CN105209491A - 针对TNFα的双重特异性结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

提供了结合TNFα、IL-13、PEG2和/或NGF的工程改造的多价和多特异性结合蛋白，连同制备方法和在预防、诊断和/或治疗疾病中的用途。

Description

针对TNFα的双重特异性结合蛋白
本申请根据要求2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/794,964的优先权，所述临时申请通过引用全文并入本文。
公开了结合TNFα、IL-13、PGE2和/或NGF的多价和多特异性结合蛋白以及制备方法和使用所述结合蛋白在诊断、预防和/或治疗急性和慢性炎性疾病、癌症以及其它疾病中。
本领域已知工程改造的蛋白，诸如能够结合两种或更多种抗原的多特异性结合蛋白。可以使用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术生成此类多特异性结合蛋白。存在本领域中已知的多种多特异性结合蛋白结构，且许多结构和方法具有明显的缺陷。
已经使用四源杂交瘤(quadroma)技术生产双特异性抗体。然而，用该技术引起的错误配对的副产物的存在以及显著降低的产率意味着需要进行复杂的纯化程序。也可以通过化学缀合两种不同的mAb产生双特异性抗体。然而，该方法不能获得均质制品。
先前使用的其它方法包括用异源双功能交联接头偶联两个亲本抗体，产生串连单链Fv分子、双抗体、双特异性双抗、单链双抗和双-双抗(di-diabodies)。然而，这些方法中的每一种都具有缺点。此外，已经描述在IgG重链中包含两个Fab重复且能够结合四个抗原分子的多价抗体构建体(参见PCT公开号WO 0177342和Miller等(2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61)。
美国专利号7,612,181(通过引用全文并入本文)提供能够以高亲和力结合两种或更多种抗原的新颖结合蛋白家族，其被称作双重可变结构域结合蛋白(DVD结合蛋白)或双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)。DVD-Ig分子是可用于同时结合相同分子上、或两种不同分子上的两种不同表位的蛋白。DVD是由融合至N-末端恒定区的两个可变结构域构成的独特结合蛋白。所述可变结构域可以彼此直接融合，或经由分级的(assorted)长度和氨基酸组成的合成肽接头连接。可以工程改造具有完整的且功能性的Fc结构域的DVD-Ig蛋白，使它们介导适当的效应功能。由于其可变结构域对、两个抗原结合结构域的取向和连接它们的接头长度的选择的灵活性，DVD-Ig形式可提供新颖治疗方式。
尽管本领域中提供一些具有优点和缺点的多种结构，但制备具有特异性特性且结合特异性目标的多价结合蛋白需要特定构建体。此外，新的可变结构域序列可以进一步改善结合蛋白的特性。例如，仍需要展现出对TNFα和选自IL-13、PGE2或NGF的第二目标标的更好靶向和/或所期望的结合效力，例如，以预防、诊断和/或治疗自身免疫、炎性或神经病症的构建体。因此，本领域中需要能够结合TNFα、IL-13、PGE2和/或NGF的改进的多价结合蛋白。
因此，本文公开了使用美国专利号7,612,181(通过引用全文并入本文)中公开的结合蛋白构架且含有特定的第一和第二多肽链的双重可变结构域免疫球蛋白，所述第一和第二多肽链各自包含第一和第二可变结构域，所述可变结构域包含形成用于结合目标诸如TNF-α、IL-13、PGE2和/或NGF的功能性结合位点的序列(例如，选自列于表1中的那些序列)。在一些实施方案中，所述结合蛋白的第一和第二多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中：VD1是第一可变结构域；VD2是第二可变结构域；C是恒定结构域；X1是接头；X2是存在或不存在的Fc区；n是0或1，并且，其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成针对TNF-α、IL-13、PGE2或NGF的第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成针对TNF-α、IL-13、PGE2或NGF的第二功能性目标结合位点。在一些实施方案中，Fc结构域存在于一条多肽链上，且不存在于另一条多肽链上，或在两条多肽链上都不存在。在一些实施方案中，每一条多肽链上的第一和第二可变结构域(即，VD1和VD2)的序列选自表1中的序列，以形成功能性结合位点。在一些实施方案中，所述第一和第二可变结构域的序列各自含有来自表1中列出的所选序列的三个CDR(即，CDR 1-3)，且与表1中所示的相同的顺序排列，由此形成功能性结合位点(即，所述结合结构域能够结合至它们的目标抗原TNF-α、IL-13、PGE2或NGF)。在一些实施方案中，所述第一和第二多肽链上的配对可变结构域序列(即，第一链上的VD1序列与第二链上的VD1序列配对，且第一链上的VD2序列与第二链上的VD2序列配对)形成用于结合目标TNF-α、IL-13、PGE2和/或NGF的功能性结合位点。在一些实施方案中，所述结合蛋白能够以改善的结合亲和力和/或中和效力结合至TNF-α、IL-13、PGE2和/或NGF。
附图说明
图1是根据本发明的某些实施方案的双重可变结构域(DVD)结合蛋白构建体的示意图。
详述
TNF-α在与涉及免疫和炎性要素的多种疾病相关的病理学中发挥作用，所述疾病诸如自身免疫性疾病，尤其是与炎症相关的疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease)，银屑病(包括斑块状银屑病(plaque psoriasis))，关节炎(包括类风湿性关节炎，银屑病关节炎(psoratic arthritis)，骨关节炎，或幼年性特发性关节炎)，多发性硬化症，全身性红斑狼疮和强直性脊柱炎。
白介素13(IL-13)是由Th2谱系的经活化T细胞产生的17-kDa糖蛋白。IL-13的功能包括，在人B细胞中免疫球蛋白同种型转换成IgE，以及抑制炎性细胞因子产生。IL-13主要与呼吸道炎症(诸如哮喘)相关。其还已与其它变应性疾病、纤维变性病况、癌症和传染性疾病相关。
本文公开了针对TNFα、IL-13、PGE2和/或NGF的改善的结合蛋白。
结合蛋白
在一些实施方案中，公开了包含第一和第二多肽链的结合蛋白，所述第一和第二多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中：VD1是第一可变结构域；VD2是第二可变结构域；C是恒定结构域；X1是接头；X2是存在或不存在的Fc区；n在第一和第二多肽链上独立地是0或1，且其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性目标结合位点。在一些实施方案中，所述结合蛋白能够结合TNFα、IL-13、PGE2和NGF中的一种或多种。在一些实施方案中，所述结合蛋白在第一和第二多肽链上包含VD1序列(即，第一链上的VD1序列与第二链上的VD1序列配对)，其一起形成能够结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF的结合结构域。在一个实施方案中，提供了能够以高亲和力结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF的结合蛋白。在一些实施方案中，所述结合蛋白能够在VD1位置结合TNFα，且在VD2位置结合第二目标(IL-13、PGE2或NGF)。在一些实施方案中，所述结合蛋白能够在VD1位置结合第二目标(IL-13、PGE2或NGF)且在VD2位置结合TNFα。
本文公开的结合蛋白包含能够结合至第一和第二目标抗原的VD1和VD2结合结构域。如本文中使用，VD1结构域或VD2结构域，或者VD1位置或VD2位置，可以指一条多肽链上的可变结构域序列(例如，VD1重链序列)，或第一和第二多肽链两者上的可变结构域序列(例如，VD1重链序列和VD1轻链序列)，其一起形成功能性结合位点。
在一些实施方案中，形成VD1结合位点的VD1序列选自表1中的配对序列(例如，表1中的SEQ ID NO: 32和33的配对序列，其一起形成针对IL-13的结合位点)。在一些实施方案中，形成VD2结合位点的VD2序列选自表1中的配对序列(例如，表1中的SEQ ID NO: 32和33的配对序列，其一起形成针对IL-13的结合位点)。在一些实施方案中，VD1和/或VD2序列包含选自表1的序列的CDR1-3，但具有不同的可变结构域构架序列(例如，CDR嫁接、亲和力成熟、人源化、人源化且回复突变的可变结构域，或表1中公开的序列的其它功能性变体)。
当所述结合蛋白包含来自选自表1的序列的CDR时，所述CDR以表1中的序列指定的顺序排列，且被合适的构架序列分隔以形成功能性结合位点。形成针对目标的功能性结合位点(即，针对TNFα、IL-13、PGE2或NGF的结合位点)的选自表1的配对序列，或来自那些序列的CDRs，可置于第一和第二多肽链上的VD1或VD2位置，以形成在VD1或VD2结构域的结合位点。例如，形成针对IL-13的结合位点的来自表1的匹配重链和轻链可变结构域序列(例如，SEQ ID NO: 34和35)可置于第一和第二多肽链上的VD1位置，以形成针对IL-13的VD1结合位点。在另一个实例中，形成针对IL-13的结合位点的来自表1的匹配重链和轻链序列(例如，SEQ ID NO: 34和35)可置于第一和第二多肽链上的VD2位置，以形成针对IL-13的VD2结合位点。相同或不同的序列可以占据VD1和VD2位置两者。例如，SEQ ID NO: 34和35可用于形成在VD1位置和VD2位置的结合结构域，或者SEQ ID NO: 34和35可形成在VD1和VD2位置之一的结合结构域，而可以选择不同的序列对以形成在另一个位置的结合结构域。类似地，可选择表1中的任何其它序列用于第一和第二多肽链上的VD1和VD2位置之一或两者。
在一些实施方案中，结合蛋白中的第一和第二多肽链上形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域序列(即，在VD1和/或VD2位置)可包含选自表1中那些序列的配对可变结构域序列，或来自那些序列的CDR1-3。例如，形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域可包含SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33，SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35，SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37，或来自那些配对可变结构域序列的CDR1-3。例如，形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域可包含来自一条多肽链上的SEQ ID NO: 32的CDR1-3，其与来自另一条链上的SEQ ID NO: 33的CDR1-3配对。
在一些实施方案中，结合蛋白中的第一和第二多肽链上形成针对TNF的功能性目标结合位点的可变结构域序列(即，在VD1和/或VD2位置)可包含选自表1中那些序列的配对可变结构域序列，或来自那些序列的CDR1-3。例如，形成针对TNF的功能性目标结合位点的可变结构域可包含SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49，或来自那些配对可变结构域序列的CDR1-3。例如，形成针对TNF的功能性目标结合位点的可变结构域可包含来自一条多肽链上的SEQ ID NO: 38的CDR1-3，其与来自另一条链上的SEQ ID NO: 39的CDR1-3配对。
在一些实施方案中，结合蛋白中的第一和第二多肽链上形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域序列(即，在VD1和/或VD2位置)可包含选自表1中那些序列的配对可变结构域序列，或来自那些序列的CDR1-3。例如，形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域可包含SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51，SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53，SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55，或来自那些配对可变结构域序列的CDR1-3。例如，形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域可包含来自一条多肽链上的SEQ ID NO: 50的CDR1-3，其与来自另一条链上的SEQ ID NO: 51的CDR1-3配对。
在一些实施方案中，结合蛋白中的第一和第二多肽链上形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域序列(即，在VD1和/或VD2位置)可包含选自表1中那些序列的配对可变结构域序列，或来自那些序列的CDR1-3。例如，形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域可包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57，或来自那些配对可变结构域序列的CDR1-3。例如，形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域可包含来自一条多肽链上的SEQ ID NO: 56的CDR1-3，其与来自另一条链上的SEQ ID NO: 57的CDR1-3配对。
在一个实施方案中，结合蛋白包含针对TNF的功能性目标结合位点(即，在VD1或VD2位置的TNF结合位点)和针对IL-13的功能性目标结合位点(即，在VD2或VD1位置的IL-13结合位点)。在一个实施方案中，TNF结合位点包含来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3。在一个实施方案中，TNF结合位点包含SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，或SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49。在一个实施方案中，IL-13结合位点包含来自SEQ ID NO: 32的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 33的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 34的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 35的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 36的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 37的CDR1-3。在一个实施方案中，IL-13结合位点包含SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33，SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35，或SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37。在一个实施方案中，第一和/或第二多肽链上的X1接头包含SEQ ID NO: 1-31中的任一者。在一个实施方案中，所述结合蛋白包含第一和第二多肽链，所述第一和第二多肽链包含表2中列出的配对重链和轻链SEQ ID NO中的任一者。在一个实施方案中，所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约5.8 x10-11 M 的KD结合TNF，和/或能够以通过TNF中和测定测量的至多约0.731 nM 的IC50中和TNF，和/或所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约1.2 x10-9 M的KD结合IL-13，和/或能够以在IL-13中和测定中测量的至多约1.379 nM的IC50中和IL-13。
在一个实施方案中，结合蛋白包含针对TNF的功能性目标结合位点(即，在VD1或VD2位置的TNF结合位点)和针对PGE2的功能性目标结合位点(即，在VD2或VD1位置的PGE2结合位点)。在一个实施方案中，TNF结合位点包含来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3。在一个实施方案中，TNF结合位点包含SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，或SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49。在一个实施方案中，PGE2结合位点包含来自SEQ ID NO: 50的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 51的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 52的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 53的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 54的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 55的CDR1-3。在一个实施方案中，PGE2结合位点包含SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51，SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53，或SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55。在一个实施方案中，第一和/或第二多肽链上的X1接头包含SEQ ID NO: 1-31中的任一者。在一个实施方案中，所述结合蛋白包含第一和第二多肽链，所述第一和第二多肽链包含表3中列出的配对重链和轻链SEQ ID NO中的任一者。在一个实施方案中，所述结合蛋白能够以在TNF中和测定中测量的至多约3.076、或约2.876 nM的IC50中和TNF，和/或所述结合蛋白能够以在PGE2中和测定中测量的至多约124.8 nM、34.78 nM、12.05 nM、或1.136 nM的IC50中和PGE2。
在一个实施方案中，结合蛋白包含针对TNF的功能性目标结合位点(即，在VD1或VD2位置的TNF结合位点)和针对NGF的功能性目标结合位点(即，在VD2或VD1位置的NGF结合位点)。在一个实施方案中，TNF结合位点包含来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3。在一个实施方案中，TNF结合位点包含SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，或SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49。在一个实施方案中，NGF结合位点包含来自SEQ ID NO: 56的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 57的CDR1-3。在一个实施方案中，NGF结合位点包含SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57。在一个实施方案中，第一和/或第二多肽链上的X1接头包含SEQ ID NO: 1-31中的任一者。在一个实施方案中，所述结合蛋白包含第一和第二多肽链，所述第一和第二多肽链包含表4中列出的配对重链和轻链中的任一者。在一个实施方案中，所述结合蛋白能够以在TNFα中和测定中测量的至多约0.673 nM、或约0.279 nM的IC50中和TNF，和/或所述结合蛋白能够以在NGF抑制测定中测量的至多约7.455 nM、或约2.895 nM的IC50抑制NGF。
在一些实施方案中，上述结合蛋白包含第一和第二多肽链中每条上的X1接头和两条链之一上的X2 Fc区。X1接头独立地存在或不存在于每一条链上(即，n在每一条链上独立地选自0或1)。在第一和第二多肽链上X1接头，如果存在，可具有相同或不同的序列。在一个实施方案中，在第一和第二多肽链上的X1是短(“S”)(例如，6个氨基酸或更短)接头。在另一个实施方案中，在第一和第二多肽链上的X1是长(“L”)(例如，大于6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，第一链上的X1是短接头且第二链上的X1是长接头。在另一个实施方案中，第一链上的X1是长接头且第二链上的X1是短接头。在一些实施方案中，第一和/或第二多肽链上的X1接头独立地选自SEQ ID NO: 1-31中的任一者。在一些实施方案中，结合蛋白第一和/或第二多肽链上的X1不是完全的CH1或CL结构域，但可包含那些结构域的部分。在一些实施方案中，第一链上的X1不是CH1，第二链上的X1不是CL，或第一链上的X1不是CL，且第二链上的X1不是CH1。在一些实施方案中，第一和/或第二多肽链上的X1接头的选择可以影响结合蛋白的结合动力学(例如，选择基于GS的接头可显著改善结合亲和力和/或效力)。
在一些实施方案中，X2(Fc区)存在于第一多肽链上且不存在于第二多肽链上，而在其它实施方案中，X2存在于第二链上且不存在于第一链上，或X2不存在于第一和第二链两者上。在一些实施方案中，X2是变体序列Fc区。在某些实施方案中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。在一些实施方案中，所述结合蛋白是结晶结合蛋白。
在一些实施方案中，所述结合蛋白的第一多肽链，如上所述，是重链，且第二多肽链是轻链。在某些实施方案中，当第一多肽链是重链且第二多肽链是轻链时，X1独立地存在或不存在于每条链上(即，n在每条链上独立地选自0或1)，且X2存在于重链上且不存在于轻链上。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含重链和/或轻链多肽链上的X1接头，其独立地选自SEQ ID NO: 1-31中的任一者。
在一些实施方案中，上述的任何结合蛋白可包含两条第一多肽链和两条第二多肽链以及四个功能性结合位点。例如，第一和第二多肽链可在结合蛋白的一条臂上配对，以形成两个功能性结合位点(在VD1和VD2位置)，而第二组第一和第二多肽链可在结合蛋白的另一条臂上配对，以形成两个额外的功能性结合位点(在VD1和VD2位置)。图1中显示具有两个臂的四链结构的实例，每一个臂包含第一和第二多肽链和两个功能性结合位点。在一些实施方案中，第一和第二臂上的VD1和VD2位置的结合结构域是相同的。在其它实施方案中，第一和第二臂在VD1和VD2位置含有不同的结构域。在一些实施方案中，VD1和VD2结合结构域包含选自表1的可变结构域序列，或包含来自所选序列的CDR。
在各个实施方案中，上述结合蛋白可包含选自野生型和突变序列的恒定区氨基酸序列。在一些实施方案中，使用野生型人κ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，使用野生型人λ轻链恒定区序列。在一些实施方案中，使用野生型或突变型人IgG重链恒定区序列。在一些实施方案中，使用野生型或突变型人IgG1重链恒定区序列。在某些实施方案中，所述突变序列是表4a中所示的序列。在一些实施方案中，本文公开的结合蛋白包含野生型人κ轻链恒定区序列，且也包含野生型人重链IgG1恒定区序列。
在一个实施方案中，提供包含结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF的多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表存在或不存在的Fc区，n是0或1。在一个实施方案中，结合蛋白中的VD1和/或VD2是重链可变结构域。在一个实施方案中，结合蛋白中的VD1和/或VD2是轻链可变结构域。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合相同的抗原。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合不同的抗原。在又另一个实施方案中，C是重链恒定结构域。例如，X1是接头，条件是X1不是CH1。
在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白包含结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF的多肽链，其中多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，X2是存在或不存在的Fc区。在一个实施方案中，X1是接头，条件是X1不是CH1。
在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白包含结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF的多肽链，其中多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，X2不存在。在一个实施方案中，X1是接头，条件是X1不是CL。
在另一个实施方案中，结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF且包含两条多肽链的结合蛋白，其中第一多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是第一接头，且X2是Fc区；且第二多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是第二接头，且X2不存在(即，第二多肽链上没有Fc)。在一些实施方案中，第一和第二多肽链上的X1是相同的。在其它实施方案中，第一和第二多肽链上的X1是不同的。在一些实施方案中，第一X1不是CH1结构域和/或第二X1不是CL结构域。在一个实施方案中，第一X1和第二X1是短(如，6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，第一X1和第二X1是长(如，多于6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，第一X1是短接头，第二X1是长接头。在另一个实施方案中，第一X1是长接头，且第二X1是短接头。
在一个实施方案中，本公开提供包含四条多肽链的双重可变结构域(DVD)结合蛋白，其中第一两条多肽链中的每一条包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是第一接头，且X2是Fc区；且第二两条多肽链中的每一条包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是第二接头，且X2不存在(即，第二两条多肽链上没有Fc)。此类DVD结合蛋白具有四个抗原结合位点。在一些实施方案中，第一两条多肽链是相同的，且第二两条多肽链是相同的，其中第一多肽链之一与第二多肽链之一配对，在所述DVD结合蛋白的每一个臂上形成两个目标结合位点。在一些实施方案中，第一和第二多肽链上的X1是相同的。在其它实施方案中，第一和第二多肽链上的X1是不同的。在一些实施方案中，第一X1不是完全的CH1结构域和/或第二X1不是完全的CL结构域。在另一个实施方案中，本文公开的结合蛋白能够结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF。因此，在一些实施方案中，所述结合蛋白包含至少两个能够以任何方向结合TNFα和IL-13、TNFα和PGE2、或TNFα和NGF的可变结构域序列(例如，VD1和VD2)(即，能够在VD1位置结合TNFα、IL-13、PGE2或NGF，且在VD2位置相同)。在一些实施方案中，VD1和VD2是独立选择的。因此，在一些实施方案中，VD1和VD2可包含相同的SEQ ID NO，并且，在其它实施方案中，VD1和VD2可包含不同的SEQ ID NO。
在一个实施方案中，本公开提供包含各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2的第一和第二多肽链的结合蛋白，其中VD1是第一可变结构域；VD2是第二可变结构域；C是恒定结构域；X1是接头，条件是其不是CH1；X2是Fc区，其存在于一条多肽链上，且不存在于另一条链上；且n是0或1，其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性目标结合位点，且其中(a)所述结合蛋白能够结合TNFα和IL-13，其中(i)形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 38-49的序列，和/或所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约5.8x10-11 M的KD结合TNFα，和/或(ii)形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 32-37的序列，和/或所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约1.2x10-9 M的KD结合IL-13；(b)所述结合蛋白能够结合TNFα和PGE2，其中(i)形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 38-49的序列和/或所述结合蛋白能够以通过TNFα中和测定测量、通过表面等离振子共振测量的至多约3.076 nM的IC50抑制TNFα，和/或(ii)形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 50-55的序列，和/或所述结合蛋白能够以通过PGE2中和测定测量的至多约124.8 nM的IC50抑制PGE2；或(c)所述结合蛋白能够结合TNFα和NGF，其中(i)形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 38-49的序列，和/或所述结合蛋白能够以通过TNFα中和测定测量的至多约0.673 nM的IC50抑制TNFα，和/或(ii)形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 56-57的序列，和/或所述结合蛋白能够以通过TF-1细胞增殖生物测定测量的至多约7.455 nM的IC50抑制NGF。
在另一个实施方案中，提供了包含各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2的第一和第二多肽链的结合蛋白，其中VD1是第一可变结构域；VD2是第二可变结构域；C是恒定结构域；X1是接头，条件是其不是CH1；X2是Fc区，其存在于一条多肽链上且不存在于另一条链上；且n是0或1，其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性目标结合位点，且其中(a)所述结合蛋白能够结合TNFα和IL-13，其中(i)形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 44的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 45的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 46的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 47的CDR1-3；来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3；和/或所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约5.8x10-11 M的KD结合TNFα，和/或(ii)形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域包含来自SEQ ID NO: 32的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 33的CDR1-3；来自SEQ ID NO: 34的CDR1-3 和来自SEQ ID NO: 35的CDR1-3；或来自SEQ ID NO: 36的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 37的CDR1-3；和/或所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约1.2x10-9 M的KD结合IL-13；(b)所述结合蛋白能够结合TNFα和PGE2，其中(i)形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 44的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 45的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 46的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 47的CDR1-3；来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3；和/或所述结合蛋白能够以通过TNFα中和测定测量的至多约3.076 nM的IC50抑制TNFα，和/或(ii)形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域包含来自SEQ ID NO: 50的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 51的CDR1-3；来自SEQ ID NO: 52的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 53的CDR1-3；或来自SEQ ID NO: 54的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 55的CDR1-3；和/或所述结合蛋白能够以通过PGE2中和测定测量的至多约124.8 nM的IC50抑制PGE2；或(c)所述结合蛋白能够结合TNFα和NGF，其中(i)形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含: 来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，来自SEQ ID NO: 44的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 45的CDR1-3，或来自SEQ ID NO: 46的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 47的CDR1-3；来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3；和/或所述结合蛋白能够以通过TNFα中和测定测量的至多约0.673 nM的IC50抑制TNFα，和/或(ii)形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域包含来自SEQ ID NO: 56的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 57的CDR1-3；和/或所述结合蛋白能够以通过TF-1细胞增殖生物测定测量的至多约7.455 nM的IC50抑制NGF。
在一个实施方案中，结合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中VD1是第一重链可变结构域；VD2是第二重链可变结构域；C是重链恒定结构域；X1是接头，条件是其不是CH1；X2是Fc区；n是0或1，且其中第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C，其中VD1是第一轻链可变结构域；VD2是第二轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；X1是接头，条件是其不是CH1；n是0或1；且该链不包含Fc区；且n是0或1，其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性目标结合位点。
在另一个实施方案中，(a)所述结合蛋白能够结合TNFα和IL-13，其中(i)形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：(1)SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，(2)SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，(3)SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，(4)SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO: 45，(5)SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47；(6)SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；和/或(ii)形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域包含：(1)SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33，(2)SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35，或(3)SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37。
在另一个实施方案中，所述结合蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中所述结合蛋白包含四个功能性目标结合位点。在另一个实施方案中，X1是SEQ ID NO: 1-31中的任一者。在另一个实施方案中，X1不是CL。在另一个实施方案中，Fc区是选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。
在另一个实施方案中，本公开提供能够结合TNFα和IL-13的结合蛋白，其包含来自表2的任何DVD-Ig VH和VL。
在另一个实施方案中，本公开提供能够结合TNFα和PGE2的结合蛋白，其包含来自表3的任何DVD-Ig VH和VL。
在另一个实施方案中，本公开提供能够结合TNFα和NGF的结合蛋白，其包含来自表4的任何DVD-Ig VH和VL。
在另一个实施方案中，所述结合蛋白包含本文表1中所示的配对的重链和轻链序列，形成来自配对的重链和轻链的功能性结合位点。
在一个实施方案中，重链、轻链、两条链或四条链实施方案中的任一者都包括至少一个X1接头，其包含：
或基于G/S的序列(例如，G4S和G4S重复；SEQ ID NO: 31)。在一个实施方案中，X1不是恒定区，不是CH区，和/或不是CL区。在一个实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。在一个实施方案中，所述接头是第一链上的GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 29)和/或第二链上的 GGSGGGGSG(SEQ ID NO: 30)。在一个实施方案中，所述接头是第一链上的GGSGGGGSG(SEQ ID NO: 30)和/或第二链上的GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 29)。
在一个实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，Fc区是变体Fc区。在又另一实施方案中，Fc区，如果存在，是天然序列Fc区或变体序列Fc区。在又另一个实施方案中，Fc区是来自IgG1的Fc区，来自IgG2的Fc区，来自IgG3的Fc区，来自IgG4的Fc区，来自IgA的Fc区，来自IgM的Fc区，来自IgE的Fc区，或来自IgD的Fc区。
结合蛋白特性
用作人治疗剂(例如，用作抗炎性药剂或神经药剂)的结合蛋白的开发和产生可以不仅仅需要鉴定能够结合至期望的一种或多种目标的结合蛋白。本文公开的结合蛋白表现出以下类别中的一种或多种的有利特性：(a)针对内部和外部抗原-结合结构域的结合动力学(结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)和亲和力)，(b)在多种生物化学和细胞生物学测定中的功效，(c)在相关肿瘤模型中的体内效力，(d)药代动力学和药效动力学特性，(e)可制造性，包括在所选细胞系中的蛋白表达水平，可扩展性，翻译后修饰，物理化学特性，诸如单体百分比，溶解度和稳定性(内在的、冷冻/解冻，储存稳定性，等)，(f)制剂特性，(g)潜在的免疫原性风险，(h)毒理学特性，和(i)结合模式和价。结合模式和价可影响分子的结合特性和细胞功效。
本文公开的结合蛋白表现出上面列出的类别中的一些或每种的有利特性，包括与针对相同目标、但包含不同的可变结构域和/或接头序列的其它结合蛋白相比，在VD1和VD2位置两者令人惊讶地高的结合亲和力。还已发现，出人意料地，本文公开的结合蛋白可以，在一些实施方案中，与针对相同目标、但包含不同的可变结构域和/或接头序列的其它结合蛋白相比，表现出一种或多种特性的优异组合，诸如，以下中的一种或多种：有效的结合动力学、改善的中和能力、增强的体内效力、优异的可配制性、期望的糖基化模式、有利的药代动力学概况和宿主细胞中的有效表达。
例如，已出人意料地发现，许多本文公开的结合蛋白以与它们各自的亲本抗体的亲和力大致相当的亲和力(即，相同数量级内)结合它们的目标。参见，例如，表5-8和10中的亲本抗体和结合蛋白的比较。这是令人惊讶的，因为从使用双重可变结构域结合结构之前可已经预计结合亲和力的丧失。在一些实施方案中，与针对相同的目标、但包含不同的可变结构域和/或接头序列的其它结合蛋白相比，本文公开的结合蛋白表现出令人惊讶有利的物理化学特征，包括溶解度、粘性、冷冻解冻后的稳定性和/或在热应激过程中缺乏其它显著变化。在一些实施方案中，与双重施用针对相同目标的分开抗体相比，和/或与针对相同目标、但包含不同的可变结构域和/或接头序列的其它结合蛋白相比，本文公开的结合蛋白表现出降低的体内免疫原性。
在各个实施方案中，与针对炎性、自身免疫或神经性病况的其它治疗相比，本文公开的结合蛋白表现出改善的特性，例如改善的安全性、增加的稳定性、更高的功效、降低的炎性或免疫应答或其它有利的体内人治疗特性。适合于比较的治疗可以包括，例如施用小分子抗炎性或神经药剂，双重施用针对本文公开的抗体结合的相同目标的分开抗体，或施用针对相同目标、但包含不同的可变结构域和/或接头序列的其它结合蛋白。在一些实施方案中，本文公开的结合蛋白表现出相对于针对自身免疫、炎性或神经病况的目前护理治疗标准的改善的特性。例如，所述结合蛋白可表现出改善的结合动力学、优异的体内治疗效力、增强的可配制性(包括降低的凝集和改善的储存稳定性)、改善的药代动力学、降低的炎性或免疫应答和/或增强的宿主细胞表达水平。
结合蛋白的制备
在另一方面，本公开提供制备结合TNFα和/或IL-13的结合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备结合TNFα和/或IL-13的结合蛋白的方法包括步骤：a)获得结合TNFα的第一亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得结合IL-13的第二亲本抗体或其抗原结合部分；c)确定亲本抗体或其抗原结合部分的可变结构域的序列；d)使用那些可变结构域序列制备编码本文描述的任何结合蛋白的构建体；和e)表达所述多肽链，使得生成结合TNFα和IL-13、TNF和PGE2或TNF和NGF的结合蛋白。
提供了制备结合TNFα和/或PGE2的结合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备结合TNFα和/或PGE2的结合蛋白的方法包括步骤：a)获得结合TNFα的第一亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得结合PGE2的第二亲本抗体或其抗原结合部分；c)制备编码本文描述的任何结合蛋白的构建体；和d)表达所述多肽链，使得生成结合所述第一和第二抗原的结合蛋白。
提供了制备结合TNFα和/或NGF的结合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备结合TNFα和/或NGF的结合蛋白的方法包括步骤：a)获得结合TNFα的第一亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得结合NGF的第二亲本抗体或其抗原结合部分；c)制备编码本文描述的任何结合蛋白的构建体；和d)表达所述多肽链，使得生成结合所述第一和第二抗原的结合蛋白。
在本文的任何实施方案中，VD1重链可变结构域(如果存在的话)和轻链可变结构域(如果存在的话)可来自第一亲本抗体或其抗原结合部分；VD2重链可变结构域(如果存在的话)和轻链可变结构域(如果存在的话)可来自第二亲本抗体或其抗原结合部分。第一和第二亲本抗体可以相同或不同。
在一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一抗原，且第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二抗原。在一个实施方案中，第一和第二抗原是相同抗原。在另一个实施方案中，亲本抗体结合相同抗原上的不同表位。在另一个实施方案中，第一和第二抗原是不同抗原。在另一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一抗原，其功效不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二抗原的功效。在又另一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一抗原，其亲和力不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二抗原的亲和力。
在另一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分，和第二亲本抗体或其抗原结合部分，是人抗体，CDR嫁接的抗体，人源化抗体和/或亲和力成熟的抗体。
在另一个实施方案中，结合蛋白具有至少一种由第一亲本抗体或其抗原结合部分、或第二亲本抗体或其抗原结合部分表现的期望特性。或者，第一亲本抗体或其抗原结合部分和第二亲本抗体或其抗原结合部分具有至少一种由结合蛋白表现的期望特性。在一个实施方案中，期望特性是一种或多种抗体参数。在另一个实施方案中，抗体参数是抗原特异性、对抗原的亲和力、功效、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解度、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性、或直向同源抗原结合。在一个实施方案中，结合蛋白是多价的。在另一个实施方案中，结合蛋白是多特异性的。本文所述的多价和或多特异性结合蛋白具有特别从治疗观点来看期望的特性。例如，多价和或多特异性结合蛋白可以(1)由表达抗体结合的抗原的细胞比二价抗体更快速内在化(和/或发生分解代谢)；(2)是激动剂结合蛋白；和/或(3)诱导表达多价结合蛋白能够结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价和或多特异性结合蛋白的至少一种抗原结合特异性的“亲本抗体”可以是，由表达抗体结合的抗原的细胞内在化(和/或发生分解代谢)的抗体；和/或可以是激动剂、细胞死亡诱导、和/或细胞凋亡诱导性抗体，且如本文所述的多价和或多特异性结合蛋白可以表现出这些特性中的一种或多种的改善。此外，亲本抗体可以缺乏这些特性中的任何一种或多种，但如本文所述构建为多价结合蛋白时可以需要它们中的一种或多种。
在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量，所述结合蛋白对于一种或多种目标具有以下结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；或至少约106M-1s-1。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量，所述结合蛋白对于一种或多种目标具有以下结合速率常数(Kon)：约102M-1s-1至约103M-1s-1；约103M-1s-1至约104M-1s-1；约104M-1s-1至约105M-1s-1；或约105M-1s-1至约106M-1s-1。
在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量，所述结合蛋白对于一种或多种目标具有以下解离速率(off rate)常数(Koff)：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；或至多约10-6s-1。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量，所述结合蛋白对于一种或多种目标具有以下解离速率常数(Koff)：约10-3s-1至约10-4s-1；约10-4s-1至约10-5s-1；或约10-5s-1至约10-6s-1。
在另一个实施方案中，所述结合蛋白对于一种或多种目标具有以下解离常数(Kd)：至多约10-7 M；至多约10-8 M；至多约10-9 M；至多约10-10 M；至多约10-11 M；至多约10-12 M；或至多约10-13 M。在一个实施方案中，所述结合蛋白对于其目标具有以下解离常数(Kd)：约10-7 M至约10-8 M；约10-8 M至约10-9 M；约10-9 M至约10-10 M；约10-10至约10-11 M；约10-11 M至约10-12 M；或约10-12M至约10-13 M。
在另一个实施方案中，所述结合蛋白是进一步包含药剂的缀合物。在一个实施方案中，所述药剂是免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。在一个实施方案中，所述显像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。在另一个实施方案中，所述放射性标记是3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。在又另一个实施方案中，所述治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素或细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，所述结合蛋白是结晶结合蛋白且作为晶体存在。在一个实施方案中，所述晶体是无载体的药学控释晶体。在另一个实施方案中，所述结晶结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性对应物更长的体内半衰期。在又另一个实施方案中，所述结晶结合蛋白保留生物学活性。
在另一个实施方案中，本文所述的结合蛋白是糖基化的。例如，糖基化模式是人糖基化模式。
还提供了分离的核酸，其编码本文公开的结合蛋白中的任一种。一个进一步实施方案提供了包含本文公开的分离的核酸的载体，其中所述载体是pcDNA；pTT (Durocher等(2002) Nucl. Acids Res.30(2)；pTT3 (具有额外的多克隆位点的pTT；pEFBOS (Mizushima和Nagata, (1990) Nucleic. Acids Res. 18(17))；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO；pEF6 TOPO；pBOS；pHybE；或pBJ。在一个实施方案中，所述载体是在美国专利公开号20090239259中公开的载体。
在另一个方面，宿主细胞用本文公开的载体转化。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，CHO、COS；NS0、SP2、PER.C6或真菌细胞诸如酿酒酵母，或昆虫细胞诸如Sf9。在一个实施方案中，在单一重组宿主细胞中产生例如具有不同特异性的两种或更多种结合蛋白。例如，抗体混合物的表达已被称为Oligoclonics™(Merus B.V.，The Netherlands)，美国专利号7,262,028和7,429,486。
提供了产生本文公开的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合蛋白的条件下，在培养基中培养本文公开的宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，50%-75%的通过该方法产生的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在另一个实施方案中，75%-90%的通过该方法产生的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在另一个实施方案中，90%-95%的产生的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。
一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含结晶结合蛋白、成分和至少一种聚合载体。在一个实施方案中，所述聚合载体是聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、(乳酸-乙醇酸)共聚物或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二氧杂环己酮)(poly(dioxanone))、聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、普朗尼克多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、或掺合物及其共聚物。在一个实施方案中，所述成分是白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇或者聚乙二醇。
另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的本文公开的组合物的步骤。
提供了包含本文公开的结合蛋白和药学上可接受载体的药物组合物。在一个进一步实施方案中，所述药物组合物包含用于治疗病症的至少一种额外治疗剂。例如，额外药剂可以是治疗剂，显像剂，细胞毒性剂，血管生成抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap)，激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)，共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗CD20)，粘附分子阻断剂(包括但不限于抗LFA-1抗体、抗E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂)，抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/细胞因子受体抗体)，氨甲喋呤，环孢菌素，雷帕霉素，FK506，可检测标记或报道分子，TNF拮抗剂，抗风湿剂，肌肉弛缓剂，麻醉药，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂，抗微生物剂，抗银屑病剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，促红细胞生成素，免疫，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子，或者细胞因子拮抗剂。
治疗和诊断用途
提供了用于治疗患有其中能够被本文公开的结合蛋白结合的一种或多种目标是有害的人受试者的方法，其包括对人受试者施用本文公开的结合蛋白，使得抑制人受试者中的一种或多种目标的活性且减轻一种或多种症状或实现治疗。本文提供的结合蛋白可用于治疗患有自身免疫性疾病(诸如例如与炎症相关的疾病)的人。在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分用于治疗哮喘，变态反应，变应性肺病(allergic lung disease)，变应性鼻炎，特应性皮炎，慢性阻塞性肺病(COPD)，纤维化，囊性纤维化(CF)，纤维变性肺病，特发性肺纤维化，肝纤维化，狼疮，乙型肝炎相关的肝病和纤维化，败血症，全身性红斑狼疮(SLE)，肾小球肾炎，炎性皮肤病，银屑病，糖尿病，胰岛素依赖性糖尿病，HIV引起的传染病，炎性肠病(IBD)，溃疡性结肠炎(UC)，克罗恩病(CD)，类风湿性关节炎(RA)，骨关节炎(OA)，多发性硬化症(MS)，移植物抗宿主病(GVHD)，移植物排斥，缺血性心脏病(IHD)，乳糜泄，接触性超敏感，酒精性肝病，贝赫切特病(Behcet’s disease)，动脉粥样硬化性血管病，眼表面炎性疾病，或莱姆病。
在另一个实施方案中，待治疗的病症或病况包括由人中的病毒感染引起的症状，其由，例如，HIV、人鼻病毒、肠道病毒、冠状病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒或腺病毒引起。
本文提供的结合蛋白可用于治疗神经病症。在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分用于治疗神经变性疾病和涉及神经元再生和脊髓损伤的病况。
在一个实施方案中，可以用本文公开的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜的肿瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)，从造血恶性肿瘤诸如白血病产生的实体瘤，和淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)。
另一个实施方案提供所述结合蛋白在治疗疾病或病症中的用途，其中所述疾病或病症是类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃、关节病、Reiter氏病、银屑病性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、卵巢早衰、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjögren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型银屑病、2型银屑病、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫、多发性硬化症(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjörgren氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍、抑郁、精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛、不同形式的疼痛、癌症、肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、造血恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复合征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗-cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉夹层、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallervorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、霍奇金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流行性感冒、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非霍奇金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢早衰、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化症风险的临床孤立综合征(cis)、儿童期发病性精神病、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barr综合征(GBS)、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、原发性帕金森综合征、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、硅树脂相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合征(SJS)、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体、I型变态反应、II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性、或伤口愈合。
在一些实施方案中，本文公开的结合蛋白中的任一种可用于治疗上面列出的病症。在某些实施方案中，用于治疗本文讨论的病症中的任一种的结合蛋白是表2-4中列出的结合蛋白中的一种或多种。
在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白用于治疗关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、ANCA血管炎、风湿性多肌痛或干眼。在一个实施方案中，所述结合蛋白用于治疗关节炎。在一个实施方案中，所述结合蛋白用于治疗类风湿性关节炎。在一个实施方案中，所述结合蛋白用于治疗银屑病关节炎。在一个实施方案中，所述结合蛋白用于治疗强直性脊柱炎。在一些实施方案中，所述结合蛋白是本文公开的结合蛋白中的任一种。在某些实施方案中，所述结合蛋白是表2-4中列出的结合蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，本文公开的结合蛋白可用于治疗上述病况之一(例如，类风湿性关节炎)，且表现出比TNF单一治疗改善的结果。例如，结合蛋白可以比抗-TNF抗体在循环中持续更长，由此提供更长持续时间的治疗作用且能够实现降低的施用频率的潜能，其进而可以降低施用药剂诱导免疫应答的风险。
在一些实施方案中，结合蛋白可以产生比施用抗-TNF抗体可以实现的更大的与类风湿性关节炎相关的炎症的减少，或者比双重施用针对TNFα和IL-13、TNF和PGE2或TNF和NGF的分开抗体后的抑制的总和实现的更大的减少。炎症可以例如通过测量IL-6、CXCL-1、PGE-2、CXCL-5、G-CSF或MMP3表达的水平进行评估。在一些实施方案中，与使用TNF抗体或使用作为单一治疗的组合施用的TNFα和IL-13、TNF和PGE2或TNF和NGF抗体可以实现的相比，所述结合蛋白可用于使炎症、软骨损失、和/或骨破坏减少更大的量。因此，与通过单独的单一治疗可以实现的相比，使用本文公开的结合蛋白靶向炎性介质的组合可以更完全地控制患者的症状。
在一个实施方案中，将所述结合蛋白或其抗原结合部分，当单独或与放射治疗和/或化疗剂组合使用时，用于治疗癌症或预防或抑制本文所述肿瘤的转移。
在另一个方面，提供了治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括在第二药剂施用之前、同时或之后，施用本文公开的结合蛋白中的任一种的步骤。在一个实施方案中，第二药剂是布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1βmAb，抗IL-6或IL-6受体mAb，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲喋呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAID，布洛芬，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞信号传导抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13或TGFβ。在特定的实施方案中，本文公开的药物组合物通过以下施用于患者：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、或经皮施用。
还提供了针对本文公开的结合蛋白的抗独特型抗体。抗独特型抗体包括含有任何蛋白或肽的分子，其包含免疫球蛋白分子的至少部分，诸如但不限于，重或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，构架区，或其可以并入本文提供的结合蛋白内的任何部分。
提供了确定测试样品中TNF〈和IL-13、TNF〈和PGE2或TNF〈和NGF或其片段的存在、量或浓度的方法。所述方法包括通过免疫测定来测定测试样品中的抗原或其片段。所述免疫测定(i)利用至少一种结合蛋白和至少一种可检测的标记，和(ii)包括将作为测试样品中的抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示的由可检测的标记生成的信号，与对照或校准物中作为抗原或其片段的存在、量或浓度的直接或间接指示的生成的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物中的一部分，其中各校准物在所述抗原或其片段的浓度方面不同于所述系列中的其它校准物。所述方法可包括(i)使测试样品与至少一种捕获剂接触，所述捕获剂结合至抗原或其片段上的表位，从而形成捕获剂/抗原或其片段复合物，(ii)使捕获剂/抗原或其片段复合物与至少一种检测剂接触，以形成捕获剂/抗原或其片段/检测剂复合物，所述检测剂包含可检测的标记且结合至抗原或其片段上未被捕获剂结合的表位，和(iii)基于(ii)中形成的捕获剂/抗原或其片段/检测剂复合物中的可检测的标记生成的信号，确定测试样品中的抗原或其片段的存在、量或浓度，其中至少一种捕获剂和/或至少一种检测剂是至少一种结合蛋白。
或者，所述方法可包括(i)使测试样品与至少一种捕获剂接触，所述捕获剂结合至抗原或其片段上的表位，从而形成捕获剂/抗原或其片段复合物，且同时或相继，以任一顺序使所述测试样品与可检测标记的抗原或其片段接触，所述可检测标记的抗原或其片段可与测试样品中的任何抗原或其片段竞争结合至至少一种捕获剂，其中测试样品中存在的任何抗原或其片段和可检测标记的抗原彼此竞争以分别形成捕获剂/抗原或其片段复合物和捕获剂/可检测标记的抗原或其片段复合物，和(ii)基于(ii)中形成的捕获剂/可检测标记的抗原或其片段复合物中的可检测的标记生成的信号，确定测试样品中的抗原或其片段的存在、量或浓度，其中至少一种捕获剂是至少一种结合蛋白，且其中捕获剂/可检测标记的抗原或其片段复合物中的可检测的标记生成的信号与测试样品中的抗原或其片段的量或浓度成反比。
所述测试样品可以来自患者，在此情况下该方法可以进一步包括诊断、预后、或评估患者的治疗性/预防性处理的效力。如果该方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，该方法任选进一步包括根据需要调整患者的治疗性/预防性处理以改善效力。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统中。因此，本文所述方法也可用于确定受试者是否具有给定疾病、病症或病况或处于发展给定疾病、病症或病况的风险中。具体地，此方法可以包括步骤：(a) 确定来自受试者的测试样品中分析物或其片段的浓度或量(例如使用本文所述的方法或本领域已知的方法)；且(b) 将步骤(a)中确定的分析物或其片段的浓度或量与预定水平比较，其中，如果步骤(a)中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是有利的，则将该受试者确定为不具有给定疾病、病症或病况或没有处于给定疾病、病症或病况的风险中。然而，如果步骤(a)中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是不利的，则将该受试者确定为具有给定疾病、病症或病况或处于给定疾病、病症或病况的风险中。
此外，本文提供了监测受试者中疾病进展的方法。最佳地，该方法包括步骤：(a) 确定来自受试者的测试样品中分析物的浓度或量；(b) 确定来自受试者的较晚测试样品中分析物的浓度或量；且(c) 将步骤(b)中确定的分析物的浓度或量与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较，其中，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(b)中确定的浓度或量是无变化的或是不利的，则确定受试者中的疾病已经继续、进展或恶化。通过比较，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(b)中确定的分析物的浓度或量是有利的，则确定受试者中的疾病已经停止、消退或改善。
任选地，该方法进一步包括将步骤(b)中确定的分析物的浓度或量例如与预定水平进行比较。进一步，如果比较显示，步骤(b)中确定的分析物的浓度或量例如相对于预定水平不利地改变，则该方法任选包括用一种或多种药物组合物治疗受试者一段时间。
还提供了用于测定测试样品中的TNFα、IL-13、PGE2和/或NGF或其片段的药剂盒。药剂盒包含用于测定测试样品中的抗原或其片段的至少一种组分，和用于测定测试样品中的抗原或其片段的说明书，其中所述至少一种组分包括至少一种包含本文公开的结合蛋白的组合物，其中任选地可检测标记所述结合蛋白。
除非本文另有定义，本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数术语，且复数术语应包括单数术语。除非另有说明，“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其它形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。除非另有说明，本申请中给出的所有范围涵盖端点。
通常，关于本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本文提供的方法和技术通常根据本领域众所周知，且如本说明书自始至终引用和讨论中各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现或如本文所述来进行。关于本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者的治疗。
为了本公开可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子，其通常由以下构成：四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链，或其保留Ig分子的表位结合特征的功能片段、突变体、变体或衍生物。此片段、突变体、变体或衍生物抗体形式是本领域已知的。在全长抗体的实施方案中，每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成。CH由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。CL由单一CL结构域构成。VH和VL可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其被称为构架区(FR)的较保守的区域点缀。通常，每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“双特异性抗体”是指在其两个结合臂(一对HC/LC)之一上结合一种抗原(或表位)，且在其第二结合臂(不同对HC/LC)上结合不同的抗原(或表位)的抗体。双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中)，且对于其结合的各抗原是单价的。双特异性抗体包括通过以下生成的抗体：四源杂交瘤技术(Milstein 和Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40)，两种不同的单克隆抗体的化学缀合(Staerz等(1985) Nature 314(6012): 628-31)，或匙-入-孔(knob-into-hole)或在Fc区中引入突变的类似技术(Holliger等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448)。
“亲和力成熟的”抗体或结合蛋白是指在其一个或多个CDRs或构架(FR)区中具有一种或多种改变的抗体或结合蛋白，与没有那些改变的亲本抗体或结合蛋白相比，所述改变导致对抗原的亲和力改善。示例性的亲和力成熟的抗体或结合蛋白将对目标抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体或结合蛋白可以通过本领域已知的程序来产生，例如，Marks等(1992)BioTechnology 10:779-783描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由以下描述：Barbas等(1994)Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813；Schier等(1995)Gene 169:147- 155；Yelton等(1995)J. Immunol. 155:1994-2004；Jackson等(1995)J. Immunol. 154(7):3310-9；Hawkins等(1992)J. Mol. Biol. 226:889-896以及如美国专利号6,914,128中所述的用活性增强氨基酸残基在选择性诱变位置、接触或高变位置的突变。
术语“CDR-嫁接的”抗体或结合蛋白是指包含重链和轻链可变区序列的抗体或结合蛋白，所述重链和轻链可变区序列中，VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一种抗体或结合蛋白的CDR序列替换。例如，所述两种抗体或结合蛋白可来自不同的物种，诸如具有鼠重链和轻链可变区(其中一个或多个鼠CDR已经被人CDR序列替换)的抗体或结合蛋白。
术语“人源化的”抗体或结合蛋白是指来自非人物种的抗体或结合蛋白，其已被改变为更加“人样(“human-like”)”，即，更加类似于人种系序列。一种类型的人源化抗体或结合蛋白是CDR-嫁接的抗体或结合蛋白，其中非人CDR序列被引入人VH和VL序列中，以替换相应的人CDR序列。人源化抗体或结合蛋白也涵盖抗体或结合蛋白的变体、衍生物、类似物或片段，其包含基本上具有人抗体的氨基酸序列(例如，与其具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同一性)的构架区(FR)序列，和至少一个基本上具有非人抗体的氨基酸序列的CDR。人源化抗体或结合蛋白可包含至少一个可变结构域(Fab，Fab’，F(ab’)2，FabC，Fv)的基本上所有，其中所有或基本上所有CDR区的序列相应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白的那些。人源化抗体或结合蛋白也可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一个实施方案中，人源化抗体或结合蛋白还可以包含人免疫球蛋白Fc区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体或结合蛋白仅含有人源化的轻链。在一些实施方案中，人源化抗体或结合蛋白仅含有人源化的重链。在一些实施方案中，人源化抗体或结合蛋白仅含有轻链的人源化的可变结构域和/或重链的人源化的可变结构域。在一些实施方案中，人源化抗体或结合蛋白含有人源化的轻链以及重链的至少可变结构域。在一些实施方案中，人源化抗体或结合蛋白含有人源化的重链以及轻链的至少可变结构域。
术语“双重可变结构域结合蛋白”和“双重可变结构域免疫球蛋白”是指在其两个结合臂(例如，一对HC/LC)中的每一个中具有两个可变结构域的结合蛋白(参见PCT公开号WO 02/02773)，每个可变结构域均能够结合至抗原。在一个实施方案中，各可变结构域结合不同的抗原或表位。在另一个实施方案中，各可变结构域结合相同的抗原或表位。在另一个实施方案中，双重可变结构域结合蛋白具有两个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其结合的各抗原是二价的。在一个实施方案中，DVD结合蛋白可以是单特异性的(即，能够结合一种抗原)，或多特异性的(即，能够结合两种或更多种抗原)。包含两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽的DVD结合蛋白也称作DVD-IgTM。在一个实施方案中，四链DVD结合蛋白的每一半包含重链DVD多肽，和轻链DVD多肽，以及两个抗原结合位点。在一个实施方案中，各结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，每个抗原结合位点总共6个CDR参与抗原结合。
术语“抗独特型抗体”是指针对另一抗体的抗原组合位点的氨基酸序列产生的抗体。可以施用抗独特型抗体以增强针对抗原的免疫应答。
术语“生物活性”是指分子(无论是在体内发现的天然存在，还是通过重组方式提供或实现)的任何一种或多种特性。生物特性包括但不限于，结合受体、诱导细胞增殖、抑制细胞生长、诱导其它细胞因子、诱导细胞凋亡和酶促活性。
术语“中和”是指当结合蛋白特异性结合至抗原时，抵消抗原的生物学活性。在一个实施方案中，中和结合蛋白结合至抗原(例如细胞因子)且使其生物学活性减少至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。
“特异性”是指结合蛋白选择性地结合抗原的能力。
“亲和力”是结合蛋白和抗原之间的相互作用的强度，通过结合蛋白的CDR的序列以及通过抗原性质(诸如其大小、形状和/或电荷)决定。可以针对亲和力选择结合蛋白，其提供期望的治疗终点，同时尽可能降低负面副作用。亲和力可以使用本领域技术人员已知的方法(US 20090311253)来测量。
术语“功效”是指结合蛋白实现期望作用的能力，且是其治疗效力的测量。功效可以使用本领域技术人员已知的方法(US 20090311253)来评价。
术语“交叉反应性”是指结合蛋白结合除了针对其产生结合蛋白的目标以外的目标的能力。通常，结合蛋白将以适当的高亲和力结合其目标组织/抗原，但将表现出对非目标正常组织的适当低亲和力。通常选择个别结合蛋白以满足两个标准。(1)对抗体目标的已知表达适当的组织染色。(2)来自相同器官的人和tox物种(小鼠和食蟹猴)组织之间类似的染色模式。这些和其它评价交叉反应性的方法是本领域技术人员已知的(US 20090311253)。
术语“生物功能”是指结合蛋白的特异性体内或体外作用。结合蛋白可靶向几类抗原，且通过多种作用机制实现期望的治疗结果。结合蛋白可靶向可溶性蛋白，细胞表面抗原，以及胞外蛋白沉积物。结合蛋白可以激动、拮抗或中和它们的目标的活性。结合蛋白可有助于清除它们结合的目标，或当结合至细胞时可导致细胞毒性。两种或更多种抗体的部分可并入多价形式中，以便在单一结合蛋白分子中实现不同的功能。用于评价生物活性的体外测定和体内模型是本领域技术人员已知的(US 20090311253)。
“稳定的”结合蛋白是在储存后基本上保留其物理稳定性、化学稳定性和/或生物稳定性的结合蛋白。在各种温度在体外稳定延长时间段的多价结合蛋白是期望的。稳定结合蛋白且评价其在各种温度的稳定性的方法是本领域技术人员已知的(US 20090311253)。
术语“溶解度”是指蛋白保持分散于水溶液内的能力。蛋白于水性制剂中的溶解度取决于疏水和亲水氨基酸残基的适当分布，因此，溶解度可以与正确折叠的蛋白的产生相关。本领域技术人员将能够使用常规的HPLC技术和本领域技术人员已知的方法(US 20090311253)检测结合蛋白的溶解度的增加或降低。
结合蛋白可以使用多种宿主细胞产生，或在体外产生，且每次尝试的相对产率决定“生产效率”。影响生产效率的因素包括但不限于，宿主细胞类型(原核的或真核的)、表达载体的选择、核苷酸序列的选择和利用的方法。结合蛋白产生中使用的材料和方法以及产生效率的测量是本领域技术人员已知的(US 20090311253)。
术语“免疫源性”意指物质诱导免疫应答的能力。治疗性结合蛋白的施用可导致免疫应答的特定发生率。多价形式中可能诱导免疫原性的潜在元件可以在选择亲本抗体过程中进行分析，且可以采取降低此类风险的步骤，以便优化亲本抗体，然后将其序列并入多价结合蛋白形式。降低抗体和结合蛋白的免疫原性的方法是本领域技术人员已知的(US 20090311253)。
术语“标记”和“可检测的标记”是指结合至特异性结合对的成员(诸如抗体/结合蛋白或其分析物)以使得特异性结合对的成员之间的反应(如，结合)可检测的部分。经标记的特异性结合对中的成员被称为“可检测标记的”。因此，术语“标记的结合蛋白”是指具有标记并入的蛋白，所述标记提供结合蛋白的鉴定。在一个实施方案中，所述标记是可检测的标志物，其可以产生可通过目视或仪器工具检测的信号，例如，并入放射性标记的氨基酸或结合至生物素化部分的多肽，所述生物素化部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如含有可以通过光学或比色法检测的荧光标志物或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)进行检测。多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm)；色原、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标志物；生物素化基团；由第二报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和磁性剂，诸如钆螯合物。通常用于免疫测定的标记的代表性实例包括产生光的部分，例如吖啶鎓(acridinium)化合物，和产生荧光的部分，例如荧光素。在这方面，部分自身可不是可检测标记的，但是与又另一个部分反应后，可变得可检测。
术语“缀合物”是指化学连接至第二化学部分诸如治疗或细胞毒性剂的结合蛋白。术语“药剂”包括化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。在一个实施方案中，治疗或细胞毒性剂包括但不限于，百日咳毒素、紫素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。当在免疫测定的背景中采用时，缀合物抗体可以是用作检测抗体的可检测标记的抗体。
术语“晶体”和“结晶的”是指以晶体形式存在的结合蛋白(例如抗体)或其抗原结合部分。晶体是物质的一种固态形式，其不同于其它形式诸如无定形固态或液晶态。晶体由原子、离子、分子(例如，蛋白诸如抗体)或分子装配体(例如，抗原/抗体复合物)的规则、重复、三维阵列构成。这些三维阵列根据本领域充分理解的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。符合给定、充分定义的晶体学对称性的排列中的不对称单位的重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有三个维度中规则平移的晶胞的重复提供了晶体。参见Giege, R.和Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York,(1999)。
术语“载体”是指能够转运其已经连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指额外的DNA区段可以连接至其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接至病毒基因组内。其它载体包括RNA载体。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，也包括其它形式的表达载体，诸如发挥等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。将一组pHybE载体(美国专利申请系列号61/021,282)可用于亲本抗体和DVD结合蛋白克隆。衍生自pJP183的V1；pHybE-hCg1,z,non-a V2，可用于克隆具有野生型恒定区的抗体和DVD重链。衍生自pJP191的V2；pHybE-hCk V3，可用于克隆具有κ恒定区的抗体和DVD轻链。衍生自pJP192的V3；pHybE-hCl V2，可用于克隆具有λ恒定区的抗体和DVD轻链。由λ信号肽和κ恒定区构建的V4可用于克隆具有λ-κ杂合V结构域的DVD轻链。由κ信号肽和λ恒定区构建的V5可用于克隆具有κ-λ杂合V结构域的DVD轻链。衍生自pJP183的V7；pHybE-hCg1,z,non-a V2，可用于克隆具有(234,235 AA)突变恒定区的抗体和DVD重链。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指其中已引入外源DNA的细胞。此类术语不仅是指特定的受试细胞，还是指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响在随后世代中可出现某些修饰，所以此类后代实际上可不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括原核和真核细胞。在一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。
术语“转染”涵盖通常用于将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染，等。
术语“细胞因子”是指由一个细胞群体释放的蛋白，其对另一细胞群体作为细胞间介质起作用。术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，和天然序列细胞因子的生物活性等价物。
术语“生物样品”意指来自活体或先前活体的一定量的物质。此类物质包括但不限于，血液(例如全血)、血浆、血清、尿、羊膜液、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其它细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
术语“组分”是指组合物中的要素。关于诊断试剂盒，例如，组分可以是可包括在用于测定测试样品的试剂盒中的捕获抗体、检测或缀合物抗体、对照、校准物、一系列校准物、灵敏度实验对象组(sensitivity panel)、容器、缓冲剂、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如作为溶液)、终止溶液等。因此。“组分”可以包括如上的多肽或其它分析物，其固定在固体支持物上，诸如通过结合至抗分析物(例如，抗多肽)抗体。一些组分可以在溶液中或者被冻干以重构用于测定中。
“对照”是指已知不是分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。“对照”、“阳性对照”和“校准物”在本文中可以互换使用，以指包含已知浓度分析物的组合物。“阳性对照”可用于确立测定性能特征，并且是试剂(例如分析物)完整性的有用指示物。
“预定截止值”和“预定水平”通常是指测定截止值，其用于通过将测定结果与预定截止值/水平比较来评价诊断/预测/治疗功力结果，其中预定截止值/水平已经与各种临床参数(例如疾病严重程度、进展/非进展/改进等)联系或相关。虽然本公开可以提供示例性预定水平，但众所周知，截止值可根据免疫测定的性质(例如采用的抗体等)而变化。进一步完全在本领域技术人员的一般能力内的是，基于此公开内容将本文的公开内容针对其它免疫测定进行调整以获得关于那些其它免疫测定的免疫测定特异性截止值。尽管预定截止值/水平的精确值在测定之间可不同，但本文所述的相关性(如果存在)可以是普遍适用的。
如在本文所述的诊断测定中所使用，“预处理试剂”，例如裂解、沉淀和/或增溶试剂，是将存在于测试样品中的任何细胞裂解和/或任何分析物增溶的试剂。如本文进一步所述，不是所有样品都需要预处理。除了其它以外，增溶分析物(例如目的多肽)可引起该分析物从存在于样品中的任何内源结合蛋白释放。预处理试剂可以是均质的(不要求分离步骤)或异质的(要求分离步骤)。使用异质预处理试剂，在进行至测定的下一个步骤前，从测试样品取出任何沉淀的分析物结合蛋白。
在本文所述的免疫测定和试剂盒的背景下，“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照和灵敏度实验对象组。通常使用“校准物”或“标准品”(例如，一种或多种，例如多种)，以便确立校准(标准)曲线用于内推(interpolation)分析物(诸如抗体或分析物)的浓度。或者，可以使用接近预定阳性/阴性截止值的单一校准物。可以结合使用多种校准物(即，多于一种校准物或不同量的校准物)，从而构成“灵敏度实验对象组”。
术语“特异性结合伴侣”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两种不同的分子，其通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除了抗原和抗体特异性结合以外，其它特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶抑制物和酶等。此外，特异性结合对可以包括作为最初特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物、片段和变体(包括变体的片段)，无论是分离的还是重组产生的。
术语“Fc区”定义免疫球蛋白重链的C末端区域，其可以通过完整抗体或结合蛋白的木瓜蛋白酶消化来生成。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域－CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。Fc部分中改变效应物功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(例如，美国专利号5,648,260和5,624,821)。Fc区介导抗体或结合蛋白和抗原-抗体或抗原-结合蛋白复合物的几种重要的效应物功能，例如细胞因子诱导、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)和半衰期/清除率。取决于治疗目标，在一些情况下这些效应物功能对于治疗免疫球蛋白是期望的，但在其它情况下可能是不必要的或甚至有害的。
术语结合蛋白的“抗原结合部分”意指保留特异性结合至抗原的能力的结合蛋白的一种或多种片段。结合蛋白的抗原结合部分可以由全长结合蛋白的片段(包括双特异性、双重特异性、或多特异性形式)来进行；特别是结合至两种或更多种不同抗原。涵盖于术语结合蛋白的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体或结合蛋白的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段, 其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来接合，所述合成接头使得它们能够被制备为单一蛋白链，在所述单一蛋白链中，VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv))。此类单链抗体或结合蛋白也预期涵盖于术语抗体或结合蛋白的“抗原结合部分”内。也涵盖其它形式的单链抗体，诸如双抗体。此外，单链抗体或结合蛋白还包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性”抗体或结合蛋白，所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域。
术语“多价结合蛋白”意指包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。在一个实施方案中，多价结合蛋白经工程改造为具有三个或更多个抗原结合位点，且可以不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两种或更多种相关或无关目标的结合蛋白。在一个实施方案中，本文提供的双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含两个或更多个抗原结合位点，且是四价或多价结合蛋白。
术语“接头”意指用于连接多肽(如，两个VH或两个VL结构域)的氨基酸残基，或包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基的多肽。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见，例如，Holliger等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等(1994)Structure 2:1121-1123)。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域中认识到的这些术语是指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体或结合蛋白或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其它氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等 (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391和Kabat等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。对于重链可变区，高变区对于CDR1范围为氨基酸位置31至35，对于CDR2范围为氨基酸位置50至65，且对于CDR3范围为氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1范围为氨基酸位置24至34，对于CDR2范围为氨基酸位置50至56，且对于CDR3范围为氨基酸位置89至97。
术语“CDR”意指在免疫球蛋白可变区序列内的互补决定区。对于各重和轻链可变区，在重链和轻链的各可变区中存在三个CDR，其被命名为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单一可变区中出现的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同系统不同地定义。由Kabat (Kabat等 (1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可适用于抗体或结合蛋白的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了定义各重链或轻链序列中的三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等(1989) Nature 342:877-883)发现Kabat CDR内的某些亚部分采取几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDR，所述Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。定义与Kabat CDR重叠的CDR的其它边界已由Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139和MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45)描述。还有其它CDR边界定义可以不严格遵循本文系统之一，但仍将与Kabat CDR重叠，尽管鉴于特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任一种定义的CDR，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。
术语“表位”意指结合蛋白结合的抗原区域，例如能够特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体的多肽和/或其它决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面定组(grouping)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，且在某些实施方案中，可以具有特定三维结构特征、和/或特定电荷特征。在一个实施方案中，表位包含已知结合至特异性结合伴侣上的互补位点的抗原(或其片段)区域的氨基酸残基。抗原片段可以含有多于一个表位。在某些实施方案中，当结合蛋白在蛋白和/或大分子的复杂混合物中识别其目标抗原时，其特异性结合抗原。如果抗体或结合蛋白交叉竞争(一个防止另一个的结合或调节作用)，则结合蛋白“结合至相同表位”。此外，表位的结构定义(重叠、类似、相同)是提供信息的；且功能定义涵盖了结构(结合)和功能性(调节、竞争)参数。蛋白的不同区域可行使不同的功能。例如细胞因子的特定区域与其细胞因子受体相互作用以引起受体活化，而可需要蛋白的其它区域用于稳定所述细胞因子。为了消除细胞因子信号传导的负面影响，可用特异性结合至受体相互作用区的结合蛋白靶向所述细胞因子，由此防止其受体的结合。或者，结合蛋白可靶向负责细胞因子稳定的区域，由此指定所述蛋白用于降解。设想且模拟表位识别的方法是本领域技术人员已知的(US 20090311253)。
“药代动力学”是指药物被生物体吸收、分布、代谢和排泄的过程。为了生成具有期望的药代动力学概况的多价结合蛋白，选择具有类似期望的药代动力学概况的亲本单克隆抗体。可在啮齿动物中，使用本领域技术人员已知的方法(US 20090311253)容易地测定选择的亲本单克隆抗体的PK概况。
“生物利用度”是指在施用后达到其目标的活性药物的量。生物利用度是先前描述的特性(包括稳定性、溶解度、免疫原性和药代动力学)中的几种的函数，且可使用本领域技术人员已知的方法(US 20090311253)进行评估。
术语“表面等离振子共振”意指通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度改变，例如使用BIAcore®系统(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden和Piscataway, NJ)，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。对于进一步描述，参见Jönsson等(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26。术语“Kon”意指结合蛋白(例如抗体或DVD-Ig)与抗原结合以形成例如DVD-Ig/抗原复合物的结合速率常数。术语“Kon”也意指“结合速率常数”或“ka”，如本文中可互换使用。指示结合蛋白与其目标抗原的结合速率、或结合蛋白例如抗体与抗原之间的复合物形成速率的该值也由以下方程显示：
抗体(“Ab”)+ 抗原(“Ag”)→Ab-Ag
术语“Koff”意指结合蛋白(例如抗体或DVD-Ig)从例如DVD-Ig/抗原复合物解离的解离速率常数或“解离速率常数”，如本领域已知。该值指示结合蛋白例如抗体从其目标抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间分离为游离抗体和抗原的解离速率，如以下方程显示：
Ab + Ag←Ab-Ag
术语“Kd”和“平衡解离常数”意指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)而获得的值。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示结合蛋白(例如，抗体或DVD-Ig)对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法是本领域众所周知的。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度和在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。可以使用其它实验方法和仪器诸如BIAcore®(生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcore International AB，a GE Healthcare company，Uppsala，瑞典获得的仪器)。此外，也可以使用可以从Sapidyne Instruments(Boise, Idaho)获得的KinExA®(动态排阻测定(Kinetic Exclusion Assay))测定。
术语“变体”意指这样的多肽，该多肽通过氨基酸的添加(例如插入)、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同于给定多肽，但保留该给定多肽的生物学活性(例如变体抗体可以与抗抗体竞争结合)。氨基酸的保守取代，即，用具有相似特性(例如，亲水性和带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸，在本领域中被认可为通常涉及小改变。如本领域所理解，可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴定这些小改变(参见例如，Kyte等(1982)J. Mol. Biol. 157:105-132)。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，可以取代在蛋白中具有相似亲水指数的氨基酸，且所述蛋白仍保留蛋白功能。在一方面，取代具有±2的亲水指数的氨基酸。也可以使用氨基酸亲水性来揭示将导致保留生物学功能的蛋白的取代。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已经报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用量度(参见例如，美国专利号4,554,101)。如本领域所理解，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以导致保留生物学活性(例如免疫原性)的肽。在一方面，用具有彼此的±2内的亲水性值的氨基酸来进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受该氨基酸的具体侧链影响。与该观察一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸、尤其是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如由疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性所揭示。术语“变体”还包括已经进行不同加工(诸如通过蛋白水解、磷酸化或其它翻译后修饰)、且仍然保留其生物学活性或抗原反应性(例如结合至的能力)的多肽或其片段。除非另有定义，术语“变体”涵盖变体的片段。变体可与野生型序列99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%相同。
结合蛋白的生成
本文公开的结合蛋白可使用多种技术生成。提供了生成结合蛋白的表达载体、宿主细胞和方法，其是本领域众所周知的。例如，DVD 结合蛋白的可变结构域可获得自亲本抗体，包括能够结合目的抗原的多克隆Ab和 mAb。这些抗体可以是天然存在的，或通过重组技术生成。本领域普通技术人员熟知多种用于产生抗体的方法，包括但不限于使用杂交瘤技术，选择的淋巴细胞抗体方法(SLAM)，使用噬菌体、酵母或RNA-蛋白融合体展示或其它文库，免疫包含人免疫球蛋白基因座中的至少一些的非人动物，和制备嵌合的、CDR-嫁接的和人源化的抗体。参见，例如，美国专利公开号20090311253 A1。也可以使用亲和力成熟技术制备可变结构域。
A. 选择亲本单克隆抗体的标准
提供了包括选择具有DVD-结合蛋白分子中期望的至少一种或多种特性的亲本抗体的实施方案。在一个实施方案中，期望的特性是一种或多种抗体参数，诸如例如，抗原特异性、对抗原的亲和力、功效、生物学功能、表位识别、稳定性、溶解度、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性或直向同源抗原结合。参见，例如，美国专利公开号20090311253。
B. 结合蛋白分子的构建
可以设计结合蛋白，使得来自两种不同亲本单克隆抗体的两个不同轻链可变结构域(VL)通过重组DNA技术直接或经由接头串联连接，随后为轻链恒定结构域CL。类似地，重链包含直接或经由接头串联连接的两个不同重链可变结构域(VH)，随后为恒定结构域CH1和Fc区(图1)。
可变结构域可以使用重组DNA技术从亲本抗体获得，所述亲本抗体通过本文所述方法中的任一种生成。在一个实施方案中，可变结构域是鼠重或轻链可变结构域。在另一个实施方案中，可变结构域是CDR嫁接的或人源化的可变重或轻链结构域。在一个实施方案中，可变结构域是人重或轻链可变结构域。
接头序列可以是单一氨基酸或多肽序列。在一个实施方案中，接头序列的选择基于几种Fab分子的晶体结构分析。在Fab或抗体分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性键。这种天然键包含约10-12个氨基酸残基，由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末端的4-6个残基促成。DVD-Ig结合蛋白使用CL或CH1的N末端5-6个氨基酸残基或11-12个氨基酸残基分别作为轻链和重链中的接头来生成。CL或CH1结构域的N末端残基，特别是前5-6个氨基酸残基，采取环构象而无强二级结构，因此可以充当两个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是Ig序列的部分，因此它们的使用在很大程度上尽可能降低可能由接头和接点产生的任何免疫原性。
在一个进一步实施方案中，在重链、轻链中任何中，两链或四链实施方案包括至少一个接头，所述接头包含：
或基于G/S 的序列(例如，G4S 和 G4S重复；SEQ ID NO: 31)。在一个实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体 Fc区。
其它接头序列可以包括CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不是CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基；轻链接头可以来自Cκ或Cλ；且重链接头可以源自任何同种型的CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε、和Cμ。接头序列还可以源自其它蛋白诸如Ig-样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)；基于G/S的序列(例如，G4S重复，SEQ ID NO: 31)；铰链区衍生的序列；和来自其它蛋白的其它天然序列。
在一个实施方案中，使用重组DNA技术将恒定结构域连接至两个连接的可变结构域。在一个实施方案中，包含连接的重链可变结构域的序列连接至重链恒定结构域，且包含连接的轻链可变结构域的序列连接至轻链恒定结构域。在一个实施方案中，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一个实施方案中，DVD重链进一步连接至Fc区。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一个实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc区。
在一个实施方案中，公开了抗体或其功能性抗原结合片段，其包含具有能够结合TNFα、IL-13、PGE2或NGF的功能性结合位点、且具有包含选自列于表1的配对的配对的VH和VL序列的可变区或包含那些VH和VL区的CDR区的抗体。例如，抗体或其功能性抗原结合片段能够结合IL-13且具有包含 SEQ ID NO: 32和33的可变区。同样，抗体或其功能性抗原结合片段能够结合TNF、PGE2或NGF且具有包含选自表1中的那些的配对序列的可变区。在一个实施方案中，公开了上述抗体的功能性抗原结合片段，其中抗原结合片段保留足以形成能够结合目标抗原的结合位点的可变序列。例如，抗原结合片段可包含取自表1中的配对的VH和VL序列的CDR区，或有或无Fc结构域的全长VH和VL 序列。功能性抗原结合片段可包括，在其它实例内，人源化抗体，完全人抗体，骆驼化抗体，单链抗体，嵌合抗体，合成抗体，重组抗体，杂合抗体，突变的抗体，回复突变的抗体，或CDR-嫁接的抗体，或Fab，F(ab')2，Fv，scFv，Fd，dAb片段，VHH(也称作 纳米抗体(nanobody))，或保留抗原结合功能的任何其它抗体片段，包括双特异性和多特异性抗体。
在一个实施方案中，公开了结合蛋白(例如，双重可变结构域结合蛋白)，其包含选自表1中的那些的可变结构域。在一些实施方案中，所述结合蛋白包含第一和第二多肽链，其各自包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，且其中所述结合蛋白的第一和第二链一起形成两个功能性结合位点，其中那些结合位点能够结合TNFα和IL-13、TNF和PGE2或TNF和NGF。在一些实施方案中，VD1和VD2序列是独立选择的(即，选择用于VD1位置的VH和VL不影响选择用于VD2位置的序列，反之亦然)。在一个实施方案中，各功能性结合位点包含选自表1中列出的配对的配对的VH和VL序列(例如，SEQ ID NO: 32和33的配对的VH和VL序列，形成针对IL-13的结合位点)，或包含那些VH和VL序列的CDR 区。在一些实施方案中，第一链包含在VD1位置的第一VH序列和在VD2位置的第二VH序列，其两者都选自表1，或VD1和VD2结构域含有来自那些选择的VH序列的CDR序列，而第二链包含在VD1位置的第一VL序列和在VD2位置的第二VL序列，其两者都选自表1，或VD1和VD2结构域含有来自那些选择的VL序列的CDR序列。在其它实施方案中，第一或第二结合位点的VH-VL排列是在两条多肽链间翻转，使得各链包含接合至VL序列的VH序列，而两条链一起仍形成两个功能性结合位点。例如，第一多肽链可包含在VD1位置的VH序列和在VD2位置的VL序列，而第二链将包含在VD1位置的配对VL序列(形成第一功能性结合位点)和在VD2位置的配对VH序列(形成第二结合位点)。
在一个实施方案中，将两个第一链多肽和两个第二链多肽组合，以形成具有两个臂和四个结合位点的DVD-Ig结合蛋白。具有两个臂和四个结合位点的DVD-Ig结合蛋白的实例显示于图1中。在一个实施方案中，DVD-Ig结合蛋白在各臂的VD1和VD2位置包含以任何方向的表1中列出的VH和VL序列对中的至少一个、或至少两个、至少三个或至少四个。在一些实施方案中，形成结合位点的序列对是独立选择的(例如，在一个臂上选择用于VD1位置的VH和VL序列不影响在另一个臂上选择用于VD1位置的序列，其也不影响在任一臂上选择用于VD2位置的序列)。下表1中提供的VH和VL序列包含互补决定区(CDR)和构架序列。在一些实施方案中，用例如来自本领域已知结合至相同抗原的结合蛋白的其它构架序列替代所述构架序列中的一个或多个，而不丧失功能。
在另一个实施方案中，将两个重链DVD-Ig多肽和两个轻链DVD-Ig多肽组合，以形成DVD-Ig结合蛋白。表1A-1C列出了用于治疗疾病的示例性抗体的VH和VL区的氨基酸序列。在一个实施方案中，提供了以任何方向包含表1中列出的VH和/或VL区中的至少两个的DVD-Ig。在一些实施方案中，VD1和VD2是独立地选择的。因此，在一些实施方案中，VD1和VD2包含相同的SEQ ID NO，且在其它实施方案中，VD1和VD2包含不同的SEQ ID NO。下面提供的VH和VL结构域序列包含本领域中已知的或使用本领域已知的方法容易辨别的互补决定区(CDR)和构架序列。在一些实施方案中，用来自本领域已知结合至相同抗原的结合蛋白的其它CDR和/或构架序列替代这些CDR和/或构架序列中的一个或多个，而不丧失功能。
表 1：用于生成结合蛋白(包括多价结合蛋白)的抗体的VH和VL区的氨基酸序列的列表
表1中列出的各VH和VL序列的CDR1-3加下划线。例如，在氨基酸31-37 (CDR1)、52-67(CDR2)和100-112(CDR3)，对SEQ ID NO: 32的CDR1-3加下划线。下面实施例部分中提供能够结合特异性目标的特异性DVD结合蛋白及其制备方法的详细描述。
C. 结合蛋白的产生
本文提供的结合蛋白可以通过本领域已知的许多技术中的任一种来产生。例如，从宿主细胞表达，其中编码DVD-Ig重链和DVD-Ig轻链的表达载体通过标准技术转染至宿主细胞内。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本文提供的DVD-Ig结合蛋白，优选在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中表达DVD-Ig结合蛋白，因为此类真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫学活性的DVD-Ig结合蛋白。
在用于重组表达DVD-Ig蛋白的示例性系统中，编码DVD-Ig重链和DVD-Ig轻链两者的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，DVD-Ig重和轻链基因各自可操作连接至CMV增强子/AdMLP启动子调节元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲喋呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达DVD-Ig重和轻链，且从培养基中回收完整的DVD-Ig蛋白。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收DVD-Ig蛋白。还提供了通过在合适的培养基中培养本文提供的宿主细胞直至合成DVD-Ig蛋白而合成本文提供的DVD-Ig蛋白的方法。该方法可以进一步包括从培养基中分离DVD-Ig蛋白。
DVD-Ig结合蛋白的重要特征是它可以以与常规抗体相似的方式产生和纯化。DVD-Ig结合蛋白的产生导致具有期望的双重特异性活性的均质、单一的主要产物，而无需恒定区的序列修饰或化学修饰。生成“双特异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的其它先前描述的方法可以导致装配的无活性、单特异性、多特异性、多价、全长结合蛋白和具有不同结合位点组合的多价全长结合蛋白的混合物的细胞内或分泌的产生。
令人惊讶地，本文提供的“双重-特异性多价全长结合蛋白”的设计导致双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，其主要装配成期望的“双重特异性多价全长结合蛋白”。
在一些实施方案中，至少50％、至少75％和至少90％装配且表达的双重可变结构域免疫球蛋白分子是期望的双重特异性四价蛋白，因此具有增强的商业效用。因此，在各个实施方案中，提供了在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链、导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一主要产物的方法。
提供了在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链、导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的“主要产物”(其中“主要产物”是多于50%、诸如多于75%和多于90%的包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的全部组装的蛋白)的方法。
结合蛋白的用途
鉴于其结合至两种或更多种抗原的能力，本文提供的结合蛋白可以用于检测抗原(例如，在生物样品诸如血清或血浆中)，其使用常规免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。所述结合蛋白用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基(prosthetic group)、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例是鲁米诺；且合适放射性材料的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
在一个实施方案中，本文提供的结合蛋白能够在体外和体内中和它们抗原目标的活性。因此，此类结合蛋白可以例如，在含有抗原的细胞培养物中、在人受试者中或在具有本文提供的结合蛋白与其交叉反应的抗原的其它哺乳动物受试者中，用于抑制抗原活性。在另一个实施方案中，提供了用于减少受试者中的抗原活性的方法，所述受试者患有其中抗原活性是有害的疾病或病症。本文提供的结合蛋白可以施用于人受试者用于治疗目的。
术语“其中抗原活性是有害的病症”意欲包括疾病或其它病症，其中患有该病症的受试者中抗原的存在已显示或怀疑负责该病症的病理生理学或是促进该病症恶化的因素。因此，其中抗原活性是有害的病症是其中抗原活性减少预期减轻该病症的症状和/或进展的病症。此类病症可以例如由患有病症的受试者生物学流体中抗原浓度的增加(例如受试者血清、血浆、滑液等中抗原浓度的增加)来证实。可以用本文提供的结合蛋白治疗的病症的非限制性实例包括下文以及涉及包含结合蛋白的药物组合物的部分中讨论的那些病症。
DVD结合蛋白可用作治疗剂以同时阻断两种不同目标以增强效力/安全性和/或增加患者覆盖度。
此外，本文提供的DVD结合蛋白可以用于组织特异性递送(靶向组织标志物和疾病介质用于增强局部PK，因此实现较高的功效和/或较低的毒性)，包括细胞内递送(靶向内在化受体和细胞内分子)，递送至脑内(靶向转铁蛋白受体和CNS疾病介质用于穿过血脑屏障)。DVD结合蛋白也可以充当载体蛋白，以经由结合至该抗原的非中和表位而将抗原递送至特定位置，且也增加抗原的半衰期。此外，DVD结合蛋白可以设计成物理连接至植入患者的医学设备，或靶向这些医学设备(参见Burke等(2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446；Hildebrand等(2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324；Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis，Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices，Marques (2005) Biodegradable System in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397)。简言之，将合适类型的细胞导向至医学植入物的部位可以促进愈合和恢复正常组织功能。或者，也提供了通过与设备偶联或靶向至设备的DVD对设备植入后释放的介质(包括但不限于细胞因子)的抑制。
本文提供的结合蛋白分子可用作治疗分子以治疗多种疾病，例如，其中由结合蛋白识别的目标是有害的。此类结合蛋白可结合参与特定疾病的一种或多种目标。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig蛋白用于治疗或诊断人自身免疫或炎性病症、哮喘、类风湿性关节炎、骨关节炎、败血症、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、神经病症或肿瘤病症。
药物组合物
在各个实施方案中，提供了药物组合物，其包含单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的一种或多种结合蛋白。包含本文提供的结合蛋白的药物组合物用于，但不限于，诊断、检测或监测病症，预防、治疗、管理或缓解病症或其一种或多种症状，和/或用于研究中。单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合配制药物组合物是本领域技术人员已知的(美国专利公开号20090311253 A1)。
施用本文提供的药物组合物或预防剂或治疗剂的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)，硬膜外施用，肿瘤内施用，粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)和肺部施用(例如，用吸入器或喷雾器施用的气溶胶的化合物)。用于特定施用途径的药物组合物的配制，和对于各种施用方法必需的材料和技术是可得和本领域技术人员已知的(例如，美国专利公开号20090311253 A1)。
可以调整剂量方案以提供最佳期望的应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以施用单一大剂量，几个分份剂量可以随着时间而施用，或剂量可以如治疗情形的紧急状态所示按比例减少或增加。为了易于施用和剂量一致，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。术语“单位剂型”是指适合作为单位剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；各单位含有与所需药学载体相关的计算为产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。关于本文提供的单位剂型的详细说明由以下指示且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗或预防效果，和(b)复合此活性化合物用于治疗个体中的敏感性的领域中固有的局限性。
关于本文提供的结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20 mg/kg，例如1-10 mg/kg。应当指出的是，剂量值可以随着待减轻的病况类型和严重性而变化。应进一步理解的是，对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，具体剂量方案可以随着时间进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，且不意欲限制要求保护的组合物的范围或实践。
组合治疗
本文提供的结合蛋白也可以与一种或多种可用于治疗多种疾病的额外治疗剂一起施用，所述额外治疗剂由技术人员出于其意欲目的进行选择。例如，所述额外药剂可以是本领域公认可用于治疗由本文提供的抗体治疗的疾病或病况的治疗剂。所述组合还可以包括多于一种额外药剂，例如，两种或三种额外药剂。
组合治疗药剂包括但不限于抗瘤剂、放射治疗、化学疗法诸如DNA烷化剂、顺铂、碳铂、抗微管蛋白剂、紫杉醇、多西他赛、紫素、阿霉素、吉西他滨、健择(gemzar)、蒽环霉素(anthracyclines)、亚得里亚霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、依立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))、激酶抑制剂和siRNAs。
治疗自身免疫和炎性疾病的组合可包括添加非类固醇消炎药，也称为NSAIDS，其包括药物如布洛芬。其它组合是皮质类固醇，包括强的松龙；当与本文提供的结合蛋白组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。可以与本文提供的结合蛋白或其结合部分组合的用于风湿性关节炎的治疗剂的非限制性实例包括以下：细胞因子抑制性消炎药(CSAID)；针对其它人细胞因子或生长因子(例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF)的抗体或拮抗剂。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子(诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA)或其配体包括CD154(gp39或CD40L)的抗体组合。
治疗剂的组合可以在自身免疫和随后的炎性级联中的不同点进行干预；因此，以下的一种或多种可以与本文公开的结合蛋白组合施用。实例包括本文公开的结合蛋白和TNF 拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体，阿达木单抗，(PCT公开号WO 97/29131)，CA2(RemicadeTM)，CDP 571，可溶性p55或p75 TNF受体，或其衍生物(p75TNFR1gG (EnbrelTM)或p55TNFR1gG(Lenercept))，TNFα转换酶(TACE)抑制剂；或IL-1抑制剂(白介素-1-转换酶抑制剂，IL-1RA，等)。其它组合包括本文公开的结合蛋白和白介素11。又另一个组合包括自身免疫应答的关键作用因子(key players)，其可以平行于、依赖于IL-12 功能或与其协同发挥作用；尤其相关的是IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体、可溶性IL-18受体或IL-18结合蛋白。已经显示，IL-12和IL-18具有重叠但不相同的功能，且针对两者的拮抗剂的组合是最有效的。又另一个组合是本文公开的结合蛋白和非耗竭型抗-CD4抑制剂。又其它组合包括本文公开的结合蛋白和共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗配体。
本文提供的结合蛋白还可以与药剂组合，所述药剂诸如氨甲喋呤、6-MP、硫唑嘌呤 柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵、乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAID，例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNFα或IL-1的信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体或其衍生物(例如，可溶性p55或p75 TNF受体或衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM)或 p55TNFRIgG(Lenercept)、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、依那西普、英夫单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松(triamcinolone acetonide)、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希单抗、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、或美苏帕玛(Mesopram)。组合包括氨甲喋呤或来氟洛米，且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。
在一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合部分与以下试剂之一组合施用用于治疗类风湿性关节炎：KDR的小分子抑制剂，Tie-2的小分子抑制剂；氨甲喋呤；强的松；塞来昔布；叶酸；硫酸羟氯喹；洛芬昔布；依那西普；英夫单抗；来氟洛米；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲基强的松龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基强的松龙；硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安缩松；萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛；叶酸盐；萘普酮；扶他林；吡罗昔康；依托度酸；双氯酚酸钠；奥沙普嗪；盐酸羟可酮；重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛；双氯酚酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素，人重组体；盐酸曲马多；双水杨酸酯；舒林酸；氰钴胺素/fa/吡哆醇；扑热息痛；阿仑膦酸钠；强的松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟可酮/扑热息痛；盐酸奥洛帕定；米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥希单抗；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18 BP；IL-12/23；抗-IL 18；抗-IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；或美苏帕玛。
可以与本文提供的结合蛋白组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制性实例包括以下：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β mAb；抗-IL-6 mAb；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；针对其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、或PDGF。本文提供的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。本文提供的抗体或其抗原结合部分还可以与药剂组合，所述药剂诸如氨甲喋呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAID，例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNFα或IL-1的信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体或其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)或抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13或TGFβ)或bcl-2抑制剂。
其中结合蛋白可以组合用于克罗恩病的治疗剂的实例包括以下：TNF拮抗剂，例如抗-TNF抗体，阿达木单抗(Adalimumab)(PCT公开号 WO 97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，p75TNFRIgG(ENBREL)或p55TNFRIgG(Lenercept))抑制剂或PDE4抑制剂。本文提供的抗体或其抗原结合部分可以与皮质类固醇(例如布地奈德和地塞米松)组合。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分还可以与药剂(诸如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪)或干扰促炎细胞因子诸如IL-1的合成或作用的药剂(诸如IL-1β转换酶抑制剂或IL-1ra)组合。本文提供的抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞信号传导抑制剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂或6-巯基嘌呤)一起使用。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分可以与IL-11组合。本文提供的结合蛋白或其抗原结合部分可以与以下组合：美沙拉秦、强的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英夫单抗、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、氨甲喋呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异噁唑/甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑(colesevelam hcl)、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗或干扰素γ。
可以与本文提供的结合蛋白组合用于多发性硬化症的治疗剂的非限制性实例包括以下：皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲喋呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a(Avonex；Biogen)；干扰素-β1b(BETASERON；Chiron/Berlex)；干扰素α-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)，干扰素-α(Alfa Wassermann/J&J)，干扰素β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)，聚乙二醇化干扰素(Peginterferon)α 2b(Enzon/Schering-Plough)，共聚物1(Cop-1；COPAXONE；Teva Pharmaceutical Industries, Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；其它人细胞因子或生长因子(例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和 PDGF)及其受体的抗体或拮抗剂。本文提供的结合蛋白可以与针对细胞表面分子(诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90)或其配体的抗体组合。本文提供的结合蛋白还可以与药剂组合，所述药剂诸如氨甲喋呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAID，例如布洛芬、皮质类固醇，诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNFα或IL-1的信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T-细胞信号传导抑制剂，诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体或其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13或TGFβ)或bcl-2抑制剂。
可以与本文提供的结合蛋白组合用于用于多发性硬化症的治疗剂的实例包括干扰素-β，例如IFNβ1a和IFNβ1b；考帕松，皮质类固醇，半胱天冬酶抑制剂，例如半胱天冬酶-1抑制剂，IL-1 抑制剂，TNF抑制剂，和针对CD40配体和CD80的抗体。
可以与本文提供的结合蛋白组合用于哮喘的治疗剂的非限制性实例包括以下：沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松、孟鲁司特钠、丙酸氟替卡松、布地奈德、强的松、沙美特罗羟萘甲酸盐(sameterol xinafoate)、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、强的松龙磷酸钠、曲安缩松、倍氯美松双丙酸酯、异丙托溴铵、阿奇霉素、醋酸吡布特罗、强的松龙、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、克拉霉素、扎鲁司特、富马酸福莫特罗、流感病毒疫苗、甲基强的松龙、阿莫西林三水合物、氟尼缩松、变态反应注射、色甘酸钠、盐酸非索那丁、氟尼缩松/薄荷醇、阿莫西林/克拉维酸钾、左氟沙星、吸入器辅助装置、愈创木酚甘油醚、地塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星、盐酸多西环素、愈创木酚甘油醚/d-甲吗喃、p-麻黄素/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙星、盐酸西替立嗪、糠酸莫米他松、沙美特罗羟萘甲酸盐、苯佐那酯、头孢氨苄、pe/二氢可待因酮/氯苯那敏、盐酸西替立嗪/伪麻黄碱(pseudoephed)、苯福林/cod/异丙嗪、可待因/异丙嗪、头孢罗齐、地塞米松、愈创木酚甘油醚/伪麻黄碱、氯苯那敏/二氢可待因酮、奈多罗米钠、硫酸特布他林、肾上腺素、甲基强的松龙、硫酸间羟异丙肾上腺素。
可以与本文提供的结合蛋白组合用于COPD的治疗剂的非限制性实例包括以下：硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、异丙托溴铵、沙美特罗/氟替卡松、沙丁胺醇、沙美特罗羟萘甲酸盐、丙酸氟替卡松、强的松、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、孟鲁司特钠、布地奈德、富马酸福莫特罗、曲安缩松、左氟沙星、愈创木酚甘油醚、阿奇霉素、倍氯美松双丙酸酯、盐酸左旋沙丁胺醇、氟尼缩松、头孢曲松钠、阿莫西林三水合物、加替沙星、扎鲁司特、阿莫西林/克拉维酸钾、氟尼缩松/薄荷醇、氯苯那敏/二氢可待因酮、硫酸间羟异丙肾上腺素、甲基强的松龙、糠酸莫米他松、p-麻黄素/cod/氯苯那敏、醋酸吡布特罗、p-麻黄素/氯雷他定、硫酸特布他林、噻托溴铵(tiotropium bromide)、(R,R)-福莫特罗、TgAAT、西洛司特(Cilomilast)、罗氟司特。
可以与本文提供的结合蛋白组合用于银屑病的治疗剂的非限制性实例包括以下：KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂、卡泊三醇(calcipotriene)、丙酸氯倍他索、曲安缩松、丙酸卤倍他索、他佐罗汀、氨甲喋呤、氟轻松、增强型二丙酸倍他米松、醋酸氟轻松、阿昔曲丁、焦油(tar)洗发剂、戊酸倍他米松、糠酸莫米他松、酮康唑、丙吗卡因/氟轻松、戊酸氢化可的松、氟羟可舒松、尿素、倍他米松、丙酸氯倍他索/润滑药(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇霉素、氢化可的松、湿润配方、叶酸、丙缩羟强龙、吡美莫司(pimecrolimus)、煤焦油、双醋二氟松、叶酸依那西普、乳酸、8-甲氧基补骨质素(methoxsalen)、hc/次五倍子酸铋(bismuth subgal)/znox/resor、乙酸甲基强的松龙、强的松、遮光剂、氯氟舒松、水杨酸、蒽地酚、氯可托龙、煤提取物、煤焦油/水杨酸、煤焦油/水杨酸/硫、去羟米松、地西泮、润滑药、氟轻松/润滑药、矿物油/蓖麻油/na lact、矿物油/花生油、石油/肉豆蔻酸异丙酯、补骨脂素、水杨酸、皂/三溴沙仑、硫柳汞/硼酸、塞来昔布、英夫单抗、环孢菌素、阿来塞普、依法利珠单抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB、柳氮磺吡啶。
可以与本文提供的结合蛋白组合用于SLE(狼疮)的治疗剂的实例包括以下：NSAIDS，例如，扶他林、萘普生、布洛芬、吡罗昔康、吲哚美辛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布、洛芬昔布、伐地考昔；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松、强的松龙、布地奈德、地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤、环磷酰胺、霉酚酸酯、氨甲喋呤；PDE4抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例如Cellcept。本文提供的结合蛋白还可以与药剂组合，所述药剂诸如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉嗪、依木兰，和干扰促炎细胞因子诸如IL-1的合成、生产或作用的药剂，例如半胱天冬酶抑制剂，如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本文提供的结合蛋白还可以与T细胞信号传导抑制剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)；或靶向T细胞活化分子的分子(例如CTLA-4-IgG或抗-B7家族抗体，抗-PD-1家族抗体)一起使用。本文提供的结合蛋白可以与IL-11或抗细胞因子抗体(例如芬突利珠单抗(fonotolizumab)(抗-IFNg抗体)，或抗受体受体抗体，例如抗IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体)组合。本文提供的抗体或其抗原结合部分还可以与以下一起使用：LJP 394(阿贝莫司(abetimus))，耗竭或失活B细胞的药剂，例如利妥希单抗(抗-CD20抗体)，淋弗斯特(lymphostat)-B(抗-BlyS抗体)，TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体，阿达木单抗(PCT公开号 WO 97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig 构建体(p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG(Lenercept))和bcl-2抑制剂，因为已证实bcl-2在转基因小鼠中的过表达导致狼疮样表型(参见Marquina)。本文提供的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本文提供的结合蛋白。“治疗有效量”是指在对于实现期望治疗结果必需的剂量和时间段有效的量。结合蛋白的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可以根据以下因素而变化，所述因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及结合蛋白在个体中引起期望应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体结合部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在对于实现期望预防结果必需的剂量和时间段有效的量。通常，由于预防剂量在疾病前或疾病早期时用于受试者中，所以预防有效量将小于治疗有效量。
诊断
本文的公开内容还提供诊断应用，包括但不限于，诊断测定方法，含有一种或多种结合蛋白的诊断试剂盒，和调整所述方法和试剂盒用于自动和/或半自动系统中。提供的方法、试剂盒和调整可用于个体中的疾病或病症的检测、监测和/或治疗。以下进一步阐明这一点。
D. 测定方法
本公开还提供了使用如本文所述的至少一种结合蛋白确定测试样品中的分析物或其片段的存在、量或浓度的方法。本领域已知的任何合适的测定可以用于该方法中。实例包括但不限于，免疫测定和/或采用质谱法的方法。
本公开提供的免疫测定可包括夹心免疫测定、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争抑制免疫测定、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶倍增免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)和匀相化学发光测定等。
化学发光微粒免疫测定，特别是采用ARCHITECT®自动化分析仪(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)的免疫测定，是免疫测定的实例。
采用质谱法的方法由本公开提供，且包括但不限于 MALDI(基质辅助激光解吸/电离)或通过SELDI(表面-增强的激光解吸/电离)。
用于使用免疫测定和质谱法收集、处理、加工和分析生物测试样品的方法对于本领域技术人员是众所周知的，提供用于实施本公开(US 2009-0311253 A1)。
E. 试剂盒
还提供了针对测试样品中分析物或其片段的存在、量或浓度测定测试样品的试剂盒。所述试剂盒包含用于测定测试样品中的分析物或其片段的至少一种组分和用于测定测试样品中的分析物或其片段的说明书。用于测定测试样品中的分析物或其片段的至少一种组分可以包括包含如本文公开的结合蛋白和/或任选固定化在固相上的抗分析物结合蛋白(或其片段、变体、或变体的片段)的组合物。
任选地，所述试剂盒可包含校准物或对照，其可以包含分离的或纯化的分析物。所述试剂盒包含用于通过免疫测定和/或质谱法测定测试样品中的分析物的至少一种组分。所述试剂盒组分，包括分析物、结合蛋白和/或抗-分析物结合蛋白或其片段，可以任选地使用任何本领域已知的可检测的标记进行标记。提供用于实践本公开的材料和方法会是本领域技术人员已知的(US 2009-0311253 A1)。
F. 试剂盒和方法的调整
通过如本文所述的测定(诸如免疫测定)确定测试样品中的分析物的存在、量或浓度的试剂盒(或其组分)以及方法，可以进行调整以用于多种自动化和半自动化系统(包括其中固相包含微粒的那些)，如例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述，和例如由Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)作为ARCHITECT®商销。
可得自Abbott Laboratories的其它平台包括但不限于AxSYM®、IMx®(参见例如，美国专利号5,294,404、PRISM®、EIA(珠)、和Quantum™ II，以及其它平台。此外，该测定、试剂盒和试剂盒组分可以用于其它形式，例如，在电化学或其它手提式或现场即时(point-of-care)测定系统上。本公开，例如，适用于实施夹心免疫测定的商业Abbott Point of Care(i-STAT®, Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。在一次性使用测试设备中的免疫传感器及其制造和操作方法描述于，例如，美国专利号5,063,081、7,419,821和7,682,833；以及美国专利号20040018577、20060160164和US 20090311253。
对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的方法的其它合适修改和调整是显而易见的，且在不背离本文公开的实施方案的范围的情况下可以使用合适的等同方案进行。尽管某些实施方案目前已得到详细描述，但其通过参考以下实施例将被更清楚地理解，所述实施例被包括仅用于举例说明性目的且不意欲是限制性的。
实施例
实施例1：双重可变结构域(DVD)结合蛋白的产生和表征
使用来自亲本抗体的可变结构域，通过根据本领域已知的方法合成编码DVD结合蛋白可变重链和DVD结合蛋白可变轻链序列的多核苷酸片段，且将所述片段克隆至pHybC-D2载体中，生成两条链或四条链双重可变结构域(DVD)结合蛋白。根据本领域已知的方法，将所述DVD结合蛋白构建体克隆至293细胞中且在其中表达，且纯化。下面提供DVD结合蛋白的DVD VH和VL链。表2-4的最左栏中列出的SEQ ID NO是指表中每一行中鉴定的DVD结合蛋白的完整可变结构域的序列。表2-4的最右栏中的每一行提供三个SEQ ID NO。第一编号是指外可变结构域序列的SEQ ID NO，第二编号是指接头的SEQ ID NO，且第三编号是指内可变结构域序列的SEQ ID NO，其一起存在于完整DVD可变结构域序列(即，包含VD1-X1-VD2的完整DVD可变结构域)内。
表2：结合TNF和IL-13的DVD结合蛋白
表3：结合TNF和PGE2的DVD结合蛋白
表4：结合TNF和NGF的DVD结合蛋白
以上表2-4中列出的所有DVD结合蛋白均可进一步包含人轻链κ恒定区和野生型人重链IgG1恒定区。所述恒定结构域序列下面显示于表4a中。
表4a：人 IgG 重链和轻链恒定结构域
实施例2：用于测定亲本抗体和DVD-Ig蛋白的功能活性的测定
实施例2.1：IL-13 生物测定和中和测定
以100 μL 体积、1.5-2 x 105个细胞/孔铺板A549细胞，且在37℃、5% CO2下孵育过夜。16-20小时过夜孵育之后，移除起始的100 μl 培养基接种体积，向所有孔添加100 μL 400 ng/mL(2x 浓缩的)rhTNF-α。将所述板置于37℃、5% CO2下，直至添加IL-13 和抗体或DVD-Ig蛋白。在完全F12培养基中制备20 μg/mL的抗体或DVD-Ig蛋白(4x浓缩的)工作储液。在Marsh稀释板中，在完全F12中进行八点连续稀释(5 μg/mL-0.0003 μg/mL)。一式四份地将60uL/孔将的各抗体或DVD-Ig蛋白稀释物添加至96孔 v型底(Costar# 3894)板，且将60 μL 4x浓缩的(20 ng/mL)IL-13溶液添加至除仅作为对照的细胞的孔以外的所有孔。1小时孵育之后，将100 μL上述IL-13/抗体或DVD-Ig蛋白复合物添加至A549细胞。所有孔体积等于200 μL。重组 IL-13的最终浓度是5 ng/mL ，rhTNF-〈 是200 ng/mL。然后将所有板试剂1x浓缩。16-20小时孵育之后，将孔内含物(200 μL)转移至96-孔圆底板(Costar# 3799)，且置于–20℃冰箱。在测定实验室(Assay Lab)中通过ELISA检测上清液中的hTARC水平。通过计算相对于仅5 ng/mL IL-13的对照值的抑制百分比来测定中和效力。使用GraphPad Prism计算报道的IC50值(S型曲线剂量应答)。参见表5。
表5：用IL-13亲本抗体和DVD-Ig蛋白的IL-13中和测定
在N-末端或C-末端位置含有来自AB397、AB398或AB399的VD的所有DVD-Ig蛋白在A549 IL-13中和测定中都显示中和作用。
实施例 2.2：PGE2 生物测定和中和测定
在用人EP4受体稳定转染的HEK293Gα16细胞中，在Ca++通量测定中测定抗-PGE2抗体和含抗-PGE2的DVD-Ig分子抑制PGE2的细胞应答的能力。将细胞铺板在黑色/透明聚-D-赖氨酸板(Corning #3667, Corning, N.Y.)中，与Ca++敏感性染料(Molecular Devices)孵育90分钟。用 FLIPR缓冲液(含有1xHBSS(Invitrogen, Carlsbad, California)、20 mM HEPES(Invitrogen, Carlsbad, California)、0.1% BSA(Sigma, St. Louis, Mo.)和2.5 mM丙磺舒(Sigma, St. Louis, Mo.))稀释PGE2储液(在200 proof乙醇中)。还将抗-PGE2抗体、DVD-Ig分子或同种型匹配的对照抗体在FLIPR缓冲液中预先稀释。将25 μl PGE2或预先孵育的PGE2/抗体混合物或预先孵育的PGE2/DVD-Ig分子混合物添加至用细胞预先铺板的孔中。通过PGE2的连续滴定完成PGE2的剂量应答，并且用FLIPR1或Tetra(Molecular Devices)测定。使用GraphPad Prism 5(GraftPad Software, La Jolla, California)测定EC50。为了测试抗体和DVD-Ig分子，将EC50浓度的PGE2与多种浓度的测试物品或同种型匹配的抗体(阴性对照)孵育20分钟，添加至HEK293Gα16细胞中的装载染料的人EP4。使用FLIPR1监测Ca++通量，且使用GraphPad Prism 5分析数据。含有不同TNF序列的DVD-Ig 构建体的PGE2抑制结果显示于表6中。
表6：用PGE2亲本抗体和DVD-Ig蛋白的PGE2 中和测定
在N-末端或C-末端位置含有来自AB048、AB131或AB135的VD的所有DVD-Ig蛋白在EP4 PGE2中和测定中都显示中和作用。
实施例 2.3：HuTNFα生物测定和中和测定
使L929细胞生长至半汇合密度，且使用0.05%胰蛋白酶(Gibco#25300)收获。用PBS洗涤细胞，计数且以1E6个细胞/mL重悬于含有4 μg/mL放线菌素D的测定培养基中。将所述细胞以50 μl体积、5E4细胞/孔接种于96-孔板(Costar#3599)中。在测定培养基中将DVD-IgTM和对照IgG稀释至4x浓度，且制备连续1:3稀释物。在测定培养基中将huTNFα稀释至400 pg/ml。以1:2稀释方案将抗体样品(200 μl)添加至huTNFα(200 μL)，且允许在室温孵育0.5小时。
将100 μl的DVD-IgTM/huTNFα溶液添加至铺板的细胞中，最终浓度为100 pg/mL huTNFα和25 nM – 0.00014 nM DVD-IgTM。在37℃、5 % CO2下，使所述板孵育20小时。为了定量活力，从孔中移除100 μL，且添加10 μL WST-1试剂(Roche目录号11644807001)。在测定条件下，孵育所述板3.5小时，以500 xg离心，将75 μL上清液转移至ELISA板(Costar目录号3369)。在Spectromax 190 ELISA 读板器上，在OD 420-600 nm下读取所述板。对于含有各种TNF序列的DVD-Ig构建体，表7中包括来自几个测定的平均EC50。
表7：用TNFα亲本抗体和DVD-Ig蛋白的huTNFα中和测定
在N-末端或C-末端位置含有来自AB436、AB437、AB441或AB444的VD的所有DVD-Ig蛋白在L929 huTNFα中和测定中都显示中和作用。
实施例2.4：TF-1细胞增殖生物测定中的NGF的抑制
在RPMI 1640(Invitrogen)+10%胎牛血清(Hyclone)+L-谷氨酰胺(Invitrogen)+rhu GM-CSF(R&D Systems)中培养TF-1。在RPMI 1640 + L-谷氨酰胺中以1 x 105个细胞/mL将TF-1细胞血清饥饿24小时，且在37℃、5% CO2下孵育过夜。实验当天，将TF-1细胞在不透明壁96-孔板中以2.5 x 104个细胞/孔铺板于100 μL 体积+测定培养基(RPMI-1640 +L-谷氨酰胺 + 4% FBS)中。通过向细胞添加NGF/DVD-Ig蛋白或抗体来刺激细胞。在测定培养基中将DVD-IgTM蛋白和对照IgG稀释至4x浓度，且进行连续1:5稀释。在测定培养基中将huNGF稀释至8 ng/mL。将DVD-IgTM蛋白(50 ul)和huNGF(50 uL)溶液添加到板中，最终浓度为2 ng/mL huNGF和25 nM – 0.000003 nM DVD-IgTM蛋白。将所述板在37℃、5 % CO2下孵育72小时。为了定量活力，使用Cell Titer Glo试剂盒(Promega目录号TB288)(遵循制造商的说明向各孔添加100 µl溶液)。在Spectromax 190 ELISA读板器上使用发光读取所述板。参见表8。
表8：用NGF亲本抗体和DVD-Ig蛋白的NGF抑制测定
在N-末端或C-末端位置含有来自AB267的VD的所有DVD-Ig蛋白在TF-1 NGF中和测定中都显示中和作用。
实施例 2.5：使用BIACORE技术测定亲和力
表9：Biacore分析中使用的试剂
抗原 销售商命名 销售商 目录号
TNFα 重组的人TNF-α/TNFSF1A R&D systems 210-TA
IL-13 重组的人IL-13 R&D systems 213-IL
NGF 重组的人β-NGF R&D systems 256-GF
BIACORE方法：
BIACORE测定(GE，Healthcare Piscataway，NJ)用结合速率和解离速率常数的动力学测量来确定抗体或DVD-Ig蛋白的亲和力。抗体或DVD-Ig蛋白与目标抗原(例如，纯化的重组目标抗原)的结合通过基于表面等离振子共振的测量，用Biacore T200使用来自GE Healthcare的 运行HBS-EP + 缓冲液于25℃进行测定。所有化学品都获得自GE Healthcare或否则来自如文中所述的不同来源。例如，使用标准胺偶联试剂盒根据制造商的说明，将在10 mM 乙酸钠(pH 4.5)中稀释的约5000 RU山羊抗小鼠IgG，(Fcγ)，片段特异性多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)直接固定化在CM5研究级生物传感器芯片上。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。在流动室1中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作参考表面。在0.8-100 nM范围内的不同抗原浓度下通过进行动力学结合测量来衍生速率常数。将结合纪录作为时间的函数，且计算动力学速率常数。在该测定中，评估结合速率5 min且检测解离10 min。对于动力学筛选分析，使用Bioevaluation软件，使源自1：1结合模型的速率方程同时拟合至所有注射的结合和解离相(使用总体拟合分析，其中Rmax局部拟合以解释捕获变异)拟合。纯化的抗体或DVD-Ig蛋白在HEPES缓冲盐水中进行稀释，以用于在山羊抗小鼠IgG 特异性反应表面上捕获。将待作为配体捕获的抗体或DVD-Ig蛋白以5 µl/分钟的流速注射在反应基质上。结合和解离速率常数，kon(M-1s-1)和koff(s-1)在50 µl/分钟的连续流速下进行测定。通过在0.8-100 nM范围内的不同抗原浓度下进行动力学结合测量来衍生速率常数。将结合记录为时间的函数且计算动力学速率常数。在该测定中，评估结合速率5 min且检测解离10 min。结果显示于表10。
表10：亲本抗体和DVD-Ig蛋白的BIACORE 分析
所有通过Biacore技术表征的DVD-Ig蛋白均表现出结合。所有可变结构域均以与亲本抗体类似的高亲和力结合。
实施例3：抗体和DVD-Ig蛋白的表征
例如，使用如实施例1中所述的细胞因子生物测定测定纯化的DVD-Ig蛋白抑制功能活性的能力。使用如实施例2中所述的表面等离振子共振(Biacore®)测量测定DVD-Ig蛋白与重组人抗原的结合亲和力。对来自生物测定的IC50值和抗体和DVD-Ig蛋白的亲和力进行排序。选择完全维持亲本mAb的活性的DVD-Ig蛋白作为用于进一步开发的候选物。进一步表征顶部的2-3种最有利的DVD-Ig蛋白。
实施例3.1：人源化抗体或DVD-Ig蛋白的药代动力学分析
在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中进行药代动力学研究。用单剂量的4 mg/kg mAb或DVD-Ig蛋白对雄性和雌性大鼠和食蟹猴进行静脉内或皮下给药，且使用抗原捕获ELISA分析样品，并且通过非区室分析测定药代动力学参数。简言之，用山羊抗生物素抗体(5 mg/ml，4℃，过夜)包被ELISA板，用Superblock(Pierce)封闭，且在室温与在10% Superblock TTBS中50 ng/ml的生物素化的人抗原孵育2小时。连续稀释血清样品(0.5%血清，10% Superblock，在TTBS中)，且于室温在板上孵育30分钟。用HRP-标记的山羊抗人抗体进行检测，且使用四参数逻辑拟合借助标准曲线测定浓度。使用WinNonlin软件(Pharsight Corporation, Mountain View, CA)通过非区室模型测定关于药代动力学参数的值。选择具有良好药代动力学概况的人源化mAb(T1/2为8-13天或更好，具有低清除率和优异的生物利用度50-100%)。
实施例3.2：人源化的单克隆抗体和DVD-Ig蛋白的物理化学和体外稳定性分析
大小排阻层析
用水将抗体或DVD-Ig蛋白稀释至2.5 mg/mL，且使用TSK gel G3000 SWXL柱(Tosoh Bioscience, 目录号 k5539-05k)在Shimadzu HPLC系统上分析20 mL。用211 mM硫酸钠，92 mM磷酸钠(pH 7.0)，以0.3 mL/分钟的流速从柱洗脱样品。HPLC系统操作条件如下：
流动相： 211 mM Na2SO4, 92 mM Na2HPO4*7H2O, pH 7.0
梯度： 等度
流速： 0.3 mL/分钟
检测器波长： 280 nm
自动采样器冷却器温度： 4℃
柱箱温度： 环境
运行时间： 50分钟。
表11含有如通过上述方案测定的表示为百分比单体(预期分子量的非聚集蛋白)的亲本抗体和DVD-Ig蛋白的纯度数据。
表11: 通过大小排阻层析确定的亲本抗体和DVD-Ig蛋白纯度
DVD-Ig蛋白显示优异的SEC概况，其中大多数DVD-Ig蛋白显示>90%单体。这种DVD-Ig蛋白概况类似于关于亲本抗体观察到的概况。
SDS-PAGE
通过在还原和非还原条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析抗体和DVD-Ig蛋白。阿达木单抗批次AFP04C用作对照。对于还原条件，将样品与具有100 mM DTT的2X tris甘氨酸SDS-PAGE 样品缓冲液(Invitrogen, 目录号 LC2676, 批号 1323208)1:1混合，且于60℃加热30分钟。对于非还原条件，将样品与样品缓冲液1:1混合，且于100℃加热5分钟。将还原的样品(10 mg/泳道)上样至12%预制tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen, 目录号 EC6005box, 批号 6111021)上，且将非还原样品(10 mg/泳道)上样至8%-16%预制tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen, 目录号 EC6045box, 批号 6111021)上。SeeBlue Plus 2(Invitrogen, 目录号LC5925, 批号 1351542)用作分子量标记。将凝胶在XCell SureLock mini cell凝胶盒(Invitrogen, 目录号 EI0001)中运行，且通过首先应用75的电压以将样品堆积在凝胶中，随后应用125的恒定电压，直至染料前沿到达凝胶的底部，来分离蛋白。使用的运行缓冲液为1X tris甘氨酸SDS缓冲液，其从10X tris甘氨酸SDS缓冲液(ABC, MPS-79-080106))制备。凝胶用胶态蓝染料(Invitrogen 目录号 46-7015, 46-7016)染色过夜，且用Milli-Q水脱染，直至背景是清楚的。然后使用Epson Expression扫描仪(型号1680，S/N DASX003641)扫描染色的凝胶。
沉降速度分析
将抗体或DVD-Ig蛋白上样至三个标准二区碳环氧类树脂中心杯(two-sector carbon epon centerpieces)的每一个的样品室中。这些中心杯具有1.2 cm光程长度，且制造具有蓝宝石窗口。PBS用于参考缓冲液，且各室含有140 µL。使用4孔(AN-60Ti)转子在Beckman ProteomeLab XL-I分析型超速离心机(系列号 PL106C01)中同时检查所有样品。
运行条件是编程的，且使用ProteomeLab(v5.6)进行离心控制。分析前允许样品和转子热平衡一小时(20.0 ± 0.1℃)。在3000 rpm进行正确的细胞上样的确认，且对各室记录单一扫描。沉降速率条件如下：
样品室体积： 420 mL
参考室体积： 420 mL
温度： 20℃
转子速度： 35,000 rpm
时间： 8:00小时
UV 波长： 280 nm
径向步长： 0.003 cm
数据收集： 每步一个数据点，信号不取平均值。
扫描总数： 100。
完整抗体的LC-MS分子量测量
通过LC-MS分析完整抗体和DVD-Ig蛋白的分子量。用水将各抗体或DVD-Ig蛋白稀释至约1 mg/mL。使用具有蛋白微捕获器(microtrap)(Michrom Bioresources, Inc,目录号 004/25109/03)的1100 HPLC(Agilent)系统脱盐，且将5 mg样品导入API Qstar pulsar i质谱仪(Applied Biosystems)。短梯度用于洗脱样品。用流动相A(0.08% FA，0.02% TFA，在HPLC水中)和流动相B(0.08% FA和0.02% TFA，在乙腈中)以50 mL/分钟的流速运行梯度。在4.5千伏喷射电压以2000至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
抗体和DVD-Ig蛋白轻链和重链的LC-MS分子量测量
通过LC-MS分析抗体和DVD-Ig蛋白轻链(LC)、重链(HC)和去糖基化的 HC的分子量测量值。用水将抗体和DVD-Ig蛋白稀释至1 mg/mL，且在37℃用最终浓度10 mM的DTT将样品还原为LC和HC，持续30分钟。为了将抗体和DVD-Ig蛋白去糖基化，将100 mg抗体或DVD-Ig蛋白与2 mL PNGase F、5 mL 10% N-辛基葡糖苷在100 mL的总体积中在37℃孵育过夜。去糖基化后，用在37℃最终浓度10 mM的DTT将样品还原30分钟。具有C4柱(Vydac, 目录号214TP5115, S/N 060206537204069)的Agilent 1100 HPLC系统用于脱盐且将样品(5 mg)导入API Qstar pulsar i质谱仪(Applied Biosystems)。短梯度用于洗脱样品。用流动相A(0.08% FA，0.02% TFA，在HPLC水中)和流动相B(0.08% FA和0.02% TFA，在乙腈中的)以50 mL/分钟的流速运行梯度。在4.5千伏喷射电压以800至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
肽作图
用最终浓度6 M盐酸胍/75 mM碳酸氢铵在室温将抗体或DVD-Ig蛋白变性15分钟。变性的样品用最终浓度10 mM的DTT于37℃还原60分钟，随后用50 mM碘乙酸(IAA)在黑暗中于37℃烷化30分钟。烷化后，将样品于4℃针对四升10 mM碳酸氢铵透析过夜。将透析的样品用10 mM碳酸氢铵(pH 7.8)稀释至1 mg/mL，且100 mg抗体或DVD-Ig蛋白用胰蛋白酶(Promega, 目录号 V5111)或Lys-C(Roche, 目录号 11 047 825 001)以1:20(w/w)胰蛋白酶/Lys-C:抗体或DVD-Ig蛋白比率于37℃消化4小时。用1 mL 1 N HCl淬灭消化物。对于用质谱仪检测的肽作图，用Agilent 1100 HPLC系统在C18柱(Vydac, 目录号 218TP51, S/N NE9606 10.3.5)上通过反相高效液相层析(RPHPLC)分离40 mL消化物。用使用流动相A(0.02% TFA和0.08% FA，在HPLC等级水中)和流动相B(0.02% TFA和0.08% FA，在乙腈中)的梯度以50 mL/分钟的流速运行肽分离。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。
二硫键作图
为了使抗体变性，将100 mL抗体或DVD-Ig蛋白与300 mL 8 M盐酸胍/100 mM碳酸氢铵混合。检查pH以确保它在7和8之间，且将样品在最终浓度6 M的盐酸胍中于室温变性15分钟。用Milli-Q 水将一部分变性的样品(100 mL)稀释至600 mL，以给出1 M的最终盐酸胍浓度。将样品(220 mg)用胰蛋白酶(Promega, 目录号V5111, 批号 22265901)或Lys-C(Roche, 目录号 11047825001, 批号 12808000)以1:50胰蛋白酶或1:50 Lys-C:抗体或DVD-Ig蛋白(w/w)比率(4.4 mg酶:220 mg样品)于37℃消化约16小时。将额外5 mg胰蛋白酶或Lys-C添加至样品，且允许于37℃进行消化额外2小时。通过向各样品添加1 mL TFA终止消化。使用在Agilent HPLC系统上的C18柱(Vydac, 目录号218TP51 S/N NE020630-4-1A)通过RPHPLC分离消化的样品。用与用于肽作图的相同的梯度，使用流动相A(0.02% TFA和0.08% FA，在HPLC等级水中)和流动相B(0.02% TFA和0.08% FA，在乙腈中)，以50 mL/分钟的流速，运行分离。HPLC操作条件与用于肽作图的那些相同。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。通过将肽的观察到的MW与通过二硫键连接的胰蛋白酶消化或Lys-C肽的预测MW进行匹配来指定二硫键。
游离巯基测定
用于定量抗体或DVD-Ig蛋白中的游离半胱氨酸的方法基于Ellman氏试剂，5,5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)与巯基(SH)的反应，其产生特征性的生色产物5-硫代-(2-硝基苯甲酸)(TNB)。该反应以下式阐明：
。
使用Cary 50分光光度计在412 nm测量TNB-的吸光度。使用2巯基乙醇(b-ME)的稀释物作为游离SH标准品绘制吸光度曲线，且从样品在412 nm的吸光度测定蛋白中的游离巯基的浓度。
通过用HPLC等级水将14.2 M b-ME连续稀释至0.142 mM的最终浓度而制备b-ME标准储液。然后制备各浓度的一式三份的标准品。使用amicon ultra 10,000 MWCO离心滤器(Millipore, 目录号 UFC801096, 批号 L3KN5251)将抗体或DVD-Ig蛋白浓缩至10 mg/mL，且将缓冲液变为用于阿达木单抗的制剂缓冲液(5.57 mM磷酸二氢钠，8.69 mM磷酸氢二钠，106.69 mM NaCl，1.07 mM柠檬酸钠，6.45 mM柠檬酸，66.68 mM甘露糖醇，pH 5.2，0.1%(w/v)Tween)。将样品于室温在摇床上混合20分钟。然后将180 mL的100 mM Tris缓冲液(pH 8.1)添加至各样品和标准品，随后添加300 mL 2 mM DTNB/10 mM磷酸缓冲液(pH 8.1)。彻底混合后，在Cary 50分光光度计上测量样品和标准品于412 nm的吸光度。通过绘制游离SH的量和b-ME标准品的OD412 nm获得标准曲线。减去空白值后，基于该曲线计算样品的游离SH含量。
弱阳离子交换层析
用10 mM磷酸钠(pH 6.0)将抗体或DVD-Ig蛋白稀释至1 mg/mL。使用具有WCX-10 ProPac分析型柱(Dionex，目录号054993，S/N 02722)的Shimadzu HPLC系统分析电荷异质性。在80%流动相A(10 mM磷酸钠，pH 6.0)和20%流动相B(10 mM磷酸钠，500 mM NaCl，pH 6.0)中将样品上样在柱上，且以1.0 mL/分钟的流速洗脱。
寡糖概况分析
用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记试剂衍生化PNGase F处理抗体或DVD-Ig蛋白后释放的寡糖。通过正相高效液相层析(NPHPLC)分离荧光标记的寡糖，且基于与已知标准品的保留时间比较表征寡糖的不同形式。
首先用PNGaseF消化抗体或DVD-Ig蛋白，以从重链Fc部分切割N-连接的寡糖。将抗体或DVD-Ig蛋白(200 mg)与2 mL PNGase F和3 mL 10% N-辛基葡糖苷一起置于500 mL Eppendorf管中。添加磷酸盐缓冲盐水，以使最终体积达到60 mL。将样品在设定为700 RPM的Eppendorf恒温混合器中于37℃孵育过夜。阿达木单抗批次AFP04C也用PNGase F消化作为对照。
PNGase F处理后，将样品在设定为750 RPM的Eppendorf恒温混合器中于95℃孵育5分钟，以沉淀出蛋白，然后将样品置于在10,000 RPM的Eppendorf离心机中2分钟以离心下沉淀的蛋白。将含有寡糖的上清液转移至500 mL Eppendorf管中且在加速真空(speed-vac)中于65℃干燥。
使用购自Prozyme(目录号GKK-404, 批号 132026)的2AB标记试剂盒用2AB标记寡糖。根据制造商的说明制备标记试剂。将乙酸(150 mL，试剂盒中提供)添加至DMSO小瓶(试剂盒中提供)，且通过上下移取溶液几次而混合。将乙酸/DMSO混合物(100 mL)转移至2-AB染料小瓶中(临使用前)，且混合直至染料完全溶解。然后将染料溶液添加至还原剂的小瓶(试剂盒中提供)，且充分混合(标记试剂)。将标记试剂(5 mL)添加至各个干燥的寡糖样品小瓶，且充分混合。将反应小瓶置于设定为65℃和700-800 RPM的Eppendorf恒温混合器中反应2小时。
标记反应后，使用来自Prozyme的GlycoClean S Cartridges(目录号GKI-4726)去除过量荧光染料。添加样品前，用1 mL milli-Q水洗涤药液筒，随后用1 mL 30%乙酸溶液洗涤5次。临添加样品前，将1 mL乙腈(Burdick and Jackson，目录号AH015-4)添加至药液筒。
所有乙腈通过药液筒后，将样品点样至新鲜洗涤的盘中央，且允许其吸附至盘上10分钟。用1 mL乙腈洗涤盘，随后用1 mL 96%乙腈洗涤5次。将药液筒置于1.5 mL Eppendorf管上，并用milli Q水的3次洗涤(每次洗涤400 mL)洗脱2-AB标记的寡糖。
使用与Shimadzu HPLC系统连接的Glycosep N HPLC(目录号GKI-4728)柱分离寡糖。Shimadzu HPLC系统由系统控制器、脱气装置、二元泵、具有样品冷却器的自动采样器和荧光检测器组成。
在高温的稳定性
使用Amicon超速离心滤器，抗体或DVD-Ig蛋白的缓冲液是5.57 mM磷酸二氢钠、8.69 mM磷酸氢二钠、106.69 mM NaCl、1.07 mM柠檬酸钠、6.45 mM柠檬酸、66.68 mM甘露糖醇、0.1%(w/v) Tween(pH 5.2)；或10 mM组氨酸、10 mM甲硫氨酸、4%甘露糖醇(pH 5.9)。用适当的缓冲液将抗体或DVD-Ig蛋白的最终浓度调整至2 mg/mL。然后将抗体或DVD-Ig蛋白溶液过滤灭菌，且在无菌条件下制备0.25 mL等分试样。将等分试样在-80℃、5℃、25℃、或40℃放置1、2或3周。孵育时间段结束时，通过大小排阻层析和SDS-PAGE分析样品。
在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析稳定性样品。使用的程序与本文所述相同。用胶态蓝染料(Invitrogen目录号46-7015, 46-7016)将凝胶染色过夜，且用Milli-Q水脱染，直至背景是清楚的。然后使用Epson Expression扫描仪(型号1680, S/N DASX003641)扫描染色的凝胶。为了获得更高灵敏度，使用银染色试剂盒(Owl Scientific)将相同凝胶银染色，且使用制造商提供的推荐程序。
动态扫描荧光测定
DVD-Ig蛋白在10 mM柠檬酸盐、10 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中透析，以获得1 mg/ml的最终浓度。对各DVD-Ig蛋白运行三次重复。对于各样品，在96孔板的孔中添加27 µl DVD-Ig蛋白，且与3 µl 4X稀释的SYPRO Orange染料(Invitrogen)混合。染料以5000X的浓度在DMSO中供应，且在水中稀释至4X的工作浓度。将板离心30秒以确保染料和蛋白两者都沉降至孔底部，且通过移液管尖端轻微抽吸以确保完全混合。然后将板用粘膜密封。
实时PCR(Applied Biosciences, 7500 Series)用于测量荧光强度随着温度的变化。该板以约0.5℃/分钟的温度斜率从25℃加热至95℃，且使用TAMRA滤光片收集发射荧光。数据输出至Microsoft Excel且针对各DVD-Ig蛋白绘制为温度vs荧光曲线。将熔解开始注释为温度记录图升高至超过基线荧光的温度。SYPRO Orange是疏水性染料且优先结合至解折叠蛋白分子中暴露的疏水性残基。因此，如荧光增加所测量的解折叠温度的开始是DVD-Ig蛋白的热稳定性的指示。DVD-Ig蛋白的解折叠温度可见于表12中。
表12：通过动态扫描荧光测定确定的DVD-Ig蛋白的热稳定性
大多数DVD-Ig蛋白显示解折叠温度>50摄氏度。该DVD-Ig蛋白概况与对于亲本抗体观察到的概况类似。
溶解度测定
在15mM His(pH 6.0)中透析DVD-Ig蛋白候选物。随后将它们在30K 截止(cutoff)的centricons中浓缩至50 μl。溶解度通过在4℃储存后不存在沉淀进行目测确认，且通过280nm的UV吸光度测量值进行定量确定。
表 13：DVD-Ig蛋白的溶解度
大多数DVD-Ig蛋白显示出澄清外观，且可以浓缩至高于25 mg/ml。该DVD-Ig蛋白概况与对于亲本抗体观察到的概况类似。
通过引用并入
可能在本申请自始至终引用的所有引用的参考文献(包括文献参考文献、专利、专利申请和网站)的内容都在此为了任何目的明确地以其整体通过引用并入，其中引用的参考文献也如此。除非另外指出，本公开将采用本领域众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
本公开还以其整体通过引用并入分子生物学和药物递送领域中众所周知的技术。这些技术包括，但不限于，在以下出版物中描述的技术：
Ausubel 等 (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993);
Ausubel, F.M. 等 eds., Short Protocols In Molecular Biology (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X);
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);
Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999);
Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984);
Hammerling, 等, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981;
Harlow 等 , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);
Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991);
Kabat, E.A., 等 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;
Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);
Lu and Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X).
Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974);
Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook, J. 等 eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4)。
等同方案
本公开在不背离其精神或基本特征的情况下可以包括其它具体形式。前述实施方案因此在所有方面被视为是示例性的而不是限制本公开。本公开的范围因此由所附权利要求而非由前述说明书指出，且在权利要求的等同方案的含义和范围内的所有改变因此预期包含于其中。

Claims (34)

1.包含第一和第二多肽链的结合蛋白，所述第一和第二多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中，
VD1是第一可变结构域；
VD2是第二可变结构域；
C是恒定结构域；
X1是接头；
X2是存在或不存在的Fc区；
n是0或1，
其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性目标结合位点，且其中所述结合蛋白能够结合
(a) TNFα和IL-13，其中，
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 38-43和48-49的序列，和/或
(ii) 形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 32-37的序列；
(b) TNFα和PGE2，其中
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 38-43和48-49的序列，和/或
(ii) 形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 50-55的序列；
或
(c) TNFα和NGF，其中
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 38-43和48-49的序列，和/或
(ii) 形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO: 56-57的序列。
2.包含第一和第二多肽链的结合蛋白，所述第一和第二多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中，
VD1是第一可变结构域；
VD2是第二可变结构域；
C是恒定结构域；
X1是接头；
X2是存在或不存在的Fc区；
n是0或1，
其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性目标结合位点，且其中所述结合蛋白能够结合
(a) TNFα和IL-13，其中，
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：
来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，
来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，
来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，或
来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3；
和/或
(ii) 形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域包含
来自SEQ ID NO: 32的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 33的CDR1-3；
来自SEQ ID NO: 34的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 35的CDR1-3；或
来自SEQ ID NO: 36的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 37的CDR1-3；
(b) TNFα和PGE2，其中，
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：
来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的三个CDR，
来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的三个CDR，
来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的三个CDR，或
来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和 来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3；
和/或
(ii) 形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域包含
来自SEQ ID NO: 50的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 51的CDR1-3；
来自SEQ ID NO: 52的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 53的CDR1-3；或
来自SEQ ID NO: 54的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 55的CDR1-3；
或
(c) TNFα和NGF，其中，
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：
来自SEQ ID NO: 38的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 39的CDR1-3，
来自SEQ ID NO: 40的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 41的CDR1-3，
来自SEQ ID NO: 42的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 43的CDR1-3，或
来自SEQ ID NO: 48的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 49的CDR1-3；
和/或
(ii) 形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域包含
来自SEQ ID NO: 56的CDR1-3和来自SEQ ID NO: 57的CDR1-3。
3.权利要求1或2的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-X2，其中
VD1是第一重链可变结构域；
VD2是第二重链可变结构域；
C是重链恒定结构域；
X1是接头；
X2是存在或不存在的Fc区；
n是0或1，且
其中第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C，其中，
VD1是第一轻链可变结构域；
VD2是第二轻链可变结构域；
C是轻链恒定结构域；
X1是接头；
n是0或1，
其中所述第一和第二多肽链上的VD1结构域形成第一功能性目标结合位点，且所述第一和第二多肽链上的VD2结构域形成第二功能性目标结合位点。
4.权利要求1-3中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合：
(a) TNFα和IL-13，其中，
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，或
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
和/或
(ii) 形成针对IL-13的功能性目标结合位点的可变结构域包含
SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO: 33；
SEQ ID NO: 34和SEQ ID NO: 35；或
SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37；
(b) TNFα和PGE2，其中
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，或
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
和/或
(ii) 形成针对PGE2的功能性目标结合位点的可变结构域包含
SEQ ID NO: 50和SEQ ID NO: 51；
SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 53； 或
SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 55；
或
(c) TNFα和NGF，其中
(i) 形成针对TNFα的功能性目标结合位点的可变结构域包含：
SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 39，
SEQ ID NO: 40和SEQ ID NO: 41，
SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43，或
SEQ ID NO: 48和SEQ ID NO: 49；
和/或
(ii) 形成针对NGF的功能性目标结合位点的可变结构域包含
SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 57。
5.权利要求1-4中任一项的结合蛋白，其中
(a) 所述结合蛋白能够结合TNFα和IL-13，其中所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约5.8x10-11 M的KD结合TNFα，和/或所述结合蛋白能够以通过表面等离振子共振测量的至多约1.2x10-9 M的KD结合IL-13；
(b) 所述结合蛋白能够结合TNFα和PGE2，其中所述结合蛋白能够以通过TNFα中和测定测量的至多约3.076 nM的IC50中和TNFα，和/或所述结合蛋白能够以通过PGE2中和测定测量的至多约124.8 nM的IC50中和PGE2；或
(c) 所述结合蛋白能够结合TNFα和NGF，其中所述结合蛋白能够以通过TNFα中和测定测量的至多约0.673 nM的IC50中和TNFα，和/或所述结合蛋白能够以通过TF-1细胞增殖生物测定测量的至多约7.455 nM的IC50抑制NGF。
6.权利要求1-5中任一项的结合蛋白，包含两条第一多肽链和两条第二多肽链以及四个功能性目标结合位点。
7.权利要求1-6中任一项的结合蛋白，其中X1是SEQ ID NO: 1-31中的任一个。
8.权利要求1-7中任一项的结合蛋白，其中X1不是CH1或CL。
9.权利要求1-8中任一项的结合蛋白，其中所述Fc区是变体序列Fc区，和/或其中所述Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。
10.权利要求1-9中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含
(a) 重链恒定区，其包含：
(i) 野生型人IgG1重链序列，或
(ii) 通过一个或多个氨基酸改变修饰的人IgG1重链序列，任选地，其中所述改变包含在恒定区序列的氨基酸位置234和235的取代，任选地，其中所述改变包含位置234和235的亮酸被丙氨酸取代；
和/或
(b) 轻链恒定区，其包含：
(i) 野生型人κ轻链恒定区序列，或
(ii) 野生型人λ轻链恒定区序列。
11.权利要求1-10中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是结晶结合蛋白。
12.结合蛋白，其能够结合
(a) TNFα和IL-13，包含来自表2的任何DVD-Ig VH和VL序列对；
(b) TNFα和PGE2，包含来自表3的任何DVD-Ig VH和VL序列对；
或
(c) TNFα和NGF，包含来自表4的任何DVD-Ig VH和VL序列对。
13.结合蛋白缀合物，其包含权利要求1-12中任一项的结合蛋白，所述结合蛋白缀合物进一步包含免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。
14.权利要求13的结合蛋白缀合物，其中所述显像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。
15.权利要求14的结合蛋白缀合物，其中所述放射性标记是3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
16.权利要求13的结合蛋白缀合物，其中所述治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素或细胞凋亡剂。
17.分离的核酸，其编码权利要求1-12中任一项的结合蛋白氨基酸序列。
18.载体，其包含权利要求17的分离的核酸。
19.权利要求18的载体，其中所述载体包含pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6、pHybE、TOPO或pBJ。
20.宿主细胞，其包含权利要求18或19的载体。
21.权利要求20的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞、大肠杆菌、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、Sf9细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞、CHO细胞或COS细胞。
22.产生结合蛋白的方法，其包括在培养基中在足以产生所述结合蛋白的条件下培养权利要求20或21的宿主细胞。
23.药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项的结合蛋白和药学上可接受的载体。
24.权利要求23的药物组合物，其进一步包含至少一种额外治疗剂。
25.根据权利要求24的药物组合物，其中所述额外治疗剂是显像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、抗细胞因子抗体或其功能片段、氨甲喋呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉弛缓剂、麻醉药、非类固醇消炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗银屑病剂、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、刺激剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
26.治疗受试者的疾病或病症的方法，其通过向所述受试者施用权利要求1-12中任一项的结合蛋白来实现。
27.权利要求26的方法，其中所述病症是：关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、银屑病、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、银屑病性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、卵巢早衰、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjögren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型银屑病、2型银屑病、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫、多发性硬化症(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjörgren氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症诸如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复合征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉夹层、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化疗相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学病况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、霍奇金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流行性感冒、电离辐射暴露、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shy-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非霍奇金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢早衰、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化症风险的临床孤立综合征(cis)、儿童期发病性精神病、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合征(GBS)、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、泵后综合征、原发性帕金森综合征、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、硅树脂相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合征(SJS)、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体、I型变态反应、II型糖尿病、普通型间质性肺炎(UIP)、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性、或伤口愈合。
28.权利要求26或27的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病、哮喘、类风湿性关节炎、骨关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、败血症、神经变性疾病或肿瘤病症。
29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述结合蛋白配制用于肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内或经皮施用。
30.通过免疫测定确定测试样品中的至少一种目标或其片段的存在、量或浓度的方法，
其中所述免疫测定包括使所述测试样品与至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记接触，且
其中所述至少一种结合蛋白包含权利要求1-12中任一项的结合蛋白。
31.权利要求30的方法，其进一步包括：
(i) 使所述测试样品与所述至少一种结合蛋白接触，其中所述结合蛋白结合至所述目标或其片段上的表位，从而形成第一复合物；
(ii) 使所述复合物与所述至少一种可检测标记接触，其中所述可检测标记结合至所述结合蛋白或所述目标或其片段上的不被所述结合蛋白结合的表位，以形成第二复合物；且
(iii) 基于所述第二复合物中的所述可检测标记生成的信号，检测所述测试样品中的所述目标或其片段的存在、量或浓度，其中所述目标或其片段的存在、量或浓度与所述可检测标记生成的信号直接相关。
32.权利要求30的方法，其进一步包括：
(i) 使所述测试样品与所述至少一种结合蛋白接触，其中所述结合蛋白结合至所述目标或其片段上的表位，从而形成第一复合物；
(ii) 使所述复合物与所述至少一种可检测标记接触，其中所述可检测标记与所述目标或其片段竞争结合至所述结合蛋白，从而形成第二复合物；且
(iii) 基于所述第二复合物中的所述可检测标记生成的信号，检测所述测试样品中的所述目标或其片段的存在、量或浓度，其中所述目标或其片段的存在、量或浓度与所述可检测标记生成的信号间接相关。
33.用于测定测试样品的所述样品中目标或其片段的存在、量或浓度的试剂盒，所述试剂盒包含(a)用于测定所述测试样品中的所述目标或其片段的说明书，和(b)至少一种包含权利要求1-12中任一项的结合蛋白的结合蛋白。
34.权利要求1-12中任一项的结合蛋白在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
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