WO2011081415A2 - c-Met의 발현을 저해하는 siRNA 및 이를 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

c-Met의 발현을 저해하는 siRNA 및 이를 포함하는 항암 조성물 Download PDF

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • siRNA that inhibits the expression of c-Met and anticancer composition comprising the same
  • the present invention is a small interfering RNA (siRNA) that binds to the c-Met transcript salt sequence complementarily to inhibit the expression of C -Met in the cell and does not induce an immune response. And the use of said siRNA in the prevention and / or treatment of cancer.
  • siRNA small interfering RNA
  • c-Met is also called HGFR because it is a receptor for hepatocyte growth factor (HGF), and was first discovered in osteosarcoma of humans treated with a chemical carcinogene in 1984, and in 1986, a translocated promoter region (tpr).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • tpr translocated promoter region
  • hepatocyte growth factor / scatter factor produced by mesenchymal cells
  • RTK receptor tyrosine kinase
  • HGF / c-Met Abnormal signaling of HGF / c-Met is mostly the result of overexpression or mutation of HGF or c-Met and increased activity, and is closely related to the poor prognosis of many cancer patients. As such, there is a close correlation between the activity of c-Met protein and cancer development and metastasis, and the clinical success of other receptor tyrosine kinase inhibitors has led to the development of anti-cancer drugs targeting c-Met.
  • candidates entering the clinical stage are mostly chemical synthesis inhibitors designed based on the tertiary structure of proteins such as antibodies antagonizing c-Met receptors or tyrosine kinase inhibitors that inhibit c-Met signaling.
  • small interfering RNA induces early immune response and frequently induces a nonspecific RNAi effect than expected.
  • siRNA anticancer drugs targeting c-Met which plays an important role in cancer progression, has been attempted, but the results have been insignificant.
  • the gene suppression efficacy of individual sequences of siRNA has not been suggested, in particular There is no consideration for immune activity.
  • siRNA drugs that can inhibit the expression of all disease target genes, including targets that cannot be medicated by conventional methods, have shown infinite possibilities as new therapeutics due to their high activity and excellent target selectivity. To succeed, it is necessary to solve the problems of low stability in blood, limited drug distribution, off-target effect, and induction of immune response.
  • the present inventors have completed the present invention by developing a siRNA that has high sequence specificity of the present invention, specifically binds to a transcript of a target human gene, increases RNAi efficiency, and does not cause immunotoxicity.
  • One embodiment of the present invention provides an siRNA that binds complementarily to the c-Met transcript ' base sequence and specifically inhibits the synthesis and / or expression of c-Met.
  • Another example provides an expression vector expressing the siRNA.
  • Another example provides the pharmaceutical composition for the synthesis and / or inhibition of c-Met containing the siRNA or the expression vector expressing siRNA as an active ingredient.
  • Another example provides an anticancer composition comprising the siRNA or an expression vector expressing siRNA as an active ingredient.
  • Another example includes preparing an expression vector expressing the siRNA or siRNA; And contacting said siRNA or an expression vector expressing siRNA with a cell expressing c-Met, a method of inhibiting synthesis and / or expression of Met and c- of an expression vector expressing siRNA or siRNA.
  • Met Provided for the synthesis and / or inhibition of expression of C- Met in expressing cells.
  • Another example includes preparing an expression vector expressing the siRNA or siRNA; And contacting the siRNA or the expression vector expressing siRNA with cancer cells expressing c-Met, the method of inhibiting growth of cancer cells and c of the expression vector expressing siRNA or siRNA. -Used to inhibit the growth of cancer cells in cancer cells expressing Met.
  • Another example includes preparing an expression vector expressing the siRNA or siRNA; And a method for preventing and / or treating cancer by administering a therapeutically effective amount of the expression vector expressing the siRNA or siRNA and providing a use for the prevention and / or treatment of the cancer of the expression vector expressing the siRNA or siRNA. do.
  • the present invention is c-Met before being combined with the complementary column, where carcasses salt to provide a drug composition of water, and its use, including in the cell siRN 'A, to inhibit the synthesis and / or expression of the standing c-Met this to be.
  • the present invention provides siRNAs that specifically inhibit the synthesis and / or expression of c-Met.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for c-Met synthesis and / or expression inhibition comprising siRNA that specifically inhibits the synthesis and / or expression of the c-Met as an active ingredient.
  • the present invention is a cancer cell growth inhibitor or a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of cancer comprising an active ingredient siRNA that specifically inhibits the synthesis and / or expression of the c-Met (anticancer composition ).
  • the present invention relates to a technique for inhibiting the expression of c-Met mRNA, its selective splice form, mutant form, or c-Met gene of the same strain in mammals including humans. This may be achieved by reducing the target mRNA when a particular dose of siRNA provided herein is administered to a patient. . This will be described in more detail below.
  • the c-Met may be c-Met and its mutants of mammalian origin, preferably of humans or of the same strain as humans. Lineages such as humans refer to other mammals whose genes or mRNAs have 80% or more sequence similarity with human c-Met genes or mRNAs derived therefrom. Specifically, humans, primates, rodents, etc. I can include it
  • the cDNA sequence of the sense strand corresponding to the mRNA encoding c-Met may be SEQ ID NO: 1.
  • SiRNA according to the present invention is one selected from the group consisting of a continuous 15 to 25 bp, preferably 18 to 22 bp, preferably SEQ ID NO: 2 to 21 inside the mRNA or cDNA of the c-Met
  • the target region on the mRNA or cDNA region corresponding to the above nucleotide sequence may be targeted.
  • the target regions on the preferred cDNA are summarized in Table 1 below. Therefore, in one embodiment of the present invention, the c-Met cDNA region of SEQ ID NO: 1 to target the mRNA or cDNA region corresponding to one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to 21.
  • siRNA Specifically, siRNA is provided that targets an mRNA region corresponding to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 18, and 21.
  • the term 'target mRNA' refers to human c-MetmRNA, human-like c-Met mRNA, a mutant thereof, or a selective splicing construct.
  • the siRNA of the present invention may be targeted to c-Met mRNA of the human or human lineage, or a selective splicing form thereof, a mutant form thereof.
  • 'targeting an mRNA (or cDNA) region' refers to a base sequence in which siRNA is complementary to all or part of the mRNA (or cDNA) region sequence, eg, 85-100% of the sequence. It means that can have a specific binding to the mRNA (or cDNA) region.
  • complementary means that both strands of a polynucleotide can form a salt group pair. Both strands of complementary polynucleotides form base pairs in a Watson-Crick fashion to form double strands.
  • base U is mentioned in the present invention, unless otherwise stated, base T may be substituted.
  • siRNA contained as an active ingredient in the pharmaceutical composition is 15-30 bp double stranded siRNA that targets one or more of the specific mRNA regions Can be.
  • the siRNA may include one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 22 to 98. More specifically, the siRNA may be one or more selected from the group consisting of siRNA 1 to siRNA 40 shown in Table 2 below. .
  • siRNA 21 asymmetric 25 UCUCGGACUUUGCUAGUGCdTdT Antisense
  • siRNA 63 AGAAUAUACACUUACA Sense
  • the siRNA has a high sequence specificity for a specific target region of the c-Met transcript sequence, which is specifically complementary to the transcript of the target gene to increase RNA interference efficiency, thereby increasing c-Met in the cell. Its expression and / or synthesis inhibition efficiency is excellent. In addition, it is characterized in that the immune-inducing activity is minimized.
  • the siRNA provided in the present invention is siRNA, preferably a sequence, which targets mRNA for at least one region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 21 in the c-Met cDNA region of SEQ ID NO: 1 SiRNA comprising at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences Nos. 22 to 98, and more preferably at least one selected from the group consisting of 40 siRNAs consisting of SEQ ID NOs: 22 to 98.
  • the siRNA is a concept including both a ribonucleic acid sequence itself or a recombinant vector (expression vector) form that expresses it.
  • the expression vector may be a viral vector selected from the group consisting of plasmid or adeno-associated virus, retrovirus, vaccinia virus, oncolytic adenovirus, and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes a case containing siRNA and a pharmaceutically acceptable carrier as an active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes all carriers commonly used in the art, and may be, for example, one or more selected from the group consisting of water, saline, phosphate buffered saline, textine, glycerol, and ethane. It is not limited to this.
  • Patients to be administered the siRNA or pharmaceutical composition of the present invention may be mammals, preferably humans, monkeys, rodents (mouses, rats), particularly those having a disease or condition associated with the expression of c-Met, or c All that require inhibition of -Met expression can be mammals, such as humans.
  • the concentration of siRNA, or use or treatment, in the composition is ⁇ to ⁇ , preferably 0.01 to ⁇ , more Preferably it may be 0.1 to 10nM, but is not limited thereto.
  • Cancers that can be treated by siRNA according to the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same include lung cancer, liver cancer, colon cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, thyroid cancer, esophageal cancer, prostate cancer, etc. It may be one or more selected from the group consisting of soft tissue sarcoma, glioma.
  • the siRNA of the present invention functions to cause the degradation of c-Met mRNA by the RNAi mechanism, thereby not causing or reducing the expression of c-Met protein.
  • siRNA refers to small inhibitory RNA duplexes that cause RNA interference (RNAi) pathways.
  • siRNA includes a sense RNA strand and an antisense strand complementary thereto,
  • the doc is an RNA double strand comprising 15-30bp, specifically 19-25bp or 27bp, more specifically 19-21bp.
  • the siRNA may comprise a double stranded region and a single strand may form a hairpin or stem-loop structure, or may be a double strand of two separate strands.
  • the sense RNA strand has the same sequence as the nucleotide sequence of the mRNA sequence of the target gene, and the sense strand and its complementary antisense strand are double stranded by complementary nucleotide sequences of Watson and Creek.
  • Antisense strands of siRNA are captured in RNA-induced silencing complexes (RISCs) to allow RISCs to identify target mRNAs complementary to the antisense strands and then induce cleavage or translational inhibition.
  • RISCs RNA-induced silencing complexes
  • the double stranded siRNA may have an overhang of 1-5 nucleotides at the 3 'end, 5' end, or both ends. Alternatively, both ends may have a form cut into blunt ends.
  • the siRNAs disclosed in US20020086356, and US7056704 which are incorporated herein by reference.
  • the siRNA includes a sense strand and an antisense strand, the sense strand and the antisense strand are 15-30 bp double strands, a symmetrical structure having a blunt end without protrusions, Or an asymmetric structure having at least one, for example, 1-5 nucleotide overhang.
  • Overhang nucleotides can be of any sequence, but can be tagged with two deoxythymidine (doxythymidines).
  • the antisense strands hybridize to the target region of mRNA of SEQ ID NO: 1 under physiological conditions.
  • 'generalization in physiological conditions' it is meant that the antisense strand of siRNA is localized to a specific target region of mRNA at z ' «w.
  • the additional antisense strand may have 85% or more of sequence complementarity with a target region of mRNA, preferably, the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2 to 21 of Table 1, and more specifically, the antisense strand may have a base of SEQ ID NO: 1 Consecutive 15 to 25 bp, preferably 18 to 22 bp base sequence in the sequence, and may include a sequence that is completely complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2 to 21 of Table 1 above.
  • siRNAs may be asymmetric double stranded structures in which one strand is shorter than the other.
  • antisense strand of 19-21 nucleotides (nucleotide, nt); And a double-stranded siRNA molecule consisting of a 15-19nt sense strand having a sequence complementary to the antisense, wherein the siRNA has a smooth end (5 'end of the antisense). blunt end) and an asymmetric siRNA with 1-5 nucleotide overhangs at the 3 'end of the antisense.
  • siRNA disclosed in WO09 / 078685 Specifically, antisense strand of 19-21 nucleotides (nucleotide, nt); And a double-stranded siRNA molecule consisting of a 15-19nt sense strand having a sequence complementary to the antisense, wherein the siRNA has a smooth end (5 'end of the antisense). blunt end) and an asymmetric siRNA with 1-5 nucleotide overhangs at the 3 'end of the antisense.
  • the first consideration in the treatment with siRNA is to select the optimal nucleotide sequence having the greatest activity in the nucleotide sequence of the targeted gene. Specifically, in one embodiment, it is desirable to design c-MetsiRNA comprising interspecies conserved sequences to increase the relevance between preclinical and clinical trials. In addition, in one embodiment, it is desirable that the antisense strand that binds to RISC is designed to have a high binding force with RISC. Therefore, the thermodynamic stability of the sense strand and the antisense strand is designed to be different so that the sense strand does not bind to the RISC and the antisense strand as a guide sequence to enhance the binding force with RISC.
  • the GC sequence of the sense strand does not exceed 60%, and there are three or more adenine / guanine bases between the 5 'end of the sense strand and the 15th and 19th stages, and the G / C base has a large number between the 1st and 7th stages.
  • the 3rd, 10th, and 19th base sequences from the 5 'end of the sense strand may be adenine in order to bind to the mRNA of the target gene and cause transcriptase degradation.
  • siRNA is characterized in that non-specific binding and immunogenic activity is minimized. Induction of immune response by interferon such as siRNA is mainly present in the endosomes of immune cells that present antigens.
  • TLR7 toll-like receptor-7
  • siRNA Occurs through toll-like receptor-7 (TLR7), and binding of siRNA to TLR7
  • the GU is sequence-specific, such as a sequence rich in, it may include a sequence that is not recognized by TLR7. Specifically, it does not have immunogenic sequences such as 5′-GUCCUUCAA-3 ′ and 5′-UGUGU-3 ′, and complementarity with other genes other than c-Met may be at least 70% or less.
  • Examples of c-Met cDNA target sequences of one embodiment of the invention include nucleotides of the sequences listed in Table 1 above. Based on the target sequence of Table 1, the length of the siRNA can be designed to be longer or shorter than the length of the target sequence, or the siRNA sequence can be designed with or without complementary nucleotides added to the DNA sequence.
  • siRNA includes a sense strand and an antisense strand, wherein the sense strand and the antisense strand are 15-30 bp double stranded, have no overhang, or at least one terminus of 1-5 nucleotides. Having an overhang, the antisense strand is localized to mRNA regions that bore SEQ ID NOS: 2-21, preferably SEQ ID NOS: 3, 18, 21, under physiological conditions. That is, the antisense strand comprises the complementary sequence of SEQ ID NO: 2 to 21, preferably SEQ ID NO: 3, 18, 21. That is, the c-Met siRNA of the present invention and the pharmaceutical composition comprising the same have the characteristics of inhibiting the expression of the c-Met gene without inducing harmful interferon reaction.
  • the present invention provides SEQ ID NO: 3 (5'-GCACTAGCAAAGTCCGAGA-3 '), SEQ ID NO: 18 (5'-GTGAGAATATAC ACTTACA-3'), and SEQ ID NO: 21
  • (5'-CCAAAGGCATGAAATATCT-3 ') is complementary to the mRNA region corresponding to one or more sequences selected from the group consisting of inhibits the expression of c-Met in cells.
  • C-Met siRNA according to an embodiment of the present invention is as described in Table 2 above.
  • the C- Met siRNA is siRNA 2 comprising the sense sequence of SEQ ID NO: 24 and the antisense sequence of SEQ ID NO: 25, siRNA 17, comprising the sense sequence of SEQ ID NO: 54 and the antisense sequence of SEQ ID NO: 55
  • a siRNA 20 comprising a sense sequence of SEQ ID NO: 60 and an antisense sequence of SEQ ID NO: 61
  • SiRNA 21 comprising an antibody sequence and an antisense sequence of SEQ ID NO: 25, a siRNA 22 comprising the sense sequence of SEQ ID NO: 63 and an antisense sequence of SEQ ID NO: 55, a sense sequence of SEQ ID NO: 64, and an antisense sequence of SEQ ID NO: 61
  • Knockdown allows for quantitative PCR (qPCR) amplification, bDNA (branched
  • DNA assay, Western blot, ELISA, etc. can be determined by measuring changes in mRNA or protein levels.
  • liposome complexes are prepared, treated with tumor cell lines, and then expression interferences mediated by ribonucleic acid can be confirmed using bDNA measurement at the mRNA stage.
  • siRNA sequence of the present invention not only effectively inhibits the synthesis or expression of c-Met, but also has a feature of low immunogenic activity.
  • immunotoxicity is human peripheral blood mononuclear cells
  • siRNA-DOTAP N- [l- (2,3-Dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimetylammonium in peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
  • metylsulfate, complexes, and free cytokines interferon alpha and gamma INF-a and INF- ⁇
  • tumor necrosis factor-a TNF-a
  • interleukin— 12 Interleukin-12, IL-12
  • the siRNA may have an unmodified ribonucleic acid unit structure, or may have a chemical modification of a binding structure or base structure of one or more ribonucleic acids, or a binding site between the ribonucleic acids. .
  • siRNA can be improved over unmodified siRNA, including the reduction of off-target effects such as se e) effects.
  • the method for chemical modification of siRNA is not particularly limited, and those skilled in the art having ordinary skill in the art to which the present invention pertains are known in the art.
  • the method can be used to synthesize and modify the siRNA in any desired manner (Andreas Henschel, Frank Buchholzl and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a webbased tool for the design and quality control of siRNAs.Nucleic Acids Research 32 (Web Server Issue) ): Wl 13-W120).
  • Ethylene bridge nucleic acid Ethylene bridge nucleic acid (ENA) or Locked nucleic acid (LNA)
  • Ethylene bridge nucleic acid LNA
  • LNA Locked nucleic acid
  • -OH (hydroxy group) in the 2 ' -position of the ribose ring is -NH 2 (amino group), -C-allyl (allyl group), -F (fluoro group), Or chemical modifications substituted with -O-Me (or CH 3 , methyl).
  • 2'-OH is substituted with 2'-0-Me in the ribose rings of nucleic acids 1 and 2 of the sense strand, or 2'-0- is substituted with 2'-0- in the ribose rings of nucleic acid 2 of the antisense strand.
  • siRNA double-stranded structure at the same time, so as not to reduce the gene expression inhibitory activity, it is preferable to make a minimum modification. It is also possible to attach ligands, such as cholesterol, biotin and cell penetrating peptides, to the 5 'or 3'-end of the sense strand to the siRNA.
  • ligands such as cholesterol, biotin and cell penetrating peptides
  • siRNA of the present invention can be prepared by cleaving long double-stranded RNA with a chemical synthesis, in vitro transcription or nuclease having Dicer or other similar activity.
  • siRNA can be expressed by plasmid, viral expression vector, or the like.
  • siRNA-specific sequences induce interferon is experimentally confirmed in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), including dendritic cells, and candidate siRNAs are selected by selecting sequences that do not induce an immune response. Can be selected as a sequence.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • candidate siRNAs are selected by selecting sequences that do not induce an immune response. Can be selected as a sequence.
  • siRNA Describe the drug delivery system (DDS) for delivery.
  • DDS drug delivery system
  • siRNA can be utilized for nucleic acid delivery (nucleic acid delivery system) ° 1.
  • Nucleic acid carriers for delivering nucleic acid material into cells include viral vectors, nonviral vectors, liposomes, cationic polymers, micelles, emulsions, and solid lipid nanoparticles.
  • Viral vectors have the advantage of high delivery efficiency and long duration.
  • the virus vector includes a retroviral vector, an adenoviral vector, a bacteriovirus vector, and an adeno-associated virus.
  • Vector adeno-associated viral vector
  • Nonviral vectors may include plasmids.
  • various formulations such as liposomes, cationic polymers, micelles, micelles and solid lipid nanoparticles can be used.
  • Cationic polymers for nucleic acid delivery include natural polymers such as chitosan, atelocollagen, catiomc polypeptides, poly (L-lysin), linear or branched polyethylene imine (PEI), and cyclo Synthetic polymers such as cyclodextrin-based polycation and dendrimer are included.
  • SiRNA of the present invention or a complex of siRNA and nucleic acid carrier is may be introduced into the i n vivo or ex vivo on cells.
  • the introduction of the siRNA of the present invention or a complex of the siRNA and the nucleic acid carrier into the cell selectively reduces the expression of the target protein, c-Met or corrects mutations in the target gene. In this role, the expression of c-Met, which is involved in the generation of cancer, is suppressed, thereby killing cancer cells and treating cancer.
  • SiRNA of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same may be topical, oral or.
  • administration of siRNA may be topical, including mucosal, vaginal, or anus administration of the eye, or pulmonary, bronchial, nasal, cortical, endothelial, intravenous, arterial, subcutaneous, intraperitoneal, muscle, cranial (penal membrane Parenteral administration, or the like, or oral administration.
  • siRNA or a pharmaceutical composition comprising the same may be formulated in the form of patches and ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, solutions, powders and the like.
  • siRNA or a pharmaceutical composition comprising the same may be prepared using a sterile aqueous solution containing appropriate additives such as buffers, diluents, penetration enhancers, and other commonly used pharmaceutically acceptable carriers or excipients. It may include.
  • the siRNA of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same is mixed with the siRNA composition for injection and administered in the form of injection to the tumor site, or mixed with a gel composition or a transdermal absorption adhesive composition, directly applied to the affected area It is desirable to implement such that it can be administered by the lump route.
  • the injectable compositions are preferably, but not limited to, in the form of isotonic aqueous solutions or suspensions, and are sterilized, and / or adjuvants (eg, preservatives, spermatizers, wetting or emulsifier solution accelerators, salts for controlling osmotic pressure). , Edema and / or liposomes).
  • the gel composition contains a conventional gel preparation, such as carboxymethyl salose, methyl salloose, acrylic acid polymer, carbopol and the like, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or liposome preparation.
  • the pressure-sensitive adhesive composition has an active ingredient layer, an adhesive layer, an adsorption layer for sebum absorption, and a therapeutic drug.
  • ⁇ comprising a layer, wherein the therapeutic drug layer comprises a pharmaceutically acceptable carrier and / or liposome It may be, but is not limited to containing an agent.
  • siRNA of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same is anti-cancer chemotherapy with c-Met siRNA. Additionally, or is resistant to growth factors, growth factor receptors, downstream signaling proteins, viral oncogenic factors, and anticancer agents. It may further comprise an siRNA that inhibits the expression of the one selected from the group consisting of genes.
  • c-Met siRNA increases sensitivity to chemotherapeutic agents to maximize therapeutic effects and reduce side effects, as well as various growth factors (eg, VEGF, EGF, PDGF). Etc.), in combination with growth factor receptors and downstream signaling proteins, viral oncogenic factors, and siRNAs that inhibit the expression of anticancer drug resistance genes, the anticancer effect can be maximized by simultaneously blocking several cancer pathways.
  • Anticancer chemotherapeutic agents that can be used in combination with siRNA that inhibits the expression of c-Met of the present invention are, for example, cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, doxorubicin, Daunorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone, valubicin, curcumin, zefitinib, erlotinib erlotinib, irinotecan, irinotecan, topotecan, vinblastine, vinblasttine, vincristine, docetaxel, docetaxel, paclitaxel and the like.
  • Another example of the present invention comprises the steps of preparing an effective amount of the c— Met siRNA for the synthesis and / or inhibition of c-Met; And contacting the siRNA to a cell expressing c-Met, providing a method of inhibiting c-Met expression and / or synthesis.
  • Another example includes preparing an effective amount of said c-Met siRNA for synthesis and / or inhibition of expression of c-Met; And contacting the siRNA to cancer cells expressing c-Met. Another example is to prepare the c-Met siRNA; And administering the siRNA to the patient in a therapeutically effective amount. Provides a way to treat.
  • the method for preventing and / or treating the cancer may further comprise specifying a patient in need of prevention and / or treatment of a cancer to which the siRNA is administered prior to the administering step.
  • Cancer that can be treated according to the present invention is most solid cancers (lung cancer, liver cancer, colon cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, thyroid cancer, esophageal cancer, prostate cancer), bone sarcoma, soft tissue sarcoma, glioma, etc. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the patient may be a mammal, preferably a human, monkey, rodent (mouse, rat, etc.), particularly having a disease or condition (eg cancer) associated with the expression of c-Met, or c-Met expression All in need of inhibition can be mammals, such as humans.
  • a mammal preferably a human, monkey, rodent (mouse, rat, etc.), particularly having a disease or condition (eg cancer) associated with the expression of c-Met, or c-Met expression
  • All in need of inhibition can be mammals, such as humans.
  • An effective amount of siRNA according to the present invention means an amount required for administration to obtain c-Met expression or synthesis inhibition or thereby inhibiting cancer cell growth and cancer treatment effect.
  • the daily dose may be 0.001 mg / kg to 100 mg / kg, and the dose may be administered all at once or in several portions.
  • RNA complementary to the nucleotide sequence of the c-Met transcript (mRNA) of the present invention or a chemically modified structure thereof is expressed by c-Met commonly expressed in cancer cells by ribonucleic acid mediated interference (RNA-mediated interference, RNAi) Since the cancer cells are killed by suppressing the expression, it is possible to exert an excellent anticancer effect. In addition, there is an advantage that can cause a minimum of immune reaction.
  • RNA-mediated interference RNA-mediated interference
  • RNAi mechanism of the present invention can inhibit the expression of certain disease-causing proteins with selective and high activity, as well as before the protein is synthesized. Decomposes mRNA, thus inhibiting cancer growth and metastasis without causing side effects It is expected to be a more fundamental cancer treatment technology.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EGF EGF
  • PDGF vascular endothelial growth factor
  • siRNA that inhibits the expression of receptors and downstream signaling proteins
  • viral oncogenic factors and anticancer drug resistance genes there is an additional advantage of maximizing anticancer effects by simultaneously blocking several pathways of cancer.
  • La to Id shows the change in cytokine concentration according to siRNA treatment, la is the interferon alpha, lb is interferon gamma, lc is interleukin-12, Id is the concentration of tumor necrosis factor.
  • Example 1 Design of a target sequence to which siRNA for c-Met expression inhibition can bind
  • siRNA design programs from siDesign Center (Dharmacon), BLOCK-iT TM RNAi Designer (Invitrogen), AsiDesigner (KRIBB), siDirect (University of Tokyo), and siRNA Target Finder (Ambion) ), A target sequence to which siRNA can bind was derived.
  • siRNAs that can bind to the target base sequences designed in Example 1 were used in synthetic applications to Samchully Pharmaceutical (Korea).
  • the sequence of 23 siRNAs was to include dTdT at the 3 'end of both strands as shown in Table 6.
  • Human lung cancer cell line (A549), human liver cancer cell line (SK-Hep-1) from 10% Fetal Bovine Serum, Penicillin (100units / ml) and Streptomycin (100ug /) were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). ml) cultured in RPMI culture medium (GIBCO / Invitrogen, USA) under the conditions of 37 ° C, 5% (v / v) CO 2 .
  • A549 human liver cancer cell line
  • SK-Hep-1 human liver cancer cell line from 10% Fetal Bovine Serum
  • Penicillin 100units / ml
  • Streptomycin 100ug /
  • Example 3-1 Lung cancer cell lines and liver cancer cell lines cultured in Example 3-1 were seeded by 10 4 cells per well in 96 well-plates, respectively. After 24 hours, remove the medium and add 50 ⁇ l of Opti-MEM medium per well. Added. 50 ⁇ 1 of the complex composition of siRNA and liposomes prepared in Example 3-2 was added thereto, and cultured in a cell incubator maintained at 37 ° C. and 5% carbon dioxide for 24 hours.
  • Lung cancer cell lines (A-549) were treated with each siRNA in seven concentration ranges between 0.0064 nM and ⁇ for calculation of IC 50 levels, a drug concentration at which c-Met mRNA expression was 50% inhibited.
  • the expression level of c-Met mRNA suppressed by siRNA liposome complex was measured by bDNA assay using Quantigene 2.0 system (Panomics).
  • the siRNA liposome complex of ⁇ was treated with human lung cancer cell line for 24 hours, and then mRNA was quantified.
  • Lysis mixture (Panomics, Quantigene 2.0 bDNA kit) of ⁇ per well of a 96-well plate was lysed for 1 hour at 50 ° C according to the manufacturer's protocol.
  • a probe (Panomics, Cat. # SA-10157) that specifically binds to c-Met mRNA was purchased from Panomics, Inc., and then mixed in a 96-well plate with 80 ⁇ l of the obtained cell samples. The mRNA was fixed in the wells and reacted at 55 ° C. for 16-20 hours to allow for binding to the probe.
  • siRNA As shown in Table 7, among the 20 siRNAs, 16 siRNAs that suppress c-Met expression to 40% or less, and one siRNA showing 40% or more and 70% or less to suppress the c-Met expression show one or more, 70% or more inhibitory effects.
  • siRNA was identified as three species. Table 7 Relative expression rate of c-Met ⁇ ⁇ after 10 nM siRNA treatment in human lung cancer cell line (A549)
  • IC 50 values were calculated using the SofrMax pro software supported in the Spectra Max 190 (ELISA instrument) model. When the IC 50 values of siRNA 2, 17 and 20 are compared with siRNA 14 and 15, it can be seen that 5 to 100 times better.
  • Symmetrical siRNA2, 17, and 20 with SEQ ID NOs: 3, 18, 21 and siRNAs 21, 22, and 23, which are asymmetric siRNAs shorter than the antisense strands, at 4 nM concentrations of liver cancer cell line SK-Hep Treatment with -1 and c-Met mRNA inhibition effect is shown in Table 9 below.
  • the experimental method was the same as in Example 3-4.
  • This percentage refers to the cell proliferation rate in the test group treated with siRNAs of siRNA 2, 14 and 15 compared to the control.
  • IC 50 values were calculated using the percentage values calculated for each siRNA concentration, and are shown in Table 10 below. As shown in Table 10, the IC 50 value of siRNA 2 was 20 to 50 times lower than that of siRNA 14 and 15, and it was confirmed that the cell proliferation inhibitory effect of siRNA 2 was significantly superior to 20 to 50 times. Therefore, siRNA 2 of the present invention was found not only to reduce c-Met mRNA expression, but also directly induced the inhibition of proliferation of cancer cells according to the c-Met expression decrease showed excellent anti-cancer efficacy.
  • Example 5 Inhibitory Effect of Immune Activity Cytokine Release on siRNA
  • the experiment was carried out as follows.
  • Example 5-1 Peripheral Blood Mononuclear Cell Preparation
  • PBMCs Human peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC phosphate buffered saline
  • SiRNA-DOTPA complex for dispensing to the PBMC cells prepared in Example 5-1 was prepared in the following manner. Prepare 5 ul of DOTAP transfection reagent (ROCHE, Germany), 4 ⁇ 1 of x-vivo I 5 medium, and 49 ul of siRNA lul (50 uM) and 15 ul of x-vivo, respectively, and then react at room temperature for 10 minutes. Turned on. After 10 minutes, the solution containing DOTAP and the solution containing siRNA were mixed and reacted at 20-25 ° C. for 20 minutes.
  • Example 5-3 Cell culture
  • siRNA 2, 14 and 15 and the siRNA-DOTAP complex prepared according to the method of Example 5-2 were added to the divided PBMC culture solution lOOuL per well (siRNA Final concentration 250 nM), and cultured for 18 hours in a C0 2 cell incubator at 37 ° C.
  • siRNA Final concentration 250 nM a cell culture group without the siRNA-DOTAP complex and a cell culture group with only DOTAP without siRNA was used.
  • Poly I a substance known to induce an immune response instead of siRNA, was used.
  • Example 5-4 Measurement of Immune Activity
  • interferon alpha and gamma INF-a and INF- ⁇
  • tumor necrosis factor TNF-a
  • interleukin-1 2 IL-12
  • 50 ⁇ l of the antibody-adhered bead (antibody bead) to each cytokine was transferred to a filter plate and washed once with a wash buffer, followed by supernatant and cytokine standard solution of 50 ul of PBMC culture. The aliquot was incubated with shaking at 500 rpm for 60 minutes at room temperature.
  • Luminex device Bioplex luminex system, Biorad, USA
  • the Luminex instrument La-Id
  • Cytokine concentrations in the samples were calculated from standard calibration curves ranging from 1.22 to 20,000 pg / ml.
  • 'Medium' is a control group that has not treated anything
  • 'DOTAP' is a DOTAP-only group
  • 'POLY I C' or ' ⁇ - ⁇ is a positive control group
  • Test group treated with siRNA of 24 and 25 refers to a test group treated with siRNA of SEQ ID NOs: 48 and 49 and 'siRNA 15' treated with siRNA of SEQ ID NOs: 50 and 51.
  • the level of cytokines secreted by PBMC can be seen from la-Id, la is interferon alpha, lb is interferon gamma, lc is interleukin-12, and Id is tumor necrosis factor.
  • siRNA 2 Compared to the control and DOTAP alone groups, all cytokines showed only a very slight increase, almost insignificant compared to the increase in cytokines induced by P () LY I: C and APOB-1 as a positive control. Is an increase in level. In addition, compared with siRNA 14 and siRNA 15, it can be seen that the increase of interferon alpha and interferon gamma, especially interferon alpha is significantly low. Therefore, it was confirmed that siRNA 2 hardly induces immune activity in human PBMC.
  • Example 6 Preparation of siRNA for Inhibiting Chemically Modified c-Met Expression
  • SiRNA 2, 17 and 20 prepared in Example 2 the chemical structure is designed to be modified in six forms (modl ⁇ 6) as shown in Table 4 above, the designed chemically modified siRNA is Samchully pharmaceutical (Korea ) Was used by the synthetic request. 17 chemically modified siRNAs are shown in Table 11 below, and the notation of chemical modifications is shown in Table 3 above.
  • siRNAs (siRNAs 2, 17 and 20) of Example 2 which are not chemically modified, are subjected to chemical structural modifications.
  • Liposome complexes were prepared in the same manner as in Example 3-2, except that a total of 17 siRNAs of 6 to 24 siRNA were used to transform the human lung cancer cell line (A549, ATCC) (10 nM siRNA), and The expression pattern of oMet in the transfected tumor cell line was quantitatively analyzed in the same manner as in Example 3-4, and the results are shown in Table 12 below.
  • modO indicates siRNA without chemical structural modifications
  • ND indicates no measurement.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • 'Medium' is a control group that has not treated anything
  • 'DOTAP' is a DOTAP-only group
  • 'POLY I C or' ⁇ - ⁇ is a positive control group
  • 'siRNA2' is 1110 (10 ⁇ ) in siRNA 2.
  • the test group treated with 5, 'siRNA' refers to the test group treated with siRNA 17 1010-6
  • 'siRNA20' refers to the test group treated with si ⁇ 20 treated with 1 ⁇ (10-6). It shows siRNA of the state which is not, modl-6 are as described in Table 4.
  • siRNA 2 had no or very low levels of change in all cytokines compared to the control and DOTAP alone groups regardless of structural modifications. Only increase was shown.
  • siRNA 17 and 20 it was confirmed that the level of interferon alpha was drastically reduced by chemical structural modification.
  • the other cytokines showed no significant change or only a very low level of increase. Therefore, in the case of siRNA 17 and 20 it was confirmed that the chemical structural modification can significantly reduce the immune activity.
  • Example 9 Inhibition Test of Off-target Effect by the Sense Strand of Chemically Modified siRNA
  • Example 9-1 Preparation of firefly luciferase vector
  • siRNA in the pMIR-REPORT Ambion vector expressing firefly luciferase
  • sequence complementary to the antisense strand and the complementary sequence to the sense strand Were cloned to prepare two different plasmids, respectively.
  • the complementary sequence was commissioned by Cosmojintech and synthesized by designing to have restriction enzyme overhangs of Spel and Hindlll at both ends. Cloning was performed using Spel and Hindlll restriction enzyme sites of the pMIR-REPORT vector.
  • Example 9-2 Inhibition measurement of off-target effects through chemical structural modification of siRNA
  • Efficacy of the antisense and sense strand of the siRNA was measured using the plasmid containing the complementary sequence of each sense and antisense of the siRNA prepared in Example 9-1.
  • the extent to which the off-target effect by the sense strand occurs is complementary to the sense strand when the sense strand binds to the RISC and acts on a sequence having a complementary base sequence with the sense strand. This can be seen by confirming that the amount of luciferase expressed by feverish firefly luciferase plasmid is reduced compared to cells that did not process siRNA.
  • the amount of firefly luciferase expressed after transfection of a firefly luciferase vector with a siRNA in HeLa and A 54 9 cells (ATCC) was determined using a luciferase assay (see FIG. luciferase assay).
  • a luciferase assay see FIG. luciferase assay.
  • HeLa and A549 cell lines were prepared in 6 * 10 ⁇ 4 cells / well in a 24 well plate.
  • Firefly luciferase measurements are based on renilla luciferase. After correcting transfection efficiency with measurements, the corrected luciferase levels of the control group transfected only with the firefly luciferase vector and the Renilla luciferase vector, which cloned the complementary sequence of each strand without siRNA (100). The percentage values for%) were calculated and shown in Table 14 below. In Table 14, modO represents siRNA without chemical structural modification, and ⁇ 10 ⁇ 11-6 are as described in Table 4.
  • siRNA (modO) itself without chemical structural modification had no effect other than the target by the sense strand.
  • siRNA 20 showed an off-target effect by the sense strand through the decrease of the activity of the firefly luciferase having a sequence complementary to the sense strand, but especially when modified with chemical spheres, the sense strand in mod 2 and 5 The effect of was significantly reduced. In other words, it was confirmed that the effect of the sense strand is reduced while the effect of the antisense is maintained.

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Abstract

c-Met 전사체 (mRNA transcript) 염기서열에 상보적으로 결합하여 세포 내에서 c-Met의 발현을 억제함과 동시에 면역반응을 유발하지 않는(optionally) 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA) 및 상기 siRNA의 암의 예방 및/또는 치료에 있어서의 용도가 제공된다. 상기 c-Met을 암호화하는 mRNA와 상보 결합할 수 있는 siRNA는 리보핵산 매개 간섭현상 (RNA interference, RNAi)에 의해 거의 모든 암세포에 공통적으로 과발현되는 c-Met의 발현을 억제하여 암세포의 증식 및 전이를 저해 할 수 있으므로, 항암제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명 칭 ]
c-Met의 발현을 저해하는 siRNA 및 이를 포함하는 항암 조성물 【기술분야】
본 발명은 c-Met 전사체 (mRNA transcript) 염 기서 열에 상보적으로 결합하여 세포내에서 C-Met의 발현을 억제함과 동시 에 면역 반응을 유발하지 않는 작은 간섭 리보핵산 (small interfering RNA, siRNA) 및 상기 siRNA의 암의 예방 및 /또는 치료에 있어서의 용도에 관한 것 이다.
【배경기술】
c-Met는 HGF (hepatocyte growth factor)의 수용체이 기 때문에 HGFR라고도 명 명되며， 1984년 화학적 암유발제 (carcinogene)을 처 리 한 사람의 골육종에서 처음으로 발견된 후, 1986년 tpr(translocated promoter region)과의 유전적 결합 (genetic fosion) 현상으로 잠재적 암유발유전자 (proto-oncogene)임 이 밝혀졌다 (Cooper et al., Nature, 311, 29-33, 1984; Dean et al., Mol cell Biol., 7, 921-924, 1987； Park et al., Cell, 45， 895-904, 1986).
세포막단백질로서 수용체 티로신 키나제 (receptor tyrosine kinase, RTK)의 일종인 c-Met 수용체가 간엽간세포 (mesenchymal cell)에서 생산된 간세포 성장인자 혹은 분산인자 (hepatocyte growth factor/scatter factor)라 불리는 리간드와 결합하면 정상세포에서는 세포의 성장 및 분화를 유발하고 을바른 개체 발생 및 상처 치유, 신생혈관 형성 에 관여하며 , 암세포의 경우에 는 암세포의 증식 , 전이 등을 촉진시 킨다 (Nakamura et al., J Clin Invest., 106， 1511-9,2000; Comoglio et al., Semin Cancer Biol, 1 1, 153-65, 2001 ; Boccaccio, Nat Rev Cancer, 6, 637-45, 2006; Huh CF et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101 , 4477-82 2004).
HGF/c-Met의 비정상적 인 신호전달은 대부분 HGF 혹은 c-Met이 과발현되거나 돌연변이가 일어나 활성 이 증가된 결과이 며 , 여 러 암환자의 좋지 않은 예후와 밀접 하게 관련되어 있다고 알려져 있다. 이처럼, c-Met 단백질의 활성과 암 발생과 전이 사이에 밀접한 상호관계가 밝혀지고 다른 수용체 tyrosine kinase 저해제들의 임상적 성공에 힘 입어, c-Met을 타겟으로 한 항암제 개발연구가 활발히 진행되고 있으나, 현재 임상 단계에 진입한 후보물질들은 c-Met 수용체에 길항하는 항체 또는 c-Met 신호전달을 저해하는 티로신 키나제 억제제와 같은 단백질들의 3차 구조를 기반으로 설계된 화학적 합성 억제제가 대부분이다. 저분자 키나제 저해제는 광범위 키나제 저해제에 비해 c-Met에 대한 선택성이 향상되었지만 여전히 약물이 c-Met 이외의 유사한 단백질의 활성을 저해함으로 인한 부작용의 우려가 있고, 항체 약물은 비교적 선택성이 우수하지만 복잡한 제조공정으로 안한 생산의 어려움과 보관상의 안정성 문제를 가지고 있다. 따라서, c-Met의 기능을 효과적으로 저해하는 약물 개발 필요성이 끊임없아 요구되어 왔다.
한편， 최근 리보핵산 매개 간섭현상이, 기존의 방법으로는 의약적으로 불가능 (non-druggable)한 타겟에 대해서도. 정밀한 유전자 선택성을 보이는 선도물질을 신속히 도출함에 따라 합성 의약 개발 시 발생되는 제한된 타겟 및 비선택성에 대한 해결책을 제시하고 화학합성 의약품의 한계를 극복할 수 있는 기술로 여겨지면서 기존의 방식으로는 치료가 어려운 각종 질병, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, siRNA(small interfering RNA)가 초기 면역반웅을 유도하며, 예상했던 것보다 비특이적인 RNAi효과를 빈번하게 유도한다는 것을 발견하게 되었다.
포유 동물 세포에서 길이가 긴 이중가닥의 siRNA는 유해한 언터페론 반응을 유도할 수 있고, 길이가 짧은 이중가닥 siRNA 역시 인체나 세포에 유해한 초기 인터페론 면역 반응을 일으키는 것으로 보고되고 있으며， 예상했던 것보다 높은 비특이적인 RNAi효과를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Kleirman et al. Nature, 452:591-7, 2008).
한편, 암의 진행에 중요한 역할을 하는 c-Met을 타겟으로 한 siRNA 항암제 개발이 시도되고 있으나 현재까지 그 성과는 미미한 수준이다. siRNA의 개별 시뭔스의 유전자 억제 효능에 대해 제시된 바 없고， 특히 면역활성에 대한 고려가 전혀 되어 있지 않은 실정이다.
이처럼, 기존의 방법으로는 의약화가 불가능한 타겟을 포함한 모든 질환 타겟 유전자의 발현을 저해할 수 있는 siRNA 약물은 높은 활성과 뛰어난 타켓 선택성 등의 장점으로 새로운 치료제로서의 무한한 가능성을 보여주고 있지만, 치료제 개발이 성공하기 위해서는 혈액 중의 낮은 안정성, 제한적 약물 분포, 타겟 이외의 효과 (off-target effect), 면역반응 유발의 문제점을 해결하는 것이 필요하다.
최근 이러한 약점올 개선하고 임상 적용을 가능토록 하기 위해 siRNA에 화학적 변형을 도입하는 연구가 진행되고 있기도 하다 (Davidson, Nat. Biotechnol, 24:951-952,2006; Sioud and Furset, J. Biomed. Biotechnol., 2006:23429,2006).
【발명의 상세한 설명】
[기술적 과제】
. 이에, 본 발명자들은 본 발명의 서열 특이성이 높아 표적 휴전자의 전사체에 특이적으로 결합하여 RNAi 효율성을 증가시키며, 면역 독성을 유발하지 않는 siRNA를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일례는 c-Met 전사체' 염기서열에 상보적으로 결합하여 c-Met의 합성 및 /또는 발현을 특이적으로 저해하는 , siRNA를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA를 발현하는 발현 백터를 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 유효성분으로 포함하는 c-Met의 합성 및 /또는 발현 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
■ 또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 c-Met을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, Met의 합성 및 /또는 발현을 억제하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터의 c-Met을 발현하는 세포에서 의 C-Met의 합성 및 /또는 발현 억제를 위 한 용도를 제공한다.
. 또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 준비하는 단계 ; 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 c-Met을 발현하는 암세포에 접촉시 키는 단계를 포함하는, 암ᅳ세포의 성장을 억 제하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터의 c-Met을 발현하는 암세포에서의 암세포의 성 장 억제를 위 한 용도휼 제공한다.
또 다른 예는 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 준비하는 단계 ; 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터를 치료적 유효량으로 투여하여 암을 예방 및 /또는 치료하는 방법 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 발현 백터의 암의 예방 및 /또는 치료를 위 한 용도를 제공한다. 【기술적 해결방법】
본 발명은 c-Met 전사체 염 기서 열에 상보적으로 결합하여 세포 내에 서 c-Met의 합성 및 /또는 발현을 억제하는 siRN'A, 이를 포함하는 의 약 조성 물， 및 이의 용도를 제공하는 것 이다.
일 실시 예에서 , 본 발명은 c-Met의 합성 및 /또는 발현을 특이 적으로 저해하는 siRNA를 제공한다. 또 다른 예에서， 본 발명은 상기 c-Met의 합성 및 /또는 발현을 특이 적으로 저해하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 c-Met 합성 및 /또는 발현 억 제용 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서 , 본 발명은 상기 c-Met의 합성 및 /또는 발현을 특이 적으로 저해하는 siRNA를 유 효성분으로 포함하는 암세포 성장 저해제 또는 암의 예방 및 /또는 치료용 약 학적 조성물 (항암 조성물)을 제공한다.
본 발명은 사람을 포함하는 포유 동물의 c-Met mRNA, 이의 선택적 스플라이싱 형 태 (alternative splice form), 돌연변이 형 태, 또는 같은 계통의 c-Met 유전자의 발현을 저해하는 기술과 관련된 것 이며， 이는 본 발명에서 제공되는 siRNA의 특정 용량을 환자에 게 투여 했을 때 타겟 mRNA가 감소함 으로써 성취 되는 것 일 수 있다. . 이하, 이를 보다 상세히 설명한다.
' 상기 c-Met는 포유동물 유래, 바람직하게는 사람 또는 사람과 동일한 계통의 c-Met 및 그의 돌연변이체일 수 있다. 사람과 같은 계통이라 함은 유 전자 또는 mRNA가 사람의 c-Met 유전자 또는 이로부터 유래하는 mRNA와 80% 이상의 서열 유사성을 가진 다른 포유동물을 말하는 것으로， 구체적으 로, 사람， 영장류, 설치류 등을 포함할 수 있다ᅳ
본 발명의 솰실시예에서, c-Met을 코딩하는 mRNA에 해당하는 센스 가닥의 cDNA서열은 서열번호 1 일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA는 상기 c-Met의 mRNA 또는 cDNA 내부의 연속하는 15 내지 25 bp, 바람직하게는 18 내지 22 bp로 이루어진 영역, 바람작하게는 서열번호 2 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열에 해당되는 mRNA 또는 cDNA 영역을 표적으로 하는 것일 수 있다ᅳ 상기 바람직한 cDNA 상의 표적 영역을 아래의 표 1에 정리하였다. 따라서, 본 발명의 일실사예에서, 서열번호 1의 c-Met cDNA 영역 중 서열번호 2 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열에 해당되는 mRNA 또는 cDNA 영역을 표적으로 하는 . siRNA을 제공한다. 구체적으로, 서열번호 3, 18 및 21로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 해당되는 mRNA 영역을 표적으로 하는 siRNA을 제공한다.
[표 1] c-MetcDNA (서열번호 1) 상의 표적 영역 (20개)
Figure imgf000007_0001
12 CAGGTTGTGGTTTCTCGAT 1390
13 CTGGTTATCACTGGGAAGA 1507
14 TTGGTCCTGCCATGAATAA 1877
15 AGACAAGCATCTTCAGTTA 2195
16 TCGCTCTAATTCAGAGATA 2376
17 TCAGAGATAATCTGTTGTA 2386
18 GTGAGAATATACACTTACA 2645
19 GGTGTTGTCTCAATATCAA 2809
20 CATTTGGATAGGCTTGTAA 2935
21 CCAAAGGCATGAAATATCT 3566 본 명세서에서 사용된 '표적 mRNA'라 함은 사람의 c-MetmRNA, 사람 과 같은 계통의 c-Met mRNA, 이의 돌연변이체, 또는 선택적 스플라이싱 구 조체를 지칭한다. 구체적으로， NM_000245, Mus musculus: NM— 008591, Macaca mulatta: NM_001168629, NM 001127500: 염기서열 2262~2317가삭제된 스플라 이싱 형태, Y1230C/A3689G, D1228H/G3682C, V1092I/G3274A, M1268T/T3795C 등의 아미노산 또는 염기서열의 돌연변이체 등이 포함된다. 따라서, 본 발명 의 siRNA은 사람 또는 사람과 같은 계통의 c-Met mRNA나 이의 선택적 스플 라이싱 형태, 돌연변이 형태를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 'mRNA (또는 cDNA)영역을 표적으로 한다'고 함은 siRNA가 상기 mRNA (또는 cDNA) 영역 염기서열 중의 전부 또는 일부, 예 컨대 염기서열의 85-100%와 상보적인 염기서열을 가져서, 상기 mRNA (또는 cDNA) 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 '상보적'이라 함은 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥이 염 기쌍을 형성할 수 있음을 의미한다. 상보쩍 폴리뉴클레오타이드의 양 가닥 은 왓슨 -크릭 방식으로 염기쌍을 형성하여 이중가닥을 형성한다. 본 발명에 서 염기 U가 언급되는 경우, 별다른 언급이 없는 한 염기 T로 치환가능하다. 본 발명의 약학적 조성물의 c-Met 합성 및 /또는 발현 억제 효과와 암 치료 효과는 c-Met의 효과적인 합성 및 /또는 발현 억제에 의하여 성취되는 것이므로, 상기 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 siRNA는 상기 특정 mRNA 영역들 중 하나 이상을 표적으로 하는 15-30 bp의 이중가닥 siRNA일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 siRNA는 서열번호 22 내지 98의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 siRNA는 아래의 표 2에 나타낸 siRNA 1 내지 siRNA 40으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. .
[표 2]
Figure imgf000009_0001
46 UUGGUCCUGCCAUGAAUAAdTdT Sense
siRNA 13
47 UUAUUCAUGGCAGGACCAAdTdT Antisense
48 AGACAAGCAUCUUCAGUUAdTdT Sense
siRNA 14
49 UAACUGAAGAUGCUUGUCUdTdT Antisense
50 UCGCUCUAAUUCAGAGAUAdTdT Sense
siRNA 15
51 UAUCUCUGAAUUAGAGCGAdTdT Antisense
52 UCAGAGAUAAUCUGUUGUAdTdT Sense
siRNA 16
53 UACAACAGAUUAUCUCUGAdTdT Antisense
54 GUGAGAAUAUACACUUACAdTdT Sense
siRNA 17
55 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT Antisense
56 GGUGUUGUCUCAAUAUCAAdTdT Sense
siRNA 18
57 UUGAUAUUGAGACAACACCdTdT Antisense
58 CAUUUGGAUAGGCUUGUAAdTdT Sense
siRNA 19
59 UUACAAGCCUAUCCAAAUGdTdT Antisense
60 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdTdT Sense
siRNA 20
61 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT Antisense
2 가닥 62 CUAGCAAAGUCCGAGA Sense
siRNA 21 비 대칭 25 UCUCGGACUUUGCUAGUGCdTdT Antisense
siRNA 63 AGAAUAUACACUUACA Sense
siRNA 22
55 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT Antisense
(3 개 )
64 GAUUGCAUUCCUACAU Sense
siRNA 23
61 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT Antisense
화학적 변형 65 GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT *dT Sense siR A2 siRNA24 siRNA 66 UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT Antisense -modi
( 17 개 ) 67 GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT Sense siRNA2 siRNA25
68 UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT Antisense -mod2
69 GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT *dT Sense siRNA2 siR A26
70 UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT Antisense -mod3
71 GCACuAGCAAAGuCCGAGAdT*dT Sense siR A2 siR A27
72 UCuCGGACuUUGCuAGuGCdT*dT Antisense -mod4
73 GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT*dT Sense siRNA2 siRNA28
74 UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT Antisense -mod5
75 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT Sense siR A17 siR A29
76 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT Antisense -modi 77 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT Sense siRNA17 siRNA30
78 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT Antisense -mod2
79 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT Sense siR A17 siRNA31
80 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT Antisense -mod3
81 GuGAGAAuAuACACuuACAdT*dT Sense siRNA17 siRNA32
82 UGuAAGuGuAUAuuCuCACdT*dT Antisense -mod4
83 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT Sense siRNA17 siRNA33
84 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT Antisense -mod5
85 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT Sense siRNA17 siR A34
86 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT Antisense -mod6
87 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT Sense siRNA20 siR A35
88 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT Antisense -modi
89 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT Sense siRNA20 siRNA36
90 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT Antisense -mod2
91 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT Sense siR A20 siRNA37
92 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT Antisense -mod3
93 CCAAAGGCAuGAAAuAuCudT*dT Sense siR A20 siRNA38
94 AGAuAuuuCAUGCCuuuGGdT*dT Antisense -mod4
95 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT Sense siRNA20 siRNA39
96 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT Antisense -mod5
97 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT Sense siR A20 siRNA40
98 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT Antisense -mod6 상기 표 2에서 , 화학적 변형 siRNA (서 열번호 65 내지 98)의 화학적 변형 표기 법 및 화학적 구조 변형 에 관한 내용을 각각 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
[표 3]
Figure imgf000011_0001
[표 4]
Figure imgf000012_0001
. 상기 siRNA는 c-Met 전사체 (mRNA transcript) 염기서열의 특정 표적 영역에 대한 서열 특이성이 높아서, 표적 유전자의 전사체에 특이적으로 상 보적 껼합하여 RNA 간섭 효율성을증가되어 세포내에서 c-Met의 발현 및 /또 는 합성 억제 효율이 우수하다. 또한, 면역 유발 활성이 최소화된 것을 특 징으로 한다.
상기한 바와 같이 , 본 발명에서 제공하는 siRNA는 서열번호 1의 c-Met cDNA 영역 중 서열번호 2 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 1종 이 상의 영역에 대한 mRNA를 표적으로 하는 siRNA, 바람직하게는 서열번호 22 내지 98의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 뉴클 레오타이드 서열을 포함하는 siRNA, 더 바람직하게는 서열번호 22 내지 98 로 이루어진 40종의 siRNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 siRNA는 리보핵산 서열 자체, 또는 이를 발현하는 재조합 백터 (발현 백터) 형태를 모두 포함하는 개념이다. 상기 발현 백터는ᅵ 플라즈미드 또는 아데노 -부속 바이러스 (adeno-associated virus), 레트로바이러스, 백시니아바이러 스, 암세포 용해성 바이러스 (oncolytic adenovirus) 등으로 이루어진 군에서 선 택되는 바이러스 백터일 수 있다. ~
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로서 siRNA와 약학 적으로 허용되는 담체를 포함하는 경우를 포함한다. 상기 약학적으로 허용 되는 담체는 이 분야에 통상적으로 사용되는 모든 담체를 포함하며, 예컨대， 물, 식염수， 인산 완충 식염수， 텍스트린, 글리세롤, 에탄을 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 siRNA또는 약학적 조성물의 투여 대상 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트)일 수 있으며， 특히 c-Met 의 발현과 관련되는 질병이나 증상을 가지거나， c-Met 발현 억제를 필요로 하 는 모두 포유 동물， 예컨대， 사람일 수 밌다.
c-Met억제에 유효한 효과를 얻으면서 면역 반웅 등의 바람직하지 않 은 부반웅을 최소화하기 위하여, 조성물 내의 siRNA의 농도， 또는 사용 또는 처리 농도는, θθΐ 내지 ΙΟΟΟηΜ, 바람직하게는 0.01 내지 ΙΟΟηΜ, 더욱 바람 직하게는 0.1 내지 10nM로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물에 의하여 치료 가능한 암은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암， 신장암, 갑성선암, 식도암, 전립선암 등의 고형암 및 골육종， 연부조직육종, 신경교종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이하 siRNA의 구조， 설계 과정 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 보 다 상세히 설명한다.
본 발명의 siRNA는 RNAi 기전에 의해 c-Met mRNA의 분해를 일으켜 c-Met 단백질의 발현을 유발하지 않거나 감소시키는 기능을 한다.
일실시예에서, siRNA는 RNA interference (RNAi) 경로를 유발하는 작은 저해 RNA 이중가닥 (small inhibitory RNA duplexes)을 의미한다. 구체적으로, siRNA는 센스 RNA 가닥과 그에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하며， 양 가 닥이 15-30bp, 구체적으로는 19-25bp 또는 27bp, 더 구체적으로는 19-21bp 를 포함하는 RNA 이중 가닥이다. siRNA는 이중가닥 영역을 포함하며 단일 가 닥이 헤어핀 (hairpin) 또는 stem-loop 구조를 형성하는 구조이거나, 2개의 분리 된 가닥의 이중가닥일 수 있다. 센스 RNA 가닥은 표적 유전자의 mRNA서 열의 뉴클레오타이드 서열과 동일한 서열을 가지며, 센스 가닥과 이에 상보 적인 안티센스 가닥이 서로 왓슨과 크릭의 상보적인 염기서열 결합에 의해 서 이중 가닥을 이루고 있다. siRNA의 안티센스 가닥은 RISC(RNA-Induced Silencing Complex)에 포집되어 RISC가 안티센스 가닥과 상보적인 목표 mRNA를 확인한 후 절단 또는 번역 (translational) 저해를 유도하게 한다. 일 실시예에서, 이중가닥 siRNA는 3' 말단, 5' 말단 또는 양쪽 말단에 1 내지 5 늉클레오타이드의 돌출부 (overhang)를 가질 수 있다. 또는, 양 말단이 평활 말단 (blunt end)으로 절단된 형태를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로는 US20020086356, 및 US7056704에 개시된 siRNA일 수 있다 (상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다).
본 발명의 일실시예에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포 함하며，센스 가닥과 안티센스 가닥이 15-30 bp의 이중가닥이고, 돌출부가 없 는 평활 말단 (blunt end)을 갖는 대칭 구조, 또는 적어도 하나， 예컨대 1-5개의 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지는 비대칭 구조일 수 있다. 돌출부 뉴클레오 타이드는 어떠한 서열이어도 상관이 없으나 dT(deoxythymidine, 디옥시티미 딘) 2개를 붙일 수 있다.
상기 안티센스 가닥은 생리학적 조건에서 서열번호 1의 mRNA의 표 적 영역에 흔성화한다. '생리학적 조건에서의 흔성화'라 함은 siRNA의 안티센 스 가닥이 z'« w에서 mRNA의 특정 표적 영역과 흔성화하는 것을 의미한다. 구체적으로, 상가 안티센스 가닥은 mRNA의 표적 영역, 바람직하게는 상기 표 1의 서열번호 2 내지 21의 염기서열과 85% 이상의 서열 상보성을 가질 수 있으며, 더 구체적으로 상기 안티센스 가닥은 서열번호 1의 염기서열 내 의 연속하는 15 내지 25 bp, 바람직하게는 18 내지 22 bp의 염기서열， 바람직 하게는 상기 표 1의 서열번호 2 내지 21의 염기서열에 완전 상보적인 서열 을 포함할 수 있다. 또한， 일실시예에서, siRNA는 한 가닥이 다른 가닥보다 짧은 비대칭적 인 이중가닥 구조일 수 있다. 구체적으로, 19~21 뉴클레오타이드 (nucleotide, nt) 의 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15~19nt의 센 스 가닥으로 구성되는 이중가닥 (double strand)의 siRNA 분자 (small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5' 방향의 말단이 평활 말단 (blunt end)이고 안티센스의 3' 말단에 1-5 뉴클레오타이드 돌출부 (overhang)를 갖는 비대칭 siRNA일 수 있다. 구체적으로 WO09/078685에 개시된 siRNA일 수 있다.
siRNA를 이용한 치료에서 가장 먼저 고려되어야 할 점은 표적화된 유전자의 염기서열에서 가장 큰 활성을 가지는 최적의 염기서열을 선정하는 것이 필요하다. 구체적으로, 일실시예에서， 전임상 시험과 임상 시험간의 관 련성을 높이기 위하여 종간 보존된 서열을 포함하는 c-MetsiRNA를 디자인하 는 것이 바람직하다. 또한, 일실시예에서, RISC에 결합하는 안티센스 가닥이 RISC와 결합력이 높도록 디자인하는 것이 바람직하다. 따라서, 센스 가닥과 안티센스 가닥의 열역학적 안정성에 차이가 나도록 디자인 되어 센스 가닥 은 RISC와 결합하지 않고 가이드 서열인 안티센스 가닥이 RISC와 결합력을 높이도록 한다. 구체적으로， 센스 가닥의 GC 서열이 60%가 넘지 않으며, 센스 가닥의 5' 말단에서부터 15번째 및 19번째 사이에는 아데닌 /구아닌 염 기가 3개 이상 있고 1~7번째 사이에는 G/C 염기가 많은 것일 수 있다ᅳ 또 한 반복 염기 서열로 인해 siRNA 자체,내부 염기 서열끼리 결합하여 mRNA 에 상보적으로 결합하는 능력을 떨어뜨릴 수 있으므로, 4개 이상의 반복 염 기 서열이 있도록 디자인하는 것은 피하는 것이 바람직하다. 또한, 19개 염 기로 이루어진 센스 서열의 경우, 표적 유전자의 mRNA에 결합하여 전사체 분해를 잘 일으키기 위해서는 센스가닥의 5' 말단에서부터 3번째, 10번째, 및 19번째 염기서열이 아데닌일 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에서, siRNA는 비특이적 결합 및 면역 유발 활성이 최소화된 것을 특징으로 한다. siRNA에 의한 인터페론 등의 면역반 웅 유도는 주로 항원을 제시하는 면역세포의 엔도솜 (endosome)에 존재하는
TLR7(Toll-like receptor-7)을 통해 일어나며， siRNA의 TLR7과의 결합 (binding)은 GU가 풍부한 서열과 같이 서열 특이적으로 일어나므로 TLR7에 의해 인지되 지 않는 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 5'-GUCCUUCAA-3'와 5'-UGUGU-3' 와 같은 면역유발 서열을 가지지 않으며, c-Met 이외의 다른 유 전자와의 상보성이 최소 70% 이하일 수 있다.
본 발명의 일실시예의 c-Met cDNA 표적 서열의 예는 상기 표 1에 기 재한 서열의 뉴클레오타이드를 포함한다. 표 1의 표적 서열을 기초로 siRNA의 길이를 표적 서열의 길이보다 더 길거나 짧게 디자인하거나, 상기 DNA 서열에 상보적인 뉴클레오타이드를 더하거나 빼고 siRNA 서열을 디자 인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포 함하며, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 15-30 bp의 이중가닥이고, 돌출부가 없 거나, 적어도 하나의 말단이 1-5 뉴클레오타이드의 돌출부를 가지며， 상기 안 티센스 가닥은 생리학적 조건에서 서열번호 2 내지 21， 바람직하게는 서열번 호 3, 18， 21에 대웅하는 mRNA 영역에 흔성화한다. 즉, 상기 안티센스 가닥 이 서열번호 2 내지 21, 바람직하게는 서열번호 3, 18, 21의 상보적인 서열을 포함한다. 즉, 본 발명의 c-Met siRNA 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 유 해한 인터페론 반웅을 유도하지 않으면서 c-Met 유전자의 발현을 저해시키는 특징을 가진다.
본 발명은 서열번호 3 (5'-GCACTAGCAAAGTCCGAGA-3'), 서열번호 18 (5'-GTGAGAATATAC ACTTACA-3 '), 및 서열번호 21
(5'-CCAAAGGCATGAAATATCT-3')로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서 열에 대응하는 mRNA 영역에 상보적으로 결합하여 세포 내에서 c-Met의 발 현을 억제한다.
본 발명에 구체예에 따른 c-Met siRNA는 상기 표 2에 기재한 바와 같 다.
일실시예에서, 상기 C-Met siRNA는 서열번호 24의 센스 서열 및 서열 번호 25의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 2, 서열번호 54의 센스 서열 및 서열번호 55의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 17, 서열번호 60의 센스 서 열 및 서열번호 61의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 20, 서열번호 62의 센 스 서열 및 서열번호 25의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 21, 서열번호 63 의 센스 서열 및 서열번호 55의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 22, 서열번 호 64의 센스 서열 및 서열번호 61의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA 23으 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
넉다운 (c-Met 발현 억제)은 정량 PCR(qPCR) 증폭, bDNA (branched
DNA) assay, 웨스턴 블롯, ELISA 등의 방법으로 mRNA 또는 단백질 수준의 변화를 측정하여 확인할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서， 리포좀 복합체 를 제조하여 종양 세포주에 처리한 다음 리보핵산 매개에 의한 발현 간섭현 상을 mRNA 단계에서 bDNA측정법을 사용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 siRNA서열은 c-Met의 합성 또는 발현을 효과적으로 저해 할 뿐만 아니라 면역 유발 활성이 낮다는 특징을 가진다.
본 발명의 일실시예에서， 면역독성은 사람의 말초혈액단핵세포
(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에 siRNA-DOTAP(N-[l-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylammonium
metylsulfate), 복합체 (complex)를 처리한 후 배양액 중에 유리된 사이토카인인 인터페론 알파 및 감마 (INF-a 및 INF-γ), 종양괴사인자 (Tumor necrosis factor-a: TNF-a), 인터류킨— 12(Interleukin-12, IL-12) 등의 증가 여부를 측정하여 확인할 수 있다.
상기 siRNA는 변형되지 않고 자연에 존재하는 리보핵산 단위구조를 가지고 있는 것이거나, 또는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조나 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형 (modification)된 것일 수 있다.
상기 화학적 변형을 통해, RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 예컨대 뉴클레아제 (nuclease)에 대한 저항성 증진, 세포내 흡수 (uptake) 증가, 세포 표 적화 향상， 안정성 증가, 인터페론 활성 감소， 면역 반웅 및 센스 (se e) 효과 와 같은 타겟 이외의 (off-target) 효과 감소 등, siRNA의 다양한 특성을 변형되 지 않은 siRNA 보다 향상시킬 수 있다.
siRNA의 화학적 변형 방법은 특별히 제한되지 않으며， 본 발명이 속 하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다 (Andreas Henschel, Frank Buchholzl and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a webbased tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):Wl 13-W120).
siRNA의 화학적 변형의 일례로, siRNA 센스 (sense) 및 안티센스
(antisense) 가닥의 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트 (boranophosphate) 결합으로 치환하는 방법이 있으며, 이를 통해 뉴클레아제 (nuclease)의 핵산 분해에 대한 저항성을ᅵ 높일 수 있다. 일례로, siRNA 센스 (sense)와 안티센스 (antisense) 양쪽 가닥의 3' -말단 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변경할 수 있다.
다른 일례로, siRNA 센스 (sense) 또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 3'말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid) 또는 LNA(Locked nucleic acid) 를 도입하는 방법이 있으며, 바람직하게는 siRNA 센스 (sense) 가닥의 5' 말단 에 도입한다. 이를 통해 RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 siRNA 안정성을 증가시키고 면역 반응 및 비특이적 억제 효과를 줄일 수 있다.
또 다른 일례로, 리보스 환 (ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH (히드록시 기)를 -NH2(아미노기), -C-allyl (알릴기)， -F (플루오로기), 또는 -O-Me (또는 CH3, 메틸기)로 치환하는 화학적 변형을 가할 수 있다. 예컨대, 센스 가닥의 1번 및 2번 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 2'-0-Me로 치환하거나, 안티센스 가닥 의 2번 핵산의 리보스 환에서 2'-OH를 2'-0-Me로 치환, 또는 구아닌 (G) 또는 유리딘 (U)을 포함하는 일부 뉴클레오타이드에서 리보스 환의 2'-OH를 2'-0-Me (메틸기) 또는 2'-F (플루오로기)로 치환할 수 있다ᅳ
상술한 화학적 변형 외에도 다양한 화학적 변형을 가할 수 있으며， 이러한 화학적 변형은 어느 한 가지 형태의 변형만 이루어질 수도 있고, 여 러 가지 화학적 변형이 함께 이루어질 수도 있다.
다만 상기 변형에 있어서, siRNA 이중 가닥구조를 안정화 시키.는 동 시에 유전자 발현 저해활성을 감소시키지 않도록， 바람직하게는 최소한의 변 형이 이루어지도록 하는 것이 좋다. 또한, siRNA에 콜레스테롤, 비오틴， 세포 침투 성 질을 가지는 펩타이 드 (cell penetrating peptide)와 같은 리간드 (ligand)를 센스가닥의 5' 또는 3'- 말단 에 붙이는 것도 가능하다.
본 발명 의 siRNA는 화학적 합성 , in vitro 전사 또는 다이서 (Dicer)나 기 타ᅳ 휴사한 활성을 가지는 뉴클리 에 이즈로 긴 이중 가닥 RNA를 절단하여 제 조할 수 있다. 또는, 상기 한 바와 같이 , siRNA를 플라즈미드나 바이 러스성 발현 백터 등을 통하여 발현시 켜 사용할 수 있다.
siRNA 특정 서 열이 인터페론을 유도하는지 여부를 수지상 세포를 포 함하는 사람의 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells: PBMC)에서 실험 적으로 확인한 후 면역 반응을 유발하지 않는 서 열을 선별하여 후보 siRNA 서 열로 선정할 -수 있다.
이하, 상기 siRNA의. 전달을 위 한 약물전달시스템 (DDS)을 설명 한다. siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 핵산 전달체 (nucleic acid delivery system) °1 활용될 수 있다.
. 세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위 한 핵산 전달체에는 바이 러스성 백터 , 비 바이 러스성 백터， 리포좀, 양이온성 고분자， 미 셀 (micelle), 에 멀젼, 지 질 나노입자 (solid lipid nanoparticles) 등이 있다. 바이 러스 백터 (viral vector)로 전달 효율이 높고 지속 시 간이 긴 이 점 이 있다. 상기 바이 러스 백터에는 레 트로바이 러스 백터 (retroviral vector), 아데노바이 러스 백터 (adenoviral vector), 백 시 니 아바이 러스 백터 , 아데노 부속 바이 러스. 백터 (adeno-associated viral vector), 암세포 용해성 바이 러스 백터 등이 포함된다. 비바이 러스 백터 (nonviral vector)는 플라즈미드를 포함할 수 있다. 그 외 에도 리포좀, 양이은성 고분자， 미 셀 (micelle), 에 멀견, 지 질 나노입자 (solid lipid nanoparticles) 등의 다양한 제형 이 사용될 수 있다. 핵산 전달을 위 한 양이온성 고분자에는 키토산， 아텔로 콜라겐 (atelocollagen), 양이온성 폴리 펩타이드 (catiomc polypeptide) 등과 같은 천연고분자와 poly(L-lysin), 선형 또는 분지 형 PEI(polyethylene imine), 사이클 로덱스트린계열 다가양이온 (cyclodextrin-based polycation), 덴드리 머 (dendrimer) 등과 같은 합성고분자가 포함된다.
본 발명의 siRNA 또는 siRNA와 핵산 전달체와의 복합체 (약학적 조성 물)는 암의 치료를 위해 in vivo 또는 ex vivo 상에서 세포.내로 도입될 수 있 다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 siRNA 또는 siRNA와 핵산 전달체와의 복합체를 세포 내에 도입하게 되면 표작 단백질인 , c-Met의 발현을 선택적으로 감소시키거나 표적 유전자에 생긴 변이를 수정하 는 역할을 하여 암의 생성에 관여하는 c-Met의 발현이 억제되어 암세포가사 멸하고 암의 치료가 가능하게 된다.
본 발명의 siRNA또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 국소, 경구 또 . 는 비경구적 등으로 투여하기 위해서 제제화할 수 있다. 구체적으로, siRNA 의 투여는 눈의 점막, 질， 또는 항문 내 투여 포함을 하는 국소 투여, 또는 폐, 기관지, 비강, 외피， 내피 투여, 정맥, 동맥, 피하, 복강, 근육, 두개 (뇌경 막 또는 뇌실) 등의 비경구 투여, 또는 경구 투여 등의 경로를 통할 수 있다. 국소 투여를 위하여， siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 패치와 연 고, 로션, 크림, 젤, 적제, 좌약, 스프레이， 용액， 파우더 등의 형태로 제제화 될 수 있다. 비경구적 투여， 뇌경막 혹은 뇌실 내 투여를 위하여, siRNA 또 는 이를 포함하는 약학적 조성물은 버퍼, 희석제, 투과 촉진제, 기타 통상적 으로 약제학적으로 사용 가능한 전달체 혹은 부형제와 같은 적절한 첨가제 을 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
또한， 본 발명의 siRNA .또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 siRNA 를 주사용 조성물과 흔합하여 종양이 발생한 부위에 주사형태로 투여하거나, 겔 조성물 또는 경피흡수용 점착 조성물과 흔합하여, 직접 환부에 바르거나 붙여서 경괴 경로로 투여할 수 있도록 구현함이 바람직하다. 상기 주사용 조성물은 특별한 제한은 없지만 등장성 수용액 또는 현탁액 형태인 것이 바 람직하고, 멸균처리, 및 /또는 보조제 (예를 들면, 방부제, 만정화제， 습윤제 또 는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완층제 및 /또는 리포좀 제 게)를 함유할 수 있다. 상기 겔 조성물은 카르복시메틸 샐를로오즈, 메틸 샐 를로오즈, 아크릴산 중합체, 카르보폴 (carbopol) 등의 통상적인 겔 제제와 약 학적으로 허용되는 담체 및 /또는 리포좀 제제를 함유하며, 상기 경피흡수용 점착 조성물은 유효성분층이 점착제층, 피지흡수를 위한 흡착층 및 치료약물
■층을 포함하고, 치료약물층은 약학적으로 허용되는 담체 및 /또는 리포좀 제 제를 함유하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아나다.
또한, 본 발명의 siRNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 c-Met siRNA와 함께 항암 화학요법제를. 추가로 포함하거나, 또는 성 장인자, 성장 인자 수용체, 하위 신호전달 단백질, 바이 러스성 종양유발인자, 및 항암제 내 성 . 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것의 발현을 저해하는 siRNA를 추 가로 포함할 수 있다.
이와 같이 , c-Met siRNA와 함께 화학요법을 병용하여 화학요법 제에 대 한 민감도를 높임으로써 치료효과를 극대화하고 부작용을 감소시 킬 수 있을 뿐 아니라, 각종 성 장인자 (예컨대 VEGF, EGF, PDGF 등), 성 장 인자 수용체 및 하위 신호전달 단백질, 바이 러스성 종양유발인자, 항암제 내성 유전자의 발현을 저해하는 siRNA와 병용하여 암의 여 러 경로를 동시에 차단함으로 항 암효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명 의 c-Met의 발현을 억 제하는 siRNA와 병용투여가 가능한 항 암 화학요법 제는 예를 들어 , 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 이 다루비신 (idarubicin), 미토산트론 (mitoxantrone), 발루비신 (valubicin), 커큐민 (curcumin), 제피티 닙 (gefitinib), 에를 로티 닙 (erlotinib), 이 리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 도세탁셀 (docetaxel), 파클리탁셀 (paclitaxel) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명 의 또 다른 예는 c-Met의 합성 및 /또는 발현 억제를 위 한 유 효량의 상기 c— Met siRNA를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA를 c-Met을 발현하 는 세포에 접촉시 키는 단계를 포함하는, c-Met 발현 및 /또는 합성을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 c-Met의 합성 및 /또는 발현 억제를 위 한 유효량의 상기 c-Met siRNA를 준비하는 단계; 및 상기 siRNA를 c-Met을 발현하는 암세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포의 성장을 억 제하는 방법을 제공한다. 또 다른 예는 상기 c-Met siRNA를 준비하는 단계 ; 및 상기 siRNA를 치료학적 유효량으로 환자에 게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 및 /또 는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암을 예방 및 /또는 치료하는 방법은， 바람직하게는 상기 투여 단 계 이전에 상기 siRNA의 투여 대상인 암의 예방 및 /또는 치료가 요구되는 환자를 특정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서 치료 가능한 암은 대부분의 고형암 (폐암, 간암, 대 장암, 췌장암， 위암, 유방암, 난소암， 신장암, 갑성선암， 식도암, 전립선암), 골 육종, 연부조직육종, 신경교종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 환자는 포유 동물, 바람직하게는 사람, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트 등) 등일 수 있으며, 특히 c-Met의 발현과 관련되는 질병이나 증상 (예 컨대， 암)을 가지거나, c-Met 발현 억제를 필요로 하는 모두 포유 동물, 예컨 대, 사람일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA의 유효량은 c-Met 발현 또는 합성 억제 또는 이로 인한 암세포 성장 저해 및 암 치료 효과를 얻기 위하여 투여에 요구되 는 양을 의미한다. 따라서 , 질환의 종류, 증상의 정도, 투여되는 siRNA의 종 류, 제형의 종류， 환자의 연령, 체중， 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시 간, 투여 경로 및 치료 기간, 동시 사용되는 화학 항암제 등의 약물을 비롯 한 다양한 인자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 예컨대， 1일 투여 용량은 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg인 것이 좋고, 상기 용량은 한 번에 모두 투여되거나 수회에 걸쳐서 분량하여 투여될 수 있다.
본 발명의 c-Met 전사체 (mRNA)의 염기서열에 상보적인 siRNA 또는 이의 화학적 변형된 구조는 리보핵산 매개 간섭현상 (RNA-mediated interference, RNAi)에 의해 암세포에 공통적으로 발현되는 c-Met의 발현을 억 제하여 암세포를 사멸시키므로, 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 면역 반웅을 최소한으로 유발할 수 있는 장점이 있다.
기존의 대부분의 약물이 이미 발현된 단백질의 기능을 억제하는 데 반하여, 본 발명의 RNAi 기전은 특정 질병 유발 단백질의 발현을 선택적 및 높은 활성으로 저해할 수 있을 뿐 아니라, 단백질이 합성되기 전 단계인 mRNA를 분해하므로 부작용을 유발하지 않고 암의 성장과 전이를 억제하여 보다 근원적인 암 치료 기술이 될 것으로 기대한다.
또한, c-Met siRNA와 함께 화학요법과 병용하여 화학요법제에 대한 민감도를 높임으로써 치료효과를 극대화하고 부작용을 감소시킬 수 있을 뿐 아니라， 각종 성장인자 (VEGF, EGF, PDGF 등), 성장 인자 수용체 및 하위 신호전달 단백질， 바이러스성 종양유발인자, 항암제 내성 유전자의 발현을 저해하는 siRNA와 병용하여 암의 여러 경로를 동시에 차단함으로 항암효과를 극대화 할 수 있는 부가적인 이점이 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 la 내지 Id는 siRNA 처리에 따른 사이토카인 농도 변화를 보여주 는 것으로, la는 인터페론 알파, lb는 인터페론 감마， lc는 인터류킨 -12, Id는 종양괴사인자의 농도를 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 대표적으로 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다. 실시예 1. c-Met 발현 억제용 siRNA가 결합할 수 있는 타겟 염기서열의 디자인
siDesign Center (Dharmacon), BLOCK-iT™ RNAi Designer (Invitrogen), AsiDesigner (KRIBB), siDirect (University of Tokyo) 및 siRNA Target Finder (Ambion)의 siRNA 디자인 프로그램을 사용하여 c-Met mRNA 서열 (NM— 000245) 가운데 siRNA가 결합할 수 있는 표적 염기서열을 도출하였다.
[표 5] 표적 염기서열
Figure imgf000023_0001
3 GCACTAGCAAAGTCCGAGA
4 CAGCAAAGCCAATTTATCA
5 CTATGATGATCAACTCATT
6 CAATCATACTGCTGACATA
7 CTCTAGATGCTCAGACTTT
8 TCTGGATTGCATTCCTACA
9 CTGGATTGCATTCCTACAT
10 GCACAAAGCAAGCCAGATT
11 CTGCTTTAATAGGACACTT
12 CAGGTTGTGGTTTCTCGAT
13 CTGGTTATCACTGGGAAGA
14 TTGGTCCTGCCATGAATAA
15 AGACAAGCATCTTCAGTTA
16 TCGCTCTAATTCAGAGATA
17 TCAGAGATAATCTGTTGTA
18 GTGAGAATATACACTTACA
19 GGTGTTGTCTCAATATCAA
20 CATTTGGATAGGCTTGTAA
21 CCAAAGGCATGAAATATCT 실시 예 2. c-Met발현 억제용 siRNA의 제조
실시 예 1에서 디자인한 표적 염 기서 열에 결합할 수 있는 siRNA 23종을 삼¾리제 약 (한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다. 23종의 siRNA의 서 열은 표 6과 같이 양 가닥의 3' 말단에 dTdT를 포함하도록 하였다.
[표 6] c-Met 발현 억제용 siRNA의 염기서 열
Figure imgf000024_0001
CAAUCAUACUGCUGACAUAdTdT Sense
siRNA 5
UAUGUCAGCAGUAUGAUUGdTdT Antisense
CUCUAGAUGCUCAGACUUUdTdT Sense
siRNA 6
AAAGUCUGAGCAUCUAGAGdTdT Antisense
UCUGGAUUGCAUUCCUACAdTdT Sense
siRNA 7
UGUAGGAAUGCAAUCCAGAdTdT Antisense
CUGGAUUGCAUUCCUACAUdTdT Sense
siRNA 8
AUGUAGGAAUGCAAUCCAGdTdT Antisense
GCACAAAGCAAGCCAGAUUdTdT Sense
siRNA 9
AAUCUGGCUUGCUUUGUGCdTdT Antisense
CUGCUXJUAAUAGGACACUUdTdT Sense
siRNA 10
AAGUGUCCUAUUAAAGCAGdTdT Antisense
CAGGUUGUGGUUUCUCGAUdTdT Sense
siRNA 11
AUCGAGAAACCACAACCUGdTdT Antisense
CUGGUUAUCACUGGGAAGAdTdT Sense
siRNA 12
UCUUCCCAGUGAUAACCAGdTdT Antisense
UUGGUCCUGCCAUGAAUAAdTdT Sense
siRNA 13
UUAUUCAUGGCAGGACCAAdTdT Antisense
AGACAAGCAUCUUCAGUUAdTdT Sense
siRNA 14
UAACUGAAGAUGCUUGUCUdTdT Antisense
UCGCUCUAAUUCAGAGAUAdTdT Sense
siRNA 15 tJAUCUCUGAAUUAGAGCGAdTdT Antisense
UCAGAGAUAAUCUGUUGUAdTdT Sense
siRNA 16
UACAACAGA而 AUCUCUGAdTdT Antisense
GUGAGAAUAUACACUUACAdTdT Sense
siRNA 17
UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT Antisense
GGUGUUGUCUCAAUAUCAAdTdT Sense
siRNA 18
UUGAUAUUGAGACAACACCdTdT Antisense
CAUUUGGAUAGGCUUGUAAdTdT Sense
siRNA 19
UUACAAGCCUAUCCAAAUGdTdT Antisense
CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdTdT Sense
siRNA 20
AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT Antisense
CUAGCAAAGUCCGAGA Sense
siRNA 21
UCUCGGACUUUGCUAGUGCdTdT Antisense 63 AGAAUAUACACUUACA Sense
siRNA 22
55 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdTdT Antisense
64 GAUUGCAUUCCUACAU Sense
siRNA 23
61 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdTdT Antisense 실시 예 3: siRNA를 이용한 종양 세포주에서의 c-Met의 발현억제 시험 상기 실시 예 2에서 제조한 각각의 siRNA를 이용하여， 종양 세포주인 인간 폐암 세포주 (A549, ATCC)와 인간 간암 세포주 (SK-Hep-1, ATCC)를 형 질전환시 키 고, 형질전환된 종양 세포주에서 c-Met의 발현양상을 측정하였다. ·
' 실시 예 3-1. 종양 세포주의 배양
미합중국 종균협회 (American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암 세포주 (A549), 인간 간암 세포주 (SK-Hep-1)를 10% 우태아 혈청 , 페니실린 (100units/ml) 및 스트렙토마이신 (100ug/ml)을 포함한 RPMI 배양배지 (GIBCO/Invitrogen, USA)에서 37 °C , 5%(v/v) C02의 조건하에 배양하였다. 실시 예 3-2. c-Met 발현 억제용 siRNA와 리포좀의 복합체 제조 실시 예 2의 siRNA 1 내지 23의 23개 siRNA ΙΟηΜ을 각각 포함한 Opti-MEM 배지 (Gibco) 25ul와 웰 (well)당 0.4ul의 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 포함한 Opti-MEM 배지를 같은 부피로 흔합하여 상온에서 20분간 반웅시 켜 siRNA와 리포좀과의 복합체를 각각 제조하였다. 실시 예 3-3. c-Met 타겟 siRNA를 이용한 종양 세포주에서의 c-Met mRNA 발현 억제
상기 실시 예 3-1에서 배양한 폐암 세포주와 간암 세포주를 96웰 -플레이트에 각각 웰당 세포를 104 세포수 씩 분주 (seeding)하였다. 24시간 후에 배지를 제거하고 Opti-MEM 배지를 웰 (well)당 50μ1씩 첨가하였다. 상기 실시예 3-2에서 제조한 siRNA와 리포좀의 복합체 조성물 50μ1를 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기에 배양하였다.
c-Met mRNA 발현이 50% 저해되는 약물농도인 IC50 수치의 계산을 위해서 폐암 세포주 (A-549)에 각각의 siRNA를 0.0064nM 내지 ΙΟΟηΜ 사이의 7개의 농도 범위로 처리하였다. 실시예 3-4. c-Met mRNA의 정량분석 _폐암세포
siRNA 리포좀 복합체에 의해 발현 억제된 c-Met mRNA의 발현 정도는 Quantigene 2.0 system(Panomics 사)를 이용한 bDNA 측정법으로 측정하였다.
ΙΟηΜ의 siRNA 리포좀 복합체를 인간 폐암 세포주에 24시간 처리한 후, mRNA를 정량하였다. 제조사의 프로토콜 대로 96-웰 플레이트 한 웰 (well)당 ΙΟΟμΙ의 Lysis mixture(Panomics, Quantigene 2.0 bDNA kit)를 처리하여 50°C에서 1시간 동안 세포를 용해시켰다. Panomics사에서 c-Met의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 (Panomics, Cat.# SA-10157)를 구매하여, 얻어진 세포 샘플 중 80μ1와 함께 96웰 플레이트에 흔합하였다. mRNA가 웰에 고정되고 프로브와 결합할 수 있도록 55°C에서 16시간 내지 20시간 동안 반응을 시켰다. 이어 각 웰에 키트의 증폭 작용 시약 ΙΟΟμΙ를 넣고 55°C에서 반웅을 시키고 세척하는 과정을 두 단계 수행하였다. 세 번째 증폭 작용 시약 ΙΟΟμΙ를 넣고 50°C에서 반웅을 시킨 후 발광을 유도하는 시약을 ΙΟΟμΙ 넣고 5분 후에 형광 및 발광 측정기 (Bio-Tek, Synergy-HT)에 넣고 발광값을 측정하여 lipofectamine만 처리한 대조군의 발광값 (100%)에 대한 백분율 값을 산출하고 표 7에 나타내었다. 이 백분율은 대조군과 각 siRNA를 처리한 시험군에서의 c-Met mRNA의 발현율을 나타낸다.
표 7에서 보듯이， 20종 siRNA 가운데, c-Met 발현을 40% 이하로 억제시키는 siRNA가 16종, 40% 이상 70% 이하로 억게 효과를 보이는 siRNA가 1종, 70% 이상 억제 효과를 보이는 siRNA가 3종임을 확인하였다. [표 7] 인간 폐 암 세포주 (A549)에 10nM siRNA를 처 리 했을 때의 c-Met ηιΙ ΝΛ의 상대적 발현율
Figure imgf000028_0001
2, 17, 및 20번에 대해 A549 세포주를 사용하여 ΙΟΟηΜ에서 0.0064nM 범위로 c-Met mRNA 발현감소효과를 조사하여 IC50을 구하여 아래의 표 8에 나타내었다. IC50 수치는 Spectra Max 190 (ELISA 기 기) 모델에서 지원되는 SofrMax pro software를 이용하여 계산하였다. siRNA 2， 17 및 20의 IC50 수치를 siRNA 14 및 15와 비 교하였을 때， 5 내지 100배 가량 우수함을 알 수 있다.
[표 8] A549 세포주에서의 IC50(nM)
Figure imgf000028_0002
24， 25 2 3 0.29
54, 55 17 18 0.87
60, 61 20 21 0.75
48,49 14 15 4.35
50,51 15 16 29 실시예 3-5. c-Met mRNA의 정량분석—간암세포
서열번호 3， 18,21올 표적으로 하는， 대칭 구조의 siRNA2, 17, 및 20과 센스가닥이 안티센스 가닥보다 짧은 비대칭구조의 siRNA인 siRNA 21, 22, 23을 4nM 농도로 간암 세포주인 SK-Hep-1에 처리하고 c-Met mRNA 억제효능을 조사하여 아래의 표 9에 나타내었다. 실험 방법은 실시예 3-4에서와 같은 방식으로 하였다.
[표 9]
Figure imgf000029_0001
표 9에 나타난 바와 같이 , 서열번호 3, 18, 및 21을 표적으로 하는 경우， 비대칭 구조 siRNA에서도 대칭구조 siRNA와 유사한 정도로 c-Met 발현을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. . 실시예 4. siRNA에 의한세포 증식 억제 시험
siRNA 2, 14 및 15에 의한 세포 증식 억제 효과를 측정하였다. 인간 폐암 세포주 A549를 96웰 -플레이트에 웰 (well)당 2.5X103 세포수를 분주 (seeding)한 24시 간 후에 웰 (well)당 0.4μ1에 실시 예 3-2의 방법으로 제조한 siRNA 리포좀 복합체를 siRNA 농도별로 Opti-MEM 배지에서 실시 예 3-3의 방법과 같이 첨가하였다. 첨가한 후 24시 간째에 신선한 세포 배양 배지 200μ1로 교체해 주고 5일 동안 37 °C , 5% 이산화탄소가 유지되는 세포 배양기 에 유지시 켰다. 이후, TCA(Trichloroacetic acid)로 30분간 고정 (fixation)시 켜 SRB(Sulforhodamine B, Sigma)로 30분간 실온에서 염 색하였다. 10%(v/v) 아세트산으로 웰 (well)을 4~5회 세척 한 후에 자연 건조시 키며 하루를 둔 후에 10mM짜리 unbuffered tris 용액 (Sigma) 200μ1를 넣고 흡광도 측정 기 (Bio-Tek, Synergy-HT)를 사용하여 540nm에서의 흡광도를 측정하여 Lipofectamine만 처 리 한 대조군 (100%)의 흡광도에 대한 백분율 값을 산출하였다.
이 백분율은 대조군과 비교한 siRNA 2, 14, 15의 siRNA를 처 리 한 시험군에서의 세포 증식율을 의 미 한다. siRNA 처 리 농도별로 산정된 백분율 수치를 이용하여 IC50 값을 구하여 아래의 표 10에 나타내었다. 표 10에 나타낸 바와 같이 siRNA 2의 IC50치가 siRNA 14 및 15보다 20~50배의 낮은 수치를 보여 , siRNA 2의 세포증식 저해 효능이 20~50배의 월등히 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 , 본 발명의 siRNA 2는 c-Met mRNA 발현을 감소시 킬 뿐 아니라, c-Met 발현감소에 따른 암세포의 증식 억 제를 직 접 적으로 유발시켜 월등히 우수한 항암효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
[표 10] c-Met을 타겟으로 하는 siRNA의 세포 분열 억제 효과 (A549:
IC50(nM))
Figure imgf000030_0001
실시 예 5. siRNA에 의 면역 활성 사이토카인 유리 억제 효과 본 발명의 siRNA가 면역독성 이 있는지를 평가하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. 실시 예 5-1. 말초혈액단핵세포 준비
사람의 말초혈액단핵세포 (PBMC)는 시험 당일 건강한 지원자로부터 공급받은 혈액에서 히스토페 이크 1077 시 약 (Histopaque 1077)(Sigma, St Louis, MO, USA)을 사용하여 밀도기울기원심분리 법 (density gradient centriftigation)을 이용하여 분리하였다 (Boyum A. Seperation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest 21(Suppl97):77,1968). 혈액은 1 :1 비율로 서로 섞 이지 않도록 15ml 튜브에 분주된 히스토페 이크 1077(Histopaque 1077) 시 약 위에 조심스럽 게 넣었다. 400 X g, 상온에서 30분간 원심분리 한 후, 멸균 파이 펫으로 PBMC가 포함된 층만을 분리하였다. 분리 된 PBMC가 담긴 튜브에 10ml의 인산염 완층액 (Phosphate buffered saline: PBS)를 넣은 다음 250 X g에서 10분간 원심분리하고, 5ml의 PBS로 두 번 더 PBMC를 씻어 주었다. 분리 된 PBMC는 혈청 이 포함되지 않은 배지 인 X- vivo 15(Lonza, Walkersville, MD, USA)배지로 4 x 106 세포 /ml가 되도록 부유시 킨 다음 96-웰 플레이트에 웰 (well)당 lOOul씩 분주하였다. 실시 예 5-2. siRNA-DOTPA 복합체 제조
상기 실시 예 5-1에서 준비된 PBMC 세포에 분주하기 위 한 siRNA-DOTPA 복합체를 다음과 같은 방법으로 쎄조하였다. DOTAP 트랜스펙션 (transfection) 시약 (ROCHE, Germany) 5ul와 x-vivo I5배지 4^1 및 siRNA lul(50uM)과 x-vivo 15배지 49ul를 각각 흔합하여 제조한 다음 10분간 실온에서 반응시 켰다. 10분 후 DOTAP이 포함된 용액과 siRNA가 포함된 용액을 흔합한 후 20분간 20~25 °C에서 반응시 켰다. 실시 예 5-3. 세포의 배양
분주된 PBMC 배양액 lOOuL에 실시 예 5-2의 방법에 따라 제조된 siRNA 2， 14 및 15와 siRNA-DOTAP 복합체를 웰당 lOOul씩 첨가한 후 (siRNA 최종 농도 250nM), 37 °C의 C02 세포배양기 에서 18시 간 배양하였다. 대조군으로 siRNA-DOTAP 복합체를 처 리하지 않은 세포 배양군 및 siRNA를 포함하지 않은 채 DOTAP만이 처 리 된 세포 배양군을 사용하였으며 , 양성 대조군으로는 siRNA 대신 면역 반웅을 유발한다고 알려진 물질인 Poly I:C (Polyinosinic-polycytidylic acid postassium salt, Sigma, USA) 및 APOB-1 siRNA (sense GUC AUC ACA CUG AAU ACC AAU (서 열번호 99), antisense： *AUU GGU AUU CAG UGU GAU GAC AC (서 열번호 100), *: 5' phosphates, 삼천리 제 약)을 상기 실시 예 5-2와 동일한 방법으로 DOTAP과 복합체를 만들어 처 리 한 세포 배양군을 사용하였다. 배양 후 세포 상층액만을 분리하였다. 실시 예 5-4. 면역활성의 측정
상층액 내에 포함되 어 있는 인터페론 알파 및 감마 (INF-a, 및 INF- γ ), 종양괴사인자 (TNF-a), 인터류킨 -12(IL-12)의 함량은 Procarta Cytokine assay kit (Affimetrix, USA)를 사용하여 측정하였다. 즉, 각 cytokine에 대한 항체가 부착된 bead (antibody bead) 50ul를 필터 플레 이트 (filter plate)에 옮겨 세정 완층액 (wash buffer)으로 1회 세척 한 후 50ul의 PBMC 배양액의 상층액 및 cytokine 표준액을 분주하여 상온에서 60분간 500rpm에서 흔들면서 배양하였다.
이후， 세정 완층액으로 1회 세척하고, 키트내 포함된 검출용 (detection) 항체 25ul를 분주하여 500rpm에서 흔들면서 30분간 상온에서 반웅시 켰다. 다시 감압 하에 반웅액을 제거하고 세정 한 후 키트내 포함된 streptavidin-PE(streptavidin phycoerythrin) 50ul를 분주하여 500rpm에서 흔들면서 상온에서 30분간 반응시 킨 후 감압 하에 반웅액을 제거하고 3회 세정을 하는 단계를 거 쳤다. 120ul의 측정 완충액 (reading buffer)을 분주하여 500rpm에서 5분간 흔들어 준 후에 Luminex 기 기 (Bioplex luminex system, Biorad, USA)를 사용하여 각 cytokine bead별 PE 형광 정도를 측정하여 그 결과를 도 la-Id에 표시하였다. 시료중의 Cytokine 농도는 1.22~20,000 pg/ml 범위의 표준검 량곡선으로부터 계산하였다. 도 la-Id에서 'Medium'은 아무 것도 처리하지 않은 대조군, 'DOTAP'은 DOTAP 단독처리군, 'POLY I:C' 또는 'ΑΡΟΒ-Γ는 양성대조물질 처리군， ' siRNA 2'는 서열번호 24 및 25의 siRNA를 처리한 시험군， 'siRNA 14'는 서열번호 48 및 49의 siRNA 및 'siRNA 15'는 서열번호 50 및 51의 siRNA를 처리한 시험군을 나타낸다. 도 la-Id를 통해 PBMC에서 분비되는 사이토카인의 수준을 알 수 있는데， la는 인터페론 알파, lb는 인터페론 감마， lc는 인터류킨 -12， Id는 종양괴사인자를 나타낸 것이다.
siRNA 2는 . 대조군 및 DOTAP 단독 처리군에 비해 모든 사이토카인에서 매우 약한 수준의 증가만을 나타내었으며, 양성대조물질로 사용된 P()LY I:C 및 APOB-1에 의해 유도된 사이토카인의 증가량에 비하면 거의 미미한 수준의 증가이다. 또한 siRNA 14 및 siRNA 15과 비교하면 인터페론 알파와 인터페론 감마, 특히 인터페론 알파의 증가가 현저히 낮음을 알 수 있다. 따라서 siRNA 2는 사람의 PBMC에서 거의 면역활성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었다. 실시예 6. 화학적 변형된 c-Met발현 억제용 siRNA의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 siRNA 2, 17 및 20를， 상술한 표 4에 나타난 바와 같이 6가지 형태 (modl~6)로 화학적 구조가 변형되도록 디자인하고, 디자인한 화학적 변형 siRNA는 삼천리 제약 (한국)에 합성 의뢰하여 사용하였다. 화학적으로 변형된 17종의 siRNA를 하기 표 11에 나타냈으며, 화학적 변형의 표기법은 상술한 표 3과 같다.
[표 11]
Figure imgf000033_0001
71 GCACuAGCAAAGuCCGAGAdT*dT siRNA 2
siR A27
72 UCuCGGACuUUGCuAGuGCdT*dT -mod4
73 GCACUAGCAAAGUCCGAGAdT *dT siRNA 2
siRNA28
74 UCUCGGACUUUGCUAGUGCdT*dT -mod5
75 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT siRNA 17
si NA29
76 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT -modi
77 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT siRNA 17
si NA30
78 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT -mod2
79 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT siRNA 17
siRNA31
80 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT -mod3
81 GuGAGAAuAuACACuuACAdT*dT siRNA 17
siRNA32
82 UGuAAGuGuAUAuuCuCACdT*dT -mod4
. 83 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT siRNA 17
siRNA33
84 UGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT -mod5
85 GUGAGAAUAUACACUUACAdT*dT siRNA 17
siRNA34
86 lJGUAAGUGUAUAUUCUCACdT*dT -mod6
87 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT siRNA 20
siRNA35
88 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT -modi
89 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT siRNA 20
siRNA36
90 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT -mod2 '
91 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT siRNA 20 .
si NA37
92 AGAUAUUUCAUGCCUXJUGGdT*dT -mod3
93 CCAAAGGCAuGAAAuAuCudT*dT siRNA 20
siRNA38
94 AGAuAuuuCAUGCCuuuGGdT*dT -mod4
95 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT siRNA 20
si NA39
96 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT -mod5
97 CCAAAGGCAUGAAAUAUCUdT*dT siRNA 20
siRNA40
98 AGAUAUUUCAUGCCUUUGGdT*dT -mod6 실시 예 7. 화학적 변형 siRNA를 이용한 종양 세포주에서의 c-Met mRNA 발현 억제 시험
siRNA를 화학적 구조 변형을 시 켰을 때에도 종양 세포주에서 mRNA 억제 효능이 유지되는지를 확인하고자, 화학적 구조변형 하지 않은 상기 실시 예 2의 siRNA (siRNA 2, 17 및 20)와, 화학적 구조변형을 한 상기 실시 예 6의 siRNA 24 내지 40의 총 17개 siRNA를 사용한 것 외에는 상기 실시 예 3-2와 동일한 방법으로 리포좀 복합체를 제조하여 인간 폐암 세포주 (A549, ATCC)를 형 질전환 시 키고 (10nM siRNA), 형 질전환된 종양 세포주에서 oMet의 발현양상을 실시 예 3-4와 동일하게 정 량분석하고, 그 결과를 아래의 표 12에 나타내었다. 표 12에서 , modO은 화학적 구조 변형을 하지 않은 상태의 siRNA를 나타내며 , ND는 측정되지 않음을 나타낸다.
[표 12] 인간 폐암 세포주 (A549)에 화학적 구조변형 siRNA ΙΟηΜ을 처 리 했을 때의 c-Met mRNA 상대적 발현율 (%)
Figure imgf000035_0001
상기 표 12에서 보듯이 . siRNA 2, 17 및 20을 화학적 구조 변형을 시 켰을 때에도 종양 세포주에서 mRNA 억 제 효능이 유지됨을 알 수 있었다. 특히， mod2, mod3, mod5 그리고 mod6의 경우 화학적 구조 변형을 하지 않은 siRNA와 비교할 때 동등 또는 유사한 효능을 보였다. 실시 예 8. 화학적 변형 siRNA의 면역 활성 사이토카인 유리 억제 시험
화학적 구조 변형 에 의 한 siRNA의 면역독성 감소 ' 정도를 확안하기 위하여 siRNA 번호 2, 17 및 20번을 각각 modi - mod6까지 구조 변형시 킨 후 사람의 말초혈액단핵세포 (PBMC)에 처 리하여 유리되는 사이토카인을 정량하였다. 시험은 상기 실시예 5의 방법과 동일하게 실시하였고, PBMC에서 유리된 사이토카인 (인터페론 알파, 인터페론 감마, 인터류킨 -12, 종양괴사인자)의 배양액 중의 농도를 정량하여 아래 표 13에 나타내었다. 표 13 에서 'Medium'은 아무것도 처리하지 않은 대조군, 'DOTAP'은 DOTAP 단독처리군， 'POLY I:C 또는 'ΑΡΟΒ-Γ은 양성대조물질 처리군, 'siRNA2' 는 siRNA 2에 1110(10~5을 처리한 시험군, 'siRNA ' 은 siRNA 17에 1010~6을 처리한 시험군， 'siRNA20' 은 siRNA 20에 1^(10~6을 처리한 시험군을 나타낸다. modO은 화학적 구조 변형을 하지 않은 상태의 siRNA를 나타내며, modl~6은 표 4에서 설명한 바와 같다.
[표 13] PBMC에 화학적 구조변형 siRNA 250nM을 처리했을 때 유리된 세포 배양액 중의 사이토카인 농도 (pg/ml)
Figure imgf000036_0001
mod6 10.1 1.9 20.1 84.9 modO 597.7 16.6 37.5 136.3 modi 6.0 10.1 57.4 153.6 mod2 6.5 14.9 61.0 108.5 siRNA 20 mod3 8.7 8.3 60.5 1 15.6
mod4 6.5 10.1 53.8 87.0 mod5 23.9 13.4 73.1 161.6 mod6 21.4 1.9 27.9 103.9 상기 표 13에서 보듯이， siRNA 2의 경우 구조 변형 에 상관없이 대조군 및 DOTAP 단독처 리군에 비해 모든 사이토카인에서 변화가 없거나 매우 낮은 수준의 증가만을 나타내었다.
반면 siRNA 17 및 20의 경우, 화학적 구조변형 에 의해 인터페론 알파의 수준이 급격하게 감소됨을 확인할 수 있었다ᅳ 그 외 나머지 사이토카인들은 큰 변화가 없거나 매우 낮은 수준의 증가만을 나타내었다. 따라서 siRNA 17 및 20의 경우에서 화학적 구조변형을 함으로써 면역활성을 현저히 감소시 킬 수 있음을 확인 할 수 있었다. 실시 예 9. 화학적 변형 siRNA의 센스 (sense) 가닥에 의한 타겟 이외의 (off-target) 효과의 억제 시험
' 본 발명의 siRNA의 화학적 구조 변형을 통해 센스 가닥에 의 한 타겟 이외의 효과를 제거할 수 있는지를 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. 실시 예 9-1. 반딧불이 루시페라제 백터 (firefly luciferase vector) 준비 반딧불이 루시페라제를 발현하는 pMIR-REPORT(Ambion) 백터 에 각각의 siRNA에 대해, 안티 센스 가닥에 상보적 인 서 열 및 센스 가닥에 상보적 인 서 열을 각각 클로닝해 넣어 두 개의 다른 플라즈미드를 각각 준비하였다. 상기 상보적 인 서 열은 코스모진텍에 의뢰하여 양쪽 끝에 Spel과 Hindlll의 제한효소 자리 돌출 (overhang)을 가지도록 디자인하여 합성 한 후에 pMIR-REPORT 백터의 Spel과 Hindlll 제한효소 자리를 이용하여 클로닝 해 넣었다. 실시 예 9-2. siRNA의 화학적 구조변형을 통한 타겟 이외의 (off-target) 효과의 억제 측정
상기 실시 예 9-1에서 준비된, siRNA의 센스와 안티 센스 각 가닥의 상보적 인 서 열이 포함된 플라즈미드를 이용하여 siRNA의 안티 센스와 센스 가닥의 효능 정도를 측정하였다. 센스 가닥에 의 한 타겟 이외의 (off-target) 효과가 일어나는 정도는, 센스 가닥이 RISC 와 결합하여 센스 가닥과 상보적 인 염 기서 열을 가진 서 열에 작용할 경우에 , 센스 가닥의 상보적 인 서 열을 가진 반딧불이 루시페라제 플라즈미드에 의 해 발현되는 루시페라제 양이 siRNA를 처 리하지 않은 세포에 비 해서 감소함을 확인함으로써 알 수 있다. 또한 안티 센스의 상보적 인 서 열을 가진 반딧불이 루시페라제 플라즈미드를 처 리 한 세포에 대해서는 siRNA에 의 해서 나타나는 루시페라제의 감소 정도로 안티 센스에 의 한 siRNA의 효능이 화학적 구조변형을 한 후에 어느 정도 유지되는지를 확인할 수 있다.
구체적으로, 반딧불이 루시 페라제 백터 (firefly luciferase vector)를 siRNA와 함께 HeLa와 A549 세포 (ATCC) 내에 트랜스팩션 (transfection) 시 킨 후에 발현되는 반딧불이 루시페라제의 양을 루시페라제 어세이 (luciferase assay)로 측정하였다. 트랜스펙션 (transfection) 하루 전에 HeLa와 A549 세포주를 24well plate에 6*10Λ4 cells/well로 준비하였다. 상보적 인 염 기서 열이 클로닝 된 루시페라제 백터 (lOOng)를 siRNA (ΙΟηΜ)와 보정 백터 인 레닐라 루시페라제 (renilla luciferase)를 발현하는 pRL-SV40백터 (2ng, Promega)와 함께 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000)(Invitrogen)을 이용하여 Opti-MEM 배지 (Gibco)에서 트랜스펙션시 켰다. 세포들은 트랜스펙션 24시 간 후에 자연형 용해 버퍼 (Passive lysis buffer, Promega)를 이용하여 용해 (lysis)시 킨 후 듀얼 루시 페라제 어세이 키트 (Dual luciferase assay kit, Promega)로 루시페라제 활성 (luciferase activity)을 측정하였다.
반딧불이 루시페라제 측정치는 레닐라 루시페라제 (renilla luciferase) 측정치로 트랜스펙션 효율을 보정한 후, siRNA 없이 각 가닥의 상보적인 서열을 클로닝해 넣은 반딧불이 루시페라제 백터와 레닐라 루시페라제 백터만 트랜스펙션시킨 대조군의 보정된 루시페라제 수치 (100%)에 대한 백분율 값을 산출하여 하기 표 14에 나타냈다. 표 14에서 modO은 화학적 구조 변형을 하지 않은 상태의 siRNA를 나타내며, ^10<11~6은 표 4에서 설명한 바와 같다.
[표 14] siRNA의 화학적 구조변형을 통한 센스 가닥에 의한 타겟 이외의 (off-target) 효과 감소
Figure imgf000039_0001
상기 표 14에사보듯이， 사람의 폐암세포주 A549와 자궁경부암세포주
Hela 모두 siRNA 2의 경우 화학적 구조 변형을 하지 않은 siRNA(modO) 그 자체로도 센스 가닥에 의한 타겟 이외의 효과가 없었다. 그러나 siRNA 20은 센스가닥에 상보적인 서열을 가지는 반딧불이 루시페라제의 활성이 감소하는 것을 통해 센스 가닥에 의한 off-target 효과를 보였으나, 화학적 구¾변형 시킨 경우 특히, mod 2 및 5에서 센스 가닥의 효과가 확연히 감소하였다. 즉, 안티센스의 효과는 그대로 유지되면서 센스 가닥의 효과는 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

【청구의 범위】
1. 다음의 표 1-1에 기재된 c-Met cDNA 영역에서 선택된 어느 하나에 해당하는 mRNA 영역을 표적으로 하는 15-30 bp의 이중가닥 siRNA (small interfering RNA).
[표 1-1]
Figure imgf000040_0001
2. 제 1항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 3, 18 및 21로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열에 해당되는 mRNA 영역을 표적으로 하는 것인, siRNA.
3. 제 1항에 있어서, 상기 siRNA는 상기 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양 말단에 1-5 뉴클레오타이드로 이루어진 돌출부가 도입되는 것인, siRNA.
4. 게 2항에 있어서， 상기 siRNA는 다음의 표 6에 기재된 siRNA 1 내지 23으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인， siRNA.
[표 6]
Figure imgf000041_0001
Of
Figure imgf000042_0001
•13 VN"HiS ^-[a^^ 01 Y
Figure imgf000042_0002
( 09 ¾:t¾i>k
Figure imgf000042_0003
Figure imgf000042_0004
Figure imgf000042_0005
M7600/0T0ZaM/X3d SI 80/II0Z OAV 포함하는 siRNA22; 및
서열번호 64의 센스 서열 및 서열번호 61의 안티센스 서열을 포함하는 siRNA23
으로 이루어진 군에서 선택된 것인, siRNA.
6. 제 1항에 있어서, 상기 siRNA는 하나 이상의 리보핵산의 당 구조, 또는 염기 구조, 또는 상기 리보핵산 간의 결합 부위가 화학적으로 변형 (modification)된 것인， siRNA.
7. 제 6항에 있어서, 상기 화학적 변형 (modification)은
3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단의 포스포디에스테르 (phosphodiester) 결합을 보라노포스페이트 (boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 결합으로 변형하는 것인, siRNA.
8. 제 6항에 있어서, 상기 화학적 변형 (modification)은
3' 말단, 5' 말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid)를 도입하는 것인, siRNA.
9. 제 6항에 있어서, 상기 화학적 변형 (modification)은
리보스 환 (ribose ring)의 2'-위치에 있는 -OH (히드록시기)를 -NH2(아미노기)， -C-알릴기, -F (플루오로기), 및 -O-Me (메틸기)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 치환하는 것인， siRNA.
10. 게 6항에 있어서, 상기 화학적으로 변형된 siRNA는 다음의 표 11-1에 기재된 siRNA 24 내지 40으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, siRNA.
[표 11-1]
Figure imgf000043_0001
工 p*工 PD9n 339iW3nnnvnvDV . 86
( 腿 s ip*ipnDnvnvwonvooovwoD L6
xp*iPoonnnooonvDnnnvnvov 96
6εν腿 s xp*xpnDnvnvwonvDDDwvDD 56
IP*IPOD™nDDOnVDnnnVnvOV 6
8εν觀 s IP*工 pnonv WO O^VVVC):) £6
ip*iPDonnnoDonvDnnnvnvDv Z6
Δεν廳 s ip*ipnDnvnvwonv30ovwDD 16
ip*ipoDnnno3DnvDnnnvnvDv 06
9εν顯 s ip*ipnDnvnvwonvDDOwvDD 68
ip*iPODnnnDDonvonnnvnvov 88 V顯 s ip*ipnDnvnvwDnvDODvwDD Z.8
ip*iPDVDnDnnvavfiDnownon 98 腿 s xp*iPVDvnnDVDvnvnwovono 58
ιρ*ιροναπ3ηηνηνποποννηοη
εεν觀 s ip*ipvavnnDVDvnvnwovono £8
IP*IPDVDnonnvnvnOnOWnon ZS ζεν腿 s IP*IPV3Vnn3VDV nWDVDnD 18
ιρ*ιρονοηοηηνηνηοηοννηοη 08 ιεν腿 s ip*iPVDvnnDV3vnvnwovono 6L
ip*iPOVDnDfinvnvnonownon 2L οεν腿 s ip*ipvDvnnovDvnvnwovono LL
ιρ+ιρονοποηπνηνηοποννηοα 9L
63V腦 s ip*iPVDvnnDVDvnvnwovono 9L
ip*iPDon9vnDDfinnovooonDn
8 V觀 s IP*IPVDVODDnOWVOOVnDVDO £L
工 P*1P；〕 OnoVnDOnntOVDEO!Ofl ZL
IP*IPVOV9DDnOVWDOVnDVDD \L ip*iPDonovnoonnn.DvooDnDn . OL
93V簡 s IP*IPVDV00DnDWV3DVnDVDD 69
ip*iP3DnovnDonnnovooonDn 89
IP*lPVOVODDnOWVDDVnDVDO L9 xp*iPDonDvnDonnnovDDDnon 99
0M7600/0T0ZaM/X3d SI 80/II0Z OAV 상기 표 11-1에서， 화학적 변형의 표기법은 다음의 표 3에 기재된 바와 같다.
[표 3]
Figure imgf000045_0001
11. 게 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 포함하는 발현 백터.
12. 제 11항에 있어서, 상기 발현 백터는 플라즈미드, 아데노 -부속 바이러스 (adeno-associated virus) 백터, 레트로바이러스 백터， 백시니아바이러스 백터， 및 암세포 용해성 바이러스 (oncolytic adenovirus) 백터로 이루어진 군에서 선택된 것인, 발현 백터.
13. 게 1항 내지 제 10항 siRNA를 효성분으로 함유하는 항암 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 상기 siRNA를 핵산 전달체 (nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 포함하는, 항암 조성물.
15. 제 14항에 있어서, 상기 핵산 전달체는 바이러스성 백터, 비바이러스성 백터， 리포좀， 양이온성 고분자, 미셀 (micelle), 에멀견, 및 지질 나노입자 (solid lipid nanoparticles)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 항암 조성물.
16. 제 13항에 있어서, 항암 화학요법제， 또는
성장인자, 성장 인자 수용체, 하위 신호전달 단백질, 바이 러스성 종양유발인자, 및 항암제 내성 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 것의 발현을 저해하는 siRNA
를 추가로 포함하는, 항암 조성물.
17. 게 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 준비하는 단계 ; 및
상기 siRNA를 c-Met을 발현하는 세포와 접촉시 키는 단계를 포함하는, c-Met의 합성 및 /또는 발현을 억제하는 방법 .
18. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 준비하는 단계; 및
상기 siRNA를 c-Met을 발현하는 암세포에 접촉시 키는 단계를 포함하는,
암세포의 성장을 억제하는 방법 .
19. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 siRNA를 준비하는 단계 ; 및
상기 siRNA를 치료적 유효량으로 환자에 게 투여하는 단계를 포함하는,
암을 예방 및 /또는 치료하는 방법 .
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