2

20.1 VH3/VK1 9,23 x 104 5,03 x 10-5 4,16 x 10-3 8,10 x 10-5 61,5 0,326 F(ab')2 Tabela 12: Análise de Fab cinético de ciclo único Fab (ajuste 1:1) Amostra Ka (1/Ms) Kd (1/S) KD(nM) Rmax (RU) Chi² (RU²)

7.2 VH2/VK1 Fab 1,98 x 105 6,39 x 10-4 3,22 66 0,114

7.2 VH2/VK2 Fab 2,22 x 105 6,69 x 10-4 3,01 61 0,091

20.1 VH3/VK1 Fab 1,76 x 106 3,57 x 10-2 20,30 55 1,330

3. Seleção do melhor candidato em termos de propriedades de afinidade

[0277] As variantes humanizadas 20.1 e 7.2 mostraram diferenças significativas em termos de propriedades de afinidade. Essas diferenças podem ser observadas com os formatos IgG e F(ab')2, mas a lacuna é ainda maior com fragmentos Fab: de fato, 20.1 mostrou um KD médio de 20,30 nM enquanto 7.2 mostrou um KD médio de 3,22 (VH2/VK1) ou 3,01 (VH2/VK2).

4. Avidez de ligação de mAb 1 a células T primárias e outras linhagens celulares

[0278] Em seguida, a avidez de ligação de mAb1 foi avaliada por citometria de fluxo em células T primárias humanas, bem como em várias linhagens celulares, incluindo WT e knock-out de BTN3A reconstituído com isoformas BTN3A1, BTN3A2 ou BTN3A3 individualmente (dados não mostrados). os valores de EC50 obtidos para cada tipo de célula testado estão resumidos na Tabela 13.

[0279] Os dados obtidos em células BTN3A KO indicaram claramente que o mAb1 se liga especificamente ao seu alvo. Adicionalmente, a reconstituição com isoformas individuais confirmou que mAb1 reconhece BTN3A1, BTN3A2 e BTN3A3 com avidez comparável. Todas as outras células testadas pareceram positivas para a ligação de mAb1 com uma faixa de EC50 valores indo de 9,6 nM para a linhagem celular de Daudi de linfoma de Burkitt a 112,3 nM para a linha de celular de adenocarcinoma colorretal HT29. Tabela 13: Avidez de ligação de mAb1 em células humanas. Células Descrição Gating EC50 EC50 (x10-9 M) µg/mL (+/-sem) (+/-sem) HV PBMC Primária (n = 6) CD3+ 5,25 (+/-0,57) 34,9 (+/-3,8) humano Daudi Linfoma de N/D 1,44 (+/-0,16) 9,6 (+/-1,04) Burkitt (n= 5) L-IPC Adenocarcinoma N/D 26,26 (+/-4,4) 175,1 (+/-29,3) (PDAC087T) ductal pancreático (n = 4) HT29 Adenocarcinoma N/D 16,84 (+/-3,1) 112,3 (+/-20,6) colorretal (n = 3) A549 Carcinoma N/D 6,53 (+/-1,8) 43,56 (+/-12,3) pulmonar (n = 6) HUVEC Endotelial N/D 12,8 (+/-1,98) 85,2 (+/-13,2) (n = 2) HEK293T WT Embrionária do N/D 6,2 (+/-0,44) 41,3 (+/-2,95) rim (n = 3) HEK293T Embrionária do N/D N/D N/D BTN3KO rim; Knock-out completo para BTN3A1, A2, A3 (n = 3) HEK293T Embrionária do CFP+ 2,4 (+/-0,34) 15,9 (+/-2,3) BTN3KO+3A1- rim; Knock-out CFP completo para

BTN3A1, A2, A3 transfectada transitoriamente com BTN3A1-CFP (n = 4) HEK293T Embrionária do CFP+ 1,88 (+/-0,39) 12,5 (+/-2,6) BTN3KO+3A2- rim; Knock-out CFP completo para BTN3A1, A2, A3 transfectada transitoriamente com BTN3A2-CFP (n = 5) HEK293T Embrionária do CFP+ 1,75 (+/-0,11) 11,68 (+/-0,72) BTN3KO+3A3- rim; Knock-out CFP completo para BTN3A1, A2, A3 transfectada transitoriamente com BTN3A3-CFP (n = 5) NA: Não aplicável

5. mAb1 não tem ligação fora do alvo

[0280] O potencial de ligação fora do alvo de mAb1 em outras moléculas não BTN3A foi avaliado pela tecnologia Retrogenix. Este trabalho teve como objetivo demonstrar a ausência de ligação fora do alvo por meio da triagem de uma matriz de células expressando > 5000 receptores de membrana humana ou proteínas secretadas expressas na superfície de células HEK293 (plataforma Retrogenix).

[0281] A investigação do nível de ligação de mAb1 a células HEK293 não transfectadas e a células que superexpressam BTN3A1, antes ou após a fixação celular, mostrou 5 μg/mL em células fixadas como uma condição de triagem adequada. Sob esta condição, mAb1 foi triado quanto à ligação contra células HEK293 humanas, expressando individualmente 5528 proteínas humanas, compreendendo proteínas da membrana da superfície celular e proteínas secretadas amarradas à superfície celular. Isso revelou dez resultados primários.

[0282] Cada resultado primário foi reexpresso, junto com dois receptores de controle (CD20 e EGFR), e testado novamente com 5 μg/mL de mAb1, 5 μg/mL de um anticorpo de controle de isotipo e outros tratamentos de controle positivo e negativo. Depois de remover cinco resultados não específicos, permaneceram cinco interações específicas para o anticorpo de teste. Todos os 5 resultados específicos foram relacionados com BTN3A; duas isoformas de BTN3A1, duas isoformas de BTN3A2 e uma isoforma de BTN3A3.

[0283] As conclusões do estudo são que nenhuma interação fora do alvo para mAb1 foi identificada, indicando alta especificidade de mAb1 para seu epítopo BTN3A.

6. mAb1 medeia ativação de células T Vγ9Vδ2 e morte de células tumorais

[0284] Originalmente, mAbs anti-BTN3A de camundongo foram mostrados para desencadear o reconhecimento de BTN3A por células T Vγ9Vδ2, mediando a ativação levando a (i) proliferação deste subconjunto específico em PBMCs humanos, (ii) produção de citocinas (IFN e TNFα), e (iii) a citólise de células alvo infectadas ou transformadas (por exemplo, por Perforin, granzimas, TRAIL) (Harly et al, Blood, 2012 & Benyamine, A. et al. 2016, Oncoimmunology 5, e1146843).

[0285] Sem estar vinculado a qualquer teoria particular, um mecanismo de ação proposto de mAb1 é que sua ligação a BTN3A expressa na superfície de uma célula alvo tumoral desencadeia uma mudança conformacional que permite sua sinalização ao seu contra-receptor em células T Vγ9Vδ2. A atividade de anticorpos anti-BTN3A é rotineiramente avaliada usando um ensaio in vitro com base na co-cultura de uma linhagem celular tumoral (o alvo) com células T Vγ9Vδ2 humanas primárias (o efetor) previamente expandidas a partir de PBMCs de doadores saudáveis por 10 a 14 dias, na presença de rHuIL-2 (200UI/mL) e aminobifosfonatos (Zometa, 1 µM). No final da fase de expansão,

a pureza das células T Vγ9Vδ2 é avaliada por citometria de fluxo e essas células são então congeladas para uso futuro. No dia anterior ao experimento, as células T Vγ9Vδ2 expandidas são descongeladas e cultivadas durante a noite com 200 UI/mL de rHuIL-2 para manter a sobrevivência in vitro. Após a co-cultura, a ativação de células T Vγ9Vδ2 é monitorada por detecção de citometria de fluxo da expressão de CD107a/b em células T γδ ou por quantificação da ativação de Caspase3/7, como uma medição de morte de células alvo.

[0286] Primeiramente, as células T Vγ9Vδ2 humanas expandidas a partir de 3 diferentes PBMCs de dadores saudáveis foram co-cultivadas com a Linhagem celular Daudi (ATCC-CCL213; linfoma de Burkitt) com concentrações crescentes de mAb1. Após 4 horas, as células foram analisadas quanto à expressão de células T Vγ9Vδ2 de CD107a/b por citometria de fluxo. Os resultados mostraram um aumento relacionado à concentração na porcentagem de células T Vγ9Vδ2 expressando CD107a/b, com uma EC50 médio de 0,89 nM (+/-0,39) (Figura 1A). Em paralelo, avaliamos a atividade citolítica das células T Vγ9Vδ2 contra células Daudi pulsadas com mAb1. Como mostrado na Figura 1B, mAb1 induziu apoptose de células-alvo de uma maneira dependente da concentração com um EC50 de 0,35 nM. Adicionalmente, a ativação de células T Vγ9Vδ2 (CD107a/b; Figura 1C painel superior) e lise de células tumorais (Casp3/7; Figura 1C painel inferior) foram testadas usando linhagens celulares tumorais de diferentes origens de tecido e em comparação com células Daudi. Os resultados mostraram que a ativação das células T Vγ9Vδ2 e a subsequente lise das células tumorais foram induzidas pela ligação de mAb1 às linhagens celulares de L-IPC (Adenocarcinoma Ductal Pancreático), A549 (Células epiteliais de carcinoma pulmonar) e HT29 (Adenocarcinoma colorretal).

7. mAb1 aumenta a morte de células T Vγ9Vδ2 de uma matriz ampla de linhagens celulares humanas que expressam BTN3A, independentemente de sua origem de tecido a. Material & Métodos. Cultura de células tumorais

[0287] HL-60 são linhagens celulares de promieloblastos humanos derivadas de leucemia promielocítica aguda. Daudi é uma linhagem celular linfoblásticas B humanas derivadas do linfoma de Burkitt. Jurkat é uma linhagem celular de leucemia de células T aguda.

[0288] HT-29 e HCT116 são células epiteliais humanas derivadas de adenocarcinoma colorretal.

[0289] PC3 e DU145 foram derivadas de carcinoma de próstata (sítio metastático, osso e cérebro, respectivamente).

[0290] SUM159 e MDA-MB-231 são linhagens celulares de câncer de mama triplo negativo (TNBC).

[0291] Células HL60, Daudi, Jurkat, DU145 e MDA-MB-231 foram cultivadas em RPMI Glutamax, FBS a 10%; Piruvato de sódio a 1 mM a 37 °C/CO2 a 5%. PC3 e HT-29 foram cultivados em DMEM 10% de FBS, piruvato de sódio a 1 mM a 37 °C/CO2 a 5%. HCT116 foram cultivados em meio McCoy 5a 10% de SVF. SUM159 foram cultivadas no meio F12 Mistura de Nutrientes 1X + Glutamax, SVF a 5%, 2mg/mL de Hidrocortisona, 2mg/mL de insulina humalog e Aminoácidos Não Essenciais. Expansão de células T V γ9Vδ2 in vitro.

[0292] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll de sangue periférico obtido a partir do Etablissement Français du Sang Provence Alpes Côte d'Azur (França). Para expandir as células T Vγ9Vδ2, 50,106 PBMCs foram ressuspensos a 1,5x106 células/mL em RPMI1640 suplementado com FBS a 10% e piruvato de sódio a 1% em frascos de 75 cm2 por 10 a 14 dias, na presença de rHuIL-2 (200UI/mL) e aminobifosfonatos (Zoledronato, 1 µM). A partir do dia 5, o rHuIL-2 foi renovado a cada 2 ou 3 dias e as células foram mantidas a 1x106/mL. No final da fase de expansão, a pureza das células T Vγ9Vδ2 foi avaliada por citometria de fluxo, e se o número de células T Vγ9Vδ2 atingiu 80% das células vivas, essas células foram congeladas em FBS com DMSO a 20% para uso futuro. Purificação de células T Vγ9Vδ2 a partir de PBMC humano.

[0293] PBMC humano fresco foi ressuspenso a 50.106 células/mL em PBS + FBS a 2% + EDTA a 1 mM. Vγ9Vδ2 foram isoladas usando o kit de isolamento de Células T Gama/Delta humanas EasySep™ (Stemcell Nº 19255) de acordo com as instruções do fabricante. Ao final do procedimento, a pureza celular foi medida por citometria de fluxo. As células CD3+ V9+ vivas eram mais de 80%. Ensaio de morte de células T Vγ9Vδ2.

[0294] 10.000 células T Vγ9Vδ2 expandidas ou frescas foram co-cultivadas com linhagens celulares tumorais em placas de 96 poços na razão indicada (E:T 1:1 ou 1:5) em RPMI 1640 + glutamax, FBS a 10% + NaPy a 1mM na presença de mAb1 ou controle de isotipo relevante. Quando adicionado à co-cultura, o rHuIL- 2 foi usado a 20 IU/mL. Após o tempo indicado, o ATP foi medido usando o reagente Glo (Promega Nº G7572) que gera um sinal luminescente proporcional ao número de células vivas. b. Resultados

[0295] Além de um método baseado na coloração de caspase 3/7 de células alvo para monitorar a morte após a co-cultura com Células T V9V2, desenvolvemos uma abordagem complementar com base na avaliação do número de células viáveis em cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas.

[0296] Com este ensaio, monitoramos a sobrevivência da linhagem celular de leucemia mielóide aguda HL60-WT, ou -BTN3A-KO, 24 horas após a co-cultura com Células T V9V2 expandidas (razão E:T 1:1) na presença de mAb1 ou controle de isotipo relevante +/-rHuIL-2 (20 IU/mL) (Figura A). Os resultados mostraram uma diminuição dependente da concentração da sobrevivência de HL60-WT na presença de mAb1, indicativo de uma morte dependente de BTN3A eficiente de células tumorais alvo por células T Vγ9Vδ2 ativadas. Experimentos similares foram realizados com Células T Vγ9Vδ2 in vitro expandidas ou frescamente isolado (Figura B e C respectivamente), e a viabilidade celular foi medida ao longo de um período de 4 dias.

[0297] A Figura B mostrou que as células T Vγ9Vδ2expandidas in vitro controlaram a proliferação de HL60-WT de uma maneira dependente da concentração. A adição de rHu-IL2 melhora a capacidade de morte de células efetoras ao longo do tempo, propensamente fornecendo sinais de sobrevivência necessários para a cultura in vitro de células T primárias. Resultados similares foram obtidos com células T Vγ9Vδ2 frescas isoladas de PBMC humano, co- cultivadas por 4 dias com HL60-WT na razão E:T de 1:1 e 1:5. Estes resultados são indicativos da capacidade das células T Vγ9Vδ2 individuais para engajar e matar repetidamente vários alvos tumorais após ativação mediada por mAb1 (Figura 2C).

[0298] Em seguida, usamos este ensaio para monitorar a atividade de morte de células T Vγ9Vδ2 mediadas por mAb1 contra linhagens celulares que expressam BTN3A de diferentes origens de tecidos (cólon, mama, próstata, linfoma T e linfoma de Burkitt). Células HT29, PC3, DU145, MDA-MB-231, HCT116, SUM159, Jurkat e Daudi foram co-cultivadas durante a noite com células T Vγ9Vδ2 expandidas in-vitro na presença de concentração crescente de mAb1 e a viabilidade celular foi medida. Os resultados confirmaram que o mAb1 aumentou a morte de células T Vγ9Vδ2 de uma matriz ampla de linhagens celulares humanas que expressam BTN3A, independentemente de sua origem de tecido (Erreur! Source du renvoi introuvable. e Figura). Tabela 15: 10.000 células tumorais foram co-cultivadas por 24 horas com células T Vγ9Vδ2 expandidas in vitro (razão E:T 1:1) na presença de diferentes concentrações de mAb1. A viabilidade celular foi medida usando um ensaio bioluminescente que detecta os níveis de ATP. Valores de bioluminescência x105 são indicados. mAb1 Sem mAb 0,1ug/mL mAb1 1ug/mL mAb1 10ug/mL Linhagem Origem celular dos Doador Doador Doador Doador Doador Doador Doador Doador tumorais tecidos A B A B A B A B HT29 Cólon 68,0 55,1 67,6 58,1 54,2 49,2 41,0 40,0 PC3 Próstata 86,2 73,5 83,3 68,5 48,6 49,7 36,8 38,0 DU145 Próstata 75,7 69,6 65,1 64,4 33,6 41,8 22,1 26,8 MDA- MB-231 Mama 66,5 59,8 68,2 59,8 57,6 54,7 43,4 44,4 HCT116 Cólon 114,1 102,7 102,9 96,3 63,6 68,3 53,4 59,4 SUM159 Mama 84,7 90,8 54,1 58,5 20,7 25,2 16,4 19,2 Linfoma Jurkat T 26,8 26,4 3,7 4,1 2,6 9,7 4,1 1,6 Linfoma de Daudi Burkitt 17,3 9,7 6,2 5,0 7,2 5,3 6,0 6,1

8. mAb1 melhora a terapia com células T Vγ9Vδ2 em um modelo de camundongo enxertado com linhagens celulares AML humanas.

[0299] Como o BTN3A alvo de mAb1 não é expresso em roedores, e a subpopulação de células T VgγVδ2 é específica para primatas, a prova experimental do conceito de atividade antitumoral de células T Vγ9Vδ2 é geralmente testada em camundongos NSG imunocomprometidos enxertados com linhagens celulares tumorais humanas que expressam BTN3A, e transferida de forma adotiva com células T Vγ9Vδ2 de doadores humanos saudáveis (as células T Vγ9Vδ2 em tais reconstituições são alogênicas à linhagem celular tumorais). Esses modelos têm sido amplamente usados para validar o potencial terapêutico antitumoral das células T Vγ9Vδ2 em uma ampla gama de malignidades sólidas, bem como hematológicas (Pauza, C.D. et al. 2018, Immunol. 9).

[0300] Além disso, o anticorpo BTN3A anti-humano murino, m20.1, administrado a camundongos que receberam células T Vγ9Vδ2 humanas, foi descrito como aumentando a sobrevivência animal e diminuindo a carga leucêmica no sangue e na medula óssea de camundongos NSG portadores de AML (benyamine et al 2016, vide acima). Neste modelo, m20.1 foi injetado em combinação com RLI, uma proteína de fusão rHuIL-15/IL-15Rα que mostrou expandir subconjuntos de linfócitos antitumorais e melhorar sua sobrevivência em camundongos, levando a uma melhor atividade antitumoral das células T Vγ9Vδ2 humanas transferidas.

[0301] Para uma caracterização adicional da eficácia de mAb1 em modelos in vivo de camundongos, investigamos o potencial da transferência de células T Vγ9Vδ2 humanas combinadas com mAb1 para atrasar o crescimento do tumor e melhorar a sobrevivência animal em camundongos NSG portadores de AML. a. modelo U937.

[0302] Camundongos fêmeas saudáveis de 6 a 8 semanas de idade (n=30) receberam 0,2x106 células U937 transduzidas com luciferase no Dia 0, conforme descrito em Gertner-Dardenne, J. et al. 2012. J. Immunol. 188, 4701-4708. No dia 1, a carga tumoral foi avaliada usando imagiologia bioluminescente e os camundongos foram aleatoriamente designados em seis grupos para receber injeções intravenosas de células T Vγ9Vδ2 humanas extintas in-vitro no Dia 1

(3x106 células) sozinhas ou combinadas com mAb1 anti-BTN3A ou controle de isotipo relevante (10 mg/kg, 200ug/camundongo). O tratamento foi repetido no dia 7. Nos grupos 2 e 4, os anticorpos também foram administrados nos dias 4 e

10. Como complexos de rHuIL-15/rHuIL15-Rα permitem a proliferação de células T Vγ9Vδ2 (J. Immunol. (2006) 177, 6072-608), esses complexos foram administrados junto com células T Vγ9Vδ2.

[0303] Todos os grupos são descritos na Tabela 16.

[0304] Os complexos hIL-15/IL-15R-Fc foram pré-complexados à temperatura ambiente (RT) por 30 minutos antes da injeção (0,2ug hIL-15+ 1,2ug IL-15R-Fc por camundongo) e misturados com células T Vγ9Vδ2 antes da injeção. O volume final para cada injeção foi de 100 µL. Os mAbs de tratamento foram injetados 4 horas antes do enxerto de células T Vγ9Vδ2.

[0305] Nossos resultados confirmaram que as células T Vγ9Vδ2 mais a infusão de rHuIL-15/rHuIL15-Rα diminuem a carga tumoral. Este efeito foi ainda mais notável e foi associado a um aumento significativo da sobrevivência quando o mAb1 anti-BTN3A foi adicionado junto com Células T Vγ9Vδ2 (Tabela 16 e Tabela 17). É importante ressaltar que a citarabina (Ara-C), uma das drogas mais eficazes para o tratamento da leucemia mielóide aguda, usada neste modelo de camundongo muito agressivo (10mg/kg em camundongos NSG com tumor U937) melhorou a sobrevivência dos camundongos por 2 a 3 dias (~10%), conforme observado com mAb1 combinado com transferência de células T Vγ9Vδ2 humanas.

[0306] Estes dados destacam o potente efeito anti-leucêmico exercido pelo mAb anti-BTN3A combinado com imunoterapia in vivo de células T Vγ9Vδ2. Tabela 16: Modelo de camundongos U937 AML: descrição do grupo. Grupo Dia 1 Dia 4 Dia 7 Dia 10 1 Não Não Não Não

2 Células T Vγ9Vδ2 (3x106 hIgG1 Células T Vγ9Vδ2 (3x106 hIgG1 células) + IL-15a (10mg/kg) células) + IL-15a (10mg/kg) +hIgG1 (10mg/kg) +hIgG1 (10mg/kg) 3 Células T Vγ9Vδ2 (3x106 Não Células T Vγ9Vδ2 (3x106 Não células) + IL-15a células) + IL-15a +mAb1 (10mg/kg) +mAb1 (10mg/kg) 4 Células T Vγ9Vδ2 (3x106 mAb1 Células T Vγ9Vδ2 (3x106 mAb1 células) + IL-15a (10mg/kg) células) + IL-15a (10mg/kg) +mAb1 (10mg/kg) +mAb1 (10mg/kg) 5 Células T Vγ9Vδ2 (3x106 Não Células T Vγ9Vδ2 (3x106 Não células) + IL-15a células) + IL-15a +mIgG1 (10mg/kg) +mIgG1 (10mg/kg) 6 Células T Vγ9Vδ2 (3x106 Não Células T Vγ9Vδ2 (3x106 Não células) + IL-15a células) IL-15a +m20.1 (10mg/kg) +m20.1 (10mg/kg) a: complexos rHu-IL-15/rHu-IL-15Rα. Tabela 17: O mAb que ativa anti-BTN3A (mAb1) tem atividade antileucêmica In Vivo em modelos de xenoenxerto de AML. Dados de bioluminescência do modelo U937. Camundongo Dia 1 Dia 7 Dia 14 Dia 19 1 1,10E+03 8,33E+04 1,06E+07 Morto 2 7,04E+03 2,50E+05 6,14E+07 Morto Grupo 1 3 7,57E+03 8,40E+04 2,41E+07 Morto

PBS 4 9,23E+03 2,55E+05 6,48E+07 Morto 5 1,37E+04 1,36E+05 3,58E+07 Morto Média 7,73E+03 1,62E+05 3,93E+07 N/D 1 3,24E+03 1,48E+04 5,23E+06 1,82E+08 Grupo 2 2 5,61E+03 1,39E+05 3,23E+07 Morto LTγδ+ 3 8,76E+03 3,44E+04 1,60E+07 2,23E+08 hIgG1 (Dias 1, 4, 7, 10) 4 9,87E+03 2,61E+04 1,66E+07 Morto

5 1,03E+04 2,90E+05 3,14E+07 3,19E+08 Média 7,56E+03 1,01E+05 2,03E+07 N/D 1 3,38E+03 5,38E+03 1,89E+06 1,87E+08 2 5,22E+03 3,68E+04 3,95E+06 2,04E+08 Grupo 3 3 7,49E+03 8,44E+04 1,23E+07 1,05E+08 LTγδ+ 4 7,73E+03 6,67E+04 4,93E+06 1,79E+08 mAb1 (Dias 1, 7) 5 1,29E+04 1,55E+04 5,32E+06 8,47E+07 Média 7,34E+03 4,18E+04 5,68E+06 1,52E+08 1 4,08E+03 1,32E+03 2,14E+06 8,98E+07 2 5,17E+03 7,58E+04 1,55E+06 1,79E+08 Grupo 4 3 9,21E+03 2,82E+04 6,82E+06 1,24E+08 LTγδ+ 4 8,97E+03 4,00E+04 6,38E+06 1,91E+08 mAb1 (Dias 1, 4, 7, 10) 5 1,00E+04 4,02E+04 3,65E+06 9,26E+07 Média 7,49E+03 3,71E+04 4,11E+06 1,35E+08 1 4,15E+03 4,01E+04 2,96E+06 1,19E+08 2 4,53E+03 7,96E+04 4,91E+06 2,40E+08 Grupo 5 3 9,72E+03 1,66E+05 1,46E+07 2,97E+08 LTγδ+ 4 8,92E+03 6,36E+04 1,35E+07 1,47E+08 mIgG1 (Dias 1, 7) 5 1,02E+04 3,97E+04 1,39E+07 1,91E+08 Média 7,50E+03 7,78E+04 9,97E+06 1,99E+08 1 4,34E+03 8,51E+04 3,55E+06 1,57E+08 2 4,42E+03 3,05E+04 4,28E+06 1,87E+08 Grupo 6 3 8,66E+03 6,62E+04 4,24E+06 5,55E+07 LTγδ+ 4 8,90E+03 3,05E+04 2,49E+06 7,32E+07 m20.1 (Dias 1, 7) 5 1,17E+04 1,62E+04 1,73E+06 9,61E+07 Média 7,60E+03 4,57E+04 3,26E+06 1,14E+08

Tabela 18: O mAb que ativa anti-BTN3A (mAb1) tem atividade antileucêmica in vivo em modelos de xenoenxerto de AML.

Sobrevivência após enxerto da linhagem celular U937. Camundongo Dia da Camundongo Dia da morte morte 1 18 1 20 2 18 Grupo 4 2 22 Grupo 1 PBS 3 19 LTγδ+ 3 23 4 19 mAb1 (Dias 1, 4, 7, 10) 4 23 5 19 5 24 Mediana 19 Mediana 23 1 20 1 20 Grupo 2 2 20 Grupo 5 2 20 LTγδ + 3 21 LTγδ+ 3 21 hIgG1 (Dias 1, 4, 7, 4 21 mIgG1 (Dias 1, 7) 4 21 10) 5 22 5 22 Mediana 21 Mediana 21 1 21 1 23 Grupo 3 2 21 Grupo 6 2 24 LTγδ + 3 22 LTγδ+ 3 24 mAb1 (Dias 1, 7) 4 24 m20.1 (Dias 1, 7) 4 24 5 24 5 24 Mediana 22 Mediana 24 b. modelo MOLM14.

[0307] A eficácia in vivo de mAb1 contra MOLM14, uma linhagem celular derivada de AML humana resistente a AraC, foi avaliada em um modelo de xenoenxerto usando camundongos NSG transplantados com a linhagem celular tumorais humanas e células T Vγ9Vδ2 humanas. O objetivo deste estudo foi confirmar o efeito de repetidas injeções iv de células T Vγ9Vδ2 humanas em combinação com mAb1 no crescimento do tumor e na sobrevivência dos camundongos.

[0308] Camundongos NSG fêmeas de seis a oito semanas de idade foram injetados por via intravenosa (iv) através da veia da cauda no dia 0 com 0,2x10 6 por camundongo em um volume de 100 µL de células MOLM14 (CVCL_7916) que expressam luciferase (luc2). A análise de bioluminescência foi desempenhada no dia 0 usando PhotonIMAGER (Biospace Lab) após a adição de luciferina livre de endotoxina (30 mg/kg) e os camundongos foram randomizados em grupos homogêneos de 7 camundongos com base na força do sinal de bioluminescência. 3x106 células T Vγ9Vδ2 humanas expandidas in vitro e complexos hIL-15/IL-15R foram injetados iv nos dias 1, 8, 15, 22 e 29. mAb1 ou hIgG1 foram injetados iv nos dias 1, 5, 8, 12, 15, 19, 22, 26 e 29.

[0309] Os diferentes grupos experimentais são resumidos na Tabela 19.

[0310] Os complexos hIL-15/IL-15R-Fc foram pré-complexados à temperatura ambiente (RT) por 30 minutos antes da injeção (0,2ug hIL-15+ 1,2ug IL-15R-Fc por camundongo) e misturados com células T Vγ9Vδ2 antes da injeção. O volume final para cada injeção foi de 100 µL. Os mAbs de tratamento foram injetados 4 horas antes do enxerto de células T Vγ9Vδ2.

[0311] O sinal de bioluminescência emitido pelas células MOLM14 foi medido nos dias 0, 7, 0, 7 e 21 e 28 após a injeção das células para acompanhar o crescimento do tumor. A amostragem de sangue foi conduzida no dia 19 para avaliar o número de células MOLM14 circulantes por citometria de fluxo. A lise das hemácias foi desempenhada antes da coloração. As células murinas mCD45+ foram excluídas da análise, as células tumorais MOLM14 foram detectadas por sua expressão de GFP. A aquisição foi desempenhada em um citômetro LSRII SORP (Becton Dickinson) e a análise foi realizada usando o software FlowJo. O monitoramento diário de camundongos quanto a sintomas de doença (perda significativa de peso, pelagem com bagunçada, costas arqueadas, fraqueza e mobilidade reduzida) determinou o momento da morte para animais injetados com sinais de sofrimento.

[0312] Como mostrado na Tabela 20, as células T Vγ9Vδ2 injetadas com isotipos de controle irrelevantes (hIgG1) não controlam significativamente o crescimento do tumor.

Em contraste, como mostrado por sinais de bioluminescência mais baixos, o crescimento do tumor foi fortemente reduzido quando o mAb1 anti-BTN3A foi administrado sequencialmente com células T Vγ9Vδ2 humanas.

Os resultados também mostraram uma diminuição significativa no número de blastos circulantes (avaliados por citometria de fluxo em sangue periférico) no dia 19 do protocolo (Tabela 20). É importante ressaltar que a diminuição dependente de mAb anti-BTN3A no crescimento do tumor leva a uma melhoria significativa de 45% na sobrevivência dos camundongos (em comparação com o respectivo controle de isotipo) (Tabela 22). Tabela 19: Modelo de camundongo MOLM14: descrição do grupo Grupo Número de Tratamento no dia 7 e 14 animais 1 6 PBS 2 7 Células T V9V2 (3x106 células) + IL15/IL15R-Fc + hIgG1 (10mg/kg) 3 7 Células T V9V2 (3x106 células) + IL15/IL15R-Fc + mAb1 (10mg/kg)

Tabela 20: Modelo de camundongo MOLM14: medição de bioluminescência nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 após o enxerto de células tumorais.

Camundongo Dia 0 Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28 1 5,1E+03 3,1E+04 1,1E+06 8,0E+06 Morto 2 1,4E+04 1,1E+04 2,5E+05 2,2E+06 Morto 3 8,0E+03 3,1E+04 1,6E+06 8,8E+06 Morto Grupo 1 PBS 4 7.2E+03 2,5E+04 7,4E+05 2,6E+06 Morto 5 7,7E+03 1,6E+04 4,5E+05 1,6E+06 Morto 6 4,0E+03 2,5E+04 1,6E+06 1,5E+07 2,4E+07 Média 7,59E+03 2,32E+04 9,57E+05 6,36E+06 N/D Grupo 2 1 9,5E+03 2,0E+04 7,4E+05 4,0E+06 1,0E+07

LTγδ+ 2 1,3E+04 5,6E+03 5,9E+05 3,1E+06 Morto hIgG1 3 7,7E+03 1,4E+04 6,0E+05 2,7E+06 Morto 4 3,1E+03 4,5E+03 1,6E+05 5,6E+06 7,4E+06 5 1,0E+04 1,2E+04 4,7E+05 5,5E+06 1,3E+07 6 6,4E+03 3,1E+04 7.2E+05 2,8E+06 Morto 7 8,8E+03 3,8E+03 2,1E+05 1,3E+06 5,4E+06 Média 8,45E+03 1,29E+04 4,97E+05 3,59E+06 N/D 1 1,2E+04 3,0E+03 1,1E+04 8,6E+04 1,4E+06 2 3,9E+03 2,0E+03 2,0E+04 2,3E+04 2,0E+05 Grupo 2 3 1,1E+04 3,4E+03 1,2E+05 2,6E+05 2,0E+06 LTγδ+ 4 1,2E+04 2,6E+03 7,0E+03 1,7E+04 1,5E+05 mAb1 5 5,7E+03 1,9E+03 1,4E+04 1,0E+05 5,2E+05 6 4,6E+03 1,3E+03 1,8E+04 2,6E+05 3,5E+06 7 5,1E+03 1,3E+03 1,2E+04 1,2E+05 2,2E+05 Média 7,76E+03 2,19E+03 2,88E+04 1,24E+05 1,13E+06

Tabela 21: Modelo de camundongo MOLM14: Número de blastos circulantes no dia 19 do protocolo.

Os dados representam o número de células/ul de sangue.

Camundongo Dia 19 1 6,1 2 3 Grupo 1 3 4,2 PBS 4 7,1 5 1,7 6 13,1 1 1,2 Grupo 2 2 1,1 LTγδ+ 3 3,3 hIgG1 4 1,3 5 4

6 0,9 7 0,5 1 0 2 0 Grupo 2 3 0,02 LTγδ+ 4 0 mAb1 5 0 6 0,02 7 0

Tabela 22: Modelo de camundongo MOLM14: sobrevivência animal.

O dia da morte de cada animal é indicado junto com a sobrevivência mediana de cada grupo.

Camundongo Dia da morte 1 23 2 26 3 27 Grupo 1 PBS 4 27 5 28 6 31 Mediana 27 1 27 2 27 3 27 Grupo 2 4 29 LTγδ 5 30 hIgG1 6 30 7 31 Mediana 29 Grupo 3 1 39 LTγδ 2 40 mAb1 3 41 4 42 5 43 6 43 7 46 Mediana 42

9. mAb1 melhora a terapia com células T Vγ9Vδ2 em um modelo de tumor sólido de camundongo enxertado com a linhagem celular de câncer de ovário humano SKOV-3. a. Material & Métodos. Expansão de células T Vγ9Vδ2 in vitro

[0313] Linfócitos T Vγ9Vδ2 humanos alogênicos foram amplificados a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de amostras de sangue de doadores saudáveis fornecidas pelo Etablissment Français du Sang (EFS, Nantes, França) e após centrifugação de densidade de Ficoll (Eurobio, Les Ulis, França). Em primeiro lugar, para expansões específicas de linfócitos T Vγ9Vδ2 humanos alogênicos periféricos, PBMC foi incubado com 3 μM de pirofosfato de bromoidrina (BrHPP), gentilmente fornecido pela Innate Pharma (Marseille, França) em meio RPMI suplementado com soro fetal de bezerro inativado por calor a 10%, L-glutamina a 2 mM, 10 mg/mL de estreptomicina, 100 IU/mL de penicilina (todos da Gibco) e 100 IU/mLIL-2 humana recombinante (PROLEUKIN, Novartis, Bale, Suíça). Após 4 dias, as culturas foram suplementadas com 300 IU/mL de IL-2. No dia 21, a pureza foi medida por citometria de fluxo (pureza> 90%). Linfócitos T Vγ9Vδ2 humanos puros foram adicionalmente expandidos usando células de alimentação (linfócitos B transformados com vírus Epstein Barr misturados e irradiados com 35 Gy e PBMC) e PHA-L em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inativado pelo calor, L-glutamina a 2 mM, 10 mg/mL de Estreptomicina,

penicilina 100 IU/mL (todos da Gibco) e IL-2 humana recombinante 300 IU/mL (Novartis). Após três semanas, linfócitos T Vγ9Vδ2 expandidos ex vivo em repouso foram usados para experimentos in vivo. Modelo de camundongo

[0314] No dia 0, camundongos NSG com 6-8 semanas de idade foram injetados intraperitonealmente (ip) com 1x106 células SKOV-3 (linhagem celular de câncer de ovário, SKOV-3-luc-D3, Perkin Elmer, Waltham, MA) expressando luciferase por camundongo em um volume de 100 µL de PBS estéril. Após 7 dias, camundongos foram randomizados em grupos homogêneos de 5 a 6 camundongos. Nos dias 7 e 14, os tratamentos com mAbs, 200 µg por camundongo de mAb1 ou controle de isotipo relevante (hIgG1), foram injetados ip em 100 µL de PBS estéril. 4 horas depois, 5x106 de células T Vγ9Vδ2 humanas expandidas in vitro humanas também foram injetadas ip em 100 µL de PBS estéril por camundongo.

[0315] O sinal de bioluminescência emitido pelas células SKOV-3 foi medido nos dias 16, 23 e 30 após a implantação das células tumorais para acompanhar o crescimento do tumor. A imagiologia bioluminescente foi realizada 8 minutos após a injeção ip de 1,5 mg de D-luciferina (Interchim, San Diego, CA), em camundongos anestesiados com 2% de isoflurano, com Imageador Biospace (Biospace Lab, Nesles-la-Vallée, França). O desfecho experimental foi alcançado quando os camundongos perderam 10% do seu peso inicial. b. Resultados

[0316] A eficácia in vivo de mAb1 contra o câncer de ovário foi avaliada em um modelo de xenoenxerto usando camundongos NSG transplantados com a linhagem celular de câncer de ovário humano SKOV-3 e células T Vγ9Vδ2 humanas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de duas injeções ip de células T Vγ9Vδ2 humanas em combinação com mAb1 no crescimento do tumor e na sobrevivência dos camundongos.

[0317] Os camundongos NSG foram injetados intraperitonealmente (ip) no dia 0 com SKOV3. Após 7 dias, os camundongos foram randomizados em grupos homogêneos de acordo com os tratamentos. Grupos são descritos na Tabela 23: Tabela 23: Modelo de camundongo com câncer de ovário: descrição do grupo Grupo Número de animais Tratamento no dia 7 e 14 1 5 PBS 2 6 Células T Vγ9Vδ2 (5x106 células) + hIgG1 (10mg/kg) 3 6 Células T Vγ9Vδ2 (5x106 células) + mAb1 (10mg/kg)

[0318] O resultado mostrou que as células T Vγ9Vδ2 humanas transferidas juntamente com mAb1 atrasaram significativamente o crescimento do tumor (Tabela 24), levando a uma melhoria significativa da sobrevivência do animal (Tabela 25). Digno de nota, este efeito foi observado na ausência de citocinas de sobrevivência pro-Vγ9Vδ2 T, como IL-2 ou IL-15. Tabela 24: Modelo de camundongo com câncer de ovário: medição de bioluminescência 16, 23 e 30 dias após o enxerto de células tumorais. Camundongo Dia 16 Dia 23 Dia 30 1 87220 Morto Morto 2 48486 92643 Morto Grupo 1 PBS 3 89032 89930 Morto 4 74242 121010 Morto 5 82132 128390 Morto Média 7,62E+04 1,08E+05 N/D Grupo 2 1 32060 70953 Morto LTγδ+ 2 82703 166009 Morto hIgG1 3 23049 51909 150537

4 85130 147390 Morto 5 18053 45097 Morto 6 41732 76461 Morto Média 4,71E+04 9,30E+04 NA 1 43000 42420 80574 Grupo 2 2 20706 43670 63418 LTγδ+ 3 6891 47150 70070 mAb1 4 11845 48139 36820 5 22958 29131 74111 6 12725 19767 Morto Média 1,97E+04 3,84E+04 6,50E+04 Tabela 25: Modelo de camundongo com câncer de ovário: sobrevivência animal.

O dia da morte de cada animal é indicado junto com a sobrevivência mediana de cada grupo.

Camundongo Dia da morte 1 20 2 23 Grupo 1 PBS 3 23 4 23 5 28 Mediana 23 1 23 Grupo 2 2 23 LTγδ+ 3 28 hIgG1 4 28 5 28

Mediana 28 1 28 2 35 Group 3 3 35 LTγδ+ 4 35 mAb1 5 35 6 39 Mediana 35

10. Efeito in vivo nas células T Vγ9Vδ2 de macaco Cinomolgo

[0319] Devido à ausência de BTN3A e do subconjunto T Vγ9Vδ2 em roedores, e com base em dados anteriores que documentam a ativação de células T Vγ9Vδ2 mediada por PAg in vitro e in vivo em macacos Cinomolgo, o macaco Cinomolgo (Macaca fascicularis) foi selecionado como a única espécie relevante para avaliação de segurança não clínica de mAb1. A. Material e Métodos Biacore

[0320] mAb1 foi avaliado quanto à ligação a proteínas recombinantes humanas ou de Cinomolgo BTN3A1, BTN3A2 e BTN3A3 (SEQ ID NO 21, 22 e 23, respectivamente) por meio de análise cinética multiciclo Biacore usando um instrumento Biacore T200 (número de série 1909913). mAb1 foi diluído a uma concentração de 2 μg/mL em BSA/PBS a 2%. No início de cada ciclo, cada anticorpo foi capturado na superfície de proteína A a uma densidade (RL) de ~150 RU (valor teórico para obter um RMax de ~50 RU). Após a captura, a superfície foi deixada estabilizar antes da injeção do antígeno BTN3A. BTN3A foi titulado em 0,1% de BSA/HBS-P+ (tampão de corrida) em uma faixa de diluição de duas vezes de 25 a 0,78 nM. A fase de associação foi monitorada por 420 segundos e a fase de dissociação por 2000 segundos. Os dados cinéticos foram obtidos usando uma vazão de 50 µL/min para minimizar quaisquer efeitos potenciais de transferência de massa. Os dados obtidos foram ajustados usando um modelo de ligação 1:1.

ELISA

[0321] A aparente afinidade de mAb1 para BTN3A1 humano e de Cinomolgo foi testada por ELISA. Resumidamente, a ligação de mAb1 no alvo foi avaliada usando BTN3A1 recombinante imobilizado em uma placa a 1 µg/mL em tampão de fosfato (1x PBS), seguido por uma etapa de saturação com tampão de bloqueio (2% de leite/PBS)). O mAb1 foi titulado em tampão de bloqueio em uma faixa de diluição de quatro vezes a partir de 0,00122 a 20 µg/mL. Um anticorpo secundário (Cadeia de Igk de cabra anti-humano, anticorpo conjugado com HRP, Millipore AP502P, diluído 1:4000 em tampão de bloqueio) e solução TMB foram usados para a detecção. A afinidade aparente foi expressa como o EC50% (a concentração de anticorpos necessária para obter 50% do platô do sinal). Avidez de ligação de mAb1 a células CD3+ humanas e de Cinomolgo.

[0322] Após hemólise, PBL humano ou de Cinomolgo foi incubado com concentração crescente de mAb1 ou controle de isotipo por 30 min a 4°C, lavado duas vezes e colorido com um anticorpo secundário conjugado de cabra anti- humano-IgG-PE (eBioscience™ Nº 12-4998-82). Após 2 lavagens, as células foram coloridas com um mAb anti-CD3-PC3 (BD Bioscience Nº 557749) e reagente vivo/Morto (Life Technology Nº L10119). Após as lavagens, as células foram ressuspensas em 200 µL de tampão de fluxo. As células foram então analisadas em um citômetro Cytoflex (Beckman Coulter). Os dados foram analisados usando o software FlowJo (Versão 10, FlowJo, LLC, Ashland, EUA) com base na população CD3+ viva. Os valores de MFI do canal de PE foram então calculados e representados graficamente contra a concentração. O ajuste de curvas foi obtido usando a equação sigmoidal 4PL do software GraphPad Prism. Expressão de superfície de BTN3A em células circulantes humanas e de Cinomolgo.

[0323] Para expressão de superfície de BTN3A em leucócitos, 100ul de sangue total de Cinomolgo e humano foi semeado em placas de 96 poços com um coquetel de anticorpos específicos (reagente Aqua live Dead, CD20-V450, CD8-BV605, CD4-BV650, Vg9 TCR-FITC, anti-BTN3A-PE (clone 20.1) (ou mIgG1- PE para controle de isotipo), CD3-PeCy7, CD45-AF700 e CD14-APC-H7) e incubado 15 minutos à RT protegido da luz. Em seguida, as hemácias foram lisadas com 900ul de reagente de lise (BD Bioscience Nº 349202) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram lavadas e analisadas usando citometria de fluxo multiparamétrica. Para expressão de superfície de BTN3A em hemácias e plaquetas, 100ul de sangue total de Cinomolgo ou humano foi diluído com 100 uL de PBS e incubados com um coquetel específico de anticorpos (Aqua live dead, CD41-APC, CD45-AF700 e anti-BTN3A (clone 20.1) (ou mIgG1-PE para controle de isotipo)) por 15 minutos em RT protegido da luz. Após as lavagens, as células foram analisadas por citometria de fluxo multiparamétrica. A fim de obter uma quantificação relativa da expressão de superfície de BTN3A, grânulos de calibração (CellQuant Calibrator Biocytex Nº 7208) e IgG anti-camundongo de cabra (H+L)-PE foram usados em paralelo de acordo com as instruções do fabricante. Para cada subconjunto de células, MFI do canal PE foi reportado para anti-BTN3A e controle de isotipo. A análise foi desempenhada subtraindo o MFI do controle de isotipo a partir do MFI da coloração anti-BTN3A e a expressão de superfície relativa foi calculada com base na curva padrão obtida com grânulos de calibração. Expansão e ativação de células T Vγ9Vδ2 de Cinomolgo in-vitro.

[0324] O sangue total de Cinomolgo de 3 animais foi tratado com tampão de hemólise. Após lavagens extensas, os leucócitos foram semeados a 1,5 M/mL de RPMI SVF a 10% em placas de 6 poços na presença de rHuIL-2 (200IU/mL) e mAb1 (10ug/mL). rHuIL-2 foi adicionado no dia 6 e 8 para imitar o protocolo de expansão celular usual usado com PBMC humano e melhorar a sobrevivência in vitro de células T Vγ9Vδ2 a longo prazo, a fim de obter um número suficiente de células para desempenhar ensaios funcionais. A porcentagem de células T Vγ9+ foi avaliada nos dias 0, 6, 8 e 10 usando um coquetel de anticorpos específicos e análise de citometria de fluxo (CD3-PC7 BD Bioscience Nº 557749, Vg9 TCR-FITC clone 7A5 Invitrogen Nº TCR2720, Live Dead IR ThermoFisher Nº L10119).

[0325] No dia 10, as células T Vγ9Vδ2 expandidas foram contadas e co- cultivadas na razão E:T de 1:1 com linhagens celulares tumorais humanas.

100.000 linhagens celulares tumorais alvo (Raji, DAUDI e K562) foram misturadas com 100.000 células T Vγ9Vδ2 de Cinomolgo na presença de controle de isotipo mAb1 ou hIgG1 (10ug/mL) ou PMA (20ng/mL)/ionomicina (1ug/mL) usados como controle positivo em placas de 96 poços. A desgranulação de células T Vγ9Vδ2 foi monitorada após 4 horas usando coloração CD107a/b (BD bioscience Nº 555800) e análise de citometria de fluxo. Estudo in vivo de macaco Cinomolgo Estudo em vida

[0326] Macacos Cinomolgo (Macaca fascicularis) de origem vietnamita com 4 a 6 anos de idade e 3 a 5 kg foram utilizados neste estudo. Todos os animais foram mantidos e usados de acordo com as diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais em uma instalação GPL para animais. Como um procedimento de saúde do criador, todos os animais foram testados para tuberculose e tratamentos profiláticos foram documentados nos registros do criador. Após a chegada, os animais foram aclimatados aos procedimentos de estudo por um período de pelo menos 2 semanas. Uma inspeção clínica para problemas de saúde e testes para tal, foram realizados. Uma avaliação de saúde animal foi desempenhada por um veterinário antes do início da fase de pré-dose para confirmar a adequação de cada animal para o estudo.

[0327] mAb1 foi administrado por via intravenosa (cadeira presa, infusão durante 15 minutos) após desinfecção da pele de animais que não jejuaram. Os animais dos grupos 1, 4 e 5 tiveram dose administrada nos dias 1, 8, 15 e 22. Os animais dos Grupos 2 e 3 tiveram dose administrada uma vez no Dia 1. Farmacocinética

[0328] Um ensaio farmacocinético qualificado foi desenvolvido para a quantificação de mAb1 em soro de macaco Cinomolgo. Resumidamente, mAb1 é quantificado usando ELISA por espectrofotometria. Uma placa pré-revestida com estreptavidina é usada para capturar o conjugado de biotina IgG-Fc PK humano. mAb1 é então capturado na superfície da placa e o analito ligado é detectado usando o anticorpo de cabra anti-humano IgG-HRP (específico para Fc), um anticorpo anti-espécie marcado com peroxidase. A faixa alvo de quantificação é de 90 ng/mL a 10.000 ng/mL em soro puro. Imunofenotipagem

[0329] Amostras de sangue (1,0 mL) foram retiradas de todos os animais a partir da veia cefálica do antebraço ou veia safena em tubos de Li-heparina. A imunofenotipagem foi realizada com coquetéis de anticorpos monoclonais específicos. Análises do número relativo de células (porcentagem de linfócitos/leucócitos) foram realizadas. As contagens totais de granulócitos/linfócitos/leucócitos foram determinadas no mesmo dia por hemoanalisador e usadas para o cálculo dos números absolutos. Os números absolutos das subpopulações de linfócitos foram computados a partir de números relativos.

Ocupação do Receptor

[0330] Amostras de sangue (400 µL) foram retiradas de todos os animais a partir da veia cefálica do antebraço ou veia safena em tubos de Li-heparina. Um anticorpo marcado que se liga de maneira não competitiva a BTN3A (clone

103.2) nas células, que foi pré-incubado com um excesso de ICT01, foi usado para determinar a expressão de BTN3A de superfície total em células T CD3+ e células B CD19+. Para a detecção de sítios de ligação de BTN3A livres, foi usada a ligação competitiva de mAb1 não marcado a BTN3A que inibe a ligação de anticorpo anti-BTN3A marcado com corante fluorescente (mAb1) em células T CD3+ e células B CD19+. Dependendo da quantidade de BTN3A que foi bloqueada por mAb1, a intensidade média de fluorescência (MFI) de mAb1 conjugado foi medida conforme a média geométrica foi reduzida. Consequentemente, uma intensidade de coloração de Ab7.2 próxima à do anticorpo de isotipo foi indicativo de uma saturação completa. b. Resultados mAb1 se liga a BTN3A de Cinomolgo.

[0331] Como a identificação diferencial dos 3 genes da isoforma BTN3A não foi possível a partir de bancos de dados públicos, ImCheck realizou PCR direcionado em cDNA isolado a partir de PBMC de Cinomolgo, usando uma sequência de cDNA altamente conservada próxima ao domínio de transmembrana para projetar um iniciador relevante. O sequenciamento de produtos de PCR permitiu a identificação de sequências de ectodomínio para Cinomolgo BTN3A1, BTN3A2 e BTN3A3. Os ectodomínios recombinantes de Cinomolgo BTN3A1, BTN3A2 e isoformas de BTN3A3 fundidos à tag 6xHis foram produzidos em células de CHO com base nessas sequências (SEQ ID NO 21, 22 e 23 respectivamente).

[0332] As proteínas recombinantes foram testadas para ligação de mAb1 por BIAcore e ELISA (Tabela 26). Os resultados do BIAcore mostraram que o mAb1 se liga vantajosamente aos 3 Cinomolgo recombinantes BTN3A1, BTN3A2 e BTN3A3, embora com uma afinidade mais baixa para a isoforma BTN3A1. ELISAs foram desempenhados em isoformas BTN3A1. Curiosamente, a Tabela 26 mostra Ec50 comparável para ligação de mAb1 em humanos ou Cinomolgo BTN3A1 recombinantes. Tabela 26: Ligação de mAb1 a proteínas recombinantes de BTN3A humano e de Cinomolgo Proteína Etiqueta KD (M) - BIAcore EC50 (M) - ELISA (MCK) BTN3A1 humano (Sino C-ter His 0,408E-9 0,93E-9 biológico Nº 15973-H08H) CynoBTN3A1 C-ter-His 83,8E-09 1,33E-9 CynoBTN3A2 C-ter His 5,97E-09 nd CynoBTN3A3 C-ter His 2,67E-09 nd nd: não determinado

[0333] Em paralelo, a ligação de mAb1 em PBMCs de Cinomolgo foi avaliada por citometria de fluxo. O EC50 médio de ligação de mAb1 a células T CD3+ de Cinomolgo foi comparável à de células T CD3+ humanas (Tabela 27). A expressão alvo em diferentes subpopulações de células imunes de Cinomolgo versus o sangue total de doador humano saudável foi abordada por citometria de fluxo multiparâmetro, usando mAb anti-BTN3A conjugado com PE (clone 20.1) juntamente com um painel de anticorpos de fenotipagem com reatividades cruzadas conhecidas para humanos e marcadores de superfície de células de macaco Cinomolgo (dados não mostrados). Estes resultados mostram que BTN3A é expresso em um amplo painel de populações de células sanguíneas periférico em ambas as espécies, embora uma expressão aparente, geralmente mais baixa, tenha sido observada em macacos Cinomolgo.

Tabela 27: Ligação de mAb1 em células T CD3+ humanas e de Cinomolgo

A EC50(µg/mL)(+/- EC50 (x10-9 Células Origem Descrição Gating sem) M) (+/-sem) HV PBMCs EFS Marseille Primária CD3+ 5,25 (+/-0,57) 34,9 (+/-3,8) humanos (n=6) PBMCs de Covance Primária CD3+ 7,02(+/-0,89) 46,79(+/- Cinomolgo Munster (n=6) 5,94) mAb1 promove a expansão e ativação das células T Vγ9Vδ2 de Cinomolgo in vitro.

[0334] Em seguida, a atividade funcional de mAb1 foi avaliada em células T Vγ9Vδ2 de Cinomolgo in vitro. Em primeiro lugar, avaliamos se mAb1 promove a expansão de células T Vγ9Vδ2 de Cinomolgo quando incubado por 10 dias com PBMCs de Cinomolgo. Como mostrado na Figura 4A, mAb1 promoveu a expansão de células T Vγ9Vδ2 em todos os 3 animais testados; esta população chegando a 60% após 10 dias, nível comparável ao observado para células humanas. Após 10 dias de expansão, as células foram co-cultivadas por 4 horas com as linhagens celulares Daudi, K562 ou Raji usadas como células alvo na presença de mAb1 e analisadas quanto à expressão de CD107a/b por citometria de fluxo. Este experimento mostrou que mAb1 induz uma ativação significativa de células T Vγ9Vδ2 quando co-cultivado com todas as 3 linhagens celulares tumorais (Figura 4B).

[0335] Em conclusão, os resultados mostram que (i) mAb1 se liga a células de Cinomolgo com uma avidez similar à das células humanas, (ii) BTN3A é expresso nas mesmas células sanguíneas em humanos e macacos Cinomolgo, embora um nível de expressão inferior tenha sido observado nos últimos e (iii) mAb1 promove a expansão do subconjunto de células T Vγ9Vδ2 em PBMC de Cinomolgo, e as células expandidas são reativas contra células alvo tumorais pulsadas com mAb1. mAb1 afeta o compartimento de células T de Cinomolgo Vg9Vd2 in vivo.

[0336] Um estudo in vivo foi conduzido em macacos Cinomolgo fêmeas saudáveis de 4 a 6 anos de idade que receberam infusões intravenosas únicas ou repetidas de mAb1 (Tabela 28).

[0337] A via intravenosa de administração foi escolhida porque é a via terapêutica humana pretendida. Os animais foram tratados com mAb1 de acordo com um projeto de dose escalonada ascendente. Tabela 28: Projeto de Estudo de Tolerabilidade/PK/PD de mAb1 Grupo Item de teste Dose (mg/kg) Número de Número e sexo injeções semanais dos animais 4 (doses 1F (animal 1 0,1-1-10-100 crescentes) sentinela) 2 1 1 3F mAb1 3 10 1 2F 4 10 4 2F 5 100 4 2F

[0338] Os seguintes desfechos foram avaliados: sinais clínicos, peso corporal, patologia clínica (hematologia, química clínica e coagulação), imunofenotipagem para populações de leucócitos do sangue periférico, marcadores de ativação/proliferação/diferenciação, farmacocinética e farmacodinâmica (ocupação do receptor BTN3A nas células T e B circulantes).

[0339] Todos os animais sobreviveram até a necropsia programada no dia 29 do estudo, após receberem infusões únicas ou 4 repetidas de 15 minutos do mAb1. Nenhum efeito relacionado ao artigo de teste foi encontrado no peso corporal ou no consumo de alimentos. Os sinais clínicos foram consistentes com observações vistas em macacos Cinomolgo em cenários de alojamento de laboratório e, portanto, não atribuíveis a um artigo de teste. Farmacocinética

[0340] mAb1 mostrou comportamento farmacocinético aproximadamente proporcional à dose após administração intravenosa (IV) ao longo do intervalo de dose de 0,1 a 100 mg/kg (dados não mostrados) e uma meia-vida de eliminação longa típica de mAbs IgG na ausência de depuração mediada por alvo. Após doses repetidas de 10 ou 100 mg/kg/semana para 4 doses (dados não mostrados), a exposição foi mantida em todos os animais durante o período de tratamento, com apenas acumulação mínima ao longo do período de tratamento de 4 semanas. Os perfis farmacocinéticos para o animal sentinela após as doses de 1 e 10 mg / kg IV em um regime de dosagem semanal crescente mostraram alguma evidência de aumento da depuração no final do intervalo de dosagem semanal que pode ser um resultado da formação de ADAs para mAb1; não houve evidência de aumento da depuração após a última dose IV de 100 mg/kg. Ocupação do Receptor (RO)

[0341] De acordo com o perfil de expressão de BTN3A e representação da população de células no sangue, o mAb1 RO foi medido em células T CD3+ e células B CD20+.

[0342] Os resultados mostram que BTN3A é rapidamente ocupado após a injeção de mAb1 em ambas as células T CD3+ e células B CD20+ (dados não mostrados). A dosagem repetida de 100 mg/kg de mAb1 pareceu ser necessária para uma ocupação total do receptor ao longo do intervalo de dosagem semanal. Imunofenotipagem

[0343] Em pontos de tempo selecionados após cada dose, o sangue de animais que receberam mAb1 foi colorido com um coquetel de mAbs específicos para quantificar subconjuntos de células T (células T CD4, CD8, Vγ9, células T regulatórias), células B, monócitos, células NK, mDCs, pDCs e granulócitos e marcadores de ativação associados (CD69, CD86, CD95, Granzima B, Ki67) e analisado por citometria de fluxo. A análise incluiu números relativos de células (porcentagem de linfócitos/leucócitos) para cada população juntamente com números absolutos de células extrapolados de contagens de linfócitos/leucócitos totais determinadas a partir de amostras de sangue colhidas ao mesmo tempo e analisadas usando um contador de células hematológicas.

[0344] As principais observações desta análise ampla são:

[0345] Vδ9 + células T (% entre CD3+) cai significativamente após a dosagem em todos os animais que recebem mAb1 e volta a subir progressivamente em animais de dose única. Este efeito parece ser específico, uma vez que não é observado em células T CD4 e CD8 αβ, e é sugestivo de ativação de células T γδ e marginação nos tecidos, conforme observado para anticorpos bi-específicos engajadores de CD3 em macacos e humanos (Smith et al., 2015 Sci Rep. 2015 Dec 11;5:17943. doi: 10,1038/srep17943.). Os resultados são mostrados na Figura 5.

[0346] Este estudo mostra que o mAb1, quando administrado pela via IV, parece ser bem tolerado em doses de até 100 mg/kg/semana. Além disso, entre os subconjuntos de células T, as células T Vγ9Vδ2 são especificamente e significativamente afetadas por mAb1. Bibliografia

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405.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-BTN3A isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo de cadeia pesada variável VH de SEQ ID NO:1 e um polipeptídeo de cadeia leve variável VL de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 3.

2. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga ao polipeptídeo BTN3A humano.

3. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que se liga ao polipeptídeo BTN3A humano com um KD de 10 nM ou menos, preferencialmente com um KD de 5 nM ou menos conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície.

4. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo induz a ativação de células T Vγ9Vδ2 em co-cultura com células que expressam BTN3, com um EC50 abaixo de 5 μg/mL, preferencialmente de 1 μg/mL ou abaixo, conforme medido em um ensaio de degranulação.

5. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de IgG1 mutante ou quimicamente modificada, em que a referida região constante de IgG1 mutante ou quimicamente modificada confere nenhuma ou ligação diminuída aos receptores Fcγ quando comparado a um anticorpo correspondente com região constante do isotipo IgG1 de tipo selvagem.

6. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida região constante de IgG1 mutante é IgG1 mutante triplo L247F L248E e P350S.

7. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que mAb1 compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO:4 e uma cadeia leve de SEQ ID NO:6.

8. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso (i) como um terapêutico ou (ii) como um diagnóstico.

9. Anticorpo anti-BTN3A isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de um câncer, opcionalmente em combinação com outros princípios ativos, por exemplo, um anticorpo anti-PD1 ou anti-PD-L1, ou uma citocina, tal como IL-2 ou IL-15 ou suas variantes peguiladas.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-BTN3A em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável, opcionalmente compreendendo outros princípios ativos, por exemplo, um anticorpo anti-PD1 ou anti-PD-L1, ou uma citocina, tal como IL-2 ou IL-15.

11. Formulação liofilizada, uma seringa pré-preenchida ou um frasco, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-BTN3A definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

12. Vetor de expressão para a produção recombinante de um anticorpo anti-BTN3A definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um ácido nucleico que codifica o referido anticorpo anti-BTN3A.

13. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos os ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves de mAb1 definido na reivindicação 7.

14. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão definido na reivindicação 12 ou 13.

15. Processo para a produção de um anticorpo anti-BTN3A definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivo da célula hospedeira definida na reivindicação 14 para expressão do referido anticorpo pela célula hospedeira; opcionalmente (ii) purificação do referido anticorpo; (iii) recuperação do anticorpo.