CN102605062A - 用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102605062A
CN102605062A CN2012100591784A CN201210059178A CN102605062A CN 102605062 A CN102605062 A CN 102605062A CN 2012100591784 A CN2012100591784 A CN 2012100591784A CN 201210059178 A CN201210059178 A CN 201210059178A CN 102605062 A CN102605062 A CN 102605062A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
affinity tag
sample
patient
wfdc2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012100591784A
Other languages
English (en)
Inventor
J·E·莫哈汉
S·赫尔施
D·L·安德森
W·O·恩德格
D·福特
K·格拉特
B·O·戈尔巴切瓦
S·卡马特卡
Y·徐
M·甘纳瓦拉普
X·赵
R·施莱格尔
M·默滕斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
THOUSAND YEARS MEDICAMENTS Inc
Millennium Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
THOUSAND YEARS MEDICAMENTS Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by THOUSAND YEARS MEDICAMENTS Inc filed Critical THOUSAND YEARS MEDICAMENTS Inc
Publication of CN102605062A publication Critical patent/CN102605062A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法。本发明还涉及与乳腺癌相关的核酸分子和蛋白。

Description

用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法
本申请是申请日为2004年5月26日的中国专利申请200480022456.2“用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法”的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年5月29日提交的美国临时申请号60/474,281和2004年3月23日提交的美国临时申请号60/555,557的权益，其内容在此引入作为参考。
技术领域
本发明的领域是乳腺癌，包括乳腺癌的诊断、鉴定、处理和治疗。
背景技术
在美国以及实际上在世界范围内报告的癌症病例增加的数量都备受关注。当前对于特定类型癌症仅有少数几种治疗方法有效，并且无法提供绝对成功的保证。为使疗效最好，这些治疗方法不仅需要对恶性肿瘤早期检测，还需要对恶性肿瘤的严重程度进行可靠的评估。
乳腺癌是女性中第一位的致死原因，其发病率在过去三十年中在美国逐渐增加。在1997年，估计在美国报道了181,000个新病例，44,000人死于乳腺癌(Parker et al.，1997，CA Cancer J.Clin.47：5-27；Chu etal.，1996，J.Nat.Cancer Inst.88：1571-1579)。尽管乳腺癌的发病机理还不清楚，正常的乳腺上皮转化为恶性表型可能是由于遗传因素，特别是在30岁以下的女性中更是如此(Miki et al.，1994，Science，266：66-71)。BRCA1和BRCA2的发现和鉴定最近扩展了我们对于可以导致家族性乳腺癌的遗传因素的了解。这两个基因座内的种系突变与50-85％的终生乳腺和/或卵巢癌风险有关(Casey，1997，Curr.Opin.Oncol.9：88-93；Marcus et al.，1996，Cancer 77：697-709)。但是，很可能其它的非遗传因素也对该疾病的病因学具有显著的影响。无论其来源如何，如果没有在其进展的早期被检测到，乳腺癌的发病率和死亡率都显著增加。因此，针对乳腺组织中的细胞转化和肿瘤形成的早期检测进行了相当多的努力。
目前，鉴定乳腺癌的主要方式是通过检测致密的肿瘤组织的存在。这可以通过在乳腺外直接检查或通过乳腺X线照像或其它X线成像方法而以不同的有效程度完成(Jatoi，1999，Am.J.Surg.177：518-524)。但是，后一种方法常常付出一定代价。每次进行乳腺X线照像，患者招致患乳腺肿瘤的小的风险，该肿瘤由试验过程中使用的辐射的离子化特性诱导。此外，该方法是昂贵的，技术人员的主观解释可以导致不准确，如，一项研究表明，由一组进行检查的放射学家分别解释的一组乳腺X线照片中，约三分之一有主要的临床不一致。此外，很多女性发现进行乳腺X线照像是痛苦的经历。因此，国家癌症研究所不推荐对50岁以下的女性进行乳腺X线照像，因为这组人群不象更年老的女性那样容易发生乳腺癌。但是，必须注意到，尽管仅仅约22％的乳腺癌发生在50岁以下的女性，但数据表明，乳腺癌在绝经前女性中更迅速发展。
因此，提供用于诊断、分期、预后、监测和治疗与乳腺癌相关的疾病的特定方法和试剂，或者指出对所述疾病的易患病体质以便采用预防措施是有益的。
发明内容
本发明涉及癌标记物(在下文中“标记物”或“本发明的标记物”)，其列于表1和表2中。本发明提供了核酸和由标记物编码或相当于标记物的蛋白(在下文中分别为“标记物核酸”的“标记物蛋白”)。本发明进一步提供了与所述蛋白和/或该标记物蛋白片段特异结合的抗体、抗体衍生物和抗体片段。
本发明也涉及用于诊断、分期、预后、监测和治疗乳腺癌的各种方法、试剂和试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供了一种评估是否患者患乳腺癌或对于发展为乳腺癌具有较正常更高的危险的诊断方法，包括比较患者样品中至少一种本发明标记物的表达水平和对照，如来自不患乳腺癌的患者中所述标记物的正常表达水平。与正常水平比较，患者样品中所述标记物的表达水平提高表明所述患者患乳腺癌或具有发生乳腺癌的危险。
在另一种实施方案中，本发明提供了评估患者是否患有生长迅速的乳腺肿瘤或是否容易发生生长迅速的乳腺肿瘤，包括比较患者样品中至少一种本发明标记物的表达水平和患有生长缓慢的乳腺肿瘤或无乳腺肿瘤的受试者样品中的标记物表达水平。标记物的表达水平升高可表明生长迅速的乳腺癌。
因此，本发明的方法可以用于鉴定发生乳腺癌的危险升高的患者(如具有乳腺癌家族史的患者、鉴定为具有突变的癌基因的患者)。该方法也是用于评估患者是否患有生长迅速的乳腺癌或是否容易发生生长迅速的乳腺癌的有用的诊断方法。
本发明的方法也可以用于预测乳腺癌的特定分期，以及评估癌症是否转移(如转移到淋巴结)。此外，本发明的方法也可以用于预测患有乳腺癌的患者，或进行治疗以根除乳腺癌的患者的临床结局。此外，本发明的方法也用于评估乳腺癌患者的疗效(如化疗效果)。
根据本发明，选择标记物，以便本发明方法的阳性预测值为至少约10％，优选约25％，更优选约50％以及最优选约90％。本发明的以下实施方案也是优选的，其中与正常非乳腺癌患者相比，在至少约15％的乳腺癌患者(如0期乳腺癌患者，I期乳腺癌患者，IIA期乳腺癌患者，IIB期乳腺癌患者，IIIA期乳腺癌患者，IIIB期乳腺癌患者，IV期乳腺癌患者，I级乳腺癌患者，II级乳腺癌患者，III级乳腺癌患者，恶性乳腺癌患者，导管癌乳腺癌患者，和小叶癌乳腺癌患者，以及任何其它类型的与乳腺相关的癌、恶性肿瘤和转化)中所述标记过量表达至少5倍。
一方面，提供了一种评估患者是否患乳腺癌的诊断方法(如，新的检测“筛选”，复发的检测，反射测定)。所述方法包括比较患者样品中的至少一种表1所列的标记物的表达水平和不具有乳腺癌的对照受试者中所述标记物的表达水平。与对照受试者中的水平相比，患者样品中标记物明显更高的表达水平表明该患者患乳腺癌。
本发明也提供了用于评估患者是否患生长迅速的乳腺癌的诊断方法，包括步骤：
确定患者样品中至少一种标记物的表达水平，其中所述标记物选自表2中列出的标记物；
确定具有生长缓慢的乳腺肿瘤或无乳腺肿瘤的对照受试者的样品中所述标记物的表达水平；和
比较患者样品和对照受试者样品中的标记物表达水平。与对照受试者样品中的水平相比，患者样品中标记物显著更高的表达水平表明该患者患有生长迅速的乳腺癌或容易发生生长迅速的乳腺肿瘤。患者样品和对照样品间表达无差异，或患者样品中显著更低的表达水平表明患者具有生长缓慢的乳腺癌。
本发明进一步提供了用于评估患者是否患已经转移的或容易转移的乳腺癌的诊断方法，该方法包括比较患者样品中的至少一种表2所列的标记物的表达水平和患有非转移的乳腺肿瘤或无乳腺肿瘤的对照受试者样品中所述标记物的表达水平。与对照受试者样品中的水平相比，患者样品中显著更高的表达水平表明乳腺癌已经转移或容易转移。
在另一种实施方案中，本发明包括用于确定患者是否患已经转移到淋巴结或容易转移到淋巴结的乳腺癌的诊断方法，该方法包括比较患者样品中的表2所列的标记物的表达水平和患有非转移的乳腺肿瘤或无乳腺肿瘤的对照受试者样品中的表达水平。与对照受试者样品中的水平相比，患者样品中显著更高的表达水平表明乳腺癌已经转移到淋巴结或容易转移到淋巴结。
本发明还提供了用于预测乳腺癌患者的临床结局的方法，包括比较患者样品中的至少一种表2所列的标记物的表达水平和具有良好临床结局的对照受试者(如具有大于5年的无病存活水平的以前的乳腺癌患者)样品中所述标记物的表达水平。与对照受试者样品中的表达水平相比，患者样品中显著更高的表达水平表明患者具有不良的结局(如小于三年的无病存活)。
本发明还提供了用于评估抑制患者中的乳腺癌的疗效的方法。所述方法包括比较在给患者提供至少一部分治疗之前从患者获得的第一样品中至少一种本发明标记物的表达和在提供该部分治疗之后从患者获得的第二样品中所述标记物的表达。相对于第一样品，第二样品中显著更低的标记物表达水平表明该治疗对于抑制患者中的乳腺癌是有效的。
可以理解的是在这些方法中，所述“治疗”可以是任何用于治疗乳腺癌的疗法，包括，但不限于，化疗、放疗、肿瘤组织的手术切除、基因治疗和生物学治疗如给予抗体及趋化因子。因此，本发明的方法可用于评估治疗前、治疗中和治疗后的患者，例如，用于评估肿瘤负荷的减少。
在一个优选实施方案中，所述方法涉及使用化学或生物试剂的治疗。这些方法包括比较获得自患者并且在存在化学或生物试剂条件下保持的第一样品中至少一种本发明标记物的表达和获得自患者并且在不存在所述试剂条件下保持的第二样品中所述标记物的表达。相对于第一样品，第二样品中标记物明显更低的表达水平表明所述试剂能有效用于抑制患者中的乳腺癌。在某些实施方案中，所述第一和第二样品可以是获得自患者的单个样品的部分或是获得自患者的合并样品的部分。
本发明还提供了用于评估患者中乳腺癌的进展的监测方法，该方法包括：
在第一时间点检测来自患者的样品中至少一种本发明标记物的表达；
在后续的时间点重复表达步骤的检测；和
比较在第一和第二个检测步骤中检测到的表达水平，从而监测患者中乳腺癌的进展。后续时间点时样品中标记物表达水平相对于第一时间点样品中标记物表达水平显著更高，表明乳腺癌在患者中进展，而显著更低的表达水平表明乳腺癌消退。在一个实施方案中，在第一时间点和后续时间点之间患者进行了手术以去除肿瘤。
本发明还提供了用于选择抑制患者中的乳腺癌的候选组合物的方法。该方法包括以下步骤：
从患者获得包含癌细胞的样品；
在至少一种受试组合物的存在下分别保持至少一种来自患者的包含癌细胞的样品；
比较每个等分样品中至少一种本发明标记物的表达；和
选择一种受试组合物作为用于抑制乳腺癌的候选组合物，其中相对于其它受试组合物存在下标记物的表达水平，该组合物显著降低至少一种本发明标记物在含有受试组合物的等分样品中的表达水平。
本发明还提供了用于评估化合物的致乳腺癌潜能的测试方法。该方法包括以下步骤：在化合物存在或不存在的条件下保持乳腺细胞的分离的等分样品；并且比较每个等分样品中本发明标记物的表达。相对于不存在化合物的条件下保持的等分样品中标记物的表达水平，化合物存在的条件下标记物的表达水平显著更高，说明化合物具有致乳腺癌的潜能。
另外，本发明进一步提供了抑制患者乳腺癌的方法。该方法包括以下步骤：
从患者获得包含癌细胞的样品；
在受试组合物的存在下分别保持至少一种来自患者的包含癌细胞的样品；
比较每个等分样品中至少一种本发明标记物的表达；和
鉴定一种组合物作为用于乳腺癌的抑制剂，其中相对于其它组合物存在下标记物的表达水平，该组合物显著降低本发明标记物在含有组合物的等分样品中的表达水平；和
给患者施用至少一种鉴定出的作为乳腺癌抑制剂的组合物。
根据本发明，例如，可以通过检测样品中以下物质的存在而评估样品中本发明的标记物的表达水平：
相应的标记物蛋白(如具有以下任一序列的蛋白：SEQ ID NO：2，SEQID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ IDNO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：96)或蛋白的片段(如，通过使用特异性结合于蛋白或蛋白片段的试剂，如抗体、抗体衍生物、抗体片段或单链抗体)；
相应的标记物核酸(如具有以下任一序列的核苷酸转录物(如SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93和SEQID NO：95)，或其互补序列)，或核酸的片段(例如通过使获得自样品的转录的多核苷酸与固定了具有以下任一序列的全部或片段的一种或多种核酸的基质相接触(如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ IDNO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ IDNO：91，SEQ ID NO：93，和SEQ ID NO：95))，或其互补序列，或由相应的标记物蛋白直接产生(即，催化的)的代谢物。
根据本发明，使用或检测多种(如，2、3、5或10或更多)乳腺癌标记物，包括提供的本发明标记物和本领域已知的其它乳腺癌标记物的组合，执行任一前述方法。在所述方法中，将样品中多种标记物的每一种标记物的表达水平与获得自对照的不患乳腺癌的人样品中同类型多种标记物的每一种标记物的正常表达水平比较，多种标记物中至少一种标记物是本发明的标记物。相对于标记物的相应正常或对照水平，样品中一或多种本发明标记物或它们某些组合的表达水平明显改变(即，在上述使用单标记物的方法中所规定的增加或减少)，表明患者患乳腺癌。对于所有前述方法，优选选择标记物，以便该方法的阳性预测值为至少约10％。
在另一方面，本发明提供了与标记物蛋白(如具有以下任一序列的蛋白：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，和SEQ ID NO：96)或蛋白片段特异性结合的抗体、抗体衍生物、或抗体片段。所述方法包括用包含标记物蛋白(如具有以下任一序列的蛋白：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ IDNO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，和SEQ ID NO：96)的完整序列，或10个或更多个氨基酸的片段的蛋白或肽免疫哺乳动物，其中所述蛋白或肽可以获得自细胞或通过化学合成获得。本发明的方法也包括生产单克隆和单链抗体，其中可进一步包括从免疫的哺乳动物中分离脾细胞，将分离的脾细胞与无限增殖化细胞系融合以形成杂交瘤，以及筛选那些能产生特异性结合标记物蛋白或所述蛋白片段的抗体的各个杂交瘤。
在另一方面，本发明涉及各种诊断和测试试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供一种用于评估患者是否患乳腺癌的试剂盒。在另一方面，所述试剂盒可以用于评估患者是否具有发生乳腺癌的危险。所述试剂盒包含用于评估至少一种本发明标记物表达的试剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于评估是否患生长迅速的乳腺癌的试剂盒。所述试剂盒包含用于评估至少一种本发明标记物表达的试剂。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于评估化学或生物试剂抑制患者中的乳腺癌的适用性的试剂盒。所述试剂盒包含用于评估至少一种本发明标记物表达的试剂，并且也可以包含一种或多种所述这样的化学或生物试剂。在更进一步实施方案中，本发明提供了用于评估乳腺癌细胞存在或治疗乳腺癌的试剂盒。所述试剂盒包含抗体、抗体衍生物或抗体片段，其特异性结合标记物蛋白或所述蛋白的片段。所述试剂盒也可包含多种抗体、抗体衍生物或抗体片段，其中所述多种所述抗体试剂特异性结合标记物蛋白或所述蛋白的片段。
在另外一个实施方案中，本发明也提供了一种用于评估乳腺癌细胞存在的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种核酸探针，其特异性结合至少一种标记物核酸或所述核酸的片段。所述试剂盒也可包含多种探针，其中每种探针特异性结合标记物核酸或所述核酸的片段。
在另一方面，本发明涉及用于治疗患乳腺癌或具有发生乳腺癌危险的患者的方法。上述方法可包含减少至少一种本发明标记物表达和/或干扰其生物学功能。在一个实施方案中，所述方法包含提供给患者标记物核酸或其片段的反义寡核苷酸或互补多核苷酸。例如，通过载体递送提供给患者反义多核苷酸，所述载体表达标记物核酸或其片段的反义多核苷酸。在另一个实施方案中，所述方法包含提供给患者抗体、抗体衍生物或抗体片段，其特异性结合标记物蛋白或所述蛋白的片段。在一个优选实施方案中，所述抗体、抗体衍生物或抗体片段特异性结合具有以下序列的蛋白SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ IDNO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，和SEQ ID NO：96，或所述蛋白的片段。
可以理解的是本发明的方法和试剂盒也可包括已知的癌标记物，包括已知的乳腺癌标记物。可更进一步理解所述方法和试剂盒可用于鉴定除乳腺癌之外的其它癌症。
本发明的另一方面涉及编码标记物蛋白或标记物多核苷酸，如标记物蛋白的生物活性部分的核酸分子。在一个优选实施方案中，分离的核酸分子编码具有以下氨基酸序列的标记物多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ IDNO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：96。在另一实施方案中，本发明提供分离的标记物核酸分子，其具有以下任一序列所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ IDNO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：95。在另一实施方案中，本发明提供与以下序列所示的核苷酸序列基本等同的核酸分子(如天然存在的等位基因变体)：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ IDNO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQID NO：93，或SEQ ID NO：95。在其它实施方案中，本发明提供在此处描述的严格杂交条件下与包含以下核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ IDNO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ IDNO：93，和SEQ ID NO：95，其中所述核酸编码全长标记物蛋白或其活性片段。
在一个相关的方面，本发明进一步提供了包含此处描述的标记物核酸分子的核酸构建体。在某些实施方案中，本发明的核酸分子与天然或异源调节序列操作性连接。还包括包含本发明的标记物核酸分子的载体和宿主细胞，如适于生产多肽的载体和宿主细胞。
在另一个相关的方面，本发明提供了适于作为用于检测编码标记物的核酸的引物或杂交探针的核酸片段。
在另一个相关的方面，提供了反义于编码标记物的核酸分子的分离的核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了标记物多肽，如具有以下序列所示氨基酸序列的标记物多肽：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQID NO：92，SEQ ID NO：94，和SEQ ID NO：96；与以下序列所示氨基酸序列基本等同的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ IDNO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，和SEQ ID NO：96；或由具有与包含以下核苷酸序列的核酸分子在此处描述的严格杂交条件下杂交的核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ IDNO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，和SEQ ID NO：95，其中所述核酸编码全长标记物蛋白或其活性片段。
在一个相关的方面，本发明进一步提供了包含此处描述的多肽分子的蛋白或肽构建体。在某些实施方案中，本发明的标记物多肽或片段与天然或异源非标记物多肽序列操作性连接以形成融合蛋白序列。
在另一方面，本发明涉及与标记物多肽反应，或更优选与标记物多肽特异性或选择性结合的抗体及其抗原结合片段。
具体实施方式
本发明涉及新发现的列于表1的与乳腺细胞的癌状态相关的乳腺癌标记物。已经发现这些标记物的任一个或这些标记物组合表达水平高于它们正常表达水平，与患者中乳腺癌相关。此外，本发明还涉及新发现的列于表2的与乳腺细胞的癌状态相关的乳腺癌标记物。已经发现这些标记物的任一个或这些标记物组合表达水平高于它们正常表达水平，与患者中乳腺癌的生长迅速相关。
提供了用于检测样品中乳腺癌存在、样品中乳腺癌不存在、乳腺癌分期、评估乳腺癌是否转移、预测乳腺癌患者的临床结局，以及检测与在患者中预防、诊断、鉴定和治疗乳腺癌相关的乳腺癌其它特征的方法。也提供了治疗乳腺癌的方法。
表1列出了与非乳腺癌患者样品(如非乳腺癌患者样品、非癌性乳腺细胞、其它非乳腺癌患者样品)相比，在乳腺癌患者样品中超量表达的本发明的标记物。表1列出了在筛选乳腺癌的存在中特别有用的标记物(“筛选标记物”)。表2列出了与正常样品(如结局好的乳腺癌患者样品、非乳腺癌患者样品、非癌性乳腺细胞)相比，在结局差的乳腺癌患者样品中超量表达的本发明的标记物。表2列出了在评估乳腺癌分期中特别有用的标记物(“分期标记物”)。表1和表2提供了由每个标记物编码或相应于每个标记物的核苷酸转录物的cDNA序列和蛋白的氨基酸序列的序列表标识符。表1鉴别了本发明的标记物(SEQ ID NOS：1-66)，表2鉴别了本发明的标记物(SEQ ID NOS：67-96)，给它们指定了名称(“标记物”)，如果可行，基因的名称(“基因名称”)通常是通过由标记物编码或相应于标记物的核苷酸转录物的cDNA序列的序列表标识符(“SEQ ID NO(nts)”)、由核苷酸转录物编码的蛋白的氨基酸序列的序列表标识符(“SEQ ID NO(AAs)”)、和蛋白编码序列在cDNA序列中的位置(“CDS”)而了解的。
表1.乳腺癌筛选标记物
Figure BSA00000681163300141
表2.乳腺癌分期标记物
Figure BSA00000681163300151
定义
在本文中使用时，下列每个术语具有与在该段落中其定义相关的含义。
本文中所用的冠词“一种”和“一个”指一种或多于一种(即，至少一种)的本文中语法上的对象。作为例子，“一种元件”指一种元件或多于一种元件。
“标记物”是一种基因，与其在正常或健康组织或细胞中表达水平相比，在组织或细胞中其改变的表达水平与疾病状态相关，例如与癌症相关。“标记物核酸”是一种本发明标记物编码的或相应于本发明标记物的核酸(如，mRNA，cDNA)。上述标记物核酸包括DNA(如，cDNA)，所述DNA包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：95的任一序列的完整或部分序列或所述序列的互补序列。记物核酸也包括RNA，所述RNA包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：95的任一序列的完整或部分序列或所述序列的互补序列，其中用尿嘧啶残基取代所有的胸腺嘧啶残基。“标记物蛋白”是本发明的标记物编码的或相应于本发明标记物的蛋白。标记物蛋白包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，和SEQ ID NO：96的任一序列的完整或部分序列。术语“蛋白”和“多肽”可交换使用。
“标记物组”指多于一个标记物的组。
术语“探针”指任何分子，其能选择性结合特别指定的靶分子，例如，核苷酸转录产物或本发明标记物编码的或相应于本发明标记的蛋白。探针可由本领域技术人员合成，或来自合适的生物制品。为达到检测靶分子的目的，可特别设计带标记的探针，如本文中所描述的。能用作为探针的分子的例子包括，但不限于，RNA、DNA、蛋白、抗体和有机分子。
此处使用的“乳腺癌”包括癌(如原位癌、侵入性癌、转移癌)和癌前状况。
“乳腺相关的”体液是一种液体，当其在患者体内时，接触或经过乳腺细胞，或从乳腺细胞脱落的核酸或蛋白能够通过所述细胞。乳腺相关的体液的例子包括血液、淋巴液、囊液、和乳头穿刺液。
“样品”或“患者样品”包含从患者获得的细胞，如肿块活检、体液，包括血液、淋巴液、囊液、和乳头穿刺液。在进一步的实施方案中，患者样品是体外的。
标记物的“正常”表达水平是在人受试者或不患乳腺癌患者的乳腺细胞中所述标记物的表达水平。
标记物的“超量表达”或“显著更高水平的表达”是指在测试样品中的表达水平高于用于评估表达的试验的标准误，和较对照样品(如，来自不具有所述标记物相关疾病的健康受试者的样品)中所述标记物表达水平以及优选地，在一些对照样品中所述标记物的平均表达水平，优选至少高两倍，和更优选高3、4、5或10倍。
标记物的“显著更低水平的表达”指在测试样品中的表达水平较对照样品(如，来自不具有所述标记物相关疾病的健康患者的样品)中所述标记物表达水平以及优选地，在一些对照样品中所述标记物的平均表达水平，至少低两倍，和更优选低3、4、5或10倍。
在本文中使用，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接于所述启动子/调节序列的基因产物表达所必需的核酸序列。在一些例子中，所述序列可以是核心启动子序列以及在其它例子中，所述序列也可包括增强子序列和基因产物表达所必需的其它调控元件。例如，所述启动子/调节序列可以是一种以组织特异性方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子是一种核苷酸序列，当其可操作地与编码或规定基因产物的多核苷酸连接时，在所述细胞大多数或所有的生理条件下，导致在活的人细胞中产生所述基因产物。
“诱导型”启动子是一种核苷酸序列，当其可操作地与编码或规定基因产物的多核苷酸连接时，仅当相应于所述启动子的诱导剂在所述细胞中存在时，才导致在活的人细胞中大量产生所述基因产物。
“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列，当其可操作地与编码或规定基因产物的多核苷酸连接时，仅在如果所述细胞是相应于所述启动子的组织类型的细胞条件下，才导致在活的人细胞中大量产生所述基因产物。
“转录的多核苷酸”或“核苷酸转录物”是一种多核苷酸(如，mRNA、hnRNA、cDNA或上述RNA或cDNA的类似物)，其与成熟mRNA的全部或部分互补或同源，所述成熟mRNA由本发明的标记物转录以及正常的转录后加工(如，剪接)所产生，如果存在，由RNA转录物的转录，以及RNA转录物的反转录产生。
“互补的”指在两个核酸链区之间或在同一个核酸链两个区之间序列互补的广泛概念。已知第一核酸区的腺嘌呤残基能与第二核酸区的残基形成特定的氢键(“碱基配对”)，如果第二核酸区的残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，第二区对于第一区是反向平行的。相似地，已知第一条核酸链的胞嘧啶残基能与第二条核酸链的残基碱基配对，如果第二条链的残基是鸟嘌呤，第二条链对于第一条链是反向平行的。如果，当所述两个区排列为反向平行方式时，核酸的第一区与同样或不同的核酸组成的第二区互补，至少一个第一区的核苷酸残基能与第二区的残基碱基配对。优选地，第一区包含第一部分并且第二区包含第二部分，由此，当第一和第二部分以反向平行方式排列时，至少约50％，和优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的第一部分中的核苷酸残基能与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分中的所有核苷酸残基能与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
本文中所使用的“同源的”指在同一个核酸链两个区之间或在两个不同核酸链的区之间的核苷酸序列相似性。当在两个区中核苷酸残基位置被同样的核苷酸残基所占据时，那么在该位置上这两个区是同源的。如果每个区的至少一个核苷酸残基位置被同样的核苷酸残基所占据，第一区与第二区是同源的。根据这两个区中被同样的核苷酸残基所占据的核苷酸残基位置的比例表示两个区之间的同源性。作为例子，具有核苷酸序列5′-ATTGCC-3′的区和具有核苷酸序列5′-TATGGC-3′的区具有50％同源性。优选地，第一区包含第一部分和第二区包含第二部分，由此，至少约50％，和优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的每个部分的核苷酸残基位置被同样的核苷酸残基所占据。更优选地，每个部分的所有核苷酸残基位置都被同样的核苷酸残基所占据。
如果分子与基质共价或非共价相连，该分子“固定”或“附着”于基质，上述基质可用流体(如，标准柠檬酸盐水，pH7.4)冲洗，所述分子的主要部分没有从基质上解离。
当在本文中所用时，“天然存在的”核酸分子指具有在自然界中发现的生物体中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如果癌症的至少一种症状减轻、终止、减缓或阻止，该癌症被“抑制”。在本文中使用时，如果乳腺癌的复发或转移减少、减缓、延迟或阻止，其也被“抑制”。
试剂盒是任何一种产品(如，包装或容器)，其包含至少一种试剂，如探针，用于特异性检测本发明标记物的表达。该试剂盒可以单位的形式推广、分发或出售用于执行本发明的方法。
“本发明的蛋白”包含标记物蛋白及其片段；标记物蛋白变体及其片段；包含标记物或标记物蛋白变体至少15个氨基酸的片段的肽和多肽；和包含标记物或标记物蛋白变体，或标记物或标记物蛋白变体至少15个氨基酸的片段的融合蛋白。
除非在本文中另有规定，术语“抗体”广泛地包含了天然存在的抗体形式(如，IgG，IgA，IgM，IgE)和重组抗体，如单链抗体、嵌合和人源化抗体以及多特异性抗体，也包括前述所有抗体的片段和衍生物，该片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体缀合的蛋白或化学部分。
本发明部分基于新鉴定的标记物，与它们在正常的(即，非癌)乳腺细胞中表达相比，所述标记物在乳腺癌细胞中超量表达。在本文中乳腺细胞中一或多种这些标记物增强的表达与组织的癌状态相关。本发明提供了用于评估乳腺细胞(如，获得自人细胞、培养的人细胞、存档或保藏的人细胞和体内细胞)癌状态和治疗患乳腺癌的患者的组合物、试剂盒和方法。
本发明所述的组合物、试剂盒、和方法具有如下用途，包括：
评估患者乳腺癌的状况；
评估患者乳腺癌的分期；
评估患者乳腺癌的分级；
评估患者乳腺癌的良性或恶性性质；
评估患者乳腺癌的转移可能；
确定乳腺癌是否转移到了淋巴结；
预测乳腺癌患者的临床结局；
评估患者是否患乳腺癌；
评估患者乳腺癌相关的赘生物的组织学类型；
制备用于治疗乳腺癌和/或评估患者是否患乳腺癌的抗体、抗体片段或抗体衍生物；
评估乳腺癌细胞的存在；
评估用于抑制患者乳腺癌的一种或多种受试化合物的效力；
评估用于抑制患者乳腺癌的治疗的有效性；
监测患者乳腺癌的进展；
选择用于抑制患者乳腺癌的组合物或治疗；
治疗患乳腺癌的患者；
抑制患者乳腺癌；
评估受试化合物的乳腺致癌潜力；和
预防具有发生乳腺癌危险的患者乳腺癌的起病。
因此，本发明包括评估患者是否患乳腺癌的方法。该方法包含比较患者样品中本发明标记物(列于表1)的表达水平和对照，如非乳腺癌样品或非癌的正常样品中所述标记物的正常表达水平。与正常表达水平相比，患者样品中标记物明显更高的表达水平表明该患者患乳腺癌。
本发明还提供了评估患乳腺癌的患者中乳腺癌细胞的生长迅速性的方法。该方法包含比较患者样品中本发明标记物(列于表2)的表达水平和对照，如非乳腺癌样品或生长缓慢的乳腺癌样品中所述标记物的正常表达水平。与正常表达水平相比，患者样品中标记物明显更高的表达水平表明该患者患生长迅速的乳腺癌。
本发明也提供了含有核酸和多肽的基因送递载体、宿主细胞和组合物(所有本文中描述的)，所述核酸包含任一本发明的序列(如SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：61，SEQ ID NO：63，和SEQ ID NO：65)的全部、或15个或更多核苷酸的片段，或上述序列的互补序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQID NO：92，SEQ ID NO：94，和SEQ ID NO：96的任一序列的全部、或10个或更多氨基酸的片段。
如本文所述，患者乳腺癌与本发明一种或多种标记物增加的表达水平相关。虽然，如上所讨论，其中一些表达水平改变是由于乳腺癌的发生，其它一些改变诱导、保持并促进乳腺癌细胞的癌状态。因此，可通过减少和/或干扰标记物表达和/或所述标记物编码蛋白的功能来抑制通过一种或多种本发明标记物表达水平增加而鉴定的乳腺癌。
通常在本领域中已知许多方法可抑制本发明标记物的表达。例如，给乳腺癌细胞提供RNA干扰寡核苷酸或反义寡核苷酸以抑制标记物的转录、翻译或这两者。另一方面，编码能特异性结合标记物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且可操作地与合适的启动子/调控区连接的多核苷酸，能提供给细胞以产生能抑制标记物蛋白功能或活性的细胞内抗体。也可通过用能特异性结合标记物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理乳腺癌细胞来抑制标记物表达和/或功能。使用本文中描述的方法，能筛选多种分子，特别是包括足够小的以致能穿过细胞膜的分子，以鉴定能抑制标记物表达或抑制标记物蛋白功能的分子。给患者提供如此鉴定的化合物以抑制患者的乳腺癌细胞。
任何本发明的标记物或标记物组合，也包括任何与本发明标记物组合的已知的标记物，可用于本发明的组合物、试剂盒和方法中。一般而言，优选使用在乳腺癌细胞中标记物表达水平和在正常乳腺细胞中相同标记物表达水平之间差异尽可能大的标记物。尽管该差异可小到用于评估该标记物表达的方法的检测极限，但是优选该差异至少大于该评估方法的标准误，以及优选较正常乳腺组织中相同标记物的表达水平至少2-，3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-，10-，15-，20-，25-，100-，500-，1000-倍或更大的差异。
认为某些标记物蛋白从乳腺细胞(即，正常和癌细胞的一种或两者)分泌到围绕着细胞的胞外间隙。这些标记物优选用于本发明的组合物、试剂盒和方法的某些实施方案中，由于在乳腺相关的体液样品中能检测到上述标记物蛋白的事实，较组织的组织活检样品，这些标记物能更容易地收集自人类患者。另外，优选用于检测标记物蛋白的体内技术，包括将抗该蛋白的标记的抗体导入患者体内。例如，可用放射性标记物标记抗体，可通过标准成像技术检测受试者体内该放射性标记物的存在和位置。
对于本领域技术人员而言，测定任何特殊标记物蛋白是否是分泌蛋白是一件简单的事情。为进行该测定，标记物蛋白表达在，例如，哺乳动物细胞中，优选人乳腺细胞系中，收集细胞外液，评估在细胞外液中存在或不存在标记物蛋白(如，使用特异性结合该蛋白的标记的抗体)。
接下来是一种用于检测蛋白分泌的方法的例子。在5％(v/v)CO2，95％空气气氛中，在含有生长培养基(补充有10％胎牛血清的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基{DMEM})的加样孔中，约8x105 293T细胞在37℃下温育至约60-70％汇合。接着用每孔中含有2微克包含编码蛋白的表达载体的DNA和10微升LipofectAMINETM(GIBCO/BRL目录号18342-012)的标准转染混合物转染细胞。转染混合物保持约5小时，接着用新鲜的培养液更换并保持在空气气氛中。每个孔用不含有甲硫氨酸或半胱氨酸的DEME(DMEM-MC；ICN目录号16-424-54)轻轻地冲洗两次。在每个孔中加入约1微升的DMEM-MC和约50微居里的Trans-35STM试剂(ICN目录号51006)。加样孔保持在上述的5％CO2气氛中并在37℃下温育选定的一段时间。温育后，除去150微升的条件培养基并离心除去漂浮细胞和碎片。在上清液中标记物蛋白的存在表明该蛋白被分泌。用于检测分泌的蛋白的其它和替代的方法是本领域公知的，并且可以用于补充或替代该方法。
应该理解的是含有乳腺细胞的患者样品可用于本发明的方法。在这些实施方案中，通过评估乳腺细胞样品(如，获得自患者的乳腺活检物)中标记物的数量(如，绝对量或浓度)可评估标记物的表达水平。当然，在评估样品中标记物数量前，可用多种众所周知的收集后制备和贮藏技术(如核酸和/或蛋白提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)处理细胞样品。同样地，也可用收集后制备或储存技术(如，固定)处理乳腺活检物。
本发明的组合物、试剂盒和方法可用于检测标记物蛋白的表达，该标记物蛋白至少有一部分在表达该蛋白的细胞表面展示。对于本领域技术人员而言，测定标记物蛋白或其部分是否暴露于细胞表面是一件简单的事情。例如，可用免疫学方法检测全细胞中的标记物蛋白，或用众所周知的基于计算机的序列分析方法来预测至少一个胞外域(即，包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面域的蛋白)的存在。无需裂解该细胞(如，使用与蛋白的细胞表面域特异性结合的标记抗体)就可检测到具有至少一部分在表达该蛋白的细胞表面展示的标记物蛋白的表达。
通过用于检测转录的核酸或蛋白的任一众所周知的方法可评估本发明标记物的表达。上述方法非限制性的例子包括用于检测分泌的、细胞表面、胞质或核蛋白的免疫学方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性分析方法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
在一个优选实施方案中，使用能特异性结合标记物蛋白或其片段，包括全部或部分进行了正常的翻译后修饰的标记物蛋白的抗体(如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(如，缀合于基质或蛋白-配体对{如，生物素-链亲和素}的蛋白或配体的抗体)，或抗体片段(如，单链抗体、分离的抗体超变区，等)来评估标记物的表达。
在另一个优选实施方案中，通过制备来自患者样品的细胞的mRNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，和通过将mRNA/cDNA和与标记物核酸或其片段互补的参照多核苷酸杂交来评估标记物的表达。在与参照多核苷酸杂交前，使用多种聚合酶链反应中的任意一种来任选地扩增cDNA；优选不被扩增。同样地，可使用定量PCR评估标记物的表达水平以检测一种或多种标记物的表达。可选地，任何已知检测本发明标记物突变或变体(如，单核苷酸多态性、缺失等)的方法可用于检测患者中标记物的存在。
在一个相关实施方案中，将获得自样品的转录的多核苷酸混合物和基质接触，该基质固定有与标记物核酸的至少一部分(如，至少7，10，15，20，25，30，40，50，100，500或更多的核苷酸残基)互补的或同源的多核苷酸。如果在底物上，互补的或同源的多核苷酸是可以差别检测的(如，可以使用不同的发色团或荧光团，或固定在不同的所选择的位置而检测)，那么使用一种单一基质(如，固定在所选择位置的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)就可同时评估多种标记物的表达水平。当使用包括将一种核酸与另一种杂交的用于评估标记物表达的方法时，优选在严格杂交条件下进行杂交。
因为本发明的组合物、试剂盒和方法依赖于检测本发明一种或多种标记物的表达水平的差异，优选标记物的表达水平明显大于用于在至少一种正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中评估表达的方法的最小检测极限。
很清楚通过使用一种或多种本发明的标记物来常规筛选额外的患者样品，可认识到在多种类型的癌症中某些标记物是超量表达的，包括特殊的乳腺癌，也包括另外的癌症如乳癌、卵巢癌等。例如，可证实某些本发明的标记物在大多数(即，50％或更多)或基本上全部(即，80％或更多)的乳腺癌中超量表达。因此本发明的组合物、试剂盒和方法可以用于鉴别患者乳腺肿瘤的良性或恶性性质。
此外，可证实某些本发明的标记物与各种组织学亚型(如浆液性、粘液性、内膜样和透明细胞亚型，也包括亚分类和交替分类的腺癌、乳头样腺癌、乳头样囊腺癌、表面乳头样癌、恶性腺纤维瘤、囊腺纤维瘤、腺癌、囊腺癌、腺棘皮癌、内膜样间质肉瘤、中胚层{富勒氏}混合瘤、中肾样肿瘤、恶性癌、Brenner肿瘤、混合上皮细胞瘤和未分化癌，使用WHO/FIGO系统用于对恶性乳腺肿瘤进行分类；Scully，Atlasof Tumor Pathology，第3辑，Washington DC)的各种乳腺癌不同分期(即，0，I，II，III和IV期乳腺癌，以及亚分类IIA，IIB，IIIA和IIIB，对于乳腺原发癌使用FIGO分期分组系统(见Breast，：American Joint Committee on Cancer：AJCC Cancer Staging Manual.Lippincott-Raven Publishers，5th ed.，1997，pp.171-180)和各种分级(即，I级{分化良好的}，II级{中度分化良好的}和III级{从周围正常组织分化不良的})相关。此外，对于本发明标记物的表达而言，评估了大量的患者样品，且获得样品的各个患者的结局是相关的，也可证实某些本发明标记物改变的表达与恶性癌症密切相关，以及本发明其它标记物改变的表达与良性肿瘤密切相关。因此，本发明的组合物、试剂盒和方法可用于鉴定患者中乳腺癌的分期、分级、组织学类型和良性/恶性性质中的一种或多种。
当本发明的组合物、试剂盒和方法用于鉴定患者中乳腺癌的分期、分级、组织学类型和良性/恶性性质中的一种或多种时，优选，选择标记物或本发明的标记物组，以便在至少约20％、优选至少约40％、60％或80％，更优选基本上全部患乳腺肿瘤的患者中获得阳性结果，该乳腺肿瘤具有相应的分期、分级、组织学类型和良性/恶性性质。优选地，选择标记物或本发明的标记物组，以便在一般人群中阳性预测值(PPV)大于约10％(更优选与特异性大于80％的测定结合)。
当多种本发明的标记物用于本发明的组合物、试剂盒和方法中时，可将患者样品中每种标记物的表达水平与在一种单独的反应混合物中(即，对于每种标记物使用试剂，如不同的荧光探针)或在相应于一种或多种标记物的单各个反应混合物中的同类型的非癌样品中多种标记物的每种正常表达水平比较。在一个实施方案中，相对于相应的正常水平，在样品中多种表达标记物中超过一种的表达水平的明显增加表明患者患乳腺癌。当使用多种标记物时，优选使用2，3，4，5，8，10，12或15或更多的各个标记物。还可以使用其它的标记物，以包括标记物组，其中使用至少20，25，30，40，50或更多的各个标记物。
为使本发明的组合物、试剂盒和方法的灵敏度最大化(即，通过因为患者样品中非癌器官的细胞的干扰)，优选在此使用的本发明的标记物是一种具有受限的组织分布，如通常不在非癌组织中表达的标记物。
已知仅有少量标记物与乳腺癌相关(如，BRCA1和BRCA2)。当然这些标记物不包括在本发明的标记物中，但是，例如在一个标记物组中它们可与一种或多种本发明的标记物联合使用。众所周知某些类型的基因，如癌基因、肿瘤抑制基因、生长因子样基因、蛋白酶样基因和蛋白激酶样基因通常参与不同类型的癌的发生。因此，在本发明的标记物中，优选使用那些相应于类似由已知癌基因和肿瘤抑制基因编码的已知蛋白的蛋白，和那些相应于类似生长因子、蛋白酶和蛋白激酶的蛋白的那些。
认为本发明的组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生乳腺癌危险的患者和他们的医学顾问具有特殊的效用。认可的具有增加的发生乳腺癌危险的患者包括，例如，具有乳腺癌家族史的患者，鉴定为具有突变的癌基因(即，至少一种等位基因)的患者，和大龄患者(即，大于50或60岁的妇女)。
可用不同的方法来评估正常(即，非癌)乳腺组织中标记物的表达水平。在一个实施方案中，通过评估看来是非癌的乳腺细胞的一部分中标记物的表达水平和通过将正常表达水平与怀疑是癌的乳腺细胞的一部分中的表达水平比较来确定该正常表达水平。可选地，和特别地作为可获得自常规进行的本文中所描述方法的结果的详细信息，对于本发明的标记物的正常表达而言，可使用群体平均值。在另一个实施方案中，标记物的‘正常的’表达水平可通过评估获得自非癌患者的患者样品，获得自在怀疑该患者患乳腺癌之前获得的患者样品，来自存档的患者样品和类似物中标记物的表达来测定。
本发明包括用于评估样品(如，存档的组织样品或获得自患者的样品)中乳腺癌细胞存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与那些上述的，除了其中不可避免的用于不同于患者样品的样品中的组合物、试剂盒和方法外，基本上是相同的。例如，当所用的样品是石蜡包埋的、存档的人组织样品时，需要调节用于评估样品中标记物表达水平的本发明组合物、试剂盒或方法中化合物的比率。在本领域和本领域普通技术人员中这样的方法是众所周知的。
本发明包括用于评估乳腺癌细胞(如，在样品，如在患者样品中)的存在的试剂盒。该试剂盒包含多种试剂，每种都能特异性结合标记物核酸或蛋白。合适的用于与标记物蛋白结合的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。合适的用于与标记物核酸(如，基因组DNA、mRNA、剪接的mRNA、cDNA或类似物)结合的试剂包括互补的核酸。例如，核酸试剂可包括固定于基质的寡核苷酸(标记的或未标记的)，不与基质结合的标记的寡核苷酸，PCR引物对，分子信标探针等。
本发明的试剂盒也可任选地包含用于操作本发明方法的额外成分。作为例子，该试剂盒可包含适用于互补核苷酸退火或用于结合抗体和与之特异性结合的蛋白的流体(如，SSC缓冲液)，一个或多个样品室，描述操作本发明方法的说明书，正常乳腺细胞的样品，乳腺癌细胞样品等。
本发明也包括一种制造分离的杂交瘤的方法，该杂交瘤产生用于评估患者是否患乳腺癌的抗体。在此方法中，合成或分离包含标记物蛋白全部或片段的蛋白或多肽(如，通过从表达其的细胞中纯化或通过在体内或体外用已知方法转录并翻译编码蛋白或多肽的核酸)。用上述蛋白或多肽免疫脊椎动物，优选哺乳动物如小鼠、大鼠、兔或绵羊。该脊椎动物可任选地(和优选地)用上述蛋白或多肽免疫至少一段额外时间，使得该脊椎动物对于上述蛋白或多肽显示强的免疫响应。使用本领域众所周知的任一方法，分离免疫的脊椎动物的脾细胞并且与无限增殖化细胞系融合形成杂交瘤。该方法中形成的杂交瘤接着用标准方法筛选以鉴定能产生特异性结合标记物蛋白或其片段的抗体的一种或多种杂交瘤。本发明也包括根据上述方法制得的杂交瘤和使用该杂交瘤制得的抗体。
本发明也包括一种评估用于抑制乳腺癌细胞的受试化合物的效力的方法。如上所述，本发明标记物的表达水平的差异与乳腺细胞的癌状态相关。尽管认为本发明某些标记物表达水平的改变可能是由于乳腺细胞的癌状态，但是同样也认为本发明其它标记物的表达水平改变诱导、保持并促进了那些细胞的癌状态。因此，能抑制患者乳腺癌的化合物可导致本发明一种或多种标记物的表达水平改变至接近该标记物的正常表达水平的水平(即，非癌乳腺细胞中该标记物的表达水平)。
因此，该方法包含比较在第一乳腺细胞样品中并在受试化合物存在的条件下保持的标记物的表达与在第二乳腺细胞样品中并在不存在受试化合物的条件下保持的标记物的表达。在存在受试化合物条件下，本发明标记物的表达明显减少表明该受试化合物抑制乳腺癌。乳腺细胞样品可以，例如，是获得自患者的正常乳腺细胞的单次抽样样品的等分试样，获得自患者的正常乳腺细胞的合并样品，正常乳腺细胞系的细胞，获得自患者的乳腺癌细胞的单次抽样样品的等分试样，获得自患者的乳腺癌细胞的混合样品，乳腺癌细胞系的细胞，等。在一个实施方案中，样品是获得自患者的乳腺癌细胞，测试多种已知能有效地用于抑制多种乳腺癌的化合物中的一种或多种，以鉴定出能最好地抑制患者乳腺癌的化合物。
同样地，该方法可用于评估用于患者乳腺癌的治疗的有效性。在该方法中，评估了一对样品(一个样品给予该治疗，另一个样品不给予该治疗)中本发明一种或多种标记物的表达水平。当用评估受试化合物效力的方法时，如果该治疗导致本发明标记物明显更低的表达水平，那么对于抑制乳腺癌而言，该治疗是有效的。同上，如果来自所选择的患者的样品用于该方法中，那么可在体外评估可选择的治疗以选择一种对于抑制患者乳腺癌最有效的治疗。
如上所述，人乳腺细胞的癌状态与本发明标记物的表达水平的改变相关。本发明包括一种用于评估受试化合物的人乳腺细胞致癌作用潜力的方法。该方法包含将人乳腺细胞等分试样分别保持在存在和不存在受试化合物的条件下。比较每个等分试样中本发明标记物的表达。保持在存在受试化合物的条件下的等分试样中本发明标记物表达水平明显更高(相对于保持在不存在受试化合物条件下的等分试样)，表明该受试化合物具有潜在的人乳腺细胞致癌作用。通过比较相应标记物表达水平增强或抑制的程度，通过比较表达水平增强或抑制的标记物的数量，或两者都比较，可评估不同受试化合物的相对致癌作用潜力。
在下列段落中更详细描述了本发明的不同方面。
分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及分离的核酸分子，包括编码标记物蛋白或其部分的核酸。本发明分离的核酸也包括足以用作为杂交探针以鉴定标记物核酸分子及标记物核酸分子片段的核酸分子，如，适于作为用于标记物核酸分子的扩增或突变的PCR引物的那些。在本文中使用时，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子(如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如，mRNA)以及用核苷酸类似物所制备的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选双链DNA。
“分离的”核酸分子是从核酸分子的天然来源中所存在的其它核酸分子中分离的核酸分子。优选地，在该核酸所来源的生物体基因组DNA中，“分离的”核酸分子不具备天然侧翼于该核酸的序列(即，位于该核酸5′和3′末端的序列)(优选蛋白编码序列)。例如，在各种实施方案中，该分离的核酸分子可含有少于约5kB，4kB，3kB，2kB，1kB，0.5kB或0.1kB的在该核酸分子所来源的细胞基因组DNA中侧翼于该核酸分子的天然核苷酸序列。此外，“分离的“核酸分子，如cDNA分子，当通过重组技术上生产时，可基本上不含有其它细胞物质或培养基，或当化学合成时，基本上不含有化合物前体或其它化合物。
可使用标准的分子生物学技术和本文所述的数据库记录的序列信息分离本发明的核酸分子。使用所述核酸序列的全部或部分，使用标准的杂交和克隆技术可分离本发明的核酸分子(如，描述于Sambrook等，编.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
根据标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物可扩增本发明的核酸分子。所扩增的核酸可克隆至合适的载体中并通过DNA序列分析来鉴定。此外，通过标准的合成技术，如使用自动化DNA合成仪，可制备相应于本发明核酸分子的全部或部分的核苷酸。
在另一个优选实施方案中，本发明分离的核酸分子包含具有与标记物核酸的核苷酸序列或编码标记物蛋白的核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸分子。与给定的核苷酸序列互补的核酸分子是一种与给定的核苷酸序列足够互补，以便能与所给定的核苷酸序列杂交从而形成稳定的双链体。
此外，本发明的核酸分子可仅包含部分核酸序列，其中全长的核酸序列包含标记物核酸或编码标记物蛋白。这样的核酸可用作为，例如，探针或引物。探针/引物通常作为一种或多种基本上纯化的寡核苷酸使用。该寡核苷酸通常包含在严格条件下能与本发明的核酸的至少约7，优选约15，更优选约25，50，75，100，125，150，175，200，250，300，350或400或更多的连续核苷酸杂交的核苷酸序列的一个区。
基于本发明的核酸分子序列的探针可用于检测相应于本发明的一种或多种标记物的转录物或基因组序列。该探针包含附于其上的标记基团，如，放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶辅因子。这样的探针可用作为用于鉴定蛋白表达异常的细胞或组织的诊断试剂盒的一部分，例如通过测定患者细胞样品中编码蛋白的核酸分子的水平，如检测mRNA水平或确定编码该蛋白的基因是否已突变或缺失。
本发明进一步包含由于遗传密码简并性而不同于编码标记物蛋白(如，具有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ IDNO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ IDNO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ IDNO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ IDNO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ IDNO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ IDNO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94h和SEQID NO：96的序列的蛋白)的核酸的核苷酸序列的核酸分子，并因此编码同样的蛋白。
本领域的技术人员可以理解，导致氨基酸序列改变的DNA序列多态性可存在于群体中(如，人群中)。由于天然等位基因变异，这样的遗传多态性可在群体的个体间存在。等位基因是可选择出现在给定的基因坐的一组基因之一。此外，可以理解的是影响RNA表达水平的DNA多态性也可存在，它影响该基因总的表达水平(如，通过影响调控或降解)。
在本文中使用时，词组“等位基因变体”指在给定的基因座出现的核苷酸序列或指该核苷酸序列编码的多肽。
在本文中使用时，术语“基因”和“重组基因”指包含编码相应于本发明标记物的多肽的开放读码框的核酸分子。在给定基因的核苷酸序列中该天然产生的等位基因变体通常能导致1-5％变异。通过对许多不同个体中感兴趣的基因测序可鉴定可选择的等位基因。通过使用杂交探针来鉴定不同个体中此同样的基因座可容易地进行上述鉴定。任一和所有这样的核苷酸变异和产生的氨基酸多态性或变异是天然等位基因变异的结果，并且不改变本发明保护范围所规定的功能活性。
在另一个实施方案中，本发明分离的核酸分子长度至少是7，15，20，25，30，40，60，80，100，150，200，250，300，350，400，450，550，650，700，800，900，1000，1200，1400，1600，1800，2000，2200，2400，2600，2800，3000，3500，4000，4500或更多个核苷酸，并在严格条件下与标记物核酸或与编码标记物蛋白的核酸杂交。在本文中使用时，术语“在严格条件下杂交”是用来描述用于杂交和洗涤的条件，在该条件下，彼此之间具有至少60％(65％，70％，优选75％)同一性的核苷酸序列通常仍能互相杂交。这样的严格条件为本领域技术人员所众所周知，并能在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)6.3.1-6.3.6节中找到。一个优选的，非限制性的严格杂交条件的例子是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃下杂交，接着用0.2X SSC，0.1％SDS在50-65℃下洗涤一或多次。
除了能存在于群体中的本发明核酸分子的天然存在的等位基因变体外，本领域的技术人员可进一步理解能通过突变导入序列改变，因此导致了所编码蛋白的氨基酸序列的改变，但不改变所编码蛋白的生物活性。例如，可进行核苷酸取代导致在“非必需的”氨基酸残基处的氨基酸取代。“非必需的”氨基酸残基是一种对野生型序列进行改变但不改变生物活性的残基，而“必需的”氨基酸残基对生物活性而言是必需的。例如，对于活性而言，在不同物种的同源物之间非保守的或仅是半保守的氨基酸残基可能是非必需的，因此很可能成为改变的对象。可选地，对于活性而言，在不同物种(如，鼠和人)同源物之间保守的氨基酸残基可能是必需的，因此就不可能作为改变的对象。
因此，本发明的另一个方面是关于编码变体标记物蛋白的核酸分子，该标记物蛋白含有对于活性而言是非必需的氨基酸残基改变。这样的变体标记物蛋白的氨基酸序列不同于天然存在的标记物蛋白，但仍保持生物活性。在一个实施方案中，这样的标记物蛋白变体具有与标记物蛋白的氨基酸序列至少约40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或98％同一性的氨基酸序列。
可以通过在标记物核酸的核苷酸序列中导入一或多个核苷酸取代、添加或缺失得到编码变体标记物蛋白的分离的核酸分子，使得一或多个氨基酸残基取代、添加或缺失导入所编码的蛋白。通过标准技术可导入突变，如定点诱变和PCR-介导的诱变。优选地，在一或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”指氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基所取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可选地，突变可随机导入编码序列的全部或部分中，如通过饱和诱变，可筛选所产生的突变体的生物活性，以通过鉴定仍保持活性的突变体。在诱变后，可以重组表达编码蛋白并测定该蛋白活性。
本发明包含反义核酸分子，即与本发明的有义核酸互补的分子，如，与双链标记物cDNA分子的编码链互补或与标记物mRNA序列互补。因此，本发明的反义核酸能通过氢键(即，退火)与本发明的有义核酸结合。该反义核酸能与完整编码链或其部分，如，蛋白编码区(或开放读码框)的全部或部分互补。反义核酸分子也可以与编码标记物蛋白的核苷酸序列的编码链的非编码区的全部或部分反义。非编码区(“5′和3′非翻译区”)是侧翼于编码区且不翻译为氨基酸的5′和3′序列。
反义寡核苷酸长度可以是，例如，约5，10，15，20，25，30，35，40，45或50或更多个核苷酸。使用本领域已知的化学合成和酶连接反应方法可构建本发明的反义核酸。例如，使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子生物学稳定性或增加在反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的进行了各种修饰的核苷酸，可化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-galactosylqueosine，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-乙醇酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯，尿嘧啶-5-乙醇酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-3-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。可选地，可用生物学方法产生反义核酸，该方法使用表达载体，其中核酸已被亚克隆入该载体的反义方向(即，由插入的核酸转录的RNA与感兴趣的靶核酸呈反义方向，在以下部分作进一步说明)。
通常给予受试者本发明的反义核酸分子，或在原位产生该反义核酸分子以使它们与编码标记物蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合以抑制标记物的表达，如，通过抑制转录和/或翻译。可通过常规的核苷酸互补杂交，以形成稳定的双链体，或，例如，结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用。给予本发明反义核酸分子的途径的例子包括在组织部位直接注射或将反义核酸输注到乳腺相关的体液中。可选地，可修饰反义核酸分子以靶定所选择的细胞，和接着通过全身方式给予。例如，对于全身性给药而言，可修饰反义核酸使之与所选择的细胞表面的受体或表达的抗原特异性结合，如，通过将反义核酸分子与肽或抗体连接，所述肽或抗体与细胞表面受体或抗原结合。使用本文中所述的载体也可将反义核酸分子递送至细胞中。为达到反义分子足够的细胞内浓度，优选以下载体构建体，其中反义核酸分子可置于强pol II或pol III启动子的控制下。
本发明的反义核酸分子可以是α-端基异构核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补的RNA形成特殊的双链杂合体，与通常使用的α-单位不同，链之间互相平行延伸(Gaultier等，1987，Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等.，1987，Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
本发明也包含核酶。核酶是催化性RNA分子，其具有核糖核酸酶活性，能裂解单链核酸，如mRNA，其具有与所裂解的单链核酸互补的互补区。因此，核酶(如，在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334：585-591中所述的锤头状核酶)可用于催化裂解mRNA转录产物由此抑制mRNA编码蛋白的翻译。基于相应于该标记物的cDNA的核苷酸序列，可设计对编码标记物蛋白的核酸分子具有特异性的核酶。例如，可构建四膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列与要裂解的核苷酸序列互补(见，Cech等，美国专利第4,987,071号；和Cech等，美国专利第5,116,742号)。可选地，编码本发明多肽的mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(参见如Bartel和Szostak，1993，Science261：1411-1418)。
本发明也包含形成三螺旋结构的核酸分子。例如，通过将导向核苷酸序列与编码标记物核酸或蛋白的基因的调控区(如，启动子和/或增强子)互补以形成阻止该基因在靶细胞中转录的三螺旋结构，来抑制本发明标记物的表达。通常见Helene(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher(1992)Bioassays 14(12)：807-15。
在各种实施方案中，可修饰本发明核酸分子的碱基部分、糖部分或磷酸酯主链以改良，如分子的稳定性、杂交性或溶解性。例如，可修饰核酸的磷酸脱氧核糖主链以产生肽核酸(见，Hyrup等，1996，Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。在本文中使用时，术语“肽核酸”或“PNAs”指核酸模拟物，如，DNA模拟物，其中假肽(pseudopeptide)主链取代了磷酸脱氧核糖主链，且仅保留有4种天然核碱基。在低离子强度的条件下，已显示PNAs中性主链可与DNA和RNA特异性杂交。可通过使用标准固相肽合成技术进行PNA寡聚体的合成，如描述于Hyrup等.(1996)，出处同上；Perry-O′Keefe等.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675。
PNAs可用于治疗和诊断应用。例如，PNAs可用作为反义或反基因(antigene)试剂用于基因表达的序列特异性调控，通过如，诱导转录或翻译停止或抑制复制。也可以使用PNA，如在基因的单碱基配对突变分析中，通过如PNA定向的PCR钳制(clamping)；当与其它酶(如S1核酸酶)结合使用时，作为人工限制酶(Hyrup(1996)，出处同上)；或作为DNA测序和杂交的探针或引物(Hyrup，1996，出处同上；Perry-O′Keefe等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675)。
在另一个实施方案中，如通过在PNA上连接亲脂性或其它辅助基团，通过形成PNA-DNA嵌合体，或通过使用脂质体或其它本领域已知的药物递送技术可修饰PNAs，以增加它们的稳定性或细胞摄取能力。例如，可产生将PNA和DNA的有益特性结合的PNA-DNA嵌合体。这样的嵌合体允许DNA识别酶，如核糖核酸酶H和DNA聚合酶与DNA部分相互作用，而PNA部分能提供高亲和力和特异性。使用合适长度的根据碱基堆积、在核碱基之间键的数目和取向选择的接头可连接PNA-DNA嵌合体，(Hyrup，1996，出处同上)。根据Hyrup(1996)，出处同上，和Finn等.(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63所描述的方法进行PNA-DNA嵌合体的合成。例如，使用标准的亚磷酰胺偶联化学和修饰的核苷类似物在固相支持物上合成DNA链。化合物，如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸苷亚磷酰胺可用作PNA和DNA的5′末端之间的接头(Mag等，1989，Nucleic Acids Res.17：5973-88)。接着以逐步进行的方法偶联PNA单体以产生具有5′PNA片段和3′DNA片段的嵌合分子(Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63)。可选地，可合成具有5′DNA片段和3′PNA片段的嵌合分子(Peterser等，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。
在另一个实施方案中，寡核苷酸包括其它附加的基团如肽(如，用于体内靶定宿主细胞受体)，或有利于转运通过细胞膜(参见如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；PCT公开号WO 88/09810)或血脑屏障的试剂(参见如PCT公开号WO89/10134)。此外，可用启动的杂交裂解试剂修饰寡核苷酸(参见如，Krol等，1988，Bio/Techniques 6：958-976)或嵌入试剂(参见如，Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)。为此，寡核苷酸可与其它分子缀合，如，肽、启动杂交的交联剂、运输载体、启动杂交的裂解剂等。
在其它实施方案中，寡核苷酸包括其它附加的基团如肽(如，用于体内靶定宿主细胞受体)，或有利于转运通过细胞膜(参见如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；PCT公开号WO 88/09810)或血脑屏障的试剂(参见如PCT公开号WO89/10134)。此外，可用杂交启动的裂解试剂(参见如，Krol等，1988，Bio/Techniques 6：958-976)或嵌入试剂(参见如，Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)修饰寡核苷酸。为此，寡核苷酸可与其它分子如，肽、启动杂交的交联剂、运输试剂、杂交启动的裂解剂等。
本发明也包括分子信标核酸，其具有至少一个能与本发明核酸互补的区，使得该分子信标可用于样品中本发明核酸的定量。“分子信标”核酸是一种包含一对互补区并具有与之相连的荧光团和荧光猝灭剂的核酸。荧光团和猝灭剂以这样的定向连接于该核酸的不同部分，当互补区相互退火时，猝灭剂猝灭了荧光团的荧光。当该核酸的互补区彼此间不退火时，荧光团的荧光被猝灭到较低程度。分子信标核酸描述于，例如，美国专利第5,876,930号中。
分离的蛋白和抗体
本发明的一个方面涉及分离的标记物蛋白及其生物活性部分，也涉及合适作为免疫原来产生抗标记物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，通过使用标准蛋白纯化技术的合适纯化方法可从细胞或组织来源中分离出天然的标记物蛋白。在另一个实施方案中，通过重组DNA技术产生包含标记物蛋白全部或片段的蛋白或肽。除重组表达，还可选择的是使用标准肽合成技术合成这样的蛋白或肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性片段是基本上不含有来自产生该蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白，或当化学合成时，基本上不含有化学物质前体或其它化学物质。术语“基本上不含有细胞物质”包括在蛋白制备物，其中该蛋白与分离或重组产生这种蛋白的细胞的细胞成分分离。因此，基本上不含有细胞物质的蛋白，包括具有小于约30％，20％，10％或5％(干重)的异源蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)的蛋白制备物。当该蛋白或其生物活性部分是重组产生时，也优选基本上不含有培养基，即培养基含量小于约20％，10％或5％的蛋白制备物的体积。当该蛋白通过化学合成产生时，优选基本上不含有化学物质前体或其它化学物质，即，它与参与蛋白的合成的化学物质前体或其它化学物质。因此，这样的蛋白制备物具有小于约30％，20％，10％，5％(干重)的化学物质前体或除了感兴趣的多肽外的化合物。
标记物蛋白的生物活性部分包括多肽，该多肽包含与标记物蛋白的氨基酸序列基本上同一的或源自标记物蛋白的的氨基酸序列，包括与全长蛋白相比更少的氨基酸，并显示相应全长蛋白的至少一种活性。通常，生物活性部分包含一个具有相应全长蛋白的至少一种活性的结构域或基序。本发明标记物蛋白的生物活性部分可以是一种多肽，其长度是，例如10，25，50，100或更多个氨基酸。而且，在标记物蛋白所缺失的其它区域的其它生物活性部分可通过重组技术制备，并用于评估天然形式标记物蛋白的一种或多种功能活性。
优选的标记物蛋白由编码包含以下任一序列的蛋白的核苷酸编码：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：96。其它有用的蛋白与这些序列之一是基本上同一的(如，至少约40％，优选50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％)，且保留相应天然存在的标记物蛋白的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变在氨基酸序列上不同。
为测定两个氨基酸序列或两个核酸之间的同一性百分数，比对序列以寻求最佳的比较效果(如，可在第一个氨基酸或核酸序列中导入空位以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳的比对)。接着比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当在第一个序列中一个位置与第二个序列中相应位置被同样的氨基酸或核苷酸占据时，那么该分子在该位点是相同的。两个序列间的同一性百分数是序列所具有相同位置的数量的函数(即，％同一性＝相同的位置数/总的位置数(如，重叠的位置)x100)。在一个实施方案中，两个序列具有相同的长度。
可使用数学算法来确定两个序列之间的同一性百分数。一个优选的，非限制性的用于比较两个序列的数学算法例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，其如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中进行改进。该算法被并入Altschul，等.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTX程序中。可用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12以获得与本发明核酸分子同源的核酸序列。可用BLASTP程序进行BLAST蛋白搜索，得分＝50，字长＝3以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的有空位比对，可使用Altschul等.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所描述的称为有空位的(Gapped)BLAST的新版本BLAST算法，对于BLASTN，BLASTP和BLASTX程序，其能执行有空位的局部比对。可选地，PSI-Blast可用于执行迭代搜索，其检测两个分子之间的远缘关系。当使用BLAST，有空位的BLAST和PSI-Blast程序时，使用各个程序(如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另一个优选的，非限制性的用于序列比较的算法例子是Myers和Miller，(1988)CABIOS 4：11-17的算法。该算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALI GN程序用于比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。然而另一个对于鉴定局部序列区域相似性和比对的有用的算法是FASTA算法，描述于Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448。当使用FASTA算法用于比较核苷酸或氨基酸序列时，例如，可使用具有κ-元组值为2的PAM 120权重残基表。
使用类似于那些上述的，允许有或不允许有空位的方法，可确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数中，仅有准确匹配被计算在内。
本发明也提供包含标记物蛋白或其片段的嵌合或融合蛋白。在本文中使用时，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含可操作地连接到异源多肽(即，不同于标记物蛋白的多肽)的标记物蛋白的全部或部分(优选生物活性部分)。在融合蛋白中，术语“可操作地连接”用来表示标记物蛋白或其片段，异源多肽互相进行框内融合。异源多肽可融合到标记物蛋白或片段的氨基末端或羧基末端。
一种有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中标记物蛋白或片段融合到GST序列的羧基末端。这样的融合蛋白能方便本发明重组多肽的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白在其氨基末端含有异源信号序列。例如，能除去标记物蛋白的天然信号序列并用来自另外蛋白的信号序列取代。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可用作为异源信号序列(Ausubel等，编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，1992)。其它真核异源信号序列的例子包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。还在另一个例子中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，出处同上)和蛋白A分泌信号(PharmaciaBiotech；Piscataway，New Jersey)。
还在另一个实施方案中，融合蛋白是一种免疫球蛋白融合蛋白，其中标记物蛋白的全部或部分与源自免疫球蛋白家族一员的序列融合。本发明的免疫球蛋白融合蛋白可掺入药物组合物中并给予患者以抑制配体(可溶的或膜结合的)与细胞表面蛋白(受体)之间的相互作用，因此抑制了体内信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可用于影响标记物蛋白的相关配体的生物利用度。配体/受体相互作用的抑制在治疗上能用于治疗增生和分化紊乱，并用于调节(如，促进或抑制)细胞存活。此外，本发明的免疫球蛋白融合蛋白可用作为免疫原，在受试者体中产生抗标记物蛋白的抗体，来纯化配体和在筛选试验中鉴定抑制标记物蛋白与配体相互作用的分子。
本发明的嵌合和融合蛋白可通过标准的重组DNA技术产生。在另一个实施方案中，通过常规技术包括自动化DNA合成仪可合成融合基因。可选地，使用锚定引物可进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物产生了两个连续的基因片段之间的互补的突出端，所述突出端随后退火并再扩增产生嵌合基因序列(参见如，Ausubel等，出处同上)。此外，许多也编码融合部分(如，GST多肽)的表达载体是商业上可获得的。编码本发明多肽的核酸可克隆入上述表达载体中使得融合部分与本发明的多肽进行框内连接。
使用信号序列可促进标记物蛋白的分泌和分离。信号序列通常的特征在于疏水氨基酸核，在一或更多的裂解事件中该疏水氨基酸核通常裂解自分泌过程中的成熟蛋白。当成熟蛋白通过分泌途径时，上述信号肽含有可允许信号序列从成熟蛋白上裂解下来的加工位点。因此，本发明涉及具有信号序列的标记物蛋白、融合蛋白或其片段，以及涉及信号序列已经蛋白水解裂解的上述蛋白(即，裂解产物)。在一个实施方案中，在表达载体中编码信号序列的核酸序列能可操作地连接感兴趣的蛋白，如标记物蛋白或其片段。信号序列指导蛋白的分泌，如从该表达载体所转化的真核宿主中，且该信号序列随后或同时被裂解。接着通过本领域所众所周知的方法能容易地从细胞外培养基中纯化蛋白。可选地，通过使用能促进纯化的序列，如具有GST结构域的序列，信号序列能被连接到感兴趣的蛋白。
本发明也涉及标记物蛋白变体。该变体具有改变的氨基酸序列，其能起激动剂(模拟物)或拮抗剂的作用。通过诱变作用能产生变体，如不连续的点突变或截短。激动剂能基本上保持蛋白天然存在形式的相同或部分的生物活性。蛋白的拮抗剂能抑制一种或多种蛋白天然存在形式的活性，通过例如，竞争性结合细胞信号传递级联的下游或上游元件，包括感兴趣的蛋白。因此，通过用具有有限功能的变体治疗能引发特定的生物效应。相对于用蛋白天然形式的治疗，用具有部分蛋白天然存在形式的生物活性的变体治疗患者可在患者中产生更少的副作用。
能起激动剂(模拟物)或拮抗剂作用的标记物蛋白变体可通过筛选本发明蛋白的突变体组合文库，如截短突变体组合文库，以鉴定激动剂或拮抗剂活性。在一个实施方案中，通过在核酸水平上组合诱变产生变体杂文库(variegated library)，该变体杂文库由杂基因文库(variegated gene library)编码。变体杂文库可通过，例如，合成的寡核苷酸混合物通过酶连接入基因序列，使得潜在蛋白序列的简并组表达为单独多肽，或可选地，表达为一组大的融合蛋白(如，对于噬菌体展示而言)。许多方法能用于从简并的寡核苷酸序列产生标记物蛋白的潜在变体文库。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域众所周知的(见，例如，Narang，1983，Tetrahedron 39：3；Itakura等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，1984，Science198：1056；Ike等，1983Nucleic Acid Res.11：477)。
另外，标记物蛋白片段文库可用于产生多肽的杂群体(variegatedpopulation)用于筛选和随后标记物蛋白或其片段变体的选择。例如，可产生编码序列片段文库，包括：通过在每个分子仅存在约一个切口条件下，用核酸酶处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段，退火该双链DNA，复性该DNA以形成双链DNA，该双链DNA包括来自不同带切口产物的有义/反义对，通过用S1核酸酶处理从重新形成的双链体上切除单链部分，并将产生的片段文库连接如表达载体中。通过这种方法，可得到编码不同大小的感兴趣蛋白氨基末端和内部片段的表达文库。
本领域已知一些技术，可用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库基因产物，和用于筛选具有所选特性的基因产物的cDNA文库。最普遍使用的技术应适用于高通量分析，对于筛选大基因文库而言，通常包括将基因文库克隆入可复制的表达载体中，用所产生的载体文库转染合适的细胞，和在其中所需活性的检测促进编码其产物被检测的基因的载体的分离的条件下，表达该组合基因。回归总体诱变(REM)，一种能增加功能性突变体在文库中出现频率的技术，可与筛选试验结合使用来鉴定本发明蛋白的变体(Arkin和Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等，1993，ProteinEngineering 6(3)：327-331)。
本发明另一个方面涉及抗本发明蛋白的抗体。在优选实施方案中，该抗体特异性结合标记物蛋白或其片段。可交换使用的术语“抗体”和“抗体”指免疫球蛋白分子和包含其免疫活性部分的片段和衍生物(即，上述部分含有抗原结合位点，其能特异性结合抗原，例如标记物蛋白，如标记物蛋白的表位)。能特异性结合本发明蛋白的抗体是一种能结合该蛋白，但在样品中，如天然含有该蛋白的生物样品中基本上不结合其它分子的抗体。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括，但不限于，单链抗体(scAb)、F(ab)和F(ab′)2片段。
本发明分离的蛋白或其片段可用作免疫原来产生抗体。可使用全长蛋白或，可选地，本发明提供了作为免疫原的抗原肽片段。本发明蛋白的抗原肽包含至少8个(优选10，15，20或30或更多个)本发明蛋白之一的氨基酸序列的氨基酸残基，并且包含该蛋白的至少一个表位，使产生的抗肽抗体与该蛋白形成免疫复合物。抗原肽包含的优选的表位是位于蛋白表面的区，如亲水区。疏水性序列分析、亲水性序列分析、或类似的分析可用于鉴定亲水区。在优选的实施方案中，一种分离的标记物蛋白或其片段用作免疫原。
免疫原通常用于制备抗体，通过免疫合适的(即，免疫活性的)受试者，如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物或脊椎动物。合适的免疫原制剂包含，例如，重组表达或化学合成的蛋白或肽。该制剂可进一步包括一种佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。优选的免疫原组合物是那些不含有其它人蛋白的，例如，使用非人宿主细胞重组表达本发明蛋白得到的免疫原性组合物。在该方法中，所产生的抗体组合物与除本发明蛋白外的其它人蛋白的结合减少或不结合。
本发明提供了多克隆和单克隆抗体。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，在本文中使用时，指仅含有一种能与特定的表位起免疫反应的抗原结合位点的抗体分子的群体。优选的多克隆和单克隆抗体组合物是选择了抗本发明蛋白的抗体的组合物。特别优选的多克隆和单克隆抗体制剂是一种仅含有抗标记物蛋白或其片段的抗体的制剂。
多克隆抗体可通过用本发明的蛋白作为免疫原免疫合适的受试者制备。通过标准方法可随时间监测免疫的受试者中的抗体滴度，如通过使用固定化多肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)。在免疫后的合适时间点，如，当特异性抗体滴度最高时，从受试者中获得产生抗体的细胞并通过标准技术用于制备单克隆抗体(mAb)，所述标准技术如杂交瘤技术，最初描述于Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497，人B细胞杂交瘤技术(见Kozbor等，1983，Immunol.Today 4：72)，EBV-杂交瘤技术(见Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy中pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)或三杂交瘤(trioma)技术。用于产生杂交瘤的技术是众所周知的(通常见，CurrentProtocols in Immunology，Coligan等，编，John Wiley & Sons，NewYork，1994)。通过对杂交瘤培养物上清液筛选结合感兴趣多肽的抗体可检测产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞，如，使用标准ELISA方法。
可选的为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤，通过用感兴趣的多肽筛选重组的组合免疫球蛋白文库(如，抗体噬菌体展示文库)可鉴定并分离抗本发明蛋白的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是商业上可获得的(如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAP噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。此外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的例子可发现于，例如，美国专利第5,223,409号；PCT公开号WO92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等.(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等.(1989)Science 246：1275-1281；Griffiths等.(1993)EMBO J.12：725-734。
本发明也提供了特异性结合本发明蛋白的重组抗体。在优选的实施方案中，该重组抗体特异性结合标记物蛋白或其片段。重组抗体包括，但不限于，嵌合和人源化单克隆抗体，包含人和非人部分，单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体是一种其中不同部分源自不同动物物种的分子，如具有源自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些(参见如Cabilly等，美国专利第4,816,567号；和Boss等，美国专利第4,816,397号，其全文在此引入作为参考)。单链抗体具有抗原结合位点，并且由单个多肽组成。它们可通过本领域已知的技术生产，例如使用描述于Ladner等，美国专利第4,946,778号(其全文在此引入作为参考)；Bird等，(1988)Science 242：423-426；Whitlow等，(1991)Methods in Enzymology 2：1-9；Whitlow等，(1991)Methodsin Enzymology 2：97-105；和Huston等，(1991)Methods in EnzymologyMolecular Design and Modeling：Concepts and Applications203：46-88的方法。多特异性抗体是具有至少两个特异性结合不同抗原的抗原结合位点的抗体分子。这样的分子可通过本领域已知的技术生产，例如使用描述于Segal，美国专利第4,676,980号(其所公开的全文在此引入作为参考)；Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Whitlow等，(1994)Protein Eng.7：1017-1026和美国专利第6,121,424号的方法。
人源化抗体是来自非人物种的具有一或多个来自非人物种的互补决定区(CDRS)和来自人免疫球蛋白分子构架区的抗体分子(参见如，Queen，美国专利第5,585,089号，其全文在此引入作为参考)。人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术生产，例如使用描述于PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT公开号WO86/01533；美国专利第4,816,567号；欧洲专利申请号125,023；Better等.(1988)Science 240：1041-1043；Liu等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3439-3443；Liu等.(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等.(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等.(1985)Nature314：446-449；和Shaw等.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等.(1986)Bio/Techniques 4：214；美国专利第5,225,539号；Jones等.(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等.(1988)Science239：1534；和Beidler等.(1988)J.Immunol.141：4053-4060。
更优选地，人源化抗体可产生自，例如，使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因，但能表达人重链和轻链基因的转基因小鼠。用选定的抗原，如相应于本发明标记物的多肽的全部或部分，以常规方法免疫转基因小鼠。使用常规杂交瘤技术可获得抗该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后经历了类转换和体细胞突变。因此，使用该技术，可产生在治疗上有用的IgG、IgA和IgE抗体。用于生产人抗体该技术的综述见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93)。用于生产人抗体和人单克隆抗体技术的详细讨论以及用于生产上述抗体的实验方法参见如美国专利第5,625,126号；美国专利第5,633,425号；美国专利第5,569,825号；美国专利第5,661,016号和美国专利第5,545,806号。此外，公司如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)使用类似于上述的技术可允诺提供抗选定的抗原的人抗体。
使用称为“指导的选择”的技术可产生识别选定表位的全人抗体。在该方法中，选定的非人单克隆抗体，如鼠抗体，被用于指导选择识别相同表位的全人抗体(Jespers等，1994，Bio/technology12：899-903)。
本发明的抗体在产生(如，从受试者的血液或血清)或合成后可通过众所周知的技术分离，并进一步纯化。例如，使用蛋白A层析可纯化IgG抗体。通过如亲和层析，对本发明蛋白特异的抗体可被选择或(如，部分纯化)或纯化。例如，如在本文中所描述的，产生重组表达和纯化(或部分纯化)的本发明的蛋白，并共价地或非共价地偶联到固相支持物，如层析柱。接着用该柱亲和纯化对本发明蛋白特异的抗体，该抗体来自含有抗许多不同表位的抗体的样品，因此产生了基本上纯化的抗体组合物，即，一种基本上不含有污染抗体的抗体组合物。在上下文中，基本上纯化的抗体组合物表示抗体样品含有至多仅30％(干重)的污染抗体，该抗体所抗的表位不同于本发明所需蛋白的那些表位，和优选至多20％，还更优选至多10％，和最优选至多5％(干重)的样品是污染抗体。纯化的抗体组合物指组合物中至少99％的抗体是抗本发明所需蛋白。
在一个优选实施方案中，本发明基本上纯化的抗体可特异性结合本发明蛋白的信号肽、分泌序列、胞外域、跨膜或胞质域或细胞质膜。在一个特别优选的实施方案中，本发明基本上纯化的抗体特异性结合本发明蛋白氨基酸序列的分泌序列或胞外域。在一个更优选的实施方案中，本发明基本上纯化的抗体特异性结合标记物蛋白氨基酸序列的分泌序列或胞外域。
通过标准技术，如亲和层析或免疫沉淀，抗本发明蛋白的抗体可用于分离蛋白。此外，该抗体可用于检测标记物蛋白或其片段(如，在细胞裂解液或细胞上清液中)以评估标记物表达的水平和模式。该抗体也可用于诊断以监测组织或体液中(如，在乳腺相关体液中)蛋白水平，作为临床试验程序的一部分，如，用于确定给定治疗方案的有效性。通过使用抗体衍生物，其包含偶联有可检测物质的本发明的抗体，可促进检测。可检测物质的例子包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三吖嗪胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
在治疗癌症中本发明的抗体也可用作为治疗剂。在一个优选实施方案中，本发明的全人抗体被用于治疗性处理人癌症患者，特别是那些患乳腺癌的患者。在另一个优选实施方案中，特异性结合标记物蛋白或其片段的抗体被用于治疗性处理。此外，该治疗性抗体可以是抗体衍生物或免疫毒素，包含缀合有治疗部分如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子的抗体。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的试剂。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素，放线菌素D、1-去氢睾甾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、萘氧丙醇胺和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。治疗剂包括，但不限于，抗代谢物(如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)，烷化剂(如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺铂(II)(DDP))，蒽环类抗生素(如，柔红霉素(原柔红霉素)和阿霉素)，抗生素(如，放线菌素D(原放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(如，长春新碱和长春碱)。
本发明缀合的抗体可用于减轻特定的生物反应，对于药物部分而言，并不解释为限制经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。该蛋白可包括，例如，毒素，如核糖体抑制蛋白(见，Better等，美国专利第6,146,631号，其所公开的全文在此引入作为参考)，相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂；或，生物反应调节剂，如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
用于将上述治疗部分缀合到抗体的技术是众所周知的，参见如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等.(编)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等.(编)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”，in Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications，Pinchera，等，(编)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等，(编)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“THE PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
因此，在一方面，本发明提供了基本上纯化的抗体、抗体片段和衍生物，其全部都特异性结合本发明的蛋白，以及优选地，结合标记物蛋白。在各种实施方案中，本发明基本上纯化的抗体，或其片段或衍生物，可以是人、非人、嵌合和/或人源化抗体。在另一方面，本发明提供了非人抗体、抗体片段和衍生物，其全部都特异性结合本发明的蛋白，以及优选地，结合标记物蛋白。上述非人抗体可以是山羊、小鼠、绵羊、马、小鸡、兔或大鼠抗体。可选地，本发明的非人抗体可以是嵌合和/或人源化抗体。此外，本发明的非人抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。还在另一方面，本发明提供了单克隆抗体、抗体片段和衍生物，其全部都特异性结合本发明的蛋白，以及优选地，结合标记物蛋白。单克隆抗体可以是人、人源化、嵌合和/或非人抗体。
本发明也提供了一种试剂盒，其含有缀合有可检测物质的本发明抗体和使用说明书。本发明的另一方面是包含本发明抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的抗体、治疗部分和药学上可接受的载体。
重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一方面涉及载体，优选表达载体，其含有编码标记物蛋白(或该蛋白一部分)的核酸。在本文中使用时，术语“载体”指能转运与它连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指一种环状双链DNA，在它上面可以连接其它DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，可以将其它DNA片段连接到该病毒基因组上。某些载体在其所导入的宿主细胞中能自主复制(如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如，非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时被整合入宿主细胞基因组中，以及因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体，称为表达载体，能指导可操作地与它连接的基因的表达。一般而言，在重组DNA技术中所用的表达载体通常是质粒(载体)的形式。然而，本发明还包括这样的其它形式的表达载体，如病毒载体(如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们能发挥相同的功能。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其以合适于在宿主细胞中表达该核酸的形式存在。意味着该重组表达载体包括一种或多种调节序列，根据要用于表达的宿主细胞选择该序列，其可操作地连接要表达的核酸序列。重组表达载体中“可操作地连接”规定为表示感兴趣的核苷酸序列以一种能够表达该核苷酸序列的方式连接到调节序列(如，当该载体导入宿主细胞时，在体外转录/翻译系统中或在宿主细胞中)。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其它表达调控元件(如，多腺苷酸化信号)。上述调节序列被描述，例如，于Goeddel，Methods in Enzymology：Gene Expression Technology vol.185，Academic Press，San Diego，CA(1991)中。调节序列包括那些在许多种宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的和那些仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的序列(如，组织特异性调节序列)。本领域的技术人员可以理解的是表达载体的设计可基于这些因素，如所选择的要转化的宿主细胞、所需蛋白的表达水平等。本发明的表达载体可导入宿主细胞中，因此产生蛋白或肽，包括融合蛋白或肽，它们由本文所述的核酸编码。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核(如，大肠杆菌)或真核细胞(如，昆虫细胞{使用杆状病毒表达载体}、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达标记物蛋白或其片段。合适的宿主细胞进一步讨论于Goeddel，出处同上。可选地，重组表达载体可在体外转录并翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
在原核生物中进行的蛋白表达最通常在大肠杆菌中进行，采用含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体。融合载体添加许多氨基酸到编码蛋白中，通常在重组蛋白的氨基末端。上述融合载体一般满足三种目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的可溶性；和3)通过在亲和纯化中作为配体有助于重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白连接处导入蛋白酶裂解位点，以便能够在纯化融合蛋白后将重组蛋白与融合部分分离。上述酶和它们的相关识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合于靶重组蛋白的pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，1988，Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等，1988，Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等，p.60-89，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology vol.185，Academic Press，San Diego，CA，1991)。来自pTrc载体的靶基因表达取决于来自杂合体trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET 11d载体的靶基因表达取决于来自T7 gn10-lac融合启动子的通过病毒RNA聚合酶(T7gn1)共表达介导的转录。在lacUV5启动子转录控制的条件下，通过宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)，由存留的携带T7gn1基因的原噬菌体提供病毒聚合酶。
一种使大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的策略是在蛋白水解裂解重组蛋白的能力受损的细菌宿主中表达蛋白(Gottesman，p.119-128，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology vol.185，Academic Press，San Diego，CA，1990)。另一种策略是改变要被插入表达载体的核酸的核酸序列，使得对于每个氨基酸而言各自的密码子是那些在大肠杆菌中能优先利用的(Wada等，1992，Nucleic AcidsRes.20：2111-2118)。上述本发明核酸序列的改变可通过标准的DNA技术进行。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。在啤酒糖酵母(S.Cerevisiae)中用于表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari等，1987，EMBO J.6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz等，1987，Gene 54：113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(InvitrogenCorp，San Diego，CA)。
可选地，表达载体是杆状病毒表达载体。可用于在培养的昆虫细胞(如，Sf 9细胞)中表达蛋白的杆状病毒表达载体包括pAc系列(Smith等，1983，Mol.Cell.Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Luchlow和Summers，1989，Virology 170：31-39)。
还在另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987，Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等，1987，EMBO J.6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常提供自病毒调控元件。例如，一般使用的启动子是来源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其它合适于原核和真核细胞的表达系统见Sambrook等，出处同上，的16和17章。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够优先在特定细胞类型中指导核酸表达(如，组织特异性调控元件被用于表达核酸)。组织特异性调控元件为本领域已知。合适的组织特异性启动子非限制性例子包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等，1987，Genes Dev.1：268-277)，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988，Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体(Winoto和Baltimore，1989，EMBOJ.8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等，1983，Cell33：729-740；Queen和Baltimore，1983，Cell 33：741-748)，神经元特异性启动子(如，神经微丝启动子；Byrne和Ruddle，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等，1985，Science 230：912-9160)和乳腺特异性启动子(如，牛奶乳清启动子；美国专利第4,873,316号和欧洲专利公开号264,166)。也包含发育调节启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss，1990，Science 249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Camperand Tilghman，1989，Genes Dev.3：537-546)。
本发明进一步提供了包含以反义方向克隆入表达载体的本发明DNA分子的重组表达载体。就是说，该DNA分子以一种允许RNA分子表达的方式(通过DNA分子的转录)可操作地连接调节序列，该RNA分子反义于编码本发明多肽的mRNA。可以选择与以反义方向克隆的核酸可操作地连接的调节序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或可以选择调节序列，其指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞特异性表达。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中在高效调节区调控下产生反义核酸，其活性可通过该载体导入的细胞类型来决定。使用反义基因调节基因表达的讨论见Weintraub等，1986，Trends inGenetics，Vol.1(1)。
本发明的另一方面涉及已导入本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可交换地使用。可以理解的是该术语不仅指特定的受试者细胞，也指该细胞后代或潜在的后代。因为，由于突变或环境影响，某些修饰可存在于后代中，所以后代可能实际上与亲本细胞并不相同，但仍包括在本文中所使用的该术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核(如，大肠杆菌)或真核细胞(如，昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞)。
通过常规的转化或转染技术，载体DNA可导入原核或真核细胞中。在本文中使用时，术语“转化”和“转染”规定为指将外源核酸导入宿主细胞的多种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。适合用于转化或转染宿主细胞的方法可见Sambrook等(出处同上)，和其它实验室手册。
为了稳定转染哺乳动物细胞，业已了解的是，根据所使用的表达载体和转染技术，仅有少部分细胞可将外源DNA整合入它们基因组中。为鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择标记(如，对抗生素有抗性的)的基因与感兴趣的基因一同导入宿主细胞中。优选的选择标记包括那些赋予对药物如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的标记。用导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物筛选来鉴定(如，已整合选择标记的细胞将存活，而其它细胞则死亡)。
本发明的宿主细胞，如培养中的原核或真核宿主细胞可用于产生标记物蛋白或其片段。因此，本发明进一步提供了使用本发明的宿主细胞生产标记物蛋白或其片段的方法。在一个实施方案中，该方法包含在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中导入了编码标记物蛋白或其片段的重组表达载体)，使得产生标记物蛋白或其片段。在另一个实施方案中，该方法进一步包含从培养基或宿主细胞中分离标记物蛋白或其片段。
本发明的宿主细胞也可用于产生非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是已导入编码标记物蛋白或其片段的序列的受精卵母细胞或胚胎干细胞。接着，该宿主细胞可用于产生非人转基因动物，其中编码本发明标记物蛋白的外源基因序列已导入它们的基因组中，或产生同源重组动物，其中编码标记物蛋白的外源基因已改变。上述动物可用于研究标记物蛋白的功能和/或活性，以及用于鉴定和/或评估标记物蛋白的调节剂。在本文中使用时，“转基因动物”指非人动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物如大鼠或小鼠，其中一或多个动物细胞包括转基因。其它的转基因动物的例子包括非人灵长类、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是外源DNA，其整合入发育成转基因动物的细胞基因组中，以及在成熟动物的基因组中仍存在，因此在该转基因动物一种或多种细胞类型或组织中指导编码的基因产物的表达。在本文中使用时，“同源重组动物”指非人动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，其中在动物发育前，通过内源基因和导入动物细胞(如动物的胚细胞)的外源DNA分子之间同源重组改变了内源基因。
可通过将编码标记物蛋白的核酸导入受精卵母细胞的雄性原核中产生本发明的转基因动物，如通过显微注射、逆转录病毒感染和使卵母细胞在假孕雌性饲养动物中发育。在转基因中也包括内含子序列和多腺苷酸化信号以增加该转基因表达效率。组织特异性调节序列可操作地与转基因连接以指导本发明多肽在特定细胞中的表达。通过胚胎操作和显微注射用于产生转基因动物，特别是小鼠等动物的方法，已经成为本领域的常规方法，以及描述于，例如，美国专利第4,736,866号和4,870,009号，美国专利第4,873,191号和Hogan，Manipulatingthe Mouse Embryo，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1986中。类似的方法被用于产生其它的转基因动物。基于在其基因组中转基因的存在和/或编码转基因的mRNA在该动物组织或细胞中的表达可鉴定转基因生成动物。接着，转基因生成动物可用于繁殖带有转基因的其它动物。此外，具有转基因的转基因动物可进一步培育成具有其它转基因的转基因动物。
为产生同源重组动物，制备含有编码标记物蛋白的基因的至少一部分的载体，在该基因中已导入缺失、添加或取代，因此改变了该基因，如，功能上破坏该基因。在一个优选实施方案中，载体可设计使得在同源重组时，内源基因功能上受到破坏(即，不再编码功能蛋白；也称为“敲除”载体)。可选地，载体可设计使得在同源重组时，内源基因突变或以别的方式改变，但仍然编码功能蛋白(如，上游调控区可改变，由此改变了该内源蛋白的表达)。在同源重组载体中，基因改变的部分在其5′和3′末端侧翼于额外的基因核酸，以便于在载体携带的外源基因与胚胎干细胞中内源基因之间的同源重组。额外的侧翼核酸序列具有足够的长度以便于成功地与内源基因同源重组。通常，几千个碱基的侧翼DNA(在5′和3′末端)包括在载体中(参见如Thomas和Capecchi，1987，Cell 51：503 for a description of homologousrecombination vectors)。该载体被导入胚胎干细胞系中(如，通过电穿孔)，以及导入的基因已与选定的内源基因同源重组的细胞中(参见如，Li等，1992，Cell 69：915)。接着将选定的细胞注射到动物(如，小鼠)胚泡中以形成聚集嵌合体(参见如Bradley，Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，Robertson，编.，IRL，Oxford，1987，pp.113-152)。接着，嵌合胚被植入合适的假孕雌性饲养动物中，并让该胚胎发育成熟。在生殖细胞中携带了同源重组DNA的后代可用于繁殖动物，其中通过种系传递转基因，该动物的所有细胞含有同源重组DNA。用于构建同源重组载体和同源重组动物的方法进一步描述于Bradley(1991)Current Opinion inBio/Technology 2：823-829和PCT公开号WO 90/11354，WO 91/01140，WO 92/0968，和WO 93/04169中。
在另一个实施方案中，可产生转基因非人动物，其含有允许转基因的受调节表达的选择的系统。该系统的一个例子是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。对于cre/loxP重组酶系统的描述参见如，Lakso等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236。另一个重组酶系统的例子是啤酒糖酵母的FLP重组酶系统(O′Gorman等，1991，Science 251：1351-1355)。如果cre/loxP重组酶系统用于调节转基因的表达，需要含有编码Cre重组酶和选定蛋白的转基因的动物。可通过构建“双”转基因动物来提供上述动物，如，通过将两种转基因动物交配，一种含有编码选定蛋白的转基因，另一种含有编码重组酶的转基因。
根据描述于Wilmut等.(1997)Nature 385：810-813和PCT公开号WO 97/07668及WO 97/07669中的方法也可产生非人转基因动物的克隆。
药物组合物
可将本发明的核酸分子、多肽、和抗体(在本文中也被称为“活性化合物”)掺入适合给药的药物组合物中。所述所述组合物通常包含所述核酸分子、蛋白或抗体以及药学上可接受载体。在本文中所使用的术语“药学上可接受载体”意在包括与药用相容的任何或所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂，及类似物。用于药用活性物质的所述介质和制剂的使用在本领域中是众所周知的。除非与所述活性化合物不相容，任何常见介质或制剂都可预见应用于所述组合物中。还可将补充性活性化合物掺入所述组合物中。
本发明包括制备调节标记物核酸或蛋白表达或活性的药物组合物的方法。所述方法包括将药学上可接受载体与调节核酸或蛋白标记物表达或活性的试剂一起配制。所述组合物可进一步包括额外的活性剂。因此，本发明进一步包括用于制备药物组合物的方法，包括将药学上可接受载体与调节标记物核酸或蛋白表达或活性的试剂和一种或多种额外的活性剂配制在一起。
本发明也提供了鉴定调节剂的方法(在本文中也被称为“筛选试验”)，调节剂即候选物或受试化合物或试剂(如，肽、模拟肽、类肽、小分子或其它药物)，其可以(a)与所述标记物结合，或(b)对所述标记物活性具有调节(如，刺激或抑制)效应，或更特别地(c)对所述标记物与其一个或多个天然底物(如，肽、蛋白、激素、辅因子或核酸)的相互作用具有调节效应，或(d)对所述标记物的表达具有调节效应。所述测定通常包含在所述标记物和一或多个测定成分之间的反应。其它成分可以是受试化合物本身，或是受试化合物与所述标记物天然结合配偶体的组合。
本发明的受试化合物可从任何可能的来源获得，包括天然和/或合成化合物的系统文库。受试化合物也可通过本领域已知众多组合文库方法中的任一方法而获得，包括：生物文库；类肽文库(具有肽功能以及新的、非肽主链的分子文库，其抗酶降解但仍然具有生物活性；参见如Zuckermann等，1994，J.Med.Chem.37：2678-85)；可空间寻址的平行固相或液相文库；需要解卷积的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；以及使用亲合层析选择的合成文库方法。所述生物文库和类肽文库方法仅限用于肽文库，而所述其它四种方法可适用于化合物的肽、非肽寡聚物或小分子文库(Lam，1997，Anticancer DrugDes.12：145)。
分子文库合成方法的例子可在现有技术中找到，例如在：DeWitt等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等(1994).J.Med.Chem.37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl 33：2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl 33：2061；以及在Gallop等(1994)J.Med.Chem.37：1233。
化合物文库可呈溶液形式(如，Houghten，1992，Biotechniques13：412-421)，或在珠(Lam，1991，Nature 354：82-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、细菌和/或孢子(Ladner，美国专利第5,223,409号)、质粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89：1865-1869)上或在噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science249：386-390；Devlin，1990，Science 249：404-406；Cwirla等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner，出处同上)。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选候选或受试化合物的测定，其中所述化合物是蛋白的底物，所述蛋白由标记物或其生物活性部分编码或相应于标记物或其生物活性部分。在另一个实施方案中，本发明提供了筛选候选或受试化合物的测定，其中所述化合物与蛋白结合，所述蛋白由标记物或其生物活性部分编码或相应于标记物或其生物活性部分。可进行受试化合物直接与蛋白结合能力的测定，例如通过将所述化合物与放射性同位素或酶标记偶联，从而使所述化合物与标记物的结合可通过检测复合物中标记的标记物化合物来测定。例如，化合物(如标记物底物)可用125I、35S、14C或3H直接或间接地，以及能用放射发射直接计数或闪烁计数检测的同位素来标记。可选地，测定成分可用如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶、以及通过合适底物转化为产物的确定而检测的酶标记来进行酶促标记。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选候选或受试化合物的测定，其中所述化合物调节标记物的表达或蛋白的活性，所述蛋白由标记物或其生物活性部分编码或相应于标记物或其生物活性部分。在所有的可能性中，由标记物编码或相应于标记物的蛋白可在体内与一或多个分子相互作用，例如但不仅限于，肽、蛋白、激素、辅因子和核酸。为了论述的目的，所述细胞和细胞外分子在本文中被称为“结合配偶体”或标记物“底物”。
为了便于所述筛选，本发明的一个必要实施方案是使用由标记物编码或相应于标记物的蛋白鉴定蛋白天然的体内结合配偶体。对于本领域技术人员而言，有许多已知的方法可完成上述筛选。一个例子是在双杂交实验或三杂交实验中把标记物蛋白用作为“诱饵蛋白”(参见如美国专利第5,283,317号；Zervos等，1993，Cell 72：223-232；Madura等，1993，J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等，1993，Biotechniques 14：920-924；Iwabuchi等，1993 Oncogene8：1693-1696；Brent WO94/10300)，以鉴定能与所述标记物(结合配偶体)结合或相互作用的其它蛋白，并因此可能参与所述标记物的天然功能。所述标记物结合配偶体也可能涉及通过标记物蛋白或标记物蛋白介导的信号传递途径的下游元件进行的信号传递。可选地，所述标记物蛋白结合配偶体也被发现可以是所述标记物蛋白的抑制剂。
双杂交系统是基于大多数转录因子组件性质的，其由可分离的DNA结合和活化结构域组成。简而言之，所述测定利用两个不同的DNA构建体。在一个构建体中，编码标记物蛋白的基因与编码已知转录因子(如，GAL-4)的DNA结合域的基因融合。在另一个构建体中，来自DNA序列文库的编码未鉴定蛋白(“猎物”或“样品”)的DNA序列与编码已知转录因子活化结构域的基因融合。如果“诱饵”和“猎物”蛋白能在体内相互作用，形成标记物依赖的复合物，则转录因子的DNA结合和活化结构域变得很靠近。这种靠近使得与转录调节位点可操作地相连的报道基因(如，LacZ)的转录反应于转录因子。报道基因的表达可容易地被检测出，并且包括功能性转录因子的细胞集落可被分离并用于获得克隆的基因，所述基因编码与所述标记物蛋白相互作用的蛋白。
在另一个实施方案中，为鉴定调节(如正或负影响)标记物蛋白与其底物和/或结合配偶体之间相互作用的化合物，可通过应用本发明来设计测定方法。所述化合物可包括，但不仅限于，诸如抗体、肽、激素、寡核苷酸、核酸及其类似物的分子。所述化合物也可从任何可获得的来源中获得，包括天然和/或合成化合物的系统文库。用于本实施方案中的优选的测定成分是在本文中鉴定出的乳腺癌标记物蛋白、已知的结合配偶体和/或相同的底物、以及受试化合物。受试化合物可从任何来源获得。
用于鉴定干扰所述标记物蛋白与其结合配偶体之间相互作用的化合物的测定系统的基本原理涉及在足以使两个产物相互作用和结合从而形成复合物的条件和时间下，制备包括标记物蛋白及其结合配偶体的反应混合物。为测试试剂的抑制活性，在受试化合物存在或不存在的条件下制备反应混合物。受试化合物可一开始就包括在反应混合物中，或在加入标记物蛋白及其结合配偶体后再被添加。对照反应混合物在不存在受试化合物或具有安慰剂的条件下温育。然后检测所述标记物蛋白及其结合配偶体之间任意复合物的形成。对照反应中形成复合物，但在包含受试化合物的反应混合物中较少或没有所述的形成，表明所述化合物干扰标记物蛋白及其结合配偶体的相互作用。反之，在存在化合物的条件下比对照反应中形成了更多的复合物，表明所述化合物可增强标记物蛋白及其结合配偶体的相互作用。
可以异质(heterogeneous)或同质(homogeneous)形式进行干扰标记物蛋白及其结合配偶体相互作用的化合物的测定。异质测定包括把标记物蛋白或其结合配偶体锚定在固相上并在反应结束时检测锚定在固相上的复合物。同质测定中，在液相中进行整个反应。在两种方法中，可以改变添加反应物的顺序以获得不同的关于受试化合物的信息。例如，干扰标记物蛋白及其结合配偶体相互作用(如通过竞争)的化合物可通过在存在受试物质的条件下进行反应来鉴定，即在标记物及其相互反应的结合配偶体加入前或同时把受试物质加进反应混合物。可选地，破坏预先形成的复合物的受试化合物，如能置换复合物中一个成分的具有较高结合常数的化合物，可通过在复合物形成后把受试化合物加入反应混合物中来进行测试。所述不同的方式简要描述如下。
在异质测定系统中，标记物蛋白或其结合配偶体锚定在固体表面或基质上，而其它相应的非锚定成分可直接或间接地被标记。实际上，微量滴定板常用于该方法。通过许多非共价或共价的方法固定锚定的种类，这些方法对本领域所属技术人员来说通常是众所周知的。经常简单地通过用标记物蛋白或其结合配偶体溶液包被固体表面并干燥来进行非共价结合。可选地，待锚定的测定成分的特异性的固定化抗体也可用于此。所述表面经常被提前制备并储存起来。
在相关的实施方案中，提供一种融合蛋白，其增加了使一或两个测定成分锚定于基质的结构域。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/标记物融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/结合配偶体可吸附于谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，然后其与受试化合物，或与受试化合物与非吸附标记物或其结合配偶体组合，并且所述混合物在有利于形成复合物的条件(如生理条件)下温育。温育后，洗涤珠或微量滴定板上的孔以除去任何未结合的测定成分，直接或间接评估固定化的复合物，例如，如上文所述的。可选地，所述复合物可从基质上解离，并可利用标准技术确定标记物结合或活性水平。
其它把蛋白固定于基质上的技术也可用于本发明的筛选试验中。例如，标记物蛋白或标记物蛋白结合配偶体可以利用缀合生物素和链亲和素来固定。利用本领域已知技术(如，生物素化试剂盒，PierceChemicals，Rockford，IL)用生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的标记物蛋白或靶分子，并固定于链亲和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。在某些实施方案中，可提前制备固定了蛋白的表面并储存起来。
为了进行所述测定，固定的测定成分的相应部分暴露于有或没有受试化合物的包被的表面。反应完成后，除去(如洗去)未反应的测定成分，任何形成的复合物仍然固定于固相表面上。有许多方法可进行锚定在固相表面上的复合物的检测。在预标记了未固定的成分时，检测到固定在表面上的标记，表明形成了复合物。在没有预标记未固定的成分时，间接标记可用于检测锚定在表面上的复合物；如，利用对最初未固定物质具有特异性的标记的抗体(所述抗体依次可直接标记或用如标记的抗Ig抗体来间接标记)。根据加入反应成分的顺序，可检测调节(抑制或增强)复合物形成的或破坏预形成复合物的受试化合物。
在本发明替换的实施方案中，可使用同质测定。这通常是一个与上述那些反应相似的反应，其在受试化合物存在或不存在的条件下在液相中进行。然后从未反应的成分中分离形成的复合物，并测定复合物的形成量。如异质试验系统所述的，反应物加入液相的顺序可得出受试化合物调节(抑制或增强)复合物形成和破坏预形成复合物的信息。
在所述的同质试验中，通过使用众多标准技术，包括但不仅限于：差示离心、层析、电泳和免疫沉淀，从未反应的测定成分中分离反应产物。在差示离心中，通过一系列离心步骤，根据基于复合物不同大小和密度的不同沉淀平衡状态，分子复合物可从未复合的分子中分离出来(参见如，Rivas，G.，和Minton，A.P.，Trens Biochem Sci 1993Aug；18(8)：284-7)。标准的层析技术也可用于从未复合的分子中分离复合的分子。例如，凝胶过滤层析以大小为基础，并通过利用层析柱中合适的凝胶过滤树脂分离分子，例如，相对较大的复合物可从相对较小的未复合成分中分离出来。相似地，复合物较之未复合分子相对不同的电荷性质可用来从残留的各个反应物中差示分离所述复合物，例如通过应用离子交换层析树脂。所述树脂和层析技术对本领域技术人员而言是众所周知的(参见如，Heegaard，1998，J Mol.Recognit11：141-148；Hage和Tweed，1997，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，699：499-525)。也可用凝胶电泳从未结合物中分离复合的分子(参见如，Ausubel等(编)，Current Protocols in MolecularBiology，J.Wiley & Sons，New York.1999)。例如，在该技术中，蛋白或核酸复合物根据大小或电荷来分离。为了在电泳过程中保持互相结合作用，通常优选不存在还原剂的非变性凝胶，而适合特定相互作用物的条件对于本领域技术人员来说是众所周知的。免疫沉淀是另一种用于从溶液中分离蛋白质-蛋白质复合物的常用技术(参见如，Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley& Sons，New York.1999)。在该技术中，通过将抗体与可容易通过离心收集的聚合物珠缀合，与特异于结合分子之一的抗体结合的所有蛋白可从溶液中沉淀出来。所述结合的测定成分从珠中释放出来(通过特异性蛋白水解事件或其它不干扰复合物中蛋白质-蛋白质相互作用的众所周知的技术)，并进行第二步免疫沉淀步骤，这次利用的是对相应地不同相互反应性的测定成分的特异的抗体。在该方法中，仅有形成的复合物仍将附着于珠上。可以比较在受试化合物存在或不存在的条件下复合物形成的变化，从而提供了关于化合物调节标记物蛋白及其结合配偶体之间的相互作用的能力的信息。
在同质或异质测定系统中，不进行进一步样品操作而直接检测标记物蛋白及其天然结合配偶体和/或受试化合物之间相互作用的方法也在本发明的范围之内。例如，可用荧光能量转移的技术(参见如Lakowicz等，美国专利第5,631,169号；Stavrianopoulos等，美国专利第4,868,103号)。一般而言，该技术包括在第一“供体”分子(如标记物或受试化合物)上添加荧光标记从而通过第二“受体”分子(如标记物或受试化合物)上的荧光标记吸收发射的荧光能量，接着基于吸收的能量而发出荧光。可选地，“供体”蛋白分子可简单利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同光波长的标记，从而使“受体”分子标记可与“供体”分子区分。由于标记间能量转换的效率与分子分离距离相关，因此可测定分子间空间关系。在分子之间发生结合的条件下，在所述测定中“受体”分子标记的荧光发射应最大化。可通过本领域众所周知的标准荧光检测方法(如利用荧光计)方便地测量FET结合事件。能增强或阻止预形成复合物中的一种物质的参与的受试物质会导致与背景不同的信号产生。以此方式，在控制的测定中可鉴定调节标记物与其结合配偶体之间的相互作用的受试物质。
在另一个实施方案中，用一种方法鉴定标记物表达的调节剂，其中细胞与候选化合物接触并测定细胞中mRNA或蛋白标记物的表达。将存在候选化合物时标记物mRNA或蛋白的表达水平与不存在候选化合物时标记物mRNA或蛋白质的表达水平相比较。然后根据该比较结果，候选化合物可被鉴定为标记物表达的调节剂。例如，标记物mRNA或蛋白在存在候选化合物的条件下比不存在时表达得更多(统计上明显更多)时，则所述候选化合物就被鉴定为标记物mRNA或蛋白表达的刺激剂。相反地，标记物mRNA或蛋白在存在候选化合物的条件下比不存在时表达得更少(统计上明显更少)时，则所述候选化合物就被鉴定为标记物mRNA或蛋白表达的抑制剂。通过在本文中所述的检测mRNA或蛋白标记物的方法可以确定细胞中标记物mRNA或蛋白的表达水平。
在另一方面，本发明涉及在本文中所述的两个或更多测定的组合。例如，利用基于细胞的或无细胞的试验，可以鉴定调节剂，并在体内可进一步确证试剂调节蛋白标记物活性的能力，如在完整动物模型中确证细胞转化和/或肿瘤发生。
本发明进一步涉及由上述筛选试验鉴定的新试剂。因此，在合适动物模型中进一步使用在本文中所鉴定的试剂，包括在本发明范围内。例如，在本文中所鉴定的试剂(如，标记物调节剂、反义标记物核酸分子、标记物特异性抗体、或标记物结合配偶体)可用在动物模型中以测定用所述试剂治疗的有效性、毒性、或副作用。可选地，本文中所鉴定的试剂可用在动物模型中以测定所述试剂的作用机理。另外，本发明涉及由上述筛选试验鉴定的新试剂在本文所述的治疗中的应用。
可以理解，合适剂量的小分子试剂和蛋白或多肽试剂依赖于许多因素，这是在普通医生、兽医或研究人员的知识范围内。例如，根据处理的受试者或样品的特性、大小、和状况，如果可行，进一步根据给予组合物的途径以及医师希望试剂对本发明核酸或多肽所产生的效果来改变这些试剂的剂量。小分子剂量的例子包括每公斤患受试者或样品重量的毫克或微克量(如约每公斤1微克至约每公斤500毫克、约每公斤100微克至约每公斤5毫克、或约每公斤1微克至约每公斤50微克)。蛋白或多肽剂量的例子包括每公斤受试者或样品体重的克、毫克或微克量(如约每公斤1微克至约每公斤5克、约每公斤100微克至约每公斤500毫克、或约每公斤1毫克至约每公斤50毫克)。进一步可知道这些试剂之一的合适剂量依赖于与调节表达或活性相关的试剂的效力。利用本文所述的测定确定所述合适的剂量。例如，当一种或多种这些试剂给予动物(如人)从而调节本发明的多肽或核酸的表达或活性时，医生、兽医或研究人员可以首先给出较低剂量的处方，接着增加剂量直至获得合适的反应。另外，可知道任何特定动物受试者的特定剂量水平依赖于多种因素，包括所使用的特定试剂的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别、以及饮食、给药时间、给药途径、排泄率、任何药物组合、和要调节的表达或活性程度。
将本发明的药物组合物配制成与其预期的给药途径相容。给药途径的例子包括肠胃外途径，如，静脉内、皮内、皮下、口服(如吸入)、经皮(外用)、经黏膜、以及直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下使用的溶液或悬浮液包括以下成分：诸如注射用水的无菌稀释剂、盐溶液、固定的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和调节渗透压的试剂，如氯化钠或葡萄糖。pH可用如盐酸或氢氧化钠的酸或碱调节。肠胃外制剂可包装在玻璃或塑料制的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量管瓶中。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中是水溶性的)或分散液，和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。为在静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的，并且其流动性应当达到容易注射的程度。在生产和储存的条件下它必须是稳定的，并且必须防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。所述载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，以及类似物)及其合适的混合物。例如，可通过使用诸如卵磷脂的包衣保持分散液所需的粒度以及通过使用表面活性剂保持合适的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞、及类似物实现抑制微生物的作用。在很多场合下，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨醇、或氯化钠。可通过在组合物中加入延长吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，延长可注射组合物的吸收时间。
可通过将所需数量的活性化合物(如多肽或抗体)与上面列举的成分之一或其组合一起掺入合适的溶剂中制备无菌注射溶液，如果需要，接着过滤消毒。一般而言，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质的无菌赋形剂中，然后掺入上面所列举的必需的其它成分可制备分散液。对于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由此可产生活性成分和来自上述无菌过滤溶液的任何其它必需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可装在凝胶胶囊中或压成片剂。为了口服治疗给药，活性化合物可与赋形剂混合并制成片剂、锭剂或胶囊形式使用。口服组合物也可用流体载体制备成漱口水，其中流体载体中的化合物可口服使用，洗漱并吐出或吞咽。
药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可添加作为所述组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊、锭剂、及类似物能包含以下成分中的任意一种或包含具有相似性质的化合物：诸如微晶纤维素的粘合剂、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；滑动剂，如胶状二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或香味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙香剂。
为了通过吸入给药，所述化合物以气溶胶喷雾形式从加压容器或分配器或雾化器中喷出，所述加压容器或分配器包括合适的推进剂，例如，气体，如二氧化碳。
也可通过经粘膜或经皮方式系统给药。为经粘膜或经皮给药，在该制剂中使用适合穿透屏障的穿透剂。所述穿透剂一般为本领域已知的，并包括，例如对于经粘膜给药而言，洗涤剂、胆盐、和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂可实现经粘膜给药。对于经皮给药而言，如本领域所普遍公知的，活性化合物可制备为软膏、敷膏、凝胶或霜剂。
所述化合物也可以栓剂(如，使用常规的栓剂基料，如可可脂和其它甘油脂)或保留灌肠剂形式制备，用于直肠递送。
在一个实施方案中，所述活性化合物是与载体一起制备的，所述载体能防止该化合物从体内快速清除，如控制释放制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，比如亚乙基乙烯乙酸酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。制备所述制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。也可从Alza公司和Nova制药有限公司获得商品化的原料。还可将脂质体悬浮液(包括脂质体，在其中或其上带有单克隆抗体)也可用作药学上可接受载体。根据本领域技术人员已知的方法，如美国专利第4,522,811号所述的，可以制备所述悬浮液。
为了便于给药以及剂量的统一性，以剂量单位形式制备口服或肠胃外组合物是特别有利的。本文所用的剂量单位指的是适合作为待治疗受试者的单位剂量的、在物理上独立的单位；每个单位包含预定数量的活性化合物，它是计算出的能与需要的药物载体一起产生需要的治疗效果的用量。有关本发明剂量单位形式的规定，是由活性化合物的特征和要获得的特定治疗效果，以及本领域中在将所述活性化合物用于治疗个体所固有的制约所决定的，并且直接取决于这些因素。
对于抗体而言，优选剂量为0.1mg/kg至100mg/kg体重(一般10mg/kg至20mg/kg)。如果抗体作用在脑，则通常合适的剂量为50mg/kg至100mg/kg。一般而言，部分人抗体和全人抗体在人体中比其它抗体具有更长的半衰期。因此，经常可用较低的剂量和较低的给药频率。诸如脂化的修饰可用于稳定抗体并增加吸收和组织穿透。Cruikshank等.(1997)J.Acquired Immune Deficiency Syndromes andHuman Retrovirology 14：193描述了脂化抗体的方法。
本发明也提供了预防和/或治疗乳腺癌的疫苗组合物。本发明提供了乳腺癌疫苗组合物，其中为了刺激抗乳腺癌免疫应答而向受试者导入表1的标记物蛋白、或表1的标记物蛋白的组合。本发明也提供了乳腺癌疫苗组合物，其中向受试者导入表达表1鉴定的标记物或其片段的基因表达构建体，从而使受试者中转染的细胞产生了高于正常水平的由表1标记物编码的蛋白或蛋白片段并引发免疫应答。
在一个实施方案中，提供并使用乳腺癌疫苗作为预防乳腺癌的免疫治疗剂。在另一个实施方案中，提供并使用乳腺癌疫苗作为治疗乳腺癌的免疫治疗剂。
作为例子，通过各种途径，如皮内、皮下、或肌内而给予疫苗，从而包含表1标记物蛋白的乳腺癌疫苗可以用于预防和/或治疗受试者的乳腺癌。另外，乳腺癌疫苗可与佐剂和/或免疫调节剂一起给药以增强疫苗的活性和受试者的应答。在一个实施方案中，适于持续或间隔释放的包含所述疫苗的装置和/或组合物可以植入体内或局部应用于体内，以便相对较慢地释放所述材料。乳腺癌疫苗可以与免疫调节分子一起导入，免疫调节分子可改变产生的免疫应答的类型从而产生更有效去除癌的应答。
在另一个实施方案中，通过肌肉注射，或通过包被到微粒上并利用为高速将微粒射入皮肤而设计的装置，可以导入包含表1标记物的表达构建体的乳腺癌疫苗。然后受试者细胞会表达表1的标记物蛋白或蛋白片段并诱导出免疫应答。另外，乳腺癌疫苗可以与免疫调节分子，如细胞因子的表达构建体一起导入，其可增加免疫应答或调节产生的免疫应答的类型从而产生更有效去除癌的应答。
标记物核酸分子可以插入载体中并用作基因治疗载体。通过如静脉注射、局部给药(美国专利第5,328,470号)，或通过立体定向注射(参见如Chen等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)，可把基因治疗载体递送到受试者体内。基因治疗载体的药物制剂可包括在可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可包含包埋了基因递送赋形剂的缓释基质。可选地，从重组细胞中可以完整产生完整的基因递送载体，如逆转录病毒载体，所述药物制剂则可以包括一或多个能产生基因递送系统的细胞。
所述药物组合物可以与指导给药的说明书一起包装在容器、包装物或分配器中。
预测医学
本发明涉及预测医学领域，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学以及监测临床试验用于预后(预测)目的从而预防性地处理个体。因此，本发明的一个方面涉及诊断测定以确定一或多个蛋白或核酸标记物的表达水平，这是为了确定个体是否有发生乳腺癌的危险。这些测定可以用于预后(预测)目的从而在癌症发生前预防性地处理个体。
而本发明的另一方面涉及在临床试验中监测试剂(例如，为了抑制乳腺癌或治疗或预防其它病症{即为了了解所述处理过程可能有任意致乳腺癌效果}而给予的药物或其它化合物)对本发明标记物表达或活性的影响。它们以及其它试剂在以下章节中会有进一步详细叙述。
诊断测定
用于监测生物样品中标记物蛋白或核酸存在或不存在的示例方法包括从受试者中获得生物样品(如与乳腺相关的体液)并且使生物样品接触能检测多肽或核酸(如mRNA、基因组DNA、或cDNA)的化合物或试剂。因而本发明的检测方法能在诸如体外和体内的生物样品中用于检测mRNA、蛋白质、cDNA、或基因组DNA。例如，mRNA的体外检测技术包括Northern杂交和原位杂交。标记物蛋白的体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀以及免疫荧光法。基因组DNA的体外检测技术包括Southern杂交。另外，标记物蛋白的体内检测技术包括向受试者导入抗蛋白或其片段的标记的抗体。例如，用放射性标记来标记抗体，通过标准成像技术就能检测出其在受试者中的存在与位置。
所述诊断和预后测定的普遍原理包括在合适条件下制备包含标记物的样品或反应混合物和探针，并经过一段足以使标记物和探针相互作用并结合的时间，从而在反应混合物中形成能被除去和/或检测的复合物。可以用各种方式进行这些测定。
例如，进行这种测定的一个方法可以包括把标记物或探针锚定在固相支持物，也被称为基质上，并在反应结束时检测锚定在固相支持物上的靶标记物/探针复合物。在这种方法的一个实施方案中，将要测定标记物存在和/或浓度的受试者样品，可以被锚定在载体或固相支持物上。在另一个实施方案中，也可能是相反的情况，其中把探针锚定在固相上并把患者样品当作测定中未锚定成分来进行反应。
已有许多现成的方法可将测定成分锚定到固相上去。这包括，但不仅限于，通过生物素和链亲和素缀合而固定的标记物或探针分子。这种生物素化的测定成分可以利用本领域已知的技术(如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)中制备，并固定于链亲和素包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。在某些实施方案中，可以提前制备固定了测定成分的表面并储存起来。
其它适于所述测定的载体或固相支持物包括任何能结合标记物或探针所属种类的分子的材料。众所周知的支持物或载体包括，但不仅限于，玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺，辉长岩以及磁铁矿。
为了用上述方法进行测定，向其上锚定了第二成分的固相物中加入未固定的成分。反应完成后，在形成的复合物仍会固定在固相上的条件下去除(如，洗去)未复合上去的成分。可以用在本文中所述的众多方法来进行锚定在固相上的标记物/探针复合物的检测。
在优选实施方案中，当探针为未锚定的测定成分时，为了测定的检测和读出之用，可以用本文所讨论的和本领域技术人员的众所周知的可检测标记来直接或间接地标记探针。
不通过进一步操作或标记这两种成分(标记物或探针)也可以直接检测标记物/探针复合物的组成，如通过利用荧光能量转移技术(参见如，Lakowicz等，美国专利第5,631,169号；Stavrianopoulos等，美国专利第4,868,103号)。例如，选用在第一“供体”分子上的荧光标记，用合适波长的入射光来激发时，其发射的荧光能量用在第二“受体”分子上的荧光标记来吸收，其接着根据吸收的能量发出荧光。可选地，“供体”蛋白分子可简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同光波长的标记，从而“受体”分子标记可以从“供体”的波长中区分出来。由于标记间能量转移的效率与分子分离距离相关，因此可以测定出分子间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下，测定中“受体”分子标记的荧光发射会变得最大。通过已知标准的荧光测定检测方法(如利用荧光计)可以方便地测出FET结合情况。
在另一个实施方案中，不标记这两种测定成分(探针或标记物)而利用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)(参见如，Sjolander，S.和Urbaniczky，C.，1991，Anal.Chem.63：2338-2345以及Szabo等，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705)等技术就能进行探针识别标记物能力的测定。在本文中使用的“BIA”或“表面等离子共振”，指的是不通过标记任何相互作用物(如，BIAcore)而实时研究生物特异性相互作用的技术。结合表面质量的改变(指示结合情况)导致近表面处光折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，这导致产生了能用作指示生物分子间实时反应指示的检测信号。
可选地，在另一个实施方案中，可用液相中用作溶质的标记物和探针来进行相似的诊断和预后测定。在所述测定中，通过众多标准技术把复合的标记物和探针从未复合成分中分离出来，包括但不见限于：差示离心、层析、电泳和免疫沉淀。在差示离心中，通过一系列离心步骤，根据基于复合物不同大小和密度的不同沉淀平衡状态，标记物/探针复合物可从未复合的测定成分中分离出来(参见如，Rivas，G.，和Minton，A.P.，Trens Biochem Sci 1993Aug；18(8)：284-7)。标准的层析技术也可用于从未复合的分子中分离复合的分子。例如，凝胶过滤层析以大小为基础，并通过利用层析柱中合适的凝胶过滤树脂分离分子，例如，相对较大的复合物可从相对较小的未复合成分中分离出来。相似地，标记物/探针复合物较之未复合成分相对不同的电荷性质可用来从未复合的成分中差示分离所述复合物，例如通过应用离子交换层析树脂。所述树脂和层析技术对本领域技术人员而言是众所周知的(参见如，Heegaard，1998，J Mol.Recognit 11：141-148；Hage和Tweed，1997，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，699：499-525)。也可用凝胶电泳从未结合成分中分离复合的测定成分(参见如，Ausubel等(编)，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley & Sons，New York.1999)。例如，在该技术中，蛋白或核酸复合物根据大小或电荷来分离。为了在电泳过程中保持结合相互作用，通常优选非变性凝胶和不存在还原剂的条件。特定的测定的合适条件及其成分是本领域技术人员公知的。
在一个特定的实施方案中，利用本领域已知方法通过原位和体外形式的方法都可以用来确定生物样品中的mRNA标记物的水平。术语“生物样品”其意包括分离自受试者的组织、细胞、生物流体及其分离物，以及受试者体内的组织、细胞和流体。许多表达检测方法利用了分离的RNA。对于体外方法，任何不阻止mRNA分离的RNA分离技术可以用于从乳腺细胞中纯化RNA(参见如，Ausubel等编的Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York 1987-1999)。另外，可以利用本领域技术人已知的技术，比如Chomczynski的单步RNA分离流程(1989，美国专利第4,843,155号)，来迅速处理大量组织样品。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，其包括但不仅限于，Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。一个优选的检测mRNA水平的诊断方法包括把分离的mRNA同核酸分子(探针)接触，所述核酸分子能同要检测基因编码的mRNA杂交。例如，核酸分子探针可以是全长cDNA或其部分，比如寡核苷酸，其长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并足以在严格条件下与编码本发明标记物的mRNA或基因组DNA特异杂交。其它用在本发明诊断测定中的合适探针也在本文中描述。mRNA同探针的杂交表明所考虑的标记物正在被表达。
在一种形式中，例如通过在琼脂糖凝胶上电泳分离的mRNA并从胶上把mRNA转移到诸如硝酸纤维素的膜上，使得mRNA固定在固体表面上并与探针接触。在可选的形式中，例如在Affymetrix基因芯片阵列中，使探针固定在固体表面上并使探针与mRNA接触。本领域技术人员能够容易改变已知的mRNA检测方法使之用于检测本发明标记物编码的mRNA的水平中。
确定样品中mRNA标记物水平的可选的方法包括核酸扩增方法，如用rtPCR(Mullis所阐述的实验实施方案，1987，美国专利第4,683,202号)、连接酶链反应(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193)、自持续序列复制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.AcadSci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology 6：1197)、滚环复制(Lizardi等，美国专利第5,854,033号)或任何其它核酸扩增方法，接着利用本领域技术人员已知的技术来检测扩增的分子。如果所述分子存在数量非常低，则这些检测方案对于检测核酸分子尤其有用。在此所用的扩增引物定义为核酸分子对，其能与基因(分别是正链和负链，或反之亦然)的5′或3′区退火并在引物对间包含了一个短区域。一般地，扩增引物长度约为10至30个核苷酸并且侧翼于长度约50至200个核苷酸的区域。在合适条件下并用合适的试剂，则这些引物使得包含了侧翼于引物的核苷酸序列的核酸分子扩增。
对于原位方法，mRNA不必在检测前从乳腺细胞中分离出来。在该方法中，用已知组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后将样品固定于支持物上，通常是玻片，然后同能与编码标记物的mRNA杂交的探针接触。
作为进行基于标记物的绝对表达水平的测定的替换，测定可以基于标记物标准化了的表达水平。通过比较其表达与不作为标记物的基因，如，与组成型表达的管家基因的表达，来纠正标记物绝对表达水平，使得表达水平标准化。用来标准化的合适基因包括管家基因，如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。标准化使得可以比较一个样品(如患者样品)同另一个样品(如非乳腺癌样品)的表达水平，或不同来源样品之间的表达水平。
可选地，表达水平可以规定为相对表达水平。为了测定标记物的相对表达水平，在测定所考虑的样品表达水平前，用正常细胞对癌细胞分离物的10个或更多样品来测定标记物的表达水平，优选50个或更多样品。测定更大量样品中每个测定基因的平均表达水平并将其用作标记物的基线表达水平。然后，测试样品所测得的标记物表达水平(绝对表达水平)除以该标记物所得的平均表达值。这就提供了相对表达水平。
优选地，用于基线测定的样品来自乳腺组织的乳腺癌或非乳腺癌细胞。依据相对表达水平的应用来选择细胞来源。把正常组织中发现的表达用作平均表达分值以帮助确认所测的标记物是否是乳腺特异性的(相对于正常细胞)。另外，当积累了更多的数据后，可以修正平均表达值，基于累积的数据得出改进的相对表达值。乳腺细胞的表达数据提供了一种将乳腺癌严重程度分级的方法。
在本发明另一个实施方案中，检测标记物蛋白。本发明优选的检测标记物蛋白的试剂是能与该蛋白或其片段结合的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选地，是单克隆的。可以使用完整的抗体、或其片段或衍生物(如Fab或F(ab′)2)。涉及引物或抗体的术语“标记的”，其意在包括通过把可检测物质与探针或抗体偶联而直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的其它试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的例子包括利用荧光标记的第二抗体检测第一抗体和用生物素末端标记DNA探针从而使其可用荧光标记的链亲和素来检测。
利用本领域技术人员已知的技术可以分离乳腺细胞的蛋白质。例如，所用的蛋白质分离方法如Harlow和Lane文(Harlow和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)中所述的那样。
可以用多种形式来确定样品是否包含与特定抗体结合的蛋白。所述形式的例子包括，但不仅限于，酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、Western印迹分析以及酶联免疫吸附测定(ELISA)。本领域技术人员可以容易改变已知的蛋白质/抗体检测方法来用于测定乳腺细胞是否表达本发明的标记物。
在一种方法中，抗体或抗体片段或衍生物可以用在诸如Western印迹或免疫荧光技术的方法中来检测表达的蛋白质。在所述应用中，一般优选把抗体或蛋白质固定在固体支持物上。合适的固相支持物或载体包括任何能结合抗原或抗体的支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺，辉长岩以及磁铁矿。
本领域技术人员会知道许多其它结合抗体或抗原的合适载体，并能改变这种支持物以应用于本发明。例如，乳腺细胞中分离的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并固定于诸如硝酸纤维素的固相支持物上。然后可以用合适的缓冲液洗涤支持物，接着用可检测标记的抗体处理。然后第二次用缓冲液洗涤支持物以去除未结合的抗体。然后通过常规的方法检测固体支持物上结合的标记的量。
本发明也包括检测生物样品(如乳腺相关体液，如乳腺穿刺物)中蛋白或核酸存在的试剂盒。可以用所述试剂盒测定受试者是否正患有乳腺癌或发生乳腺癌的危险增加。例如，所述试剂盒可包含一种能检测生物样品中标记物蛋白或核酸的化合物或试剂以及测定样品中蛋白或mRNA量的装置(如，结合蛋白或其片段的抗体，或结合编码蛋白质的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒也可包括用于解释用试剂盒得到结果的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可包含，如：(1)结合标记物蛋白的第一抗体(如，附着在固体支持物上的)；和，任选地，(2)不同的第二抗体，其结合蛋白或第一抗体并与可检测标记缀合。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒可包含，如：(1)寡核苷酸，如，可检测标记的寡核苷酸，其与编码蛋白标记物的核酸序列杂交，或(2)用于扩增核酸分子标记物的引物对。所述试剂盒也可包含，如，缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。所述试剂盒可进一步包含对于检测可检测标记所必需的成分(如酶或底物)。所述试剂盒也可包含一个对照样品或一系列对照样品，其可被测定并与测试样品相比较。所述试剂盒的每个成分可以与用于解释用试剂盒进行测定所得的结果的说明书一起包装在各个容器中，而且各种容器都可以装置在单个包装物中。
药物基因组学
本发明的标记物也可用作药物基因组学的标记物。这里所用的“药物基因组学的标记物”指客观的生化标记物，其表达水平与患者的特异临床药物反应或易感性相关(如参见McLeod等.(1999)Eur.J.Cancer 35(12)：1650-1652)。药物基因组学的标记物表达的存在或数量与用特定药物或药物种类治疗的患者的预测反应有关，更具体地是与患者对肿瘤的反应有关。通过评估患者中的一或多个药物基因组学的标记物表达的存在或数量，可以选出最适合于患者的或预计有更大成功程度的药物疗法。例如，根据患者中特异肿瘤标记物编码的RNA或蛋白的存在或数量，可以选择最优化的用于治疗患者可能存在的特定肿瘤的药物或疗程。因此应用药物基因组学的标记物可以在不用尝试不同药物或疗法的情况下，对每个癌症患者选出或设计出最合适的疗法。
药物基因组学的另一方面涉及改变身体对药物作用的遗传状况。这些药物遗传状况可以以罕见的缺陷或多态性而出现。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏是常见的遗传性先天性代谢病，其中主要临床并发症是在摄取氧化药物(抗疟疾药、磺胺药、镇痛药、硝基呋喃)和食用蚕豆后出现溶血。
作为一种说明性实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的主要决定因素。药物代谢酶(如，N-乙酰转移酶2(NAT 2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)遗传多态性的发现给出了解释，即为什么有些患者在服用药物的标准和安全剂量后没有获得预期的药效或者显示出过大的药物反应和严重的毒性。这些多态性在人群中表现为两种表型，即充分代谢型(EM)和不良代谢型(PM)。不同群体中PM的倾向不同。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态性，而且已经在PM中鉴定出数个突变，其均导致功能性CYP2D6缺乏。CYP2D6和CYP2C19的不良代谢型在其接受标准剂量后通常会出现过大的药物反应和副作用。假如代谢物是活性治疗成分，则PM将不显示治疗反应，正如通过其CYP2D6形成的代谢物吗啡介导的可待因的镇痛效果所证实的。其它极端情况是所谓的超快代谢型，其对标准剂量没有反应。近来，已确定出超快代谢的分子基础是由于CYP2D6基因扩增。
因此，可以测定本发明标记物在个体中的表达水平从而选出治疗或预防个体的合适试剂。另外，可以利用药物基因组学研究运用编码药物代谢酶的多态性等位基因的基因型分析来鉴定个体的药物反应表型。该知识，当应用于给药或药物选择时，能够避免不良反应或治疗失败，因而在用本发明标记物表达的调节剂治疗患者时，可增强治疗或预防功效。
监测性临床试验
监测试剂(如，药物化合物)对本发明标记物表达水平的影响不仅可以用在基础药物筛选中，而且可用在临床试验中。例如，在接受乳腺癌治疗的受试者的临床试验中能监测试剂影响标记物表达的效力。在优选的实施方案中，本发明提供了一种用试剂(如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白、肽、核酸、小分子、或其它候选药物)监测受试者的治疗有效性的方法，包括如下步骤(i)在给予试剂前从患者中获取给药前的样品；(ii)检测给药前样品中一个或多个所选的本发明标记物的表达水平；(iii)从受试者中获取一个或多个给药后样品；(iv)检测给药后样品中的标记物的表达水平；(v)把给药前样品中的标记物表达水平同给药后样品中的标记物表达水平相比较；和(vi)据此改变给予患者的试剂。例如，在治疗过程中标记物的表达增加可以显示出无效的剂量和增加剂量的需求。相反地，标记物基因的表达减少可以显示出有效的治疗并且不需要改变剂量。
电子设备可读介质和阵列
这也提供了包括本发明标记物的电子设备可读介质。在本文中所用的“电子设备可读介质”是指任何用于储存、保持或容纳数据或信息的介质，其可用电子设备直接读出和访问。这种介质包括，但不仅限于：磁储存介质，如软盘、硬盘储存介质、和磁带；光储存介质，如光盘；电储存介质，如RAM、ROM、EPROM、EEPROM以及类似物；一般的硬盘和这些种类的混合产品，如磁/光储存介质。改变或配置介质使其上记录本发明的标记物。
在本文中使用时，术语“电子设备”其意在包括为存储数据或信息而配置或改变的任何合适的计算或处理设备或其它装置。适合用于本发明的电子设备的例子包括单机计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网(WAN)因特网、企业内部互联网以及外部互联网；电器，如个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机及类似物；和本地或分布式处理系统。
在本文中使用时，“记录”是指用于在电子设备可读介质上储存或编码信息的过程。本领域技术人员能够容易地采用当前已知的任何方法在已知的介质上记录信息来生产包括本发明标记物的产品。
可用各种软件程序和格式在电子设备可读介质上储存本发明标记物信息。例如，标记物核酸序列可以用字处理文本文件来表示，其可用商业化软件的格式，如WordPerfect和MicroSoft Word，或者用ASCII文件的形式来表示，其储存于数据库应用程序中，如DB2、Sybase、Oracle或类似程序，以及用其它形式。为了获得或创建其上记录有本发明标记物的介质，可以用许多数据处理器结构格式(如文本文件或数据库)。
通过以可读形式提供本发明标记物，技术人员可以为各种目的存取地访问标记物序列信息。例如，所属领域技术人员可以用可读形式的本发明核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序同储存在数据储存装置中的序列信息相比较。利用检索工具来鉴定本发明序列中匹配特定靶序列或靶结构基序的片段或区域。
因此本发明提供了一种为执行确定受试者是否患乳腺癌或易患乳腺癌的方法而保存指令的介质，其中所述方法包括以下步骤：确定标记物存在或不存在，并基于标记物的存在或不存在，确定受试者是否患乳腺癌或易患乳腺癌和/或推荐特定的治疗乳腺癌或乳腺癌前状况的方法。
本发明进一步在电子系统和/或网络中提供一种确定受试者是否患乳腺癌或易患与标记物相关的乳腺癌的方法，其中所述方法包括以下步骤：确定标记物存在或不存在，并基于标记物的存在或不存在，确定受试者是否患乳腺癌或易患乳腺癌，和/或推荐特定的治疗乳腺癌或乳腺癌前状况的方法。该方法可以进一步包括接受与受试者相关的表型信息和/或从网络中获得与受试者相关的表型信息的步骤。
本发明也在网络中提供了一种确定受试者是否患乳腺癌或易患与标记物相关的乳腺癌的方法，所述方法包括接受与标记物相关的信息、接受与受试者相关的表型信息、从网络中获得相应于标记物和/或乳腺癌信息的步骤，并基于一个或多个表型信息、标记物、和所获得的信息，确定受试者是否患乳腺癌或易患乳腺癌。该方法可以进一步包括推荐特定的乳腺癌或乳腺癌前状况治疗的步骤。
本发明也提供了一种确定受试者是否患乳腺癌、生长迅速的乳腺癌、或易患乳腺癌的商业方法，所述方法包括接受与标记物相关的信息、接受与受试者相关的表型信息、从网络中获得相应于标记物和/或乳腺癌信息的步骤，并基于一个或多个表型信息、标记物、和所获得的信息，确定患者是否患乳腺癌或易患乳腺癌。该方法可以进一步包括推荐特定的乳腺癌或乳腺癌前状况治疗的步骤。
本发明也包括一种包含本发明标记物的阵列。所述阵列可用于测定阵列中一个或多个基因的表达。在一个实施方案中，阵列可用于测定组织中的基因表达以确定阵列中基因的组织特异性。用这种方式，可同时测定最多至大约7600个基因的表达。这可以开发特征图谱以显示在一个或多个组织中特异表达的一组基因。
除了这些定性测定方法，本发明可以定量基因表达的情况。因此，不仅是组织特异性的，而且组织中一组基因的表达水平也是能确定的。因此，基因可以基于其组织表达本身和该组织中表达水平来分组。例如，这可用在确定组织之间的基因表达的关系中。因此，可以干扰一个组织并且测定对第二个组织中的基因表达的影响。在本文中，可以测定一种细胞类型反应于生物刺激而对另一种细胞类型产生的影响。例如，这种测定方法可用于了解在基因表达水平上的细胞-细胞相互作用的影响。如果治疗性地给予试剂以处理一种细胞类型，但其具有对另一种细胞类型的不良影响，则本发明提供了一种测定以确定不良影响的分子基础并据此提供共同给予抵消试剂或另外处理不良影响的机会。相似地，即使在单一细胞类型中，也可以在分子水平上测定不良生物影响。因此，可以确定并抵消试剂对于除靶基因之外的基因表达的影响。
在另一个实施方案中，所述阵列可被用于监测阵列中一个或多个基因表达的时程。如此处所述，这可以发生在各种生物内容中，例如乳腺癌的发生、乳腺癌的进展、以及过程，如与乳腺癌相关的细胞转化。
所述阵列也可用于确定在相同细胞中或在不同细胞中一个基因表达对另外的基因表达的影响。这提供了，如在不能调节最终或下游靶时，可以选择治疗干预的替代的分子靶。
所述阵列也可用于确定在正常或异常的细胞中一个或多个基因差示表达模式。这提供了一组基因，其能用作诊断或治疗干预的分子靶。
替代标记物
本发明的标记物可以用作一种或多种病症或疾病状态或者导致病态状态的状况的替代标记物，尤其是乳腺癌的。这里所用的“替代标记物”是一个客观的生化标记物，其与疾病或病症的缺乏或存在、或与疾病或病症的进展相关(如，与肿瘤的存在或不存在)。所述标记物的存在或数量不依赖于疾病。因而，这些标记物用来显示特定治疗过程是否能有效减轻疾病状态或病症。当疾病状态或病症难以用标准方法来评估时(如早期阶段的肿瘤)，或在达到潜在危险的临床终点前已需要评估疾病进展时(如，在心肌梗塞或完全发展成AIDS的不良临床结局显现前，用胆固醇水平作为替代标记物评估心血管疾病，和用HIV RNA水平作为替代标记物分析HIV感染)，替代标记物尤其有用。本领域的替代标记物应用的例子包括：Koomen等.(2000)J.Mass.Spectrom.35：258-264；和James(1994)AIDS Treatment News Archive209。
本发明的标记物也可用作药代动力学标记物。这里所用的“药代动力学标记物”是一个客观的生化标记物，其特异地与药物效果相关。药代动力学标记物的存在或数量并不与给予药物的疾病状况或病症相关；因此，药代动力学标记物的存在或数量可作为受试者的药物存在或活性的指标。例如，药代动力学标记物可指示生物组织中药物浓度，因为在该组织中标记物是相关于药物水平而被表达的或转录的，或是未被表达或转录的。以这种方式，用药代动力学标记物监测药物的分布或摄取。相似地，药代动力学标记物的存在或数量可以与药物代谢产物的存在或数量相关，以便标记物的存在或数量可指示体内的药物相对分解速度。药代动力学标记物尤其可应用于增加检测药物效果的灵敏度，尤其在以低剂量给予药物的时候。由于即使是少量的药物也足以活化大量标记物的转录或表达，因此扩增的标记物在量上比药物本身更容易检测。而且，由于标记物本身的性质使得标记物更容易检测；例如，利用在此所述的方法，在基于免疫的检测系统中用抗体做蛋白标记物，或用标记物特异性放射性标记探针来检测mRNA标记物。另外，应用药代动力学标记物可以提供以机理为基础的危险预测，所述危险是由于超出可能的直接观察范围之外的药物治疗。应用现有本领域中的药代动力学标记物的例子包括：Matsuda等的US 6,033,862；Hattis等.(1991)Env.Health Perspect.90：229-238；Schentag(1999)Am.J.Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3：S21-S24；和Nicolau(1999)Am，J.Health-Syst.Pharm.56 Suppl.3：S16-S20。
实施例1：用cDNA和组织微阵列鉴定乳腺癌标记物
I.材料和方法
样品收集和RNA制备
收集乳腺组织并速冻于液氮中。在提取RNA前先确认组织的组织学和细胞成分。利用Trizol试剂(Life Technologies)从冷冻的组织中提取总RNA，接着用Qiagen的Rneasy试剂盒进行二次洗涤步骤以增加RNA探针标记效率(Qiagen，Valencia CA)。在琼脂糖凝胶电泳后进行RNA乙锭染色，计算出28S/18S核糖体RNA比率至少为1.0的RNA才应用于本研究中。
cDNA微阵列杂交
包括得自Research Genetics(Hunstville，AL)的30,732个单基因克隆的cDNA微阵列在尼龙滤膜上产生。通过逆转录方法使用33P-dCTP、寡dT-30引物以及Superscript II逆转录酶(LifeTechnologies)，把总共4-6μg的总RNA用作模板以制备放射性标记的cDNA。用cot-1DNA和聚dA 40-60(Pharmacia，Peapack，NJ)预退火33P标记的第一链cDNA以减少非特异性杂交。用约6X106个计数的标记的探针在缓冲液中在65℃下杂交每块滤膜16小时，缓冲液包含7％十二烷基硫酸钠(SDS)、250mM Na3PO4(pH 7.2)、1mM EDTA、0.5％酪蛋白-Hammerstein和0.1mg/ml变性的鲑鱼精子DNA。用4％和1％SDS洗涤缓冲液(20mM Na3PO4(pH 7.2)，1mM EDTA和4％或1％SDS)洗滤膜后，将其置于Fuji磷成像仪屏幕下并用BAS 2500型扫描仪扫描。用由Millennium Pharmaceuticals公司开发的自动分析程序GridGuru v1.0对这些点进行定量。
标记物得分算法和数据分析
为纠正杂交效率的差异，用滤膜上所有点的中值强度来标准化每个阵列滤膜上的数字化数据。进行基于阵列和基于基因的分级分簇并用Stanford的Gene Cluster和Tree View软件使之可视化。通过计算每个基因的标记物得分使差异表达的基因分级。
为计算标记物得分，把样品分成对照和试验组。标记物得分的起始点是试验样品高于对照样品的平均倍数变化(比率)。设计得分使之反映出差异表达的变化程度(表达比率)和试验样品数，而不被少部分有很高值的测试样品所支配。为减少该“逸出值”效应，把表达比率大于10的基因当作不是有意义地不同于表达比率为10的那些。在利用跨试验样品的平均倍数变化前，用渐近压缩函数通过改变试验：对照表达比率来完成所需的标记物得分运算。当试验组并不比对照更高表达时，标记物得分记为1，反之则值大于1。任何基因的标记物得分不会超过10。
因此，基因g的标记物得分Sg计算作为如下的各个试验和对照水平的加权强度比率的平均值：
Sg＝(∑Sgs)/N试验
Sgs＝C(xgs/(k+xg Q))，其中Sgs代表基因g和样品s的标记物得分，
C(r)是压缩函数，当r≥1时C(r)＝A(1-e-r/A)，且当r＜1时C(r)＝1，
A是倍数变化值的上渐近数(我们用10)，
xgs是样品s中基因g的表达值，
xg Q是样品表达值的百分之Q；通常，Q＝50，
k是反映数据中外加噪声的常数，即，重复测量中变量的固定成分。该参数从用微阵列技术的校准试验中得到0.25的值。
N试验试验样品的数量。
组织微阵列的原位杂交
这里提供一种福尔马林固定的、石蜡包埋的乳腺组织微阵列。用自动组织-Tek DRS 2000玻片染色仪(Sakura，Torrance，CA)根据前述方法(Duncan，L.M.，等，2001，J.Clin.Oncol.19(2)：568-576)来进行预杂交处理。用含4％多聚甲醛的PBS对乳腺组织脱蜡、再水化，后固定15分钟。用PBS洗后，用2μg/ml蛋白酶K于37℃消化组织微阵列15分钟，再用4％多聚甲醛/PBS温育10分钟。接着用0.2N HCl温育组织切片10分钟，用0.25％醋酸酐/0.1mol/L三乙醇胺温育10分钟，并用乙醇梯度脱水。利用源自IMAGE克隆的500ng线性化质粒DNA，用体外转录反应中的35S-UTP(Riboprobe Combination System，Promega，Madison，WI)标记反义探针。利用5X107cpm/ml下在10mM Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液中标记的探针在50℃下杂交18小时，其中缓冲液包含50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、1xDenhardt氏溶液、0.6M NaCl、10mMDTT、0.25％SDS和200μg/ml tRNA。杂交后，用5x标准柠檬酸盐液(SSC)在50℃下洗玻片10分钟，用50％甲酰胺/2X SSC在50℃下洗30分钟，用10mM Tris-HCl(pH 7.6)/500mM NaCl/1mM EDTA(TNE)在37℃下洗10分钟，在含10μg/ml RNA酶的TNE中在37℃下温育30分钟，用TNE在37℃下洗涤10分钟，在2xSSC中在50℃下温育20分钟一次，在0.2xSSC中在50℃下温育20分钟二次，并用乙醇梯度脱水。在KodakNTB2型照相乳胶(Eastman Kodak，Rochester，NY)中浸泡玻片并在4℃下曝光14-21天，以此测定mRNA转录产物的位置。玻片用Myers苏木精和乙醇曙红Y复染。
用定量PCR进行基因表达分析
通过
Figure BSA00000681163300791
定量PCR(Applied Biosystems)在从正常和患病(如癌)的人组织样品制备的cDNA中测量基因表达。简言之，按照厂商的说明书(Invitrogen)利用TRIZOL试剂，用单步法从患者样品制备总RNA。用DNA酶I(Ambion)在37℃下处理每个RNA制备物1小时。利用β-2微小球蛋白作为内部扩增对照，样品如果需要至少38个PCR扩增循环以达到荧光阈值水平(或18s核糖体基因进行35个PCR扩增循环)，则确定DNA酶I处理已完成。DNA酶I处理后，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来确认RNA样品的完整性。用苯酚提取RNA后，根据厂商的说明书(Applied Biosytems)利用Taqman逆转录试剂从样品中制备cDNA。未加逆转录酶的RNA阴性对照针对每个RNA样品进行模拟逆转录。
基于特定基因及其相关转录产物序列，用Primer Express软件(Applied Biosystems)设计探针。每个靶基因探针用FAM(6-羧基荧光素)标记，而18s参照探针用不同的荧光染料VIC来标记。因此靶基因和内部对照基因不一样的标记能使测定在同一个孔中进行。检测引物和探针对特定基因的每个转录产物的灵敏度和特异性。把18s和靶基因的正向和反向引物和探针加入到
Figure BSA00000681163300801
通用PCR主混合物(AppliedBiosystems)中。尽管引物和探针的终浓度可能发生变化，但是每个在特定实验中都是内在一致的。对于18s，典型的实验包含100nM正向和反向引物加上200nM探针，对于靶基因，包含900nM正向和反向引物加上250nM探针。在ABI PRISM 7700型序列检测系统(AppliedBiosystems)上进行
Figure BSA00000681163300802
基质实验。热循环条件如下：50℃下维持2分钟并在95℃下维持10分钟，接着进行两步PCR：95℃下15秒40个循环的，接着60℃下1分钟。
应用以下方法定量计算相对于相同组织中的18s表达，各种组织中的基因表达。阈循环(Ct)值定义为检测到荧光有统计学显著增加的循环。较低的Ct值指示了较高的mRNA浓度。应用以下公式：ΔCt＝Ct(靶转录产物)-Ct(18s)，扣除18s核糖体基因的C t值使基因的Ct值标准化从而获得ΔCt值。然后用2-ΔCt给出的算术公式计算相对表达。
II.结果
筛选标记物选择
通过在上文材料和方法部分定义的转录谱分析，使用来自于乳腺筛选组的mRNA，鉴定表1中列出的所有标记物，所述筛选组由“乳腺肿瘤合并物”(3个乳腺肿瘤患者样品)、“乳腺正常合并物”(3个正常乳腺上皮患者样品)和“其它正常合并物”(来自于正常心脏、肾、小肠、脾、白细胞、肺、肝、脑、骨髓和结肠患者组织样品的一个样品)和“其它肿瘤合并物”(4个宫颈癌、5个结肠肿瘤、各种类型的8个肺癌患者样品、4个卵巢肿瘤样品和5个前列腺肿瘤样品)的患者样品组成。与乳腺正常、其它正常或其它肿瘤的表达相比，至少25％的乳腺肿瘤中表达至少高3倍的克隆被称作乳腺肿瘤特异性筛选标记物。选择这些cDNA克隆以确定它们的蛋白编码转录物序列。
为了确定所选cDNA克隆的全长蛋白编码转录物，用所选克隆的序列查询公共和私有的序列数据库，以便鉴定其它具有显著重叠的EST序列或簇。这样，将邻接的EST序列和/或簇组装到蛋白编码转录物中。按如下描述进行所有要求保护的标记的替代转录物分析。
采用现有的将任意给定标记物基因的已知核苷酸序列作图到人基因组序列的方法，并且通过额外将任意给定标记物基因的新核苷酸序列作图到人基因组序列上(如，使用“UCSC基因组浏览器”等资源或具有相似功能的内部资源，结合允许快速和精确将研究序列作图到基因组序列上的BLAT等算法)，确定标记物基因的外显子-内含子结构，其中额外考虑了匹配相同基因的EST序列。
设计PCR引物以便从感兴趣的组织和对照样品扩增给定标记物基因的编码序列。由此分析得到的具有改变编码序列潜力的标记物基因的替代的5’或3’末端，导致设计出了对此替代的末端特异的额外引物。
将用来源于乳腺肿瘤标本的cDNA模板获得的PCR产物克隆到质粒载体中，并且通过DNA序列分析进行表征。典型地，通过PCR产物的限制消化和凝胶电泳，或通过DNA序列分析，分析96个克隆。
对以2％或更高的频率存在的代表替代的基因转录物的克隆进行测序。通过基于所有可获得的序列在人工管理的组装(重叠群)中包含的可读框(ORF)的鉴定而完成相应于这些替代转录物的蛋白序列的鉴定。在序列表和表1中命名了这些鉴定的序列。
在从患者组织标本制备的cDNA中通过
Figure BSA00000681163300811
定量PCR(AppliedBiosystems)证实了具有鉴定的替代转录物的基因的差别基因表达。在某些情况下(如BCMP11，DNAJC1和NPY1R)制备对给定基因鉴定的所有转录物敏感的基因特异性
Figure BSA00000681163300812
试剂。此外，对某些标记物的每种转录物(如M725，M726，M727，M111，M149，M730，M165A，M731，M732，M96A，M739，M740，M741，M716，M717)分别开发剪接形式特异性
Figure BSA00000681163300821
试剂。一个例外是，发现了具有相似扩增效率的、证明不同的肿瘤-正常表达的基因特异性以及转录物特异性表达谱。在一种情况下(M731，一种NPY1R转录物)，用
Figure BSA00000681163300822
PCR没有证明表达，这假定是由于该转录物的低冗余性。
分期标记物选择
通过材料和方法部分定义的转录谱分析，使用来自具有良好结局(定义为无病存活期大于5年)的23个IDC淋巴结阴性乳腺肿瘤和具有不良临床结局(定义为无病存活期小于3年)的16个IDC淋巴结阴性乳腺肿瘤的mRNA鉴定表2中列出的所有标记物。与在良好临床结局肿瘤中的表达相比，表达比至少25％的不良临床结局肿瘤至少高3倍的克隆，被称作不良临床结局肿瘤特异性标记物。选择这些cDNA克隆来确定它们的蛋白编码转录物序列。
按照上文关于筛选标记物的描述进行选定的cDNA克隆的全长蛋白编码转录物的确定。鉴定的序列在表2和序列表中命名。通过
Figure BSA00000681163300823
定量PCR(Applied Biosystems)，在从具有良好结局和不良结局的侵入性导管癌(IDC)肿瘤的患者组织标本制备的cDNA中证实鉴定的替代转录物的差别基因表达。对每种转录物开发剪接形式特异性TaqMan引物和探针试剂组，用每种基因的所有试剂组获得相似的扩增效率(参见表3)。
通过基于所有可获得的序列在人工管理的组装(重叠群)中包含的可读框(ORF)的鉴定而完成相应于这些替代转录物的蛋白序列的鉴定。在表2和序列表中命名了这些鉴定的蛋白序列。
表3.乳腺癌分期标记物差别表达
实施例2：通过终点PCR进行基因表达分析
I.材料和方法
简言之，合并来自不同样品的总RNA，以便用作产生第一链cDNA的模板。将等量的每种样品包含在合并物中。乳腺筛选组由“乳腺肿瘤合并物”(3个乳腺肿瘤患者样品)、“乳腺正常合并物”(3个正常乳腺上皮患者样品)和“其它正常合并物”(来自于正常心脏、肾、小肠、脾、白细胞、肺、肝、脑、骨髓和结肠患者组织样品的一个样品)和“其它肿瘤合并物”(4个宫颈癌、5个结肠肿瘤、各种类型的8个肺癌患者样品、4个卵巢肿瘤样品和5个前列腺肿瘤样品)的患者样品组成(参见例如表2)。乳腺分期组由“肿瘤良好结局合并物”(4个腺癌患者样品)、“肿瘤不良结局合并物”(5个腺癌患者样品)、“乳腺正常合并物”(4个正常乳腺上皮患者样品)和“其它正常合并物”(来自于正常心脏、肾、小肠、脾、白细胞、肺、肝、脑、骨髓和结肠患者组织样品的一个样品)和“其它肿瘤合并物”(宫颈、结肠、肺、卵巢和前列腺肿瘤)的患者样品组成(参见例如表3)。
按照厂商的说明书(Invitrogen)利用TRIZOL试剂，用单步法从患者样品制备总RNA。用DNA酶I(Ambion)在37℃下处理每个RNA制备物1小时。将来自每个患者样品的RNA合并到4个患者合并物，如乳腺正常合并物、乳腺肿瘤合并物、其它正常合并物、其它肿瘤合并物中的一个。用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen，San Diego，CA)从五个患者合并物中的每一个获得cDNA。简言之，按照厂商的说明书，1μg RNA和1μl 50μM寡(dT)20引物以10μl体积在65℃下变性5分钟。在85℃下温育5分钟从而终止反应。最终产物用水稀释成最终体积100μl。
就在可读框外设计基因特异性引物(如表2的分类“终点PCR引物1”和“终点PCR引物2”所示)。对引物和预期的产物大小进行PCR条件的最优化。在接触循环条件下将2μl cDNA用于20μl反应中。在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上对产物进行电泳，对得到的凝胶照片进行半定量分析和评分。组织组上的终点PCR的凝胶照片以1-5的标准评分。由3人独立基于可视条带强度对每个照片评分并汇编其结果，比较得分以证实在条带的相对强度上是一致的并在需要的地方进行修饰。然后把3个得分的中值记为最终得分。
II.结果
表4.乳腺筛选终点PCR数据
Figure BSA00000681163300851
标记物在乳腺肿瘤样品中的表达水平比从其它肿瘤样品或正常样品组获得的水平高(表4)。与从乳腺正常、其它正常或其它肿瘤组获得的表达相比，用M725，M728，M729，M158A，M242，M156，M419和M149A在乳腺肿瘤组中观察到了特别强的表达。
表5.乳腺分期终点PCR数据
Figure BSA00000681163300861
标记物在不良结局组的乳腺肿瘤样品中的表达水平比从良好结局组获得的水平高(表5)。与从良好结局组获得的表达相比，用M672A，M675A，M514，M708，M710，M674，M234A，M711和M421A在不良结局组中观察到了特别强的表达。
实施例3：OSF-2剪接变体的表征
I.材料和方法
cDNA合成
按照与上文在实施例1和2中描述的程序相似的程序从3个正常和12个肿瘤乳腺组织样品分离总RNA。简言之，根据厂商的说明用TRIZOL试剂(Invitrogen，San Diego，CA)系统，然后根据厂商的说明通过RNAeasy(Qiagen，Valencia，CA)或DNA酶I(Ambion)处理。将每种样品的1μg混合到正常和肿瘤合并物中。按照上文实施例2的描述，用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen，San Diego，CA)获得cDNA。用水将最终产物稀释到400-800μl的最终体积。
用OSF-2基因特异性引物从外显子16和外显子23开始扩增cDNA，以便覆盖参与剪接变异的区域。用Primer 5.0版软件(WhiteheadInstitute，Cambridge，MA)设计PCR扩增的引物。对引物和预期的产物大小进行PCR条件最优化。采用PCR条件将0.5μl稀释的RT反应用于30μl反应，所述条件是在起始2分钟的95℃变性步骤后，进行55轮的95℃ 30秒，在60℃退火35秒和在72℃的延伸温度下延伸30秒，以及72℃下的最终延伸步骤7分钟。
克隆菌落PCR和测序
根据厂商的说明，用TOPO TA克隆试剂盒对来源于RT/PCR的两个反应的PCR产物进行凝胶纯化并克隆到pCR2.1，并且转化到大肠杆菌One-Shot化学感受态细胞(Invitrogen，San Diego，CA)中。选择得到的菌落并且按照下文中的描述用来自作为模板的正常和肿瘤合并物的菌落细胞在30μL体积中进行菌落PCR。用QIAquick 96多孔试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)纯化得到的PCR产物，并且进行测序。用带有Big Dye Terminators 1.1版的ABI 3700自动化测序仪进行测序。
用程序BLAST[Kent，2002]将所有克隆序列与OSF-2基因座的基因组序列进行比对。仅仅考虑匹配OSF-2的完整可变区，即至少跨外显子17到外显子22或跨外显子21到外显子16的序列(“定量序列”)。然后根据可变外显子17-21的存在-缺乏模式对序列分组。
II.结果
OSF-2表达经历产生8种转录变体的可变剪接事件，其特征在于外显子17-21的不同组合(在总共23个外显子中)(参见表6)。可变外显子17-19和21位于编码序列内，并且可以在不改变转录物的读框的情况下存在或缺乏，以组件方式产生不同的蛋白产物。
表6：OSF-2可变剪接变体的图表显示
  标记物ID   外显子   外显子   外显子   外显子   外显子   外显子   外显子
  M56A   16   17   18   19   20   21   22
  M733   16   17   18   19   20   22
  M734   16   18   19   20   21   22
  M735   16   18   19   20   22
  M491A   16   19   20   21   22
  M736   16   19   20   22
  M737   16   20   21   22
  M738   16   20   22
OSF-2的8种列出的剪接变体的相对表达水平在正常和肿瘤组织之间是不同的。表7描述了通过分析定量来源于正常乳腺组织和乳腺肿瘤组织的克隆的序列获得的正常和乳腺肿瘤组织中每种转录物的相对频率。
表7：组织中OSF-2剪接变体转录物的相对频率
Figure BSA00000681163300881
在正常乳腺组织中含外显子21的转录物水平增加，在乳腺肿瘤组织中缺乏外显子21的转录物水平增加(如在分析的样品中在乳腺肿瘤组织中所有转录物的总共59％缺乏外显子21，而在正常乳腺组织中所有转录物的仅仅45％缺乏外显子21)。
对于OSF-2，确定含有或缺乏外显子21的转录物的表达水平。使用两种试剂组：一种对含有外显子21的转录物特异，第二种对不含有外显子21的转录物特异。观察到了显著的肿瘤/正常的表达增加。例如，用缺乏外显子21的OSF-2转录物的特异性试剂组观察到了肿瘤样品中平均2.5倍的超量表达。在评估含有外显子21的OSF-2转录物时没有观察到这种增加。这些结果反映了上述正常和肿瘤组织之间相对转录物频率的差异和最初观察到的肿瘤组织中OSF-2的普遍超量表达，所述最初的观察是采用不能区分描述的OSF-2变体的探针，通过转录谱分析微阵列试验进行的。
在此引用的参考文献，包括本申请全文中引用的期刊文章、专利、公开的专利申请、和包括GenBank，IMAGE联盟和Derwent的数据库记录，在此并入作为参考。
其它实施方案
本领域技术人员会知道，或者在使用不超过常规实验技术的条件下，能确认本文中描述的本发明具体实施方案的许多等同实施方案。所述等同实施方案规定为被如下权利要求所涵盖。
Figure ISA00000681163400011
Figure ISA00000681163400021
Figure ISA00000681163400031
Figure ISA00000681163400051
Figure ISA00000681163400061
Figure ISA00000681163400071
Figure ISA00000681163400081
Figure ISA00000681163400091
Figure ISA00000681163400101
Figure ISA00000681163400111
Figure ISA00000681163400121
Figure ISA00000681163400141
Figure ISA00000681163400151
Figure ISA00000681163400161
Figure ISA00000681163400171
Figure ISA00000681163400181
Figure ISA00000681163400191
Figure ISA00000681163400201
Figure ISA00000681163400221
Figure ISA00000681163400231
Figure ISA00000681163400241
Figure ISA00000681163400251
Figure ISA00000681163400261
Figure ISA00000681163400281
Figure ISA00000681163400291
Figure ISA00000681163400301
Figure ISA00000681163400311
Figure ISA00000681163400321
Figure ISA00000681163400331
Figure ISA00000681163400351
Figure ISA00000681163400361
Figure ISA00000681163400371
Figure ISA00000681163400381
Figure ISA00000681163400391
Figure ISA00000681163400401
Figure ISA00000681163400411
Figure ISA00000681163400421
Figure ISA00000681163400431
Figure ISA00000681163400451
Figure ISA00000681163400461
Figure ISA00000681163400481
Figure ISA00000681163400491
Figure ISA00000681163400511
Figure ISA00000681163400521
Figure ISA00000681163400541
Figure ISA00000681163400561
Figure ISA00000681163400571
Figure ISA00000681163400581
Figure ISA00000681163400591
Figure ISA00000681163400601
Figure ISA00000681163400611
Figure ISA00000681163400621
Figure ISA00000681163400631
Figure ISA00000681163400641
Figure ISA00000681163400661
Figure ISA00000681163400671
Figure ISA00000681163400681
Figure ISA00000681163400691
Figure ISA00000681163400701
Figure ISA00000681163400711
Figure ISA00000681163400721
Figure ISA00000681163400741
Figure ISA00000681163400751
Figure ISA00000681163400761
Figure ISA00000681163400771
Figure ISA00000681163400781
Figure ISA00000681163400791
Figure ISA00000681163400801
Figure ISA00000681163400821
Figure ISA00000681163400831
Figure ISA00000681163400841
Figure ISA00000681163400851
Figure ISA00000681163400861
Figure ISA00000681163400871
Figure ISA00000681163400881
Figure ISA00000681163400891
Figure ISA00000681163400901
Figure ISA00000681163400911
Figure ISA00000681163400931
Figure ISA00000681163400941
Figure ISA00000681163400961
Figure ISA00000681163400971
Figure ISA00000681163400981
Figure ISA00000681163400991
Figure ISA00000681163401001
Figure ISA00000681163401011
Figure ISA00000681163401021
Figure ISA00000681163401041
Figure ISA00000681163401051
Figure ISA00000681163401061
Figure ISA00000681163401101
Figure ISA00000681163401131
Figure ISA00000681163401141
Figure ISA00000681163401151
Figure ISA00000681163401161
Figure ISA00000681163401171
Figure ISA00000681163401191
Figure ISA00000681163401211
Figure ISA00000681163401221
Figure ISA00000681163401231
Figure ISA00000681163401241
Figure ISA00000681163401251
Figure ISA00000681163401261
Figure ISA00000681163401271
Figure ISA00000681163401281
Figure ISA00000681163401291
Figure ISA00000681163401301
Figure ISA00000681163401341
Figure ISA00000681163401351
Figure ISA00000681163401361
Figure ISA00000681163401371
Figure ISA00000681163401391
Figure ISA00000681163401401
Figure ISA00000681163401411
Figure ISA00000681163401421
Figure ISA00000681163401431
Figure ISA00000681163401441
Figure ISA00000681163401451
Figure ISA00000681163401461
Figure ISA00000681163401491
Figure ISA00000681163401501
Figure ISA00000681163401511
Figure ISA00000681163401531
Figure ISA00000681163401541
Figure ISA00000681163401551
Figure ISA00000681163401561
Figure ISA00000681163401571
Figure ISA00000681163401581
Figure ISA00000681163401601
Figure ISA00000681163401621
Figure ISA00000681163401631
Figure ISA00000681163401641
Figure ISA00000681163401651
Figure ISA00000681163401661
Figure ISA00000681163401671
Figure ISA00000681163401681
Figure ISA00000681163401701
Figure ISA00000681163401721

Claims (45)

1.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于评估患者是否患有乳腺癌的试剂盒中的用途，其中患者是否患有乳腺癌是通过以下步骤评估的：
a)确定患者样品中WFDC2标记物的表达水平；
b)确定对照样品中WFDC2标记物的表达水平；和
c)比较患者样品中和对照样品中WFDC2标记物的表达水平，
其中患者样品与对照样品中WFDC2标记物表达水平之间的差异表明患者患有乳腺癌。
2.权利要求1的用途，其中对照样品来自具有生长缓慢的乳腺肿瘤或不具有乳腺肿瘤的受试者。
3.权利要求1的用途，其中由来自非癌症患者的乳腺细胞确定对照样品中的表达水平。
4.权利要求1的用途，其中用具有生长缓慢的乳腺肿瘤或不具有乳腺肿瘤的受试者群体的表达水平平均值预先确定对照样品中的表达水平。
5.权利要求1的用途，其中所述标记物相应于分泌的蛋白。
6.权利要求1的用途，其中所述标记物包含转录的多核苷酸或其部分。
7.权利要求1的用途，其中所述样品包含获得自患者的细胞。
8.权利要求1的用途，其中所述样品包含液体，所述液体选自血液、淋巴液、囊液、乳头穿刺液和收集自肿块活检物的液体。
9.权利要求1的用途，其中通过检测样品中标记物蛋白的存在而评估样品中标记物的表达水平。
10.权利要求9的用途，其中用与蛋白特异性结合的试剂检测标记物蛋白的存在。
11.权利要求10的用途，其中所述试剂选自抗体、抗体衍生物和抗体片段。
12.权利要求1的用途，其中通过检测样品中相应于核酸标记物的转录的多核苷酸或其部分的存在而评估样品中标记物的表达水平。
13.权利要求12的用途，其中转录的多核苷酸是mRNA或cDNA。
14.权利要求12的用途，其中检测转录的多核苷酸包括扩增转录的多核苷酸。
15.权利要求1的用途，其中通过检测样品中在严格杂交条件下与核酸标记物退火的转录的多核苷酸或其部分的存在而评估样品中标记物的表达水平。
16.权利要求1的用途，其中样品中标记物的表达水平与不患乳腺癌的患者中标记物的正常表达水平有因数为至少约2或至少约5的差异。
17.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于评估患者是否患有乳腺癌的试剂盒中的用途，其中患者是否患有乳腺癌是通过以下步骤评估的：
a)确定样品中WFDC2标记物和至少一种另外的标记物的表达水平，其中所述另外的标记物选自表1和表2所列的标记物；
b)确定对照样品中WFDC2标记物和所述另外的标记物的表达水平；和
c)比较患者样品中WFDC2标记物和所述另外的标记物的表达水平与对照样品中WFDC2标记物和所述另外的标记物的表达水平；
其中患者样品与对照样品中WFDC2标记物和所述另外的标记物的表达水平的差异表明患者患有乳腺癌。
18.权利要求16的用途，其中对照样品来自具有生长缓慢的乳腺肿瘤或不具有乳腺肿瘤的受试者。
19.权利要求16的用途，其中由来自非癌症患者的乳腺细胞确定对照样品中的表达水平。
20.权利要求18的用途，其中用具有生长缓慢的乳腺肿瘤或不具有乳腺肿瘤的受试者群体的表达水平平均值预先确定对照样品中的表达水平。
21.权利要求17的用途，其中确定至少3种标记物的表达。
22.权利要求17的用途，其中确定至少5种标记物的表达。
23.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于评估患者是否患有已经转移或容易转移的乳腺癌的试剂盒中的用途，其中患者是否患有已经转移或容易转移的乳腺癌是通过以下步骤评估的：
a)确定患者样品中WFDC2标记物的表达水平；
b)确定对照样品中WFDC2标记物的表达水平；和
c)比较患者样品和对照样品中WFDC2标记物的表达水平，
其中与对照样品中的WFDC2标记物表达水平相比，患者样品中更高的WFDC2标记物表达水平表明患者患有已经转移或容易转移的乳腺癌。
24.权利要求23的用途，其中所述评估表明患者是否患有已经转移到淋巴结或者容易转移到淋巴结的转移性乳腺癌。
25.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于预测乳腺癌患者的临床结局的试剂盒中的用途，其中乳腺癌患者的临床结局的预测是通过以下步骤：
a)确定患者样品中WFDC2标记物的表达水平；
b)确定对照样品中WFDC2标记物的表达水平；和
c)比较患者样品和对照样品中WFDC2标记物的表达水平；
其中与对照样品中的WFDC2标记物表达水平相比，患者样品中更高的WFDC2标记物表达水平表明患者具有不良的临床结局。
26.权利要求25的用途，其中所述对照样品来自具有良好临床结局的患者。
27.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于监测患者中乳腺癌的进展的试剂盒中的用途，其中乳腺癌的进展是通过以下步骤监测的：
a)确定第一时间点的患者样品中WFDC2标记物的表达水平；
b)确定后续时间点的患者样品中WFDC2标记物的表达水平；和
c)比较步骤a)和b)中检测的WFDC2标记物的表达水平，从而监测患者中乳腺癌的进展
其中步骤a)和b)中检测的WFDC2标记物的表达水平的改变表明乳腺癌的进展或消退。
28.权利要求27的用途，其中所述标记物相应于分泌的蛋白。
29.权利要求27的用途，其中所述标记物包含转录的多核苷酸或其部分。
30.权利要求27的用途，其中所述样品包含获得自患者的细胞或液体，所述液体选自血液、淋巴液、囊液、乳头穿刺液和收集自肿块活检物的液体。
31.权利要求27的用途，其中所述患者已经在第一时间点和后续时间点之间进行了去除肿瘤的手术。
32.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于评估受试化合物抑制患者中乳腺癌的有效性的试剂盒中的用途，其中受试化合物抑制患者中乳腺癌的有效性是通过以下步骤评估的：
a)确定获得自患者并且暴露于受试化合物的第一样品中WFDC2标记物的表达；
b)确定获得自患者的第二样品中WFDC2标记物的表达，其中所述样品不暴露于受试化合物；
c)比较暴露于受试化合物的样品和不暴露于受试化合物的样品中WFDC2标记物的表达，
其中相对于第二样品，暴露于受试化合物的样品中WFDC2标记物的表达水平更低，表明受试化合物可以有效抑制患者中的乳腺癌。
33.权利要求32的用途，其中第一和第二样品是获得自患者的单个样品的部分。
34.权利要求32的用途，其中第一和第二样品是获得自患者的合并样品的部分。
35.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于评估一种治疗对抑制患者中乳腺癌的有效性的试剂盒中的用途，其中一种治疗的有效性是通过以下步骤评估的：
a)在给患者施用至少一部分治疗之前确定获得自患者的第一样品中WFDC2标记物的表达；
b)在施用该部分治疗后确定获得自患者的第二样品中WFDC2标记物的表达；
c)比较第一和第二样品中WFDC2标记物的表达；和
d)当相对于第一样品，第二样品中WFDC2标记物的表达水平更低时，确定该治疗可以有效抑制患者中的乳腺癌。
36.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于选择抑制患者中的乳腺癌的组合物的试剂盒中的用途，其中所述化合物是通过以下步骤选择的：
a)从患者获得包含癌细胞的样品；
b)分别将样品的等分样品暴露于多种受试组合物；
c)比较每个等分样品中WFDC2标记物的表达；和
d)选择至少一种相对于其它受试组合物，诱导暴露于受试组合物的等分样品中更低的WFDC2标记物表达水平的受试组合物。
37.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于选择抑制患者中乳腺癌转移的组合物的试剂盒中的用途，其中所述化合物是通过以下步骤选择的：
a)从患者获得包含癌细胞的样品；
b)分别将样品的等分样品暴露于多种受试组合物；
c)比较每个等分样品中WFDC2标记物的表达；和
d)选择至少一种相对于其它受试组合物，诱导暴露于受试组合物的等分样品中更低的WFDC2标记物表达水平的受试组合物。
38.用于评估WFDC2标记物的表达的试剂在制备用于评估受试组合物对乳腺细胞的致癌潜力的试剂盒中的用途，其中对乳腺细胞的致癌潜力是通过以下步骤评估的：
a)在受试组合物存在和不存在的条件下保持分开的乳腺细胞等分样品；和
b)比较每种等分样品中选自表1所列的标记物的至少一种标记物的表达，其中所述至少一种标记物是WFDC2标记物，
c)其中在受试组合物存在的条件下保持的等分样品中WFDC2标记物或至少一种表1所列的标记物的表达水平的增加，表明受试组合物具有对人乳腺细胞的致癌潜力。
39.评估患者是否患有乳腺癌的试剂盒，该试剂盒包含用于评估至少一种表1所列的标记物的表达的试剂，其中所述至少一种标记物是WFDC2。
40.评估乳腺癌细胞的存在的试剂盒，该试剂盒包含至少一种核酸探针，其中所述探针特异性结合于相应于至少一种表1所列的标记物的转录的多核苷酸，其中所述至少一种标记物是WFDC2。
41.评估乳腺癌细胞的存在的试剂盒，该试剂盒包含至少一种抗体，其中所述抗体特异性结合于相应于至少一种表1所列的标记物的蛋白，其中所述至少一种标记物是WFDC2。
42.评估一种或多种受试化合物抑制患者中乳腺癌的适用性的试剂盒，该试剂盒包含：
a)一种或多种受试化合物；和
b)用于评估至少一种表1所列的标记物的表达的试剂，其中所述至少一种标记物是WFDC2。
43.分离的核酸分子，包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：65。
44.分离的多肽，包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66。
45.抗体，其选择性结合于包含选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQID NO：64和SEQ ID NO：66。
CN2012100591784A 2003-05-29 2004-05-26 用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法 Pending CN102605062A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47428103P 2003-05-29 2003-05-29
US60/474281 2003-05-29
US55555704P 2004-03-23 2004-03-23
US60/555557 2004-03-23

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800224562A Division CN1839205B (zh) 2003-05-29 2004-05-26 用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102605062A true CN102605062A (zh) 2012-07-25

Family

ID=33493381

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800224562A Expired - Fee Related CN1839205B (zh) 2003-05-29 2004-05-26 用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法
CN2012100591784A Pending CN102605062A (zh) 2003-05-29 2004-05-26 用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800224562A Expired - Fee Related CN1839205B (zh) 2003-05-29 2004-05-26 用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US7601505B2 (zh)
EP (1) EP1639137A4 (zh)
JP (2) JP2007504842A (zh)
KR (1) KR20060013425A (zh)
CN (2) CN1839205B (zh)
CA (1) CA2527571A1 (zh)
WO (1) WO2004106495A2 (zh)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002322280A1 (en) * 2001-06-21 2003-01-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
ATE461214T1 (de) * 2005-09-05 2010-04-15 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor-assoziierte peptide, welche an unterschiedliche menschliche leukozytenantigene der klasse ii binden
RU2008130898A (ru) * 2005-12-28 2010-02-10 Асубио Фарма Ко., Лтд. (Jp) Антитело против периостина и содержащая его фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания, в развитии которого участвует периостин
US8017119B2 (en) * 2005-12-28 2011-09-13 Daiichi Sankyo Company, Ltd. Antibody against periostin, and a pharmaceutical composition comprising it for preventing or treating a disease in which periostin is involved
WO2007090076A2 (en) * 2006-01-27 2007-08-09 Tripath Imaging, Inc. Methods for identifying patients with an increased likelihood of having ovarian cancer and compositions therefor
EP1987359B1 (en) * 2006-02-22 2015-03-18 Philogen S.p.A. Vascular tumor markers
TW200813231A (en) * 2006-04-13 2008-03-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Methods of treating, diagnosing or detecting cancer
EP2168599B1 (en) 2007-06-27 2016-08-10 Osaka University Cancer remedy containing antibody against peptide encoded by exon-17 of periostin
AU2009203785A1 (en) 2008-01-04 2009-07-16 Centre National De La Recherche Scientifique Molecular in vitro diagnosis of breast cancer
EP2271770B1 (en) * 2008-03-31 2018-08-22 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing asthma
WO2010032797A1 (ja) * 2008-09-19 2010-03-25 シスメックス株式会社 乳癌の転移の判定方法及び血清の評価方法
US20120129168A1 (en) * 2009-04-10 2012-05-24 Shingo Ichimiya Tumor marker and use thereof
AU2010273543B2 (en) * 2009-07-14 2017-06-15 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Serum markers associated with early and other stages of breast cancer
GB201009798D0 (en) 2010-06-11 2010-07-21 Immunovia Ab Method,array and use thereof
US20120071407A1 (en) * 2010-06-18 2012-03-22 Douglas Hamilton Method of treating wounds
CN106978480A (zh) * 2010-09-15 2017-07-25 阿尔玛克诊断有限公司 用于癌症的分子诊断试验
CN105175542B (zh) 2010-12-16 2018-12-18 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 与th2抑制相关的诊断和治疗
CN102183655B (zh) * 2011-01-24 2014-06-11 中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心 用于乳腺癌内分泌治疗预后判断的新的分子标志物cuedc2蛋白质
WO2012116357A2 (en) * 2011-02-25 2012-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Use of agr3 for treating cancer
US9340584B2 (en) 2011-03-29 2016-05-17 The General Hospital Corporation Engineered thioredoxin-like fold proteins
GB201206323D0 (en) * 2012-04-10 2012-05-23 Immunovia Ab Methods and arrays for use in the same
US10227396B2 (en) 2013-03-08 2019-03-12 Osaka University Antibody against peptide encoded by Exon-21 of periostin and pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation-associated diseases containing the same
EP3077812A4 (en) * 2013-12-06 2017-06-07 Paul Walfish Methods for the prognosis of breast cancer
KR20180120145A (ko) * 2016-02-02 2018-11-05 온코이뮨, 아이앤씨. 렙틴-결핍 병태를 치료하기 위한 cd24 단백질의 용도
CN115873110A (zh) * 2016-04-14 2023-03-31 刘扶东 抑制scube2，一种新颖vegfr2辅助受体，抑制肿瘤血管发生
CN111693701A (zh) * 2020-07-11 2020-09-22 成都益安博生物技术有限公司 一种大肠癌的外周血tcr标志物序列及其检测试剂盒和应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5889159A (en) * 1993-10-29 1999-03-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies to tumor marker TC1 and methods for use of same
US6171816B1 (en) * 1996-08-23 2001-01-09 Human Genome Sciences, Inc. Human XAG-1 polynucleotides and polypeptides
US6171815B1 (en) * 1996-10-03 2001-01-09 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human sulfonylurea receptor
WO2002000690A2 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
WO2000055629A2 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosing and treating breast cancer
US6750013B2 (en) * 1999-12-02 2004-06-15 Protein Design Labs, Inc. Methods for detection and diagnosing of breast cancer
GB0004576D0 (en) 2000-02-25 2000-04-19 Oxford Glycosciences Uk Ltd Proteins
US20020068691A1 (en) 2000-06-21 2002-06-06 Susana Salceda Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating breast cancer
US7208267B2 (en) * 2000-11-22 2007-04-24 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins
AUPR201500A0 (en) * 2000-12-11 2001-01-11 Biosceptre Pty Ltd Methods for identifying pre-neoplastic and neoplastic states in mammals
MXPA03006617A (es) * 2001-01-24 2004-12-02 Protein Design Labs Inc Metodos de diagnostico de cancer de pecho, composiciones y metodos de rastreo de moduladores de cancer de pecho.
AU2002324451A1 (en) 2001-06-21 2003-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast and ovarian cancer
AU2002322280A1 (en) * 2001-06-21 2003-01-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
AU2002323120A1 (en) * 2001-08-13 2003-03-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Periostin-based diagnostic assays
US7270960B2 (en) * 2001-08-29 2007-09-18 Pacific Northwest Research Institute Diagnosis of ovarian carcinomas
AU2002343417A1 (en) 2001-09-24 2003-04-14 Nuvelo Novel nucleic acids and polypeptides
KR20060015296A (ko) * 2003-05-23 2006-02-16 제넨테크, 인크. 신경교 기원의 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN1839205A (zh) 2006-09-27
JP2007504842A (ja) 2007-03-08
JP2010246558A (ja) 2010-11-04
US20050042642A1 (en) 2005-02-24
WO2004106495A2 (en) 2004-12-09
EP1639137A4 (en) 2008-04-23
US20100075325A1 (en) 2010-03-25
EP1639137A2 (en) 2006-03-29
CN1839205B (zh) 2012-05-16
CA2527571A1 (en) 2004-12-09
WO2004106495A3 (en) 2006-01-12
US7601505B2 (en) 2009-10-13
KR20060013425A (ko) 2006-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1839205B (zh) 用于鉴定、评估、预防和治疗乳腺癌的组合物、试剂盒及方法
CN101044247B (zh) 用于鉴定,评估,预防和治疗子宫颈癌的组合物,试剂盒及方法
CN102680686A (zh) 用于鉴定、评估、预防和治疗前列腺癌的基因、组合物、试剂盒和方法
US20130102482A1 (en) Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of breast and ovarian cancer
US20100291068A1 (en) Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
WO2003004989A2 (en) Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
WO2001060860A2 (en) Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
WO2001070979A9 (en) Genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention and therapy of ovarian cancer
WO2002071928A2 (en) Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
WO2003009814A2 (en) Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
WO2001051628A2 (en) Genes compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
WO2001053836A9 (en) Identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
WO2002101075A2 (en) Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
US20030215805A1 (en) Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment prevention, and therapy of breast cancer
WO2001046697A2 (en) Identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
WO2005015236A2 (en) A method for predicting the progression of adenocarcinoma

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120725