JP2016520560A - 結腸切除なしに炎症性腸疾患を処置するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

たとえば潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患などの疾患または損傷のある組織を処置するための方法および組成物は、幹細胞か、または損傷のある組織への幹細胞の移動を刺激する組織グラフトを用いた組織再生を含む。組織グラフトは、たとえば組織特異的細胞外マトリックス（ＴＳ−ＥＣＭ）などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料であってもよい。この方法はさらに、グラフトの配置の前に、損傷または疾患のある組織の粘膜切除を含んでもよい。【選択図】図１

Description

本発明は、結腸切除なしに疾患または損傷のある粘膜組織を置換することによってＵＣを処置するための、新規の組織グラフトおよび方法に関する。

炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）は、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ：ＵＣ）という２つの独立した疾患からなっており、８３３，０００人の米国人が罹患している。

ＣＤは消化管（口から肛門まで）のどこにでも現れる可能性があり、しばしば消化管壁の厚さ全体を冒すのに対し、ＵＣは結腸および直腸に限られており、壁の粘膜（内壁）のみを冒す。

深刻な副作用を有し得る抗炎症剤の使用を含む医療処置は、ＵＣの症状を処置できないことがあり、患者が他のすべての医療処置に対して不応性であるときには、結腸の完全除去（結腸切除）がＵＣに対する唯一の公知の「治療法」である。結腸切除は十分確立されているが大手術であり、しばしば廃棄物の除去を容易にするために回腸瘻造設を必要とする。

ＵＣを含むＩＢＤを処置および治癒するための第１線の処置（有害であり得る副作用を伴う薬物療法）および第２線の処置（結腸切除）に対する代替処置が必要である。

手術手順の侵襲性を最小限にする傾向によって、組織再生に有用な人工的足場の開発が促された。尿失禁、逆流症、喉頭病態、および新生児心筋細胞の処置のための再生医療においては、精製コラーゲン、ゼラチン、自己の脂肪、ヒアルロン酸、および合成材料が注射用足場として臨床的に用いられてきた。しかし、過度に精製された材料、化学的に修飾された材料、または合成材料は、宿主による有害な免疫反応をもたらして、マトリックスへの細胞移動を制限するおそれがある。

天然に生じる細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）由来の足場は、多くの生理活性特性を有しており、下部尿路構造、食道、心臓組織、および筋腱（ｍｕｓｃｕｌｏｔｅｎｄｏｎｏｕｓ）構造を含むさまざまな組織の修復のために用いられてきた。しかし、これらの足場の多くは非ヒト組織に由来しており、かつたとえば結腸組織などの下部腸組織の処置または再生、特にＵＣの処置に対する使用が記載されているものはない。

主題の発明は、結腸切除なしに疾患または損傷のある粘膜組織を置換することによってＵＣを処置するための、新規の組織グラフトおよび方法に関する。

一実施形態において、本発明の方法は、結腸の粘膜内壁に対する疾患または損傷の徴候を有するか、またはそれを被っている患者において、（１）結腸の疾患または損傷のある粘膜内壁に対する粘膜切除を任意に行うステップと、（２）幹細胞もしくは前駆細胞によって結腸の粘膜内壁を播種するか、または疾患もしくは損傷のある結腸組織への幹細胞および前駆細胞の移動を刺激するステップとによって、損傷または疾患のある下部腸組織を処置するステップを含む。結腸の粘膜内壁の疾患とは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であってもよく、この方法はＩＢＤを処置、寛解、または治癒するために用いられてもよい。

よって主題の発明は、幹細胞または前駆細胞を損傷または疾患のある結腸組織に直接送達することによって、幹細胞または前駆細胞を播種することを含んでもよく、たとえば幹細胞または前駆細胞は、結腸の粘膜内壁の再構築組織リモデリングを開始または刺激するために、幹細胞または前駆細胞が結腸の内腔壁に接触して、少なくとも一時的にそこに存在するように、結腸の内腔への注射または注入によって結腸組織に送達するための、たとえば溶液、懸濁物またはゲルなどの流体組成物中に調製される。よって本発明の方法は、損傷または疾患のある結腸組織を新しい健康な結腸組織に置換させることができる。

代替的に、固体（シートもしくはチューブ）または流体（溶液、懸濁物、もしくはゲル）の形の、たとえばＥＣＭグラフトまたは足場などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物を結腸内腔壁に導入または接触させることによって、損傷または疾患のある結腸組織の部位に対して幹細胞または前駆細胞を刺激してもよい。

本発明の別の実施形態においては、幹細胞または前駆細胞を固体または流体ＥＣＭ組成物に組み込んでもよく、その幹細胞または前駆細胞を含むＥＣＭ組成物を、本明細書に記載される組成物に対して適切な送達手段によって結腸の粘膜内壁に送達してもよい。たとえば、固体ＥＣＭを結腸内壁に内視鏡的に植込んでもよいし、流体ＥＣＭを結腸内に注入、注射または噴霧してもよい。

損傷のある結腸組織の部位に播種または移動した後に、幹細胞または前駆細胞は特殊化し、インサイツで発達し、結腸の粘膜内壁を置換する。この方法はさらに、以下の付加的なステップの１つまたはそれ以上を含んでもよい。（３）回腸瘻造設を行うステップ、および（４）新たな粘膜が形成して疾患のある粘膜内膜を置換する間、消化管をバイパスして患者に静脈内栄養供給することによって、患者に完全静脈栄養（Ｔｏｔａｌ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ：ＴＰＮ）を提供するステップ。

本発明の方法の一部として用いられるとき、グラフトの植込み、移植または投与の前に疾患または損傷のある組織を除去する粘膜切除ステップは、組織切除またはアブレーションによって行われてもよい。

切除またはアブレーションの方法は、内視鏡または手術による粘膜切除（切除法）、内視鏡レーザー療法、光線力学的療法、アルゴンプラズマ凝固を用いた内視鏡的熱凝固、高周波アブレーション、冷凍アブレーション、またはＥＤＴＡもしくはたとえば好ましくは加熱される食塩水などのその他の切除剤の使用を含む。これらの粘膜切除手順は、当該技術分野において十分に実証されている。切除またはアブレーションステップが使用される主題の発明の方法において、上記の技術または手順の任意の１つまたはそれ以上が用いられてもよい。

主題の発明はさらに、処置される組織と同じ組織に由来する、たとえば細胞外マトリックス（ＥＣＭ）足場などの組織グラフトを用いた、疾患または外傷による損傷のある組織の処置のための方法および組成物を含む。処置される組織と同じ組織に由来するＥＣＭを含む組織グラフトのことを、本明細書においては「組織特異的細胞外マトリックス（ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）」（ＴＳ−ＥＣＭ）と呼ぶ。

好ましいＴＳ−ＥＣＭは、同じタイプの組織に由来する（すなわち、結腸組織の処置に対する結腸由来ＥＣＭ）だけでなく、処置される種と同じ種に由来するものである。たとえば、ヒトのＵＣの処置では、ＴＳ−ＥＣＭ足場組成物としてヒト結腸粘膜組織を用いる。組織グラフトは同種移植片であっても異種移植片であってもよい。ＥＣＭと細胞との間には、刺激および情報の相互交換（当該技術分野において「動的相互作用」と呼ばれて公知である）が存在してもよく、ＥＣＭグラフトを用いることの利点を提供する。ＴＳ−ＥＣＭグラフトを用いることによって、この動的相互作用が促進または改善され得る。

よって主題の発明は、疾患または損傷のある大腸組織の置換のための、大腸組織に由来する組織グラフト組成物を含むが、それに限定されない。大腸組織に由来するＥＣＭは結腸組織であってもよく、好ましくは結腸粘膜を含み、かつ処置される大腸組織は結腸組織であってもよく、やはり好ましくは結腸粘膜である。

一実施形態において、組織グラフト組成物は、結腸粘膜上に配置または固定できる固体シートまたはチューブとして形成されたＥＣＭ足場であってもよい。固体シートまたはチューブ足場は、縫合、ステープル、ステント、またはクリップを含むがそれに限定されない機械的または外科的手段によって、患者の所望の部位に植込みもしくは移植されるか、または当該技術分野において認識されるとおりに貼付け、適用もしくは付着されてもよいし、たとえば薬学的に許容可能であるか、または治療上許容可能であるバイオ接着剤を含む接着剤などの許容可能な接着剤によって粘膜に接着されてもよい。ＥＣＭ組成物を結腸に送達するための好ましい手順の１つは、侵襲性の手術手順を有利に最小化できる内視鏡を使用してもよい。

代替的には、ＥＣＭを粉末化または消化して、たとえばゲル、溶液または懸濁物などの流体の形で提供するために溶解または懸濁してもよい。流体組成物は、処置される部位にゲル、溶液または懸濁物を注射、注入、または噴霧することなどによって有利に投与され得る。たとえば、浣腸療法などとして、流動化ＥＣＭを結腸の内腔に注射、注入または噴霧することによって投与または適用してもよく、それによって流体ＥＣＭは結腸の粘膜内壁をコートするか、または粘膜切除した結腸の場合には結腸の露出した内腔壁をコートする。所望に応じて、生存可能または健康な組織の許容可能な再増殖または置換をモニタする処置医師によって定められるとおりに、こうした投与を数回繰り返してもよく、それは１日当り１回またはそれ以上の回数の投与を数日間、数週間または数ヵ月間、最大約１年間にわたって続けることを含む。

流動化ＥＣＭの噴霧用ゲル、溶液または懸濁物の好ましい実施形態の１つは、噴霧による投与のために組成物をエアロゾル化することである。こうした流動化ＥＣＭを所望の部位または場所に送達するように製造または改変された内視鏡の中に設けられるか、または内視鏡とともに設けられたカニューレまたはその他の導管を通じて、エアロゾル化噴霧剤をソースリザーバから汲み出してもよい。

有利なことに、幹細胞または前駆細胞は、ＥＣＭ配置または投与の部位に移動して、時間とともに、細胞または組織の正常な特性および機能を有する健康または非症候性の細胞および組織によって、組織を置換できることが公知である。よって、本発明の組成物の代替的実施形態は、固体ＥＣＭチューブもしくはシート足場を単独で含むか；幹細胞もしくは前駆細胞をコートもしくは埋込んだ固体ＥＣＭ足場を含むか；流動化ＥＣＭ（例、ゲル）を単独で含むか；または、固体もしくは流体ＥＣＭにコート、埋込みもしくは混合された幹細胞もしくは前駆細胞を有するかもしくは有さない、流動化ＥＣＭを付加的に含む固体ＥＣＭ足場を含む。

加えて、ＥＣＭ組成物は複合型であってもよく、部分的に天然の組織に由来して、合成または天然ポリマーと混合または組み合わされてもよいことが理解されるだろう。合成または天然ポリマーを含む本発明のＥＣＭ組成物においては、生分解性ポリマーが用いられることが好ましいが、必須ではない。

本発明の別の実施形態においては、たとえば３次元（３−Ｄ）プリンタ技術を用いることによって、固体シートまたはチューブのＥＣＭ組成物が形成または生成されてもよい。

この組成物はさらに、ＥＣＭに特定の望ましい特性をもたらすための添加剤を含んでもよい。たとえば、ＥＣＭ組成物は１つまたはそれ以上の薬物または生物学的製剤、たとえば抗生物質、抗炎症剤、免疫抑制剤、モノクローナル抗体、または増殖因子などを含んで、添加された薬物または生物学的製剤の所望の活性を提供してもよい。これらの添加剤は、局所環境を好ましい組織リモデリングが行えるようにできる。組成物に対するその他の添加剤は、たとえば粘度増強剤、またはゲルの形成を開始できる薬剤などを含み得る。当該技術分野においては一般的に、ゲルの粘度が高くなるほどゲルの接着特性が改善され得ることが認められている。したがって、粘度増強剤も接着を促進する働きをし得る。接着促進剤は当該技術分野において周知であるが、粘度増強剤または接着増強剤として、たとえば血液凝固剤または血液凝固因子などの血液成分をさらに含んでもよい。

本発明の一部としてさらに含まれるのは、先行する切除またはアブレーションを伴わずに、本明細書に記載されるＥＣＭグラフトまたは足場を用いて、疾患または損傷のある結腸組織を処置するための方法である。たとえば、組織に対する疾患または損傷が、たとえば組織の表面の露出または出血などの障害を生じる場合においては、ＥＣＭ足場またはグラフト組成物の植込み、移植、適用、または投与に先行する組織の切除が省略されてもよい。したがって、主題の方法の一実施形態は、以下のステップを含む。
ａ）腸、生殖器、外皮、膵臓、腎臓、循環器、および呼吸器から選択される組織を用いて、ＥＣＭ足場、グラフト、または組成物を調製するステップ、および
ｂ）腸組織を冒す疾患、損傷または状態を被っている患者のうち、下部腸管組織を冒す疾患または状態を被っている患者の組織に、ＥＣＭグラフトまたは足場組成物を植込み、移植、適用または投与するステップであり、ここで腸組織は、ＥＣＭ組成物の植込み、移植、適用または投与の前に切除またはアブレーションを受けない。

好ましい実施形態において、この方法は、たとえば潰瘍性大腸炎またはクローン病などのＩＢＤ、家族性大腸腺腫、ヒルシュスプルング病、狭窄、直腸炎（ｐｒｏｃｔｉｔｉｔｓ）、結腸癌、または瘻孔を示す、損傷または疾患のある結腸組織を処置するステップ、より好ましくは、結腸粘膜組織に対する疾患または損傷を処置するステップを含む。

本発明の別の実施形態は、先行する切除またはアブレーションを伴うかまたは伴わずに、本明細書に記載される組織特異的ＥＣＭ（ＴＳ−ＥＣＭ）足場を用いて、疾患または損傷のある組織を処置するための方法である。したがって、主題の方法の一実施形態は、以下のステップを含む。
ａ．損傷または疾患のある組織に対する粘膜切除を任意に行うステップ、
ｂ．腸、生殖器（膣以外）、外皮、膵臓、腎臓、循環器、および呼吸器から選択される組織を用いて、ＴＳ−ＥＣＭグラフトまたは足場組成物を調製するステップ、ならびに
ｃ．同じ腸、生殖器（膣以外）、外皮、膵臓、腎臓、循環器、および呼吸器の組織を冒す疾患または状態を被っている患者の組織に、ＴＳ−ＥＣＭ足場または組成物を植込み、移植、または投与するステップ。

本発明のＥＣＭまたはＴＳ−ＥＣＭグラフト、足場または組成物は、生体適合性の多孔性、マクロ多孔性、または微孔性のマトリックスであってもよく、その中に幹細胞またはＥＣＭのゲル、溶液または懸濁物が分散されてもよいことが理解されるだろう。加えて、本発明のＥＣＭまたはＴＳ−ＥＣＭはゲル化されてもよい。

グラフトとして用いられる細胞増殖マトリックスまたは足場として有用なチューブ、シート、およびゲル化、可溶化ＥＣＭ組成物を調製するための方法は、当該技術分野において記述されている。ゲルＥＣＭ組成物は、植込み前に成形されてもよいし、ゲル化前に未ゲル化形状で患者に投与されて、組成物がインサイツでゲル化してもよい。ＥＣＭグラフトを形成するこれらの方法およびその他の方法は、たとえばその全体が引用により援用される米国特許第８，３６１，５０３号などに記載されている。

好ましい実施形態において、ゲルＥＣＭ組成物は、記載されるとおりの１つまたはそれ以上のプロセスに従って調製される。たとえば、ゲルＥＣＭは、以下のステップを含む方法によって調製されてもよい。
ｉ）ＥＣＭを粉砕するステップ、
ｉｉ）酸性溶液中の酸性プロテアーゼによる消化によって、インタクトな非透析または非架橋ＥＣＭを可溶化して、消化溶液を生成するステップ、
ｉｉｉ）消化溶液のｐＨを７．２から７．８のｐＨに調整して、中和消化溶液を生成するステップ、および
ｉｖ）２５℃よりも高い温度で溶液をゲル化するステップ。

別の実施形態において、ＥＣＭグラフトまたは足場組成物を調製する方法は、足場を超音波処理するステップをさらに含む。本発明のさらなる方法は、患者の組織にＴＳ−ＥＣＭ足場を付着させるステップを含み、ここで足場の表面は、患者のたとえば幹細胞などの細胞を埋込みまたはコートしたゲル化可溶化ＥＣＭを含み、その埋込みまたはコートされた細胞は、組織に足場を植込み、移植または投与する前に、足場内に患者の細胞が内部増殖するために十分な時間を与えられる。

本発明の方法を実行する際には、本明細書に記載されるとおりに、またはＥＣＭを調製するその他の公知の方法によって、足場またはグラフトが調製され、次いで疾患または損傷のある組織の少なくとも一部に植込み、移植または投与されて、置換細胞が増殖して疾患または損傷のある細胞を置換するために十分な期間だけ、疾患または損傷のある組織と接触し続けるようにされる。十分な期間とは、１日から約６ヵ月間であり得る。

有利なことに、ＥＣＭグラフトの植込み、移植または投与によって、ＥＣＭグラフトの植込み、移植または投与の部位に幹細胞を移動させるための刺激が提供される。たとえば、ＵＣの処置においては、疾患または損傷のある結腸粘膜が存在した（粘膜切除後の場合）か、または存在する（粘膜切除を行わない場合）結腸の少なくとも一部に接触させてＥＣＭグラフトを植込み、移植または投与し、結腸粘膜細胞の増殖および置換を可能にする期間だけ粘膜と接触させて保持し、結果として疾患または損傷のある細胞を健康な細胞で置換する。ＥＣＭグラフトは、結腸の内壁に同時または順次に植込み、移植または投与される、１〜１０センチメートルのオーダの比較的短い固体セグメントとして提供されてもよい。代替的に、ＥＣＭグラフトは、結腸全体に対応する複数の部分または長さを有するように調製されてもよい。

本明細書に記載されるとおりに小腸粘膜下層細胞外マトリックス（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ：ＳＩＳ−ＥＣＭ）によって処置されたイヌから取出された結腸部分（下側の写真）の結果を示す図である。顕微鏡写真（上側の写真Ａ〜Ｄ）は、結腸部分の遠位→近位勾配に沿った顕微鏡細胞検査を示しており、勾配に沿って粘膜被覆が増加していること、すなわち遠位吻合においては不完全な粘膜被覆がみられ（Ａ）、近位端部に向かって増加する粘膜被覆が存在することが示される（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）。

主題の発明は、結腸切除なしに、疾患または損傷のある粘膜細胞および組織を置換するか、またはその置換を刺激することによって、たとえば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病（ＣＤ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置することに関する。

一実施形態において、本発明の方法は、結腸の粘膜内壁に対する疾患または損傷の徴候を有するか、またはそれを被っている患者において、（１）結腸の疾患または損傷のある粘膜内壁に対する粘膜切除を任意に行うステップと、（２）幹細胞もしくは前駆細胞によって結腸の粘膜内壁を播種するか、または疾患もしくは損傷のある結腸組織への幹細胞および前駆細胞の移動を刺激するステップとによって、損傷または疾患のある下部腸組織を処置するステップを含む。結腸の粘膜内壁の疾患とは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であってもよく、この方法はＩＢＤを処置、寛解、または治癒するために用いられてもよい。

よって主題の発明は、幹細胞または前駆細胞を損傷または疾患のある結腸組織に直接送達することによって、幹細胞または前駆細胞を播種することを含んでもよく、たとえば幹細胞または前駆細胞は、結腸の粘膜内壁の再構築組織リモデリングを開始または刺激するために、幹細胞または前駆細胞が結腸の内腔壁に接触して、少なくとも一時的にそこに存在するように、結腸の内腔への注射または注入によって結腸組織に送達するための、たとえば溶液、懸濁物またはゲルなどの流体組成物中に調製される。よって本発明の方法は、損傷または疾患のある結腸組織を新しい健康な結腸組織に置換させることができる。

代替的に、固体（シートもしくはチューブ）または流体（溶液、懸濁物、もしくはゲル）の形の、たとえばＥＣＭグラフトまたは足場などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物を結腸内腔壁に導入または接触させることによって、損傷または疾患のある結腸組織の部位に対して幹細胞または前駆細胞を刺激してもよい。

本発明の別の実施形態においては、幹細胞または前駆細胞を固体または流体ＥＣＭ組成物に組み込んでもよく、その幹細胞または前駆細胞を含むＥＣＭ組成物を、本明細書に記載される組成物に対して適切な送達手段によって結腸の粘膜内壁に送達してもよい。たとえば、固体ＥＣＭを結腸内壁に内視鏡的に植込んでもよいし、流体ＥＣＭを結腸内に注入、注射または噴霧してもよい。

意図的に、ＥＣＭはインサイツで迅速に分解し、その部位へのマクロファージの移動を含む炎症反応を促進する。ＥＣＭの一意の特徴の１つは、これらのマクロファージの表現型をタイプＭ１（ＵＣに罹った患者においてみられるような、炎症促進性のタイプ）からタイプＭ２（根底に炎症促進性の状態を有さない人物においてみられるような、組織リモデリング促進性のタイプ）に切換えることを促進することである。このＭ１からＭ２への表現型切換えによる重要な波及効果は、別様には炎症になりやすくなる組織を健康なままにすることを可能にすることである。

グラフトの植込み、移植または投与の前に、たとえば結腸粘膜組織などの疾患または損傷のある組織を除去するために行われる任意の粘膜切除ステップは、たとえば組織切除またはアブレーションなど、任意の一般的に許容される方法を用いて行われてもよい。公知の切除またはアブレーションの方法は、内視鏡または手術による粘膜切除（切除法）、内視鏡レーザー療法、光線力学的療法、アルゴンプラズマ凝固を用いた内視鏡的熱凝固、寒冷療法、高周波アブレーション、またはＥＤＴＡもしくはたとえば加熱すなわち「高温」食塩水もしくはその他の水溶液などのその他の切除剤を使用したアブレーションを含む。

粘膜切除した組織に幹細胞または前駆細胞を播種するステップは、たとえば医学文献に記載されるとおりにその部位に幹細胞を注射することなどの公知の方法によって行われ得る。たとえば、ランツォーニ（Ｌａｎｚｏｎｉ），Ｇ．、「炎症性腸疾患：幹細胞に基づく療法への動き（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｏｖｉｎｇ ｔｏｗａｒｄ ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）」、ワールド・ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー（Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．）、１４（２９）：４６１６−４６２６（２００８年８月７日）などを参照されたい。この文献は、ＩＢＤの処置における造血幹細胞および間葉系幹細胞の使用を概説しているが、先行する粘膜切除については教示も示唆もしていない。

好ましくは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料または組成物を、その部位にＥＣＭ足場またはグラフトとしてたとえば植込み、移植または投与するなどして配置および／または固定することによって、粘膜切除された組織に幹細胞が導入されてもよい。粘膜切除された部位へのＥＣＭ組成物の導入は、固体シートまたはチューブの形であってもよいし、たとえば溶液、懸濁物またはゲルなどの流体の形であってもよい。固体ＥＣＭ材料の配置または固定は、縫合、クリップ、ステープル、接着剤、またはその他の周知の固定手段によるものであってもよい。

代替的に、たとえば注射、注入、もしくは浸漬（その部位への「噴射」）などの一般的に用いられる流体投与または送達プロセスによって、またはその部位に流体を噴霧することによって、流動化ＥＣＭが投与されてもよい。好ましい噴霧技術は、たとえば内視鏡的に送達されるエアロゾル化ＥＣＭ流体を用いて行われる。

本明細書において、ＥＣＭに言及して用いられる「組成物」、「材料」、「足場」、および「グラフト」という用語は相互交換可能に用いられてもよく、たとえば固体、液体、流体またはその他の形状などの特定の構成を暗示するものではない。たとえば、「ＥＣＭ足場」は固体であっても流体であってもよい。

好ましくは、流動化ＥＣＭ組成物は、粘性の特性を有し、かつその流体が体内の所望の場所に自身で接着するために十分な粘度を有するようなゲルとして形成される。好ましい実施形態において、流動化ＥＣＭは適用または投与されるときには比較的非粘性の液体特性を有するヒドロゲルであり、有利には、投与または適用部位において身体と接触した際、またはその直後に、濃化するかまたは粘性が高くなって、接着性のゲルを形成する。ゲル化は、たとえば投与後の体熱などの温度上昇によって開始され得る。加えて、十分な粘度を提供するために、たとえばヒドロゲルまたはその他の一般的に公知のゲル化剤などの別個の粘性薬剤と、流体ＥＣＭとが混合されてもよい。代替的には、２つの流体が投与されてもよく、その流体の少なくとも一方がＥＣＭ材料を含有しており、それら２つの流体が互いに接触するか、または混合されるときにゲル化してもよい。

組織の十分な血管新生が存在するときには、ＥＣＭ組成物が幹細胞をその部位に移動させ得ることがよく確証されており、血管は細胞がその部位に移動するための適切な導管を提供する。加えて、ＥＣＭは化学的シグナリングを介して隣接する組織または下側の組織と連絡しており、隣接する組織または下側の組織は、ＥＣＭが用いられる場所の細胞および組織の置換または再生を最適化する「動的相互作用」と呼ばれる現象によって、ＥＣＭと連絡する。よってＥＣＭ組成物は、配置、投与または適用部位における新たな細胞および組織増殖のための固体、液体またはゲル足場として働き得る。

さらなる実施形態において、ＥＣＭ由来組成物は組織グラフトであることによって、ＥＣＭ組成物が植込み部位における組織の新たな増殖を促進するための足場として働いてもよい。足場は、所望の部位に配置されるＥＣＭチューブまたはシートであってもよい。足場は生体適合性の多孔性、マクロ多孔性、または微孔性のマトリックスであってもよく、その中に幹細胞またはＥＣＭのゲル、溶液または懸濁物が分散されてもよい。加えて、幹細胞またはＥＣＭの溶液または懸濁物の分散の後に、ＥＣＭがゲル化されてもよい。

一実施形態において、ＥＣＭは、当該技術分野において一般的に用いられる組織に由来してもよい。たとえば、ＥＣＭは小腸粘膜下層（ＳＩＳ）または膀胱マトリックス（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｍａｔｒｉｘ：ＵＢＭ）組織に由来するものである。より好ましい実施形態においては、「組織特異的細胞外マトリックス」または「ＴＳ−ＥＣＭ」と呼ばれる、処置される組織と同じ組織タイプに由来するＥＣＭが、動的相互作用を通じて起こり得る、たとえばより効率的またはより反応性が高い再構築組織リモデリングなどの有利な結果を提供し得ることが見出されている。

よって主題の発明は、ＴＳ−ＥＣＭグラフトを用いて、疾患または外傷による損傷のある下部腸管、生殖器（膣以外）、外皮、膵臓、腎臓、循環器、または呼吸器の組織を処置するための方法および組成物をさらに含む。一実施形態において、ＴＳ−ＥＣＭは、処置される種と同じ種に由来するものである。たとえば、ヒトのＵＣの処置では、ＴＳ−ＥＣＭ足場組成物としてヒト結腸粘膜組織を用いる。上述のとおり、組織グラフトは同種移植片であっても異種移植片であってもよい。

好ましい実施形態の１つにおいて、主題の発明は、疾患または損傷のある大腸組織の置換のための、大腸組織に由来する組織グラフト組成物の使用方法、およびそれを含む組成物を含む。由来する大腸組織または処置される大腸組織は、結腸組織であってもよく、好ましくは結腸粘膜であってもよい。

有利なことに、たとえばＣＤまたはＵＣなどのＩＢＤに罹った患者の結腸組織が示すものなどの、開放または出血性の障害をもたらす組織の疾患、損傷または状態においては、粘膜切除またはアブレーションの先行ステップを伴わないＴＳ−ＥＣＭの植込み、移植または投与を含む方法によって、処置または治癒がもたらされ得ることが予期される。よって、組織に対する疾患または損傷が、たとえば組織の表面の露出または出血などの障害を生じる場合においては、先行する組織の切除が省略されてもよい。

本明細書において用いられる、植込む（ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ）または植込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、移植する（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、適用する（ａｐｐｌｙｉｎｇ）または適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）または投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、注入する（ｉｎｆｕｓｉｎｇ）または注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、注射する（ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ）または注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）または送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）という用語はすべて、処置部位にＥＣＭを提供するプロセスを示すものであり、組成物特性およびその部位へのＥＣＭ送達を行うために使用される手順に依存して同じ意味を有することが、通常の当業者に理解されるだろう。これらの用語は相互交換可能に用いられてもよく、本発明の方法を限定することはまったくない。

したがって、主題の方法の一実施形態は、
下部腸管、生殖器（膣以外）、外皮、膵臓、腎臓、循環器、および呼吸器から選択される組織を用いて、ＴＳ−ＥＣＭ足場を調製するステップと、
同じ下部腸管、生殖器（膣以外）、外皮、膵臓、腎臓、下部腸管、循環器、および呼吸器の組織を冒す疾患または状態を被っている患者の組織に、ＴＳ−ＥＣＭ足場を植込み、移植、または投与するステップとを含む。

任意には、結腸を処置するときに、この方法はさらに、以下の付加的なステップの１つまたはそれ以上を含んでもよい。（３）回腸瘻造設を行うステップ、および（４）新たな粘膜が形成する間、患者に静脈内栄養供給することによって患者に完全静脈栄養（ＴＰＮ）を提供するステップ。

好ましい実施形態において、この方法は、損傷または疾患のある結腸組織を処置するステップを含む。この方法はたとえば、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性大腸腺腫、ヒルシュスプルング病、狭窄、直腸炎、または瘻孔によってもたらされる結腸組織の損傷または疾患を処置するため、より好ましくは結腸粘膜組織に対する疾患または損傷を処置するために用いられ得る。

細胞増殖足場として有用なチューブ、シート、およびゲル化、可溶化ＥＣＭ組成物を調製するための方法は、当該技術分野において記述されている。ゲルＥＣＭ組成物は、植込み前に成形されてもよいし、ゲル化前に未ゲル化形状で患者に投与されて、組成物がインサイツでゲル化してもよい。

ＥＣＭグラフトを形成するこれらの方法およびその他の方法は、たとえばその全体が引用により援用される米国特許第８，３６１，５０３号などに記載されている。好ましい実施形態において、ゲルＥＣＭ組成物は、記載されるとおりの１つまたはそれ以上のプロセスに従って調製される。たとえば、ゲルＥＣＭは、以下のステップを含む方法によって調製されてもよい。
ｉ．ＥＣＭを粉砕するステップ、
ｉｉ．酸性溶液中の酸性プロテアーゼによる消化によって、インタクトな非透析または非架橋ＥＣＭを可溶化して、消化溶液を生成するステップ、
ｉｉｉ．消化溶液のｐＨを７．２から７．８のｐＨに調整して、中和消化溶液を生成するステップ、および
ｉｖ．２５℃よりも高い温度で溶液をゲル化するステップ。

別の実施形態において、ＥＣＭ足場を調製する方法は、足場を超音波処理するステップをさらに含む。

本発明のさらなる方法は、患者の組織にＴＳ−ＥＣＭ足場を付着させるステップを含み、ここで足場の表面は、患者のたとえば幹細胞などの細胞を埋込みまたはコートしたゲル化可溶化ＥＣＭを含み、その埋込みまたはコートされた細胞は、組織に足場を植込み、移植または投与する前に、足場内に患者の細胞が内部増殖するために十分な時間を与えられる。

本発明の方法を実行する際には、本明細書の記載に従って足場グラフトが調製され、次いで疾患または損傷のある組織の少なくとも一部に植込み、移植または投与されて、置換細胞が増殖して疾患または損傷のある細胞を置換するために十分な期間だけ、疾患または損傷のある組織と接触し続けるようにされる。

十分な期間とは、こうした処置法に対する患者の応答性に依存して、１日から数週間または数ヵ月の間であり得る。組織再構築に成功しないときの１年間の処置が、こうした処置を継続する上限となり得る。ＥＣＭ材料は体内で自然に生物分解するため、除去する必要はない。

ＵＣを処置する主題の方法を実行するために、疾患または損傷のある結腸の少なくとも一部に接触させてＥＣＭグラフトを植込み、移植または投与し、結腸粘膜細胞の増殖および置換を可能にする期間だけ粘膜と接触させて保持し、結果として、炎症またはその他のＵＣ疾患細胞の徴候を示さない健康な粘膜細胞によって、疾患または損傷のある細胞を置換する。

ＥＣＭグラフトは、結腸の内壁に植込み、移植または投与される、長さ１〜１０センチメートルのオーダの比較的短いチューブまたはシートセグメントとして提供されてもよい。代替的に、ＥＣＭグラフトは、結腸の全長に対応する１つまたはそれ以上の長さを含んでもよい。固体チューブまたはシートＥＣＭは、縫合、クリップ、ステープル、または接着剤などによって、処置される組織に固定されてもよい。代替的には、たとえば処置される部位に、液体溶液、懸濁物、またはゲル組成物を噴霧するなどして投与することによって、結腸組織を処置してもよい。

粘膜切除ステップを含むＵＣ処置法においては、ＵＣは粘膜内に限定されるために、ＵＣの徴候を示す組織が除去される。粘膜切除ステップは内視鏡的に行われてもよく、開放性手術または腹腔鏡手術の必要をなくしてもよい。（ＴＳ−ＥＣＭグラフトの導入を介した）幹細胞刺激ステップによって、結腸内腔に新たな健康な粘膜が形成することが可能になる。粘膜切除は結腸の部分的または短いセグメントに対して行われてもよいし、結腸のより長い部分に対して行われてもよい。

結腸のセグメントに対して行われても、結腸の全長に対して行われても、主題の発明は腹腔結腸切除の必要をなくし、インサイツで天然の直腸組織カフを残すという利益を提供でき、これはたとえばＵＣまたは家族性ポリープ症などの増殖性（悪性）の病態から保持される直腸における悪性度を取り除き、医療専門家がより長い直腸Ｓ状部セグメントを所定の場所に残すことを可能にするという利益を含み、これは以下の機能的利益を有する。
−下部切開に伴う括約筋の破損（失禁）または仙椎神経の損傷（インポテンス）のリスクを減少させ、かつ
−貯留機能を改善し、水分吸収の増加および貯蔵能力の改善によってより正常な排便習慣を可能にする；
−結腸切除またはたとえばＩＰＡＡ（回腸肛門吻合を伴う全直腸結腸切除）などの類似の手順よりも比較的単純になり、侵襲性が少なくなる；粘膜切除はかなり直接的な手順であり、全快／回腸瘻造設と同時に、またはその後の任意のときに下側から行われ得る。迂回回腸瘻造設がまだ現存している間に幹細胞が「植えられ」て粘膜を再生してもよい。
−結腸を残すことによって、結腸なしで生活することによる生涯の懸念（例、嚢炎、腸閉塞、脱水など）を取り除く；
−一時的な回腸瘻造設のみを行う（すなわち新たな粘膜が生存可能になるまで）；および
−別様にはＩＢＤを処置するために独立に働き得るさまざまな分野（手術、医学、内視鏡、および組織工学）を一緒にする。

幹細胞を結腸に送達するために、たとえば足場、浣腸を介して送達されるブロス、またはカテーテルに基づく送達システムなど、さまざまな方法および手順が用いられ得ることが理解されるだろう。有利には、回腸瘻造設が行われるときに同じ手術手順の間にＥＣＭ材料が適用されてもよく、内部嚢が治癒する間に粘膜が増殖または再生され得る。

実施例１−結腸組織の置換のための固体ＥＣＭの外科的配置
４匹の生きたイヌの結腸組織に、小腸粘膜下層細胞外マトリックス（ＳＩＳ−ＥＣＭ）グラフトを移植した。公知の技術に従って、長さ約３〜４センチメートルのＳＩＳ−ＥＣＭグラフトを調製した。２層、４層、６層、および８層の異なる層数を有するシートまたはチューブのグラフトを調製し、経肛門環状粘膜切除の後にテストした。

４匹の健康な雑種のメスの成犬（体重約２０ｋｇ）に、環状結腸粘膜ＥＭＲを受けさせた。全身麻酔下のイヌに、外科的粘膜切除を行った。代替的には、たとえば治療用内視鏡（ＥＧ−３４３０、ペンタックス・メディカル（Ｐｅｎｔａｘ Ｍｅｄｉｃａｌ）、モントヴェール（Ｍｏｎｔｖａｌｅ）、ＮＪ）および商業的に入手可能なキット（ＥＭＲキット、オリンパス・アメリカ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ）、センターバレー（Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ）、Ｐａ）などによって、ＥＭＲなどの粘膜組織アブレーションを行ってもよい。４ｃｍの環状切除が完了するまで、漸次粘膜切除を順次行った。

次いで、ブタ小腸粘膜下層（ＳＩＳ）由来の管状ＥＣＭグラフトまたは足場を、４匹のイヌに内視鏡的外科的に配置した。前述のとおりにＳＩＳ−ＥＣＭ生物学的足場材料を調製して、管状の形に構成した。簡単にいうと、死亡直後の市場体重のブタ（約１１０〜１３０ｋｇ）からブタＳＩＳを収集した。脂肪組織を含む残留外部接続組織を切り落とし、水道水で繰り返し洗浄することによってすべての残留廃棄材料を除去した。小腸組織から粘膜下層を機械的に剥離した。次いで、粘膜下層を０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過酢酸、４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール、および９６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）脱イオン水に２時間浸漬することによって、脱細胞化および消毒した。

次いで、ＳＩＳ−ＥＣＭ材料をリン酸緩衝食塩水溶液（ｐＨ Ｚ７．４）で１５分間、２回洗浄し、脱イオン水で１５分間、２回洗浄した。イヌ結腸の解剖学的形態に適合するように、管状の足場を製作した。簡単にいうと、臍帯テープで覆われた２２ｍｍの穿孔チューブ／マンドレルの周りにＳＩＳの水和シートを巻き付けて、合計数回完全に回転させる（すなわち多層チューブ）ことによって、多層チューブを作製した。次いで、この構築物をプラスチック袋に入れて、一列になった凝縮トラップを有する真空ポンプ（モデルＤ４Ｂ、レイボルド（Ｌｅｙｂｏｌｄ）、エクスポート（Ｅｘｐｏｒｔ）、ＰＡ）に取付けた。

構築物に７１０ｍｍＨｇから７４０ｍｍＨｇの減圧を１０時間から１２時間受けさせて、水分を除去し、堅く結合した多くの薄層からなる構築物を形成した。マンドレルから各ＥＣＭデバイスを取外した後、それらを最後にエチレンオキシドで滅菌した。

ＳＩＳ−ＥＣＭグラフトの内視鏡的配置のために、管状の足場を食塩水溶液槽内で５分間水和し、次いで３０ｍｍのアカラシアバルーン（クック・エンドスコピー・アカラシア（Ｃｏｏｋ Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ Ａｃｈａｌａｓｉａ）バルーン、ウィルソン−クック・メディカル（Ｗｉｌｓｏｎ−Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ウィンストン−セーレム（Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ）、ＮＣ）の上に置いた。このＳＩＳ−ＥＣＭデバイスは、外科結びを伴う２本の４−０絹縫合糸による拘束を受けており、バルーンが膨張するときに外科結びが解放される。０．０３５インチのワイヤ（ジャグワイヤ（Ｊａｇｗｉｒｅ）、ボストン・サイエンティフィック（Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ネーティック（Ｎａｔｉｃｋ）、ＭＡ）を、イヌの結腸内に内視鏡的に配置した。次いで、そのワイヤの上にバルーンを通して、ＳＩＳ−ＥＣＭが粘膜切除の長さを埋めるようにして、内視鏡の誘導下で位置決めした。

次いで、ずれを防ぐために、結腸壁とＳＩＳ−ＥＣＭとの間の、デバイスの対向側部上の２つの別個のストリップ内に、１ｍｌの分解性のリジン由来ウレタン（ｌｙｓｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｕｒｅｔｈａｎｅ：ＬＤＵ）外科用接着剤（ＴｉｓｓｕＧｌｕ（登録商標）、コヒーラ・メディカル（Ｃｏｈｅｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）、Ｐａ）を、６Ｆ内視鏡ガイディングカテーテル（Ｏａｓｉｓ（登録商標）ステント導入システム、ウィルソン−クック・メディカル）を通じて注射した。次いで、バルーンを全容量まで手動で膨張させて、結腸壁に対して足場を拡張させた。バルーン膨張を１５分間維持した後に収縮および除去し、結腸内の所定の場所にＳＩＳ−ＥＣＭ足場を残した。

手術後、イヌを麻酔から回復させ、抜管し、イヌが胸骨の位置で快適に休むまで回復室でモニタした。イヌを一晩ケージに入れておき、術後１日目により大きなランハウジングに戻した。すべてのイヌに、セファロチン／セファレキシン（３５ｍｇ／ｋｇ）からなる経口予防抗生物質を１日２回、７日から９日間与えた。

静脈内アセプロマジン（０．１ｍｇ／ｋｇ）およびブトルファノール（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を２日間投与した後、鎮痛のために必要に応じて皮下または筋肉内ブプレノルフィン（０．０１ｍｇ／ｋｇから０．０２ｍｇ／ｋｇ）を１２時間ごとに投与した。

加えて、すべてのイヌにオメプラゾールを１日２０ｍｇずつ与えた。手術の３６時間後に経口摂取を始めた。上昇／高くしたプラットフォームからイヌに給餌した。１日の栄養所要量を算出し、３回分の給餌に分割した。手術後１週間は薄い粥／柔らかい食物を与え、その後に続く２週間の期間は固体の食物に徐々に変えていった。１週間ごとにイヌの体重を測定し、自由に歩き回らせるために約１０〜１４フィートの寸法のランに収容した。

結腸粘膜の外観および狭窄を評価するために、手術の１ヵ月後および１２週間後の安楽死の直前に内視鏡検査を行った。

安楽死の直後に、足場配置部位と、足場配置部位の近位および遠位の天然結腸組織とを収集した。切除セグメントを長手方向に裂き、露出した粘膜表面を寸法測定のために検査および撮影した。狭窄の程度を定めるために、リモデリング部位の上方端縁の３ｃｍ近位と、グラフトの中央とにおいて結腸の内腔外周を測定した。結果は、リモデリング部位と近位の正常組織との外周の減少パーセントとして表した（平均＋／−ＳＤ）。

切除した組織は、平らにした位置でコルク板にピン留めし、１０％の中性緩衝ホルマリンに浸漬した。この検体を、正常組織およびリモデリング組織の両方を含むように長手方向に切り取り、分割し、ヘマトキシリン−エオシンおよびマッソントリクローム染色の両方で染色した。検査した区域は、天然組織と、リモデリング区域および天然組織の間の近位および遠位界面と、リモデリング区域の中央領域とを含んだ。データの分布の検査に基づき、データは正規分布していると考えられた。よって、結果を比較するために用いた統計学的アプローチはパラメトリックｔ検定（ｎ＝４）であった。

テストした仮説は、ＳＩＳ−ＥＣＭによってＥＭＲ欠損を処置することによって、処置なしの場合に比べて外周の減少が少なくなるというものである。個々のテスト動物からのデータが、複数の統計学的分析（すなわち外周減少および体重）を受けたことが認識される。イヌにおける内腔外周減少の比較は、複数のテストを伴わない第１の統計学的分析とした。その他すべての統計学的テストは二次的なものとみなし、それらのＰ値は測定の繰り返しに対して修正せずに述べており、単に記述的なものとみなされるべきである。

結果および結論
処置がないときは、瘢痕および狭窄が形成されるという結果が予期される。しかし、ＥＣＭ処置によって、全体的および顕微鏡的に正常にみえる切除組織の粘膜被覆が得られた。管状デバイスのＥＣＭ層の数に基づいて、結果がわずかに変動した。すなわち、一般的にＥＣＭ層数が多いことが粘膜被覆の増加に関連付けられた。ＥＣＭ足場で処置されたいずれのイヌにも、狭窄の徴候は存在しなかった。

イヌモデルにおけるこの研究は、環状ＥＭＲ後に内視鏡的に配置されたＳＩＳ−ＥＣＭ足場が、狭窄を形成することなく結腸粘膜リモデリングを促進する（図１）ことを示した。リモデリングされた組織は、密な組織化されたコラーゲン性粘膜下層と、正常な外見の外筋層とを有する完全に上皮化した内腔からなっていた。

よって、イヌモデルを用い、かつ結腸粘膜内壁組織の再生のためにＳＩＳ−ＥＣＭグラフトを用いたこれらの研究は、たとえばＵＣまたはＣＤなどのＩＢＤを処置するためにＥＣＭを用い得ることを実証するものである。

こうして本発明について説明したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、異なる実施形態であるようにみえるものが提供され得ることが明らかである。よって、上述の明細書は限定的な意味ではなく例示的なものとして解釈されることが意図される。

実施例２−結腸組織の置換のためのゲルＥＣＭの適用
本発明に従うと、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置のためにＥＣＭゲル組成物を用いることの実行可能性を、ラットにおいてインビボでテストできる。ラットは、たとえば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などのヒトＩＢＤに対するモデルとして確立されてもよく、デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍ：ＤＳＳ）を数日間飲料水に入れて適宜投与することによって、ラット結腸組織にＵＣを誘導できる。

適宜提供される飲料水にて２％ＤＳＳを７日間投与した後に食塩水洗浄を行うことによって、ラットに急性ＵＣを誘導できる。適宜提供される飲料水にて２％ＤＳＳを１回またはそれ以上の連続する７日の期間投与した後に通常の水を投与することによって、ラットに慢性ＵＣを誘導できる。

小腸粘膜下層（ＳＩＳ）に由来し、浣腸を介して結腸に導入されたゲル細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を用いて、ＵＣの処置を行ってもよい。ゲルＳＩＳ−ＥＣＭを１日１回またはそれ以上、少なくとも１週間、好ましくは最大約１ヵ月の期間にわたって投与してもよい。ＳＩＳ ＥＣＭに対する好ましい投薬計画は、１日１回３０日間の投与である。

ＥＣＭからのゲルの調製方法
小腸のセグメントからのＳＩＳの調製は、米国特許第４，９０２，５０８号、米国特許第５，２７５，８２６号、および米国特許第５，５１４，５３３号に詳述されており、それらの開示は本明細書において明確に引用により援用される。腸のセグメントは最初に、外側層（特に漿膜および筋層）および内側層（粘膜の内腔部分）の両方を除去するための長手方向の拭い取り運動を用いたアブレーションを受ける。典型的に、ＳＩＳを食塩水でリンスし、以下に記載されるとおりに使用するまで、水和または脱水状態で任意に保存する。

本流動化組成物は、前記組織を可溶化して実質的に均質な溶液を形成するために十分な期間、粘膜下層を粉砕するか、および／またはたとえばトリプシンもしくはペプシンなどのプロテアーゼによって消化することによって、腸粘膜下層の溶液または懸濁物として調製する。腸粘膜下層の出発材料を、引き裂き、切断、粉砕（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、および剪断などによって粉砕（ｃｏｍｍｉｎｕｔｅｄ）する。凍結または凍結乾燥状態の粘膜下層を粉砕することが好ましいが、粘膜下層の断片の懸濁物を高速（高剪断）ブレンダにおいて処理し、必要であれば遠心分離して余分な水分をデカントすることによって脱水することによっても、良好な結果を得ることができる。粉砕した腸粘膜下層を乾燥して粘膜下層粉末を形成してもよい。その後、その粘膜下層粉末を水和し、すなわち水または緩衝食塩水および任意にその他の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、２５℃にて約２ｃｐｓから約３００，０００ｃｐｓの粘度を有する流体として組織グラフト組成物を形成してもよい。より高粘度のグラフト組成物は、ゲルまたはペーストの粘稠度を有し得る。本組成物を、たとえば電離放射線への露出など、当該技術分野において認識される滅菌技術を用いて滅菌してもよい。

本発明の流動化粘膜下層は、最も典型的には外傷または疾患に誘導された組織欠損を直すための修復または増強を必要とする、たとえば軟部組織などの組織に対する注射用異種移植片としても使用できる。

ＳＩＳ懸濁物
上述のとおりに調製したＳＩＳ検体を、組織ハサミ、片刃カミソリ、またはその他の適切な切断器具を用いて任意の小片に刻むかまたは細断する。平底のステンレス鋼容器に検体を入れ、容器内に液体窒素を導入し、検体を凍結させて粉砕のために準備する。

次いで、凍結ＳＩＳ検体を粉砕して粗ＳＩＳ粉末を形成する。こうした処理は、たとえば凍結検体の頂部に置かれた円筒形の黄銅インゴットを伴う手動アーバープレスなどで行ってもよい。インゴットは、検体とプレスのアーバーとの間の界面の役割をする。ＳＩＳ検体の凍結を保つために、ＳＩＳ検体に液体窒素を周期的に加えてもよい。

本発明に従って使用可能なＳＩＳ粉末を生成するために、ＳＩＳ検体を粉砕するためのその他の方法を用いてもよい。たとえば、ＳＩＳ検体を凍結乾燥し、次いで手動アーバープレスまたはその他の粉砕手段を用いて粉砕してもよい。代替的には、ＳＩＳを高剪断ブレンダにおいて処理し、脱水および乾燥してＳＩＳ粉末を生成してもよい。

一貫した、より微細に分割された生成物を生成するために、予め冷却した乳鉢および乳棒を用いたＳＩＳ粉末のさらなる粉砕が用いられてもよい。ここでも、最終粉砕の際に固体凍結粒子を維持するために、必要に応じて液体窒素を用いる。たとえば緩衝食塩水などを用いてこの粉末を容易に水和して、本発明の流動化組織グラフト材料を所望の粘度にて生成できる。

ＳＩＳ溶液
ＳＩＳ粉末を金網でふるいにかけて、任意の便利な容器に入れる。次いで粉末をタンパク質消化して、実質的に均質な溶液を形成する。一実施形態においては、ＨＣｌでｐＨ２．５に調整した０．１Ｍ酢酸中で、１ｍｇ／ｍｌのペプシン（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、Ｍｏ．）によって、粉末を室温にて４８時間にわたり消化する。消化活性を不活性化するために、反応媒体を水酸化ナトリウムで中和する。次いで、可溶化した粘膜下層を溶液の塩析によって濃縮し、さらなる精製および／または凍結乾燥のために分離して、粉末形状のプロテアーゼ可溶化腸粘膜下層を形成してもよい。

本発明に従う流動化粘膜下層組成物の粘度は、粘膜下層成分の濃度および水和の程度を制御することによって操作できる。粘度は、２５℃にて約２ｃｐｓから約３００，０００ｃｐｓの範囲に調整できる。関節内適用または体腔内適用に対しては、低粘度粘膜下層組成物がより良く適応する。ＳＩＳ消化溶液のｐＨを約６．０から約７．０に調整することによって、こうした溶液からたとえばゲルなどの高粘度調合物を調製してもよい。シリンジまたはカテーテルを用いた皮下または筋肉内適用に対しては、粘膜下層懸濁物または粘膜下層消化溶液としての本組成物のゲル形状が典型的に好ましい。

加えて、ＳＩＳゲルは、０．１Ｎ ＮａＯＨ（消化溶液の体積の１／１０）および１０×ＰＢＳ ｐＨ７．４（消化溶液の体積の１／９）の適切な量を４℃にて混合することによってゲルに形成されることが記載されている。冷たい（４℃）１×ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いて溶液を所望の体積および濃度にして、ゲル化を起こすために３７℃のインキュベータに入れた。

ＥＣＭは、溶液中で４０分後にマトリックスを形成できた。ＥＣＭ由来のゲルは、２０℃未満の温度では液体だったが、温度を３７℃に上げるとゲルになる。

ＥＣＭからゲルを調製する際には、すべての溶液を氷上に保つべきであり、かつ本明細書においてその全体が引用により援用される米国特許第８，３６１，５０３号に従って、以下の変数を定める必要がある。
Ｃ_ｆ＝最終ゲルの濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｃ_ｓ＝ＥＣＭ消化溶液の濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｖ_ｆ＝実験のために必要な最終ゲル溶液の体積
Ｖ_ｄ＝ＥＣＭ消化溶液から必要な体積（ｍｌ）
Ｖ_１０Ｘ＝必要な１０×ＰＢＳの体積（ｍｌ）
Ｖ_１Ｘ＝必要な１×ＰＢＳの体積（ｍｌ）
Ｖ_ＮａＯＨ＝必要な０．１Ｎ ＮａＯＨの体積（ｍｌ）

最初に、必要なＥＣＭゲルの最終濃度（Ｃ_ｆ）および体積（Ｖ_ｆ）を定める。次いで、Ｃ_ｆ（ｍｇ／ｍｌ）＊Ｖ_ｆ（ｍｌ）を乗じることによって、必要なＥＣＭの質量を算出する。この値はＥＣＭ消化溶液から必要な体積（Ｖ_ｄ）を与えるものであり、ここでＶ_ｄ＝［Ｃ_ｆ（ｍｇ／ｍｌ）＊Ｖ_ｆ（ｍｌ）］／Ｃ_ｓである。

算出された体積Ｖ_ｄを９で割ることによって、必要な１０×ＰＢＳの体積を算出する（Ｖ_１０Ｘ＝Ｖ_ｄ／９）。算出された体積Ｖ_ｄを１０で割ることによって、必要な０．１Ｎ ＮａＯＨの体積を算出する（Ｖ_ＮａＯＨ＝Ｖ_ｄ／１０）。以下のとおりにして、溶液を適切な濃度／体積にするために必要な１×ＰＢＳの量を算出する：Ｖ_１Ｘ＝Ｖ_ｆ−Ｖ_ｄ−Ｖ_１０Ｘ−Ｖ_ＮＡＯＨ。ＥＣＭ消化（Ｖ_ｄ）を除くすべての試薬（Ｖ_１Ｘ＋Ｖ_ｄ＋Ｖ_１０Ｘ＋Ｖ_ＮＡＯＨ）を適切な容器（通常は１５ｍｌまたは５０ｍｌの遠心管）に加える。溶液を氷上に置き、常時氷上に保つ。

上記で調製したＰＢＳ／ＮａＯＨ混合物に、適切な体積のＥＣＭ消化溶液（Ｖ_ｄ）を加え、溶液中に気泡が生じるのを避けながら注意深く、１ｍｌマイクロピペットでよく混合する。ＥＣＭ消化溶液の粘度によっては、移行の際にかなりの体積損失が生じることがある。総体積をモニタし、最終体積に達するまで適切な量を追加する。このプレゲル溶液のｐＨを測定し、ここでｐＨは約７．４であるべきである。

プレゲル溶液を鋳型または適切なウェルに加える。鋳型またはウェルを３７℃のインキュベータに最低４０分間入れる。ＣＯ_２制御を伴うインキュベータを用いることは避ける。水分の蒸発が問題となるときは、鋳型をインキュベータに入れる前にプラスチックのジプロック方式の袋に入れる。ゲル化の後、ゲルを鋳型から取出して１×ＰＢＳ上に置いてもよい。組織培養プレート内でゲルを作製したときは、使用するまでゲルの水和を維持するために、１×ＰＢＳをゲルの頂部に置いてもよい。サンプルの算出：１０ｍｇ／ｍｌストック溶液から最終濃度６ｍｇ／ｍｌを有するゲル６ｍｌを作製する。

ＳＩＳ−ＥＣＭ投与手順
ＳＩＳ−ＥＣＭ溶液または懸濁物を、ＵＣ誘導ラットの結腸内に浣腸によって投与してもよい。グラフトの投与後に、宿主動物の拒絶反応、感染症、または異常な生理反応は予期されない。加えて、内視鏡および腹腔鏡を介して、溶液または懸濁物を結腸に投与してもよい。本発明の予期されない結果とは、ＳＩＳ溶液または懸濁物材料によって結腸粘膜の増強を達成できるような、適切な組織リモデリングの刺激であると考えられる。

本発明の流動化組成物は、組織の置換および修復をもたらすことができ、さらにＵＣを含むＩＢＤの処置または治癒をもたらすことができる。天然の結腸粘膜組織の再増殖を誘導するために、本方法に従って流動化粘膜下層組成物が用いられる。欠損組織の場所に有効量の流動化ＥＣＭ組成物を注射することによって、より侵襲的な外科技術を必要とせずに、生体栄養性（ｂｉｏｔｒｏｐｉｃ）の特性を実現できる。

特定の好ましい実施形態を参照しながら本発明を詳細に説明したが、以下の請求項に記載および定義されるとおりの本発明の趣旨および範囲内に変更形および修正形が存在する。

Claims (32)

1. 脊椎動物の下部腸管組織の状態もしくは疾患、または前記組織の損傷を処置、寛解、または治癒するための方法であって、前記方法は、前記疾患または損傷のある組織に幹細胞または前駆細胞を送達するか、あるいは前記幹細胞または前駆細胞の移動を刺激するステップを含むことによって、前記幹細胞または前駆細胞は、結腸切除なしに前記疾患または損傷のある組織の前記処置、寛解、または治癒をもたらすために、前記疾患または損傷のある組織の再構築組織リモデリングを提供する、方法。
2. 前記幹細胞または前駆細胞の前記送達は、前記幹細胞または前駆細胞を含む組成物を前記疾患または損傷のある組織の部位に直接適用することによるものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記幹細胞または前駆細胞の移動は、前記疾患または損傷のある組織の部位に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）グラフトまたは足場組成物を適用することによって刺激される、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＥＣＭは、小腸、大腸、および膀胱から選択される組織に由来するものである、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＥＣＭは、固体シートまたはチューブとしての送達のために調製される、請求項３に記載の方法。
6. 前記ＥＣＭは、溶液、懸濁物、およびゲルから選択される流体としての送達のために調製される、請求項３に記載の方法。
7. 前記ＥＣＭは、薬物または生物学的製剤をさらに含む、請求項３に記載の方法。
8. 前記流体ＥＣＭは内視鏡的に送達される、請求項６に記載の方法。
9. 前記下部腸組織は、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性大腸腺腫、ヒルシュスプルング病、狭窄、直腸炎、結腸もしくは直腸の癌、または瘻孔の結果として疾患または損傷を有する、請求項１に記載の方法。
10. 脊椎動物の下部腸管組織の状態もしくは疾患、または前記組織の損傷を処置、寛解、または治癒するための方法であって、前記方法は、
    ａ．小腸組織、大腸組織、および膀胱組織から選択される組織に由来する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）グラフトを調製するステップと、
    ｂ．前記疾患または損傷のある下部腸管組織に前記ＥＣＭグラフトを植込み、移植、投与、適用、または接着もしくは貼付けするステップと
    によって前記損傷または疾患のある組織を置換するステップを含むことによって、前記下部腸管組織に対する前記状態、疾患、または損傷は、結腸切除なしに再構築組織リモデリングによって処置、寛解、または治癒される、方法。
11. 前記状態、疾患、または損傷を示す前記組織は結腸である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記組織の状態、疾患、または損傷は、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性大腸腺腫、ヒルシュスプルング病、狭窄、結腸もしくは直腸の癌、直腸炎、または瘻孔によってもたらされたものである、請求項１０に記載の方法。
13. 前記ＥＣＭグラフト組成物は、シートまたはチューブの形の固体グラフトまたは足場として調製および送達される、請求項１０に記載の方法。
14. 前記ＥＣＭグラフト組成物は、流動化ゲル、溶液、または懸濁物として調製および送達される、請求項１０に記載の方法。
15. 前記ＥＣＭは浣腸によって送達される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＥＣＭは内視鏡的に送達される、請求項１４に記載の方法。
17. 前記ＥＣＭグラフトは、小腸粘膜下層（ＳＩＳ）に由来するものである、請求項１０に記載の方法。
18. 前記疾患または損傷のある下部腸管組織に前記ＥＣＭグラフトを植込み、移植、投与、適用、または接着もしくは貼付けするステップの前に、前記状態、疾患、または損傷を示す前記組織を切除またはアブレーションするステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
19. 前記切除またはアブレーションするステップは、内視鏡的粘膜切除を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記切除またはアブレーションするステップは、ＥＤＴＡ洗浄を含む、請求項１８に記載の方法。
21. 患者の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための方法であって、前記方法は、
    ａ）腸組織に由来する細胞外マトリックス組成物を提供するステップと、
    ｂ）疾患または損傷のある組織の、健康な下部腸組織によるインサイツ置換を誘導するために、ＩＢＤを示す前記患者の腸組織に前記組成物を適用または投与するステップと
    を含む、方法。
22. 前記ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎およびクローン病から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記細胞外マトリックス組成物の前記適用または投与は、結腸組織への幹細胞の移動を刺激し、前記幹細胞は、潰瘍性大腸炎またはクローン病を示す結腸粘膜組織の再構築組織リモデリングをもたらすようにインサイツで発達する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ＥＣＭグラフト組成物は、流動化ゲル、溶液、または懸濁物として調製される、請求項２１に記載の方法。
25. 前記ＥＣＭは固体シートまたはチューブである、請求項２１に記載の方法。
26. 前記ＥＣＭは、浣腸によって投与される溶液または懸濁物である、請求項２１に記載の方法。
27. 前記ＥＣＭは、内視鏡的に投与される溶液または懸濁物である、請求項２１に記載の方法。
28. 前記適用または投与ステップｂ）の前に、前記方法は、疾患または損傷のある結腸粘膜組織を切除またはアブレーションするステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
29. 前記切除するステップは、ＥＤＴＡを用いた内視鏡的粘膜切除（ＥＭＲ）またはアブレーションを含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記方法はさらに、
    ａ）前記患者に回腸瘻造設を行うステップと、
    ｂ）新たな結腸粘膜が形成または発達する間、完全静脈栄養を用いて前記患者に静脈内栄養供給するステップと
    からなる群より選択される任意のステップを含む、請求項２１に記載の方法。
31. 大腸粘膜を置換するためのグラフトとして用いるための組織特異的細胞外マトリックス組成物であって、前記組成物は下部腸組織に由来するものである、組織特異的細胞外マトリックス組成物。
32. 前記下部腸粘膜は結腸である、請求項２９に記載の組織特異的細胞外マトリックス組成物。
    
    

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