TW201920669A

TW201920669A - ＨＮＦ４ａｓａＲＮＡ組成物和使用方法

Info

Publication number: TW201920669A
Application number: TW107131506A
Authority: TW
Inventors: 漢斯修伯; 大衛布萊基; 喬恩伍迪拉; 莫妮卡克拉姆波特; 馬庫斯霍斯巴赫
Original assignee: 英商美納治療公司
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2019-06-01
Also published as: EP3679138A1; US11162099B2; CA3075219A1; US20200255827A1; EP3679138B1; AU2018330495A1; US20200255826A1; US11965163B2; US20230031703A1; EP4233880A2; EP3679139B1; AU2018330494A1; US11447773B2; WO2019048631A1; EP3679139A1; EP4233880A3; EP4183882A1; US20220090074A1; WO2019048632A1; US20240035026A9

Abstract

本發明關於靶向肝細胞核因子4a(HNF4a)轉錄子之短激活RNA(saRNA)及包含該saRNA之治療性組成物。本發明亦提供該治療性組成物之使用方法。

Description

ＨＮＦ４ａ　ｓａＲＮＡ組成物和使用方法

本發明關於多核苷酸(具體地saRNA)、用於調控HNF4a和HNF4a途徑之組成物及於治療應用(諸如治療代謝性疾病、過度增殖性疾病和調節幹細胞譜系)中使用該組成物之方法。

肝細胞核因子4α(HNF4a，亦稱為NR2A1)為核受體超家族之成員。HNF4a已與肝細胞基因(特別是牽涉脂質代謝、葡萄糖代謝、分化和形態發生者)之轉錄調控密切相關。HNF4a調控數種基因之表現，包括肝細胞核因子1α，其為調節數種肝基因之表現的轉錄因子。與HNF4a相關之疾病包括單基因常染色體顯性遺傳非胰島素依賴型糖尿病第I型；年輕人成年發病型糖尿病(MODY)，第I型及范可尼氏腎小管症候群4(fanconi renotubular syndrome 4)及年輕人成年發病型糖尿病。HNF4a係由HNF4a基因編碼。以saRNA靶向調控HNF4a來用於治療目的是有需求的。

本發明提供可調控HNF4a基因表現及/或用於治療目的之功能，包括診斷和預後的短激活RNA(saRNA)分子之組成物、用於設計、製備、製造、調配及/或使用該短激活RNA(saRNA)分子之方法和套組。

本發明之各種實施態樣的細節闡述於下文中。本發明之其他特性、目的和優點將可從說明書和附圖，及發明申請專利範圍中顯明。

本專利案或申請檔案包含至少一張彩色圖案。具有彩色圖案之本專利案或專利申請刊物的副本將在要求並支付必要的費用時藉由Office提供。

本發明提供用於調控HNF4a基因表現及/或功能以用於治療目的之組成物、方法和套組。這些組成物、方法和套組包含靶向HNF4a轉錄子之核酸構建體。

HNF4a蛋白被稱為關鍵之核轉錄因子。調控HNF4a基因在用於治療目的方面具有很大的潛力。本發明藉由提供靶向HNF4a轉錄子之核酸構建體來滿足此需求，其中該核酸構建體可包括具有或不具有修飾之單股或雙股DNA或RNA。

如本發明所使用之HNF4a基因為包含編碼股和模板股之雙股DNA。其在本申請案中亦可稱為靶基因。

在本發明之背景下，術語“HNF4a轉錄子”、“HNF4a靶的轉錄子”或“靶的轉錄子”可為編碼HNF4a蛋白之HNF4a mRNA。HNF4a mRNA係從HNF4a基因之模板股轉錄且可能存在於粒線體中。

下文中，從HNF4a基因之編碼股轉錄之HNF4a基因的反義RNA稱為靶的反義RNA轉錄子。該靶的反義RNA轉錄子可為長的非編碼反義RNA轉錄子。

在本發明之背景下，術語“小激活RNA”、“短激活RNA”或“saRNA”係指上調特定基因之表現或對特定基因之表現具有正面效果的單股或雙股RNA。該saRNA可為具有14至30個核苷酸之單股RNA。該saRNA亦可為雙股RNA，每一條股包含14至30個核苷酸。該基因被稱為saRNA之靶基因。上調HNF4a之表現的saRNA基因被稱為“HNF4a-saRNA”且該HNF4a基因為HNF4a-saRNA之靶基因。

於一實施態樣中，靶向HNF4a靶的反義RNA轉錄子之HNF4a-saRNA上調HNF4a基因表現及/或功能。

在本發明之背景下，術語“靶的”或“靶向”係指對HNF4a基因具有效應。該效應可為直接或間接的。直接效應可由與HNF4a靶的反義RNA轉錄子完全或部分雜交引起。間接效應可能為上游或下游。

HNF4a-saRNA可能對生物學過程或活性具有下游效應。於該等實施態樣中，HNF4α-saRNA可能對第二非靶的轉錄子具有效應(上調或下調)。

在本發明之背景下，術語“基因表現”可包括從HNF4a基因生成HNF4a mRNA之轉錄步驟或從HNF4a mRNA生成HNF4a蛋白之轉譯步驟。HNF4a mRNA增加和HNF4a蛋白增加二者均指示HNF4a基因表現增加或正面效應。

基因之“上調”或“激活”意指基因表現濃度、或由基因編碼之多肽的濃度或其活性，或從基因之模板股轉錄之RNA轉錄子的濃度增加至高於無本發明之saRNA存在時所觀察到者。本發明之saRNA可能對該靶基因之表現具有直接或間接之上調效應。

I. 本發明之組成物

本發明之一態樣提供包含上調HNF4a基因之saRNA和至少一種醫藥上可接受之載體的醫藥組成物。該等saRNA在下文中稱為“HNF4a-saRNA”或“本發明之saRNA”，此二者在本申請案中可互換使用。

saRNA 設計

HNF4a-saRNA上調HNF4a基因。於一實施態樣中，其被設計成與HNF4a基因之靶的反義RNA轉錄子互補，且其可藉由下調該靶的反義RNA轉錄子對HNF4a基因表現及/或功能發揮其作用。

在本發明之背景下，術語“與...互補”意指能夠在嚴格條件下與該靶的反義RNA轉錄子雜交。

在本發明之背景下，當使用術語“有義”來描述核酸序列時，其係指該序列與基因之編碼股上的序列相一致。在本發明之背景下，當使用術語“反義”來描述核酸序列時，其係指該序列與基因之編碼股上的序列互補。

應理解的是，DNA之胸苷被RNA中之尿苷替代，而此種差異不會改變對術語“反義”或“互補性”之理解。

靶的反義RNA轉錄子可從編碼股上之基因座轉錄，該基因座係介於對應於該靶基因之轉錄起始位點(TSS)的位置上游多達100、80、60、40、20或10kb與對應於該靶基因之轉錄終止位點的位置下游多達100、80、60、40、20或10 kb之間。

於一實施態樣中，該靶的反義RNA轉錄子係從編碼股上位於該靶基因之轉錄起始位點的+/-1kb內之基因座轉錄。

於另一實施態樣中，該靶的反義RNA轉錄子係從編碼股上位於該靶基因之轉錄起始位點的+/-500、+/-250或+/-100內之基因座轉錄。

於另一實施態樣中，該靶的反義RNA轉錄子係從編碼股上位於該靶基因之轉錄起始位點的+/-2000個核苷酸內之基因座轉錄。

於另一實施態樣中，該在編碼股上之基因座距離對應於該靶基因之轉錄起始位點的上游或下游不超過1000個核苷酸。

於另一實施態樣中，該在編碼股上之基因座距離對應於該靶基因之轉錄起始位點的上游或下游不超過500個核苷酸。

本文所使用之術語“轉錄起始位點”(TSS)係指在基因之模板股上的核苷酸，其對應於或標記該轉錄起始位置。TSS可位於該基因之模板股上的啟動子區內。

本文所使用之術語“轉錄終止位點”係指在基因之模板股上的可為一或多個核苷酸之區域，其具有至少一種特性，諸如，但不限於編碼至少一個該靶的轉錄子之終止密碼子的區、編碼在該靶的轉錄子之3’UTR前面之序列的區、RNA聚合酶在該處釋出基因之區、編碼剪接位點之區或在剪接位點之前的區域及該靶的轉錄子終止轉錄之模板股上之區。

在本發明之靶的反義RNA轉錄子的背景下，短語“從特定之基因座轉錄”意指該靶的反義RNA轉錄子從該特定基因座開始轉錄。

靶的反義RNA轉錄子與該靶基因之基因組序列的編碼股互補，本文中對“基因組序列”之任何引用均為“基因組序列之編碼股”的簡寫。

基因之“編碼股”具有與所產生之mRNA相同的鹼基序列，除了在mRNA中T被U取代之外。因此，該基因之“模板股”與所產生之mRNA互補且反向平行。

因此，該靶的反義RNA轉錄子可包含與位於靶基因之轉錄起始位點上游100、80、60、40、20或10kb和靶基因之轉錄終止位點下游100、80、60、40、20或10kb之間的基因組序列互補的序列。

於一實施態樣中，該靶的反義RNA轉錄子包含與位於靶基因之轉錄起始位點上游1kb和靶基因之轉錄終止位點下游1kb之間的基因組序列互補的序列。

於另一實施態樣中，該靶的反義RNA轉錄子包含與位於該靶基因之轉錄起始位點上游500、250或100個核苷酸和靶基因之轉錄終止位點下游500、250或100個核苷酸之間的基因組序列互補的序列。

該靶的反義RNA轉錄子可包含與基因組序列互補之序列，該基因組序列包括HNF4a基因之編碼區。該靶的反義RNA轉錄子可包含與基因組序列互補之序列，該基因組序列與模板股上之靶基因的啟動子區域對齊。基因可擁有多個啟動子區，在此種情況下，該靶的反義RNA轉錄子可與一、二或更多個啟動子區對齊。加註釋之基因座的線上數據庫可用來鑑定基因之啟動子區域。當在核苷酸序列對之背景下使用時，術語“對齊(align和alignment)”係指該核苷酸序列對彼此互補或彼此具有序列同一性。

該靶的反義RNA轉錄子和該靶基因之啟動子區之間的對齊區可為部分的且長度上可與單一核苷酸一樣短，儘管其長度可能為至少15或至少20個核苷酸、或至少25個核苷酸長、或至少30、35、40、45或50個核苷酸長、或至少55、60、65、70或75個核苷酸長、或至少100個核苷酸長。下列各特定排列意圖被涵蓋在術語“對齊”之範圍內：

a) 該靶的反義RNA轉錄子和該靶基因之啟動子區的長度相一致且它們相對齊(即，它們的整個長度均對齊)。

b) 該靶的反義RNA轉錄子較該靶基因之啟動子區短且該靶的反義RNA轉錄子的全長與該靶基因之啟動子區對齊(即，該靶的反義RNA轉錄子之全長與該靶基因之啟動子區內的序列對齊)。

c) 該靶的反義RNA轉錄子較該靶基因之啟動子區長且該靶基因之啟動子區之全長與該靶的反義RNA轉錄子對齊(即，該靶基因之啟動子區的全長與該靶的反義RNA轉錄子內之序列對齊)。

d) 該靶的反義RNA轉錄子與該靶基因之啟動子區之長度相同或不同且該對齊區較該靶的反義RNA轉錄子之長度和該靶基因之啟動子區二者的長度短。

上述之“對齊(align和alignment)”的定義準用於其他重疊之描述，例如整個說明中之對齊的序列。很清楚地，若靶的反義RNA轉錄子被描述為與除了該啟動子區以外之靶基因區對齊，則該靶的反義RNA轉錄子之序列與該註明之區內的序列對齊，而非與該靶基因之啟動子區內的序列對齊。

於一實施態樣中，該靶的反義RNA轉錄子為至少1kb、或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10kb，例如20、25、30、35或40kb長。

於一實施態樣中，該靶的反義RNA轉錄子包含序列，該序列之全長與該靶基因之編碼股上的序列為至少75%、或至少85%、或至少90%、或至少95%互補。

本發明提供與該靶的反義RNA轉錄子內之區具有高度互補性之saRNA。saRNA與欲靶向之靶的反義RNA轉錄子內之區將具有不超過5個、或不超過4或3個、或不超過2個、或不超過1個、或無錯配。於一些實施態樣中，該saRNA下調該靶的反義RNA轉錄子。於一些實施態樣中，該saRNA不會下調該靶的反義RNA轉錄子。

參考第1圖，由於該靶的反義RNA轉錄子與該靶基因之模板股的區具有序列同一性，該靶的反義RNA轉錄子將與該靶基因之模板股內的區部分一致，因而允許引用該基因之模板股或靶的反義RNA轉錄子。該saRNA與該靶的反義RNA轉錄子雜交或結合之位置(因此，與模板股上之位置相同)被稱為“被靶向之序列”或“靶的位點”。不願被任何理論束縛，該機制可能如下：在AGO2之存在下，saRNA在靶的位點結合，導致RNA聚合酶II募集並產生由RNA誘導之轉錄激活(RITA)複合體，然後導致新mRNA轉錄(詳細描述於Li et al,Cell Research 26(3) 320-35 (2016)中，該參考資料之全部內容以引用方式併入本文)。在該saRNA機制中，下調該靶的反義RNA轉錄子並非必要。

該saRNA之反義股(無論是單股或雙股)可與該被靶向之序列的反向互補序列具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%之同一性。因此，該saRNA之反義股的反向互補序列與該被靶向之序列具有高度之序列同一性。該被靶向之序列可與saRNA及/或saRNA之反向互補序列具有相同的長度，即，相同數目之核苷酸。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列包含至少14個且少於30個核苷酸。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列具有19、20、21、22或23個核苷酸。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列之位置係位於該模板股之啟動子區域內。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於該模板股之TSS(轉錄起始位點)核心內。如本文所使用之“TSS核心”或“TSS核心序列”係指介於TSS(轉錄起始位點)上游2000個核苷酸與下游2000個核苷酸之間的區。因此，TSS核心包含4001個核苷酸且TSS係位於距離TSS核心序列之5’端的位置2001。

該HNF4a靶基因具有二個來自二個啟動子的轉錄起始位點：P1啟動子TSS係位於P2啟動子TSS下游之45455個核苷酸處。該P1啟動子TSS核心具有SEQ ID No.1之序列。該P2啟動子TSS核心具有SEQ ID No.2之序列。HNF4a TSS核心序列顯示於下表中：

於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於TSS之上游1000個核苷酸與下游1000個核苷酸之間。

於一些實施態樣中，該被靶向序列係位於TSS之上游500個核苷酸與下游500個核苷酸之間。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於TSS之上游250個核苷酸與下游250個核苷酸之間。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於TSS之上游100個核苷酸與下游100個核苷酸之間。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於TSS核心中之TSS上游。該被靶向之序列可在TSS上游少於2000、少於1000、少於500、少於250或少於100個核苷酸處。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於TSS核心中之TSS下游。該被靶向之序列可在TSS下游少於2000、少於1000、少於500、少於250或少於100個核苷酸處。

於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於TSS核心中之TSS周圍的+/-50個核苷酸處。於一些實施態樣中，該被靶向之序列基本上與TSS核心之TSS重疊。於一些實施態樣中，該被靶向之序列重疊在TSS核心之TSS開始或結束。於一些實施態樣中，該被靶向之序列在TSS核心之TSS的上游或下游方向與TSS重疊1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個核苷酸。

該被靶向之序列在模板股上之位置係由該被靶向之序列之5’端的位置定義。該被靶向之序列之5’端可位於TSS核心之任何位置且該被靶向之序列可在選自TSS核心之位置1至位置4001的任一位置開始。作為本文之參考，當該被靶向之序列之最5’端係從TSS核心之位置1到位置2000時，該被靶向之序列被認為是TSS之上游，而當該被靶向之序列之最5’端係從TSS核心之位置2002到位置4001時，該被靶向之序列被認為是TSS之下游。當該被靶向之序列之最5’端係在核苷酸2001處時，該被靶向之序列被認為是TSS中心序列且既不在TSS之上游亦不在其下游。

作為進一步參考，例如，當該被靶向序列之5’端係在TSS核心之位置1600，即，其為TSS核心之第1600個核苷酸時，該被靶向序列係從TSS核心之位置1600開始且被認為在TSS之上游。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可具有形成雙股的二條股，一條股為嚮導股。該saRNA雙股體亦稱為雙股saRNA。如本文所使用之雙股saRNA或saRNA雙股體為包括一股以上，較佳為二股之saRNA，其中股間雜交可形成雙股體結構之區。雙股saRNA的二條股被稱為反義股或嚮導股及有義股或隨從股。

該saRNA雙股體之反義股(可與反義股saRNA或反義saRNA互換使用)與該靶的反義RNA轉錄子內的區具有高度互補性。該反義股與該靶的反義RNA轉錄子或被靶向之序列內的區具有不超過5個、或不超過4或3個、或不超過2個、或不超過1個錯配、或無錯配。因此，該反義股與該模板股上之被靶向的序列具有高度互補性。該saRNA雙股體之有義股(可與有義股saRNA或有義saRNA互換使用)與模板股上之被靶向的序列具有高度之序列同一性。於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於該模板股之啟動子區域內。於一些實施態樣中，該被靶向之序列係位於該模板股之TSS核心內。

該saRNA雙股體之反義股及/或有義股相關於該被靶向序列之位置係藉由參考TSS核心序列定義。例如，當該被靶向之序列在TSS下游時，該反義saRNA和有義saRNA從TSS之下游開始。於另一實例中，當該被靶向之序列從TSS核心之200位置處開始時，該反義saRNA和有義saRNA從TSS上游開始。

該saRNA、靶基因、靶基因之編碼股、靶基因之模板股、靶的反義RNA轉錄子、靶的轉錄子、被靶向之序列/靶的位點和TSS之間的關係顯示於第1圖中。

在本發明之背景下，“股”係指核苷酸之連續序列，包括非天然存在或經修飾之核苷酸。二或更多股可為單獨之分子或各自形成單獨之分子的一部分，或其可，例如藉由連接子(諸如聚乙二醇連接子)共價連接。saRNA之至少一股可包含與靶的反義RNA互補之區。該等股被稱為saRNA雙股體之反義股或嚮導股。包含與saRNA之反義股互補的區之saRNA的第二股被稱為有義股或隨從股。

saRNA雙股體亦可從單一分子形成，該單一分子至少部分自我互補而形成髮夾結構，包括雙股體區。在此情況中，術語“股”係指與saRNA之另一內部區互補的saRNA之區的其中一者。saRNA之嚮導股與該靶的反義RNA轉錄子內之序列將具有不超過5個、或不超過4或3個、或不超過2個、或不超過1個錯配、或無錯配。

於一些實施態樣中，該saRNA之隨從股可包含至少一個不與該嚮導股上之對應核苷酸互補的核苷酸，稱為與該嚮導股錯配。與該嚮導股錯配可能會鼓勵該嚮導股優先裝載(Wu et al.,PLoS ONE , vol.6(12):e28580 (2011)，其全部內容以引用方式併入本文)。於一實施態樣中，該至少一個與嚮導股之錯配可位於隨從股之3’端。於一實施態樣中，該隨從股之3’端可包含1-5個與該嚮導股之錯配。於一實施態樣中，該隨從股之3’端可包含2-3個與該嚮導股之錯配。於一實施態樣中，該隨從股之3’端可包含6-10個與該嚮導股之錯配。

於一實施態樣中，該saRNA雙股體可顯示增殖細胞之效應。

saRNA雙股體與靶的反義RNA轉錄子之區可具有siRNA樣互補性；即，saRNA雙股體之嚮導股5’端的核苷酸2-6與反義RNA轉錄子的區之間具有100%互補性。此外，該saRNA之其他核苷酸可與該靶的反義RNA轉錄子之區具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%互補性。例如，saRNA之核苷酸7(從5’端開始計數)直至3’端可與該靶的反義RNA轉錄子之區域具有至少80%、90%、95%、98%、99%或100%互補性。

在本發明之背景下，術語“小干擾RNA”或“siRNA”係指參與RNA干擾(RNAi)途徑及干擾或抑制特定基因之表現的雙股RNA，其通常為20至25個核苷酸長。該基因為siRNA之靶基因。例如，干擾APOA1基因表現之siRNA被稱為“APOA1-siRNA”，而APOA1基因為該靶基因。siRNA通常約為21個核苷酸長，在該二條股的各端點具有3’突出端(例如2個核苷酸)。

siRNA藉由與靶基因結合並促進在特定序列之靶基因之一或多個RNA轉錄子裂解來抑制靶基因表現。通常，在RNAi中，該RNA轉錄子為mRNA，所以mRNA裂解導致基因表現下調。不欲受任何理論的束縛，本發明中，可能之機制之一為本發明之saRNA可藉由與該靶的反義RNA轉錄子結合來調控該靶基因表現。該靶的反義RNA轉錄子可能會或可能不會被裂解。

雙股saRNA可以包括一或多個單股核苷酸突出端。在雙股saRNA和siRNA之背景下，術語“突出端”或“尾端”係指至少有一個未經配對之核苷酸從saRNA或siRNA的雙股體結構突出。例如，當saRNA之一股的3’端延伸超過另一股的5’端時(或反之亦然)，其具有核苷酸突出端。saRNA可包含具有至少一個核苷酸之突出端；或者，該突出端可包含至少二個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少5個核苷酸或更多。核苷酸突出端可包含或由核苷酸/核苷類似物(包括脫氧核苷酸/核苷)所組成。該突出端可在有義股、反義股或彼等之任何組合上。此外，突出端之核苷酸可存在於saRNA之反義股或有義股的5’端、3’端或二端。當二個寡核苷酸經過設計以在雜交時形成一或多個單股突出端時，該等突出端在測定互補性時不應被視為錯配。例如，在本文所描述之目的方面，包含一長度為19個核苷酸的寡核苷酸及另一長度為21個核苷酸之寡核苷酸(其中該較長之寡核苷酸包含一具有19個核苷酸並與該較短之寡核苷酸完全互補之序列)的saRNA又可稱為“完全互補”。該突出端之核苷酸可為天然或非天然核苷酸。該突出端可為如本文所定義之經修飾的核苷酸。

於一實施態樣中，該雙股saRNA之反義股在3’端及/或5’端具有為1至10個核苷酸之突出端。於一實施態樣中，該雙股saRNA之反義股在其3’端具有為1至4個核苷酸之突出端，或者在其3’端具有為1至2個核苷酸之突出端。於一實施態樣中，該雙股saRNA之有義股在3’端及/或5’端具有為1至10個核苷酸之突出端。於一實施態樣中，該雙股saRNA之有義股在其3’端具有為1至4個核苷酸之突出端，或者在其3’端具有為1至2個核苷酸之突出端。於一實施態樣中，該雙股saRNA的有義股和反義股二者均具有3’突出端。該3’突出端可包含一或多個尿嘧啶，例如序列UU或UUU。於一實施態樣中，該突出端中之一或多個核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代，其中該核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。於一實施態樣中，該突出端包含一或多個脫氧核糖核苷，例如序列 dTdT 或dTdTdT。於一實施態樣中，該突出端包含序列dT * dT，其中“*”為硫代磷酸酯核苷間鍵聯(有時稱為“s”)。於一實施態樣中，該突出端包含至少一個2’-OMe修飾之U(稱為u)。於一實施態樣中，該突出端包含u * u(亦稱為usu)。於一實施態樣中，該突出端包含uu。於一實施態樣中，該突出端包含倒置之核苷酸或核苷，該倒置之核苷酸或核苷係以反向鍵聯(3’-3’或5’-5’鍵聯)連接股。例如，該突出端可包含倒置之dT，或倒置之無鹼基核苷。倒置之無鹼基核苷不具有鹼基部分。

本技藝之技術熟習人士將理解藉由參考該靶的反義RNA轉錄子或被靶向之序列可以很方便地定義本發明之saRNA，而不管該saRNA係藉何種機制調控該靶基因之表現。然而，本發明之saRNA或可藉由參考該靶基因來定義。該靶的反義RNA轉錄子與該靶基因之編碼股上的基因組區互補，而本發明之saRNA又與該靶的反義RNA轉錄子之區互補，因此本發明之saRNA可被定義為與該靶基因之編碼股上的區具有序列同一性。本文中參考該靶的反義RNA轉錄子所討論之所有關於本發明之saRNA的定義之特性準用於參考該靶基因之本發明saRNA的定義，如此，對該靶的反義RNA轉錄子之互補性的任何討論應被理解為包括與該靶基因之基因組序列的同一性。因此，本發明之saRNA可與該靶基因上之基因組序列具有高度百分比同一性，例如至少80%、90%、95%、98%、或99%、或100%同一性。該基因組序列可至多為該靶基因之轉錄起始位點的上游或下游之2000、1000、500、250、或100個核苷酸。其可與該靶基因之啟動子區對齊。因此，該saRNA與該與靶基因之啟動子區對齊的序列可具有序列同一性。

於一實施態樣中，設計本發明之saRNA並不需要確定是否存有該靶的反義RNA轉錄子。換言之，設計該saRNA並不需要鑑定該靶的反義RNA轉錄子。例如，TSS核心之核苷酸序列，即，該靶基因之轉錄起始位點上游2000個核苷酸至該靶基因之轉錄起始位點下游2000個核苷酸的區中之序列可藉由該靶基因之編碼股的基因組序列、藉由測序或藉由在數據庫中搜索來取得。可選擇在TSS核心內，從該模板股上之TSS核心的位置1到位置4001之間的任何位置處開始的被靶向序列，然後可將具用來設計saRNA序列。如上文所討論者，該saRNA與被靶向之序列的反向互補序列具有高度之序列同一性。

然後，測定在整個基因組中該saRNA序列之脫靶命中數、0錯配(0mm) 命中數及1個錯配(1mm)命中數。術語“脫靶命中數”係指在整個基因組中與該靶基因之模板股上的saRNA被靶向序列相一致的其他位點之數目。術語“0mm命中數”係指除了該saRNA之靶的轉錄子外之已知的蛋白質編碼轉錄子數目，該saRNA可在0錯配下與其互補序列雜交或結合。換言之，“0mm命中數”計算除了該saRNA之靶的轉錄子(其包含與該saRNA序列完全相同之區域)外的已知蛋白質編碼轉錄子的數目。術語“1mm命中數”係指除了該saRNA之靶的轉錄子外的已知之蛋白質編碼轉錄子之數目saRNA，該saRNA可在1個錯配下與其互補序列雜交或結合。換言之，“1mm命中數”計算除了該saRNA之靶的轉錄子(其包含與該saRNA序列完全一致，僅具有1個錯配之區)外的已知蛋白質編碼轉錄子的數目。於一實施態樣中，僅選擇不具有脫靶命中、不具0mm命中及不具有1mm命中的saRNA序列。在那些揭示於本發明之saRNA序列方面，各序列無脫靶命中、無0mm命中且無1mm命中。

該揭示於2011年6月23日提交之US 2013/0164846(saRNA算法)(其全部內容以引用方式併入本文)中之方法亦可用來設計saRNA。saRNA之設計亦揭示於授予Corey等人之美國專利案號8,324,181和美國專利案號7,709,566、授予Li等人之美國專利刊物2010/0210707號及Voutila等人之Mol Ther Nucleic Acids, vol. 1, e35 (2012)中，各篇之全部內容以引用方式併入本文。

“存有之測定”係指搜索EST之數據庫及/或該靶基因之基因座周圍的反義RNA轉錄子以鑑定合適之靶的反義RNA轉錄子，或使用RT PCR或任何其他已知之技術來確認細胞中物理存有之靶的反義RNA轉錄子。

於一些實施態樣中，本發明之saRNA可呈單股或雙股。雙股分子包含第一股和第二股。若為雙股，該雙股體的每一股長度可為至少14、或至少18，例如19、20、21或22個核苷酸。該雙股體之雜交長度可為至少12個、或至少15個、或至少17個、或至少19個核苷酸。各股之長度可為正好19個核苷酸。較佳地，該saRNA之長度少於30個核苷酸，因為超過此長度之寡核苷酸雙股體誘導干擾素反應的風險可能增加。於一實施態樣中，該saRNA之長度為19至25個核苷酸。形成該saRNA雙股體的股可為等長或不等長。

於一實施態樣中，本發明之saRNA包含具有至少14個核苷酸且少於30個核苷酸之序列，該序列與被靶向之序列為至少80%、90%、95%、98%、99%或100%互補。於一實施態樣中，該與被靶向之序列至少80%、90%、95%、98%、99%或100%互補之序列的長度至少為15、16、17、18或19個核苷酸、或18至22、或19至21、或正好19個核苷酸。

於一些實施態樣中，本發明之saRNA呈單股且包含至少14個核苷酸和少於30個核苷酸。該股之長度可包含15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。於一實施態樣中，該saRNA之分子量或質量為約5000 Da至約10000 Da、約6000 Da至約8000 Da、或6500 Da至約7500 Da。

於一些實施態樣中，本發明之saRNA呈雙股且每一股包含至少14個和少於30個核苷酸。各股之長度可包含15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸。於一實施態樣中，saRNA之各股的分子量或莫耳質量為約5000 Da至約10000 Da、約6000 Da至約8000 Da、或6500 Da至約7500 Da。

本發明之saRNA可包括不與該靶的反義RNA轉錄子互補的短3’或5’序列。於一實施態樣中，該等序列係在該股之3’端。該序列之長度可為1至5個核苷酸、或2或3個核苷酸。該序列可包含尿嘧啶，如此其可為具有2或3個尿嘧啶之3’延伸。該序列可包含一或多個脫氧核糖核苷，諸如dT。於一實施態樣中，該序列中之一或多個核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代，其中該核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。作為非限制性實例，該序列包含序列 dT* dT，其中*為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。此非互補性序列可稱為“尾”。若存有3’尾，該股可能較長，例如19個核苷酸加3’尾，該3’尾可為UU或UUU。當測定saRNA與該靶的反義RNA轉錄子之間的互補性時該等3’尾不應被視為錯配。

因此，本發明之saRNA可由下列(i)和(ii)所組成：(i)與該靶的反義RNA轉錄子之區至少80%互補的序列；(ii)具有1-5個核苷酸的3’尾，其可包含或由尿嘧啶殘基所組成。因此，該saRNA之全長通常將與該靶的反義RNA轉錄子的區互補，除了3’尾外(若存在時)。本申請案中所揭示之任何saRNA序列可選擇地包括該等3’尾。因此，saRNA表和序列表中所揭示之任一saRNA序列可選擇地包括該等3’尾。本發明之saRNA可進一步包含Dicer或Drosha受質序列。

本發明之saRNA可含有側翼序列。該側翼序列可插入本發明之saRNA的3’端或5’端。於一實施態樣中，該側翼序列為miRNA之序列，使得該saRNA具有miRNA構型並可以Drosha和Dicer加工處理。於一非限制性實例中，本發明之saRNA具有二股並被選殖入微小RNA前體，例如miR-30骨架側翼序列。

本發明之saRNA可包含限制性內切酶受質或識別序列。該限制性內切酶識別序列可在本發明之saRNA的3’端或5’端。該限制性內切酶之非限制性實例包括NotI和AscI。

於一實施態樣中，本發明之saRNA係由經穩定地鹼基配對在一起的二股所組成。於一些實施態樣中，該隨從股可包含至少一個不與嚮導股上之對應核苷酸互補的核苷酸，稱為與該嚮導股錯配。於一實施態樣中，該至少一個與嚮導股之錯配可位於該隨從股之3’端。於一實施態樣中，該隨從股之3’端可包含1至5個與嚮導股之錯配。於一實施態樣中，該隨從股之3’端可包含2至3個與嚮導股之錯配。於一實施態樣中，該隨從股之3’端可包含6至10個與嚮導股之錯配。

於一實施態樣中，該雙股saRNA可在形成3’突出端的每一股之3’端包含許多未配對之核苷酸。形成每一股之3’突出端的未配對之核苷酸數目可在1至5個核苷酸、或1至3個核苷酸之範圍內、或2個核苷酸。該3’突出端可在上述之3’尾形成，因此該3’尾可為雙股saRNA之3’突出端。

因此，本發明之saRNA可呈單股且由下列(i)和(ii)所組成：(i)與該靶的反義RNA轉錄子之一區域至少80%互補的序列；(ii)具有1-5個核苷酸的3’尾，其可包含尿嘧啶殘基。本發明之saRNA的全長可與靶的反義RNA轉錄子之區互補，除了3’尾外(若存在時)。如上述，本發明之saRNA亦可被定義為與該靶基因之編碼股具有“同一性”，而非與該靶的反義RNA轉錄子互補。本發明之saRNA可呈雙股且係由第一股和第二股所組成，該第一股包含：(i)與該靶的反義RNA轉錄子之區至少80%互補的第一序列；和(ii)具有1-5個核苷酸的3’突出端；而該第二股包含(i)與第一序列形成雙股體之第二序列和(ii)具有1-5個核苷酸之3’突出端。

如本文所描述，該HNF4a基因之序列係用於設計HNF4a-saRNA。HNF4a基因之靶的反義RNA轉錄子的序列可從用於設計HNF4a-saRNA之HNF4a基因的序列來測定。然而，並不需要測定該等靶的反義RNA轉錄子之存在。本發明之合適之HNF4a-saRNA的序列提供於表1中。因此，提供具有包含選自下列群組之序列的第一股之HNF4a-saRNA：SEQ ID No：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32。可選擇地，該HNF4a-saRNA可在這些序列之3’端包含3’尾。

單股HNF4a-saRNA僅由第一股所組成，而雙股HNF4a-saRNA亦具有第二股。該單股HNF4a-saRNA包含選自表1中之反義股的序列。該雙股HNF4a-saRNA包含第一股和第二股，其中該第一股包含選自表1中之反義股的序列，而其中該第二股包含對應於表1中之有義股的序列。該反義及/或有義股可包含3’突出端。於一實施態樣中，該3’突出端為mUmU(m係指2’-OMe修飾的)。

本發明之saRNA可藉由任何合適之方法產生，例如使用本技藝之一般技術人士所周知之標準分子生物學技術合成或在細胞中表現。例如本發明之saRNA可使用本技藝中已知之方法化學合成或重組產生。

saRNA 之化學修飾

本文中，在saRNA中，術語“修飾”或依適當情況，“經修飾的”係指關於A、G、U或C核糖核苷酸之結構及/或化學修飾。本發明之saRNA中的核苷酸可包含非標準核苷酸，諸如非天然存在之核苷酸或化學合成性核苷酸或脫氧核苷酸。本發明之saRNA可包含任何有用之修飾，諸如對糖、核鹼基或核苷間鍵聯的修飾(例如對連接磷酸鹽/對磷酸二酯鍵聯/對磷酸二酯骨架之修飾)。嘧啶核鹼基之一或多個原子可被可選擇地經取代之胺基、可選擇地經取代之巰基，可選擇地經取代之烷基(例如甲基或乙基)或鹵素(例如氯或氟)替換或取代。於某些實施態樣中，修飾(例如一或多個修飾)係存在於每一個糖和核苷間鍵聯中。根據本發明之修飾可為核糖核酸(RNA)對脫氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或其雜合物之修飾。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可包含至少一種本文所描述之修飾。

於另一實施態樣中，該saRNA為saRNA雙股體且該有義股和反義序列可獨立地包含至少一個修飾。作為非限制性實例，該有義序列可包含修飾而該反義股可為未經修飾。作為另一非限制性實例，該反義股可包含修飾而該有義股可為未經修飾。作為另一非限制性實例，該有義序列可包含一個以上之修飾，而該反義股可包含一個修飾。作為非限制性實例，該反義序列可包含一個以上之修飾且該有義股可包含一個修飾。

本發明之saRNA可包括對糖、核鹼基及/或該核苷間鍵聯之修飾組合。這些組合可包括此處或國際申請刊物(2012年10月3日提交之WO2013/052523)中描述之任何一或多種修飾，尤其是式(Ia)-(Ia-5)、(Ib)-(If)、(IIa)-(IIp)、(IIb-1)、(IIb-2)、(IIc-1)-(IIc-2)、(IIn-1)、(IIn-2)、(IVa)-(IVl)及(IXa)-(IXr)，該專利申請案之全部內容以引用方式併入本文。

本發明之saRNA可或可不沿著該分子的整個長度被均勻地修飾。例如，本發明之saRNA中的一或多個或所有類型之核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或任何一或多個或所有A、G、U、C)可被或可不被均勻地修飾。於一些實施態樣中，本發明之saRNA中的所有核苷酸X係經修飾，其中X可為核苷酸A、G、U、C之任一者，或A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C組合之任一者。

不同的糖修飾、核苷酸修飾及/或核苷間鍵聯(例如骨架結構)可存在於saRNA中之不同位置。本技藝之一般技術人士將理解該核苷酸類似物或其他修飾可位於saRNA之任何位置，從而使該saRNA之功能基本上不會降低。本發明之saRNA可含有約1%至約100%之經修飾的核苷酸(或是相對於總體核苷酸含量，或是相對於一或多種類型之核苷酸(即，A、G、U或C之任何一或多者))或任何介於中間之百分比(例如1%至20%、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%、95%至100%)。

於一些實施態樣中，該修飾可在核糖環上。在核糖上之2’-OH基團可經取代以保護saRNA防止核糖核酸酶之作用。例如該2’-OH基團可被2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-烯丙基(2’-O-烯丙基)，等取代。

於一些實施態樣中，該修飾包括核苷酸(LNA、ENA、CLNA、CENA、AENA，等)、無環核苷酸(UNA、PNA，等)或含吡喃糖環之核苷酸(ANA、HNA)之雙環衍生物，而不是核糖。

於一些實施態樣中，該修飾可在骨架上以增加該saRNA之核酸酶抗性。非限制性實例包括以硫代磷酸酯(PS)或硼烷磷酸酯(PB)基團替代磷酸基(PO)、以2’,5’-鍵或醯胺鍵二者替代3’,5’-磷酸二酯鍵，而非酯鍵，等。

於一些實施態樣中，該修飾可在核鹼基上。例如，可以假尿苷(ψ)、2-硫代尿苷(s2U)、二氫尿苷(D)、5-溴-U、5-碘-U，等替代尿苷(U)。可以2,6-二胺基嘌呤替代嘌呤。

於一些實施態樣中，該修飾可在saRNA之端點上。任何終端修飾可用於增加核酸酶抗性，以協助非對稱RISC組裝、幫助saRNA在細胞累積及檢測saRNA。例如，螢光標記物和生物素可連接在saRNA之端點。於另一實例中，倒置之脫氧核糖可用在saRNA之端點。

於一些實施態樣中，本發明之saRNA可被修飾成球形核酸(SNA)或環狀核酸。本發明之saRNA的端點可藉由化學試劑或酶連接，產生無游離端之球形saRNA。球形saRNA被預期較其線性對應部分更穩定且對以RNaseR核酸外切酶進行之分解具有抗性。球形saRNA相關於A、G、U或C核糖核苷酸可進一步包含其他結構及/或化學修飾。

於一些實施態樣中，本發明之saRNA可包含倒置之dT修飾。該倒置之修飾可在5’端或3’端。於一些實施態樣中，核苷酸之2’-OH被-OMe取代，稱為2’-OMe。於一些實施態樣中，核苷酸之2’-OH被-F取代，稱為2’-F。於一些實施態樣中，核苷酸之間具有硫代磷酸酯鍵聯。於一些實施態樣中，本發明之saRNA可包含無鹼基修飾。

本發明之saRNA可包含修飾之組合。該saRNA可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個修飾。例如，該saRNA可包含交替之2’-F和2’-OMe修飾。於一些實施態樣中，該saRNA可橫跨其整個長度進行修飾。

可使用任何不會干擾嚮導股活性，可使有義股無活性及/或減少脫靶的合適修飾。

saRNA 軛合物及組合物

軛合可導致穩定性及/或半衰期增加，且可能對將本發明之saRNA靶向細胞、組織或生物體之特定位點特別有用。本發明之saRNA可被設計成與下列其他物質軛合：多核苷酸、染料、嵌入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素(psoralene)、絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、德克薩卟啉(texaphyrin)、噻卟啉(Sapphyrin))、多環芳香族烴類(例如吩嗪、二氫吩嗪)、人工內切核酸酶(例如EDTA)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂ 、聚胺基、烷基、經取代之烷基、經放射性標記之標記物、酶、半抗原(例如生物素)、轉運/吸收促進者(例如阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成性核糖核酸酶、蛋白質，例如糖蛋白、或肽，例如對共配體具有特定親和力之分子、或抗體，例如與特定之細胞類型，諸如癌細胞、內皮細胞或骨細胞結合之抗體、激素和激素受體、非肽物種，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、或藥物。用於核酸分子之合適的軛合物揭示於2012年12月14日提交之國際刊物WO2013/090648中，其全部內容以引用方式併入本文。

根據本發明，HNF4a-saRNA可與下列群組之一或多者一起投予或進一步編碼以實現不同的功能：RNAi試劑、小干擾RNA(siRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、長非編碼RNA(lncRNA)、增強子RNA、增強子衍生之RNA或增強子驅動之RNA(eRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA結合位點、反義RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、誘導形成三螺旋體之RNA、適體或載體，等。該一或多個RNAi試劑、小干擾RNA(siRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、長非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA結合位點、反義RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、誘導形成三螺旋體之RNA、適體或載體可包含至少一個修飾或取代。於一些實施態樣中，該修飾係選自在糖位置之核酸的化學取代、在磷酸鹽位置之化學取代和在鹼基位置之化學取代。於其他實施態樣中，該化學修飾係選自下列群組：併入經修飾之核苷酸；3’加帽；與高分子量，非免疫原性化合物軛合；與親脂性化合物軛合；及在磷酸骨架中併入硫代磷酸酯。於一較佳之實施態樣中，該高分子量，非免疫原性化合物為聚伸烷基二醇，且更佳為聚乙二醇(PEG)。

於一實施態樣中，HNF4a-saRNA可附接於轉基因，從而使其可以從RNA聚合酶II啟動子共同表現。於一非限制性實例中，HNF4a-saRNA係附接於綠色螢光蛋白基因(GFP)。

於一實施態樣中，HNF4a-saRNA可附接於DNA或RNA適體，藉此產生HNF4a-saRNA-適體軛合物。適體為具有高選擇性、親和性和穩定性之寡核苷酸或肽。它們呈現特定和穩定之三維形狀，從而提供對靶的分子之高特異性，與靶的分子緊密結合。適體可為已透過在玻管內反複進行多輪選擇或同等之SELEX(配體指數富集之系統進化技術)的工程處理以與各種分子靶的(諸如小分子、蛋白、核酸、甚至細胞、組織和生物體)結合之核酸物種。核酸適體透過除了經典沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基配對外之交互作用對分子具有特異性結合親和力。核酸適體(如藉由噬菌體展示或單株抗體(mAb)產生之肽)能夠與選定之靶的特異結合並透過結合來阻斷其靶的發揮作用的能力。在一些情況下，適體亦可為肽適體。對於任何特定之分子靶的，核酸適體可從核酸之組合庫鑑定，例如藉由SELEX。肽適體可使用酵母雙雜交系統鑑定。因此，本技藝之技術熟習人士能夠設計合適之適體以遞送本發明之saRNA或細胞至靶細胞，諸如肝細胞。DNA適配體、RNA適體和肽適體為所考量的。特佳的為使用肝特異性適體將本發明之saRNA投予肝臟。

如本文所使用之典型核酸適體的大小為大約10-15 kDa (20-45個核苷酸)，其以至少奈米莫耳之親和力與其靶的結合並辨別密切相關之靶的。核酸適體可為核糖核酸、脫氧核糖核酸或混合之核糖核酸和脫氧核糖核酸。適體可為單股核糖核酸、脫氧核糖核酸或混合之核糖核酸和脫氧核糖核酸。適體可包含至少一種化學修飾。

用於適體之合適的核苷酸長度的範圍為約15至約100個核苷酸(nt)且於各種其他較佳實施態樣中，該長度為約15-30nt、20-25nt、30-100nt、30-60nt、25-70nt、25-60nt、40-60nt、25-40nt、30-40nt、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40nt之任一者或40-70nt。然而，該序列可被設計成具有足夠彈性，從而使其可容許適體與二個在本文所描述之距離之靶的交互作用。適體可被進一步修飾以提供保護不受核酸酶和其他酶活性的影響。該適體序列可藉由本技藝已知之任何合適方法進行修改。

該HNF4a-saRNA-適體軛合物可使用任何已知之用於連接二個部分的方法形成，諸如直接形成化學鍵、經由連接子(諸如鏈親和素)鍵聯，等。

於一實施態樣中，HNF4a-saRNA可附接於抗體。產生針對靶細胞表面受體之抗體的方法為眾所周知的。本發明之saRNA分子可藉由已知方法附接於該等抗體，例如使用RNA載體蛋白。然後可將所產生之複合體投予個體，並由靶細胞經由受體介導之內吞作用攝入。

於一實施態樣中，HNF4a-saRNA可與下列群組軛合：脂質部分(諸如膽固醇部分)(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、膽酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、硫醚，例如綠柱石-5-三苯甲基硫醇(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309；Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H膦酸酯(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973)、或金剛烷醋酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)、或十八烷基胺或己胺基-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)，各篇之全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，本發明之saRNA與授予Manoharan等人之US 20130184328(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之配體軛合。該軛合物具有公式：配體-[連接子]_可選擇的 -[繫鏈]_可選擇的 -寡核苷酸試劑。該寡核苷酸試劑可包含授予Manoharan等人之US 20130184328(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之具有式(I)之亞單位。

教導該等核酸/脂質軛合物之製備方法的代表性美國專利案包括，但不限於下列美國專利案：編號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，各篇之全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，該saRNA與碳水化合物配體，諸如授予Manoharan等人(Alnylam 製藥公司)之美國專利案號8106022和8828956(各篇之全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之任何碳水化合物配體軛合。例如，該碳水化合物配體可為單醣、雙醣、三醣、四醣、寡糖或多醣。這些與碳水化合物軛合之RNA劑可靶向肝臟之實質細胞。於一實施態樣中，該saRNA與一個以上之碳水化合物配體軛合，較佳為二個或三個。於一實施態樣中，該saRNA與一或多個半乳糖部分軛合。於另一實施態樣中，該saRNA與至少一個(例如二個或三個或更多個)乳糖分子(乳糖為與半乳糖偶聯之葡萄糖)軛合。於另一實施態樣中，該saRNA與N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc)、N-Ac-葡糖胺(GluNAc)或甘露糖(例如甘露糖-6-磷酸鹽)至少一者(例如二個、或三個、或更多個)軛合。於一實施態樣中，該saRNA與至少一個甘露糖配體軛合且該經軛合之saRNA靶向巨噬細胞。

於另一實施態樣中，該saRNA與一或多個含有未甲基化之胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的寡核苷酸(稱為CpG寡核苷酸)軛合。於一實例中，該CpG寡核苷酸之尺寸係介於2至100個鹼基對之間且含有由下式代表之共有促有絲分裂CpG基序：
5’X₁ X₂ CGX₃ X₄ 3’，
其中C和G為未甲基化的，X₁ 、X₂ 、X₃ 和X₄ 為核苷酸且GCG三核苷酸序列不存在於5’和3’端或接近5’和3’端。CpG寡核苷酸之實例描述於授予Krieg等人之美國專利案號6,194,388和授予Krieg等人之6,207,646號中(各篇之全部內容以引用方式併入本文)。較佳地，該CpG寡核苷酸之大小的範圍係在8和40個鹼基對之間。此外，較佳地，該CpG寡核苷酸為穩定之寡核苷酸，特佳為硫代磷酸酯穩定化之寡核苷酸。該CpG寡核苷酸可藉由任何連接子及/或授予Jove等人之WO2012128785和授予Yu等人之US 20140128324中所揭示之任何方法與本發明之saRNA軛合(各篇之全部內容以引用方式併入本文)，諸如使用支化或橋聯化合物、共價構建體、點擊化學(click chemistry)，等。

本發明之saRNA可與其他已知在所考慮之特定方法中具有效應之活性成分組合提供。該其他活性成分可與本發明之saRNA同時、單獨或依序投予。於一實施態樣中，HNF4a-saRNA係與調控不同靶基因之saRNA一起投予。非限制性實例包括調控白蛋白、胰島素或HNF4a基因之saRNA。調控任何基因可使用單一saRNA或二或更多種不同saRNA之組合來達成。可與本發明之HNF4a-saRNA一起投予之saRNA的非限制性實例包括揭示於國際刊物WO2015/075557中之調控CEBPA的saRNA、揭示於2012年6月20日提交之國際刊物WO2012/175958中之調控白蛋白或HNF4a的saRNA、揭示於2011年10月10日提交之國際刊物WO2012/046084和WO2012/046085中之調控胰島素的saRNA、揭示於2006年11月13日提交之美國專利案第7,709,456號和2010年4月23日提交之美國專利刊物US 2010/0273863中之調控人孕酮受體、調控人類穹窿體主蛋白(hMVP)、E-鈣黏蛋白基因、p53基因或PTEN基因的saRNA及揭示於2006年4月11日提交之國際刊物WO2006/113246中之p21基因的saRNA，各篇之全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，HNF4a-saRNA係與調節代謝(尤其是肝功能)的一或多種藥物一起投予。於非限制性實例中，本發明之HNF4a-saRNA係與降低低密度脂蛋白(LDL)膽固醇濃度之藥物一起投予，該藥物為，諸如他汀(statin)、辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、依澤替米貝(ezetimibe)、菸酸(niacin)、PCSK9抑制劑、CETP抑制劑、氯貝丁酯(clofibrate)、非諾貝(fenofibric)、生育三烯酚(tocotrienol)、植物固醇(phytosterol)、膽酸多價螯合劑(bile acid sequestrant)、普羅布考(probucol)或彼等之組合。HNF4a-saRNA亦可與授予Orvig等人之US 6287586中所揭示之釩雙胍複合體一起投予。於另一實例中，HNF4a-saRNA可與授予Rhodes之WO201102838(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示的組成物一起投予以降低血清膽固醇。該組成物包含抗原結合蛋白及RNA效應劑，該抗原結合蛋白選擇性地與PCSK9蛋白結合並抑制PCSK9蛋白；而該RNA效應劑抑制PCSK9基因在細胞中表現。再於另一實例中，HNF4a-saRNA可依授予Brooks-Wilson等人之EP1854880 (其全部內容以引用方式併入本文)中之描述，與具有ABC1生物活性之ABC1多肽，或編碼具有ABC1生物活性之ABC1多肽的核酸一起投予以調控膽固醇之濃度。

於另一實施態樣中，本發明之HNF4a-saRNA係與增加胰島素敏感性或治療第II型糖尿病之藥物(諸如二甲雙胍、磺醯脲、非磺醯脲促分泌素(secretagogue)、α葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮、吡格列酮、羅格列酮、胰高血糖素(glucagon)樣肽-1類似物和二肽基肽酶-4抑制劑或彼等之組合)一起投予。可與本發明之saRNA一起投予之其他肝保護劑揭示於Adams et al.,Postgraduate Medical Journal, vol. 82, 315-322 (2006)(其全部內容以引用方式併入本文)中。

Gankyrin 和 FXR 蛋白

肝細胞癌(HCC)之發展為一種多步驟過程，該過程涉及導致肝過度增殖和肝癌之基因表現漸進變化。在肝癌之癌發生期間，腫瘤抑制蛋白Rb、p53、肝細胞核因子4α(HNF4α)及C/EBP-α被中和。這些蛋白質之排除係由26S蛋白酶之小次單位gankyrin介導，gankyrin係被癌激活。Wang等人揭示gankyrin與C/EBPα之S193-ph同種型交互作用並且將其靶向由泛素蛋白酶體(ubiquitinproteasome)系統(UPS)-介導之降解。在肝癌發展早期Gankyrin濃度會升高(Wang et al.,J. Clin. Invest, vol.120(7):2549-2562 (2010)(其全部內容以引用方式併入本文)。抑制gankyrin (例如使用gankyrin基因(亦稱為PSMD10基因)之siRNA及/或gankyrin抑制劑)可防止及/或治療HCC。

Jiang等人發現類法尼醇(farnesoid)X受體(FXR)(亦稱為膽汁酸受體(BAR)或NR1H4)藉由透過HDAC1-C/EBPβ複合體使gankyrin啟動子靜默來抑制休眠肝臟中之gankyrin表現(Jiang et al.,Hepatology, vol.57(3): 1098-1106 (2013)，其全部內容以引用方式併入本文)。小鼠中之FXR信號傳導的缺失導致gankyrin啟動子被去遏抑並在12個月大自發性發展肝癌。在野生型小鼠中之由二乙基亞硝胺(DEN)介導的肝癌亦牽涉到FXR減少和gankyrin激活。在老年小鼠之肝癌和人類患者之肝癌的檢查透露出在肝癌之自發性發展過程中FXR減少而gankyrin 升高。Jiang等人歸結出FXR經由C/EBPβ-HDAC1複合體抑制gankyrin啟動子，導致接下來保護腫瘤抑制蛋白不會被降解以防止肝癌。FXR之穩定化及核轉位抑制gankyrin。激活FXR(例如使用FXR激動劑或激活劑、或NR1H4基因之激活劑)可防止及/或治療HCC。

本發明之HNF4a-saRNA可與一或多種下調gankyrin或上調FXR之治療劑組合使用。該組合物對預防及/或治療HCC可能具有協同作用。於一些實施態樣中，本發明之HNF4a-saRNA可與gankyrin-siRNA組合使用。雙股Gankyrin-siRNA可使用由Higashitsuji等人在“Inhibition of endogenous gene expression by RNAi” 章節(Higashitsuji et al.,Cancer Cell, vol.8:75-87 (2005)，其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之方法製造。於一些實施態樣中，本發明之HNF4a-saRNA可與FXR激動劑組合使用。FXR激動劑或激活劑之非限制性實例包括牛磺膽酸、奧貝膽酸(obeticholic acid)(OCA)、INT-767(Intercept製藥)、INT-777(Intercept製藥)及下列文獻中揭示之任何FXR激動劑或激活劑：美國專利申請案號20140057886、美國專利案號8546365、美國專利案號7932244、美國專利申請案號20140100209、美國專利案號8445472、美國專利案號8114862、美國專利申請案號20140094443、美國專利案號8410083、美國專利案號8796249、美國專利申請案號20140024631、美國專利案號8377916、美國專利案號8258267、美國專利案號7786102、美國專利案號7138390、美國專利案號7994352、美國專利案號7858608、美國專利案號7812011、美國專利申請案號20140148428及美國專利申請案號20060252670(各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

配製、遞送、投予及給藥

藥物配製劑可另外包含醫藥上可接受之賦形劑，如本文所使用之醫藥上可接受之賦形劑包括，但不限於適合用於所需之特定劑型的任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體載劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑，等。用於配製醫藥組成物之各種賦形劑和用於製備該組成物之技術為本技藝所已知(參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；其全部內容以引用方式併入本文)。除了可能與物質或其衍生物不相容之任何傳統之賦形劑介質(諸如產生任何不欲有之生物效應或以有害方式與該醫藥組成物之任何其他組分交互作用)外，使用傳統之賦形劑介質可在本發明考量之範圍內。

於一些實施態樣中，組成物係對人類、人類患者或個體投予。為了本發明之目的，短語“活性成分”一般係指欲依本文之描述遞送的HNF4a-saRNA。

雖然本文提供之醫藥組成物的描述主要針對適合投予人類之醫藥組成物，本技藝之技術熟習人士將理解該等組成物通常適合投予任何其他動物，例如投予非人動物，例如非人類哺乳動物。修飾適合用於投予人類之醫藥組成物以使該組成物適合投予各種動物已為人充分理解且一般技術之獸醫藥理學家可僅以普通之實驗(若有的話)設計該等修飾及/或執行該等修飾。考慮對其投予該醫藥組成物之個體包括，但不限於：人及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括與商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠及/或大鼠；及/或鳥類，包括商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。

於一實施態樣中，本文所描述之經配製之saRNA的效力可在增殖細胞中測定。

本文所描述之醫藥組成物的配製劑可藉由藥理學領域中任何已知或之後研發的方法製備。一般而言，該等製備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他輔助成分聯結的步驟，然後若需要及/或合適的話，將該產品分割、成形及/或包裝成所需之單劑量或多劑量單位。

根據本發明之醫藥組成物可以單一單位劑量及/或以多個單一單位劑量之形式製備、包裝及/或散裝銷售。如本文所使用之“單位劑量”為包含預定量之活性成分的離散量之醫藥組成物。該活性成分之量通常等於將對個體投予之活性成分的劑量及/或該等劑量之方便級分，例如該等劑量之一半或三分之一。

根據本發明之醫藥組成物中的活性成分、醫藥上可接受之賦形劑及/或任何附加成分之相對量將根據接受治療之個體的身份、大小及/或病況而變化，且進一步取決於將用於投予該組成物之路線。舉例來說，該組成物可包含0.1%至100%，例如0.5至50%、1至30%、5至80%、至少80%(w/w)之活性成分。

於一些實施態樣中，本文所描述之配製劑可包含至少一種saRNA。作為非限制性實例，該配製劑可含有1、2、3、4或5個具有不同序列之saRNA。於一實施態樣中，該配製劑含有至少三個具有不同序列之saRNA。於一實施態樣中，該配製劑含有至少五個具有不同序列之saRNA。

本發明之saRNA可使用一或多種賦形劑配製以：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染；(3)允許持續或延遲釋出(例如，從saRNA之貯庫配製劑釋出)；(4)改變生物分佈(例如將該saRNA靶向特定之組織或細胞類型)；(5)增加該經編碼之蛋白質在活體內轉譯；及/或(6)改變該經編碼之蛋白質在活體內之釋出變化形廓。除了傳統之賦形劑(諸如任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑、或其他液體載劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑)外，本發明之賦形劑可包括，但不限於類脂質、脂質體、脂質奈米顆粒、聚合物、脂質體複合體、核-殼奈米顆粒、肽、蛋白質、以saRNA轉染之細胞(例如用於移植入個體)、透明質酸酶、奈米顆粒模擬物和彼等之組合。因此，本發明之配製劑可包括一或多種賦形劑，各賦形劑之含量在累加時可增加saRNA之穩定性及/或藉由saRNA增加細胞轉染。此外，本發明之saRNA可使用自組裝核酸奈米顆粒配製。可與本發明之saRNA一起配製之核酸的醫藥上可接受之載體、賦形劑和遞送劑揭示於2012年12月14日提交之國際刊物WO2013/090648中，其全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，本發明之saRNA包含二個長度各為21個核苷酸之單股RNA，該二個單股RNA黏合在一起以形成作為醫藥組成物之活性成分的雙股HNF4a-saRNA。

於另一實施態樣中，本發明之saRNA可以樹枝狀聚合物(dendrimer)遞送。樹枝狀聚合物為高度支化之大分子。於一較佳之實施態樣中，本發明之saRNA與結構上有彈性之聚(醯胺基胺)(PAMAM)樹枝狀聚合物複合以用於活體內之靶向遞送。樹枝狀聚合物具有高度之分子均勻性、狹窄之分子量分佈、特定之尺寸和形狀特性及高度官能化之終端表面。該製造過程為從中央引發劑核心開始之一系列重複的步驟。隨後之各生長步驟代表具有較前一代更大之分子直徑和分子量及更多反應性表面位點的新一代聚合物。PAMAM樹枝狀聚合物為在其表面上攜帶一級胺基團且在結構內部亦攜帶三級胺基團的有效核苷酸遞送系統。該一級胺基團參與核苷酸結合並促進其細胞攝取，而該被掩埋之三級胺基作為胞內體(endosome)中之質子海綿並增進核酸釋入細胞質中。這些樹枝狀聚合物保護由其攜帶之saRNA不被核糖核酸酶降解並達成在延長之期間內經由內吞作用大量釋出saRNA以取得有效之基因靶向。這些奈米顆粒在體內之效力先前已有評估，其中生物分佈研究顯示出該樹枝狀聚合物優先累積在外周血單核細胞且存活時沒有可察覺之毒性(參見Zhou et al., Molecular Ther. 2011 Vol. 19, 2228-2238，其全部內容以引用方式併入本文)。PAMAM樹枝狀聚合物可包含三乙醇胺(TEA)核心、二胺基丁烷(DAB)核心、胱胺核心、二胺基己烷(HEX)核心、二胺基十二烷(DODE)核心或伸乙基二胺(EDA)核心。較佳地，PAMAM樹枝狀聚合物包含TEA核心或DAB核心。

於一些實施態樣中，saRNA在醫藥組成物中之濃度為約1 mg/ml至約10 mg/mL、約2 mg/mL至約5 mg/mL或約2.5 mg/mL至約3 mg/mL。

於一些實施態樣中，該醫藥組成物之pH係介於約6至約8之間或約7至約8之間。

於一些實施態樣中，該醫藥組成物之雜質濃度小於約10%、小於約8%、小於約7%、小於約6%或小於約5%。

於一些實施態樣中，本發明之saRNA係包封在顆粒中。該顆粒可為奈米顆粒。粒徑(z-平均值)可介於約50nm至約1000nm之間、約100nm至約500nm之間或約100nm至約200nm之間。

類脂質

類脂質之合成已被廣泛描述且含有這些化合物之配製劑特別適合用於遞送寡核苷酸或核酸(參見Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454；Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21；Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569；Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869；Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001；這些文獻之全部內容以引用方式併入本文)。

雖然這些類脂質已用於在囓齒動物和非人類靈長類動物中有效地遞送雙股小干擾RNA分子(參見Akinc et al.,Nat Biotechnol. 2008 26:561-569；Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105:11915-11920；Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879；Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869；Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010；這些文獻之全部內容以引用方式併入本文)，本發明描述其配製劑及於遞送saRNA之用途。可製備含有這些類脂質之複合體、膠束、脂質體或顆粒，因此，經由局部化及/或全身投予途徑注射類脂質配製劑後可導致有效遞送saRNA。saRNA之類脂質複合體可藉由各種方式投予，包括，但不限於靜脈內、肌內、或皮下途徑。

體內遞送核酸可藉由多種參數來起作用，該參數包括，但不限於該配製組成物、粒子聚乙二醇化之性質、裝載之程度、寡核苷酸對脂質之比例及生物物理學參數，諸如，但不限於粒子大小(Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879；其全部內容以引用方式併入本文)。舉例而言，聚(乙二醇)(PEG)脂質之錨鏈長度的小改變可能對活體內效力產生顯著影響。可測試具有不同類脂質之配製劑的活體內活性，該具有不同類脂質之配製劑包括，但不限於五[3-(1-月桂基胺基丙醯基)]-三伸乙基四胺鹽酸鹽(TETA-5LAP；又名98N12-5，參見Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)；其全部內容以引用方式併入本文)、C12-200(包括衍生物和變體)及MD1。

本文中稱為“98N12-5”之類脂質揭示於Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879中且其全部內容以引用方式併入本文。(參見第2圖)。

在本文中稱為“C12-200”之類脂質係揭示於Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869 (參見第2圖)及Liu and Huang, Molecular Therapy. 2010 669-670 (參見第2圖)；該二篇之全部內容以引用方式併入本文。除了saRNA外，該類脂質配製劑可包括3或4個或更多個組分之顆粒。舉例而言，具有某些類脂質之配製劑包括，但不限於98N12-5且可含有42%類脂質、48%膽固醇和10%PEG(C14烷基鏈長)。作為另一實例，具有某些類脂質之配製劑包括，但不限於C12-200且可包含50%類脂質、10%二硬脂醯磷脂醯膽鹼、38.5%膽固醇和1.5%PEG-DMG。

於一實施態樣中，該與類脂質一起配製以用於全身靜脈內投予之saRNA可靶向肝臟。例如，使用saRNA且包含脂質莫耳組成物的最終優化之靜脈內配製劑可導致分佈至肝臟的該配製劑多於90%，該脂質莫耳組成物具有42%98N12-5、48%膽固醇及10%PEG-脂質，總脂質對saRNA的最終重量比為約7.5比1，PEG脂質上之烷基鏈長為C14，且平均粒徑大約50-6nm。(參見，Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879；其全部內容以引用方式併入本文)。於另一實例中，使用C12-200(參見美國臨時申請案61/175,770和已發表之國際申請案WO2010129709，各篇全部內容以引用方式併入本文)類脂質之靜脈內配製劑可具有50/10/38.5/1.5之C12-200/二硬脂醯磷脂醯膽鹼/膽固醇/PEG-DMG之莫耳比，總脂質對核酸重量比為7比1且平均粒徑為80nm可有效地遞送saRNA(參見，Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869，其全部內容以引用方式併入本文)。於另一實施態樣中，含有MD1類脂質之配製劑可用於在體內有效地將saRNA遞送至肝細胞。用於肌肉內或皮下途徑之經優化的類脂質配製劑之特性可根據該靶細胞類型和配製劑通過細胞外基質擴散入血流之能力而明顯不同。雖然由於內皮膜孔的尺寸而使得粒徑小於150nm的粒徑可能有利於有效遞送至肝細胞(參見，Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879；其全部內容以引用方式併入本文)，使用經類脂質配製之saRNA來將配製劑遞送至其他細胞類型(包括，但不限於內皮細胞、骨髓細胞及肌肉細胞)可能沒有類似之尺寸限制。已有使用類脂質配製劑在體內將siRNA遞送至其他非肝細胞(諸如骨髓細胞和內皮細胞)之報導，參見Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569；Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010；Cho et al. Adv. Funct. Mater. 2009 19:3112-3118；8^th International Judah Folkman Conference, Cambridge,MA October 8-9, 2010；各篇之全部內容以引用方式併入本文)。用於有效遞送至骨髓細胞(諸如單核細胞)之類脂質配製劑可具有類似之組分莫耳比。可使用不同比率之類脂質和其他組分(包括，但不限於二硬脂醯磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG-DMG)來優化該saRNA之配製劑以遞送不同之細胞類型，包括，但不限於肝細胞、骨髓細胞、肌肉細胞，等。例如，該組分莫耳比可包括，但不限於50%C12-200、10%二硬脂醯磷脂醯膽鹼、38.5%膽固醇和1.5%PEG-DMG(參見 Leuschner et al., Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010；其全部內容以引用方式併入本文)。使用類脂質配製劑以經由皮下或肌肉內遞送將核酸局部遞送至細胞(諸如，但不限於脂肪細胞和肌肉細胞)可能不需要用於全身遞送所需之所有配製劑組分，因此可僅包含類脂質和saRNA。

脂質體、脂質複合體(lipoplex)和脂質奈米粒

本發明之saRNA可使用一或多個脂質體、脂質複合體或脂質奈米粒配製。於一實施態樣中，saRNA之醫藥組成物包括脂質體。脂質體為人工製備之囊泡，其可主要由脂質雙層組成並可作為用於投予營養物質和醫藥配製劑之遞送載體。脂質體可具有不同尺寸，諸如，但不限於多層囊泡(MLV)(其直徑可為數百奈米且可含有一系列被狹窄水性隔室分開的同心雙層)、小單細胞囊泡(SUV)(其直徑可小於50nm)及大單層囊泡(LUV)(其直徑可介於50和500nm之間)。脂質體設計可包括，但不限於調理素(opsonin)或配體以改善脂質體附著至不健康組織或用於激活，諸如，但不限於內吞作用之事件。脂質體可含有低或高pH值以改善該醫藥配製劑之遞送。

脂質體之形成可取決於物理化學特性，諸如，但不限於被圈閉之醫藥配製劑和脂質體成分、其中分散著該脂質囊泡之介質的性質、該被圈閉之物質的有效濃度及其可能之毒性、在施用及/或遞送該囊泡之期間所牽涉之任何附加過程、該優化尺寸、多分散性和囊泡在意圖施用方面的保存期限，以及批次間之可重複性和大規模生產安全有效之脂質體產品的可能性。

於一實施態樣中，本文描述之醫藥組成物可包括，但不限於脂質體，諸如從1,2-二油醯氧基-N ,N -二甲胺基丙烷(DODMA)脂質體形成者、來自Marina生物技術公司(Bothell，WA)之DiLa2脂質體、1,2-二亞油醯氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亞油醯-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)和MC3 (US20100324120；其全部內容以引用方式併入本文)，以及可遞送小分子藥物之脂質體，諸如，但不限於來自Janssen生物技術公司(Horsham，PA)之DOXIL®。

於一實施態樣中，本文所描述之醫藥組成物可包括，但不限於脂質體，諸如那些先前已有描述之從合成穩定化之質粒-脂質顆粒(SPLP)或穩定化之核酸脂質顆粒(SNALP)形成且顯示出適合在玻管內和體內遞送寡核苷酸者(參見Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281；Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447；Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372；Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-1007；Zimmermann et al., Nature. 2006441:111-114；Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287；Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176；Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673；deFougerollesHum Gene Ther. 2008 19:125-132；各篇之全部內容以引用方式併入本文)。Wheeler等人之原始製造方法為清潔劑透析方法，該方法後來由Jeffs等人改善且稱為自發性囊泡形成法。除了saRNA外，該脂質體配製劑可由3至4個脂質組分所組成。脂質體之實例可含有，但不限於：55%膽固醇、20%二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、10%PEG-S-DSG和15% 1,2-二油醯氧基-N ,N -二甲胺基丙烷(DODMA)，如Jeffs等人所描述者。於另一實例中，某些脂質體配製劑可含有，但不限於48%膽固醇、20%DSPC、2%PEG-c-DMA和30%陽離子性脂質，其中該陽離子性脂質可為1,2-二硬脂醯氧基-N ,N -二甲胺基丙烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亞麻基氧基-3-二甲胺基丙烷-3-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)，如Heyes等人所描述者。於另一實例中，該核酸-脂質顆粒可包含陽離子性脂質，該陽離子性脂質包含存在於該顆粒中之總脂質的約50莫耳%至約85莫耳%；非陽離子性脂質，該非陽離子性脂質包含存在於該顆粒中之總脂質的約13莫耳%至約49.5莫耳%；及抑制顆粒聚集之經軛合的脂質，該經軛合的脂質包含存在於該顆粒中之總脂質的約0.5莫耳%至約2莫耳%，如授予Maclachlan等人之WO2009127060 (其全部內容以引用方式併入本文)中的描述。於另一實例中，該核酸-脂質顆粒可為授予Maclachlan等人之US2006008910(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之任何核酸-脂質顆粒。作為非限制性之實例，該核酸-脂質顆粒可包含式I之陽離子性脂質、非陽離子性脂質和抑制顆粒聚集之經軛合的脂質。

於一實施態樣中，該saRNA可配製在脂質囊泡中，該脂質囊泡在功能化之脂質雙層之間可具有交聯。

於一實施態樣中，該脂質體可含有授予Bally等人之US5595756(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之經糖修飾的脂質。該脂質可為含量約10莫耳%之神經節苷脂和腦苷。

於一實施態樣中，該saRNA可配製在包含陽離子性脂質之脂質體中。該脂質體之陽離子性脂質中的氮原子對saRNA中之磷酸鹽的莫耳比(N：P比)可介於1：1至20：1之間，如國際刊物第WO2013006825號(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述者。於另一實施態樣中，該脂質體之N：P比可大於20：1或小於1：1。

於一實施態樣中，該saRNA可配製在脂質-聚陽離子複合體中。該脂質-聚陽離子複合體之形成可藉由本技藝中已知之方法及/或如美國刊物第20120178702號(其全部內容以引用方式併入本文)中之描述完成。作為非限制性實例，該聚陽離子可包括陽離子肽或多肽，諸如，但不限於聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸和描述於國際刊物第WO2012013326號(其全部內容以引用方式併入本文)中之陽離子肽。於另一實施態樣中，該saRNA可配製在脂質-聚陽離子複合體中，該脂質-聚陽離子複合體可進一步包括中性脂質，諸如，但不限於膽固醇或二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)。

該脂質體配製劑可被，但不限於下述各項影響：該陽離子性脂質組分之選擇、陽離子性脂質之飽和度、PEG化之性質、所有組分之比率和生物物理參數，諸如大小。於一由Semple等人(Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176；其全部內容以引用方式併入本文)提出之實例中，該脂質體配製劑係由57.1%陽離子性脂質、7.1%二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、34.3%膽固醇和1.4%PEG-c-DMA所組成。

於一些實施態樣中，PEG在該脂質奈米顆粒(LNP)配製劑中之比率可增加或減少及/或該PEG脂質之碳鏈長度可從C14修改成C18，以改變該LNP配製劑之藥代動力學及/或生物分佈。作為非限制性實例，與陽離子性脂質、DSPC和膽固醇相比較，LNP配製劑可含有1-5%莫耳比之PEG-c-DOMG。於另一實施態樣中，該PEG-c-DOMG可被PEG脂質(諸如，但不限於PEG-DSG(1,2-二硬脂醯-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)或PEG-DPG(1,2-二棕櫚醯-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)替代。該陽離子性脂質可選自本技藝中已知之任何脂質，諸如，但不限於：DLin-MC3-DMA、DLin -DMA、C12-200和DLin -KC2-DMA。

於一實施態樣中，該saRNA可配製在脂質奈米顆粒中，諸如國際刊物第WO2012170930(其全部內容以引用方式併入本文)號中所描述之脂質奈米顆粒。

於一實施態樣中，可用於本發明之配製劑中的陽離子性脂質可選自，但不限於下列文獻：國際刊物編號WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865和WO2008103276、美國專利案號7,893,302、7,404,969和8,283,333及美國專利刊物案號US20100036115和US20120202871；各篇之全部內容以引用方式併入本文。於另一實施態樣中，該陽離子性脂質可選自，但不限於描述於下列文獻中之式A：國際刊物編號WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365和WO2012044638；各篇之全部內容以引用方式併入本文。再於另一實施態樣中，該陽離子性脂質可選自，但不限於國際刊物編號WO2008103276之式CLI-CLXXIX、美國專利案號7,893,302之式CLI-CLXXIX、美國專利案號7,404,969之式CLI-CLXXXXII和美國專利刊物US20100036115之式I-VI；各篇之全部內容以引用方式併入本文。再於另一實施態樣中，該陽離子性脂質可為多價陽離子性脂質，諸如授予Gaucheron等人之美國專利案第7223887號中所揭示之陽離子性脂質，其全部內容以引用方式併入本文。該陽離子性脂質可具有帶正電荷之頭基，包括二個季胺基團及包括4個烴鏈之疏水性部分，如授予Gaucheron等人之美國專利案第7223887號(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述者。再於另一實施態樣中，該陽離子性脂質可為如授予Maier等人之US20130195920 (其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之可生物降解的脂質般可生物降解。該陽離子性脂質可具有一或多個位於該陽離子性脂質之脂質部分中的可生物降解的基團，如授予Maier等人之US20130195920(其全部內容以引用方式併入本文)中之式I-IV中所描述者。作為非限制性實例，該陽離子性脂質可選自下列群組：(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十五碳-l6,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-5-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺、(15Z,18Z) -N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十一碳-22,25-二烯-10-胺、(21Z ,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺、(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-胺、(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七碳-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20,23-二烯-l0-胺、1-[(11Z,14Z)-l-壬基二十碳-11,14-二烯-l-基]吡咯啶、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-l0-胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-l0-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-烯-l0-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-l0-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三碳-24-烯-l0-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-l0-胺、(22Z)-N,N-二甲基三十一碳-22-烯-l0-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-l3,16-二烯-l-胺、N,N-二甲基-l-[(lS,2R)-2-辛基環丙基]十七碳-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基環丙基]-N,N-二甲基十九碳-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S ,2R)-2-辛基環丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-21-[(lS,2R)-2-辛基環丙基]二十一碳-l0-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(lR,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十六碳-8-胺、N,N-二甲基-[(lR,2S)-2-十一烷基環丙基]十四碳-5-胺、N,N-二甲基-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]庚基}二十二碳-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基環丙基]-N,N-二甲基十八碳-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基環丙基]-N,N-二甲基十五碳-6-胺、N,N-二甲基-l-[(lS,2R)-2-辛基環丙基]十五碳-8-胺、R-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯啶、(2S)-N,N-二甲基-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-八碳-5-烯-1-基氧基]丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吖丁啶、(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-N,N-二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八碳-6,9,12-三烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z,16Z)-二十碳-l3,16-二烯-l-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六碳-9-烯-1-基氧基]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛基)氧基]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z) 十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N,N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基環丙基]甲基}環丙基]辛基}氧基)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基環丙基)辛基]氧基}-3-(辛氧基)丙-2-胺和(1lE,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-l1,20,2-三烯-10-胺或其醫藥上可接受之鹽或立體異構體。

於一實施態樣中，該脂質可為可裂解之脂質，諸如描述於國際刊物第WO2012170889號(其全部內容以引用方式併入本文)。中者。

於一實施態樣中，本文所描述之奈米顆粒可包含至少一種本文所描述及/或本技藝已知之陽離子聚合物。

於一實施態樣中，該陽離子性脂質可藉由本技藝中已知之方法及/或如國際刊物編號WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724和WO201021865(各篇之全部內容以引用方式併入本文)中所描述之方法合成。

於一實施態樣中，該saRNA之LNP配製劑可含有3%脂質莫耳比之PEG-c-DOMG。於另一實施態樣中，該saRNA之LNP配製劑可含有1.5%脂質莫耳比之PEG-c-DOMG。

於一實施態樣中，該saRNA之醫藥組成物可包括至少一種國際刊物第2012099755號(其全部內容以引用方式併入本文)中描述之聚乙二醇化脂質。

於一實施態樣中，該LNP配製劑可含有PEG-DMG 2000(1,2-二肉荳蔻醯-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。於一實施態樣中，該LNP配製劑可含有PEG-DMG 2000、本技藝中已知之陽離子性脂質和至少一種其他組分。於另一實施態樣中，該LNP配製劑可含有PEG-DMG 2000、本技藝中已知之陽離子性脂質、DSPC和膽固醇。作為非限制性實例，該LNP配製劑可含有PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和膽固醇。作為另一非限制性實例，該LNP配製劑可含有莫耳比為2：40：10：48之PEG-DMG 2000、DLin-DMA、DSPC和膽固醇(參見例如Geall et al., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012；PMID: 22908294；其全部內容以引用方式併入本文)。作為另一非限制性實例，本文所描述之saRNA可依美國刊物第20120207845號(其全部內容以引用方式併入本文)中之描述配製在欲經由腸胃道外途徑遞送之奈米顆粒中。該陽離子性脂質亦可為授予Manoharan等人之US20130156845和授予Manoharan等人之US 20130129785、授予Wasan等人之WO2012047656、授予Chen等人之WO2010144740、授予Ansell等人之WO2013086322或授予Manoharan等人之WO2012016184中所揭示之陽離子性脂質，各篇之全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與多種陽離子性脂質一起配製，諸如授予Hope等人之US20130017223 (其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之第一和第二陽離子性脂質。該第一陽離子性脂質可基於第一屬性選擇，而該第二陽離子性脂質可基於第二屬性選擇，其中該屬性可依US20130017223(其全部內容以引用方式併入本文)中之概述決定。於一實施態樣中，該第一和第二屬性為互補的。

於另一實施態樣中，該saRNA可依授予Cullis等人之US20120276209(其全部內容以引用方式併入本文)中之描述與包含一或多種陽離子性脂質和一或多種第二脂質，及一或多種核酸的脂質顆粒一起配製，其中該脂質顆粒包含固體核心。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可依授予Satishchandran等人之EP2298358(其全部內容以引用方式併入本文)中的描述與在水包油(o/w)乳劑中之陽離子性兩親分子複合。該陽離子性兩親分子可為陽離子性脂質、經修飾或經未修飾之精胺、布比卡因(bupivacaine)或苯扎氯胺(benzalkonium chloride)，且該油可為植物油或動物油。作為非限制性實例，該至少10%之核酸陽離子性兩親分子複合體係在該水包油乳劑中之油相(參見，例如授予Satishchandran等人之歐洲刊物第EP2298358號(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之複合體)。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與包含陽離子性化合物和中性脂質之混合物的組成物一起配製。作為非限制性之實例，該陽離子化合物可為授予Ansell等人之WO 1999010390(其全部內容以引用方式併入本文)中揭示的式(I)，而該中性脂質可選自由下列所組成之群組：二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺和鞘磷脂。

於一實施態樣中，該LNP配製劑可藉由國際刊物第WO2011127255或WO2008103276號(各篇之全部內容以引用方式併入本文)中所描述之方法配製。作為非限制性實例，本發明之saRNA可包封在WO2011127255及/或WO2008103276(各篇之全部內容以引用方式併入本文)中所描述之任何脂質奈米顆粒(LNP)配製劑中。

於一實施態樣中，本文所描述之LNP配製劑可包含聚陽離子性組成物。作為非限制性實例，該聚陽離子性組成物可選自美國專利刊物US20050222064號(其全部內容以引用方式併入本文)中之式1-60。於另一實施態樣中，該包含聚陽離子性組成物之LNP配製劑可用於在體內及/或玻管內遞送本文所描述之saRNA。

於一實施態樣中，本文所描述之LNP配製劑可另外包含滲透性增強分子。非限制性滲透性增強分子描述於美國專利刊物US20050222064號(其全部內容以引用方式併入本文)中。

於一實施態樣中，該醫藥組成物可配製在脂質體中，諸如，但不限於DiLa2脂質體(Marina Biotech, Bothell, WA)、SMARTICLES®/NOV340 (Marina Biotech, Bothell, WA)、基於中性DOPC(1,2-二油醯-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼)之脂質體(例如遞送siRNA以用於治療卵巢癌(Landen et al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713(其全部內容以引用方式併入本文))和經透明質酸塗層之脂質體(Quiet Therapeutics，以色列)。於一些實施態樣中，該醫藥組成物可與授予Panzner之WO2008/043575(其全部內容以引用方式併入本文)和授予Essler等人之US 8580297(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之兩性脂質體配製。該兩性脂質體可包含脂質之混合物，包括陽離子性兩親分子、陰離子性兩親分子和可選擇之一或多個中性兩親分子。該兩性脂質體可包含基於兩親分子之兩性化合物，其頭基被一或多個兩性基團所取代。於一些實施態樣中，該醫藥組成物可與兩性脂質配製，該兩性脂質包含一或多個具有介於4至9之間的等電點之兩性基團，如授予Essler等人之US 20140227345(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示者。

該奈米顆粒配製劑可為包含碳水化合物載體及核酸分子(例如saRNA)之碳水化合物奈米顆粒。作為非限制性實例，該碳水化合物載體可包括，但不限於酸酐改質之植物糖原或糖原型材料，植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改質之植物糖原β-糊精。(參見，例如國際刊物第WO2012109121號；其全部內容以引用方式併入本文)。

脂質奈米顆粒配製劑可藉由以可生物降解之陽離子性脂質替代陽離子性脂質來改善，該可生物降解之陽離子性脂質被稱為快速排除之脂質奈米顆粒(reLNP)。可離子化之陽離子性脂質(諸如，但不限於DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA)已被證明會隨時間累積在血漿和組織，且可為毒性之潛在來源。快速代謝該被快速排除之脂質粒可改善該脂質奈米顆粒從1mg/kg劑量至10 mg/kg劑量在大鼠中之耐受性和治療指數達一個數量級。包含經酶催化降解之酯鍵聯可改善該陽離子組分之降解和代謝變化形廓，同時仍然保持該reLNP配製劑之活性。該酯鍵聯可位於脂質鏈內部，或者其可位於脂質鏈之末端。內部酯鍵聯可替代脂質鏈中之任何碳。

於一實施態樣中，該saRNA可被配製成脂質複合體，諸如，但不限於ATUPLEX^TM 系統、DACC系統、DBTC系統及來自Silence Therapeutics(倫敦，英國)、來自STEMGENT®(劍橋，麻薩諸塞州)之STEMFECT^TM 和聚乙烯亞胺(PEI)或基於魚精蛋白之靶向和非靶向遞送核酸的其他siRNA-脂質複合體技術(Aleku et al. Cancer Res. 2008 68:9788-9798；Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78；Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234；Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370；Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344；Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293；Weide et al. JImmunother. 2009 32:498-507；Weide et al. J Immunother. 2008 31:180-188；Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294；Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15；Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717；Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 6；104:4095-4100；deFougerollesHum Gene Ther. 2008 19:125-132；各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，亦可構建該等配製劑或改變組成使其在體內被動或主動地針對不同的細胞類型，包括，但不限於肝細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、抗原呈遞細胞和白血球(Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364；Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717；Judge et al., J Clin Invest. 2009 119:661-673；Kaufmann et al., Microvasc Res 2010 80:286-293；Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234；Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370；Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344；Basha et al., Mol. Ther. 2011 19:2186-2200；Fenske and Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:25-44；Peer et al., Science. 2008 319:627-630；Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133；各篇之全部內容以引用方式併入本文)。一種將配製劑被動靶向肝細胞之實例包括基於DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA之脂質奈米顆粒配製劑，該脂質奈米顆粒配製劑已被證明與載脂蛋白E結合並促進這些配製劑在活體內與肝細胞結合及攝入肝細胞(Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364；其全部內容以引用方式併入本文)。配製劑亦可透過令不同配體在其表面上表現而選擇性地靶向，舉例而言，但不限於葉酸鹽、轉鐵蛋白、N-乙醯基半乳糖胺及抗體靶向之方法(Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206；Musacchio and Torchilin,Front Biosci. 2011 16:1388-1412；Yu et al., Mol Membr Biol. 2010 27:286-298；Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61；Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714；Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319；Akinc et al., Mol Ther. 2010 18:1357-1364；Srinivasan et al., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116；Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507；Peer 2010 J Control Release. 20:63-68；Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:4095-4100；Kim et al., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353；Subramanya et al., Mol Ther. 2010 18:2028-2037；Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717；Peer et al., Science. 2008 319:627-630；Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133；各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該saRNA被配製成固體脂質奈米顆粒。固體脂質奈米顆粒(SLN)可為其平均直徑介於10至1000nm之間的球形。SLN具有固體脂質核心基質，其可溶解親脂性分子並可以表面活性劑及/或乳化劑穩定之。於進一步之實施態樣中，該脂質奈米顆粒可為自組裝之脂質-聚合物奈米顆粒(參見Zhang et al., ACS Nano, 2008, 2 (8), pp 1696–1702；其全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可被配製成經控制釋出及/或靶向遞送。如本文所使用之“經控制釋出”係指符合特定之釋出模式以得到治療效果之醫藥組成物或化合物釋出變化形廓。於一實施態樣中，該saRNA可被包封在本文所描述及/或本技藝中已知之用於控制釋出及/或靶向遞送的遞送劑中。如本文所使用之術語“包封”係指圍住、包圍或包住。當與本發明之化合物的配製劑有關時，包封可為實質上的、完全或部分的。術語“實質上包封”係指至少多於50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9或多於99.999%之本發明的醫藥組成物或化合物可能被圍在、包圍或包在該遞送劑內。“經部分包封的”係指廣於10、10、20、30、40、50或更少之本發明的醫藥組成物或化合物可能被圍在、包圍或包在該遞送劑內。有利的是，包封可藉由使用螢光及/或電子顯微照片測量本發明之醫藥組成物或化合物的逃逸情形或其活性來確定。例如，至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或多於99.99%之本發明之醫藥組成物或化合物被包封在遞送劑內。

於另一實施態樣中，該saRNA可以被包封在脂質奈米顆粒或快速排除型脂質奈米顆粒中，然後，該脂質奈米顆粒或快速排除型脂質奈米顆粒可被包封在本文所描述及/或本技藝已知之聚合物、水凝膠及/或手術密封劑中。作為非限制性實例，該聚合物、水凝膠或外科密封劑可為PLGA、乙烯醋酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆(poloxamer)、GELSITE®(Nanotherapeutic公司，佛羅里達州Alachua)、HYLENEX®(Halozyme治療公司，加州聖地牙哥)、外科密封劑，諸如纖維蛋白原聚合物(Ethicon公司，加州Cornelia)、TISSELL®(Baxter國際公司，伊利諾州迪爾菲爾德)、基於PEG之密封劑和COSEAL®(Baxter國際公司，伊利諾州迪爾菲爾德)。

於另一實施態樣中，該脂質奈米顆粒可被包封入本技藝中已知之任何聚合物，該聚合物在被注射入個體時可形成凝膠。作為另一非限制性實例，該脂質奈米顆粒可被包封入可能為生物可降解之聚合物基質中。

於一實施態樣中，該用於控制釋出及/或靶向遞送之saRNA配製劑亦可包括至少一種控制釋出之塗層。控制釋出之塗層包括，但不限於OPADRY®、聚乙烯基吡咯啶酮/醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、EUDRAGIT RL®、EUDRAGIT RS®和纖維素衍生物，諸如乙基纖維素水性分散液(AQUACOAT®和SURELEASE®)。

於一實施態樣中，該經控制釋出及/或靶向遞送之配製劑可包含至少一種可降解之聚酯，該聚酯可含有聚陽離子性側鏈。可降解之聚酯包括，但不限於聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及彼等之組合。於另一實施態樣中，該可降解之聚酯可包括PEG軛合物以形成聚乙二醇化之聚合物。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與具有靶向部分(諸如授予Manoharan等人之US20130202652中所揭示之靶向部分，該US20130202652之全部內容以引用方式併入本文)之靶向脂質一起配製。作為非限制性實例，可選擇授予Manoharan等人之US20130202652的式I之靶向部分以有利於該脂質局部定位在理想之器官、組織、細胞、細胞類型或亞型、或細胞器。本發明所考量之非限制性靶向部分包括轉鐵蛋白、茴香醯胺、RGD肽、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、岩藻糖、抗體、或適體。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可被包封在治療性奈米顆粒中。治療性奈米顆粒可藉由本文所描述和本技藝已知之方法配製，諸如，但不限於國際刊物編號WO2010005740、WO2010030763、WO2010005721、WO2010005723、WO2012054923、US刊物編號US20110262491、US20100104645、US20100087337、US20100068285、US20110274759、US20100068286和US20120288541及美國專利編號8,206,747、8,293,276、8,318,208和8,318,211；各篇之全部內容以引用方式併入本文。於另一實施態樣中，治療性聚合物奈米顆粒可藉由US刊物第US20120140790號(其全部內容以引用方式併入本文)中描述的方法鑑定。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可配製成用於持續釋出。如本文所使用之“持續釋出”係指在特定之期間內遵照釋出速率釋出的醫藥組成物或化合物。該期間可包括，但不限於幾小時、幾天、幾週、幾個月、甚至幾年。作為非限制性實例，該持續釋出之奈米顆粒可包含聚合物和治療劑，諸如，但不限於本發明之saRNA(參見國際刊物編號2010075072和美國刊物編號US20100216804、US20110217377和US20120201859(各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可配製成靶的特異性。作為非限制性實例，該治療性奈米顆粒可包括皮質類固醇(參見國際刊物第WO2011084518號；其全部內容以引用方式併入本文)。於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可被配製成癌症特異性。作為非限制性實例，該治療性奈米顆粒可配製在國際刊物編號WO2008121949、WO2010005726、WO2010005725、WO2011084521和美國刊物編號US20100069426、US20120004293和US20100104655(各篇之全部內容以引用方式併入本文)中所描述之奈米顆粒中。

於一實施態樣中，本發明之奈米顆粒可包含聚合物基質。作為非限制性實例，該奈米顆粒可包含二或更多種聚合物，例如，但不限於聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羥基酸、聚丙基富馬酸酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或彼等之組合。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒包括二嵌段共聚物。於一實施態樣中，該二嵌段共聚物可包括PEG與聚合物之組合，該聚合物為諸如，但不限於聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羥基酸、聚丙基富馬酸酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙烯亞胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或彼等之組合。

作為非限制性實例，該治療性奈米顆粒包含PLGA-PEG嵌段共聚物(參見美國刊物案號US20120004293和美國專利案號8,236,330，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。於另一非限制性實例中，該治療性奈米顆粒為隱形奈米顆粒，其包含PEG和PLA或PEG和PLGA之二嵌段共聚物(參見美國專利案號8,246,968和國際刊物編號WO2012166923，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可包含多嵌段共聚物，諸如，但不限於美國專利案號8,263,665和8,287,910中所描述之多嵌段共聚物；各篇之全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，本文所描述之嵌段共聚物可被包含在聚離子複合體中，該聚離子複合體包含非聚合體型膠束和嵌段共聚物。(參見，例如美國刊物案號20120076836；其全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可包含至少一種丙烯酸類聚合物。丙烯酸類聚合物包括，但不限於丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙氧乙基甲基丙烯酸酯、氰乙基甲基丙烯酸酯、胺烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及彼等之組合。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可包含至少一種含胺聚合物，諸如，但不限於聚離胺酸、聚乙烯亞胺、聚(醯胺基胺)樹枝狀聚合物、聚(β-胺基酯)(參見，例如美國專利案號8,287,849；其全部內容以引用方式併入本文)和彼等之組合。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可包含至少一種可降解之聚酯，該可降解之聚酯可含有聚陽離子性側鏈。可降解之聚酯包括，但不限於聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及彼等之組合。於另一實施態樣中，該可降解之聚酯可包括PEG軛合，以形成聚乙二醇化之聚合物。

於另一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可包括具有至少一個靶向配體之軛合物。該靶向配體可為本技藝已知之任何配體，諸如，但不限於單株抗體。(Kirpotin et al,Cancer Res 2006 66：6732-6740；其全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該治療性奈米顆粒可配製在水溶液中，其可用於靶向癌症(參見國際刊物第WO2011084513號和美國刊物第US20110294717號，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該saRNA可被包封在合成性奈米載體、連接合成性奈米載體及/或與合成性奈米載體聯結。合成性奈米載體包括，但不限於那些描述於國際刊物編號WO2010005740、WO2010030763、WO201213501、WO2012149252、WO2012149255、WO2012149259、WO2012149265、WO2012149268、WO2012149282、WO2012149301、WO2012149393、WO2012149405、WO2012149411、WO2012149454和WO2013019669、以及美國刊物編號US20110262491、US20100104645、US20100087337和US20120244222(各篇之全部內容以引用方式併入本文)中者。該合成性奈米載體可使用本技藝中已知及/或本文中所描述之方法配製。作為非限制性實例，該合成性奈米載體可藉由國際刊物編號WO2010005740、WO2010030763和WO201213501及美國刊物編號US20110262491、US20100104645、US20100087337和US2012024422(各篇之全部內容以引用方式併入本文)中描述之方法配製。於另一實施態樣中，該合成性奈米載體配製劑可藉由國際刊物編號WO2011072218和美國專利案號8,211,473 (各篇之全部內容以引用方式併入本文)中描述之方法凍乾。

於一實施態樣中，該合成性奈米載體可含有反應性基團以釋出本文所描述之saRNA (參見國際刊物編號WO20120952552和美國刊物編號US20120171229，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該合成性奈米載體可被配製成用於靶向釋出。於一實施態樣中，該合成性奈米載體可被配製成在指定之pH值及/或所需之期間之後釋出saRNA。作為非限制性實例，該合成性奈米顆粒可被配製成在24小時後及/或在pH為4.5下釋出saRNA (參見國際刊物第WO2010138193和WO2010138194號和美國刊物第US20110020388和US20110027217號，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，該合成性奈米載體可被配製成用於控制及/或持續釋出本文所描述之saRNA。作為非限制性實例，該用於持續釋出之合成的奈米載體可藉由本技藝中已知、本文所描述及/或如國際刊物第WO2010138192號和US刊物第20100303850號中之方法配製，各篇之全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，該奈米顆粒可經優化以用於口服投予。該奈米顆粒可包含至少一種陽離子性生物聚合物，諸如，但不限於殼聚醣或其衍生物。作為非限制性實例，該奈米顆粒可藉由美國刊物編號20120282343中描述之方法配製；其全部內容以引用方式併入本文。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可配製成諸如授予Manoharan等人之US 8575123(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之模塊化組成物。作為非限制性實例，該模塊化組成物可包含核酸，例如本發明之saRNA、至少一種胞內體裂解組分和至少一個靶向配體。該模塊化組成物可具有諸如授予Manoharan等人之US 8575123(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述的任何化學式。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可被包封在脂質配製劑中以形成穩定之核酸-脂質顆粒(SNALP)，諸如授予de Fougerolles等人之US8546554(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述者。該脂質可為陽離子或非陽離子性。於一非限制性實例中，該脂質對核酸之比例(質量/質量比)(例如脂質對saRNA之比例)將在下列範圍內：約1：1至約50：1、約1：1至約25：1、約3：1至約15：1、約4：1至約10：1、約5：1至約9：1、或約6：1至約9：1、或5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、或11：1。於另一實例中，該SNALP包括40%之2,2-二亞油醯-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(脂質A)、10%二油醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、40%膽固醇、10%聚乙二醇 (PEG)-C-DOMG(莫耳%)，其具有63.0±20nm之粒徑和0.027核酸/脂質比。於另一實施態樣中，本發明之saRNA可與核酸-脂質顆粒一起配製，該核酸-脂質顆粒包含如授予Lam等人之US 7189705(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示的胞內體膜去穩定劑。作為非限制性實例，該胞內體膜去穩定劑可為Ca²⁺ 離子。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與授予Akine等人之US8148344(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之配製的脂質顆粒(FLiP)一起配製。Akine等人教導FLiP可包含至少一個單股或雙股寡核苷酸(其中該寡核苷酸已與親脂劑軛合)和至少一種乳劑或脂質體(該經軛合之寡核苷酸已聚集在該乳劑或脂質體中、與該乳劑或脂質體混合或聯結)。令人驚訝地，授予Akine等人之US8148344(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之這些顆粒已被證明能有效地將寡核苷酸遞送至心臟、肺和肌肉。

於一些實施態樣中，本發明之saRNA可藉由病毒載體(諸如腺病毒或腺相關病毒(AAV)載體)遞送。於一實施態樣中，本發明之saRNA可使用如授予Tam等人之US 6086913(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之組成物遞送至細胞，該組成物包含在脂質配製劑中之表現載體。Tam所揭示之組成物為血清穩定性且包含表現載體，該表現載體包含來自腺相關病毒(AAV)之第一和第二倒置的重複序列、來自AAV之rep基因及核酸片段。Tam中之表現載體係與脂質複合。於另一實施態樣中，授予Fox等人之US 20140249209中所揭示之任何AAV載體可用於遞送本發明之saRNA。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與授予deFougerolles等人之US 20120270921(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之脂質配製劑一起配製。於一非限制性實例中，該脂質配製劑可包括US 20120270921(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之式A的陽離子性脂質。於另一非限制性實例中，US 20120270921(其全部內容以引用方式併入本文)之表A中所揭示的示例性核酸-脂質顆粒之組成物可與本發明之saRNA一起使用。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可被完全包封在授予Maurer等人之US 20120276207(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示的脂質顆粒中。該顆粒可包含脂質組成物，該脂質組成物包含預先形成之脂質囊泡、帶電荷之治療劑和去穩定劑以形成預成形之囊泡和在去穩定化溶劑中之治療劑的混合物，其中該去穩定化溶劑能有效將預形成之脂質囊泡膜去穩定化而不破壞囊泡。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與經軛合之脂質一起配製。於一非限制性實例中，該經軛合之脂質可具有授予Lin等人之US 20120264810(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述化學式。該軛合物脂質可形成脂質顆粒，該脂質顆粒進一步包含陽離子性脂質、中性脂質和能夠減少聚集之脂質。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可配製在中性脂質體配製劑中，諸如授予Fitzgerald等人之US 20120244207(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示者。短語“中性脂質體配製劑”係指在生理pH值下具有接近中性或中性表面電荷之脂質體配製劑。生理pH可為，例如約7.0至約7.5、或例如約7.5、或例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、或7.5、或例如7.3，或例如7.4。中性脂質體配製劑之實例為可離子化之脂質奈米顆粒(iLNP)。中性脂質體配製劑可包括可離子化陽離子性脂質，例如DLin-KC2-DMA。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與帶電荷之脂質或胺基脂質一起配製。如本文所使用之術語“帶電荷之脂質”意圖包括具有一或二個脂族醯基或脂族烷基鏈和季胺基頭基的那些脂質。季胺攜帶永久正電荷。頭基可選擇性地包括一個可離子化基團，諸如可在生理pH下被質子化之一級、二級或三級胺。該三級胺之存在可相對於該缺乏季胺(例如季胺被三級胺取代)之結構上相似之化合物中的基團之pKa改變該可離子化之基團的pKa。於一些實施態樣中，帶電荷之脂質被稱為“胺基脂質”。於一非限制性實例中，該胺基脂質可為授予Hope等人之US20110256175(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之胺基脂質。例如，該胺基脂質可具有如授予Hope等人之US20110256175(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之結構(II)，DLin-K-C2-DMA，DLin-K2-DMA，DLin-K6-DMA之結構。於另一實例中，該胺基脂質可具有如授予Muthiah等人之WO2009132131(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之結構(I)，(II)，(III)，或(IV)，或4-(R)-DUn-K-DMA(VI)，4-(S)-DUn-K-DMA(V)。於另一實例中，用於本文所描述之任何配製劑中的帶電荷之脂質可為授予Manoharan等人之EP2509636(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之任何帶電荷之脂質。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與含有脂質、脂質體或脂質複合物之締合複合體一起配製。於一非限制性實例中，該締合複合體包含一或多種各自具有由式(I)定義之結構的化合物、具有式(XV)定義之結構的PEG-脂質、類固醇和揭示於授予Manoharan等人之US8034376 (其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之核酸。該saRNA可與US8034376(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之任何締合複合體一起配製。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可與反向頭基脂質一起配製。作為非限制性實例，該saRNA可與包含頭基之兩性離子脂質一起配製，其中該正電荷位於靠近該醯基鏈區，而負電荷位於該頭基遠端，諸如授予Leung等人之WO2011056682(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之具有結構(A)或結構(I)之脂質。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可配製在脂質雙層載體中。作為非限制性實例，該saRNA可與包含脂質混合物(莫具有約5 mol%至約20 mol%之量的防聚集劑、約0.5 mol%至約50 mol%之量的陽離子性脂質和融合脂質)及洗滌劑之脂質洗滌劑混合物組合，以提供核酸-脂質洗滌劑混合物；然後將該核酸-脂質洗滌劑混合物對緩衝之鹽溶液透析以去除該洗滌劑，並將該核酸包封在脂質雙層載體中以提供脂質雙層-核酸組成物，其中該經緩衝之鹽溶液具有足以包封約40%至約80%之該核酸的離子強度(如授予Cullis等人之WO1999018933中所描述者，其全部內容以引用方式併入本文)。

於一實施態樣中，本發明之saRNA可配製在能夠選擇性地將saRNA靶向心臟、肝或腫瘤組織部位的核酸-脂質顆粒中。例如，該核酸-脂質顆粒可包含(a) 核酸；(b) 1.0 mol%至45 mol%之陽離子性脂質；(c) 0.0 mol%至90 mol%之另一脂質；(d) 1.0 mol%至10 mol%之雙層穩定化組分；(e) 0.0 mol%至60 mol%之膽固醇；及(f) 0.0 mol%至10 mol%之陽離子性聚合物脂質(如授予Cullis等人之EP1328254中所描述者，其全部內容以引用方式併入本文)。Cullis教導改變該陽離子性脂質、雙層穩定化組分、另一脂質、膽固醇和陽離子性聚合物脂質各項的量可賦予對心臟、肝臟或腫瘤組織部位之組織選擇性，從而鑑定能夠選擇性地將該核酸靶向心臟、肝臟或腫瘤組織部位的核酸-脂質顆粒。

遞送

本發明包含藉由任何被考慮可能促進藥物遞送科學之適當途徑遞送saRNA，、以用於任何治療、藥物、診斷或成像。遞送可為裸出的或經配製的。

本發明之saRNA可以裸出形式遞送至細胞。如本文所使用者，“裸出的”係指遞送saRNA時不含有促進轉染之作用劑。例如，遞送至細胞之saRNA可不含有任何修飾。該裸出之saRNA可使用本技藝已知和本文所描述之投予途徑遞送到細胞。

本發明之saRNA可使用本文描述之方法配製。該配製劑可含有可能經修飾及/或未經修飾之saRNA。該配製劑可進一步包括，但不限於細胞滲透劑、醫藥上可接受之載體、遞送劑、可生物蝕解或生物相容之聚合物、溶劑和持續釋出遞送貯庫。該經配製之saRNA可使用本技藝已知和本文描述之投予途徑被遞送到細胞。

該組成物亦可被配製成以本技藝之多種方式其中任一者直接遞送至器官或組織，該遞送方式包括，但不限於經由導管直接浸泡或浸入、藉由凝膠、粉末、軟膏、乳膏、凝膠、乳劑及/或滴劑、藉由使用塗覆或灌輸該組成物之底物(諸如織物)或可生物降解材料，等。本發明之saRNA亦可被選殖入逆轉錄病毒複製載體(RRV)並轉導入細胞中。

投予

本發明之saRNA可藉由導致治療有效結果之任何途徑投予。這些包括，但不限於腸內、胃腸道、硬膜外、口服、經皮、硬膜外(epidural)(peridural)、腦內(進入大腦)、腦室內(進入腦室)、表皮(施用在皮膚上)、皮內(進入皮膚本身)、皮下(在皮膚下)、經鼻投予(通過鼻子)、靜脈內(進入靜脈)、動脈內(進入動脈)、肌肉內(進入肌肉)、心內(進入心臟)、骨內輸注(進入骨髓)、鞘內(進入椎管)、腹膜內(輸注或注射入腹膜)、膀胱內輸注、玻璃體內(通過眼睛)、海綿體內注射(進入陰莖基部)、陰道內投予、子宮內、羊膜外投予、經皮(通過完整的皮膚擴散以分佈至全身)、經黏膜(通過黏膜擴散)、注氣法(鼻子吸入)、舌下、唇下、灌腸、眼滴劑(在結膜上)、或在耳滴劑中。於特定之實施態樣中，組成物可以允許它們穿過血-腦屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式投予。2012年12月14日提交之國際刊物WO2013/090648(其全部內容以引用方式併入本文)中所揭示之投予途徑可用來投予本發明之saRNA。

劑型

本文所描述之醫藥組成物可配製成本文所描述之劑型，諸如局部、鼻內、氣管內或可注射(例如靜脈內、眼內、玻璃體內、肌內、心內、腹膜內、皮下)劑型。2012年12月14日提交之國際刊物WO2013/090648(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之液體劑型、可注射製劑、肺劑型及固體劑型可作為用於本發明之saRNA的劑型。

II. 使用方法

本發明之一種態樣提供使用HNF4a-saRNA及包含該HNF4a-saRNA和至少一種醫藥上可接受之載體的醫藥組成物之方法。HNF4a-saRNA調控HNF4a基因表現。於一實施態樣中，與無本發明之saRNA存在時HNF4a基因之表現相比較，在本發明之saRNA的存在下，HNF4a基因之表現增加至少20%、30%、40%，更佳為至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%，再更佳為至少80%。於更佳之實施態樣中，與無本發明之saRNA存在時HNF4a基因之表現相比較，在本發明之saRNA的存在下，HNF4a基因之表現增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更佳為至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，再更佳為至少60、70、80、90、100倍。

數種HNF4a之剪接變體係經由二個可輪替之啟動子(近端啟動子P1和遠端啟動子P2)和二次不同的3’剪接事件產生。P1驅動之HNF4a蛋白(HNF4a P1)和P2驅動之HNF4a蛋白(HNF4a P2)扮演不同的功能角色。據報導，癌症中之HNF4a P1被下調，HNF4a P2被上調(Vuong et al.,Molecular and Cellular Biology , vol.35：3471 (2015))。Vuong等人發現HNF4a P1抑制結腸癌細胞株中之腫瘤生長，而HNF4a P2不會。HNF4a P1上調參與生長抑制和細胞死亡之基因，而HNF4α P2上調參與細胞增殖和抗細胞凋亡之基因。因此，理想的情況是增加HNF4a P1濃度，而非HNF4a P2濃度。

於一些實施態樣中，本申請案之HNF4a-saRNA增加HNF4a P1表現。於一些實施態樣中，本申請案之HNF4a-saRNA不會增加HNF4a P2表現。

於一實施態樣中，在增殖之細胞中顯示出本文所描述之saRNA的基因表現增加。

代謝物調節

肝細胞通常被認為對維持數種重要功能而言是重要的。例如，它們可調節碳水化合物和脂質代謝並將外源性和內源性化合物解毒。HNF4a 表現在各種組織中，其中HNF4a在許多細胞類型之分化中具有重要作用。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)為重要的全球健康問題並影響美國三分之一的人口。NAFLD為在肝臟細胞中積聚額外之脂肪(脂質)，此種脂肪積聚並非由過度使用酒精所引起。若超過5%-10%之肝臟重量為脂肪，則稱為脂肪肝(脂肪變性(steatosis))。NAFLD可進展為脂肪性肝炎(steatoheptitis)、硬化和肝癌。其與代謝失調有關，諸如代謝症候群、胰島素抗性、第II型糖尿病、高脂血症、高血壓、肥胖，等。治療方法包括降低低密度脂蛋白(LDL)膽固醇濃度、改善胰島素敏感性、治療代謝危險因素、減肥，等。[Adams et al.,Postgraduate Medical Journal, vol. 82, 315-322 (2006)；Musso et al.,Curr. Opin. Lipidol., vol. 22(6), 489-496 (2011)，其全部內容以引用方式併入本文]。

HNF4a蛋白在調節肝功能和代謝物中具有重要作用。於一實施態樣中，提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療以在玻管內和活體內調節肝臟代謝基因之方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療以在玻管內和活體內調節參與NAFLD之肝臟基因的方法。該基因包括，但不限於固醇調節元素結合因子1(SREBF-1或SREBF)、分化簇36(CD36)、乙醯輔酶A羧化酶2(ACACB)、載脂蛋白C-III(APOC3)、微粒體三酸甘油脂轉運蛋白(MTP)、過氧化物酶體增殖劑激活之受體γ共激活因子1α(PPARγCoA1α或PPARGC1A)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、過氧化物酶體增殖劑激活之受體γ共激活因子1β(PPARγ-CoA1β或PERC)、過氧化物酶體增殖劑激活之受體γ(PPARγ)、乙醯輔酶A羧化酶1(ACACA)、碳水化合物反應性元素結合蛋白(ChREBP基因或MLX1PL)、過氧化物酶體增殖劑激活之受體α(PPARα或PPARA)、FASN(脂肪酸合成酶)、二酸甘油脂醯基轉移酶-2(DGAT2)和雷帕黴素(mTOR)之哺乳動物靶的。

可以HNF4a-saRNA調控之NAFLD和IR基因的概述顯示於表2中。表2中之縮寫：NAFLD：非酒精性脂肪肝病；IR：胰島素抗性；DNL：重新生成脂肪；FA：脂肪酸；TG：三酸甘油酯；LPL：脂蛋白脂肪酶；HP：肝脂肪酶；CHOL：膽固醇

表 2 可以 HNF4a-saRNA 調控之 NAFLD 和 IR 基因

表 2 可以 HNF4a-saRNA 調控之 NAFLD 和 IR 基因 ( 續 )

於本發明之一實施態樣中，提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來降低血清膽固醇濃度之方法。與未治療之血清膽固醇濃度相比較，使用HNF4a-saRNA可將血清膽固醇濃度降低至少25%，較佳為50%，更佳為75%。亦提供藉由投予本發明之HNF4a-saRNA來降低肝細胞中之LDL和三酸甘油酯濃度並增加活體內LDL之循環濃度的方法。與無HNF4a-saRNA存在時之循環LDL濃度相比較，該循環LDL濃度可增加至少2倍、較佳為3倍、較佳為4倍、較佳為5倍、較佳為10倍、較佳為15倍。與無HNF4a-saRNA存在時之肝臟三酸甘油酯濃度相比較，該肝臟三酸甘油酯濃度可降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、或70%。與無HNF4a-saRNA存在時之肝臟LDL濃度相比較，該肝臟LDL濃度可降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、或70%。亦提供藉由投予本發明之HNF4a-saRNA來降低活體內之血清葡萄糖濃度的方法。與無HNF4a-saRNA存在時之血清葡萄糖濃度相比較，該血清葡萄糖濃度可降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、或70%。

於本發明之一實施態樣中，提供藉由對有此需要之患者投予本發明之HNF4a-saRNA來治療NAFLD並減少脂肪肝尺寸之方法。與未經治療之患者相比較，以HNF4a-saRNA治療之患者的脂肪肝尺寸減少至少10%、20%、30%、40%、或50%。亦提供藉由對有此需要之患者投予本發明之HNF4a-saRNA來減輕體重和治療肥胖症的方法。與未以HNF4a-saRNA治療之患者的體重相比較，以HNF4a-saRNA治療之患者的體重減輕至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、或70%。本發明之HNF4a-saRNA可在1個劑量、2個劑量、3個劑量或更多個劑量中投予。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來減少肝臟攝取游離脂肪酸之方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來減少白脂肪組織(WAT)炎症的方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來減少從頭生成脂肪之方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來增加肝臟中之β-氧化作用的方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來增加肝臟中之棕色脂肪組織(BAT)的方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來減少肝臟脂質攝取之方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來減少WAT中脂肪生成之方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來減少脂質儲存在肝臟的方法。亦提供藉由本發明之HNF4a-saRNA進行治療來降低肝臟中脂質超載的方法。

於另一實施態樣中。本發明之HNF4a-saRNA係用於增加肝功能。於一非限制性實例中，HNF4a-saRNA增加白蛋白基因表現並藉此增加血清白蛋白和未經軛合之膽紅素濃度。與無本發明之saRNA存在時白蛋白基因之表現相比較，在本發明之saRNA的存在下，白蛋白基因之表現可增加至少20%、30%、40%，更佳為至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%，再更佳為至少80%。於更佳之實施態樣中，與無本發明之saRNA存在時白蛋白基因之表現相比較，在本發明之saRNA的存在下，白蛋白基因之表現增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更佳為至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，再更佳為至少60、70、80、90、100倍。於另一非限制性實例中，HNF4a-saRNA降低丙胺酸轉胺酶(ALT)、天門冬胺酸轉胺酶(AST)、γ麩胺醯轉肽酶(GGT)、α胎兒蛋白(AFP)和肝細胞生長因子(HGF)之量。與無本發明之saRNA存在時ALT、AST、GGT、AFP或HGF任一者之量相比較，在本發明之saRNA的存在下，ALT、AST、GGT、AFP或HGF任一者之量可減少至少20%、30%、40%，更佳為至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%，再更佳為至少80%。

外科護理

肝切除術、手術切除肝臟或肝組織可能引起肝功能衰竭、減少白蛋白和凝血因子產生。肝切除術後需要正確的手術護理。於一些實施態樣中，本發明之HNF4a-saRNA可在肝切除術後用於外科護理以促進肝再生和增加存活率。於一些實施態樣中，本發明之HNF4a-saRNA係用於治療肝功能衰竭、肝纖維化或急性肝功能衰竭。

過度增殖病症

於本發明之一實施態樣中，本發明之HNF4a-saRNA係用於減少過度增殖性細胞之細胞增殖。過度增殖性細胞之實例包括癌性細胞，例如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤和母細胞瘤。該等癌性細胞可為良性或惡性。過度增殖性細胞可能由自體免疫病況(諸如類風濕性關節炎、炎性腸病或牛皮癬)導致。過度增殖性細胞亦可能在患者體內之過敏免疫系統與過敏原接觸時產生。該等牽涉過敏免疫系統之病況包括，但不限於氣喘、過敏性鼻炎、濕疹和過敏性反應，諸如過敏性過敏反應。於一實施態樣中，腫瘤細胞發展及/或生長受到抑制。於一較佳之實施態樣中，實體瘤細胞之增殖受到抑制。於另一較佳之實施態樣中，腫瘤細胞之轉移被阻止。於另一較佳之實例中，未分化之腫瘤細胞增殖受到抑制。

抑制細胞增殖或減少增殖意指增殖被減少或完全停止。因此，“減少增殖”為“抑制增殖”的一種實施態樣。與以本發明之saRNA治療前該細胞之增殖情況相比較，或與同等之未經處理的細胞之增殖情況相比較，在本發明之saRNA的存在下，細胞增殖減少至少20%、30%或40%，或較佳為至少45、50、55、60、65、70或75%，甚至更佳為至少80、90或95%。在其中過度增殖性細胞中的細胞增殖被抑制的實施態樣中，該“同等”細胞亦為過度增殖細胞。於較佳之實施態樣中，增殖速率被降低至與該同等之健康(非過度增殖)細胞的增殖速率相當。從另一方面來看，“抑制細胞增殖”之較佳實施態樣為抑制過度增殖或調控細胞增殖至達到正常、健康之增殖濃度。

於一非限制性實例中，HNF4a-saRNA係用於減少白血病和淋巴瘤細胞增殖。較佳地，該細胞包括Jurkat細胞(急性T細胞淋巴瘤細胞株)、K562細胞(紅白血病細胞株)、U373細胞(膠質母細胞瘤細胞株)和32Dp210細胞(髓樣白血病細胞株)。

於另一非限制性實例中，HNF4a-saRNA係用於減少卵巢癌細胞、肝癌細胞、胰臟癌細胞、乳癌細胞、前列腺癌細胞、大鼠肝癌細胞和胰島瘤細胞增殖。較佳地，該細胞包括PEO1和PEO4(卵巢癌細胞株)、HepG2(肝細胞癌細胞株)、Panc1(人胰臟癌細胞株)、MCF7(人乳腺癌細胞株)、DU145(人轉移性前列腺癌細胞株)、大鼠肝癌細胞及MIN6(大鼠胰島瘤細胞株)。

於一實施態樣中，本發明之saRNA係用於治療過度增殖性疾病。腫瘤和癌症代表特別重要之過度增殖性病症，包括所有類型之腫瘤和癌症，例如包括實體瘤和血液癌症。癌症之實例包括，但不限於子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、膽囊癌、肝癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌、胃腸癌、乳癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌、非小細胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病(諸如急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病和慢性髓細胞性白血病)、腦癌(例如星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤)、神經母細胞瘤、肉瘤、結腸癌、直腸癌、胃癌、肛門癌、膀胱癌、子宮內膜癌、漿細胞瘤、淋巴瘤、視網膜母細胞瘤、威爾姆氏瘤(Wilm’s tumor)、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、黑色素瘤和其他皮膚癌。肝癌可包括，但不限於膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤或肝細胞癌(HCC)。HCC為特別重要的。

原發性肝癌為全世界排名第五之最常見的癌症和第三名之癌症相關死亡最常見的原因。HCC代表絕大多數之原發性肝癌[El-Serag et al.,Gastroenterology, vol. 132(7), 2557-2576 (2007)，其全部內容以引用方式併入本文]。HCC受數種涉及癌細胞生物學、免疫系統和不同病因(病毒、毒性和一般)之因子的交互作用影響。大多數HCC患者從肝硬化之背景發展出惡性腫瘤。目前，大多數患者確診時已在末期，因此大多數HCC患者之5年生存率仍然很低。手術切除、局部區域消融和肝移植為目前可能治癒HCC的唯一治療選擇。然而，根據對個體肝功能和腫瘤負荷之評估，僅約5-15%之患者有資格進行手術干預。本發明利用HNF4a-saRNA來調控HNF4a基因之表現及治療肝硬化和HCC。

本發明之方法可將腫瘤體積減少至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。較佳地，一或多種新腫瘤之發展受抑制，例如根據本發明治療之個體發展出較少及/或較小之腫瘤。較少之腫瘤意味在設定之期間內發展出較同等個體少數之腫瘤。例如，該個體較同等對照組(未治療)個體少發展出1、2、3、4或5個腫瘤。較小之腫瘤係指該腫瘤之重量及/或體積較同等個體之腫瘤的重量及/或體積小至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。本發明之方法減輕腫瘤負荷至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%。

該設定之期間可為任何合適之期間，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個月或幾年。

於一非限制性實例中，提供治療未分化之腫瘤的方法，其包含令細胞、組織、器官或個體與本發明之HNF4a-saRNA接觸。與已分化者相比較，未分化之腫瘤一般預後較差。由於腫瘤之分化程度與預後有關，所以假設分化生物製劑之用途可能為有益之抗增殖藥物。可以 HNF4a-saRNA治療之未分化的腫瘤包括未分化之小細胞肺癌、未分化之胰臟腺癌、未分化之人類胰臟癌、未分化之人類轉移性前列腺癌和未分化之人類乳癌。

於一實施態樣中，使用HNF4a-saRNA來調節致癌基因和腫瘤抑制基因。較佳地，癌基因之表現可被下調。與無本發明之HNF4a-saRNA存在時的癌基因表現相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該癌基因之表現降低至少20、30、40%，更佳為至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%。於進一步之較佳的實施態樣中，與無本發明之HNF4a-saRNA存在時的癌基因表現相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該癌基因之表現減少至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更佳為至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，甚至更佳為至少60、70、80、90、100倍。較佳地，該腫瘤抑制基因的表現可受到抑制。與無本發明之HNF4a-saRNA存在時之表現相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該腫瘤抑制基因的表現增加至少20、30、40%，更佳為至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%，甚至更佳為至少100%。於進一步之較佳的實施態樣中，與無本發明之HNF4a-saRNA存在時之表現相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該腫瘤抑制基因的表現增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更佳為至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，甚至更佳為至少60、70、80、90、100倍。癌基因和腫瘤抑制基因之非限制性實例包括Bcl-2相關之X蛋白(BAX)、BH3交互作用結構域死亡激動劑(BID)、凋亡蛋白酶8(CASP8)、失能同源物2-交互作用蛋白(DAB21P)、肝癌缺失基因1(DLC1)、Fas 表面死亡受體(FAS)、脆性組胺酸三聯體(FHIT)、生長停滯和DNA損傷誘導型蛋白β(GADD45B)、刺猬交互作用蛋白(HHIP)、胰島素樣生長因子2(IGF2)、淋巴增強結合因子1(LEF1)、磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)、蛋白質酪胺酸激酶2(PTK2)、視網膜母細胞瘤1(RB1)、runt相關轉錄因子3(RUNX3)、SMAD家族成員4(SMAD4)、細胞因子信號傳導抑制劑(3SOCS3)、轉化生長因子、β受體II(TGFBR2)、腫瘤壞死因子(配體)超家族成員10(TNFSF10)、P53、解聚素及金屬蛋白酶結構域包含蛋白17(ADAM17)、v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物1(AKT1)、血管生成素2(ANGPT2)、B細胞CLL/淋巴瘤2 (BCL2)、BCL2樣1(BCL2L1)、桿狀病毒IAP重複子包含蛋白2(BIRC2)、桿狀病毒IAP重複子包含蛋白5(BIRC5)、趨化因子(CC基序)配體5(CCL5)、細胞週期蛋白D1(CCND1)、細胞週期蛋白D2(CCND2)、鈣黏蛋白(cadherin)1(CDH1)、鈣黏蛋白13(CDH13)、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A)、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑1B(CDKN1B)、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(CDKN2A)、CASP8和FADD樣凋亡調節劑(CFLAR)、連環蛋白(catenin)(鈣黏蛋白相關蛋白質)β1(CTNNB1)、趨化因子受體4 (CXCR4)、E2F轉錄因子1(E2F1)、表皮生長因子(EGF)、表皮生長因子受體(EGFR)、E1A結合蛋白p300(EP300)、Fas(TNFRSF6)死亡結構域(FADD)相關蛋白、FMS-相關酪胺酸激酶-1(FLT1)、捲曲蛋白家族受體7(FZD7)、穀胱甘肽S-轉移酶pi 1(GSTP1)、肝細胞生長因子(HGF)、哈維(Harvey)大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、胰島素樣生長因子結合蛋白1(IGFBP1)、胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)、胰島素受體受質1(IRS1)、整合素β1(ITGB1)、激酶插入結構域受體(KDR)、髓樣細胞白血病序列1(MCL1)、met原癌基因(MET)、mutS同源物2 (MSH2)、mutS同源物3(MSH3)、異黏蛋白(metadherin)(MTDH)、v-myc禽髓細胞瘤病毒癌基因同源物(MYC)、B-1細胞κ輕鏈多肽基因增強子之核因子(NFKB1)、神經母細胞瘤RAS病毒(v-ras)癌基因同源物(NRAS)、鴉片樣物質結合蛋白/細胞黏附分子樣(OPCML)、血小板衍生之生長因子受體，α多肽(PDGFRA)、肽基脯胺醯順/反異構酶、NIMA交互作用1(PIN1)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、PYD和CARD結構域包含蛋白(PYCARD)、ras基因相關C3肉毒桿菌毒素受質1(RAC1)、Ras相關(RalGDS/AF-6)結構域家族成員1(RASSF1)、絡絲蛋白(RELN)、ras同源物家族成員A(RHOA)、分泌型捲曲相關蛋白2(SFRP2)、SMAD族成員7(SMAD7)、細胞因子信號傳導抑制因子1(SOCS1)、信號轉導和轉錄激活蛋白3(STAT3)、轉錄因子4(TCF4)、端粒酶逆轉錄酶(TERT)、轉化生長因子α(TGFA)、轉化生長因子β1(TGFB1)、toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子受體超家族成員10b(TNFRSF10B)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、腎母細胞瘤1(WT1)、X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)和Yes相關蛋白1(YAP1)。

於一實施態樣中，HNF4a-saRNA在治療肝細胞癌中係用於調節微小RNA(miRNA或miR)。微小RNA為調節基因表現之小非編碼RNA。它們涉及重要的生理功能且它們可能參與癌發生的每個單一步驟。它們通常具有21個核苷酸並經由阻斷mRNA轉譯或藉由與該mRNA之3’-未轉譯區(3’-UTR)結合來誘導mRNA降解以調節轉錄後之基因表現濃度。

在腫瘤中，調節miRNA表現會影響腫瘤發展。在HCC中，如在其他癌症中，miRNA或是作為癌基因或作為腫瘤抑制基因，影響細胞生長和增殖、細胞代謝和分化、細胞凋亡、血管生成、轉移，且最終影響預後。[Lin et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications , vol. 375, 315-320 (2008)；Kutay et al.,J. Cell. Biochem., vol. 99, 671-678 (2006)；Meng et al.,Gastroenterology, vol. 133(2), 647-658 (2007)，各篇之全部內容以引用方式併入本文] 本發明之HNF4a-saRNA調控HNF4a基因表現及/或功能且亦調節HCC細胞中之miRNA濃度。可被本發明之HNF4a-saRNA調節的miRNA之非限制性實例包括hsa-let-7a-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-184、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-134、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7c、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-206、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-150-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-128、hsa-miR-215、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-203a、hsa-miR-30c-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-210、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-372、hsa-miR-149-5p和hsa-miR-32-5p。

於一非限制性實例中，該miRNA為癌基因miRNA且與無HNF4a-saRNA存在時相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該癌基因miRNA被下調至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1、1.5、2、2.5和3倍。於另一非限制性實例中，該miRNA為腫瘤抑制miRNA，與無HNF4a-saRNA存在時相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該miRNA被上調至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1倍，更佳為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更佳為至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，再更佳為至少60、70，80、90和100倍。

幹細胞調節

於本發明之一些實施態樣中，HNF4a-saRNA係用於調節自我更新之多能性因素並影響幹細胞分化。改變細胞之表型以表現所欲蛋白質或將細胞改變成不同的細胞表型已被用於不同的臨床、治療和研究設置中。目前改變細胞之表型係藉由表現來自DNA或病毒載體之蛋白質來實現。目前正在研究以評估使用人類胚胎幹細胞作為治療各種疾病，諸如帕金森氏症及糖尿病和傷害(諸如脊髓損傷)之治療選項。胚胎幹細胞具有無限生長，同時保持多能性來產生任何分化之細胞類型的能力。

許多因子，諸如多能性因子、細胞表型改變因子、轉分化因子、分化因子和去分化因子可用來改變細胞表型，此可用於個人再生醫學、細胞療法和其他疾病的治療領域中。例如，幹細胞之自我更新和多能性性能係藉由核心調節線路中之基因陣列(諸如轉錄因子和染色質重塑酶，包括OCT4、SOX2、NANOG和KLF基因)調節 [Bourillot et al.,BMC Biology, 8：125 (2010), 其全部內容以引用方式併入本文]。該用於自我調節網路之調節線路亦影響下游基因。寡核苷酸已用於調節該核心調節線路。Xu等人揭示miRNA-145靶向OCT4，SOX2和KLF4之3’-UTR。減少miRNA-145會損害分化並提高OCT4、SOX2和KLF4。[Xu et al.,Cell, vol. 137, 1-12 (2009), 其全部內容以引用方式併入本文]。

於一實施態樣中，本發明之HNF4a-saRNA係用於調節自我更新多能性基因。多能性基因之非限制性實例包括SOX2、OCT4、cKit、KLF4、KLF2、KLF5、NANOG、CDX2和SALL4。於一實施態樣中，與無HNF4a-saRNA存在時相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該多能性基因之表現減少至少20%、30%或40%，或較佳地，至少45、50、55、60、65、70或75%，再更佳為至少80、90或95%。於另一實施態樣中，與無HNF4a-saRNA存在時相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該多能性基因之表現增加至少20、30、40%，更佳為至少45、50、55、60、65、75、75%，再更佳為至少80%。於較佳之實施態樣中，與無HNF4a-saRNA存在時相比較，在本發明之HNF4a-saRNA的存在下，該多能性基因之表現增加2、3、4、5、6、7、8、9、10倍，更佳為至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，再更佳為至少60、70、80、90、100倍。

於一實施態樣中，HNF4a-saRNA係用於調節細胞之上皮-間質轉換(EMT)。一些腫瘤含有可自我更新並透過分化成癌細胞之不同譜系來保持腫瘤起始能力之癌幹細胞或癌幹細胞樣細胞。現已證明，EMT與癌症幹細胞樣細胞、腫瘤侵襲性和轉移、及腫瘤復發相關聯。[Kong等人，Cancers, vol. 3(1), 716-729 (2011))]。調節EMT之因素有許多，包括miRNA，諸如miR-200和miR-134、生長因子，諸如成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、源自血小板之生長因子(PDGF)，及因子，諸如Notch-1和Wnt信號傳導途徑。

III. 套組和裝置
套組

本發明提供各種用於方便及/或有效地實施本發明方法之套組。通常，套組將包含足夠量及/或數目之組分以允許使用者執行個體之多次治療和/或進行多次實驗。

於一實施態樣中，該包含本文所描述之saRNA的套組可與增殖細胞一起使用以顯示功效。

於一實施態樣中，本發明提供用於調節玻管內或體內之基因表現的套組，該套組包含本發明之HNF4a-saRNA或HNF4a-saRNA、調節其他基因之saRNA、siRNA或miRNA之組合。該套組可進一步包含包裝和指示及/或遞送劑以形成配製組成物。該遞送劑可包含鹽水、緩衝溶液、類脂質、樹枝狀聚合體或本文所揭示之任何遞送劑。基因之非限制性實例包括C/EBPα、C/EBP家族之其他成員、白蛋白基因、α胎蛋白基因、肝特異性因子基因、生長因子、核因子基因、腫瘤抑制基因、多能性因子基因。

於一非限制性實例中，該緩衝溶液可包括氯化鈉、氯化鈣、磷酸鹽及/或EDTA。於另一非限制性實例中，該緩衝溶液可包括，但不限於鹽水、具有2mM鈣之鹽水、5%蔗糖、具有2mM鈣之5%蔗糖、5%甘露糖醇、具有2mM鈣之5%甘露糖醇、乳酸林格氏液、氯化鈉、具有2mM鈣之氯化鈉和甘露糖(參見美國刊物第20120258046號；其全部內容以引用方式併入本文)。再於另一非限制性實例中，該緩衝溶液可被沉澱或被凍乾。各組分之量可有變化以取得一致的、可重複產生之較高濃度鹽水或單純之緩衝製劑。該組分亦可有變化，以增加緩衝溶液中之saRNA在經過一段時間及/或在各種條件下的穩定性。

於另一實施態樣中，本發明提供套組以調節細胞增殖，該套組包含本發明之HNF4a-saRNA(其中所提供之HNF4a-saRNA的量為當將HNF4a-saRNA引入該細胞時能有效抑制細胞增殖的量)；可選擇地，siRNA和miRNA(以進一步調節靶細胞之增殖)；及包裝和指示，及/或遞送劑以形成配製組成物。

於另一實施態樣中，本發明提供用於降低細胞中LDL濃度之套組，該套組包含本發明之saRNA分子；可選擇地，降低LDL之藥物；及包裝和指示及/或遞送劑以形成配製劑組成物。

於另一實施態樣中，本發明提供用於調節細胞中之miRNA表現濃度的套組，該套組包含本發明之HNF4a-saRNA；可選擇地，siRNA、eRNAs和lncRNAs；及包裝和指示，及/或遞送劑以形成配製劑組成物。

裝置

本發明提供可併入本發明之HNF4a-saRNA的裝置。這些裝置內含有可立即被遞送到有需要之個體(諸如人類患者)的穩定製劑。該等個體之非限制性實例包括具有過度增殖性病症，諸如癌症、腫瘤、或肝硬化；和代謝失調，諸如NAFLD、肥胖、高LDL膽固醇、或第II型糖尿病之個體。

裝置之非限制性實例包括泵、導管、針、透皮貼劑、加壓之嗅覺遞送裝置、離子電泳裝置、多層微流體裝置。該裝置可根據單次、多次或分割給藥方案來遞送本發明之HNF4a-saRNA。該裝置可穿越生物組織經由皮內、皮下或肌肉內途徑來遞送本發明之HNF4a-saRNA。適合用於遞送寡核苷酸之裝置的更多實例揭示於2012年12月14日提交之國際刊物編號WO 2013/090648中，其全部內容以引用方式併入本文。

定義

為了方便起見，本專利說明書、實施例和申請專利範圍中所使用之某些術語和短語的含義提供於下文中。若本專利說明書之其他部分和本章節中提供之術語的定義在使用上有明顯差異，以本節中之定義為準。

約：如本文所使用之術語“約”係指所引用之數值的+/-10%。

組合給藥： 如本文所使用之術語“一起投予”或“組合投予”係指將二或更多種藥劑(例如saRNA)在相同時間或在一個期間內投予個體，從而使各試劑對該患者之效果可能重疊。於一些實施態樣中，該二或更多種藥劑彼此係在約60、30、15、10、5、或1分鐘內投予。於一些實施態樣中，該藥劑之投予間隔足夠靠近，從而取得組合(例如協同)效果。

胺基酸： 如本文所使用者，術語“胺基酸(amino acid(s))”係指所有天然存在之L-α-胺基酸。該胺基酸係藉由如下列之單字母或三字母命名來鑑別：天門冬胺酸(Asp：D)、異白胺酸(Ile：I)、蘇胺酸(Thr：T)、白胺酸(Leu：L)、絲胺酸(Ser：S)、酪胺酸(Try：Y)、麩胺酸(Glu：E)、苯丙胺酸(Phe：F)、脯胺酸(Pro：P)、組胺酸(His：H)、甘胺酸(Gly：G)、離胺酸(Lys：K)、丙胺酸(Ala：A)、精胺酸(Arg：R)、半胱胺酸(Cys：C)、色胺酸(Trp：W)、纈胺酸(Val：V)、麩胺醯胺(Gln：Q)、甲硫胺酸(Met：M)、天門冬醯胺(Asn：N)，其中先列出該胺基酸，括號後再分別列出三個和一個字母代碼。

動物： 如本文所使用之術語“動物”係指動物界之任何成員。於一些實施態樣中，“動物”係指在發育之任何階段的人類。於一些實施態樣中，“動物”係指在發育之任何階段的非人類動物。於某些實施態樣中，該非人類動物為哺乳動物(例如囓齒類動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。於一些實施態樣中，動物包括，但不限於哺乳動物、鳥類、爬行類、兩棲類、魚類和蠕蟲。於一些實施態樣中，該動物為轉基因動物、經遺傳工程處理之動物或選殖株。

大約： 如本文所使用者，術語“大約”或“約”當應用於所關注的一或多個數值時係指類似於所陳述之參考值的數值。於某些實施態樣中，除非另有說明或以其他方式從上下文顯明，術語“大約”或“約”係指落在該陳述之參考值之任一方向(大於或小於)的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小之範圍內的數值(除了其中該等數值會將超過可能數值的100%之外)。

與 ..聯結：如本文所使用之術語“聯結”、“軛合”、“連接”、“附接”和“栓繫”當關於二或更多個部分使用時係指該部分為物理上彼此聯結或連接(無論是直接或經由一或多個作為連接劑之額外的部分連接) 以形成足夠穩定之結構，從而使該部分在使用該結構之條件下(例如生理條件)保持物理上聯結。“聯結”不必絕對透過直接共價化學鍵合。其亦可能意味基於足夠穩定之離子或氫鍵結或雜交連接性，從而使該“聯結”實體保持物理上相聯結。

雙功能： 如本文中所使用之術語“雙功能”意指任何能夠或維持至少二種功能之物質、分子或部分。該功能可能影響相同之結果或不同之結果。該產生該功能之結構可為相同或不同。

生物相容 ：如本文所使用之術語“生物相容的”係指與活細胞、組織、器官或系統相容，免疫系統顯示出很少到沒有損傷、毒性或排斥風險。

生物可降解的 ：如本文所使用之術語“生物可降解的”係指能夠藉由生物之作用而分解成無害的產物。

生物學上活性 ：如本文所使用之短語“生物學上活性”係指在生物系統及/或有機體中具有活性之任何物質的特性。例如，當投予生物體時，對該生物體具有生物作用之物質被認為是生物學上活性。於特殊之實施態樣中，本發明之saRNA可被認為是生物學上活性的，即使該saRNA之一部分為生物學上活性或模擬被認為是生物學相關的活性。

癌症： 如本文所使用者，在個體中術語“癌症”係指存在具有典型之致癌細胞特性(諸如不受控制之增殖、永生、轉移潛能、快速生長和增殖速率，以及某些獨特之形態特性)的細胞。通常，癌細胞將為腫瘤形式，但該等細胞可單獨存在於個體內或在血流中以獨立細胞(諸如白血病細胞)之形式循環。

細胞生長： 如本文所使用者，術語“細胞生長”主要與細胞數目增長有關，細胞數目增長係當細胞產生(即，增殖)之速率快過細胞死亡(例如藉由細胞凋亡或壞死)之速率而發生細胞群體大小增加，儘管在某些情況下，此種增長的一小部分亦可能是由於細胞大小或個別細胞之細胞質體積增加。因此，抑制細胞生長之作用劑可藉由抑制細胞增殖或刺激細胞死亡或此二者，從而改變這二個相對過程之間的平衡來達成。

細胞類型： 如本文所使用者，術語“細胞類型”係指來自指定來源(例如組織、器官)之細胞，或為分化之指定狀態的細胞，或與指定之病理或基因構成相關之細胞。

染色體： 如本文所使用者，術語“染色體”係指在細胞中發現之DNA和蛋白質的組織化結構。

互補： 如本文所使用者，術語“互補”當與核酸有關時係指核苷酸或核酸之間(諸如，例如雙股DNA分子的二股之間或寡核苷酸探針與靶的之間)的雜交或鹼基配對。

病況：如本文所使用者，術語“病況”係指任何細胞、器官、器官系統或生物體之狀態。病況可反映實體之疾病狀態或僅是生理表現或情況。病況可藉由表型病況(諸如疾病之巨觀呈現)或基因型病況(諸如與該病況相關之潛在基因或蛋白質表現變化形廓)表徵。病況可能為良性或惡性。

控制釋出 ：如本文所使用者，術語“控制釋出”係指符合特定之釋出模式以實現治療效果之醫藥組成物或化合物的釋出變化形廓。

抑制細胞的 ：如本文所使用者，“抑制細胞的 ”係指抑制、減少、壓抑細胞(例如哺乳動物細胞(例如人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、普里昂蛋白、或彼等之組合的生長、分裂或增殖。

細胞毒性的 ：如本文所使用者，“細胞毒性的”係指殺死細胞或引起對細胞(例如哺乳動物細胞(例如人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、普里昂蛋白、或彼等之組合的有害、有毒或致命之影響。

遞送：如本文所使用者，“遞送”係指遞送化合物、物質、實體部分、貨物或有效載荷之行為或方式。

遞送劑 ：如本文所使用者，“遞送劑”係指促進(至少部分)本發明之saRNA在體內遞送至靶細胞的任何物質。

去穩定化的： 如本文所使用之術語“去穩定的”、“去穩定化”或“去穩定化區”係指較相同區或分子之起始、野生型或天然型不穩定的區或分子。

可檢測標記： 如本文所使用之“可檢測標記”係指與另一實體連接、合併或聯結而可藉由本技藝中已知之方法很容易地檢測的一或多種標記物、信號或部分，該檢測方法包括放射照相術、螢光、化學發光、酶催化活性、吸光度，等。可檢測之標示包括放射性同位素、螢光團、生色團、酶、染料、金屬離子、配體，諸如生物素、抗生物素蛋白、鏈親和素及半抗原、量子點，等。可檢測之標示可被定位在該肽、蛋白質或多核苷酸(例如本發明之saRNA)之任何位置。其可依情況在胺基酸、肽、蛋白質、或多核苷酸內位於N或C端或5’或3’端。

包封： 如本文所使用者，術語“包封”係指圍住、圍繞或包住。

經工程處理的： 如本文所使用者，當本發明之實施態樣被設計成具有與起點、野生型或天然分子不同之特徵或特性(無論是結構或化學)時，其為“經工程處理的”。

相等個體： 如本文所使用者，“相等個體”可為，例如具有類似之年齡、性別和健康，諸如肝臟健康或癌症階段的個體，或在本發明的治療之前的同一個體。該相等個體為“未經治療的”，因為他未接受以本發明之saRN進行之治療。然而，他可接受傳統之抗癌治療，惟其該接受以本發明之saRNA治療的個體係接受相同或相等之傳統抗癌治療。

外泌體 (exsome) ：如本文所使用者，“外泌體”為由哺乳動物細胞分泌之囊泡。

表現：如本文所使用者，核酸序列之“表現”係指下列事件之一或多者：(1) 從DNA序列產生RNA模板(例如藉由轉錄)；(2) RNA轉錄子之加工(例如藉由剪接、編輯、形成5’帽及/或3’端加工)；(3) RNA轉譯成多肽或蛋白質；和(4) 多肽或蛋白質之轉譯後修飾。

特性： 如本文所使用者，“特性”係指特徵、性能或獨特之要素。

配製劑 ：如本文所使用者，“配製劑”包括至少一本發明之saRNA和遞送劑。

片段： 如本文所使用者，“片段”係指一部分。例如，蛋白質之片段可包含藉由分解從培養之細胞中分離出的全長蛋白質所取得之多肽。

功能：如本文所使用者，“功能性”生物分子為生物分子之形式，在該形式中生物分子顯示出為其特點之性能及/或活性。

基因： 如本文所使用者，術語“基因”係指包含控制序列，且最常為產生多肽或前體序列所必要之編碼序列的核酸序列。然而，基因可能不被轉譯而是編碼調節或結構性RNA分子。

基因可全部或部分源自本技藝已知之任何來源，包括植物、真菌、動物、細菌基因組或游離基因、真核、核或質粒DNA、cDNA、病毒DNA、或化學合成性DNA。基因在該可能影響該表現產物之生物活性或化學結構、表現率或表現控制之方式的編碼區或非轉譯區可含有一或多個修飾。該等修飾包括，但不限於突變、插入、缺失和一或多個核苷酸之取代。該基因可構成未被中斷之編碼序列，或其可包括一或多個藉由適當之剪接連接點鍵結之內含子。

基因表現： 如本文所使用者，術語“基因表現”係指核酸序列藉此經歷成功轉錄，且在大多數情況中轉譯以產生蛋白或肽之過程。為了清楚起見，當與測量“基因表現”相關時，其應該被理解為係指測量轉錄之核酸產物，例如RNA或mRNA或轉譯之胺基酸產品，例如多肽或肽。測量RNA、mRNA、多肽和肽之量或濃度的方法為本技藝所周知。

基因組： 術語“基因組”意圖包括生物體之整套DNA補體，包括核DNA組分、染色體或染色體外DNA及細胞質結構域(例如粒線體DNA)。

同源性 ：如本文所使用者，術語“同源性”係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如 DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。於一些實施態樣中，若聚合分子之序列為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%一致或相似，則該聚合分子被認為彼此“同源”。術語“同源”必定指至少二個序列(多核苷酸或多肽序列)之間的比較。根據本發明，若二個多核苷酸序列所編碼之多肽在至少一具有至少約20個胺基酸的延伸序列具有至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、或甚至99%之同一性，則該二個多核苷酸序列被認為是同源。於一些實施態樣中，同源多核苷酸序列之特徵在於其有能力編碼具有至少4至5個被唯一具體指定之胺基酸的延伸序列。在長度短於60個核苷酸之多核苷酸序列方面，同源性之測定係藉由編碼具有至少4至5個被唯一具體指定之胺基酸的延伸序列之能力。根據本發明，若二個蛋白質序列在至少一具有至少約20個胺基酸的延伸序列具有至少約50%、60%、70%、80%、或90%之同一性，則該二個蛋白質序列被認為是同源。

術語“過度增殖細胞”可指與相等之健康細胞(其可被稱為“對照組”)的增殖速率相比較時增殖速率異常高之任何細胞。“相等之健康”細胞為細胞之正常、健康對應細胞。因此，其為相同類型之細胞，例如與比較細胞來自相同器官並執行相同功能之細胞。例如過度增殖之肝細胞的增殖應參考健康之肝細胞來進行評估，而過度增殖之前列腺細胞的增殖應參考健康之前列腺細胞來進行評估。

“異常高”之增殖速率係指與相等之健康(非過度增殖)細胞的增殖速率相比較時，過度增殖性細胞的增殖速率增加至少20、30、40%、或至少45、50、55、60、65、70、75%，或至少80%。“異常高”之增殖速率亦可指與相等之健康細胞的增殖速率相比較時，增殖速率增加至少2、3、4、5、6、7、9，10倍，或至少15、20、25、30、35、40、45、50倍，或至少60、70、80、90、100倍。

如本文所使用之術語“過度增殖性細胞”並非指與大多數細胞相比較時自然以較高速率增殖，但是為健康之細胞。已知會在整個生命持續地分裂的細胞實例為皮膚細胞、胃腸道細胞、血液細胞和骨髓細胞。然而，當該等細胞以較其健康之對應細胞更高的速率增殖時，其為過度增殖的。

過度增殖性病症： 如本文所使用者，“過度增殖性病症”可為涉及如上述定義之過度增殖性細胞的任何病症。過度增殖性病症之實例包括腫瘤性疾病，諸如癌症、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、胃過度增殖性病症，諸如炎性腸病、皮膚病(包括牛皮癬)、Reiter症候群、毛孔性紅糠疹(pityriasis rubra pilaris)和角質化病症之過度增殖性變體。

本技藝之技術熟習人士充分明白如何識別過度增殖性細胞。動物體內存有過度增殖性細胞時可使用掃描，諸如X射線、MRI或CT掃描識別。亦可鑑定該過度增殖性細胞，或透過在玻管內培養樣本，使用細胞增殖分析(諸如MTT、XTT、MTS或WST-1分析)來分析細胞之增殖。玻管內細胞增殖亦可使用流式細胞術測定。

同一性 ：如本文所使用者，術語“同一性”係指聚合分子之間，例如寡核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。二個多核苷酸序列之百分比同一性的計算可藉由，例如比對該二個用於最佳比較目的之序列來進行(例如可在用於最佳比對之第一和第二核酸序列其中一或二者引入間隙並可忽略用於比較目的之非-同一序列)。於某些實施態樣中，用於比較目的之比對的序列長度至少為該參考序列之長度的30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%。然後，比較在對應之核苷酸位置處的核苷酸。當第一序列中之位置被第二序列中之對應位置的相同鹼基佔據時，則該分子在該位置為相一致。二個序列之間的百分比同一性為該二個序列所共有之一致位置之數目的函數，考慮間隙之數目和各間隙(其需要被引入以進行二個序列的最佳比對)的長度。二個序列之間的序列比較和同一性百分比的測定可使用數學算法完成。例如，可使用諸如描述於下列文獻中之方法來測定二個核苷酸序列之間的百分比同一性：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988； Biocomputing： Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993； Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；和Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991，各篇之全部內容以引用方式併入本文。例如，二個核苷酸序列之間的同一性百分比可使用Meyers和Miller的算法(CABIOS, 1989, 4：11-17) (該Meyers和Miller的算法已被併入ALIGN程式(第2.0版)中)，利用PAM120重量殘基表，該間隙長度懲罰為12，而間隙懲罰為4測定。或者，二個核苷酸序列之間的同一性百分比可使用GCG軟體包中之GAP程式，利用NWSgapdna.CMP基質來測定。常用於測定序列之間的同一性百分比之方法包括，但不限於揭示於Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48：1073 (1988) (其全部內容以引用方式併入本文)中者。用於測定同一性之技術被編入可公開取得之電腦程式。用於測定二個序列之間的同源性的示例性電腦軟體包括，但不限於GCG程序包，Devereux, J.,et al. ,Nucleic Acids Research , 12(1), 387 (1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA Altschul, S. F.et al. ,J. Molec. Biol. , 215, 403 (1990))。

抑制基因表現： 如本文所使用者，短語“抑制基因表現”意指造成該基因之表現產物的量減少。該表現產物可為從基因轉錄之RNA(例如mRNA)或從該基因轉錄之mRNA所轉譯之多肽。通常，mRNA之濃度降低導致從其轉譯之多肽的濃度降低。表現濃度可使用用於測量mRNA或蛋白質之標準技術測定。

玻管內 ：如本文所使用者，術語“玻管內”係指發生在人工環境中的事件，例如在試管或反應容器中、在細胞培養中、在培養皿中，等，而非生物體(例如動物、植物或微生物)中。

活體內 ：如本文所使用者，術語“活體內”係指發生在生物體中的事件(例如動物、植物、或微生物、或其細胞、或組織)。

經分離的 ：如本文所使用者，術語“經分離的”係指已經與至少一些與其聯結之組分(無論在自然界或在實驗設置中)分開的物質或實體。參考那些與該經分離之物質聯結的物質，該經分離之物質可具有不同的純度濃度。經分離之物質及/或實體可與至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或更多之最初與其聯結的其他組分分開。於一些實施態樣中，經分離之試劑為超過約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或超過約99%純質。如本文所使用者，若物質基本上不含其他組分，則該物質為“純”的。
基本上經分離的 ：“基本上經分離的”係指該化合物基本上與形成該化合物或檢測到該化合物之環境分開。部分分開可包括，例如富含本發明之化合物的組成物。基本上分開可包括含有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%、或至少約99%(重量)之本發明化合物或其鹽的組成物。用於分離化合物及其鹽之方法為本技藝之例行方法。

標示： 術語“標示”係指被併入物體中，從而使該物質、化合物、或物體可為可檢測之物質或化合物。

連接子： 如本文所使用者，連接子係指一組原子，例如10至1,000個原子，且可由，諸如，但不限於下列原子或基團所組成：碳、胺基、烷胺基、氧、硫、亞碸、磺醯、羰基和亞胺。該連接子可附接在第一端之核鹼基或糖部分上的經修飾之核苷或核苷酸，及附接在第二端之有效載荷，例如可檢測之試劑或治療劑。該連接子可具有足夠長度以不干擾併入核酸序列。該連接子可用於如本文所描述之任何有用之目的，諸如形成saRNA軛合物及用於投予有效載荷。可被併入該連接子之化學基團的實例包括，但不限於如本文所描述之烷基、烯基、炔基、醯胺基、胺基、醚、硫醚、酯、伸烷基、雜伸烷基、芳基、或雜環基，其各自可選擇地為經取代的。連接子之實例包括，但不限於不飽和烷烴、聚乙二醇(例如乙二醇或丙二醇單體單元，例如二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、或四乙二醇)，和葡聚醣聚合物及彼等之衍生物。其他實例包括，但不限於該連接子內之可裂解部分，諸如，例如可使用還原劑或光解來裂解之二硫鍵(-S-S-)或偶氮鍵(-N=N-)。選擇性可裂解之鍵的非限制性實例包括可藉由使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其他還原劑，及/或光解來裂解之醯胺鍵，及可藉由，例如酸性或鹼性水解來裂解之酯鍵。

轉移： 如本文所使用者，術語“轉移”係指癌症從其以原發性腫瘤形式第一次出現的地方擴散至體內遠處位置的過程。轉移亦指從原發性腫瘤擴散所導致之癌症。例如，患有乳癌之患者可能會顯示出轉移至淋巴系統、肝臟、骨骼或肺中。

經修飾的： 如本文所使用者，“經修飾的”係指本發明分子之改變的狀態或結構。分子可以許多方式，包括在化學、結構和功能上進行修飾。於一實施態樣中，本發明之saRNA分子係藉由引入非天然核苷及/或核苷酸進行修飾。

天然存在的： 如本文所使用者，“天然存在的”係指沒有人工輔助而存在於自然界。

核酸： 如本文所使用者，術語“核酸”係指由一或多個核苷酸，即核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或此二者所組成之分子。該術語包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸之單體和聚合物，而在聚合物的情況下，核糖核苷酸及/或脫氧核糖核苷酸係經由5’至3’鍵聯結合在一起。該核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸聚合物可呈單股或雙股。然而，鍵聯可包括本技藝中已知之任何鍵聯，例如包含5’至3’鍵聯之核酸。該核苷酸可為天然存在的或可為能與天然存在之鹼基對形成鹼基配對關係之合成產生的類似物。能夠形成鹼基配對關係之非天然存在之鹼基的實例包括，但不限於氮雜和脫氮雜嘧啶類似物、氮雜和脫氮雜嘌呤類似物，及其他雜環鹼基類似物，其中該嘧啶環之一或多個碳原子和氮原子被雜原子(例如氧、硫、硒、磷，等)取代。

患者： 如本文所使用者，“患者”係指可能尋求或有治療需要、必須治療、正在接受治療、將接受治療之個體，或正接受訓練有素之專業人員對特定疾病或病症之護理的個體。

肽：如本文所使用者，“肽”為少於或等於50個胺基酸長，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50個胺基酸長。

醫藥上可接受的 ：本文中所使用之短語“醫藥上可接受的”係指那些在合理的醫學判斷範圍內為適合與人類和動物組織接觸，而沒有過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題、或併發症，並具有合理之利益/風險比，相稱之化合物、材料、組成物及/或劑型。

醫藥上可接受之賦形劑： 本文所使用之短語“醫藥上可接受之賦形劑”係指除了本文所描述之化合物之外(例如能懸浮或溶解該活性化合物之載劑)的任何成分且該成分之屬性為在患者體內基本上無毒且非炎性。賦形劑可包括，例如：抗黏著劑、抗氧化劑、結合劑、塗層、壓縮助劑、崩散劑、染料(顏色)、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或塗層、調味劑、香料、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑和水合用之水。示例性賦形劑包括，但不限於：丁基化之羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(二鹽基的)、硬脂酸鈣、交聯羧甲基纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露醇、蛋胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶型纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、預膠化之澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、視黃基棕櫚酸酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C和木糖醇。

醫藥上可接受之鹽 ：本發明亦包括本文所描述之化合物之醫藥上可接受的鹽。如本文所使用者，“醫藥上可接受之鹽”係指所揭示之化合物的衍生物，其中該母化合物係藉由將已存在之酸或鹼部分轉化成其鹽形式(例如將該游離鹼基團與合適之有機酸反應)來修飾。醫藥上可接受之鹽的實例包括，但不限於鹼性殘基之礦物或有機酸鹽，諸如胺；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼鹽或有機鹽；等。代表性酸加成鹽包括醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天門冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽和類似物。代表性之鹼或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂，等之鹽，及無毒之銨、季銨和胺陽離子，包括，但不限於銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺，等。本發明之醫藥上可接受之鹽包括，例如母化合物形成之傳統非毒性鹽，例如從非毒性無機酸或有機酸形成者。本發明之醫藥上可接受之鹽可藉由傳統化學方法從含有鹼性或酸性部分之母化合物合成。一般而言，該等鹽類可藉由將這些化合物之游離酸或鹼形式與水或有機溶劑或該二者之混合物中之化學計算量的合適鹼或酸或反應來製備；一般而言，非水性介質，如乙醚、醋酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈為較佳者。合適之鹽的列表可在下列文獻中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences , 17^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p.1418、Pharmaceutical Salts ： Properties, Selection, and Use , P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008，及Berge et al.,Journal of Pharmaceutical Science , 66, 1-19 (1977)，各篇之全部內容以引用方式併入本文。

醫藥上可接受之溶劑化物 ：如本文所使用之術語“醫藥上可接受之溶劑化物”意指本發明之化合物，其中合適之溶劑分子被併入晶格中。合適之溶劑為在投予之劑量下為生理上可耐受的。例如，溶劑化物可藉由從包含有機溶劑、水、或彼等之混合物的溶液中結晶而出、再結晶或沉澱來製備。合適之溶劑的實例有乙醇、水(例如單-、二-和三-水合物、N- 甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N ,N 2’- 二甲基甲醯胺(DMF)、N ,N 2’- 二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苄酯和類似物。當水為溶劑時，該溶劑化物被稱為“水合物”。

藥理學效果 ：如本文所使用者，“藥理學效果”為在生物體或系統中之可測量的生物現象，其係在該生物體或系統已經接觸或暴露於外源試劑之後出現。藥理學效果可導致治療有效之結果，諸如治療、改善一或多種症狀、診斷、預防及延遲疾病、病症、病況或感染發病。該等生物現象之測量可為定量、定性或相對於另一生物現象測量。定量測量可為統計上有意義的。定性測量可藉由程度或種類，且可為相差至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。他們可能以存在或不存在、較好或較差、較常或較少觀察到。當指藥理學效果時，外源試劑為那些對生物體或系統而言為全部或部分外來者。例如，對野生型生物分子之修飾(無論為結構或化學的)將產生外源試劑。同樣地，將野生型分子併入無法在生物體或系統中天然發現之化合物、分子或物質中或與該化合物、分子或物質組合時亦將產生外源試劑。本發明之saRNA包含外源性試劑。藥理學效果之實例包括，但不限於細胞計數之改變，諸如下列細胞之增加或減少：中性粒細胞、網狀紅血球、粒細胞、紅血球(紅血球細胞)、巨核細胞、血小板、單核細胞、結締組織巨噬細胞、表皮朗格漢斯細胞、破骨細胞、樹突細胞、小膠質細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、肥大細胞、輔助T細胞、抑制性T細胞、細胞毒性T細胞、天然殺手T細胞、B細胞、天然殺手細胞、或網狀紅細胞。藥理學效果亦包括血液化學、pH值、血紅蛋白、血細胞比容變化、酶之濃度的變化(諸如，但不限於肝酶AST和ALT)、脂質變化形廓、電解質、代謝標記物、激素或本技藝中之技術熟習人士已知之其他標記物或變化形廓的改變。

理化： 如本文所使用者，“物理化學”意指或關於物理及/或化學性質。

預防：如本文所使用者，術語“預防”係指部分或完全延緩感染、疾病、病症及/或病況發作；部分或完全延緩特定感染、疾病、病症及/或病況之一或多種症狀、特性或臨床表現發作；部分或完全延緩特定感染、疾病、病症及/或病況進展，及/或降低發展出與該感染、疾病、病症及/或病況相關之病理的風險。

前藥：本發明亦包括本文所描述之化合物的前藥。如本文所使用者，“前藥”係指任何物質、分子或實體，其形式為當化學或物理改變時可作為治療劑。前藥可藉由共價鍵合或以某些方式隔絕，其在投予哺乳動物個體之前、投予時或投予後釋出或被轉化成活性藥物部分。前藥可藉由修飾存在於該化合物中之官能基來製備，該修飾方法為在常規操作中或在體內使該修飾裂解成母化合物。前藥包括其中羥基、胺基、巰基或羧基與基團鍵合之化合物，當被投予哺乳動物時，則裂解分別形成游離之羥基、胺基、巰基或羧基。前藥之製備和用途討論於T. Higuchi and V. Stella, “Pro-drugs as Novel Delivery Systems,” Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series和Bioreversible Carriers in Drug Design , ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987中(該二篇之全部內容以引用方式併入本文)。

預後： 如本文所使用者，術語“預後”係指陳述或主張特定之生物學事件將，或者很可能在未來發生。

進展： 如本文所使用者，術語“進展”或“癌症進展”係指疾病或病況進步或惡化、或朝向疾病或病況。

增殖： 如本文所使用者，術語“增殖”係指生長、擴充或增加或造成迅速生長、擴充或增加。“增殖性的”係指具有增殖的能力。“抗增殖性的”係指具有與增殖性質對立或相反之性質。

蛋白質： “蛋白質”係指藉由肽鍵連接在一起之胺基酸殘基的聚合物。如本文所使用之術語係指具有任何大小、結構或功能之蛋白質、多肽和肽。然而，蛋白質之長度通常為至少50個胺基酸。於一些情況中，該經編碼之蛋白質小於約50個胺基酸。在此情況中，該多肽被稱為肽。若該蛋白質為短肽，其將為至少約10個胺基酸殘基長。蛋白質可為天然存在、重組或合成性、或這些之任何組合。蛋白質亦可包含天然存在之蛋白質或肽的片段。蛋白質可為單分子或可為多分子複合物。術語蛋白質亦可應用於其中一或多個胺基酸殘基為對應之天然存在的胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物。

蛋白質表現： 術語“蛋白質表現”係指一種過程，藉由該過程，核酸序列經歷轉譯，從而使該胺基酸序列或蛋白質表現出可檢測之濃度。

純化的： 如本文所使用者，“純化(purify)”、“經純化的(purified)”、“純化(purification)”係指製作成基本上純的或清除掉不需要之組分、沾污材料、混合物或瑕疵。

消退： 如本文所使用者，術語“消退”或“消退程度”係指癌症進展之逆轉，可指表型或基因型。減緩或停止癌症進展可被認為是消退。

樣本： 如本文所使用者，術語“樣本”或“生物樣本”係指其組織、細胞或組分部分之子集(例如體液，包括，但不限於血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿液、陰道液和精液)。樣本可進一步包括從整個生物體或其組織、細胞或組分部分之子集、或其級分或部分製備之勻漿、溶胞產物或萃取物，包括，但不限於，例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道之外在部分、眼淚、唾液、乳汁、血球、腫瘤、器官。樣本還可指培養基，諸如可含有細胞組分(諸如蛋白質或核酸分子)之營養肉湯或凝膠。

信號序列： 如本文所使用者，短語“信號序列”係指可指導蛋白質轉運或定位之序列。

單一單位劑量 ：如本文所使用者，“單一單位劑量”為在一個劑量中/一次/單一途徑/單一接觸點，即，單次投予事件中投予之任何治療劑的劑量。

相似性 ：如本文所使用者，術語“相似性”係指聚合分子之間，例如多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。如本技藝所理解者，相似性百分比之計算除了考慮保守性取代之外，聚合分子彼此之間的相似性百分比的計算可依計算同一性百分比的相同方式進行。

分割劑量 ：如本文所使用者，“分割劑量”為單次單位劑量或每日總劑量分割成二或更多個劑量。

穩定： 如本文所使用者，“穩定”係指化合物足夠穩固以經受得住從反應混合物中分離至有用的純度，且較佳地，能夠配製成有效之治療劑。

穩定化的： 如本文所使用者，術語“穩定化”、“穩定化的”、“穩定化之區”係指能夠製成或變成穩定。

個體： 如本文所使用者，術語“個體”或“患者”係指可對其投予根據本發明之組成物的任何有機體，例如用於實驗、診斷、預防及/或治療目的。典型之個體包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物和人類)及/或植物。

基本上 ：如本文所使用者，術語“基本上”係指表現所關注之特性或性質的全部或接近全部之範圍或程度的定性條件。在生物技藝中之一般技術人士將理解生物學和化學現象很少(若有的話) 達到完全及/或進行到完全或實現或避免絕對結果。因此，術語“基本上”係用於捕捉許多生物和化學現象中所固有之缺乏完整性的可能。

基本上相等 ：如本文所使用者，當與劑量之間的時間差有關時，該術語意指加/減2%。

基本上同時地 ：如本文所使用者，當與多個劑量有關時，該術語意指在2秒內。

患有：“患有”疾病、病症及/或病況之個人已被確診或顯示出疾病、病症及/或病況之一或多種症狀。

易罹患 ：“易罹患”某疾病、病症及/或病況之個人尚未被確診或可能未顯示出該疾病、病症及/或病況之症狀，但有傾向發展出疾病或其症狀。於一些實施態樣中，易罹患某疾病、病症及/或病況(例如癌症)之個人可藉由下列一或多項表徵：(1) 與該疾病、病症及/或病況之發展有關的基因突變；(2) 與該疾病、病症及/或病況之發展有關的基因多態性；(3) 與該疾病、病症及/或病況有關之蛋白質及/或核酸的表現及/或活性增加及/或減少；(4) 與該疾病、病症及/或病況之發展有關的習慣及/或生活方式；(5) 該疾病、病症及/或病況之家族史；及(6) 暴露於及/或感染與該疾病、病症及/或病況之發展有關的微生物。於一些實施態樣中，易罹患某疾病、病症及/或病況(例如癌症)之個人將發展該疾病、病症及/或病況。於一些實施態樣中，易罹患某疾病、病症及/或病況之個人不會發展該疾病、病症及/或病況。

持續釋出： 如本文所使用者，術語“持續釋出”係指醫藥組成物或化合物的釋出變化形廓在特定之期間內的釋出速率相一致。

合成的 ：術語“合成的”係指藉由人工產生、製備及/或製造。本發明之多核苷酸或多肽或其他分子的合成方法可為化學方法或酶催化方法。

靶細胞： 如本文所使用者，“靶細胞”係指所關注之任何一或多種細胞。細胞可在玻管內、活體內或在生物體之原位或組織或器官內發現。該生物體可為動物，較佳為哺乳動物，更佳為人且最佳為患者。

治療劑： 當投予給個體時，術語“治療劑”係指當投予個體時具有治療、診斷及/或預防效果及/或引出理想之生物學及/或藥理學作用的任何作用劑。

治療有效量： 如本文所使用者，術語“治療有效量”係指當投予患有或易罹患感染、疾病、病症及/或病況之個體時，欲投遞之作用劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑，等 )的量足以治療、改善感染、疾病、病症及/或病症之症狀、診斷、預防及/或延遲該感染、疾病、病症及/或病症發作。

治療之有效之結果 ：如本文所使用者，術語“治療上有效之結果”係指足以在患有或易罹患感染、疾病、病症及/或病況之個體中治療、改善感染、疾病、病症及/或病症之症狀、診斷、預防及/或延遲該感染、疾病、病症及/或病症發作。

總日劑量： 如本文所使用者，“總日劑量”為在24小時之期間內的指定量或開立量。其可以單次單位劑量之形式投予。

轉錄因子： 如本文所使用者，術語“轉錄因子”係指調節DNA轉錄成RNA之DNA結合蛋白，例如藉由激活或抑制轉錄。一些轉錄因子可單獨有效調節轉錄，而其他轉錄因子刖與其他蛋白質協同作用。一些轉錄因子可在某些條件下同時激活和抑制轉錄。一般而言，轉錄因子與特定之靶的序列結合，該特定之靶的序列與靶基因之調節區中的特定共有序列高度相似。轉錄因子可單獨調節靶基因之轉錄或在具有其他分子之複合物中調節靶基因之轉錄。

治療：如本文所使用者，術語“治療”係指部分或完全減輕、改善、改進、緩和特定之感染、疾病、病症及/或病況的一或多種症狀或特性、或使特定之感染、疾病、病症及/或病況的一或多種症狀或特性延遲發作、抑制進展、降低嚴重程度及/或減少發生率。例如，“治療”癌症可指抑制腫瘤存活、生長及/或擴散。治療可投予未表現出疾病、病症及/或病況之徵兆的個體及/或僅表現出疾病、病症及/或病況之早期徵兆的個體以降低發展與該疾病、病症及/或病況相關之病理的風險。

當應用於，例如癌症時，短語“治療方法”或其同等物係指經過設計以減少、排除或預防個人之癌細胞數目，或減輕癌症之症狀的程序或作用過程。癌症或另一增殖性疾病之治療方法”事實上並不一定意指該癌細胞或其他病症將被完全排除，而是該細胞之數目或病症事實上被減輕，或者該癌症或其他疾病之症狀事實上被減輕。通常，即使成功的可能性很小仍將執行治療癌症之方法，但鑑於個體之病史和估計之預期生存期，該治療癌症之方法仍然被認為是整體有益的行動過程。

腫瘤生長： 如本文所使用者，除非另有說明，術語“腫瘤生長”或“腫瘤轉移生長”常用於腫瘤學中，其中該術語主要與腫瘤的質量或體積增加或腫瘤轉移有關，此主要為腫瘤細胞生長之結果。

腫瘤負荷： 如本文所使用者，術語“腫瘤負荷”係指個體所攜帶之直徑超過3mm的所有腫瘤結節的總體腫瘤體積。

腫瘤體積： 如本文所使用者，術語“腫瘤體積”係指腫瘤的大小。以mm³ 計之腫瘤體積係藉由下式計算：體積=(寬度)² ×長度/2。

未經修飾的 ：如本文所使用者，“未經修飾的”係指在以任何方式改變之前的任何物質、化合物或分子。未經修飾的可指，但並非總是指生物分子之野生型或天然形式。分子可能經歷一系列修飾，藉此每個經修飾之分子可作為“未經修飾的”起始分子以用於後續修飾。

等效物和範圍

本技藝之技術熟習人士將理解或能夠僅使用常規實驗來確定許多本文所描述之根據本發明的具體實施態樣之等效物。本發明之範圍並不限於上述說明，而是如所附之申請專利範圍中所闡述者。

在發明之申請專利範圍中，除非有相反之指示或另外從上下文中顯明，冠詞，諸如“一(a、an)”和“該(the)”可表示一或一個以上。除非有相反之指示或另外從上下文中顯明，若群組之一或一個以上或全部成員存在於、用於或以其他方式與指定之產品或過程相關，則在一或多個群組成員之間包括“或”的申請專利範圍或描述被認為是達到滿足的。本發明包括其中該群組正好一個成員存在於、用於、或以其他方式與指定之產品或過程相關的實施態樣。本發明包括其中一個以上或全部之群組成員均存在於、用於、或以其他方式與指定之產品或過程相關的實施態樣。

亦需注意的是，術語“包含”意圖開放並允許包括額外之元件或步驟。

當給予範圍時，端點係包含在內。此外，本技藝之一般技術人士應理解，除非另外指明或從上下文中顯明，表示範圍之數值可假定在本發明之不同實施態樣中所陳述之範圍內的任何特定值或子範圍，達該範圍之下限單位的十分之一。

此外，應理解的是，在先前技藝範圍內之本發明的任何特殊實施態樣可從發明之申請專利範圍之任何一或多項明確排除。由於該等實施態樣被認為是本技藝之一般技術人士所已知，其可能被排除，即使本文中並未明確闡述將其排除在外。本發明組成物之任何特殊實施態樣(例如，任何核酸或由該核酸編碼之蛋白質；任何生產方法；任何使用方法；等)可為了任何理由從申請專利範圍之任一項或多項排除，無論是否與存在先前技藝有關。

所有引用之資料，例如參考文獻、出版物、數據庫、數據庫條目和本文引用之技藝係以引用併入本申請粟中，即使在引用中並未明確說明。在引用來源與本申請案之陳述衝突的情況下，以本申請案中之陳述為準。

本發明藉由下列非限制性實施例進一步說明。

[實施例]
縮寫列表

實施例 1. 以 HNF4a-saRNA 進行玻管內 研究

以HNF4a-saRNA(PR3)和加擾對照組(scramble control)轉染包括HEPG2、HEP3B、PLCPRF5和SNU475之肝細胞株小組。測量HNF4a mRNA濃度。

以每孔100,000個細胞之密度將細胞接種在24孔培養皿中，並使用Lipofectamine 2000，以20nM(f.c.)之各測試項目反向轉染。在24小時之培育期後，使用Lipofectamine 2000，以20nM(f.c.)之各測試項目進行另外之前向轉染步驟。第二次轉染後24小時，將細胞裂解並收集之以藉由定量逆轉錄-PCR(qRT-PCR)測定HNF4a-mRNA濃度。如第2A-2D圖所示，在所有以HNF4a-saRNA轉染之細胞中，HNF4a-mRNA濃度增加至少75%。

於另一項研究中，以HNF4a-saRNA(PR3)轉染包括HEPG2、HEP3B和PLCPRF5之細胞小組並測量細胞增殖。第3A-3F圖顯示WST-1分析(相對增殖)結果和絕對細胞數目。HNF4a-saRNA減少所有細胞株中之細胞增殖，其中在HEP3B和HEPG2細胞株中之細胞增殖減少程度超過PLCPRF5細胞中所減少者。

表3中包括另外之HNF4a-saRNA序列和PR3周圍之基因移步序列。在PR3周圍基因移步+10/-10個核苷酸可產生PR3-40-XD7569、PR3-41-XD7570、PR3-42-XD7571、PR3-43-XD7572、PR3-44-XD7573、PR3-45-XD7574、PR3-46-XD7575、PR3-47-XD7576、PR3-48-XD7577、PR3-49-XD7578、PR3-50-XD7579、PR3-51-XD7580、PR3-52-XD7581、PR3-53-XD7582、PR3-54-XD7583、PR3-55-XD7584、PR3-56-XD7585、PR3-57-XD7586、PR3-58-XD7587、PR3-59-XD7588和PR3-60-XD7589。

當描述序列時，小寫字母=2’-O-甲基修飾的；f= 2’-氟修飾的；s =硫代磷酸酯鍵；invabasic =倒置之無鹼基加蓋的；invdT =倒置dT。

使用上述之轉染方案以表3中之HNF4a-saRNA轉染HepG2細胞。使用特異於HNF4a P1轉錄子之試劑，藉由qPCR測量HNF4a P1 mRNA濃度。作為下游標記物，亦測量以HNF4a-saRNA轉染之細胞中的白蛋白mRNA濃度。HNF4a P1 mRNA的變化顯示於表4中及第17A圖中。第17B圖顯示白蛋白mRNA之變化。藉由與管家基因β-肌動蛋白相比較來計算第17A圖和第17B圖中之相對的HNF4a P1 mRNA和白蛋白mRNA表現。

僅PR3、PR3-50(與PR3之序列相同，具有3’uu尾)、PR3-49-XD7578和PR3-50-XD7579(與PR3之序列相同，具有5’倒置之無鹼基帽和3’uu尾)之HNF4a P1表現增加超過2倍。

第18A圖和第18B圖顯示PR3和PR3-50(與PR3之序列相同，具有3’uu尾)二者之HNF4a P1 mRNA濃度增加，但HNF4a P2 mRNA濃度未增加。第18C圖顯示HNF4a P1 mRNA增加導致白蛋白mRNA濃度增加。

PR3-50、PR3-50-XD7579和PR3-49-XD7578顯示出在食蟹猴肝細胞中有活性。第19A圖和第19B圖中顯示出HNF4a P1 mRNA和白蛋白mRNA之變化。PR3-49-XD7578中之種子序列與人序列同源，而PR3-50-XD7579在不影響活性之種子區末端具有單一錯配。

實施例 2. 代謝失調中之 HNF4 α-saRNA

在大鼠中，強制重新表現轉錄因子HNF4a可誘導其他由肝細胞表現之轉錄因子表現；恢復從經CCl4處理之動物分離出的末期患病的肝細胞之功能；及藉由恢復患病之肝細胞來迅速逆轉致命之肝衰竭(Nishikawa et al.,J Clin Invest . 2015, 1533–1544，其全部內容以引用方式併入本文)。本研究中使用高脂肪飲食(HFD)大鼠模型以研究HNF4a對動物代謝之影響。研究透露高脂肪飲食會促進高血糖和全身胰島素抗性，許多研究人員已檢查高脂肪飲食對肌肉和肝臟生理，以及胰島素信號轉導的影響。接著，一般公認高脂肪飲食(HFD)可用來產生有效之囓齒動物模型以用於具有胰島素抗性及受損之β細胞功能的代謝症候群。

本研究之目的係調查在注射HNF4a-PR4+樹枝狀聚合物時被激活之內源性HNF4是否將救援高脂肪飲食表型。本研究之終點包括幾種糖尿病(葡萄糖、HbA1C、C-肽和胰島素)、肥胖(器官重量和重量損失)、炎症(IL6、IL-1β、α2M、TNFα和WBC)及肝功能(ALT、AST和氨)的標記物。

材料和方法
測試項目

該實驗之測試項目為rrHNF4a-PR4(大鼠特異性)。此外，使用非靶向雙鏈體，FLUC-500018作為陰性對照組。RNA寡核苷酸之序列：

關鍵試劑

樹枝狀聚合物之合成和表徵。依前述合成5(G₅ )之三乙醇胺-核心PAMAM樹枝狀聚合物並藉由IR、NMR、MS和HPLC^(3-7) 表徵。將樹枝狀聚合物儲存於-20℃。

用於注射之PBS(磷酸鹽緩衝之鹽水)係來自UniRegion生物技術，目錄編號UR-PBS001。

RNA分離.根據製造商之方案，以RNeasy迷你套組(Qiagen，荷蘭Venlo)分離總RNA。

互補DNA(cDNA)合成. 根據製造商之方案，使用Quantitect逆轉錄套組，以在10μL反應物(Qiagen公司)中之500ng RNA合成cDNA。

定量PCR. 使用Taqman Fast Advanced Master (FAM) Mix (Life技術公司)和QuantiFast SYBR Green (Qiagen)在Applied Biosystems 7900HT實時PCR系統(Life技術公司)上進行定量性PCR。反應係在一式三份之孔中進行。

ELISA套組. 根據製造商之方案使用下列ELISA套組：大鼠胰島素，Mercodia目錄編號：10-1250-01；大鼠IL-1β，RayBiotech目錄編號ELR-IL1b；大鼠α-2巨球蛋白，Cloud-Clone目錄編號SEB017Ra；大鼠介白素6，Cloud-Clone目錄編號SEA079Ra;和大鼠TNF-α，BioLegend目錄編號438207。

動物飼養

用於此項研究之動物為6-8週齡之Wistar雄性大鼠。為了誘導HFD表型，餵食動物由83%標準飲食(LabDiet®目錄編號5001)、15%豬油(SIGMA目錄編號L0657)和2%膽固醇(SIGMA目錄編號C8503)所組成之高脂肪飲食16週。實驗期間，在動物飼養所中將動物安置在籠子裡，每個籠子三隻。每天維持22±3℃，50±20%濕度和12小時之夜間/暗循環的標準控制環境，每小時換氣15-20次。

實驗設計

將24隻大鼠(HFD)分成四組，每組6隻。在第1天處死第1組(對照組)。在第1、3、5、12和17天為第2-3-4組注射。為第2組注射600μl之PBS、第3組注射600μl之加擾RNA+樹枝狀聚合物(SC+D)、為第4組注射600μl之HNF4a-PR4 saRNA+樹枝狀聚合物(HNF4+D)(表5)。考慮Wistar大鼠之平均體重(300毫克)計算HNF4a-saRNA劑量。在處死動物之前，在第22天收集血液樣本。在投藥前一天，將樣本置於冰箱中過夜。在投藥上午，從冰箱中取出樣本，並令其在室溫下解凍。接著，將RNA寡核苷酸與樹枝狀聚合物混合在一起，並輕輕震盪混合2至3秒。將混合物在室溫下培育25分鐘。然後將600ul之大丸藥注射入每隻動物中。

數據評估

使用非參數t檢驗和雙尾p值分析數據。將HNF4+D與SC+D比較。只有重量損失係使用非參數t檢驗和單尾p值計算。在95%之置信區間內，P值低於0.05被認為是統計上有意義。

結果與討論

將24隻HFD大鼠隨機分為4組。在實驗開始之前測量動物之體重(第4圖)。

在治療完成時，經注射HNF4a-saRNA+樹枝狀聚合物(HNF4a+d)之動物顯示出明顯較高之體重減輕(第5A圖)及降低之肝臟重-體重比(第5B圖)，類似於降低之白色脂肪-體重比(第3C圖)。胰臟-體重比和棕色脂肪-體重比保持不變(第3D圖和第3E圖)。該等結果表明HNF4a-saRNA減少體重和肝臟重，但不影響其他器官，諸如胰臟和棕色脂肪組織。取而代之的，甘油三酸酯及LDL、HDL、HDL/LDL比和總膽固醇變化形廓(第6A、6B、6C、6D和6E圖)並未觀察到顯著降低。然而，H&E染色顯示出HNF4a+D組之肝臟中的脂肪含量降低(第7A圖)，特別是肝臟膽固醇(第7B圖)。與未改變之總膽固醇相比較，肝臟膽固醇降低表明HNF4a-saRNA在肝臟中之特定作用。

與SC+D組(第8A圖)相比較，HNF4a減少炎症標記物，諸如介白素1β(IL-1Β)及α2巨球蛋白(α2M)(在肝纖維化期間修復和重塑的標記物)濃度(第8B圖)。介白素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α (TNFα)和白血球(WBC)沒有變化(第8C、8D和8E圖)。類似地，丙胺酸轉胺酶(ALT)、天門冬胺酸轉胺酶(AST)和氨未改變(第9A、9B和9C圖)。在糖尿病表型方面觀察到相反的結果。在經處理之動物中，葡萄糖濃度降低(第10A圖)；相反地，C-肽顯著增加(第10B圖)，而胰島素和HbA1C沒有變化(第10C和10D圖)。

在轉錄濃度上，HNF4-P1(從P1啟動子表現之同種型)被明顯上調，然而以SYBR和FAM二種探針測量之總體轉錄子濃度(從P1和P2啟動子二者表現之HNF4a-P1/P2同種型)保持不變(第11A、11B和11C圖)。

結論

HNF4a-saRNA處理似乎改善該測試動物之HFD表型。體重損失較高和肝臟重-體重比降低，及脂質膽固醇特定減少支持此說法。同樣地，檢測到炎症標記物IL-1β和α2M減少和葡萄糖減少。再者，TNFα未改變，這表明在此治療濃度下沒有毒性。

於進一步之研究中，加入另一非HFD大鼠之對照組。此組提供健康試驗動物之參數。在幾個時間點採取血液樣本以界定HNF4a之最佳“作用窗口”。

實施例 3. HNF4a-saRNA 在 高脂飲食 (HFD) 餵養之大鼠模型中治療血脂異常 (dyslipidemia) 並促進有利之代謝分佈
方法
基於樹枝狀聚合物活體內遞送 siRNA

從三乙醇胺核心開始，接著依前述重複麥可(Micheal)加成反應和醯胺化以合成G5樹枝狀聚合物。為了形成經HNF4saRNA塗層之G5樹枝狀聚合物-siRNA複合物，首先以N/P([G5中之總終端胺]/[saRNA中之磷酸鹽])比等於5將G5與saRNA混合並保持在37℃下30分鐘。然後，經由靜脈內途徑注射G5-saRNA複合物。本研究中使用rrHNF4a-PR4。

動物模型、實驗設計和樣本收集

從國立台灣大學動物中心取得18隻體重為300±20克之雄性Wistar大鼠。依循用於科學目的之動物的護理和使用的嚴格法規適當安置大鼠。將每組為三至四隻之大鼠安置在(22±2℃)，濕度65%-70%之光線受控制的房間中。餵食大鼠高脂肪和高膽固醇飲食(83%標準飲食、15%豬油和2%膽固醇)(LabDiet®目錄編號5001、SIGMA目錄編號L0657、SIGMA目錄編號C8503)。4週後，將大鼠隨機分成3組並經由尾靜脈注射PBS、0.6mg/kg HNF-4α saRNA+樹枝狀聚合物(HNF+D)或0.6mg/kg加擾saRNA+樹枝狀聚合物(SC+D)(在最終體積為600μl之PBS中)。16週後，收集血液樣本，為動物稱重並將其處死。移出肝臟和胰臟並稱重。亦評估白色和棕色脂肪含量。相對於體重來表示肝臟、胰臟和脂肪重量。

血清生化變化形廓

以VITROS 5.1 FS化學系統(Ortho-Clinical Diagnostics公司)測量丙胺酸轉胺酶(ALT)、天門冬胺酸轉胺酶(AST)、膽固醇、三酸甘油酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、氨、白血球(WBC)、葡萄糖、胰島素、α-2巨球蛋白(A2M)、介白素1β(IL-1β)和介白素6(IL-6)的血清濃度。在脂質分析方面，使用商業套組(Sigma公司，美國密蘇里州)測定所收集之血液樣本的膽固醇和TG含量及總量。透過TG/HDL比來評估胰島素抗性。TG/HDL比≥大於3被認為是胰島素抗性的指標。根據製造商之方案使用下列ELISA套組：1). 大鼠胰島素，Mercodia目錄編號10-1250-01。2). 大鼠IL-1β，RayBiotech目錄編號ELR-IL1b。3). 大鼠α-2巨球蛋白，Cloud-Clone目錄編號SEB017Ra。4). 大鼠介白素6，Cloud-Clone目錄編號SEA079Ra。5). 大鼠TNF-a，BioLegend目錄編號438207。6). 大鼠白蛋白，Bethyl Laboratories目錄編號E110-125。

肝臟脂質萃取和定量

在測量肝臟膽固醇方面，以200μl之氯仿：異丙醇：NP-40(7：11：0.1)萃取10毫克肝組織。按照製造商之指示，使用膽固醇/膽固醇酯定量套組(K603-100，Biovision)以酶催化方式定量從肝臟萃取之膽固醇。

在萃取三酸甘油酯方面，將組織(〜100mg)在1ml含有5%NP-40之水溶液中均化。在水浴中緩慢加熱至80-100℃後，將樣本保持在水浴中2-5分鐘，或直至NP-40變得渾濁，再冷卻至室溫。隨後重複加熱。然後將樣本在微量離心機中以最高速度離心2分鐘，以移除任何不溶性物質。按照製造商之指令，使用三酸甘油酯定量套組(K622-100，Biovision)，以酶催化方式定量從肝臟萃取之三酸甘油酯。

組織學

將來自肝臟之樣本固定在10%磷酸鹽緩衝之福馬林中，包埋在石蠟中，並以蘇木精-伊紅(H&E)染色。

蛋白質組分析

依先前之報導使用質譜分析進行磷酸蛋白質組實驗(27)。簡單地說，將細胞溶解在尿素細胞溶解緩衝液(8M尿素、10mM Na₃ VO₄ 、50mM Naf、100mM β磷酸甘油和25mM Na₂ H₂ P₂ O₇ )中，並藉由依序加入1mM DTT和5mM 碘乙醯胺來還原和烷基化蛋白質。然後，加入固定之胰蛋白酶以分將蛋白質分解成肽。與胰蛋白酶培育過夜後，按照製造商之指導方針(除了洗提緩衝液含有1M乙醇酸外)，使用OASIS HLB柱(Waters)，在真空歧管盧藉由固相萃取(SPE)將肽脫鹽。依Larsen之描述(28)和Montoya (29)描述之修飾，使用TiO₂ 色層分析法從所得之肽混合物富集磷酸肽。將TiO₂ 色層分析介質加入SPE洗提之肽中，並一邊轉動一邊培育5分鐘。然後，將TiO₂ 介質包裝在空的旋轉尖嘴中並以1M乙醇酸，5%TFA洗滌三次。以5%NH₄ OH洗提磷酸肽，並在真空濃縮器中乾燥。

將乾燥之磷酸萃取物溶解於0.1%TFA中，並依前述在LTQ-orbitrap中藉由奈米流LC-MS/MS分析(27)。梯度洗提係在90分鐘內使用2%至35%之緩衝液B，並使用緩衝液A(緩衝液A：0.1%甲酸水溶液；緩衝液B：0.1%甲酸之乙腈溶液)來平衡流動相。在多級獲取模式中取得MS/MS。使用Mascot Distiller(版本1.2)將MS原始檔轉換成Mascot Generic格式，而針對SwissProt數據庫(2013.03版本)進行之搜索受限於使用Mascot搜索引擎(版本2.3)之人輸入。親體和片段質荷值所允許之質量窗口分別為10ppm和600 mmu。包括在搜索中之可變修飾為甲硫胺酸、焦麩胺酸(N端)之氧化及絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸之磷酸化。將搜索對decoy數據庫進行比較來過濾結果以包括那些可能具有小於1%之錯誤發現率者。使用PESCAL，經由取得每個肽離子之前三種同位素的萃取離子層析圖(XIC)的波峰面積來定量(31,32)。XIC之質量和保留時間窗口分別為7ppm和1.5分鐘。

轉染反應

為了分析基因激活和蛋白質表現，將肝細胞以每孔1×10⁵ 細胞之密度接種在24孔盤中。按照製造商之說明書(生命科技公司，目錄編號11668019)將最終濃度為50nM之lipofectamine 2000 HNF4a-saRNA或加擾之saRNA加入細胞中以進行轉染。24小時後重複處理並在72小時之時間點收穫細胞。以最終濃度為10μM之利福平(rifampicin)處理所有實驗。

RNA 萃取

萃取總RNA以進行逆轉錄(QuantiFast^® Reverse transcription，Qiagen公司)並藉由實時PCR(QuantiFast^® SYBR^® Green Master mix)擴增靶的cDNA。使用之cDNA探針為下列之來自Qiagen的QuantiTect^® SYBR探針。

實時 PCR 探針

依照製造商(Qiagen，Applied Biosystems)之說明以下列SYBR/FAM探針進行實時PCR：

用於西方墨點法之蛋白質萃取

使用傳統RIPA緩衝液(50mM Tris-HCL、150mM 氯化鈉、1.0% Igepal、0.5%脫氧膽酸鈉和0.1%十二烷基硫酸鈉)萃取總蛋白質。然後，按照製造商之說明書(Bio-Rad Bradford Assay)，使用Bradford分析定量總蛋白質含量。藉由SDS-PAGE分開總蛋白萃取物，並轉移到PVDF膜上，然後以針對HNF4a(Abcam，目錄編號ab92378)、CYP3A4(Abcam，目錄編號ab124921)、白蛋白(Abcam，目錄編號ab131176)和HSP90(Stressgene，目錄編號SPA-846)之抗體探查。以與HRP軛合之第二抗體(1：5000)檢測感興趣之蛋白質，並根據製造商之方案以LI-COR Western Sure ECL受質可視化。

螢光素酶分析

根據製造商之說明書(Promega p450-Glo，TB325)進行螢光素酶分析。

數據分析

所有數值均以平均值±標準偏差(SD)表示。使用Student T檢驗進行組別之間的統計比較，置信區間95%；p＜0.05被認為是統計上有意義(SPSS版本17.0，IBM公司，紐約Armonk)。

結果

由 HNF4a-saRNA 誘導之 HCC 細胞中的 HNF-4 α 表現： 為了測試saRNA靶向激活HNF-4α，以哺乳動物特異性saRNA瞬時轉染常用之HepG2、Hep3B和PLCPRF5 HCC細胞株。使用與任何已知之人序列均不具有顯著同源性之非特異性dsRNA(加擾)作為陰性對照組。將50nM之雙股加擾-RNA或HNF4a-saRNA轉染入HepG2、Hep3B細胞和PLCPRF5細胞中。72小時後評估HNF-4α表現。藉由定量性RT-PCR分析證明HNF4a-saRNA在所有細胞株中顯著誘導HNF-4αmRNA表現。與未經轉染者相比較，HNF4a-saRNA造成HepG2細胞中之HNF-4αmRNA濃度增加3倍(p＜0.0001)(第2A圖)；Hep3B細胞中增加6倍(p= 0.0022)(第2B圖)，而在PLCPRF5細胞中增加2倍(p=0.0087)(第2C圖)。加擾核苷酸不會誘導HNF-4αmRNA濃度(第2A、2B和2C圖)。藉由西方點墨驗證蛋白質層級之HNF-4α表現(第12A圖)。相對於未經轉染之對照組，HNF4a-saRNA增加3倍HNF-4α表現。當以光密度分析法定量蛋白質條帶時，在10μM利福平之存在(CYP450誘導劑)下，HNF4a-saRNA增強HepG2細胞之能力而進一步增加HNF-4α蛋白質之表現，變化可高達5倍(第12B圖)。HNF4a-saRNA誘導白蛋白表現增加15倍，而當以10μM利福平處理時，白蛋白表現可被進一步擴增(35倍)(第12C圖)。與未經轉染之HepG2細胞相比較，CYP3A43之蛋白質表現增加5.6倍(第12D圖)。藉由螢光素酶分析可證實HNF4a-saRNA轉染亦增加細胞色素p450活性(第12H圖)。藉由qPCR測量時細胞色素p450上調，其中觀察到CYP3A4 之濃度顯著增加1.5倍(p=0.05) (第12E圖)；CYP3A5 之濃度增加2倍(p=0.05) (第12F圖)和CYP3A7 之濃度增加3.6倍(p=0.05) (第12G圖)。

HNF-4α增加已知促進代謝調節之信號傳導途徑和轉錄因子的活性：使用質譜分析來自經HNF4a-saRNA轉染之HepG2、Hep3B和PLCPRF5細胞株的蛋白質溶胞產物，調查出現在HNF-4α表現下游之總體蛋白表現和磷酸蛋白變化。

在過度代表分析中顯示出在經HNF4a-saRNA處理之細胞株中蛋白質濃度明顯改變的基因富集在調節葡萄糖轉運、脂質代謝和能量產生之途徑中。參與脂肪酸β氧化和生酮作用之基因被觀察到蛋白質表現增加。在先前之高脂肪飲食餵養之動物研究中亦記錄觀察到肝臟中之三酸甘油酯濃度的變化(第13I圖)與脂質轉運P4HB 和SEC24C 之介導子在玻管中之變化同步，該研究中建議減少脂肪酸β氧化以促進肝臟脂肪累積，同時據報導生酮作用可防止脂肪肝損傷和高血糖症。P4HB 參與肝臟VLDL組裝和脂質穩態，而SEC24C 為將飲食中之脂肪輸送穿越腸吸收細胞的速率限制步驟。亦在所有經HNF4a-saRNA處理的細胞株中均觀察到YAP1 在多個位點之蛋白質表現和去磷酸化減少。YAP1 為 Hippo信號轉導途徑之下游靶的且被認為在器官大小中具有作用。延長激活YAP1 已顯示出可導致成年小鼠之肝臟大小增加，然而，此效果在抑制YAP1表現時是可逆的。

在代謝信號傳導途徑中亦觀察到蛋白激酶之表現增加。這些包括糖原合酶激酶-3β(GSK3β)和cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA)調節次單位的二種同種型(PRKAR1A 和PRKAR1B )，及環形AMP反應元件結合蛋白1(CREB1) 。這些因子減低導致非酒精性脂肪肝病之病理生理變化。

HNF4a-saRNA處理後參與該途徑之基因的基因表現變化總結於表6A-6D中：

表 6A . 參與葡萄糖轉運之基因的基因表現變化

表 6B . 參與脂質代謝之基因的基因表現變化

表 6C . 參與代謝信號傳導之基因的基因表現變化

表 6D. 經 HNF4a-saRNA 處理的細胞中存在於反應組學 ( Reactome)“ 脂質代謝 ” 途徑中蛋白質表現顯著改變之基因的基因表現變化

HNF4a-saRNA 樹枝狀聚合物處理增加 HNF-4 α 之肝臟表現： 由於HNF-4α被saRNA上調引起預測之脂質和膽固醇代謝途徑改變，在持續高脂肪飲食(HFD)之大鼠模型中調查遞送治療量之HNF4a-saRNA樹枝狀聚合物(0.6mg/kg)或加擾之寡核苷酸對照組(加擾之樹枝狀聚合物)的生理效應。以HFD餵養18隻Wistar雄性大鼠(6-8週齡)16週。將動物分成三組，每組6隻。在第1、3、5、12和17天為第1-3組注射。為對照組1注射600μl之PBS；為對照組2注射600μl之加擾樹枝狀聚合物並為實驗組3注射600μl之HNF4a-saRNA樹枝狀聚合物。在處死動物之前，在第22天收集血液樣本以供分析並採取肝之葉活體組織切片以立即萃取總RNA(第14圖)。

為了確認saRNA在肝臟樣本中之靶的接合，使用HNF4a-P1啟動子特異性FAM標記之探針分析來自組織切片之總RNA的HNF4a轉錄子表現。來自經處理之肝臟的HNF4a轉錄子相對於加擾對照組而言增加1.5倍(p值=0.0411)(第13A圖)。各治療組之白蛋白轉錄子濃度沒有變化表明對於從動物釋出白蛋白並沒有病理需求或者白蛋白之穩態濃度純粹係透過先前描述之大鼠中的反饋調節來維持(Pietrangelo et al,J Clin. Invest, vol.89：1755 (1992)) (第13B圖)。肝功能參數(AST、ALT和氨)未觀察到明顯變化表明HNF4a-saRNA樹枝狀聚合物注射並未造成肝臟特異性禁忌症(contraindication)(第13C圖、第13D圖和第13E圖)。當測量來自經處理之大鼠的炎症循環標記物時，觀察到IL-1B明顯降低1.3倍(p= 0.0411)(第13F圖)，這表明炎症減輕(Sgroi et al.,PLoS ONE, vol.6：e25442 (2011))，而a2M降低1.8倍(p= 0.0260)(第13G圖)，這表明至少有一促進胰島素抗性之因子減少。白血球未觀察到異常變化(第15A圖)。

HNF-4 α 對血清脂質變化形廓之效果： 與對照組相比較，HNF4a-saRNA樹枝狀聚合物處理明顯降低經處理之動物的肝臟膽固醇的濃度超過40%(p=0.0022，第13H圖)，儘管該動物持續被飼餵高脂肪飲食。此外，在經處理之動物中可觀察到肝臟三酸甘油酯降低1.3倍(p= 0.0388)(第13I圖)，且HDL/LDL比增加1.4倍(p= 0.0465) (第13J圖)。將經福馬林固定之石蠟包埋(FFPE)的組織切片加工處理，並以蘇木精和伊紅染色以用於脂肪沉積之超微結構觀察。當與觀察到點狀未染色區域之對照組(PBS和加擾)相比較時，該經HNF4a-saRNA處理之組中的H&E染色似乎更強烈爆發(第7A圖)。與未經處理之對照組相比較，經HNF4a-saRNA樹枝狀聚合物處理組之總體重損失亦明顯高出3.5倍(p = 0.0263) (第5A圖)。經HNF4a-saRNA樹枝狀聚合物處理動物之白色脂肪組織對體重之比及肝臟對體重之比亦分別顯示出明顯降低1.15倍和降低1.2倍(分別為p=0.0411和p=0.0260)(第5C圖和第5B圖)。胰臟重量和棕色脂肪含量未明顯減少(第15B圖和第15C圖)。

HNF-4 α 標準化之葡萄糖穩態： 與對照組相比較時，HNF4a-saRNA樹枝狀聚合物處理會引起血清葡萄糖濃度明顯降低1.3倍(p = 0.0129)(第10A圖)。循環之胰島素濃度未受HNF4a-saRNA影響(第10C圖)表明似乎不可能藉由胰臟分泌胰島素來清除葡萄糖。IL-6的濃度降低(第8C圖)和三酸甘油酯/HDL比降低1.9倍(p= 0.0411)(第16A圖)表明代謝變化形廓改善，這可能有助於在HNF4a-saRNA處理後降低胰島素抗性。

總之，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)包含無症狀肝脂肪變性肝至硬化的寬譜組織學。無肝臟炎症或纖維化存在時，大多數NAFLD患者具有單純之脂肪肝。NAFLD進展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)具有重要的意義，因為它可演變為肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌。肥胖、糖尿病和胰島素抗性為NASH進展的重要危險因素。因此，為了防止或管理NASH之進展，了解對脂質和葡萄糖代謝極為重要之關鍵因素是很重要的。HNF4α為轉錄控制之複雜網絡的中心，在該轉錄控制之複雜網絡中，HNF4α遭受破壞直接與數種人類疾病，包括糖尿病和脂肪變性相關。對HNF4a轉錄調控網絡的深入了解凸顯此轉錄因子於調節參與葡萄糖、膽固醇和脂肪酸代謝之肝臟特異性基因上的重要性。

此研究證明在其中涉及生物合成三酸甘油酯、磷脂代謝和花生四烯酸代謝的NAFLD大鼠模型中以HNF4a-saRNA重置HNF4a之轉錄網絡的重要性(第16B圖)。

由HNF4a-saRNA造成之基因表現改變的分析顯示出葡萄糖運輸和胰島素抗性之顯著改變：

葡萄糖轉運 . 在肝細胞中藉由HNF4a調節ARSA 、 PSAP 、 GBA3 和 Cdc42 交互作用蛋白4表明更有效率之葡萄糖轉運有助於降低經HNF4a-saRNA處理之動物中葡萄糖血清濃度。

胰島素抗性 . 藉由HNF4a-saRNA加上減少IL6來調節用於脂質轉運 (P4HB 和 SEC24C )、用於脂質代謝(YAP1 降低)和用於氧化脂肪酸(HADHB 、ACADVL) 之因子；肝臟膽固醇、肝臟三酸甘油酯(TG)、HDL/LDL比和TG/HDL比均指向HNF4a-saRNA誘導增加HNF4a降低胰島素抗性。

在脂肪肝疾病之模型(經飼餵HFD之動物)中，HNF4a-saRNA處理造成因子之集合網絡變化在代謝變化形廓顯著改善時達到高峰。目前並無針對脂肪肝或其進展為肝炎之單一藥劑。大多數管理需要以數種藥物進行多靶向方法，甚至手術以治療代謝危險因素並提高胰島素敏感性。

藉由saRNA/奈米顆粒軛合物激活HNF4a被證明可作為治療或管理脂肪肝疾病(例如其特徵為血液中膽固醇或脂肪(脂質)異常升高的血脂異常及NAFLD)和胰島素抗性時之單一藥劑的新範例代表。

實施例 4. HNF4a-saRNA 之化學修飾

在PR3-50-XD7579和PR3-49-XD7666(與PR3-49-XD7578相同之序列，但沒有錯配)加入針對抑制免疫刺激及/或增加穩定性之化學修飾。完全穩定化之saRNA包括PR3-50-XD7663和PR3-49-XD7667。免疫抑制設計包括PR3-50-XD7664和PR3-49-XD7668。其他經化學修飾之設計包括PR3-50-XD7665和PR3-49-XD7669。彼等之序列包含在表7中。

在HepG2細胞中之玻管內效力研究的結果顯示於表8中。如表8中所示，完全穩定化和免疫抑制設計增加HNF4a P1 mRNA濃度超過50%且為活性的。

PR3-50-XD7665和PR3-49-XD7669具有允許保留siRNA活性之化學修飾模式。根據表8、第20A圖和20B圖，PR3-50-XD7665和PR3-49-XD7669未顯示表明siRNA和saRNA可耐受之修飾中之差異的HNF4a上調或白蛋白上調。

在HepG2細胞中比較該完全穩定化序列(PR3-50-XD7663和PR3-49-XD7667)和免疫抑制設計序列(PR3-50-XD7664和PR3-49-XD7668)與親本序列(PR3-50-XD7579、PR3-49-XD7666和PR3-50)之活性。如第20C圖所示，該完全穩定化和免疫抑制設計之序列顯示出與PR3-50-XD7579、PR3-49-XD7666和PR3-50具相同活性。

免疫刺激活性研究

在人PBMC中測試活性HNF4a-saRNA，PR3-50-XD7579(亦稱為XD-7579)、PR3-50-XD7663(亦稱為XD-7663)、PR3-50-XD7664(亦稱為XD-7664)、PR3-50-XD7668(亦稱為XD-7668)之免疫刺激活性。該分析包括表9中所示之陽性對照組。

藉由ficoll梯度離心法將來自2個獨立供體的PBMC分離出；100000細胞/孔。用於轉染之對照組和測試項之濃度為100nM和300nM；用於直接培育之濃度為0.5和1.5μM。使用RNAiMax，0.3μl/孔作為轉染對照組。以一式三份進行轉染。培育時間為24小時。採取25μl上清液，使用MSD平台(Meso scale diagnostics LLC，美國Rockville)以一式三份進行分析，該MSD平台為採用電化學發光讀出之多套式ELISA系統。根據製造商之說明進行用於干擾素α、介白素-6和腫瘤壞死因子α之三重分析(3-plex assay)。

所有4種HNF4a-saRNA均未顯示出免疫刺激之證據，而陽性對照組為活性的。IL6濃度顯示於表10-1中。IFNα濃度顯示於表10-2中。TNFa濃度顯示於表10-3中。

實施例 5. PR3-50-XD7664 之生物信息學分析和玻管內研究

PR3-50-XD7664(亦稱為XD7664或XD-07664)為saRNA化合物，其經過設計以上調核受體HNF4a之表現。此研究之範圍為相關於基因激活活性、血清穩定性、可能之免疫刺激副作用和基於序列之可能的脫靶效應的XD-07664表徵。

材料和方法
測試項目

XD-07664為在有義和反義股二者之3’端具有uu-突出端的19聚體雙股saRNA。該有義股進一步在5’端以倒置之無鹼基殘基和數個2’OMe修飾進行修飾：

依照標準程序在固體支撐吻上進行寡核苷酸合成。寡核苷酸在被釋出以供進一步測試之前必須滿足下列QC標準：單股同一性：計算之質量的+/-0.05%(藉由MS)；單股純度：＞85%全長寡核苷酸(藉由HPLC)；雙股體純度：＞90%，藉由非變性HPLC。將樣本冷藏貯存於4℃直至使用時。

細胞培養和 saRNA 轉染

自ATCC(馬利蘭州Rockville，#HB-8065)購買HepG2細胞並培養在提供者所建議之條件(具有10%FCS、100U/ml青黴素、100mg/ml鏈黴素之MEM)下。為了轉染，將細胞以15000細胞/孔之密度直接平皿接種在96孔細胞培養皿中的轉染溶液中(“反向轉染”)。根據製造商之方案，使用0.4μL/孔之脂質體2000(Lipofectamine 2000)(Life Technologies)作為轉染劑。以一式四份進行所有轉染。24小時後，提供細胞新鮮培養基並在1小時後加入新的轉染混合物(“前向轉染”)。48小時總培養時間之後，以150μl之溶胞混合物(QuantiGene 2.0分析套組，Panomics/ Affimetrix)將細胞溶解，該溶胞混合物係以細胞培養基做1：3之稀釋。將溶胞產物冷凍保存，直到分析。

mRNA 量化

使用分支型DNA分析(Panomics公司/Affymetrix公司，加州Fremont)在用於人HNF4a和白蛋白之QuantiGene 2.0版及用於人β肌動蛋白之QuantiGene 1.0版中定量mRNA。此基於雜交之分析系統提供化學發光讀數。探針組係由Panomics訂製設計。

根據製造商之說明進行該分析：簡單地說，將溶胞經物與對應之探針組雜交過夜，隨後進行加工處理以發展信號。在Victor Light發光讀數器(Perkin Elmer)上測量信號。在轉染實驗分析方面，將所取得之靶基因的發光單位對管家β-肌動蛋白標準化。將所取得之經單獨之轉染試劑處理(“模擬”)的細胞的相對表現值設為1。使用XL擬合軟體(ID business solution有限公司)進行劑量-反應實驗之曲線擬合及測定EC₅₀ 值。

從健康供體之血沉棕黃層 (buffy coat) 分離出人類 PBMC

藉由梯度離心分離外周血單核細胞(PBMC)。簡單地說，藉由Ficoll梯度(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，德國Steinheim)將三位供體之人類血沉棕黃層血液(從德國Suhl輸血醫學研究所取得)進行分級分離。吸出白血球層，藉由第二次梯度離心及最後以細胞培養基(不含補充劑之RPMI1640)洗滌二次來純化。藉由顯微鏡評估來自所有3位供體之細胞的活力和形態並指定二位供體之PBMC用於接下去之實驗中。

分析 PBMC 中之免疫刺激

為了監測XD-07664之潛在免疫刺激活性，將來自二位健康供體之新鮮分離出的PBMC以100000個細胞/孔之密度接種在常規之96孔組織培養盤中的100μl完全培養基(補充有標準濃度之L-麩胺醯胺和10%FCS之RPMI1640)中。根據製造商之方案使用Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific，#13778)作為轉染試劑，以100nM至300nM之測試樣本或對照組序列轉染細胞，一式三份。使用單獨之轉染試劑作為模擬對照組。另外之對照組係直接添加500nM和1500nM之濃度而不轉染。培育24小時後，收集上清液並保持冷凍直至分析。

MSD ELISA 分析

使用MSD平台(Meso scale diagnostics LLC，美國Rockville)測量PBMC上清液中之細胞因子含量，該MSD平台為使用電化學發光讀出之多套式ELISA系統。根據製造商之說明進行干擾素α、干擾素-6和腫瘤壞死因子α之3-重分析(3-plex assay)。使用MSD Discovery workbench 4.0軟體進行標準曲線擬合並計算細胞因子量。

大鼠血清中之穩定性分析

為了測定血清穩定性，將5μL在PBS中之50μM XD-07664溶液與45μL之中性大鼠血清混合，並在37℃下，在血清中培育0、0.5、1、3、6、24和48小時。將5μL XD-07664溶液在45μl之PBS中培育以作為非特異性降解之對照組。在指定之時間點藉由蛋白酶K處理來停止培育以分解所有存在於血清樣本中之核酸酶。以蛋白酶K處理後，樣本中之RNA是穩定的。隨後藉由通用之AEX-HPLC方法，在提高之pH(11)和40℃之變性條件下，在Dionex DNA Pac PA200柱(4×250mm)上分析樣本。

在這些條件下，將XD-07664的二條單股彼此分開並與降解產物分開，且可以不同波峰之形式評估。藉由在相同條件下分析二條參考單股來完成二條單股之分配。根據該參考單股，該波峰可被標記為有義和反義。在數據評估方面，僅評估XD-07664之二條單股的波峰面積。將大鼠血清在T=0時之波峰面積設定為100%，而所有其他時間點對T=0之波峰面積標準化。然後，以對T= 0標準化之%完整股的形式報告數據。

生物信息學

該HNF4a-saRNA XD-07664具有siRNA雙股體典範結構，其在每一股上具有一19聚體雙股區及2nT 3’-突出端。因此，saRNA XD-07664可能顯示出siRNA樣活性，包括可能之脫靶效應。

首先使用專有算法預測在人、恆河猴、食蟹猴、小鼠和大鼠轉錄組(transcriptome)(NCBI參考數據庫數釋出80，2017年1月)中分別與saRNA XD-07664的有義股和反義股完全或部分互補的潛在脫靶位點。由於siRNA之位置1和19以及UU3’-突出端對siRNA活性並非必要，僅考慮使用位置2至18之17聚體序列來預測與該檢查之saRNA股具有多達4個錯配之可能脫靶位點。基於錯配之數目和位置，計算每個預測之脫靶位點的特異性分數。最可能之脫靶位點的特異性評分係分配給對應之saRNA股。此外，分別計算各saRNA股之具有0、1、2、3或4個錯配的預測之脫靶基因數(脫靶頻率)。

接著分析可能之種子依賴性，微小RNA樣脫靶效應。siRNA可經由種子區(通常為鹼基2至7)與任何mRNA分子之3’-UTR內的互補序列鹼基配對以類似於miRNA之方式起作用。分析極有可能存在功能性miRNA靶位點之已知miRNA的種子區序列。此可藉由比較各saRNA股之種子區(位置2至7)與來自人、恆河猴、大鼠和小鼠之已知成熟miRNA(miRBase版本21)的種子區(位置2至7) (miRBase釋出21，2014年6月)來完成。若適用的話，將有義和反義股之種子區特性和對應之miRNA名稱列表。

然後，創建所有已檢查之物種及saRNA之二股的預測脫靶列表。詳細描述預測之脫靶位點的特性：股的定向、登錄編號、基因ID、基因符號、轉錄子描述、脫靶位點之序列、錯配之數目和位置、靶的位點之定位(坐標和區域)、完美之種子匹配的指示(位置2-7之6聚體種子及位置2-8之7聚體種子)。為了允許更精確地評級，再基於錯配之數目、錯配之位置和在5’-UTR和CDS或3’-UTR中之預測的靶位點之位置來將預測之脫靶位點進一步分類。分類範圍從第1類(最有可能脫靶)到第11類(最不可能脫靶)，最有可能之脫靶點不具有或具有很少的錯配且saRNA種子區與該預測之脫靶點的3’UTR具有完美匹配。接著，為每個脫靶位點定義代表性轉錄子以減少相同之靶的位點序列可能出現在多個轉錄子中或在相同之轉錄子內的重複性。最後，該預測之脫靶係根據所分配之脫靶類別評級。

在最後之步驟中，鑑定匹配時具有多達2個錯配之所有預測的脫靶位點並指出人類與其他物種至少一者相一致之脫靶點。使用在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ homologene，Release 68之HomoloGene數據庫鑑定恆河猴、大鼠和小鼠之同源基因。使用可在
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/gene/DATA/gene_history.gz(NCBI基因數據庫，2017年1月)取得之基因歷史數據更新基因Id和基因符號。食蟹猴之同源基因未列在HomoloGene數據庫中。因此，它們係藉由與官方基因符號相比較來鑑定。

結果與結論
效力研究

為了測定基因誘導效力，在6個濃度劑量反應實驗(50nM、20nM、5nM、2nM、0.5nM和0.2nM)中將XD-07664轉染入HepG2細胞中。測量HNF4a及其下游靶白蛋白之mRNA濃度作為讀出值(參見第21A和21B圖及表11)。使用XL擬合軟體來進行劑量-反應實驗之分析並測定3.01nM之EC₅₀ 值(其定義為取得HNF4a之半最大誘導的濃度)。

PBMC 分析

為了監測可能之免疫刺激效力，將XD-07664轉染入來自二位供體之經接種的原代人PBMC。為了分析，在MSD ELISA平台上測量細胞因子干擾素α、介白素6和TNF-α。使用2個未經修飾之siRNA、CpG寡核苷酸和未經修飾之與膽固醇軛合的siRNA作為陽性對照組。XD-07664轉染後24小時，未觀察到明顯分泌該3種細胞因子之任一者，而所有對照組均顯示出預期之反應。總之，我們可以說在所測試之條件下XD-07664未顯示出任何不欲有之免疫反應。

穩定性

在大鼠血清中，RNA之降解主要係由取決於二價陽離子之3’-核酸外切酶誘導。在XD-07664方面，進行下列觀察(參見第23圖；表12)：中性大鼠血清中之XD-07664被迅速降解；在37℃下培育30分鐘後觀察到反義峰72%降解且有義峰82%降解；在37℃下培育1小時後該有義股僅出現10%全長產物及該反義股之5%全長產物；在37℃培育3小時後該二條股幾乎完全降解。

從結果看來，可歸結出若沒有保護(例如藉由脂質體配製劑保護)，界當施用於體內時，XD-07664將在循環中迅速降解。

脫靶分析

進行脫靶分析以解決該saRNA化合物XD-07664可能之脫靶效應。結果顯示於表13-1和表13-2中。預測二個saRNA股和各種物種之具有多達4個錯配的脫靶位點並測定脫靶頻率。

反義股與任何其他人類轉錄子具有至少2個錯配。有義股與任何其他人類轉錄子具有至少1個錯配。預測22個人類脫靶位點與反義股匹配時具有多達2個錯配，而33個人類脫靶位點與有義股匹配時具有多達2個錯配。在反義股和有義股二者中，與人類脫靶位點之匹配沒有零錯配者，6個脫靶點與有義股匹配時具有一個錯配。基於該分析，saRNA XD-07664被預測在人、食蟹猴、大鼠和小鼠中具特異性，並假設該有義股為無活性的(由於該倒置之無鹼基單位)。

二個saRNA XD-07664股之saRNA種子區(2-7)與來自人、恆河猴、大鼠和小鼠之已知miRNA的種子區(2-7)並不一致。此應能避免該saRNA XD-07644經由功能性miRNA靶位點作為miRNA。

實施例 6. PR3-50-XD7664 在人化肝臟小鼠模型中之活性 .

在人化肝臟小鼠模型中證明PR3-50-XD7664之活性，該模型中之人肝細胞已被移植入小鼠中以生成人化肝臟(例如，參見Kim et al,Transplantation Proceedings , vol.46：1186 (2014))。在第1天和第3天經由全身途徑投予小鼠包封在合適之配製劑中的劑量為0.3-3mg/kg之PR3-50-XD7664，諸如SMARTICLE®奈米顆粒(描述於Rodrigueza et al.,Cancer Chemother. Pharmacol , vol.74：151 (2014)中)，在第5天處死小鼠。第5天，藉由qPCR測量小鼠肝臟中之人HNF4a mRNA及在第5天，藉由測量小鼠血中之人血清白蛋白來證明PR3-50-XD7664之影響。PR3-50-XD7664引起小鼠肝臟中人類HNF4a mRNA增加及血清中之人白蛋白濃度增加。

實施例 7. PR3-50-XD7664 在 代謝異常 食蟹猴中之活性

在已發展出糖尿病且具有非酒精性脂肪肝病的食蟹猴中證明PR3-50-XD07664之活性(例如，參見Wang et al.,Journal of Diabetes and Metabolism , 7, 1, 2016)。經由全身途徑投予代謝異常食蟹猴包封在NOV340 SMARTICLE® (Marina Biotech，華盛頓州Bothell)奈米顆粒中之劑量為3mg/kg之PR3-50-XD7664，每週投予二次(D1/D3)，共4週。

NOV340 SMARTICLE®奈米顆粒之脂質組分係由1-棕櫚醯-2-油醯-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS)和4-(2-胺乙基)-嗎啉基-膽固醇半琥珀酸酯(MOCHOL)組成。NOV340係由莫耳比6：24：23：47之POPC、DOPE、CHEMS和MOCHOL組成。奈米顆粒在生理pH下為陰離子性且其特定脂質比賦予該脂質體“pH可調”特性和電荷，此將根據該微環境之周圍pH而變化以促進跨越生理膜之運動。SMARTICLES®奈米顆粒具有平均直徑近似約50nm-約150nm或約100-約120nm之大小以避免大範圍之立即性肝隔離症，在經由靜脈內途徑注射後促進更長時間之全身分佈並改善血清穩定性而導致更廣泛之組織分佈，據報導，在肝臟、脾臟和骨髓中具有高濃度。

該研究之方案顯示在第23圖中。“第1週”為它們接受第一個劑量當天之給藥前濃度。“第5週”為4週給藥時間表結束時之時間點。監測每隻動物之體重、ALP、ALT、AST、三酸甘油酯、膽固醇、膽紅素、血液白蛋白、HDL/LDL比和葡萄糖濃度。第24A圖顯示在第1週(給藥前)、第2週、第3週、第4週、第5週(給藥4週後)測量之每隻動物的ALT濃度。第24B圖中顯示每隻動物之AST濃度。第24C圖和24D圖中顯示每隻動物之體重和體重變化。第24A至24D圖中之每條線代表經處理之單一動物的變化。使用配對t檢驗可在第4週見到ALT統計學上顯著減低並可在第5週見到ALT、AST和體重統計學上顯著減低。臨床觀察之結果正常，表明體重減輕並非因為毒性。

其他實施態樣

應當理解的是，雖然本發明已結合其詳細說明來描述，前述內容旨在說明而不欲限制本發明之範圍，本發明之範圍係由所附之申請專利範圍的範圍定義。其他態樣、優點和修飾係在下列申請專利範圍之範圍內。

前述和其他目的、特性和優點將從下文中本發明之特定實施態樣的描述顯明，如在附圖中之說明，其中類似之參考符號係指透過不同視野之相同部件。該圖形不一定按比例繪製，而是將重點放在說明本發明之各種實施態樣的原理。

第1圖之示意圖說明涉及本發明之saRNA的功能之核酸部分之間的關係。

第2A-2D圖顯示以HNF4a-saRNA轉染之肝細胞中之HNF4a mRNA濃度：第2A圖：HEPG2細胞；第2B圖：HEP3B細胞；第2C圖：PLCPRF5細胞；和第2D圖：SNU475細胞。HNF4a基因表現被HNF4a-saRNA上調。

第3A-3F圖顯示WST-1細胞增殖分析結果及HEPG2、HEP3B和PLCPRF5細胞株之絕對細胞數(未經轉染的、經FLUC對照組轉染的或經HNF4a-saRNA轉染的)。第3A圖(HEPG2細胞)、第3C圖(HEP3B)和第3E圖(PLCPRF5)為WST-1相對增殖分析結果。第3B圖(HEPG2細胞)、第3D圖(HEP3B)和第3F圖(PLCPRF5)為絕對細胞數目。

第4圖顯示所有組別中之大鼠在任何處理之前的體重。

第5A-5E圖顯示所有組別中之大鼠體重喪失(第5A圖)、肝臟/體重比(第5B圖)、白色脂肪/體重比(第5C圖)、胰臟/體重比(第5D圖)和棕色脂肪/體重比(第5E圖)。

第6A-6E圖顯示所有組別中之大鼠的三酸甘油酯(第6A圖)、HDL(第6B圖)、LDL(第6C圖)、HDL/LDL比(第6D圖)和總膽固醇(第6E圖)濃度。

第7A圖顯示所有組別中之脂肪含量的H&E染色。第7B圖顯示所有組別中之肝臟膽固醇濃度。

第8A-8E圖顯示所有組別中之炎症標記物濃度：IL-1B(第8A圖)、α2M(第8B圖)、IL-6(第8C圖)、TNFα(第8D圖)和WBC(第8E圖)。

第9A-9C圖顯示所有組別中之肝功能標記物濃度：ALT(第9A圖)、AST(第9B圖)和氨(第9C圖)。

第10A-10D圖顯示所有組別中之糖尿病標記物濃度：葡萄糖(第10A圖)、C-肽(第10B圖)、胰島素(第10C圖)和HbA1C(第10D圖)。

第11A-11C圖顯示在所有組別之大鼠中以FAM探針(第11A圖)測量之HNF4-PR1濃度(啟動子同種型1)和以FAM(第11B圖)和SYBR(第11C圖)二種探針測量之總體轉錄子濃度(HNF4a-PR1/PR2，啟動子同種型1和2)。

第12A圖顯示西方點墨數據，該數據顯示HNF4a蛋白表現濃度之變化。上圖：轉染方案和利福平(rifampicin)處理之示意圖。下圖：細胞色素P450家族3亞家族A成員43(CYP3A43)、白蛋白、HNF4a和HSP90表現之蛋白質萃取物的分析。使用HSP90作為管家基因(HKG)。

第12B-12D圖為第12A圖西方點墨之定量。第12B圖顯示HNF4a-saRNA上調HNF4a蛋白表現。第12C圖顯示HNF4a-saRNA上調白蛋白表現。第12D圖顯示HNF4α-saRNA上調CYP3A43蛋白表現。利福平(一種CYP450誘導劑)進一步增強該上調。

在qPCR中測量細胞色素p450上調並觀察細胞色素P450家族3亞家族A成員4(CYP3A4)(第12E圖)、細胞色素P450家族3亞家族A成員5(CYP3A5)(第12F圖)和細胞色素P450家族3亞家族A成員7(CYP3A7)(第12G圖)之上調。以DMSO或利福平處理HepG2細胞並以sa-HNF4-RNA或加擾-RNA(Scramble-RNA)轉染之。第二次轉染後72小時，收穫細胞並萃取RNA。將CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7對ACTIN標準化。星號表示如下述之統計顯著性：* p＜0.05(單尾t檢驗，95%置信度)。

第12H圖顯示以DMSO或利福平處理並以HNF4a-saRNA或加擾-RNA轉染之HepG2細胞的螢光素酶分析數據。結果證明HNF4a-saRNA轉染增加細胞色素p450活性。

第13A-13J圖顯示HNF4a-P1(第13A圖)、白蛋白(第13B圖)、AST(第13C圖)、ALT(第13D圖)、氨(第13E圖)、IL-1B(第13F圖)、α2M(第13G圖)、肝臟膽固醇(第13H圖)、肝臟三酸甘油酯(第13I圖)和HDL/LDL(第13J圖)。分析從肝組織萃取之RNA的(A)HNF4a-P1和(B)白蛋白表現。將HNF4a-PR1對HPRT標準化。將白蛋白對GAPDH標準化。(C)天門冬胺酸轉胺酶(AST)、(D)丙胺酸轉胺酶(ALT)和(E)氨之血清濃度顯示在HNF4a-saRNA處理時無顯著變化。(F)介白素1β(IL-1B)和(G)α-2巨球蛋白(A2M)顯示出顯著減少。(H)肝臟膽固醇、(I)三酸甘油酯和(J)HDL/LDL在HNF4a-saRNA處理時改變。星號表示如下述之統計顯著性：* p＜0.05(雙尾t檢驗，95%置信度)。

第14圖為動物處理之示意圖。

第15A-15C圖證明白血球(WBC)(第15A圖)、胰臟體重比(第15B圖)和棕色脂肪體重比(第15C圖)顯示出無明顯變化。

第16A圖顯示處理後之TG/HDL比。星號表示如下述之統計顯著性：*p＜0.05，**p＜0.01(雙尾t檢驗，95%置信度)。

如第16B圖所示，在肝臟之脂質代謝背景下描述在經HNF4a-saRNA處理之細胞株中顯示出表現顯著增加或減少的基因。“Up”箭頭指示觀察到基因之蛋白產物的表現增加，而“down”箭頭指示基因之蛋白產物的表現減少。星號註記在肝臟中之表現濃度＞20的基因(根據Illumina Body Map)而基因名稱之顏色對應於在基因上游存有HNF4a結合位點。

第17A圖顯示在以HNF4a-saRNA轉染之細胞中之HNF4a P1 mRNA的改變。第17B圖顯示在以HNF4a-saRNA轉染之細胞中之白蛋白mRNA的變化。

第18A圖顯示在以PR3或PR3-50轉染之細胞中HNF4a P1 mRNA濃度增加。第18B圖顯示在以PR3或PR3-50轉染之細胞中HNF4a P2 mRNA 濃度未增加。第18C圖顯示在以PR3或PR3-50轉染之細胞中白蛋白mRNA 濃度增加。

第19A圖顯示在以HNF4a-saRNA轉染之食蟹猴肝細胞中之HNF4a P1 mRNA的濃度增加。第19B圖顯示在以HNF4a-saRNA轉染之食蟹猴肝細胞中之白蛋白mRNA濃度增加。

第20A和20B圖顯示bDNA分析之結果。在接種後48小時測量以50nM PR3-49-XD7666、PR3-49-XD7669、PR3-49-XD7668、PR3-49-XD7667、PR3-50-XD7579、PR3-50-XD7665、PR3-50-XD7664及PR3-50-XD7663轉染之HepG2細胞中HNF4a P1 mRNA和白蛋白mRNA變化。第20C圖顯示以PR3-50、PR3-50-XD7579、PR3-49-XD7666、PR3-50-XD7663、PR3-49-XD7667、PR3-50-XD7664及PR3-49-XD7668轉染之HepG2細胞中之HNF4a P1 mRNA濃度增加。

第21A-21B圖顯示藉由在HepG2細胞中之劑量-反應實驗分析之XD-07664的基因誘導效力。第21A圖顯示HNF4a mRNA倍數變化。第21B圖顯示白蛋白mRNA倍數變化。

第22圖顯示來自中性大鼠血漿中之XD-07664的穩定性研究之結果。

第23圖顯示研究配製在NOV340 SMARTICLES®中之PR3在代謝異常之食蟹猴中之活性的方案。

第24圖顯示在給藥4週後，代謝異常之食蟹猴之肝酶濃度和體重變化。第24A圖：ALT濃度；第24B圖：AST濃度；第24C圖：體重；及第24D圖：體重變化。

Claims

一種合成性經分離之短激活RNA(saRNA)，其上調肝細胞核因子4a(HNF4a)基因之表現，其中該saRNA與SEQ ID No.1之一區域至少80%互補且其中該saRNA具有14至30個核苷酸。
如申請專利範圍第1項之saRNA，其中該saRNA呈單股。
如申請專利範圍第2項之saRNA，其中該saRNA包含3’突出端。
如申請專利範圍第2項之saRNA，其中該saRNA經修飾。
如申請專利範圍第4項之saRNA，其中該saRNA包含至少2個修飾。
如申請專利範圍第4項之saRNA，其中該修飾包含下列任一者：2’-F、2’-OMe、反向脫氧核糖或介於核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
如申請專利範圍第2項之saRNA，其中該saRNA包含SEQ ID No.136。
如申請專利範圍第1項之saRNA，其中該saRNA呈雙股且包含反義股和有義股。
如申請專利範圍第8項之saRNA，其中該反義股包含SEQ ID No.136。
如申請專利範圍第9項之saRNA，其中該有義股包含選自SEQ ID No.135之序列。
如申請專利範圍第8項之saRNA，其中該saRNA經修飾。
如申請專利範圍第11項之saRNA，其中該saRNA包含至少2個修飾。
如申請專利範圍第11項之saRNA，其中該修飾可包含下列任一者：2’-F、2’-OMe、反向脫氧核糖或介於核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
如申請專利範圍第11項之saRNA，其中該修飾係在該有義股上。
如申請專利範圍第11項之saRNA，其中該修飾係在有義股和反義股二者上。
如申請專利範圍第8項之saRNA，其中該反義股和有義股中至少一者包含3’突出端。
一種上調細胞中HNF4a基因之方法，其包含對該細胞投予如申請專利範圍第1項之saRNA。
如申請專利範圍第17項之方法，其中HNF4a P1 mRNA被上調。
如申請專利範圍第17項之方法，其中HNF4a P2 mRNA未被上調。
如申請專利範圍第17項之方法，其中該細胞為過度增殖性細胞。
如申請專利範圍第20項之方法，其中該細胞為癌細胞。
如申請專利範圍第21項之方法，其中該細胞為肝細胞癌(HCC)細胞。
如申請專利範圍第17項之方法，其中該細胞為肝細胞。
如申請專利範圍第17項之方法，其中HNF4a基因被上調至少50%。
如申請專利範圍第24項之方法，其中HNF4a基因被上調至少2倍。
一種調節參與脂質機制之靶基因之方法，其包含投予如申請專利範圍第1項之saRNA。
如申請專利範圍第26項之方法，其中該靶基因參與神經鞘脂質(Sphingolipid)代謝、神經鞘脂質分解代謝、脂肪酸β氧化作用、生酮作用(ketogenesis)、相關氧物種(ROS)之解毒作用、脂質轉運或YAP1磷酸化蛋白質組。
如申請專利範圍第26項之方法，其中該靶基因係選自由下列所組成之群組：ABHD3、ACACB、ACADM、ACADVL、ACOT2、ACSL4、AKR1C2、AKR1C1、AKR1D1、APOA2、ARSA、ARSB、ASAH1、EPHX2、FDPS、GBA3、GPX1、HADHB、HMGCL、HMGCLL1、HMGCS1、IDH1、LPIN3、P4HB、PCYT1A、PCYT2、PIK3R2、PLIN2、PPP1CB、PPT1、PTGR1、PSAP、SEC23A、SEC24C、TBL1X、TXNRD1和YAP1。
一種調節參與葡萄糖轉運之靶基因之方法，其包含投予如申請專利範圍第1項之saRNA。
如申請專利範圍第29項之方法，其中該靶基因為TRIP10。
一種調節參與代謝信號傳導之靶基因之方法，其包含投予如申請專利範圍第1項之saRNA。
如申請專利範圍第31項之方法，其中該靶基因係選自由下列所組成之群組：TRIM28、PRKAR1A、GSK3B、CREB1、ARPP19和PRKAR1A。
一種調節個體之血清脂質濃度或葡萄糖濃度、治療個體之血脂異常或治療個體之胰島素抗性之方法，其包含投予如申請專利範圍第1項之saRNA。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該血清葡萄糖濃度被降低。
如申請專利範圍第34項之方法，其中該血清葡萄糖濃度被降低至少25%、50%或75%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之肝臟膽固醇濃度被降低。
如申請專利範圍第36項之方法，其中該個體之肝臟膽固醇濃度被降低至少10%、25%、50%或75%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之肝臟三酸甘油酯濃度被降低。
如申請專利範圍第38項之方法，其中該個體之肝臟三酸甘油酯濃度被降低至少10%、25%、50%或75%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之HDL/LDL比被增加。
如申請專利範圍第40項之方法，其中該個體之HDL/LDL比被增加至少10%、25%、50%、75%、100%、1.5倍或2倍。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之IL-6濃度被降低。
如申請專利範圍第42項之方法，其中該個體之IL-6濃度被降低至少10%、25%、50%或75%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之三酸甘油酯/HDL濃度被降低。
如申請專利範圍第44項之方法，其中該個體之三酸甘油酯/HDL濃度被降低至少10%、25%、50%或75%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之白色脂肪組織對體重比被降低。
如申請專利範圍第46項之方法，其中該個體之白色脂肪組織對體重比被降低至少10%、25%或50%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之肝臟對體重比被降低。
如申請專利範圍第48項之方法，其中該個體之肝臟對體重比被降低至少10%、25%或50%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之IL-1B濃度被降低。
如申請專利範圍第50項之方法，其中該個體之IL-1B濃度被降低至少10%、25%或50%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之a2M濃度被降低。
如申請專利範圍第52項之方法，其中該個體之a2M濃度被降低至少10%、25%或50%。
如申請專利範圍第33項之方法，其中該個體之循環胰島素濃度未顯著改變。
如申請專利範圍第54項之方法，其中該個體之胰臟重量或棕色脂肪含量未顯著改變。
如申請專利範圍第26、29、31或33項之方法，其中該saRNA呈雙股且包含反義股和有義股。
如申請專利範圍第56項之方法，其中該反義股包含SEQ ID No.136。
如申請專利範圍第55項之方法，其中該有義股包含SEQ ID No.135。
一種醫藥組成物，其包含合成性經分離之saRNA和CYP450誘導劑，其中該saRNA與SEQ ID No.1或SEQ ID No.2之一區域至少80%互補且其中該saRNA具有14至30個核苷酸。
如申請專利範圍第59項之醫藥組成物，其中該CYP450誘導劑為利福平(rifampicin)。
一種上調細胞中靶基因之方法，其包含對該細胞投予如申請專利範圍第59項之組成物。
如申請專利範圍第61項之方法，其中該細胞為高度增殖性細胞。
如申請專利範圍第62項之方法，其中該細胞為癌細胞。
如申請專利範圍第63項之方法，其中該細胞為肝細胞癌(HCC)細胞。
如申請專利範圍第61項之方法，其中該靶基因係選自由下列所組成之群組：HNF4a、白蛋白和CYP3A43。
如申請專利範圍第61項之方法，其中該靶基因被上調至少25%、50%或75%。
如申請專利範圍第66項之方法，其中該靶基因被上調至少2倍。