CN102782133A - 抑制c-Met表达的siRNA及含有所述siRNA的抗癌组合物 - Google Patents

抑制c-Met表达的siRNA及含有所述siRNA的抗癌组合物 Download PDF

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Abstract

公开了一种可互补结合到c-Met转录本（mRNA转录本）从而抑制c-Met表达而不引起免疫应答的小干扰RNA（siRNA），以及所述siRNA用于预防和/或治疗癌症的用途。可互补结合到编码c-Met的mRNA的该siRNA可以通过RNA干扰（RNAi）来抑制在几乎所有癌细胞中共同过表达的c-Met的表达，从而抑制癌细胞的增殖和转移，因此所述siRNA可以用作抗癌剂。

Description

抑制c-Met表达的siRNA及含有所述siRNA的抗癌组合物
技术领域
本发明涉及一种小干扰RNA（siRNA），其可以互补结合到c-Met转录本（mRNA转录本）的碱基序列上，从而抑制c-Met的表达且不引起免疫反应，本发明还涉及所述siRNA用于预防和/或治疗癌症的用途。
背景技术
c-Met是一种编码被称为肝细胞生长因子受体（HGFR）的蛋白的原癌基因。1984年，c-Met首次在化学致癌物处理的人骨肉瘤中被发现。1986年，由于与tpr（易位启动子区）基因整合，c-Met被发现是潜在的原癌基因，（Cooper et al.,Nature,311,29-33,1984;Dean et al.,Mol cellBiol.,7,921-924,1987;Park et al.,Cell,45,895-904,1986）。
一旦和被称为c-Met的细胞表面受体酪氨酸激酶（TK）结合，由间充质细胞分泌的肝细胞生长因子（HGF）就会刺激细胞生长、细胞运动、胚胎发生、伤口愈合及血管生成。这些多能作用在发育、内环境平衡和组织再生中起基础性的重要作用。HGF信号传递还有助于几种人癌症中的癌发生和肿瘤发展，并且可促进肿瘤转移密切相关的攻击性细胞侵袭力。（Nakamura et al.,J Clin Invest.,106,1511-9,2000;Comoglio et al.,Semin Cancer Biol,11,153-65,2001;Boccaccio,Nat Rev Cancer,6,637-45,2006;Huh CF et al.,Proc Natl Acad Sci USA,101,4477-82,2004）。
大多数的HGF/c-Met信号转导异常来自于由HGF或c-Met过表达或突变导致的HGF或c-Met活性升高，并且已知这与多种癌症患者的不利预后密切相关。
由于发现c-Met蛋白活性和癌症发生率/转移之间密切关系以及其他受体酪氨酸激酶抑制剂在临床上成功，对靶向c-Met的抗癌药物的开发有积极进展。但是，目前临床阶段的大多数候选药物是基于蛋白质或c-Met受体抗体的三级结构设计的化学合成抑制剂，例如抑制c-Met信号途径的酪氨酸激酶抑制剂。
虽然低分子量的激酶抑制剂与靶向大量蛋白激酶的激酶抑制剂相比具有提高的对c-Met的选择性，但仍然顾虑由于脱靶至其他与c-Met结构相似的蛋白质而导致的副作用。
虽然相比之下抗体药物有着极好的选择性，但仍然存在由复杂生产过程导致的生产率问题和储存过程中不稳定问题。因此，一直需求开发靶向c-Met功能的有效抑制剂。
最近，人们发现核糖核酸介导的干扰（RNAi）可以通过引起甚至对现有技术来说还不是药物靶点的序列特异性基因沉默来帮助开发首要候选药物。因此，RNAi被认为是一种能够对靶点有限和合成药物非特异性问题提供解决方案且可以克服化学合成药物局限的技术。因而，许多关于RNAi在开发现有技术很难治疗的多种疾病尤其是癌症的药物中应用的研究取得了积极的进展。
不过，已经发现siRNA（small interfering RNA）会引发固有的免疫反应，并且还会超预计地更频繁引起非特异性RNAi作用。
有报道显示，在哺乳动物细胞中，长的双链siRNA可以诱导有害的干扰素反应；短的双链siRNA也可以诱导对人身体或细胞有害的始初干扰素反应；并且已经知道，许多siRNA会引起比预计更高的非特异性RNAi作用（Kleirman et al.Nature,452:591-7,2008）。
虽然已经尝试开发靶向在癌症发展中起重要作用的c-Met的siRNA抗癌药物，但到目前为止尚未取得显著成果。siRNA的个体序列的基因抑制效应还未被提出，尤其是免疫活性还未被考虑。
虽然，siRNA由于其高活性、极好靶特异性等优点而显示出了作为新药的巨大前景，但是对于治疗性开发仍然有一些障碍需要克服，例如由于其可能被血液中的核酸酶降解而血稳定性低、由于带负电荷而穿过细胞膜的能力较弱、由于快速被排泄而在血液中的半存留期较短，从而其组织分布有限、并且可诱导能够作用于其他基因调节途径的脱靶效应。
最近，为改善这些缺点并使之能应用到临床试验中，在siRNA中引入化学修饰的研究取得了一定进展（Davidson,Nat.Biotechnol.,24:951-952,2006;Sioud and Furset,J.Biomed.Biotechnol.,2006:23429,2006）。
发明内容
因此，发明人开发了具有高序列特异性并因此可特异性结合到靶基因的转录本以增强RNAi活性且不会诱导任何免疫毒性的siRNA，并完成了本发明。
一实施方案提供了可互补结合到c-Met mRNA转录本并因此可特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA。
另一实施方案提供了用于表达所述siRNA的表达载体。
另一个实施方案提供了抑制c-Met合成和/或表达的药物组合物，含有所述siRNA或所述siRNA表达载体作为活性成分。
另一实施方案提供了含有所述siRNA或所述siRNA表达载体作为活性成分的抗癌组合物。
另一实施方案提供了一种抑制c-Met合成和/或表达的方法，包括制备所述siRNA或所述siRNA表达载体；以及使所述siRNA或所述siRNA表达载体与表达c-Met的细胞相接触，并将所述siRNA和/或所述siRNA表达载体用于在表达c-Met的细胞中抑制c-Met的合成和/或表达。
又一实施方案提供了一种抑制癌细胞生长的方法，包括制备所述siRNA或所述siRNA表达载体；以及使所述siRNA或所述siRNA表达载体与表达c-Met的细胞相接触，并将所述siRNA或所述siRNA表达载体用于在表达c-Met的癌细胞中抑制癌细胞生长。
又一实施方案提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括制备所述siRNA或所述siRNA表达载体；以及将所述siRNA或所述siRNA表达载体以有效治疗剂量给予患者，并将所述siRNA或所述siRNA表达载体用于预防和/或治疗癌症。
附图说明
图1a到图1d显示了siRNA处理的细胞因子浓度变化，其中1a表示α-干扰素的浓度，1b表示γ-干扰素的浓度，1c表示白介素-12的浓度，1d表示肿瘤坏死因子的浓度。
具体实施方式
本发明提供了可互补结合到c-Met mRNA转录本的碱基序列并因此抑制所述细胞中c-Met合成和/或表达的siRNA、含有所述siRNA的药物组合物以及其用途。
本发明一方面提供了特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA。另一方面提供了抑制c-Met合成和/或表达的药物组合物，含有特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA作为活性成分。另一方面提供了抑制癌细胞生长的药剂或预防和/或治疗癌症的药物组合物（抗癌组合物），含有可特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA作为活性成分。
本发明涉及抑制哺乳动物包括人体内c-Met mRNA、其可变剪接形式或变体或者相同谱系c-Met基因的表达的技术，这可以通过给予患者某一量的本发明siRNA以减少靶mRNA来实现。
以下将详细描述本发明。
c-Met可以源自于哺乳动物，优选人，或者它可以是与人相同谱系的c-Met或其突变体。术语“与人相同谱系”是指具有与人c-Met基因或源自其的mRNA有80%或更大序列同源性的基因或mRNA的哺乳动物，具体地，它可以包括人、灵长类、啮齿类等。
根据一个实施方案，对应于编码c-Met的mRNA的正义链的cDNA序列可以是SEQ ID NO 1。
本发明的siRNA可以靶向对应于选自由以下序列组成的区域的至少一个碱基序列的mRNA或cDNA区域：c-Met的mRNA或cDNA中的连续15-25bp，优选连续18-22bp，优选连续2-21bp。cDNA上优选的靶点区域总结在下表1中。因此，本发明的一个实施方案提供了靶向对应于选自SEQ ID NO:1的c-Met cDNA区域中SEQ ID NO.2到21的至少一个碱基序列的mRNA或cDNA区域的siRNA。具体地，提供了靶向对应于选自SEQ ID NO.3、18和21的碱基序列的mRNA区域的siRNA。
【表1】c-Met cDNA上的靶区域（SEQ ID NO:1）(20)
Figure BDA00002079872000051
本文使用的术语“靶mRNA”是指人c-Met mRNA、与人相同谱系的c-Met mRNA、其变体或可变剪接形式。具体地，其可以包括氨基酸或碱基序列例如NM_000245、小鼠（Mus musculus）:NM_008591、猕猴（Macaca mulatta）:NM_001168629、NM_001127500:其中碱基序列2262-2317缺失的剪接形式、Y1230C/A3689G、D1228H/G3682C、V1092I/G3274A、M1268T/T3795C等的变体。因此，本发明的siRNA可以靶向人或与人相同谱系的c-Met mRNA、其可变剪接形式或变体。
本文使用的词语“靶向mRNA（或cDNA）区域”意指siRNA具有与所述mRNA（或cDNA）区域全部或部分的碱基序列互补（例如与全部碱基序列的85-100%互补）的碱基序列，因此能够特异性结合到所述mRNA（或cDNA）区域。
本文使用的术语“互补的”或“互补地”意指多核苷酸的两条链能形成碱基对。互补多核苷酸的两条链可形成沃森-克里克碱基对来形成双链。除非另外指明，否则当本文中提到碱基U时，它可以被碱基Ｔ替换。
由于本发明的药物组合物对c-Met合成和/或表达的抑制效应以及癌症治疗效果通过有效抑制c-Met合成和/或表达来实现，所述药物组合物作为活性成分包含的siRNA可以是靶向上文所述的至少一个具体mRNA区域的15-30bp的双链siRNA。根据优选的实施方案，所述siRNA可以包括选自SEQ ID NO.22到98的至少一个。更具体地，所述siRNA可以是选自如下表2中描述的siRNA 1到siRNA 40的至少一个。
【表2】
Figure BDA00002079872000071
Figure BDA00002079872000091
表2中化学修饰siRNA（SEQ ID NO.65到98）的化学结构修饰的标记和内容在下表3和表4中描述。
【表3】
【表4】
由于所述siRNA对c-Met mRNA转录本的特异靶区域具有高序列特异性，其可以特异性地互补结合到靶基因的转录本上，从而增强RNA干扰活性，因此具有抑制细胞内c-Met表达和/或合成的极好活性。并且，所述siRNA具有最小的免疫反应诱导活性。
如上所述，本发明的siRNA可以是靶向选自SEQ ID NO:1的c-MetcDNA区域SEQ ID No.2到21的至少一个mRNA区域的siRNA。优选地，所述siRNA可以包括选自SEQ ID No.22到98的至少一个核苷酸序列，更优选，选自SEQ ID No.22到98的40种siRNA的至少一个核苷酸序列。所述siRNA包括核糖核酸序列本身以及表达所述核糖核酸序列的重组载体（表达载体）。所述表达载体可以是选自质粒或腺相关病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、溶瘤腺病毒等的病毒载体。
本发明的药物组合物可以包括所述siRNA作为活性成分以及可药用载体。所述可药用载体可以包括任何通常使用的载体，例如其可以是选自但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、糊精、甘油、乙醇等的至少一种。
所述siRNA可被给予哺乳动物，优选人、猴或啮齿类（小鼠、大鼠），特别是患有与c-Met表达有关的疾病或症症或者需要抑制c-Met表达的任何哺乳动物，例如人。
为了获得c-Met抑制效应而又使不利的副作用例如免疫反应等最小化，所述组合物中所述siRNA的浓度或所述siRNA的使用浓度或治疗浓度可以是0.001到1000nM，优选0.01到100nM，更优选0.1到10nM，但并不限于此。
所述siRNA或含有所述siRNA的药物组合物可以治疗选自多种实体癌症例如肺癌、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、食管癌、前列腺癌等以及骨肉瘤、软组织肉瘤、神经胶质瘤等的至少一种癌症。
以下将详细描述所述siRNA的结构和设计方法及含有所述siRNA的药物组合物。
通过RNAi途径降解c-Met mRNA,所述siRNA不会诱导c-Met的表达或者会减少c-Met蛋白的表达。
根据一个实施方案，siRNA是指能够诱导RNA干扰（RNAi）途径的小抑制性RNA双链体。具体地，siRNA是包含正义链和与之互补的反义链的RNA双链体，其中，两条链都包含15-30bp，特别是19-25bp或27bp，更特别是19-21bp。所述siRNA可包含双链区域并且具有单链形成发卡或茎环的结构，或者其可以是两条独立链的双链体。所述正义链可以具有和靶基因mRNA序列的核苷酸序列相同的序列。正义链和与之互补的反义链之间通过沃森-克里克碱基配对形成双链体。siRNA的反义链被RISC（RNA诱导的沉默复合物）捕捉，所述RISC可识别与反义链互补的靶mRNA，然后诱导靶mRNA的裂解或其翻译抑制。
根据一个实施方案，所述双链siRNA在3’末端、5’末端或两个末端可以有1到5个核苷酸的悬突。或者，在其两个末端可以有截短的平末端。具体地，其可以是US20020086356和US7056704中描述的siRNA，这两个申请以引用的方式纳入本文。
根据一个实施方案，所述siRNA包括正义链和反义链，其中所述正义链和所述反义链形成15-30bp的双链体，并且所述双链体可以具有平末端且没有悬突的对称结构，或至少一个核苷酸例如1-5个核苷酸的悬突的不对称结构。所述悬突的核苷酸可以是任何序列，但其可以具有2个dT（脱氧胸苷）附着其上。
使所述反义链与SEQ ID NO.1的mRNA的靶区域在生理条件下杂交。短语“在生理条件下杂交”意指使所述siRNA的反义链在体内与mRNA的特异性靶区域杂交。具体地，所述反义链可以具有与所述靶mRNA区域85%或更大的序列互补，其中所述靶mRNA区域优选为选自表1所示的SEQ ID NO.2到21的至少一个碱基序列，更具体地，所述反义链可包括与SEQ ID NO.1的碱基序列中连续15-25bp，优选连续18-22bp，完全互补的序列。更优选地，所述siRNA的反义链可以包括与选自表1中所示的SEQ ID NO.2到21的至少一个碱基序列完全互补的序列。
根据一个实施方案，所述siRNA可以具有不对称的双链结构，其中一条链比另一条链短。具体地，如果双链的siRNA（小干扰RNA）分子由19-21个核苷酸（nt）的反义链和具有与所述反义链互补的序列的15-19nt正义链所组成，那么所述siRNA可以是在所述反义链5’末端具有平末端且在所述反义链3’末端具有1-5个核苷酸悬突的不对称siRNA。具体地，它可以是WO09/078685中公开的siRNA。
在使用siRNA的治疗中，需要从靶基因的碱基序列中选择具有最高活性的最佳碱基序列。具体地，根据一个实施方案，为增强临床前试验和临床试验的关联性，优选设计含有不同物种之间的保守序列的c-MetsiRNA。并且，根据一个实施方案，优选进行设计使得所述结合到RISC的反义链具有对RISC的高结合能力。因此，可以进行设计使得正义链和反义链之间具有不同的热力学稳定性，从而增加作为指导链的反义链的RISC结合能力，而正义链不会结合到RISC。具体地，正义链的GC含量不能超过60%；3个或更多个腺嘌呤/鸟嘌呤碱基可存在于所述正义链从5’末端起的第15位到第19位；并且在正义链从5’末端起的第1位到第7位可富含G/C碱基。并且，由于重复碱基序列的原因，siRNA本身的内部序列可以互相结合并降低互补结合到mRNA的能力，所以它优选被设计成存在少于4个重复碱基序列。并且，如果正义链由19个碱基组成，那么为了结合到靶基因的mRNA上以正确地诱导所述转录本的降解，所述正义链从5’末端起的第3、10和19位碱基可以是腺嘌呤。
更进一步地，根据一个实施方案，所述siRNA具有最小的非特异性结合和免疫应答诱导活性。由siRNA诱导的干扰素等的免疫应答大多数通过存在于抗原呈递免疫细胞内体的TLR7（Toll样受体-7）发生，并且siRNA与TLR7的结合在富含GU的序列中以类似序列特异性方式发生，因此所述siRNA最好包含不被TLR7识别的序列。具体地，其可以不含有免疫应答诱导序列例如5'-GUCCUUCAA-3'和5'-UGUGU-3'，并且与除c-Met以外的基因具有70%或更小的互补性。
c-Met cDNA靶点序列的实例包括如上述表1所述的序列的核苷酸。基于表1中的靶序列，siRNA序列可以被设计使得siRNA长度可以长于或短于靶序列的长度，或者可以增加或删除与所述DNA序列互补的核苷酸。
根据本发明的一个实施方案，siRNA可以包括正义链和反义链，其中所述正义链和所述反义链形成15-30bp的无悬突的或至少一个末端可以有1-5个核苷酸悬突的双链，并且所述反义链可以在生理条件下与SEQ ID NO.2到21，优选SEQ ID NO.3、18、21，中任一序列对应的mRNA区域杂交。也就是说，所述反义链包括与SEQ ID NO.2到21，优选SEQ ID NO.3、18、21，中任一序列中互补的序列。因此，本发明的c-Met siRNA及含有所述c-Met siRNA的药物组合物不会诱导有害的干扰素反应但仍可抑制c-Met基因的表达。
本发明通过互补结合到与选自SEQ ID NO.3
（5'-GCACTAGCAAAGTCCGAGA-3'）、SEQ ID NO.18
（5'-GTGAGAATATACACTTACA-3'）和SEQ ID NO.21
（5'-CCAAAGGCATGAAATATCT-3'）中至少一个序列对应的mRNA区域来抑制细胞中c-Met的表达。
根据本发明一个具体实施方案的c-Met siRNA如上表2中所述。
根据一个实施方案，所述c-Met siRNA可以是选自siRNA 2、siRNA17、siRNA 20、siRNA 21、siRNA 22和siRNA 23的至少一个，所述siRNA2包含SEQ ID NO.24的正义序列和SEQ ID NO.25的反义序列，所述siRNA 17包含SEQ ID NO.54的正义序列和SEQ ID NO.55的反义序列，所述siRNA 20包含SEQ ID NO.60的正义序列和SEQ ID NO.61的反义序列，所述siRNA 21包含SEQ ID NO.62的正义序列和SEQ ID NO.25的反义序列，所述siRNA 22包含SEQ ID NO.63的正义序列和SEQ IDNO.55的反义序列，所述siRNA 23包含SEQ ID NO.64的正义序列和SEQ ID NO.61的反义序列。
敲低（c-Met表达抑制）可以通过定量PCR（qPCR）扩增、bDNA（分支DNA）测定、蛋白质印迹、ELISA等测量mRNA或蛋白质水平的改变来确认。根据一个实施方案，可以制备脂质体复合体用于处理癌细胞系，然后核糖核酸介导的表达干扰可以通过mRNA阶段的bDNA测定来确认。
本发明的siRNA序列具有低免疫应答诱导活性，而可以有效抑制c-Met的合成或表达。
根据一个实施方案，可以通过以siRNA-DOTAP（N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基甲磺酸铵）复合物来处理人外周血单核细胞（PBMC），然后测定培养液中的释放细胞因子INF-α和INF-γ、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-12（IL-12）等是否增加来确认免疫毒性。
所述siRNA可以是天然形成的（未修饰的）核糖核酸单元结构，或者其可以是化学修饰过的，例如其可以被合成以使得至少一个核糖核酸的糖或碱基结构、核糖核酸之间的键可以有至少一个化学修饰。
通过对siRNA进行化学修饰，可以在不影响起始RNAi活性的情况下获得希望的效应，例如对核酸酶抗性增加、细胞内摄取增加、细胞靶向（靶特异性）增加、稳定性提高，或者脱靶效应减少（例如干扰素活性、免疫应答和正义链效应降低）等。
siRNA的化学修饰方法没有具体的限制，本领域普通技术人员可以通过本领域已知的方法（Andreas Henschel,Frank Buchholz1 andBianca Habermann(2004)DEQOR:a web based tool for the design andquality control of siRNAs.Nucleic Acids Research 32(Web ServerIssue):W113-W120）按需要合成和修饰所述siRNA。
例如，可以用硼烷磷酸（boranophosphate）键或磷硫酰键取代siRNA正义链和反义链的磷酸二酯键以增强对核酸降解的抗性。例如，可以用磷硫酰键修饰siRNA正义链和反义链的3’末端的磷酸二酯键。
再例如，可以将ENA（乙烯桥接核酸）或LNA（锁核酸）引入siRNA正义链或反义链的5’末端或3’末端或者两末端，优选将其引入siRNA正义链的5’末端。以此，可以增加siRNA的稳定性，并且可以减少免疫应答和非特异性抑制，而不影响所述RNAi的活性。
又例如，可以用-NH2(氨基)、-C-烯丙(烯丙基)、-F(氟基)或-O-Me(或CH3，甲基)取代核糖环的2’-OH基团。例如，可以用2’-O-Me取代正义链的第1位和第2位核酸的核糖的2’-OH基团，可以用2’-O-Me取代反义链的第2位核苷酸的核糖的2’-OH基团，或者可以用2’-O-Me（甲基）或2’-F（氟基）取代含有鸟嘌呤（G）或尿嘧啶（U）的核苷酸的核糖的2’-OH。
除以上所述化学修饰外，还可以进行多种化学修饰，并且可以进行仅一种化学修饰或者进行多种化学修饰组合。
在所述化学修饰中，优选基因表达的敲低活性不被降低而稳定所述siRNA的双链结构，因此优选最小限度的修饰。
并且，可以配基将例如胆固醇、生物素或细胞透过性肽附着到siRNA正义链的5’末端或3’末端。
可以通过体外转录或者通过以dicer酶或其他具有类似活性的核酸酶来切割长双链RNA制备本发明的siRNA。或者，如上文所述，可以通过质粒或病毒表达载体等表达siRNA。
可以通过以下方式选择候选siRNA序列：实验确定具体siRNA序列是否会在包括树突细胞的人外周血单核细胞（PBMC）中诱导干扰素，然后选择那些不会诱导免疫应答的序列。
以下将描述用来递送所述siRNA的药物递送系统（DDS）。
可以应用核酸递送系统来增加siRNA的细胞内递送的效率。
用来递送核酸至细胞的系统可以包括病毒载体、非病毒载体、脂质体、阳离子聚合物、微团、乳剂和固态脂质纳米颗粒等。所述非病毒载体可以具有高递送速率和长保留时间。所述病毒载体可以包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘苗病毒载体、腺相关病毒载体和溶瘤腺病毒载体等。所述非病毒载体可以包括质粒。另外，也可以使用例如脂质体、阳离子聚合物、微团、乳剂、固态脂质纳米颗粒等的多种形式。用于递送核酸的阳离子聚合物可以包括天然聚合物例如壳聚糖、去端肽胶原、阳离子多肽等以及合成聚合物例如聚L-赖氨酸、直链或支链聚乙烯亚胺（PEI）、基于环糊精的聚阳离子、树枝石等。
本发明的siRNA或所述siRNA和核酸递送系统的复合物（药物组合物）可以在体内或者离体引入细胞用于癌症治疗。如下文实施例所示，如果本发明的siRNA或所述siRNA和核酸递送系统的复合物被引入细胞，它可以选择性地降低靶蛋白c-Met的表达或者修饰靶基因中的突变以抑制参与癌生成的c-Met的表达，因此癌细胞被杀死，癌症被治疗。
本发明的siRNA及含有所述siRNA的药物组合物可以被配制用于外用、口服、肠胃外给药等。具体地，siRNA的给药途径可以是外用的例如经眼、阴道内、肛内等；肠胃外例如肺内、支气管内、鼻内、上皮内、内皮内、静脉内、动脉内、皮下、腹内、肌肉、颅内（脑膜内或脑室内）等；或者口服；等。对于外用给药，所述siRNA及含有所述siRNA的药物组合物可以配制成补片剂、软膏剂、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、溶液剂、粉剂等形式。对于肠胃外给药、脑膜内或脑室内给药，所述siRNA及含有所述siRNA的药物组合物可以包括含有适当添加剂例如缓冲液、稀释剂、渗透促进剂、其他可药用载体或赋形剂的无菌水溶液。
进一步地，所述siRNA可以与可注射溶液混合并以注射物的方式通过瘤内注射给药，或者其可以与凝胶或胶粘剂组合物混合用于经皮递送，直接涂布或粘附在将通过经皮途径给药的受损区域。所述可注射溶液没有具体的限制，不过优选其可以是等渗水溶液或悬液，可以是无菌的并且/或者含有添加剂（例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、用于控制渗透压的盐、缓冲液和/或脂质体化剂）。所述凝胶组合物可以含有常规的凝胶剂例如羧甲基纤维素、甲基纤维素、丙烯酸聚合物、聚羧乙烯等；以及可药用载体和/或脂质体化剂。并且，在用于经皮递送的胶粘剂组合物中，有效成分层可以包括胶粘剂层、脂肪吸附层和药物层，所述药物层可以含有可药用载体和/或脂质体化剂，但不限于此。
进一步地，本发明的siRNA及含有所述siRNA的药物组合物除了包含所述c-Met siRNA以外还可以包含抗癌化学治疗物，或者它还可以包含可抑制选自以下至少一种的表达的siRNA：生长因子、生长因子受体、下游信号转导蛋白、病毒癌基因和抗癌剂抗性基因。
因此，化学治疗与c-Met siRNA结合可以增加对化学治疗物的敏感度，进而使治疗效果最大并降低副作用；抑制多种生长因子（VEGF、EGF、PDGF等）、生长因子受体、下游信号转导蛋白、病毒癌基因和抗癌剂抗性基因表达的siRNA与本发明的抑制c-Met表达的siRNA结合可以同时阻断多种癌症途径以使抗癌效果最大。
可以用来与本发明的可抑制c-Met表达的siRNA结合给药的抗癌化学治疗物可以包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星、姜黄素、吉非替尼、厄洛替尼、伊立替康、托泊替康、长春碱、长春新碱、多西紫杉醇、紫杉醇及其结合物。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种用于抑制c-Met表达和/或合成的方法，包括制备用于抑制c-Met表达和/或合成的有效量的c-Met siRNA，使所述siRNA与表达c-Met的细胞相接触。
根据另一个实施方案，提供了一种用于抑制癌细胞生长的方法，包括制备用于抑制c-Met合成和/或表达的有效量的c-Met siRNA，使所述siRNA与表达c-Met的癌细胞相接触。
根据另一个实施方案，提供了一种用于预防和/或治疗癌症的方法，包括制备所述c-Met siRNA，向患者给予治疗有效量的所述siRNA。
所述用于预防和/或治疗癌症的方法还可以包括在所述给药前鉴定有预防和/或治疗癌症需求的患者。
可以根据本发明治疗的癌症可以是选自大多数实体癌（肺癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、食管癌、前列腺癌）、骨肉瘤、软组织肉瘤、神经胶质瘤等的至少一种。
所述患者可以包括哺乳动物，优选人、猴、啮齿类（小鼠、大鼠等）等，特别是患有与c-Met表达有关的疾病或症症（例如癌症）或者需要抑制c-Met表达的任何哺乳动物，例如人。
本发明的siRNA的有效量意指用于给药所需的量，目的是获得抑制c-Met表达或合成，或者产生癌细胞生长抑制和癌症治疗效果。因此，所述有效量可以被适当地控制，取决于多种因素，包括疾病的种类或严重程度；给予的siRNA的种类；剂型的种类；患者的年龄、体重、整体健康状态、性别和饮食；给药时间、给药途径和治疗周期；所结合的药物例如结合的化学治疗剂；等等。例如，日剂量可以是0.001mg/kg-100mg/kg，其可以一次给药或以分开的剂量分几次给药。
本发明的与c-Met转录本（mRNA）的碱基序列互补的siRNA可以通过RNA介导的干扰来抑制通常在癌细胞中表达的c-Met的表达，以杀死癌细胞，因此它显示出极好的抗癌效果。并且，其可以使得免疫应答的诱导最小化。
虽然大多数现有的药物可抑制已经表达的蛋白的功能，但本发明的RNAi技术可以高活性地选择性抑制特定疾病诱导蛋白的表达，并降解作为蛋白合成之前步骤的mRNA，因此可以抑制癌症生长和转移而不诱导副作用，该技术有望成为更基础的癌症疗法。
进一步地，化学治疗和c-Met siRNA结合可以增加对化学治疗物的敏感度以使治疗活性最大并降低副作用，抑制多种生长因子（VEGF、EGF、PDGF等）、生长因子受体和下游信号转导蛋白、病毒癌基因和抗癌剂抗性基因的表达的siRNA与所述c-Met siRNA结合可以同时阻断多种癌症途径，因此使抗癌效果最大。
以下将参考如下的实施例来描述本发明。
但是，这些实施例只是用于解释本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例1.设计抑制c-Met表达的siRNA可以结合的靶碱基序列
使用siDesign Center(Dharmacon)、BLOCK-iTTM RNAi Designer(Invitrogen)、AsiDesigner(KRIBB)、siDirect(University of Tokyo)和siRNA Target Finder(Ambion)的siRNA设计程序，从c-Met mRNA序列（NM_000245）得到siRNA可以结合的靶碱基序列。
【表5】靶碱基序列
  SEQ ID NO.   序列(5′-＞3′)
  2   GTAAAGAGGCACTAGCAAA
  3   GCACTAGCAAAGTCCGAGA
  4   CAGCAAAGCCAATTTATCA
  5   CTATGATGATCAACTCATT
  6   CAATCATACTGCTGACATA
  7   CTCTAGATGCTCAGACTTT
  8   TCTGGATTGCATTCCTACA
  9   CTGGATTGCATTCCTACAT
  10   GCACAAAGCAAGCCAGATT
  11   CTGCTTTAATAGGACACTT
  12   CAGGTTGTGGTTTCTCGAT
  13   CTGGTTATCACTGGGAAGA
  14   TTGGTCCTGCCATGAATAA
  15   AGACAAGCATCTTCAGTTA
  16   TCGCTCTAATTCAGAGATA
  17   TCAGAGATAATCTGTTGTA
  18   GTGAGAATATACACTTACA
  19   GGTGTTGTCTCAATATCAA
  20   CATTTGGATAGGCTTGTAA
  21   CCAAAGGCATGAAATATCT
实施例2.制造抑制c-Met表达的siRNA
从ST Pharm Co.Ltd（韩国）获得在实施例1中设计的23种可以结合到靶碱基序列的siRNA。这23种siRNA如表6所描述，其中两条链的3’末端都包含dTdT。
【表6】抑制c-Met表达的siRNA的碱基序列
Figure BDA00002079872000191
Figure BDA00002079872000201
Figure BDA00002079872000211
实施例3.在癌细胞系中使用siRNA的c-Met表达抑制测试
使用实施例2中制造的每一种siRNA，转染人肺癌细胞系（A549，ATCC）和人肝癌细胞系（SK-Hep-1，ATCC），并测量转染的癌细胞系中的c-Met表达。
实施例3-1.癌细胞系的培养物
将从美国模式培养物集存库（ATCC）获得的人肺癌细胞系（A549）和人肝癌细胞系（SK-Hep-1）使用含10%（v/v）胎牛血清、青霉素（100单位/ml）和链霉素（100μg/ml）的RPMI培养基(GIBCO/Invitrogen,USA)在37℃和5%(v/v)CO2下培养。
实施例3-2.制备用于c-Met表达抑制的siRNA脂质体复合体
在每孔中将均含有实施例2中siRNA 1到23的10nM siRNA的25μlOpti-MEM培养基（Gibco）和含有0.4μl lipofectamine 2000（Invitrogen）的Opti-MEM培养基以相同体积混合，在室温反应20分钟以制备siRNA的脂质体复合体。
实施例3-3.使用c-Met靶向siRNA抑制癌细胞系中的c-Met mRNA表达
将实施例3-1中培养的肺癌细胞系和肝癌细胞系以每孔104个细胞接种在96孔板中。24小时后，除去培养基，加入每孔50μl的量的Opti-MEM培养基。加入实施例3-2中制备的50μl siRNA脂质体复合体，在维持37℃和5%(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24小时。
为计算IC50值，即50%抑制c-Met mRNA表达的药物浓度，对肺癌细胞系（A549）使用0.0064nM到100nM之间7个浓度的每种siRNA进行处理。
实施例3-4.定量分析肺癌细胞系中的c-Met mRNA表达
使用Quantigene 2.0系统（Panomics,Inc.）通过bDNA分析测量c-Met mRNA的表达率，c-Met mRNA的表达被siRNA脂质体复合体抑制。
用10nM的siRNA脂质体复合体处理人肺癌细胞系24小时后，对mRNA进行定量。根据制造商的操作手册，向96孔板的每孔加入100μl的裂解混合液（Panomics,Quantigene 2.0bDNA kit），在50℃下裂解细胞1小时。可特异性结合到c-Met mRNA的探针（Panomics,Cat.#SA-10157）购自Panomics公司，并在96孔板中与80μl所得到的细胞样品的混合。在55℃下进行反应16到20小时以使mRNA可以被固定在孔中并结合到探针上。随后，在每孔中加入所述试剂盒的100μl扩增试剂，在55℃下反应并洗涤，这个过程分两阶段进行。加入100μl的第三扩增试剂并在50℃下反应，然后加入100μl荧光诱导剂，在5分钟后，使用酶标仪（Bio-Tek,Synergy-HT）测量荧光，将其表示为仅以lipofectamine处理的对照（100%）的百分数。所述百分数表示每种siRNA处理的测试组相对于对照的c-Met mRNA表达率。
如表7所示，已确定在20种siRNA中，16种siRNA抑制c-Met表达40%或以下，1种siRNA抑制c-Met表达40%到70%、3种siRNA抑制c-Met表达70%或以上。
【表7】以10nM siRNA处理的人肺癌细胞系（A549）中c-MetmRNA的相对表达率
  SEQ ID NO.   序列(5′-＞3′)   siRNA编号   c-Met mRNA表达率(％)
  2   GAAAGAGGCACTAGCAAA   1   66.7
  3   GCACTAGCAAAGTCCGAGA   2   22.7
  4   CAGCAAAGCCAATTTATCA   3   69.2
  5   CTATGATGATCAACTCATT   4   81.4
  6   CAATCATACTGCTGACATA   5   68.5
  7   CTCTAGATGCTCAGACTTT   6   71.5
  8   TCTGGATTGCATTCCTACA   7   81.8
  9   CTGGATTGCATTCCTACAT   8   99.8
  10   GCACAAAGCAAGCCAGATT   9   84.6
  11   CTGCTTTAATAGGACACTT   10   68.0
  12   CAGGTTGTGGTTTCTCGAT   11   68.8
  13   CTGGTTATCACTGGGAAGA   12   67.1
  14   TTGGTCCTGCCATGAATAA   13   71.7
  15   AGACAAGCATCTTCAGTTA   14   55.5
  16   TCGCTCTAATTCAGAGATA   15   68.1
  17   TCAGAGATAATCTGTTGTA   16   99.9
  18   GTGAGAATATACACTTACA   17   12.8
  19   GGTGTTGTCTCAATATCAA   18   60.5
  20   CATTTGGATAGGCTTGTAA   19   115.4
  21   CCAAAGGCATGAAATATCT   20   26.6
对于表7中具有极好基因表达抑制效应的3种siRNA：siRNA 2、17和20，c-Met mRNA表达降低的程度使用A549细胞系在100nM到0.0064nM范围的siRNA下进行检查以计算IC50，结果在下表8中描述。IC50值使用Spectra Max 190(ELISA设备)模型支持的SofrMax pro软件进行计算。将siRNA 2、17和20的IC50值与siRNA 14和15的IC50值相比较，可以看出siRNA 2、17和20显示约5到100倍的siRNA 14和15的抑制。
【表8】A549细胞系的IC50值（nM）
Figure BDA00002079872000241
实施例3-5.定量分析肝癌细胞中的c-Met mRNA表达
分别以靶向SEQ ID NO.3、18或21的均4nM的对称结构siRNA 2、17和20以及正义链比反义链短的不对称结构siRNA 21、22和23处理肝癌细胞系SK-Hep-1，并检查c-Met mRNA抑制效应，结果在下表9中描述。实验方法同实施例3-4。
【表9】
Figure BDA00002079872000242
如表9中所示，若靶向SEQ ID NO.3、18或21，则不对称siRNA可以以与对称siRNA相似的程度有效抑制c-Met表达。
实施例4.siRNA对细胞增殖的抑制检测
测定了siRNA 2、14和15的细胞增殖抑制效应。将人肺癌细胞A549以每孔2.5×103的数量接种在96孔板中，在24小时后，将通过实施例3-2的方法制备的0.4μl siRNA脂质体复合体按照实施例3-3的方法以指定的siRNA浓度加入到每孔中。在加入后24小时，将培养基换为200μl新鲜的细胞培养基，并在37℃、5%CO2的细胞培养箱中保持5天。然后，将其以TCA（三氯乙酸）固定30分钟，并用SRB（磺酰罗丹明B，Sigma）在室温下染色30分钟。将所述孔以10%(v/v)的乙酸洗涤4到5次，自然干燥，使其保持一天，然后加入200μl 10mM的未缓冲的Tris溶液（Sigma），以酶标仪（Bio-Tek,Synergy-HT）测量540nm下的吸光度，将其表示为仅以lipofectamine处理的对照（100%）的百分数。
所述百分数表示以siRNA 2、14或15处理的测试组相对于对照组的细胞增殖率。IC50值使用根据处理的siRNA浓度计算的百分数值而得到，结果在下表10中描述。如表10中所示，siRNA 2展示出的IC50值是siRNA14和15的20-50分之一，因此表示siRNA 2的细胞增殖抑制效应是siRNA14和15的20-50倍。因此，本发明的siRNA 2可以降低c-Met mRNA表达，并由于c-Met表达降低而直接诱导癌细胞增殖的抑制，因此显示出非常突出的抗癌效果。
【表10】c-Met靶向siRNA的细胞分裂抑制效应（A549：IC50（nM））
  SEQ ID NO.   siRNA编号   IC50(nM)
  48,49   14   116
  50,51   15   50.8
  24,25   2   2.44
实施例5.siRNA对免疫活性细胞因子释放的效应
为评估本发明的siRNA是否有免疫毒性，按以下程序进行实验。
实施例5-1.制备外周血单核细胞
将人外周血单核细胞（PBMC）在实验日当天使用Histopaque 1077试剂（Sigma,St Louis,MO,USA）通过密度梯度离心（Boyum A.Separation of leukocytes from blood and bone marrow.Scand J ClinLab Invest 21(Suppl97):77,1968）从健康志愿者提供的血液中分离。将血液以1:1比例（质量比）小心加入到转移至15ml管中的Histopaque1077试剂上，以避免相互混合。在室温下以400×g离心30分钟后，以无菌移液管仅分离含PBMC的层。向含有所分离PBMC的管中加入10ml磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后将混合物以250×g离心10分钟，将PBMC以5ml PBS再洗涤两次。将所分离的PBMC以无血清的x-vivo 15培养基（Lonza,Walkersville,MD,USA）重悬为4×106个细胞/ml的浓度，以每孔100μl的体积接种于96孔板中。
实施例5-2.形成siRNA-DOTAP复合体
按如下制备用于转染实施例5-1中制备的PBMC的siRNA-DOTAP复合体。将5μl DOTAP转染试剂（ROCHE，Germany）和45μl x-vivo15培养基混合，将1μl（50μM）siRNA和49μl x-vivo 15混合，然后在室温下反应10分钟。在10分钟后，将含所述DOTAP的溶液和含所述siRNA的溶液混合，在20到25℃的温度下反应20分钟以制备siRNA-DOTAP复合体。
实施例5-3.细胞培养物
向100μl的接种的PBMC培养基中在每孔100μl的体积中分别加入按实施例5-2制备的siRNA 2、14和15的siRNA-DOTAP复合体（siRNA的终浓度为250nM），然后在37℃的CO2培养箱中培养18小时。作为对照，使用了未以所述siRNA-DOTAP复合体处理的细胞培养物组和仅以DOTAP而未以siRNA处理的细胞培养物组。并且，通过与实施例5-2相同的方法以已知可诱导免疫应答的多聚I：C（聚肌苷酸-聚胞苷酸钾盐，Sigma，USA）和APOB-1siRNA（正义链GUC AUC ACA CUG AAUACC AAU(SEQ ID NO 99)、反义链:*AUU GGU AUU CAG UGUGAU GAC AC(SEQ ID NO 100),*:5'磷酸盐,由ST Pharm Co.Ltd.提供）代替siRNA与DOTAP配制成复合体，将细胞培养物组以其处理，用作阳性对照。在培养之后，仅分离细胞上清物。
实施例5-4.测量免疫活性
使用Procarta细胞因子测定试剂盒（Affymetrix,USA）测量释放到所述上清物中的α-干扰素（INF-α）和γ-干扰素（INF-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-12（IL-12）的量。具体地，将50μl其抗体吸附细胞因子的珠子（抗体珠）转移到过滤板上，用洗涤缓冲液洗涤一次，然后加入50μl PBMC培养液的上清物和细胞因子标准溶液，在室温以500rpm摇动孵育60分钟。
然后，用洗涤缓冲液洗涤所述溶液一次，加入试剂盒中包括的25μl检测抗体，在室温以500rpm摇动反应30分钟。再次，将所述反应溶液在减压下移出并洗涤，然后加入试剂盒中包括的50μl streptavidin-PE（链霉素-藻红蛋白），在室温以500rpm摇动反应30分钟，然后移出所述反应溶液并洗涤三次。加入120μl读取缓冲液并将所述反应溶液以500rpm摇动5分钟，然后使用Luminex装置（Bioplex luminex system,Biorad,USA）测量每个细胞因子珠子的PE荧光，结果在图1a-1d中显示。所述样品中的细胞因子浓度从1.22-20,000pg/ml区间的标准校准曲线计算。
在图1a-1d中，“培养基”表示未处理的对照组，“DOTAP”表示仅以DOTAP处理的组，“POLY I:C”或“APOB-1”表示阳性对照组，“siRNA 2”表示以SEQ ID NO.24和25的siRNA处理的测试组，“siRNA14”表示以SEQ ID NO.48和49的siRNA处理的测试组，“siRNA 15”表示以SEQ ID NO.50和51的siRNA处理的测试组。图1a-1d显示了PBMC中释放的细胞因子水平，其中1a代表α-干扰素，1b代表γ-干扰素，1c代表白介素-12，1d代表肿瘤坏死因子。
与对照组和仅以DOTAP处理的组相比，siRNA 2呈现所有细胞因子的非常微弱增加，与用作阳性对照的POLY I:C和APOB-1诱导的细胞因子增加相比，所述增加几乎可以忽略。并且，与siRNA 14和siRNA 15相比，可以发现siRNA 2所诱导产生的α-干扰素和γ-干扰素的增加，尤其是α-干扰素的增加，非常低。因此，确定了siRNA 2在人PBMC中几乎不会诱导免疫活性。
实施例6.制备用于抑制c-Met表达的化学修饰siRNA
实施例2中制备的siRNA 2、17和20被设计使得其化学结构可以如前文表4中所示的6种形式（mod 1-6）进行修饰。所述化学修饰的siRNA由ST Pharm Co.Ltd（韩国）合成。经化学修饰的17种siRNA如下表11中所示，其中化学修饰的标记如前文表3中所说明。
【表11】
Figure BDA00002079872000281
Figure BDA00002079872000291
实施例7.使用化学修饰siRNA抑制癌细胞系中c-Met mRNA表达
为确定化学修饰siRNA在癌细胞系中是否保持mRNA抑制活性，将实施例2中未修饰的siRNA（siRNA 2、17和20）和实施例6中17种化学修饰siRNA（siRNA 24-40）以与实施例3-2相同的方式分别配制成脂质体复合体以转染人肺癌细胞系（A549，ATCC）（10nM siRNA），以与实施例3-4相同的方式定量分析转染的癌细胞系中的c-Met表达，结果在下表12中描述。在表12中，mod0表示未化学修饰的siRNA，ND表示未检测。
【表12】以10nM的化学修饰siRNA处理的人肺癌细胞系（A549）中c-Met mRNA相对表达率（%）
  siRNA 2   siRNA 17   siRNA 20
  mod0   20.28   13.00   12.23
  mod1   18.04   38.90   44.91
  mod2   18.74   20.70   24.61
  mod3   19.67   16.10   25.71
  mod4   34.06   22.00   60.02
  mod5   18.76   16.60   23.06
  mod6   ND   15.50   20.00
如表12中所示，甚至当siRNA 2、17和20被化学修饰时，在癌细胞系中仍保留所述mRNA抑制效应。具体地，mod2、mod3、mod5和mod6显示出与未修饰siRNA的效应相同或更好的效应。
实施例8.化学修饰siRNA对免疫活性细胞因子释放的抑制效应
为了研究化学修饰导致的siRNA免疫毒性降低的程度，将siRNA 2、17和20分别结构修饰成mod1-mod6，然后以其处理人外周血单核细胞（PBMC）以定量释放的细胞因子。以与实施例5相同的方式进行该实验，将培养液中从PBMC释放的细胞因子（α-干扰素、γ-干扰素、白介素-12、肿瘤坏死因子）浓度定量，在下表13中显示。在表13中，“培养基”表示未处理的对照组，“DOTAP”表示仅以DOTAP处理的组，“POLY I:C”或“APOB-1”表示阳性对照组，“siRNA 2”表示其中所述siRNA 2被以mod0-5化学修饰的测试组，“siRNA 20”表示其中所述siRNA 20被以mod0-6化学修饰的测试组。所述mod0表示未修饰的siRNA，mod1-6如表4中所说明。
【表13】当PBMC被以250nM化学结构修饰siRNA处理时，细胞培养液中的释放细胞因子浓度（pg/ml）
Figure BDA00002079872000311
如表13中所示，与对照和仅以DOTAP处理的组相比，siRNA 2呈现所有细胞因子都没有变化或有非常微弱的增加。
同时，siRNA 17和20呈现了由于所述化学修饰导致的α-干扰素急剧降低。对于其他细胞因子，没有显著变化或有非常微弱的增加。因此，确定了siRNA 17和20的化学修饰可以显著降低免疫活性。
实施例9.化学修饰siRNA抑制正义链的脱靶效应
进行以下实验以检查正义链的脱靶效应是否可以通过siRNA的化学修饰来去除。
实施例9-1.制备萤火虫萤光素酶载体
将与siRNA反义链互补的序列和与siRNA正义链互补的序列分别克隆到表达萤火虫萤光素酶的pMIR-REPORT（Ambion）载体中，以制被两种不同的质粒。所述互补序列由Cosmo Genetech设计并合成，使得两端都有SpeI和HindIII限制性位点悬突，然后使用pMIR-REPORT载体的SpeI和HindIII限制性位点进行克隆。
实施例9-2.测量通过化学修饰siRNA对脱靶效应的抑制
使用实施例9-1中制备的含有分别与siRNA的正义链和反义链互补的各个序列的质粒，测量了siRNA的反义链和正义链的效应。通过确定正义链是否结合到RISC并作用于具有与所述正义链互补的碱基序列的序列，以及与未以所述siRNA处理的细胞相比具有与所述正义链互补的序列的萤火虫荧光素酶质粒表达的萤光素酶量是否下降，可以看出正义链的脱靶效应的程度。并且，对于以具有与反义链互补的序列的萤火虫萤光素酶质粒处理的细胞，化学修饰后反义链siRNA活性的保留程度可以通过siRNA展示的萤光素酶降低的程度来确定。
具体地，将实施例9-1中制备的萤火虫萤光素酶载体和所述siRNA一起转染进HeLa细胞和A549细胞（ATCC）中，然后通过萤光素酶测定法来测量表达的萤火虫萤光素酶量。在转染前一天，将HeLa细胞系和A549细胞系以每孔6×104个细胞制备于24孔板中。将已克隆有互补碱基序列的萤光素酶载体（100ng）与用于归一化的载体表达海肾（renilla）萤光素酶的pRL-SV40载体（2ng，Promega）一起在Opti-MEM培养基（Gibco）中使用lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。在24小时后，使用被动性裂解缓冲液（Promega）裂解所述细胞，然后使用双荧光素酶测定试剂盒（Promega）测量萤光素酶活性。
将测量的萤火虫萤光素酶值和测量的海肾萤光素酶值进行转染效率的归一化，然后计算相对于对照归一化荧光素酶值（100%）的百分数，所述对照被以克隆有与每条链互补的序列而无siRNA的海肾萤光素酶载体和萤火虫萤光素酶载体转染，所述百分数在下表14中描述。在表14中，mod0表示未修饰siRNA，mod1-6如表4中所说明。
【表14】通过siRNA化学修饰降低脱靶效应
Figure BDA00002079872000331
如表14中所示，在人肺癌细胞系A549和子宫颈癌细胞系HeLa细胞中，对于siRNA 2，未经修饰siRNA（mod0）本身没有正义链的脱靶效应。然而，对于siRNA 20，通过降低含有与所述正义链互补的序列的萤火虫萤光素酶活性可以看到正义链的微弱脱靶效应，但是若被化学修饰，尤其是mod2和mod5，正义链效应降低且反义链效应保持。
Figure IDA00002079872900011
Figure IDA00002079872900021
Figure IDA00002079872900041
Figure IDA00002079872900051
Figure IDA00002079872900061
Figure IDA00002079872900091
Figure IDA00002079872900101
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Figure IDA00002079872900271
Figure IDA00002079872900281

Claims (19)

1.一种15到30bp的双链siRNA（小干扰RNA），其可靶向对应于选自下表1-1中描述的c-Met cDNA区域的至少一个的mRNA区域：
【表1-1】
  序列编号   序列(5'->3')   2   GAAAGAGGCACTAGCAAA   3   GCACTAGCAAAGTCCGAGA   4   CAGCAAAGCCAATTTATCA   5   CTATGATGATCAACTCATT   6   CAATCATACTGCTGACATA   7   CTCTAGATGCTCAGACTTT   8   TCTGGATTGCATTCCTACA   9   CTGGATTGCATTCCTACAT   10   GCACAAAGCAAGCCAGATT   11   CTGCTTTAATAGGACACTT   12   CAGGTTGTGGTTTCTCGAT   13   CTGGTTATCACTGGGAAGA   14   TTGGTCCTGCCATGAATAA   15   AGACAAGCATCTTCAGTTA   16   TCGCTCTAATTCAGAGATA   17   TCAGAGATAATCTGTTGTA   18   GTGAGAATATACACTTACA   19   GGTGTTGTCTCAATATCAA   20   CATTTGGATAGGCTTGTAA   21   CCAAAGGCATGAAATATCT
2.权利要求1的siRNA，其中所述siRNA可靶向对应于选自SEQ IDNO 3、18和21的至少一个碱基序列的mRNA区域。
3.权利要求1的siRNA，其中所述siRNA在3’末端、5’末端或两个末端包含由1到5个核苷酸组成的悬突。
4.权利要求2的siRNA，其中所述siRNA包括选自下表6中描述的siRNA 1到23的核苷酸序列：
【表6】
Figure FDA00002079871900021
5.权利要求4的siRNA，其中所述siRNA选自：
siRNA 2，其包含SEQ ID NO.24的正义序列和SEQ ID NO.25的反义序列；
siRNA 17，其包含SEQ ID NO.54的正义序列和SEQ ID NO.55的反义序列；
siRNA 20，其包含SEQ ID NO.60的正义序列和SEQ ID NO.61的反义序列；
siRNA 21，其包含SEQ ID NO.62的正义序列和SEQ ID NO.25的反义序列；
siRNA 22，其包含SEQ ID NO.63的正义序列和SEQ ID NO.55的反义序列；以及
siRNA 23，其包含SEQ ID NO.64的正义序列和SEQ ID NO.61的反义序列。
6.权利要求1的siRNA，其中至少一个核糖核苷酸的糖或碱基结构或者核糖核苷酸之间的键被化学修饰。
7.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰是以硼烷磷酸键或磷硫酰键修饰3’末端、5’末端或两末端的磷酸二酯键。
8.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰是在3’末端、5’末端或两末端引入ENA(乙烯桥接核酸)。
9.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰是以选自-NH2(氨基)、-C-烯丙基、-F(氟基)和-O-Me(甲基)的至少一个取代核糖环的2’-OH（羟基）。
10.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰siRNA包括选自下表11-1中描述的siRNA 24-40中的核苷酸序列：
【表11-1】
Figure FDA00002079871900051
在上表11-1中，化学修饰的标记如下表3中所描述：
【表3】
  标记   引入的化学修饰   *   磷酸二酯键被磷硫酰键取代   下划线   核糖环2’-OH被2’-O-Me取代   小写字母   核糖环2’-OH被2’-F取代   粗体字母   引入ENA（乙烯桥接核酸）
11.一种表达载体，其包含权利要求1-10任一项的siRNA。
12.权利要求11的表达载体，其中所述表达载体选自质粒、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体和溶瘤腺病毒载体。
13.一种抗癌组合物，其含有权利要求1-10任一项的siRNA作为活性成分。
14.权利要求13的抗癌组合物，其包括与核酸递送系统的复合物形式的siRNA。
15.权利要求14的抗癌组合物，其中所述核酸递送系统选自病毒载体、非病毒载体、脂质体、阳离子聚合物、微团、乳剂和固态脂质纳米颗粒。
16.权利要求13的抗癌组合物，还包括抗癌化学治疗物，或
抑制选自生长因子、生长因子受体、下游信号转导蛋白、病毒癌基因和抗癌剂抗性基因的一个的表达的siRNA。
17.一种抑制c-Met合成和/或表达的方法，包括制备权利要求1-10任一项的siRNA；使所述siRNA与表达c-Met的细胞相接触。
18.一种抑制癌细胞生长的方法，包括制备权利要求1-10任一项的siRNA；使所述siRNA与表达c-Met的癌细胞相接触。
19.一种预防和/或治疗癌症的方法，包括制备权利要求1-10任一项的siRNA；将所述siRNA以治疗有效量给予患者。
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