CN105358095A - 不用结肠切除术治疗炎性肠病的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于治疗患病或损伤的组织如炎性肠病，例如，溃疡性结肠炎的方法和组合物，包括使用刺激干细胞迁移至损伤的组织的干细胞或组织移植物使组织再生。所述组织移植物可以是细胞外基质(ECM)材料，例如，组织特异性细胞外基质(TS-ECM)。该方法还可以包括在放置移植物之前，切除损伤或患病的组织的粘膜。

Description

不用结肠切除术治疗炎性肠病的方法和组合物

背景技术

炎性肠病(IBD)由两种独立的疾病：克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)组成，其影响833,000名美国人。

尽管CD可以出现在沿着消化道(从口至肛门)的任何地方，并且通常影响消化道壁的整个厚度，但是UC局限于结肠和直肠并且仅影响壁的粘膜(内层)。

医学治疗包括使用可能具有严重副作用的抗炎药，该医学治疗可能不能治疗UC的症状，并且当患者对于所有其他医学治疗难治时，完全移除结肠(结肠切除术)是唯一已知的用于UC的“治愈疗法”。结肠切除术是众所周知且主要的外科手术，通常需要回肠切口以利于废物移除。

需要治疗和治愈IBD(包括UC)的第一线治疗(具有潜在地有害副作用的药物治疗)和第二线治疗(结肠切除术)的替换方案。

向最小化侵入性外科程序的趋势已经促进开发了用于组织再生的人工支架。纯化的胶原、明胶、自体脂肪、透明质酸和合成材料临床上已经被用作在用于治疗尿失禁、反流病、喉病理学和新生心肌细胞的再生医学中的可注射支架。但是，过度纯化的、化学修饰的或合成的材料可能导致通过宿主的不利免疫应答，并且限制细胞迁移至基质。

天然存在的细胞外基质(ECM)衍生的支架具有许多生物活性特性，并且已经用于修复各种组织，包括下尿路结构、食道、心脏组织和肌腱结构。但是，许多这些支架源自非人组织，都没有描述用于下肠道组织如结肠组织的治疗或再生，并且不能特异性治疗UC。

发明内容

本发明涉及通过替换患病或损伤的粘膜组织而不用结肠切除术来治疗UC的新型组织移植物和方法。

在一个实施方式中，本发明的方法包括通过下述步骤治疗损伤或患病的下肠道组织：(1)任选地对患病或损伤的结肠的粘膜内层进行粘膜切除术；以及(2)用干细胞或祖细胞接种结肠的粘膜内层、或刺激干细胞和祖细胞迁移至患者的患病或损伤的结肠组织，所述患者具有结肠的粘膜内层的疾病或损伤的症状或遭受结肠的粘膜内层的疾病或损伤。结肠的粘膜内层的疾病可以是炎性肠病(IBD)，并且所述方法可以用于治疗、改善或治愈IBD。

因此，本发明可以包括例如通过将干细胞或祖细胞直接递送至损伤或患病的结肠组织来接种干细胞或祖细胞，其中将干细胞或祖细胞制备为流体组合物如溶液、悬浮液或凝胶，用于通过注射或注入结肠的内腔来递送至结肠组织，使得干细胞或祖细胞接触结肠的腔壁且至少临时存在于结肠的腔壁上，以便引发或刺激结肠的粘膜内层的重建组织重构。因此，本发明的方法可以实现用新鲜的、健康的结肠组织替换损伤或患病的结肠组织。

可选地，干细胞或祖细胞可以通过将细胞外基质(ECM)组合物，例如，ECM移植物或支架，以固体(片材或管材)或流体(溶液、悬浮液或凝胶)的形式引入至结肠腔壁或与结肠腔壁接触，来刺激损伤或患病的结肠组织的位点。

在本发明的另一实施方式中，干细胞或祖细胞可以引入至固体或流体ECM组合物，并且包括干细胞或祖细胞的ECM组合物可以通过适于如本文所描述的组合物的递送方式，递送至结肠的粘膜内层。例如，固体ECM可以内窥镜植入到结肠内层上，或者流体ECM可以注入、注射或喷射至所述结肠。

一旦接种或迁移至损伤的结肠组织的位点，干细胞或祖细胞原位特异化、发育、且替换结肠的粘膜内层。所述方法可进一步包括一个或多个另外的步骤：(3)产生回肠切口；和(4)通过绕过消化道静脉内喂养患者，为患者提供完全肠胃外营养(TPN)，同时新的粘膜形成且替换患病的粘膜内层。

当用作本发明方法的一部分时，可通过组织切除或消融进行粘膜切除步骤，该步骤在植入、移植或施用移植物之前，移除患病或损伤的组织。

切除或消融方法包括内窥镜或外科粘膜切除(切除)、内窥镜激光疗法、光动力学疗法、使用氩等离子体凝固的内窥镜热凝固术、射频消融、冷冻消融，或使用EDTA或其他消融剂如生理盐水，优选地是加热的。这些粘膜切除术程序详细记载在现有技术中。任何一个或多个上述技术或程序可用于使用切除或消融步骤的本发明方法中。

本发明进一步包括使用源自与被治疗的组织相同的组织的组织移植物如细胞外基质(ECM)支架，治疗疾病或创伤损伤的组织的方法和组合物。包括源自与待治疗组织相同的组织的ECM组织移植物，本文称为“组织特异性细胞外基质”(TS-ECM)。

优选的TS-ECM不仅源自相同类型的组织(即，对于结肠组织治疗，源自结肠的ECM)，但是也源自如与部治疗物种相同的物种。例如，人中UC的治疗将采用人结肠粘膜组织作为TS-ECM支架组合物。组织移植物可以是同种异体移植物或异种移植物。刺激和信息的相互交换(本领域已知且称为“动态相互作用”)可以出现在ECM和细胞之间，提供使用ECM移植物的优势。可以通过使用TS-ECM移植物来促进或改善该动态相互作用。

因此，本发明包括但不限于源自大肠组织用于替换患病或损伤的大肠组织的组织移植组合物。源自大肠组织的ECM可以是结肠组织，优选地包括结肠粘膜，治疗的大肠组织可以是结肠组织，还优选地是结肠粘膜。

在一个实施方式中，组织移植组合物可以是形成为固体片材或管材的ECM支架，其可放置或固定在结肠粘膜上。如本领域认识到的，固体片材或管材支架可以通过机械或外科手段，植入或移植或附加、施加或附着在患者中所以期望的位点，所述机械或外科手段包括但不限于缝合、钉住、支架或夹子；或可以通过接受的粘合剂如药学上可接受或治疗上接受的粘合剂，包括生物粘合剂，附着至粘膜。将ECM组合物递送至结肠的一个优选的程序可以采用内窥镜，其可有利地使侵入性外科程序最小化。

可选地，ECM可以被粉末化或消化，并且溶解或悬浮，用于以流体如凝胶、溶液或悬浮液的形式呈现。流体组合物可以有利地通过将凝胶、溶液或悬浮液注射、注入、喷射等施用至待治疗的位点。例如，可以通过注射、注入或喷射至结肠的内腔来施用或施加流化的ECM，例如，作为灌肠疗法由此流体ECM覆盖结肠的粘膜内层，或在切除粘膜的结肠情况下，覆盖暴露的结肠内腔壁。这样的施用可以重复数次，包括一天一次或多次，持续数天、数周或数月，多达约一年，如所期望的，根据治疗医生监测有活力或健康的组织可接受的再生长或替换来决定。

流化的ECM可喷射的凝胶、溶液或悬浮液的一个优选的实施方式是使组合物雾化用于通过喷射施用。雾化的喷雾可以从来源存储区通过制造或改良的内窥镜中提供或配备的套管或其他导管泵送，以将这样流化的ECM递送至所期望的位点或区域。

有利地，已知干细胞或祖细胞迁移至ECM放置的位点或施用，并且随着时间的推移，可以用具有那些细胞或组织的正常特性和功能的健康或非炎症细胞和组织替换所述组织。因此，本发明的组合物的可选实施方式包括单独固体ECM管材或片材支架；用干细胞或祖细胞包被或嵌入的固体ECM支架；单独流化的ECM(例如，凝胶)；或包括流化的ECM的固体ECM支架，其中有或没有干细胞或祖细胞包被、嵌入固体或流体ECM或与固体或流体ECM混合。

还应当理解的是，ECM组合物可以是混合的，部分源自天然组织，以及混合的或结合合成的或天然聚合物。但是，优选地但不是必须的，用于本发明的ECM组合物的生物可降解的聚合物包括合成或天然的聚合物。

在本发明的另一实施方式中，例如，固体片材或管材ECM组合物，可以通过使用三维(3-D)打印机技术来形成或产生。

所述组合物可以进一步包括为ECM实现特定期望的性质的添加剂。例如，ECM组合物可以包括一个或多个药物或生物制剂如抗生素、抗炎药、免疫抑制剂、单克隆抗体、生长因子等，为添加的药物或生物制剂提供所期望的活性。这些添加剂可以使得局部环境有助于有利的组织重构。所述组合物的其他添加剂可以包括，例如，粘度增强剂，或可启动凝胶形成的试剂。本领域大体上可接受的是，更高粘度的凝胶可提供改善的凝胶粘合特性。因此，该粘度增强剂也可以用作增加粘合。粘合促进剂是本领域熟知的，但是可进一步包括血液组分如血液凝血剂或血液凝血因子作为粘度增强剂或粘合增强剂。

作为本发明的一部分，还包括的是不用在先切除或消融，使用如本文所描述的ECM移植物或支架治疗患病或损伤的结肠组织的方法。例如，在组织的疾病或损伤产生损害，例如，组织暴露的表面或出血表面的情况下，在植入、移植、施加或施用ECM支架或移植组合物之前，可以省略切除组织。因此，所述方法的一个实施方式包括下述步骤：

a)使用选自下述的组织制备ECM支架、移植物或组合物：肠道、生殖器、皮肤、胰腺、肾、循环组织和呼吸组织；以及

b)将ECM移植物或支架组合物植入、移植、施加或施用在遭受疾病或病况的患者的组织，所述疾病或病况影响遭受影响肠道组织的疾病、损伤或病况的患者的下肠道组织，其中肠道组织在植入、移植，施加或施用ECM组合物之前没有进行切除或消融。

在优选的实施方式中，该方法包括治疗显示出IBD的损伤或患病的结肠组织如溃疡性结肠炎或克罗恩病；家族性腺瘤性息肉病；赫希施普龙氏病(Hirschsprungs)；狭窄；直肠炎；结肠癌；或瘘管，更优选为治疗结肠粘膜组织的疾病或损伤。

本发明的另一实施方式是在有或没有在先的切除或消融的情况下，使用如本文所描述的组织特异性ECM(TS-ECM)支架治疗患病或损伤的组织的方法。因此，所述方法的一个实施方式包括下述步骤：

a.任选地对损伤或患病的组织进行粘膜切除；

b.使用选自下述的组织制备TS-ECM移植物或支架组合物：肠道、生殖器(除了阴道)、皮肤、胰腺、肾、循环组织和呼吸组织；以及

c.将TS-ECM支架或组合物植入、移植或施用至患者中的组织，所述患者遭受影响相同的肠道、生殖器(除了阴道)、皮肤、胰腺、肾、循环组织和呼吸组织的疾病或病况。

将会理解的是，本发明的ECM或TS-ECM移植物、支架或组合物可以是可分散干细胞或ECM凝胶、溶液或悬浮液的生物相容的多孔、大孔或微孔基质。另外，本发明的ECM或TS-ECM可以是凝胶状的。

本领域中描述了制备用作细胞生长基质的管材、片材和凝胶化、溶解的ECM组合物或用作移植物的支架的方法。凝胶ECM组合物可在植入或施用至患者之前以组合物原位凝胶的凝胶化之前的未凝胶形式被模制。例如，美国专利号8,361,503描述了形成ECM移植物的这些和其他方法，通过参考将该专利整体引入。

在优选的实施方式中，根据如描述的一个或多个方法制备凝胶ECM组合物。例如，可通过下述方法制备凝胶ECM，所述方法包括：

i)粉碎ECM，

ii)通过用在酸性溶液中的酸蛋白酶消化以产生消化液，来溶解完整的、非透析或非交联的ECM，

iii)调整消化液的pH至在7.2和7.8之间的pH值以产生中性消化液，以

及

iv)使溶液在大于25℃的温度下胶凝。

在制备ECM移植物或支架组合物的方法的另一实施方式中，进一步包括超声该支架。本发明的进一步方法包括将TS-ECM支架附着至患者的组织，其中所述支架的表面包括凝胶溶解的ECM，其用患者的细胞如干细胞嵌入或包被，其中在将支架植入、移植或施用至所述组织之前，所述嵌入或包被的细胞允许足够的时间使患者的细胞生长成支架。

在进行本发明的方法中，如本文所描述的方法或制备ECM的其他已知方法来制备支架或移植物，然后植入、移植或施用至少一部分患病或损伤的组织，并且允许保持与患病的或损伤的组织接触足够的时间，从而替换细胞生长且替换患病或损伤的细胞。足够的时间可以是一天至约六个月。

有利地，植入、移植或施用ECM移植物提供了用于将干细胞迁移至植入、移植或施用ECM移植物的位点的刺激。例如，在治疗UC时，ECM移植物被植入、移植或施用使其与至少一部分结肠接触，其中患病或损伤的结肠粘膜已经(在粘膜切除术后的情况下)或将(在未进行粘膜切除术的情况下)保持与粘膜接触一段时间，以允许结肠粘膜细胞的生长和替换，导致用健康的细胞替换患病或损伤的细胞。ECM移植物可以提供为相对短的固体区段，大约1-10厘米，其同时或顺序植入、移植或施用至结肠的内壁。可选地，可以制备具有对应整个结肠的多个片段或长度的ECM移植物。

附图说明

图1显示如本文所描述的从用小肠道粘膜下层细胞外基质(SIS-ECM)治疗的狗中移除的结肠片段(下图)的结果；显微照片(上图A-D)显示沿着结肠片段的远端→近端梯度显微镜细胞检查，且图解了沿着梯度增加的粘膜覆盖率3，即：在远端吻合看到不完整的粘膜覆盖(A)，朝近端出现逐渐增加的粘膜覆盖(B)、(C)和(D)。

具体实施方式

本发明涉及通过替换或刺激患病或损伤的粘膜细胞和组织的替换而不用结肠切除术来治疗炎性肠病(IBD)，例如，溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)等。

在一个实施方式中，本发明的方法包括通过下述步骤治疗损伤或患病的下肠道组织：(1)任选地对患病或损伤的结肠的粘膜内层进行粘膜切除；以及(2)用干细胞或祖细胞接种结肠的粘膜内层，或刺激干细胞和祖细胞迁移至具有结肠的粘膜内层的疾病或损伤的症状、或遭受结肠的粘膜内层的疾病或损伤的患者中的患病或损伤的结肠组织。结肠的粘膜内层的疾病可以是炎性肠病(IBD)，该方法可以用于治疗、改善或治愈IBD。

因此，本发明可以包括通过将干细胞或祖细胞直接递送至损伤或患病的结肠组织来接种干细胞或祖细胞，其中干细胞或祖细胞制备为流体组合物如溶液、悬浮液或凝胶，用于通过注射或注入结肠的内腔递送至结肠组织，从而干细胞或祖细胞与结肠的腔壁接触且至少临时存在于结肠的腔壁，以便启动或刺激结肠的粘膜内层的重建组织重构。因此，本发明方法可以实现用新的健康结肠组织替换损伤或患病的结肠组织。

可选地，干细胞或祖细胞可以通过将细胞外基质(ECM)组合物，例如，ECM移植物或支架，以固体(片材或管材)或流体(溶液、悬浮液或凝胶)的形式引入或接触结肠腔壁，从而刺激损伤或患病的结肠组织的位点。

在本发明的另一实施方式中，干细胞或祖细胞可以并入固体或流体ECM组合物，包括干细胞或祖细胞的ECM组合物可以通过适于如本文所描述组合物的递送方式递送自至结肠的粘膜内层。例如，固体ECM可以以内窥镜方式植入结肠内层，或流体ECM可以注入、注射或喷射至结肠。

通过设计，ECM快速原位降解并且促进炎症响应，包括将巨噬细胞迁移至位点。ECM的一个独特的特征是促进这些巨噬细胞的表型从M1型(促炎症，例如，在遭受UC的患者中可见)转换至M2型(促组织重构，例如，在没有经历促炎症病况的人中)。该M1至M2表型转换的重要的分支是使得可能有炎症倾向的组织仍保持健康。

可使用任何通常接受的方法如组织切除或消融法，在植入、移植或施用移植物之前，进行以移除患病或损伤的组织(例如，结肠粘膜组织)的任选粘膜切除术步骤。已知的切除或消融方法包括内窥镜或外科粘膜切除(切除)、内窥镜激光疗法、光动力学疗法、使用氩等离子体凝固的内窥镜热凝固法、冷冻治疗、使用EDTA或其他消融剂如加热的或“热”生理盐水或其他水溶液的射频消融或消除。

通过已知方法如在位点注射干细胞，可以进行用干细胞或祖细胞接种切除粘膜的组织，如在医学文献中描述。参见例如以下文献：Lanzoni，G.，Inflammatoryboweldisease：Movingtowardastemcell-basedtherapy，WorldJGastroenterol.14(29)：4616-4626(2008年8月7日)，其总结了使用造血干细胞和间质干细胞治疗IBD，但是没有教导或暗示先前的粘膜切除术。

优选地，通过在位点放置和/或固定(例如，植入、移植或施用)以ECM支架或移植物形式的细胞外基质(ECM)材料或组合物，可以将干细胞引入切除粘膜的组织。将ECM组合物引入切除粘膜的位点可以是固体片材或管材的形式，或可以为流体的形式如溶液、悬浮液或凝胶。固体ECM材料的放置或固定可以通过缝合、夹子、钉住、胶合或熟知的其他固定方式来进行。

可选地，可以通过通常采用的流体施用或递送方法如注射、注入或浸泡(“喷出”在位点上)或通过将流体喷射在位点上而施用流化的ECM。优选的喷射技术是，使用例如以内窥镜方式递送雾化的ECM流体来进行。

如本文所使用的，当提及ECM时，术语“组合物”、“材料”、“支架”和“移植物”可以交换使用，并且意味着具体的构造如为固体、液体、流体或其他形式。例如，“ECM支架”可以是固体或流体形式。

优选地，流化的ECM组合物形成为凝胶，使得其具有粘性特性，并且具有足够的粘度从而流体自粘附至身体内所期望的区域。在优选的实施方式中，流化的ECM是当施加或施用时具有相对非粘性液体特性的水凝胶，在施用或施加位点接触身体时，或在施用或施加位点接触身体后不久有利地变稠或更加有粘性，形成粘合剂凝胶。可以通过升高温度，例如，施用之后身体加热来启动凝胶化。流体ECM也可以与分开的粘性试剂如水凝胶或其他通常已知的凝胶剂混合，以提供足够的粘度。可选地，可以施用两种流体，由此至少一种流体包含ECM材料，其中两种流体在彼此接触或混合时进行胶凝。

非常确定的是，当存在足够的组织形成血管时，ECM组合物可使得干细胞迁移至位点，并且血管提供足够的导管用于细胞迁移至位点。另外，ECM与相邻的或下面的组织经化学信号传导通讯，相邻的或下面的组织与ECM通过称为“动态相互作用”的现象通讯，其优化使用ECM时的细胞和组织替换或再生。因此，ECM组合物可以用作固体、液体或凝胶支架以用于细胞和组织在放置、施用或施加的位点处生长。

在进一步的实施方式中，ECM衍生的组合物可以是组织移植物，由此ECM组合物用作促进组织在植入位点新的生长的支架。该支架可以是放置在所期望的位点的ECM管材或片材。支架可以是其中可分散干细胞或ECM凝胶、溶液或悬浮液的生物相容的多孔、大孔或微孔基质。ECM还可以在干细胞或ECM溶液或悬浮液的分散之后进行胶凝。

在一个实施方式中，ECM可源自本领域常用的组织。例如，ECM已经源自小肠粘膜下层(SIS)或膀胱基质(UBM)组织。在更优选的实施方式中，已经发现源自与待治疗的组织相同组织类型的ECM，称为“组织特异性细胞外基质”或“TS-ECM”可提供有利的结果，例如，更有效或更响应的重建组织重构，其可通过动态相互作用存在。

因此，本发明进一步包括使用TS-ECM移植物治疗疾病或创伤损伤的下肠道、生殖器(除了阴道)、皮肤、胰腺、肾、循环组织或呼吸组织的方法和组合物。在一个实施方式中，TS-ECM源自与待治疗物种相同的物种。例如，治疗人中的UC采用人结肠粘膜组织作为TS-ECM支架组合物。组织移植物可以是如上述同种异体移植物、或异种移植物。

在一个优选的实施方式中，本发明包括方法的应用和组合物，该组合物包括源自大肠组织用于替换患病或损伤的大肠组织的组织移植组合物。衍生的大肠组织或治疗的大肠组织可以是结肠组织，并且可优选地是结肠粘膜。

有利地，在造成敞开或出血损害如遭受IBD(例如，CD或UC)的患者的结肠组织显示出的组织疾病、损伤或病况中，考虑治疗或治愈可以通过包括植入、移植或施用TS-ECM而不用先前粘膜切除或消融步骤的方法来实现。因此，在这样的情况下，其中组织的疾病或损伤造成损伤，例如，组织的暴露的或出血表面，可省略之前的组织切除。

如本文所使用，术语植入(implanting)或植入(implantation)、移植(transplanting)或移植(transplantation)、施加(applying)或施加(application)、施用(administering)或施用(administration)、注入(infusing)或注入(infusion)、注射(injecting)或注射(injection)、递送(delivering)或递送(delivery)都指过程或为治疗位点提供ECM，并且本领域普通技术人员理解具有相同的含义，这取决于组合物特性和所采用的用于进行递送ECM至位点的程序。这些术语可交换使用，并且绝不限于本发明的方法。

因此，本发明方法的一个实施方式包括下述步骤：

使用选自下述的组织制备TS-ECM支架：下肠道、生殖器(除了阴道)、皮肤、胰腺、肾、循环组织和呼吸组织；以及

将TS-ECM支架植入、移植或施用至遭受影响相同的下肠道、生殖器(除了阴道)、皮肤、胰腺、肾、下肠道、循环组织和呼吸组织的疾病或病况的患者的组织。

任选地，当治疗结肠时，该方法可以进一步包括一个或多个另外的步骤：(3)产生回肠切口；以及(4)通过患者静脉内喂养为患者提供完全肠胃外营养(TPN)，同时新的粘膜形成。

在优选的实施方式中，该方法包括治疗损伤或患病的结肠组织。该方法可以用于，例如，治疗源自下述的结肠组织的损伤或疾病：克罗恩病、溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病、赫希施普龙氏病、狭窄、直肠炎或瘘管，更优选治疗结肠粘膜组织的疾病或损伤。

现有技术描述了制备用作细胞生长支架的管材、片材和凝胶化溶解的ECM组合物的方法。凝胶ECM组合物可以在植入或施用至患者之前以组合物原位凝胶的凝胶化之前的未凝胶形式被模制。

形成ECM移植物的这些和其他方法描述在例如美国专利号8,361,503中，其通过参考将其整体并入。在优选的实施方式中，根据如描述的一个或多个方法制备凝胶ECM组合物。例如，可通过包括下述的方法制备凝胶ECM：

i.粉碎ECM，

ii.通过用在酸性溶液中的酸蛋白酶消化以产生消化液，将完整的、非透析或非交联的ECM溶解，

iii.调整消化液的pH至在7.2和7.8之间的pH以产生中性消化液，以及

iv.使溶液在大于25℃的温度下胶凝。

在另一实施方式中，制备ECM支架的方法进一步包括超声所述支架。

本发明的进一步方法包括将TS-ECM支架附接至患者的组织，其中支架的表面包括用患者的细胞(例如，干细胞)嵌入或包被的凝胶化溶解的ECM，其中嵌入或包被的细胞在将支架植入、移植或施用至组织之前，允许足够的时间将患者的细胞生长成支架。

在进行本发明的方法时，根据本文描述制备支架移植物，然后植入、移植或施用至患病或损伤的至少一部分组织，并且允许保持接触患病或损伤的组织足够的时间从而替换细胞生长且替换患病的或损伤的细胞。

足够的时间可以是一天至数周或数月，这取决于患者对这样的治疗方法的反应性。没有成功组织重建的一年期治疗可以是继续这样治疗的上限。ECM材料在身体中天然生物降解并且不需要被移除。

对于进行治疗UC的主题方法，ECM移植物被植入、移植或施用接触至少一部分患病或损伤的结肠，保持接触粘膜一段时间，以允许生长和替换结肠粘膜细胞，使得用没有显示出炎症或UC-患病的细胞其他症状的健康粘膜细胞替换患病或损伤的细胞。

ECM移植物可以提供为相对短的管材或片材区段，长度大约1-10厘米，植入、移植或施用至结肠的内壁。可选地，ECM移植物可以包括对应结肠整个长度的一个或多个长度。固体管材或片材ECM可通过缝合、夹子、钉住、胶合等固定至待治疗的组织。可选地，可以通过施用(例如，喷射)液体溶液、悬浮液或凝胶组合物至待治疗的位点来治疗结肠组织。

在包括粘膜切除术步骤的治疗UC的方法中，因为UC限于粘膜内，移除显示出UC症状的组织。粘膜切除术步骤可以内窥镜方式进行，消除了对于打开或腹腔镜检查的外科手术的需要。干细胞刺激步骤(经引入TS-ECM移植物)允许新的、健康粘膜在结肠内腔中形成。可对部分或短区段的结肠或更长的结肠进行粘膜切除。

无论在结肠的区段或整个长度的结肠上进行，本发明可以提供如下益处，其消除了对腹部结肠切除术的需要并且原位留下天然直肠组织封套，还包括如下益处：消除了残留的直肠增生性(恶性)病理学的恶性可能，例如，UC或家族性息肉；以及允许护理专业人员将更长的直肠乙状结肠区段留在适当的位置，其功能上的益处是：

-降低了伴随下部解剖的括约肌破坏(失禁)或骶骨神经损伤(阳痿)的风险；和

‐改善的储存功能，因为增加的水吸收和改善的储存能力，允许更正常的肠习惯；

‐比下述提供相对简单和较少侵入性：结肠切除术或类似程序如IPAA(全部直肠结肠切除术，回肠肛管吻合术)；粘膜切除术是相对直接的程序，其可在下部与牵引/回肠切口同时或在稍后的时间进行。干细胞可以“种植”和使粘膜再生，同时改道的回肠切口仍然存在。

‐节省结肠消除了没有结肠生活的终身顾虑(例如，结肠袋炎、肠道阻塞、脱水等)；

‐产生仅仅临时的回肠切口(即，直到新的粘膜是有活力的)；和

‐其将可能独立治疗IBD的各个学科整合在一起(外科、医学、内窥镜和组织工程)。

应理解的是，各种方法和程序可以用于将干细胞(例如，在支架上)递送至结肠，在经灌肠剂递送的培养基中，通过基于导管的递送系统等。有利地，可在如当产生回肠切口时的相同外科程序期间施加ECM材料，并且当内袋治愈时，可允许粘膜增生或再生。

实施例1–外科放置固体ECM用于替换结肠组织

将小肠粘膜下层细胞外基质(SIS-ECM)移植物移植至四(4)只活狗的结肠组织。根据已知技术制备约3-4厘米长度的SIS-ECM移植物。制备移植物具有不同的层数–2层、4层、6层和8层片材或管材，并且测试下述经肛圆周粘膜切除。

四(4)只健康的成年杂种雌性狗(体重约20kg)进行圆周结肠粘膜EMR。在狗进行麻醉之后，进行外科粘膜切除。可选地，可以例如用治疗性内窥镜(EG-3430，PentaxMedical，Montvale，NJ)和商业上可获得的试剂盒(EMRKit，OlympusAmerica，CenterValley，Pa)进行粘膜组织消融(例如，EMR)。顺序进行零碎粘膜切除术直到完成4-cm圆周切除。

然后，源自猪小肠粘膜下层(SIS)的管状ECM移植物或支架内视镜外科放入四只狗中。如先前描述的方式，制备SIS-ECM生物支架材料并且构造成管状形状。简言之，在死亡之后，从上市体重猪(约110-130kg)获得猪SIS。切除残留的外部结缔组织，包括脂肪组织，通过用自来水重复洗脱去除所有残留的废物材料。使粘膜下层与小肠组织机械分层。然后使粘膜下层脱细胞，并且通过浸入0.1％(vol/vol)过乙酸(s)、4％(vol/vol)乙醇、和96％(vol/vol)去离子水2小时来消毒。

然后，用磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH7.4)冲洗SIS-ECM材料两次15分钟，并且用去离子水冲洗两次15分钟。制备管状支架，以匹配大结肠的解剖学。简言之，通过围绕22-mm穿孔的管/心轴包装水合片材SIS产生多层管，所述穿孔的管/心轴用脐带线总共数个完全的转数(即，多层管)。然后将构建体放入塑料袋并且连接至具有在线冷凝阱的真空泵(modelD4B，Leybold，Export，PA)。

构建体经历710至740mmHg的真空10-12小时，以去除水和形成紧密连接的多层构建体。在每个ECM设备从心轴移除之后，它们最后用环氧乙烷灭菌。

对于SIS-ECM移植物的内窥镜放置，管状支架在生理盐水溶液浴中水合5分钟，然后放置在30mm失弛缓性气囊(CookEndoscopy失弛缓性气囊，Wilson-CookMedical，Winston-Salem，NC)。用两个4-0蚕丝缝合约束SIS-ECM设备，当气囊膨胀时外科医生的结头松开。0.035-英寸导线(Jagwire，BostonScientifi，Natick，MA)内视镜放入狗的结肠。然后气囊越过电线并且放置在内窥镜引导下方，SIS-ECM桥接粘膜切除的长度。

然后将一毫升可降解的赖氨酸衍生的氨基甲酸乙酯(LDU)外科粘合剂(TissuGlu，CoheraMedical，Pittsburgh，Pa)注射通过结肠壁和在设备对侧的2个分开的条带中SIS-ECM之间的6F内窥镜引导导管(Oasisstentintroductionsystem，Wilson-CookMedical)，以防止滑动。然后手动使气囊膨胀至充分容量，使支架扩展靠着结肠壁。气囊膨胀保持15分钟，然后放气和移除，将SIS-ECM支架留在结肠中适当位置。

术后，狗从麻醉中恢复，去掉管子，并且在恢复室中监测直到它们舒适地以胸骨姿势休息。狗保持在笼中过夜，并且在术后1天返回它们更大的实验住处。所有的狗口服给予由头孢菌素/头孢氨苄(35mg/kg)组成的预防性抗生素，每天两次，共7-9天。

静脉内施用乙酰丙嗪(0.1mg/kg)和布托啡诺(0.05mg/kg)2天，接着根据需要每12小时皮下或肌内施用丁丙诺啡(0.01至0.02mg/kg)用于止痛。

所有的狗也给予奥美拉唑每天20mg。外科手术后36小时开始口服摄入。从升高/上升的平台饲养狗。计算每日营养要求并且分成3个分开的饲养组。术后提供稀粥/软食物1周，随后在接下来2周时间内逐渐改变为固体食品。每周对狗称重并且居住在约10-14英尺实验测量中，以允许自由走动。

术后1个月和在12周就在安乐死之前进行内窥镜检查，以评估结肠粘膜外观和狭窄。

就在安乐死之后，收获支架放置位点和支架放置位点近端和远端的天然结肠组织。纵向分离切除的区段并且检查暴露的粘膜表面，拍照用于尺寸测量。测量上边缘附近结肠的腔周长3cm重建的位点，且在移植物的中部确定狭窄的程度。结果表达为重建的位点和近端正常组织之间周长减少的百分数(平均数+/-SD)。

将切除的组织以平整的姿势固定至软木板并且浸入10％中性缓冲福尔马林。纵向切除样品，包括正常和重建的组织、切片，并且用苏木精-伊红和马森氏三色染色剂染色。检测的区域包括天然组织、重建的区域和天然组织之间的近端和远端界面、和重建的区域的中间区域。基于数据分布的检查，数据似乎是正态分布。因此，用于比较结果的统计方法是参数t检验(n＝4)。

测试的假设是用SIS-ECM治疗EMR缺陷比没有治疗将造成较少的周长减少量。应该认识到，来自个体测试动物的数据进行多个统计分析(即，周长减少和体重)。狗中腔周长的减少的比较作为主要统计分析，其不涉及多重检验。所有其他统计检验认为是次要的，它们的P值指示对于重复测量的未修正的，并且应解释为仅仅描述性的。

结果和结论。

在没有治疗的情况下，预期出现结疤和狭窄形成。但是，ECM治疗使得切除组织的粘膜覆盖，其外观大体上和纤维镜下正常。基于管状设备中ECM层的数量，结果稍微不同，更大数量的ECM层一般与增加的粘膜覆盖相关。在任何用ECM支架治疗的狗中，没有出现狭窄信号。

狗模型中目前的研究显示出在圆周EMR之后内视镜部署的SIS-ECM支架促进了结肠粘膜重构(图1)，而没有狭窄形成。重建的组织由完全上皮化的内腔组成，所述内腔具有致密、组织化的胶原粘膜下层和正常外观的外肌层。

因此，使用狗模型和采用SIS-ECM移植物用于结肠粘膜内层组织再生的这些研究表明ECM可用于治疗IBD如UC或CD。

已经这样描述了本发明，清楚的是，在没有背离本发明的精神和范围的情况下，可提供似乎不同的实施方式。因此，期望前述说明书解释为示意性而不是限制性的。

实施例2–施加凝胶ECM用于替换结肠组织

根据本发明，使用ECM凝胶组合物用于治疗炎性肠病(IBD)的可行性可在大鼠中体内测试。可将大鼠确定为用于人IBD如溃疡性结肠炎(UC)的模型，由此可在大鼠结肠组织中通过在引用水中施用葡聚糖硫酸钠(DSS)自由采食数天诱导UC。

可通过在自由采食提供的饮用水中施用2％的DSS七天，随后生理盐水冲洗，在大鼠中诱导急性UC。可通过在提供自由采食的饮用水中施用2％的DSS一个或多个连续的7-天周期，随后施用常规水，在大鼠中诱导慢性UC。

可使用源自小肠粘膜下层(SIS)并且引入结肠经灌肠剂的凝胶细胞外基质(ECM)进行治疗UC。可每天一次或多次施用凝胶SIS-ECM，至少一周，优选地多达约一个月的时间。SISECM的优选给药方案是每天一次，共30天。

由ECM制备凝胶的方法

由小肠区段制备SIS的方法详述在美国专利号4,902,508、美国专利号5,275,826和美国专利号5,514,533中，其内容通过引用明确并入本文。首先，肠道的区段使用纵向擦拭运动进行磨蚀，以去除外层(尤其浆膜和肌层)和内层(粘膜层的腔部分)。通常SIS用生理盐水冲洗，任选地储存为水合或脱水状态直到使用，如下面描述的。

通过粉碎和/或用蛋白酶如胰蛋白酶或胃蛋白酶消化粘膜下层足够溶解所述组织和形成基本上均质溶液的时间，该流化组合物制备为肠道粘膜下层的溶液或悬浮液。通过撕碎、切割、研磨、剪切等，使肠道粘膜下层开始材料粉碎。在冰冻或冷冻干燥状态下研磨粘膜下层是优选的，但是也通过使粘膜下层片段的悬浮液进行高速(高剪切)搅拌器和脱水，如果需要，通过离心和倾析过多的水，可获得好的结果。粉碎的肠道粘膜下层可被干燥以形成粘膜下层粉末。其后，其可以被水合，即：结合水或缓冲的生理盐水以及任选的其他药学上可接受的赋形剂，以形成作为流体的组织移植组合物，其在25℃下的粘度为约2至约300,000cps。较高的粘度移植组合物可具有凝胶或糊状粘度。可使用本领域熟知的消毒技术如暴露于电离辐射使本组合物灭菌。

本发明的流化粘膜下层也用作可注射的异种移植用于需要修复或增强的组织，例如，软组织，大部分通常是纠正创伤或疾病诱导的组织缺陷。

SIS悬浮液

如上述制备的SIS样品，使用组织剪刀、单刃剃须刀或其他适当的切割工具被切碎或剁碎成随意小片。样品放置在平底不锈钢容器中，将液氮引入容器以冷冻样品，以准备它们用于粉碎。

然后粉碎冷冻的SIS样品以形成粗糙的SIS粉末。这样的加工可以例如用手动手扳压机进行，圆柱形黄铜铸块放置在冷冻样品的顶部。铸块用作样品和手扳压机之间的界面。液氮可定期添加至SIS样品以保持它们冷冻。

用于粉碎SIS样品的其他方法可用于产生根据本发明使用的SIS粉末。例如，SIS样品可被冷冻干燥并且然后使用手动手扳压机或其他研磨方式粉碎。可选地，SIS可在高剪切搅拌器中处理，以当脱水和干燥时产生SIS粉末。

使用预冷冻马达和碾槌的SIS粉末的进一步研磨可以用于产生一致的、更精细分开的产物。再一次，液氮根据需要用于在最终研磨期间维持固体冷冻颗粒。粉末可以容易地使用，例如，缓冲的生理盐水水合，以产生所期望的粘度的本发明流化的组织移植材料。

SIS溶液

通过金属丝网将SIS粉末筛选至任何方便的容器。然后，粉末进行蛋白水解的消化，以形成基本上均质的溶液。在一个实施方式中，在室温下用HCl将pH调整至2.5的0.1M乙酸中的1mg/ml的胃蛋白酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis，Mo.)来消化粉末48小时。用氢氧化钠中和反应介质，以使肽活性失活。然后通过溶液的盐沉淀浓缩可溶的粘膜下层并且分开，以用于进一步纯化和/或冷冻干燥，从而形成粉末形式的蛋白酶溶解的肠道粘膜下层。

可通过控制粘膜下层组分的浓度和水合的程度，操作根据本发明的流化的粘膜下层组合物的粘度。粘度可调整至在25℃下约2至约300,000cps。低粘度粘膜下层组合物更适于关节内施加或施加在体腔中。通过调整这样的溶液pH至约6.0至约7.0，由SIS消化液制备较高的粘度制剂(例如，凝胶)。本组合物的凝胶形式，如粘膜下层悬浮液或粘膜下层消化液，对于使用注射器或导管皮下或肌内施加通常是优选的。

SIS凝胶也已经描述为通过在4℃下以适当的量混合0.1NNaOH(1/10的消化液体积)和10XPBSpH7.4(1/9的消化液体积)形成凝胶。使用冷的(4℃)1XPBSpH7.4将溶液带来期望的体积和浓度，并且放置在37℃培养箱中用于发生凝胶化。

ECM能够在40分钟之后在溶液中形成基质。ECM衍生的凝胶在20℃温度以下是液体。但是当温度上升至37℃时变成凝胶。

在由ECM制备凝胶时，所有的溶液应保持在冰上，并且下述变量必须根据美国专利号8,361,503的记载来确定，其通过引用以其整体并入本文：

C_f＝终凝胶的浓度，以mg/ml计

Cs＝ECM消化液的浓度，以mg/ml计

V_f＝实验需要的终凝胶溶液的体积

V_d＝从ECM消化液需要的体积，以ml计

V_10X＝需要的10XPBS的体积，以ml计

V_1X＝需要的1XPBS的体积，以ml计

V_NaOH＝需要的0.1NNaOH的体积，以ml计

首先，确定需要的ECM凝胶的终浓度(C_f)和体积(V_f)。然后，通过乘以C_f(mg/ml)×V_f(ml)，计算需要的ECM的质量。该值给出从ECM消化液需要的体积(V_d)，其中V_d＝[C_f(mg/ml)×V_f(ml)]/C_s。

通过计算的体积V_d除以9，计算需要的10XPBS的体积(V_10X＝V_d/9)。通过计算的体积V_d除以10，计算需要的0.1NNaOH的体积(V_NaOH＝V_d/10)。计算需要的1XPBS的量，以使溶液至适当的浓度/体积，如下：V_1X＝V_f-V_d-V_10X-V_NaOH。添加所有的试剂(V_1X+V_d+V_10X+V_NaOH)至适当的容器(通常15或50ml离心管)，而没有ECM消化液(V_d)。将溶液放置在冰上并且在所有时间保持在冰上。

添加适当的来自ECM消化液的体积(V_d)至上面制备的PBS/NaOH混合物，并且与1ml微量移液器充分混合，同时小心和避免在溶液中产生气泡。取决于ECM消化液的粘度，在转移期间可能有一些明显的体积损失。检测总体积并且添加适当的量，直到实现终体积。测量预凝胶溶液的pH值，其中pH值应为约7.4。

将预凝胶溶液添加至模具或至适当的孔。将模具或孔放置在37℃培养箱中最低40分钟。避免使用具有CO₂控制的培养箱。如果水蒸发是关心的，将塑料自封袋放置在模具内侧，然后放置在培养箱中。凝胶化之后，可从模具移除凝胶并且放置在1XPBS上。如果在组织培养板上制备凝胶，可将1XPBS放置在凝胶顶部直到使用，以维持凝胶水合。样品计算：由10mg/ml原料液制备6ml终浓度为6mg/ml的凝胶。

SIS-ECM施用程序

可通过灌肠剂至诱导UC的大鼠的结肠施用SIS-ECM溶液或悬浮液。在施用移植物之后没有预期的宿主动物的排斥、感染或异常生理学响应。也可经内窥镜和经腹腔镜将溶液或悬浮液施用至结肠。相信本发明出人意料的结果将是刺激适当的组织重构，使得可用SIS溶液或悬浮液材料实现结肠粘膜的增加。

本发明流化的组合物可使得组织替换和修复，并且进一步使得治疗或治愈IBD，包括UC。根据本方法使用流化的粘膜下层组合物，以诱导天然结肠粘膜组织的再生长。通过注射有效量的流化的ECM组合物至缺陷组织的场所，可实现活体营养性特性，而不需要更侵入性的外科技术。

尽管已经参考某些优选的实施方式详细描述了本发明，但是在不背离下述权利要求描述和限定的范围和精神的情况下，存在变化和变型。

Claims (32)

1.一种用于治疗、改善或治愈脊椎动物的下肠道组织的病况或疾病、或所述组织的损伤的方法，所述方法包括递送或刺激干细胞或祖细胞迁移至患病或损伤的组织，由此所述干细胞或祖细胞提供所述患病或损伤的组织的重建组织重构，从而实现不用结肠切除术来治疗、改善或治愈所述患病或损伤的组织。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞或祖细胞的所述递送是将包括所述干细胞或祖细胞的组合物直接施加至所述患病或损伤的组织的位点。

3.如权利要求1所述的方法，其中，迁移所述干细胞或祖细胞是通过将细胞外基质(ECM)移植物或支架组合物施加至所述患病或损伤的组织的位点来刺激的。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述ECM源自于选自小肠、大肠和膀胱的组织。

5.如权利要求3所述的方法，其中，所述ECM被制备为固体片材或管材用于递送。

6.如权利要求3所述的方法，其中，所述ECM被制备为选自溶液、悬浮液和凝胶的流体用于递送。

7.如权利要求3所述的方法，其中，所述ECM进一步包括药物或生物制剂。

8.如权利要求6所述的方法，其中，所述流体ECM以内窥镜方式递送。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述下肠道组织由于下述疾病而导致患病或损伤：克罗恩病、溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病、赫希施普龙氏病、狭窄、直肠炎、结肠或直肠癌或瘘管。

10.一种用于治疗、改善或治愈脊椎动物的下肠道组织的病况或疾病、或所述组织的损伤的方法，所述方法包括通过下述步骤替换所述损伤或患病的组织：

a.制备源自于下述组织的细胞外基质(ECM)移植物，所述组织选自小肠组织、大肠组织和膀胱组织；以及

b.将所述ECM移植物植入、移植、施用、施加或附着或附加至患病或损伤的下肠道组织，

由此通过重建组织重构而不用结肠切除术，治疗、改善或治愈下肠道组织的病况、疾病或损伤。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述显示出病况、疾病或损伤的组织是结肠。

12.如权利要求10所述的方法，其中，所述组织病况、疾病或损伤是由克罗恩病、溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性息肉病、赫希施普龙氏病、狭窄、结肠或直肠癌、直肠炎或瘘管而导致的。

13.如权利要求10所述的方法，其中，制备所述ECM移植组合物，并且以片材或管材的形式的固体移植物或支架递送。

14.如权利要求10所述的方法，其中，制备所述ECM移植组合物，并且以流化的凝胶、溶液或悬浮液递送。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述ECM通过灌肠剂递送。

16.如权利要求14所述的方法，其中，所述ECM以内窥镜方式递送。

17.如权利要求10所述的方法，其中，所述ECM移植物源自于小肠粘膜下层(SIS)。

18.如权利要求10所述的方法，进一步包括下述步骤：在将ECM移植物植入、移植、施用、施加或附着或附加至所述患病或损伤的下肠道组织之前，切除或消融显示出病况、疾病或损伤的组织。

19.如权利要求18所述的方法，其中，切除或消融步骤包括内窥镜粘膜切除。

20.如权利要求18所述的方法，其中，切除或消融步骤包括EDTA冲洗。

21.一种治疗患者的炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括下述步骤：

a)提供源自肠道组织的细胞外基质组合物；以及

b)将所述组合物施加或施用至显示出IBD的患者的肠道组织，以诱导用健康的下肠道组织原位替换患病或损伤的组织。

22.如权利要求21所述的方法，其中，所述IBD选自溃疡性结肠炎和克罗恩病。

23.如权利要求22所述的方法，其中，所述细胞外基质组合物的施加或施用刺激干细胞迁移至结肠组织，其中所述干细胞原位发育，以实现显示出溃疡性结肠炎或克罗恩病的肠粘膜组织的重建组织重构。

24.如权利要求21所述的方法，其中，ECM移植物组合物被制备为流化的凝胶、溶液或悬浮液。

25.如权利要求21所述的方法，其中，所述ECM是固体片材或管材。

26.如权利要求21所述的方法，其中，所述ECM是通过灌肠法施用的溶液或悬浮液。

27.如权利要求21所述的方法，其中，所述ECM是以内窥镜方式施用的溶液或悬浮液。

28.如权利要求21所述的方法，其中，在施加或施用步骤b)之前，所述方法进一步包括切除或消融患病或损伤的结肠粘膜组织。

29.如权利要求28所述的方法，其中，所述切除步骤包括内窥镜粘膜切除(EMR)或使用EDTA消融。

30.如权利要求21所述的方法，其中，所述方法进一步包括选自以下步骤所组成的组中的任选步骤：

a)在患者中产生回肠切口；以及

b)使用完全肠胃外营养法静脉内喂养患者，同时新的结肠粘膜形成或发育。

31.一种组织特异性细胞外基质组合物，其用作替换大肠道粘膜的移植物，所述组合物源自下肠道组织。

32.如权利要求29所述的组织特异性细胞外基质组合物，其中，所述下肠道粘膜是结肠。