CN111154802B - Ecm1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种ECM1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用，具体地，本发明提供了一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的制备方法，包括以下步骤：(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的ECM1基因失活，得到ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞；和(b)利用步骤(a)中得到的ECM1基因失活的细胞，制备得到ECM1基因失活的肝纤维化或其相关疾病动物模型。本发明的动物模型是一种有效的肝纤维化或其相关疾病的动物模型，可用于研究肝纤维化或其相关疾病，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。

Description

ECM1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及ECM1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用。
背景技术
肝纤维化是一个动态的肝脏受损修复过程，类似于伤口修复反应，其特征是细胞外基质在肝脏内的非正常聚集。任何一种导致肝脏长期慢性损伤的因素都会诱导出这种修复反应。在中国，最常见的的肝脏损伤因素就是HBV和HCV慢性感染导致的肝损伤。而在发达国家非酒精性脂肪性肝(NAFLD)则是最常见的发病因素。随着经济水平的发展和优秀的抗病毒药物和疫苗的出现，HBV和HCV的发病率在逐渐下降，非酒精性脂肪性肝的发病率和流行率都在上升。NAFLD现在被公认为是美国慢性肝病的最常见原因，相信随着中国经济的不断发展，非酒精性脂肪性肝也会成为中国的头号肝病。其他肝纤维化病因也包括酒精性肝病，药物引起的肝脏疾病，和自身免疫，代谢和胆道疾病引起的肝脏疾病。
肝纤维化的过程是肝脏内胶原纤维生成的速度大于降解的速度。尽管肝纤维化可以在消除损伤后发生逆转，但慢性持续损伤可导致细胞外基质蛋白高度交联并丧失潜在的可逆性。肝硬化则是纤维化的最终阶段，肝实质大量缺失和血管结构发生严重扭曲。肝硬化可导致肝功能失调性疾病，这是一个重要的致死性疾病之一。失代偿性肝硬化的表现包括可以导致腹水的门静脉高压，静脉曲张出血和肝性脑病。此外，肝硬化是一种“癌前状态”，伴随着时间的推移，肝细胞癌(HCC)的风险增加，即使是尚未出现肝硬化的进展性纤维化患者，其HCC的风险也会增加。
目前肝纤维化或其相关疾病动物模型多为诱导型动物模型，有很多缺点，比如造模时间过长，无肝硬化症状如腹水或死亡等。
因此本领域迫切需要开发一种可以作为研究肝纤维化的发生机理以及新药筛选的有力工具的动物模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以作为研究肝纤维化的发生机理以及新药筛选的有力工具的动物模型。
本发明第一方面提供了一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的制备方法，包括以下步骤：
(a) 提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的 ECM1基因失活，得到 ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞；和
(b) 利用步骤(a)中得到的 ECM1基因失活的细胞，制备得到 ECM1基因失活的肝纤维化或其相关疾病动物模型。
在另一优选例中，所述肝纤维化或其相关疾病动物模型为非诱导型自发肝纤维化或其相关疾病的动物模型。
在另一优选例中，在步骤(a)中，包括如下步骤：
(a1)利用DNA同源重组技术，将所述 ECM1基因中的编码区(如外显子1至外显子10)或非编码区(如5’UTR或3’UTR)或3’编码区或内含子区进行剔除或基因编辑，并用筛选标记替换，得到 ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞。
在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括如下步骤：
(b1)利用步骤(a)中得到的 ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞制备得到嵌合非人哺乳动物；
(b2)将步骤(b1)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁育，在后代中筛选获得 ECM1基因失活的杂合子非人哺乳动物；和
(b3)通过将步骤(b2)中得到的杂合子非人哺乳动物相互交配获得 ECM1基因失活的纯合子非人哺乳动物，从而得到 ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型。
在另一优选例中，在步骤(b3)中，还包括步骤(b4)：将 ECM1基因失活的纯合子非人哺乳动物与同一物种的肝脏特异性的特异性敲除工具非人哺乳动物或同一物种的全身敲除工具的非人哺乳动物进行杂交，从而获得肝脏特异性的 ECM1基因失活或全身性的ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型。
在另一优选例中，所述将 ECM1基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。
在另一优选例中，所述基因失活包括 ECM1基因不表达，或表达没有活性的ECM1蛋白。
在另一优选例中，所述将 ECM1基因失活还包括将 ECM1基因或其蛋白的表达下降50%，较佳地，70%，更佳地，80%，更佳地，90%，更佳地，100%。
在另一优选例中，所述的 ECM1基因失活是肝脏特异性或全身性的 ECM1基因失活。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物是小鼠，并且在步骤(b4)中把ECM1 Loxp/Loxp小鼠与工具鼠NSE(neuron-specific enolase)-Cre交配，即得到在肝脏特异性 ECM1基因敲除小鼠简称Alb-cre/ECM1flox/flox小鼠(即肝脏特异性 ECM1失活小鼠)。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物是小鼠，并且在步骤(b4)中把ECM1基因敲除杂合子小鼠与ECM1基因敲除杂合子小鼠交配，即得到全身性ECM1基因敲除小鼠，简称ECM1-KO小鼠(即全身性ECM1失活小鼠)。
在另一优选例中，所述筛选标记选自下组：抗性基因、荧光蛋白基因、或其组合。
在另一优选例中，所述筛选标记包括 neo基因和/或GFP基因。
在另一优选例中，所述步骤(b)中得到的 ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：
(t1) 肝纤维化进展程度增加；
(t2) a-SMA阳性细胞的数量增加；
(t3) 羟脯氨酸的含量增加；
(t4) 肝纤维化的相关基因表达量增加；
(t5) 谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的含量略微增加；
(t6) 星状细胞HSC的激活程度增加；
(t7) 胶原蛋白含量增加。
在另一优选例中，所述肝纤维化的相关基因表达量增加指相对于野生型对照动物，肝纤维化的相关基因表达量≥500，较佳地，≥800，更佳地，≥1000。
在另一优选例中，所述肝纤维化的相关基因选自下组：a-SMA、Col1a1、Col1a3、Desmin、或其组合。
本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，该模型用作研究肝纤维化或其相关疾病的动物模型。
在另一优选例中，所述肝纤维化或其相关疾病选自下组：肝纤维化、肝硬化、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、病毒性肝炎、或其组合。
本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，用于筛选或鉴定可减轻或治疗肝纤维化或其相关疾病的物质(治疗剂)。
本发明第四方面提供了一种筛选或确定预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂的方法，包括步骤：
(a) 在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达 ECM1的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的 ECM1基因或其蛋白的表达水平E1；和/或ECM1蛋白的活性水平V1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的 ECM1基因或其蛋白的表达水平E2；和/或ECM1蛋白的活性水平V2；和
 (b) 将上一步骤所检测的E1、E2，和/或V1、V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂；
其中，如果E1显著高于E2；和/或V1显著高于V2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂。
在另一优选例中，所述“显著高于”指E1/E2≥2, 较佳地，≥3，更佳地，≥4。
在另一优选例中，所述“显著高于”指V1/V2≥2, 较佳地，≥3，更佳地，≥4。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述方法包括步骤(c)，将步骤(b)中所确定的潜在治疗剂施用于本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型，从而测定其对所述动物模型的肝纤维化或其相关疾病的影响。
本发明第五方面提供了一种筛选或确定预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂的方法，包括步骤：
(a) 在测试组中，在测试化合物存在的条件下，将测试化合物施用于本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型，检测测试组中所述动物模型的肝纤维化的严重程度Q1；并且在不施用所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组中所述动物模型的肝纤维化的严重程度Q2；和
(b)将上一步骤所检测的严重程度Q1和严重程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂；
其中，如果严重程度Q1显著低于严重程度Q2时，则表示所述测试化合物为预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂。
在另一优选例中，所述的检测肝纤维化严重程度包括检测选自下组的一个或多个指标的变化：活化的HSC的数量、a-SMA阳性细胞的数量、羟脯氨酸的含量、谷丙转氨酶的含量、谷草转氨酶的含量、肝脏内胶原蛋白含量、肝脏内胶原纤维含量。
在另一优选例中，所述肝纤维化严重程度降低表现为：非人哺乳动物（如小鼠）肝纤维化进展程度降低、a-SMA阳性细胞的数量降低、羟脯氨酸的含量减低、肝纤维化的相关基因表达量降低、谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的含量略微减低、星状细胞HSC的激活程度降低、胶原蛋白含量降低。
在另一优选例中，所述“显著低于”指严重程度Q1/严重程度Q2之比值≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地，≤1/4。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和治疗性的。
在另一优选例中，所述方法包括步骤(c)，将步骤(b)筛选或鉴定的潜在治疗剂施用于本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型，从而测定其对所述动物模型的肝纤维化严重程度的影响。
本发明第六方面提供了一种非人哺乳动物模型，所述模型用本发明第一方面所述的方法制备。
在另一优选例中，对于 ECM1基因失活而言，所述的非人哺乳动物模型是杂合的或纯合的。
在另一优选例中，所述的 ECM1基因失活是肝脏特异性的 ECM1基因失活或全身的 ECM1基因失活。
本发明第七方面提供了一种细胞的用途，所述细胞中的 ECM1基因失活或下调，用于制备构建非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的生物制剂。
在另一优选例中，所述生物制剂为液态制剂。
本发明第八方面提供了一种 ECM1基因或其蛋白失活剂或下调剂的用途，用于制备构建非人哺乳动物肝纤维化或其相关疾病动物模型的制剂。
在另一优选例中，所述失活剂包括抑制剂。
在另一优选例中，所述失活剂或下调剂指将 ECM1基因或其蛋白的表达下降50%，较佳地，70%，更佳地，80%，更佳地，90%，更佳地，100%。
在另一优选例中，所述失活剂或下调剂选自下组：抗体、小分子化合物、核酸、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了 ECM1基因敲除小鼠表型发生变化。同窝相同父母的ECM1基因表达正确小鼠(WT)，和ECM1表达缺失小鼠(KO)。两只小鼠的年龄均为8周。
图2显示了ECM1基因敲除小鼠肝脏发生变化。同窝相同父母的ECM1基因表达正确小鼠(WT)，和ECM1表达缺失小鼠(KO)的肝脏。两只小鼠的年龄均为8周。
图3显示了ECM1-WT和KO小鼠肝脏切片染色。ECM1-WT和KO小鼠在对应的周龄处死(6周和8周)，取肝脏固定，脱水，包埋，切片。分别进行H&E；Masson染色和a-SMA免疫组化染色，其中，图3A的H&E染色结果显示相比较同年龄的WT小鼠，ECM1-KO小鼠肝脏结构发生变化，肝实质细胞减少，组织中出现了大量被染成淡红色的物质沉积，图3B显示了这些胶原蛋白主要沉积在肝窦内，这种沉积方式与典型的CCL4造模的小鼠肝纤维化模型有明显区别，图3C显示了在KO小鼠的肝脏切片中，在肝窦间隙内出现了大量的α-SMA阳性的细胞。
图4显示了ECM1-WT和KO小鼠肝纤维化标志物检测。其中，
(A)ECM1-WT和KO小鼠在8周龄处死，取肝脏裂解，按照羟脯氨酸检测试剂盒处理样品及检测，最后用分光光度计在OD550波长处读值。
(B)将8周大小的ECM1-WT和KO小鼠的肝脏进行灌流，消化，密度梯度离心分选等到HSC。 TRIZO裂解，抽提mRNA，反转录得到cDNA，最后通过RT-PCR检测相关基因的表达。
图5显示了ECM1-KO小鼠肝损伤情况分析。其中，ECM1-WT和KO小鼠在8周龄处死，收集血清。同时取一组WT小鼠，每周2次注射CCL4造模，一共4周，然后取血清作为阳性对照。血清样本用对应的AST和ALT检测试剂盒检测。
图6显示了ECM1蛋白与整合素αv相互作用。其中，野生型小鼠(WT)肝脏PFA固定后，脱水，包埋，冰冻切片后使用抗鼠ECM1抗体和抗整合素αv染色后，复染DAPI，封片，拍照。激光共聚焦荧光显微镜拍照。
图7显示了ECM1蛋白抑制TGF-β1的活化和小鼠HSC的激活。其中，
A：分离野生型小鼠(WT)肝脏原代的星状细胞(HSC)，与含有TGF-β1活性报告系统的NIH-3T3细胞共同培养。培液中加入重组的小鼠ECM1蛋白(50μg/ml)，cRGD(10μg/ml)或无关的IgG蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(NC)。培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(Luciferase)活性。
B: 分离野生型小鼠(WT)肝脏原代的星状细胞(HSC)，体外培养2个星期。培液中加入重组的小鼠ECM1蛋白(50μg/ml)，cRGD(10μg/ml)或无关的IgG蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(NC)。每3天更换一次新鲜培液。2个星期后 用TRIZO裂解，抽提mRNA，反转录得到cDNA，最后通过RT-PCR检测相关基因的表达。
图8显示了ECM1敲除小鼠(ECM1-KO)肝脏中TGF-β1过度活化。其中，
A：分离野生型小鼠(WT)和ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏原代的星状细胞(HSC)，与含有TGF-β活性报告系统的NIH-3T3细胞共同培养。共培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(Luciferase)活性。
B：ECM1-WT和KO小鼠在8周龄处死，取肝脏TRIZO裂解，抽提mRNA，反转录得到cDNA，最后通过RT-PCR检测TGF-β mRNA的表达。
C：分离野生型小鼠(WT)和ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏原代的星状细胞(HSC)，裂解于RIPA裂解液中。用BCA定量后，用RIPA裂解液统一稀释为2ug/ml,加入Loading Buffer加热变性。上样时每个样品20ug/泳道。使用抗磷酸化SMAD3(Phosphorylated-SMAD3, p-SMAD3)抗体，SMAD3抗体和抗Actin抗体进行检测。
图9显示了腺相关病毒介导的ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)肝脏中ECM1基因重表达。其中，
A：ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周，分为2组分别通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒(AAV-ECM1)或不表达基因的对照病毒(AAV-NC)。注射病毒4周后，处死小鼠，收集肝脏，TRIZO裂解，抽提mRNA，反转录得到cDNA，最后通过RT-PCR检测ECM1基因的表达。GAPDH的表达作为内参。
B: ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒(AAV-ECM1)或不表达基因的对照病毒(AAV-NC)。注射病毒4周后，处死小鼠，收集肝脏500mg裂解于1ml RIPA裂解液中，研磨裂解。用BCA定量后，用RIPA裂解液统一稀释为2ug/ml,加入Loading Buffer加热变性。上样时每个样品20ug/泳道。使用抗小鼠ECM1抗体检测。Actin的表达作为内参。
图10显示了腺相关病毒介导的ECM1表达使ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)免于死亡。其中，ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周，分为2组，每组10只。分别通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒(AAV-ECM1)或不表达基因的对照病毒(AAV-NC)。进行小鼠死亡率的观察和统计。
图11显示了腺相关病毒介导的ECM1表达抑制ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)的肝纤维化。其中，ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周，分为2组，每组10只。分别通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒(AAV-ECM1)或不表达基因的对照病毒(AAV-NC)。注射病毒4周后，处死小鼠取肝脏固定，脱水，包埋，切片。分别进行H&E；Masson染色和a-SMA免疫组化染色。
图12显示了腺相关病毒介导的ECM1表达抑制ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)的肝纤维化。其中，ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周，分为2组，每组10只。分别通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒(AAV-ECM1)或不表达基因的对照病毒(AAV-NC)。注射病毒4周后，处死小鼠取肝脏裂解，按照羟脯氨酸检测试剂盒处理样品及检测，最后用分光光度计在OD550波长处读值。
图13显示了腺相关病毒介导的sTGFBR2表达抑制ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)的肝纤维化。ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周，分为2组，每组10只。分别通过尾静脉注射sTGFBR2基因的2/8型腺相关病毒(AAV- sTGFBR2)或不表达基因的对照病毒(AAV-NC)。其中，
A:小鼠死亡率的观察和统计。
B:处死小鼠，收集肝脏500mg裂解于1ml RIPA裂解液中，研磨裂解。用BCA定量后，用RIPA裂解液统一稀释为2ug/ml,加入Loading Buffer加热变性。上样时每个样品20ug/泳道。使用抗小鼠smad3/p-smad3抗体检测。Actin的表达作为内参。
C: 处死小鼠取肝脏固定，脱水，包埋，切片。分别进行Masson染色和a-SMA免疫组化染色。
D: 处死小鼠取肝脏裂解，按照羟脯氨酸检测试剂盒处理样品及检测，最后用分光光度计在OD550波长处读值。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，肝脏或全身的 ECM1 基因表达水平降低后，会导致小鼠的肝纤维化或其相关疾病的进展增加。此外，本发明还首次建立了一种肝纤维化或其相关疾病动物模型，它是 ECM1基因被剔除或失活(包括部分失活)的小鼠或其他非人哺乳动物。本发明的动物模型是一种有效的肝纤维化或其相关疾病的动物模型，可用于研究肝纤维化或其相关疾病，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。在此基础上，本发明人完成了本发明。
基因及其蛋白
如本文所用，术语“ECM1”、“Extracellular Matrix Protein 1”、“胞外基质蛋白1”可互换使用。
应理解，术语“ECM1”还包括各种天然存在的ECM1基因的变异形式。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的ECM1蛋白的核苷酸序列，编码野生型ECM1蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于小鼠之外的其他哺乳动物时，该术语指ECM1基因在该哺乳动物中的同系物。例如对于人而言，该术语指人的ECM1 (已知小鼠ECM1基因与人类ECM1基因的cDNA同源度为76.6 %，氨基酸序列的同源度为73.4%，)。小鼠ECM1基因的登录号：NM_007899.3；小鼠ECM1蛋白的登录号：NP_031925.2，人的ECM1基因的登录号：NM_004425.3；人ECM1蛋白的登录号：NP_004416.2。
在本发明中，ECM1的缺乏会导致小鼠肝纤维化进展程度增加、 a-SMA阳性细胞的数量增加、羟脯氨酸的含量增加、肝纤维化的相关基因表达量增加、谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的含量略微增加、星状细胞HSC的激活程度增加、胶原蛋白含量增加。
 ECM1基因或其蛋白的失活剂或下调剂
在本发明中，所述ECM1的失活剂包括全部失活或部分失活。
本发明的ECM1蛋白的失活剂包括(a)抑制剂，所述抑制剂的例子包括(但并不限于)：小分子化合物、抗体、反义核酸、miRNA、siRNA、或其组合；和/或(b) ECM1基因的敲除剂。
在本发明中，所述失活剂或下调剂指将 ECM1基因或其蛋白的表达下降50%，较佳地，70%，更佳地，80%，更佳地，90%，更佳地，100%。
肝纤维化或其相关疾病
在本发明中，肝纤维化或其相关疾病包括(但不限于)：肝纤维化、肝硬化、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、病毒性肝炎。
基因失活
对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。
在本发明中，基因失活还包括将 ECM1基因或其蛋白的表达下降50%，较佳地，70%，更佳地，80%，更佳地，90%，更佳地，100%。
动物模型
在本发明中，提供了一种非常有效的肝纤维化或其相关疾病的非人哺乳动物模型。
在本发明中，非人哺乳动物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠。
如本文所用，术语“ECM1基因失活”包括一个或两个ECM1基因被失活的情况，即包括ECM1基因杂合地和纯合地失活。例如，ECM1基因失活的小鼠可以是杂合或纯合的小鼠。
在本发明中，可基因剔除或转入外源基因(或片段)而使ECM1基因失活等方法制备ECM1基因失活的非人哺乳动物(如小鼠)。在本领域中，通过基因剔除或转入外源基因而使靶基因失活的技术是已知的，这些常规技术都可用于本发明。
在本发明的另一优选例中，ECM1基因的失活是通过基因剔除实现的。
在本发明的另一优选例中，ECM1基因的失活是通过ECM1基因中插入外源基因(或片段)而实现的。
在本发明的一具体实例中，可构建一含有外源插入片段的构建物，该构建物含有与靶基因(ECM1)的插入位点的两侧的侧翼序列同源的同源臂，从而可以通过同源重组高频地将外源插入片段(或基因)插入至ECM1基因组序列(尤其是外显子区域)，造成小鼠ECM1基因的移码、提前终止、或敲除，从而导致ECM1基因缺失或失活。
用本发明方法获得的纯合或杂合的小鼠可育。失活的ECM1基因可以孟德尔规律遗传给后代小鼠。
在一优选例中，本发明提供了一种缺失ECM1基因的纯合小鼠模型动物。
候选药物或治疗剂
在本发明中，还提供了一种利用本发明的动物模型，筛选治疗肝纤维化或其相关疾病的候选药物或治疗剂的方法。
在本发明中，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、糖类、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。
药物筛选方法
本发明还提供了基于ECM1进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(增强)ECM1表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对患有肝纤维化或其相关疾病动物模型小鼠的治疗效果。
本发明提供的筛选预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病治疗剂的方法，基于该化合物对ECM1的表达量和/或活性的影响，一种典型的筛选方法包括步骤：
(a) 在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达 ECM1的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的 ECM1基因或其蛋白的表达水平E1；和/或ECM1蛋白的活性水平V1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的 ECM1基因或其蛋白的表达水平E2；和/或ECM1蛋白的活性水平V2；和
 (b) 将上一步骤所检测的E1、E2，和/或V1、V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂；
其中，如果E1显著高于E2；和/或V1显著高于V2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂。
在一优选实施方式中，所述方法包括步骤(c)，将步骤(b)中所确定的潜在治疗剂施用于本发明所述方法制备的非人哺乳动物模型，从而测定其对所述动物模型的肝纤维化或其相关疾病的治疗效果。
ECM1的表达水平可以在mRNA水平或蛋白水平进行，例如通过常规方法或市售的设备和试剂(如抗体、引物等)进行。
本发明的主要优点包括：
(1) 本发明首次发现ECM1对维持肝脏稳态具有重要作用，并且首次发现ECM1的缺乏会导致小鼠肝纤维化进展程度增加、a-SMA阳性细胞的数量增加、羟脯氨酸的含量增加、肝纤维化的相关基因表达量增加、谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的含量略微增加、星状细胞HSC的激活程度增加、胶原蛋白含量增加。
(2) 本发明首次构建一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病的动物模型，并可利用该模型有效筛选预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的治疗剂。
(3) 本发明通过对ECM1全身敲除小鼠进行详细的研究，首次发现其纤维化出现的模式与经典的肝纤维化模型不一致，是一种全新的，独特的自发肝纤维化模型。
(4) 本发明首次发现，胞外基质蛋白1(Extracellular Matrix Protein 1,ECM1)大量表达在肝脏的胞外基质中，全身敲除ECM1会导致小鼠出现自发的，严重的，致死性的肝纤维化。
(5) 本发明首次发现，ECM1蛋白通过与整合素αv分子(Integrin αv)相互作用，从而抑制HSC的活化和胶原蛋白的产生。
(6) 本发明首次发现，在ECM1基因敲除小鼠肝脏内重新表达ECM1基因也可以抑制肝纤维化的发生。
(7) 本发明首次发现，ECM1基因敲除小鼠可以自发的发生肝纤维化疾病，且是一种非常独特的肝纤维化小鼠模型，可以用于抗肝纤维化药物的筛选和验证。
 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
如无特别说明，实施例所用的所有材料和试剂均为市售产品。
 实验方法
构建ECM1基因敲除小鼠
利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：
① ． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。[1]
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3]
③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。[4,5]
④．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2 ～10-5 ，植物的概率为10－4 ～10－5 。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。其中应用最多的是PNS法。[6]
⑤．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。[2，3,7]
⑥．得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
 实施例1 ECM1基因表达减少促进肝纤维化发展
获自本实验室的ECM1全身基因敲除小鼠在繁殖培养过程中发现纯合子小鼠(ECM1-KO)在发育到6-8周龄大小时会出现自发死亡现象。主要表现为体型较正常对照小鼠(ECM1-WT)较小，皮下脂肪较少，腹部鼓胀疑似有腹水(图1)。因此我们对ECM1-KO小鼠进行了详细的病理诊断和研究，寻找ECM1-KO小鼠自发死亡的原因。
 实施例2 ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)出现自发性肝纤维化
将小鼠进行解剖后发现小鼠大部分器官发育正常，肉眼观察没有出现明显病变。但是小鼠腹腔内充满腹水，肝脏颜色变浅，质地变硬，表面变的凹凸不平(图2)。肝脏的变化及腹水的出现提示我们小鼠可能出现了严重的肝纤维化，甚至在后期进展为了肝硬化阶段。
为了进一步确认小鼠是否发生肝纤维化，对小鼠的肝脏进行的切片染色分析。我们收集了不同周龄的小鼠肝脏进行石蜡切片染色。H&E染色结果显示相比较同年龄的WT小鼠，ECM1-KO小鼠肝脏结构发生变化，肝实质细胞减少，组织中出现了大量被染成淡红色的物质沉积(图3 A)。因为肝纤维化过程中会在肝脏中沉积大量的胶原蛋白，为了进一步确定肝脏沉积的物质是否为胶原蛋白，我们对肝脏进行了Masson染色。 Masson染色可以特异性的将胶原蛋白染成蓝色。染色结果表明，ECM1-KO小鼠肝脏内沉积了大量的被染为蓝色的胶原蛋白。且这些胶原蛋白主要沉积在肝窦内，这种沉积方式与典型的CCL4造模的小鼠肝纤维化模型有明显区别(图3 B)。且这种胶原蛋白的沉积模式更容易诱发门脉高压和腹水生成。
肝纤维化发生的另外一个明显标志是肝脏内大量的静止期的HSC细胞(QuiescentHSC， qHSC)被激活为活化的HSC(Activated HSC， aHSC),它们可以大量的生成胶原蛋白，也被叫做成纤维细胞(MFs)。α-SMA是成纤维细胞的典型标志物之一。肝脏内aHSC的数量可以进一步反应出肝纤维化的进展情况。
对ECM1-WT小鼠和KO小鼠的肝脏切片做了α-SMA的免疫组化染色后，结果发现在WT小鼠中只有大血管的血管壁表现为α-SMA阳性。而在KO小鼠的肝脏切片中，在肝窦间隙内出现了大量的α-SMA阳性的细胞(图3 C)。并且随着小鼠年龄的增长，α-SMA阳性的细胞也大量增多，这和Masson染色结果的变化是一致的。
为了更进一步的确认ECM1-KO小鼠的肝脏的纤维化的发生，我们检测了肝脏内羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)的量。羟脯氨酸是亚氨基酸之一，是一种非必需氨基酸，也是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的13%。利用羟脯氨酸在胶原蛋白中含量最高这一特点，通过对肝脏内羟脯氨酸的测定，可了解肝脏内胶原蛋白代谢情况。利用羟脯氨酸检测试剂盒检测结果表明，ECM1-KO小鼠肝脏内羟脯氨酸的含量远大于WT小鼠，表明ECM1-KO小鼠肝脏内沉积着大量的胶原蛋白(图4A)。
检测肝脏内与纤维化发生的一些相关基因的表达情况也是肝纤维化诊断的一种公认方法。一般用来检测的基因为星状细胞激活相关基因(α-SMA， Desmin等)已经相关的胶原蛋白表达基因(Col1a1；Col1a3等)。我们将8周大小的ECM1-WT和KO小鼠的肝脏进行灌流，消化，密度梯度离心分选得到HSC。 TRIZO裂解，抽提mRNA，反转录得到cDNA，最后通过RT-PCR检测相关基因的表达。结果表明，相对于ECM1-WT小鼠，KO小鼠中肝纤维的相关基因表达量高出1000倍以上(图4 B)。
这些结果说明了ECM1-KO小鼠的肝脏在没有任何在外界刺激下，的确出现了自发的纤维化。
 实施例3 ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)肝功能分析
在初步确定了ECM1-KO小鼠的确出现了严重的自发纤维化后，我们进行了初步的文献检索与已有的基因敲除肝纤维化模型进行了对比。结果发现目前大部分的基因敲除小鼠依然需要外界的刺激或者诱导才能出现肝纤维化，如药物刺激(CCL4，TAA等)，饮食调节(高脂饮食，MCD饮食等)以及胆管结扎。只有极少的几种基因敲除小鼠可以在不需要外界刺激的情况下出现自发的肝纤维化，但是这些小鼠纤维化进展较慢，且和诱导小鼠模型相比有着类似的肝纤维化的进展模式，如大量的肝细胞死亡和炎性细胞激活。
为了进一步比较ECM1-KO小鼠这种自发的肝纤维化模型与经典的肝纤维化诱导模型的异同，收集了ECM1-KO小鼠和CCL4诱导肝纤维化模型小鼠的血清，进行肝功能检测(谷草转氨酶AST和谷丙转氨酶ALT)。这两个指标可以反映肝纤维化发展过程中肝细胞的死亡情况。
检测结果表明，ECM1-KO小鼠在8周龄，肝纤维化及其严重，已经出现腹水的情况下，AST和ALT的值也只是略高于WT小鼠，远低于CCL4诱导肝纤维化模型小鼠(图5 )。此结果提示可能ECM1-KO小鼠出现肝纤维化的原因和机制与经典的肝纤维化模型不一致。
 实施例4 ECM1蛋白通过与整合素αv作用抑制TGFβ1的活化和HSC的激活
通过对ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)和肝实质细胞(Hepatocyte)条件性敲除小鼠(Alb-cre/ ECM1 flox/ flox)的研究显示ECM1基因的敲除并没有像其他经典的纤维化模型那样对肝细胞损伤或者炎症有显著的影响。ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)和肝实质细胞(Hepatocyte)条件性敲除小鼠(Alb-cre/ ECM1 flox/ flox)都显示了肝窦内的星状细胞(HSC)发生了原位激活转化为活化的成纤维细胞。在星状细胞(HSC)活化的过程中，最重要也是最必须的一个因素是TGF-β1的刺激。星状细胞(HSC)必须要经过TGF-β1的刺激才能被激活转化为活化的成纤维细胞，在这个过程中如果抑制了TGF-β1的功能，星状细胞(HSC)的活化也会受到抑制。
TGF-β1在肝脏内可以有多种细胞合成。但是合成的TGF-β1在一开始是以非活性形式被分泌到细胞外，被称为Latent TGF-β1。Latent TGF-β1与LAP(latency-associatedpeptide)通过LTBP1(latent TGF-β1 binding protein 1)结合成为LLC(large latentcomplex),储存在胞外基质中。 Latent TGF-β1需要在细胞外被特定因子剪切并从LAP上分离后，才能成为有活性的TGF-β1，与TGF-β1受体相结合并激活下游信号通路。整合素分子(Integrins)主要组成型的表达于许多种细胞表面。它们是一个由α亚基和β亚基所组成的异源二聚体受体分子家族。到目前为止，整合素家族一共发现有24个亚基，其中18个α 亚基和6个β亚基。在整合素家族分子中，有五个整合素类分子含有αν亚基(αvβ1, αvβ3, αvβ5,αvβ6,和αvβ8)，这五个含有αν亚基的整合素分子可以与TGF-β1前体复合物中LAP上的RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽序列相互结合，这种结合对前体TGF-β1在生理条件下的成熟活化非常重要。随后的研究发现，αv整合素在TGF-β1的活化过程中是必需的，αv整合素的缺失或TGF-β1上αv整合素结合位点的突变都会使体内的TGF-β1前体无法成熟活化产生有生物活性的TGF-β1，造成体内TGF-β1信号通路缺失。
 4.1 ECM1蛋白与整合素αV(Integrin αV)相互作用
通过对小鼠肝脏的切片做原位的荧光染色来确定ECM1蛋白与整合素αV是否有相互作用。免疫荧光染色结果表明，小鼠肝脏内ECM1蛋白与整合素αV在肝窦内都表达为强阳性，红色荧光可以和绿色荧光叠加为黄色荧光信号。说明ECM1蛋白与整合素αV在小鼠肝脏内由相互作用（图6）。
 4.2 ECM1蛋白抑制TGF-β1的活化和小鼠星状细胞HSC的激活
Latent TGF-β1激活为TGF-β1的过程是一种瞬时的作用。激活的TGF-β1会与邻近细胞表面的TGF-β1受体结合，使下游的SMAD蛋白发生磷酸化，然后激活下游基因表达。为了更好的检测Latent TGF-β1激活为TGF-β1的过程，我们使用了一种共培养体系用来检测发生在星状细胞HSC表面的TGFβ1β1激活过程。NIH-3T3细胞稳转了一个荧光素酶报告基因。在这个报告基因上游包含4个重复SMAD结合位点。因此一旦有Latent TGF-β1被激活为有活性的TGF-β1，其会结合到NIH-3T3细胞表面的受体上，激活NIH-3T3细胞下游的SMAD信号通路，诱导荧光素酶报告基因表达。通过检测NIH-3T3细胞内的荧光素酶的活性就可以反映出在这个共培养体系中有多少Latent TGF-β1被激活为有活性的TGF-β1。
首先分离野生型小鼠(WT)肝脏原代的星状细胞(HSC)，与含有TGF-β1活性报告系统的NIH-3T3细胞共同培养。培液中加入重组的小鼠ECM1蛋白(50μg/ml)，cRGD(10μg/ml)或无关的IgG蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(NC)。培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(Luciferase)活性。实验结果表明，重组的小鼠ECM1蛋白可以显著的抑制星状细胞(HSC)表面Latent TGF-β1的活化(图7 A)。这个体系中我们加入了一个经典的整合素αv的抑制剂cRGD作为阳性对照。
小鼠肝脏原代的星状细胞(HSC)在体外培养的过程中会发生自激活。这是因为培养条件的改变，细胞分泌的Latent TGF-β1会被细胞表面的整合素αv活化从而活化了星状细胞(HSC)，在这个过程中加入整合素αv的抑制剂(cRGD)或者TGF-β1的中和抗体都会抑制星状细胞(HSC)的自激活。
因此分离野生型小鼠(WT)肝脏原代的星状细胞(HSC)，体外培养2个星期。培液中加入重组的小鼠ECM1蛋白(50μg/ml)，cRGD(10μg/ml)或无关的IgG蛋白(50μg/ml)作为阴性对照(NC)。每3天更换一次新鲜培液。2个星期后 用TRIZO裂解，抽提mRNA，反转录得到cDNA，最后通过RT-PCR检测相关基因的表达来确定原代的星状细胞(HSC)的活化程度。实验结果显示重组的小鼠ECM1蛋白和cRGD都显著的抑制了星状细胞(HSC)的活化(图7B)。
这些实验结果表明，ECM1蛋白有着和cRGD类似的功能，可以通过与整合素αv的相互作用抑制胞外基质中的Latent TGF-β1会被细胞表面的整合素αv活化为TGF-β1从而激活肝窦内的星状细胞(HSC)转化为活化的成纤维细胞。
4.3 ECM1敲除小鼠(ECM1-KO)肝脏中TGF-β1过度活化
为了更进一步确认ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)的肝纤维化发病机制，我们对其肝脏内的TGF-β信号通路进行了详细的检测。
首先分离野生型小鼠(WT)和ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏原代的星状细胞(HSC)，与含有TGF-β1活性报告系统的NIH-3T3细胞共同培养。共培养16小时后裂解细胞，检测裂解液中的荧光素酶(Luciferase)活性。实验结果表明，来源于ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏原代的星状细胞(HSC)可以产生更多的TGF-β1。这说明了ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏内星状细胞(HSC)具有更强的产生胶原蛋白的能力，已经是一种非常活化的星状细胞(HSC)了(图8A)。
为了确定ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏内强烈的TGF-β1信号是来源于TGF-β1基因的过度表达，还是Latent TGF-β1的过度激活，我们将ECM1-WT和KO小鼠在8周龄处死，取肝脏TRIZO裂解，抽提mRNA，反转录得到cDNA，最后通过RT-PCR检测TGF-β1 mRNA的表达。实验结果表明ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏内TGF-β1基因表达相对于ECM1-WT小鼠没有显著差异(图8B)。
同时我们也分离野生型小鼠(WT)和ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏原代的星状细胞(HSC)，裂解于RIPA裂解液中。用BCA定量后，用RIPA裂解液统一稀释为2ug/ml,加入LoadingBuffer加热变性。上样时每个样品20ug/泳道。使用抗磷酸化SMAD3(Phosphorylated-SMAD3, p-SMAD3)抗体，SMAD3抗体和抗Actin抗体进行检测。实验结果显示ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏内的SMAD3的磷酸化显著增强(图8 C)。
这些实验结果表明ECM1蛋白可以通过抑制胞外基质中的Latent TGF-β1激活为TGF-β1。同时也可以通过这条信号通路抑制星状细胞(HSC)的活化和胶原蛋白的产生。
 实施例5 腺相关病毒介导的ECM1表达抑制ECM1-KO小鼠的肝纤维化
ECM1基因作为一种肝实质细胞内组成表达的基因，在肝纤维化过程中表达被下调，从而促进了肝纤维化的发展。发明人进一步做了将ECM1基因在肝实质细胞中重新表达，是否可以抑制肝纤维化的发展的研究。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV) 属于微小病毒科。无被膜且具有二十面体结构。遗传基因为一条大小约 4.7kb的线性单链 DNA 分子，其两端为反向重复序列ITR，每个 ITR大小为 145bp，两个 ITR 中间的两个开放读码框架(ORF)分别为 Rep、Cap，其中 Rep 编码 4 种蛋白，Cap 编码 3 种蛋白质衣壳。重组腺相关病毒中 Rep 基因和Cap基因的敲除，同时在ITR 之间装载目的基因，形成病毒质粒载体。随后与携带腺病毒辅助基因的质粒载体和携带具有复制功能的 Rep基因和具有转染功能的 Cap 基因 AVV 质粒载体，共同转染到同一细胞系中，形成具有转染能力的重组腺相关病毒。AVV 分为 AVV1～AVV13 13 个血清型，AVV 都具有二十面体的结构，但由于不同血清型存在分子序列及空间构型的差异，不同血清型 AVV 转染嗜亲性也不同，研究表明，AVV8 对肝细胞具有较强的嗜亲性。因此，可以选择 AVV8 重组腺相关病毒特异性感染肝实质细胞的载体将ECM1基因在肝脏内进行过表达。
 实施例6 腺相关病毒介导的ECM1-KO小鼠肝脏中ECM1基因重表达
因为AVV8 重组腺相关病毒介导的基因表达在感染后需要1-2周的时间才能达到表达高峰，且ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周以后才开始出现明显的肝纤维化症状。所以我们交配得到的ECM1全身敲除小鼠(ECM1-KO)在出生后第4周，分为2组分别通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的8型腺相关病毒(AAV-ECM1)或不表达基因的对照病毒(AAV-NC)。注射病毒4周后，处死小鼠，收集肝脏，检测ECM1基因在小鼠肝脏内的表达情况。
实验结果表明，在注射重组腺相关病毒AVV8 4周后，AAV-ECM1组的肝脏可以检测到非常强的ECM1基因mRNA转录和蛋白表达，而阴性对照组检测不到ECM1基因的表达(图9，A和B)。
 实施例7 腺相关病毒介导的ECM1表达使ECM1-KO小鼠免于死亡
因为ECM1全身敲除小鼠（ECM1-KO）会在出生后6-8的时间内会因为严重的肝纤维化导致的腹水和并发症死亡，所以我们想观察一下AVV8 重组腺相关病毒介导的ECM1基因重表达后，是否可以拯救小鼠。
我们将ECM1全身敲除小鼠（ECM1-KO）在出生后第4周，分为2组，每组10只。分别通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）或不表达基因的对照病毒（AAV-NC）。进行小鼠死亡率的观察和统计。实验结果表明注射了不表达基因的对照病毒（AAV-NC）组的ECM1全身敲除小鼠（ECM1-KO）和以前观察到的小鼠一样会在出生后6-8的时间内会因为严重的肝纤维化导致的腹水和并发症死亡。而注射了表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）的小鼠全部存活了下来（图10）。
 实施例8 腺相关病毒介导的ECM1表达抑制ECM1-KO小鼠的肝纤维化
同时ECM1全身敲除小鼠（ECM1-KO）在出生后第4周，分为2组，分别通过尾静脉注射1x1011表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）或不表达基因的对照病毒（AAV-NC）。注射病毒4周后，处死小鼠取肝脏固定，脱水，包埋，切片。分别进行H&E；Masson染色和α-SMA免疫组化染色。
H&E染色实验结果表明，注射了不表达基因的对照病毒（AAV-NC）组的ECM1全身敲除小鼠（ECM1-KO）肝脏结构发生变化，肝实质细胞减少，组织中出现了大量被染成淡红色的物质沉积，而注射了表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）的小鼠肝脏结构表现和和正常小鼠类似。Masson染色结果表明，注射了表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）的小鼠肝脏蓝色的胶原蛋白含量大为减少。同样的，而在注射了表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）的小鼠肝脏切片中，在肝窦间隙内出现了大量的α-SMA阳性的细胞。而注射了表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）的小鼠肝脏结构表现和和正常小鼠类似，只有大血管的血管壁表现为a-SMA阳性（图11）。利用羟脯氨酸检测试剂盒检测结果表明，注射了表达ECM1基因的2/8型腺相关病毒（AAV-ECM1）的小鼠肝脏内羟脯氨酸的含量远小于于（AAV-NC）组小鼠（图12）。
这些实验结果表明用2/8型腺相关病毒介导ECM1基因在肝脏内重表达可以保护ECM1全身敲除小鼠（ECM1-KO）肝脏不再自发的出现纤维化。上述这些实验结果说明ECM1蛋白在小鼠体内同样可以抑制星状细胞的激活和肝纤维化的产生。同时也说明了ECM1全身敲除小鼠（ECM1-KO）中，肝脏严重的纤维化及其带来的并发症是ECM1-KO小鼠最重要的死亡原因。
 实施例9 阻断ECM1-KO小鼠肝脏内的TGF-β1信号通路可以抑制ECM1-KO小鼠的肝纤维化
sTGFBR2是TGF-β1受体的细胞外可溶性片段，已被验证可以用于体内与TGF-β1结合，抑制TGF-β1的活性和功能。本发明中将sTGFBR2基因在肝实质细胞中重新表达，可以抑制肝纤维化的发展。再次证明了阻断ECM1-KO小鼠肝脏内的TGF-β1信号通路可以抑制ECM1-KO小鼠的肝纤维化（图13）。
讨论
上述的实验结果表明，ECM1蛋白可以通过抑制胞外基质中的Latent TGF-β1激活为TGF-β1。因此肝脏胞外基质内的ECM1蛋白可以抑制星状细胞(HSC)的活化和胶原蛋白的产生。
因此在ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏内因为大量的Latent TGF-β1活化为TGF-β1，沉默的星状细胞被活化为了表达大量胶原蛋白的成纤维细胞，使得ECM1全身敲除小鼠(KO)肝脏自发的出现了肝纤维化。而在ECM1杂合子小鼠(ECM1-Het)和ECM1肝实质细胞特异性敲除小鼠(Alb-cre/ECM1 flox/ flox)中，因为肝脏胞外基质内的ECM1蛋白含量更低，所以相对于ECM1野生型小鼠会肝纤维化的进展速度会加快。而在正常的小鼠被肝纤维化造模的时候，因为外界的致病因素损伤了肝实质细胞(Hepatocyte)，使得肝实质细胞(Hepatocyte)产生ECM1蛋白的能力减弱，肝脏胞外基质内的ECM1蛋白减少，从而更进一步的促进了肝脏内Latent TGF-β1的活化和纤维化的进展。
ECM1基因作为一种肝脏内组成表达的基因，在肝纤维化过程中表达被下调，从而促进了肝纤维化的发展。
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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的ECM1基因失活，得到ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞；和
(b) 利用步骤(a)中得到的ECM1基因失活的细胞，制备得到ECM1基因失活的肝纤维化或其相关疾病动物模型。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝纤维化或其相关疾病动物模型为非诱导型自发肝纤维化或其相关疾病的动物模型。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的ECM1基因失活是肝脏特异性或全身性的ECM1基因失活。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中得到的ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：
(t1) 肝纤维化进展程度增加；
(t2) a-SMA阳性细胞的数量增加；
(t3) 羟脯氨酸的含量增加；
(t4) 肝纤维化的相关基因表达量增加；
(t5) 谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的含量略微增加；
(t6) 星状细胞HSC的激活程度增加；
(t7) 胶原蛋白含量增加。
5.一种权利要求1所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，该模型用作研究肝纤维化或其相关疾病的动物模型。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肝纤维化或其相关疾病选自下组：肝纤维化、肝硬化、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、病毒性肝炎、或其组合。
7.一种权利要求1所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，用于筛选或鉴定可减轻或治疗肝纤维化或其相关疾病的物质。
8.一种筛选或确定预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a) 在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达ECM1的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的ECM1基因或其蛋白的表达水平E1；和/或ECM1蛋白的活性水平V1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的ECM1基因或其蛋白的表达水平E2；和/或ECM1蛋白的活性水平V2；和
 (b) 将上一步骤所检测的E1、E2，和/或V1、V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂；
其中，如果E1显著高于E2；和/或V1显著高于V2，则表示所述测试化合物是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂。
9.一种筛选或确定预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a) 在测试组中，在测试化合物存在的条件下，将测试化合物施用于权利要求1所述方法制备的非人哺乳动物模型，检测测试组中所述动物模型的肝纤维化的严重程度Q1；并且在不施用所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组中所述动物模型的肝纤维化的严重程度Q2；和
(b)将上一步骤所检测的严重程度Q1和严重程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂；
其中，如果严重程度Q1显著低于严重程度Q2时，则表示所述测试化合物为预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的检测肝纤维化严重程度包括检测选自下组的一个或多个指标的变化：活化的HSC的数量、a-SMA阳性细胞的数量、羟脯氨酸的含量、谷丙转氨酶的含量、谷草转氨酶的含量、肝脏内胶原蛋白含量、肝脏内胶原纤维含量。
11.一种细胞的用途，其特征在于，所述细胞中的ECM1基因失活或下调，用于制备构建非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的生物制剂。
12.一种ECM1基因或其蛋白失活剂或下调剂的用途，其特征在于，用于制备构建非人哺乳动物肝纤维化或其相关疾病动物模型的制剂。
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Application publication date: 20200515

Assignee: Yingchuang Intelligence (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: Center for excellence and innovation of molecular cell science, Chinese Academy of Sciences

Contract record no.: X2024980001852

Denomination of invention: Application of ECM1 gene knockout mice in screening anti liver fibrosis drugs

Granted publication date: 20230502

License type: Exclusive License

Record date: 20240202