CN113874505A - 一种与kras蛋白特异性结合的适配体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与KRAS蛋白特异性结合的适配体及其使用方法。由于一方面的适配体对用于调节体内细胞生长信号传导系统的主要因素KRAS具有优异的结合强度，因此阻断癌细胞中的KRAS突变与构成细胞生长信号传导系统的亚蛋白Raf‑1激酶蛋白的结合，从而能够有效地抑制癌细胞生长和癌症发生。此外，由于所述适配体能够与癌细胞中的KRAS特异性结合，因此可以被广泛地使用于治疗或预防癌症的药物组合物、诊断剂和试剂等的领域中。

Description

一种与KRAS蛋白特异性结合的适配体及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种与KRAS蛋白特异性结合的适配体及其使用方法。
背景技术
适配体(aptamer)为具有茎、环、发夹等结构的单链DNA或RNA分子，并且为通过具有固有三级结构来具有与特定蛋白、病毒或肽等的结合能力的物质。为了发现以高亲和力与特定靶物质结合的适配体，需要重复进行1015个或多个DNA文库与靶物质之间的结合和分离过程，从而从一组随机合成的DNA文库中体外(in vitro)筛选与靶物质特异性结合的小数DNA的过程，这种方法被称为SELEX(Systemic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)。
适配体不仅具有被称为抗体替代物质的高亲和力，而且由于其为DNA或RNA物质，与蛋白抗体相比，其具有更高的耐久性，并且可以大量生产，并且几乎不发生免疫排斥，因此由于适配体的这种特点，与现有的蛋白药物相比，其具有更高的使用价值作为疾病治疗剂。
此外，KRAS为调节体内细胞生长信号传导系统的主要因素之一，并且被认为是大多数癌症患者中发现的最具代表性的致癌蛋白。在正常状态下，KRAS根据是否发生EGF等细胞生长信号，通过GDP或GTP结合来以失活或激活状态存在，从而调节信号传导。然而，众所周知，当发生KRAS蛋白的核苷酸序列的12位氨基酸甘氨酸变成天冬氨酸或缬氨酸的突变时，GTP总是以结合的形式存在，因此被异常激活，向子阶段发送持续的细胞生长信号，从而导致癌症。
尤其是，由于30-50％的KRAS突变蛋白出现在结肠癌、肺癌中，70-95％的KRAS突变蛋白出现在胰腺癌中，如果无法控制KRAS突变蛋白，即使向癌症患者施用抗癌剂，也仍然无法期待有效的治疗结果，并且KRAS突变蛋白的异常激活导致的持续的细胞生长信号表明KRAS突变为癌症发生和癌症发展的重要因素，因此虽然控制激活的KRAS的抗癌剂的开发正在进行中，但尚未开发出直接控制KRAS的靶抗癌剂，因此需要对其进行开发。
发明内容
技术问题
一方面是提供一种与KRAS蛋白特异性结合的适配体。
另一方面是提供一种包括所述适配体作为活性成分的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
另一方面是提供一种包括所述适配体的用于检测癌细胞的组合物或用于检测癌细胞的试剂盒。
再一方面是提供一种通过使用所述适配体来提供用于诊断癌症的信息的方法。
再一方面涉及一种包括向有需要的个体施用所述适配体的预防或治疗癌症的方法。
技术方案
一方面提供一种适配体，其包括由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成的核苷酸序列，并且与KRAS蛋白特异性结合。
以下，将更详细地描述。
所述“适配体(Aptamer)”是指一种单链核酸，其自身具有稳定的三级结构，同时具有能够以高亲和力和特异性与靶分子结合的特征。所述适配体可以为DNA、RNA或变形的核酸。自从首次开发出名为SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment)的适配体发现技术以来，不断发现了许多能够与包括小分子有机物、肽和膜蛋白在内的各种靶分子结合的适配体。适配体常常与单抗体相比较，因为其具有能够以固有的高亲和力和特异性与靶分子结合的特点，并且被认为具有作为替代抗体的巨大潜力，尤其是作为“化学抗体”。
KRAS蛋白为调节体内细胞生长信号传导系统的主要因素之一，并且被认为是大多数癌症患者中发现的最具代表性的致癌蛋白。在正常状态下，KRAS根据是否发生EGF等细胞生长信号，通过GDP或GTP结合来以失活或激活状态存在，从而调节信号传导。然而，众所周知，当发生KRAS蛋白氨基酸序列的12位氨基酸甘氨酸变成天冬氨酸或缬氨酸的突变时，GTP总是以结合的形式存在，因此被异常激活，向子阶段发送持续的细胞生长信号，从而导致癌症。
KRAS蛋白除了在动物体内制备外，还可以通过使用小鼠等哺乳细胞、昆虫细胞和大肠杆菌等细胞来制备，也可以通过化学合成来制备。在通过培养细胞或化学合成来制备的情况下，可以容易地制备突变体。在本文中，突变体是指几个氨基酸被取代的或氨基酸序列的一部分，并且是指KRAS原本具有的具有至少一个或多个活性的蛋白或肽。当氨基酸被取代时，被取代的氨基酸可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸。一方面所述的KRAS蛋白特别包括其突变体，例如可以为KRAS蛋白氨基酸的12位氨基酸甘氨酸变成天冬氨酸或缬氨酸的突变。
一方面的适配体可以与野生型KRAS蛋白，具体地与KRASG12D特异性结合，阻断KRAS蛋白与Raf-1蛋白之间的相互作用，有效地抑制癌细胞生长和癌症发生信号传导活性，从而表现出癌细胞凋亡活性，并且本说明书的一具体方面对其进行确认。
一方面的适配体通过与KRAS蛋白或KRASG12D特异性结合来阻断KRASG12D与Raf-1激酶的结合，从而阻断来自任意哺乳动物的KRAS的信号传导活性。哺乳动物可以提及例如，灵长类动物(例如，人类、猴子)、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠(rat)、豚鼠(guinea pig))和宠物、家畜和劳作动物(例如，狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。
抑制KRAS的信号传导活性是指阻断KRAS具有的任意信号传导活性的能力。例如，众所周知，KRAS与Raf-1激酶结合，然后通过MEK等来对ERK进行磷酸化，从而激活癌症发生信号传导通路，并且通过这些信号传导通路来诱导各种细胞因子或趋化因子的生产。因此，KRAS信号传导阻断活性可以是指阻断存在于KRAS信号传导通路的下游的这些细胞因子或趋化因子等的生产的活性。由于这些细胞因子或趋化因子的表达诱导癌细胞的生长和发生，因此KRAS的信号传导阻断活性也可以是指对其活性的阻断。
所述适配体的长度没有特别限制，通常可以在约200个核苷酸以下，但众所周知，核苷酸总数越少，化学合成和大量生产就越容易，成本优势也就越大。因此，从适用于药物用途的角度来看，一方面的发明，例如适配体可以为约10至200个核苷酸、50至150个核苷酸、55至100个核苷酸、60至90个核苷酸的长度。
一方面的适配体可以包括核心序列或随机序列，并且可以在本说明书中互换使用。所述核心序列是指如果具有显示其序列的核苷酸序列，则能够执行适配体的功能的核心区域。所述适配体的核心序列可以为一方面的适配体，可用于增加与KRAS的结合、KRAS与Raf-1之间的结合阻断活性等的所有核苷酸序列，例如可以由SEQ ID NO:1或2组成的核苷酸序列。一方面的适配体可以是指具有在两端5'端和3'端都恒定保守的引物核苷酸序列(conserved primer region)与核心序列结合的形式的适配体。一方面的适配体可以进一步包括在由所述SEQ ID NO:1或2组成的核苷酸的5'端和3'端中的任何一个或多个处的5至50个核苷酸的连续多核苷酸，并且所述连续多核苷酸可以为引物序列。所述适配体的引物序列是指引物能够附着的序列。
【表1】
Figure BDA0003366967890000041
(在所述通式中，N分别独立地选自A、T、G和C，并且下划线以外的部分表示引物序列。)
一方面的适配体可以通过本说明书中公开的和本领域本身已知的方法来进行化学合成。适配体根据各种结合模式与靶物质结合，例如使用磷酸基的负电荷的离子键、使用核糖的疏水键和氢键、使用核酸核苷酸的氢键或堆积作用(stacking interaction)等。尤其是，使用与构成核苷酸的数目一样多的磷酸基的负电荷的离子键很强，并且与存在于蛋白表面的赖氨酸或精氨酸的正电荷结合。因此，不参与与靶物质的直接结合的核酸核苷酸可以被取代。尤其是，由于茎(stem)结构的一部分已经形成核苷酸对，并且面向双螺旋结构的内部，因此核酸核苷酸难以直接与靶物质结合。因此，在许多情况下，即使一个核苷酸对被另一个核苷酸对取代，适配体的活性也不会降低。即使在不形成核苷酸对的结构中，例如环结构等，当核酸核苷酸不参与与靶分子的直接结合时，核苷酸也可以被取代。
适配体可以通过使用SELEX方法及其改进方法(例如，Ellington et al.,(1990),Nature,346,818-822)来制备。在SELEX方法中，可以通过增加轮数或使用竞争物质来浓缩并筛选与靶物质的结合强度较强的适配体。因此，可以通过调整SELEX的轮数和/或改变竞争状态来获得结合强度不同的适配体、结合形式不同的适配体以及结合强度或结合形式相同但核苷酸序列不同的适配体。此外，虽然SELEX方法包括通过PCR的扩增过程，在该过程中添加诸如使用锰离子之类的突变，从而可以实施更具多样性的SELEX。
如上所述，可以通过实施优化的SELEX来进一步增强具有选择的活性的适配体。优化的SELEX可以制备确定任何序列的适配体的一部分作为随机序列的模板或掺杂有10至30％的随机序列的模板，并且可以再次实施SELEX。
包括在所述适配体中的核苷酸的核糖(ribose)可以修饰为例如，2'号碳上的氢(Hydrogen)被氟基(fluoro group)或氨基(amino group)取代，或2'号碳上的羟基(OHgroup)被甲氧基(methoty group)取代。
所述适配体可以包括由以下所示的SEQ ID NO:3至6组成的核苷酸序列中任何一个，或者，只要其通过与KRAS结合来阻断KRAS与Raf-1的结合，可以为本领域适配体的多个缀合物。
对于所述适配体的多个缀合物，缀合可以以串联(tandem)结合实施。此外，可以在缀合时使用接头。作为接头，可以提及核苷酸链(例如，1至约20个核苷酸)和非核苷酸链(例如，-(CH2)n-接头、-(CH2CH2O)n-接头、六甘醇接头、TEG接头，包括肽的接头、包括-S-S-键的接头、包括-C0NH-键的接头、包括-0P03-键的接头)。对于在所述多个缀合物中的多个，只要其为两个或多个没有特别限制，例如可以为2个、3个、或4个。
所述适配体可以包括两个或多个茎-环结构(Stem-Loop Structure)，并且所述环结构可以由4至10个核苷酸组成。
此外，所述适配体可以为在5'端和3'端中的任何一个或多个处结合或标记选自由荧光染料、半导体纳米晶体、镧系元素螯合物以及绿色荧光蛋白组成的组的一个或多个荧光体。所述“荧光体”包括能够发光的物质，即能够从另一个荧光体和共轭聚合物电解质中吸收能量作为信号显色团的物质，例如荧光染料、半导体纳米晶体、镧系元素螯合物和荧光蛋白。荧光染料的实例包括荧光素(fluorescein)、6-FAM(6-carboxyfluorescein)、TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)、罗丹明、得克萨斯红(Texas Red)、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基罗多、羧基罗丹明110、级联蓝(CascadeBlue)、级联黄(Cascade Yellow)、香豆素、Cy2(商标名)、Cy3(商标名)、Cy3.5(商标名)、Cy5(商标名)、Cy5.5(商标名)、Cy-铬、藻红蛋白、PerCP(多甲藻黄素叶绿素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4'、5'-二氯-2'、7'-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄(Lucifer Yellow)、深蓝(Marina Blue)、俄勒冈绿(OregonGreen)488、俄勒冈绿(OregonGreen)500、俄勒冈绿(OregonGreen)514、Alexa Fluor(商标名)350、Alexa Fluor(商标名)430、Alexa Fluor(商标名)488、Alexa Fluor(商标名)532、Alexa Fluor(商标名)546、Alexa Fluor(商标名)568、Alexa Fluor(商标名)594、Alexa Fluor(商标名)633、Alexa Fluor(商标名)647、Alexa Fluor(商标名)660、Alexa Fluor(商标名)680、7-氛基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY(商标名)FL、BODIPY(商标名)FL-Br2、BODIPY(商标名)530/550、BODIPY(商标名)558/568、BODIPY(商标名)564/570、BODIPY(商标名)576/589、BODIPY(商标名)581/591、BODIPY(商标名)630/650、BODIPY(商标名)650/665、BODIPY(商标名)R6G、BODIPY(商标名)TMR、BODIPY(商标名)TR、其共轭物，以及其配合物。镧系元素螯合物的实例可以包括铕(europium)螯合物、铽(terbium)螯合物和钐(samarium)螯合物。
另一方面提供一种包括所述适配体作为活性成分的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
术语“受试者”、“个体”和“患者”可以在本文中互换使用，以指脊椎动物、哺乳动物或人类。哺乳动物包括但不限于鼠类、猴子、人类、农场动物、竞技动物和宠物。还包括在体内获得或在体外孵育的生物实体(entity)的组织、细胞及其后代。
术语“治疗剂”或“药物组合物”是指在向受试者施用时赋予一些有益效果的分子或化合物。有益效果包括支持诊断决策；改善疾病、症状、障碍或病症；减少或预防疾病、症状、障碍或疾患的发生；以及通常对疾病、症状、障碍或病症的反应。
如本文所用，“治疗”或“进行治疗”或“缓解”或“改善”可以互换使用。这些术语是指获得包括但不限于治疗益处和/或预防益处的有益或期望结果的方法。治疗益处是指对治疗中的一个或多个疾病、疾患或症状的任意治疗上有意义的改善或其效果。对于预防有益，可以向有发生特定疾病、疾患或症状的风险的受试者，或报告疾病的一个或多个生理症状的受试者施用组合物，即使可能还未出现疾病、疾患或症状。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有益或期望结果的试剂的量。治疗有效量可以根据所治疗的受试者和病症、受试者的体重和年龄、病症的严重程度、施用方式等中的一个或多个而变化，并且这可以很容易地由本领域技术人员确定。此外，所述术语适用于通过在本文中所述的成像方法中的任意一个来提供用于检测的图像的剂量。特定剂量可以根据所选择的特定试剂、随后的施用方案、其是否与其他化合物组合施用、施用时间、被成像的组织以及运载其的身体传导系统中的一个或多个而变化。
术语“癌症”是指当正常的细胞凋亡平衡被破坏时，具有以细胞过度增殖和侵入周围组织为特征的一组疾病。所述癌症可以为选自由来自例如肺癌、喉癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌等的上皮细胞的癌瘤、来自骨癌、肌肉癌、脂肪癌、成纤维细胞癌等的结缔组织细胞的肉瘤、来自黑色素瘤、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤等的造血细胞的血液癌以及发生在神经组织中的肿瘤组成的组的一个或多个癌症。具体地，所述癌症可以为胰腺癌、结肠癌或肺癌。
所述用于预防或治疗癌症的药物组合物可以通过在所述适配体上混合药学上可接受的载体，即生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体和这些成分中的一种或多种来使用，并且根据需要可以进一步包括诸如抗氧化剂和缓冲液之类的其他常规添加剂。此外，可以通过额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂来制备成诸如水溶液、悬液、乳剂之类的用于注射的制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。进一步地，可以通过本领域适当的方法或使用雷明顿的文献(Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA)中公开的方法来根据各成分优选制备。所述药物组合物没有特别限制，但可以制备成注射剂或吸入剂。
根据一方面的药物组合物的施用方法没有特别限制，但根据预期的方法，可以肠胃外施用，例如静脉内、皮下、腹膜内、吸入或局部施用，或口服施用。给药量根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、排泄率和疾患的严重程度而变化。日给药量是指根据一方面的用于治疗的物质的量，其足以治疗通过向需要治疗的个体施用来减轻的疾病状态。用于治疗的物质的有效量根据特定化合物、疾病状态和其严重程度、需要治疗的个体而变化，并且这可以由本领域技术人员常规确定。作为非限制性示例，根据一方面的组合物对人体的给药量可以根据患者的年龄、体重、性别、施用形式、健康状态和疾患程度而变化。以体重70公斤的成年患者计算，所述有效量可以包括每所述组合物例如0.1μg/mL至1,000μg/mL、例如0.1μg/mL至500μg/mL、0.1μg/mL至100μg/mL、0.1μg/mL至50μg/mL、0.1μg/mL至25μg/mL、1μg/mL至1,000μg/mL、1μg/mL至500μg/mL、1μg/mL至100μg/mL、1μg/mL至50μg/mL、1μg/mL至25μg/mL、5μg/mL至1,000μg/mL、5μg/mL至500μg/mL、5μg/mL至100μg/mL、5μg/mL至50μg/mL、5μg/mL至25μg/mL、10μg/mL至1,000μg/mL、10μg/mL至500μg/mL、10μg/mL至100μg/mL、10μg/mL至50μg/mL或10μg/mL至25μg/mL、10μg/mL至350μg/mL、12.5μg/mL至300μg/mL、25μg/mL至270μg/mL、50μg/mL至150μg/mL或100μg/mL至200μg/mL的所述适配体。
所述组合物可以进一步包括抗癌剂，例如靶抗癌剂。靶抗癌剂可以是指通过靶向仅出现在特定癌细胞中的特定蛋白或特定基因变化来阻断参与癌症生长和发生的信号，从而选择性地仅杀死癌细胞的抗癌剂。
另一方面提供一种包括所述适配体的用于检测癌细胞的组合物和用于检测癌细胞的试剂盒。
所述“检测”都是指简单地“检测”试料中是否存在靶物质和对试料中的靶物质进行的“定量分析”。
所述一方面的适配体可以与用于分子成像的荧光体结合，以通过成像诊断癌症，并且所述检测剂可以包括如上所述的物质。
所述癌细胞检测剂可以用作作为检测探针的所述适配体，尤其是KRAS突变体的检测探针。适配体的标记方法没有特别限制，可以适用本身已知的方法。这种方法可以包括，例如用放射性同位素的标记、用荧光色素或染料或荧光蛋白的标记。
所述用于分子成像的荧光体是指产生荧光的所有物质，例如可以为发出红色或近红外线(near-infrared)的荧光，也可以为具有高量子产率(quantum yield)的荧光体，但不限于此。
所述用于分子成像的荧光体例如可以为荧光蛋白或其他用于成像的物质，但能够与所述适配体特异性结合的荧光体不限于此。
所述荧光体例如可以为荧光素(fluorescein)、BODYPY、四甲基罗丹明(Tertramethylrhodamine)、Alexa、花青(Cyanine)、别异花青(allopicocyanine)或其衍生物，但不限于此。
所述荧光蛋白例如可以为Dronpa蛋白、绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(redfluorescent protein,DsRFP)、作为显示近红外线荧光的花青荧光体的Cys3、Cy5.5或其他荧光蛋白，但不限于此。
所述其他用于成像的物质例如可以为氧化铁、放射性同位素等，但不限于此，可以适用于诸如MRI、PET之类的成像设备。
所述试剂盒可以为固体载体，例如基板、树脂、板(例如，多孔板)、过滤器、筒、柱和多孔材料。所述基板可以为用于DNA芯片、蛋白芯片等的基板，例如镍-PTFE(聚四氟乙烯)基板或玻璃基板、磷灰石基板、硅基板、氧化铝基板等，并且可以提及在这些基板上涂覆聚合物等的基板。树脂可以提及，例如琼脂糖颗粒、二氧化硅颗粒、丙烯酰胺和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交联二乙烯基苯颗粒、通过将葡聚糖交联为表氯醇而获得的颗粒、纤维素纤维、烯丙基葡聚糖和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物、单分散合成聚合物、单分散亲水聚合物、琼脂糖凝胶、Toyopearl等，并且也包括在这些树脂上结合各种官能团的树脂。所述试剂盒可用于例如KRAS蛋白的检测和定量。此外，所述试剂盒包括但不限于RT PCR试剂盒、微阵列芯片(micro array chip)试剂盒、DNA试剂盒或蛋白芯片试剂盒。
适配体可以通过本身已知的方法来固定在试剂盒中。例如，可以提及将亲和物质(例如，上述的)或预定官能团引入到所述适配体中，然后通过使用本领域亲和物质或预定官能团来将其固定在固体载体上的方法。预定官能团可以为能够提供用于偶联反应的官能团，例如可以提及氨基、硫醇基、羟基和羧基。本说明书还提供其中引入这种官能团的适配体。
一方面的试剂盒不仅包括用于检测癌细胞的适配体等，而且可以包括适合于分析方法的一种或多种其他组分组合物、溶液或装置。
此外，用于检测一方面的癌细胞的试剂盒可以包括底物、适当的缓冲液、用显色酶或荧光物质标记的二抗和显色底物等，以检测癌细胞。所述的底物可以采用硝酸纤维素膜、由聚乙烯树脂合成的96孔板、由聚苯乙烯树脂合成的96孔板以及玻璃制载玻片等，并且显色酶可以采用过氧化物酶(peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)等，并且荧光物质可以采用FITC、RITC等，并且显色底物液可以采用ABTS(2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))或OPD(邻苯二胺)、TMB(四甲基联苯胺)。
再一方面涉及一种提供用于诊断癌症的信息的方法，其包括：通过将生物试料与所述适配体接触来形成适配体-KRAS复合体；测量所述适配体-KRAS复合体的水平；以及将所述测得的适配体-KRAS复合体与对照组的水平进行比较，如果测得的水平高于对照组，则将其确定为癌症。
所述生物试料是指从个体中分离出来的试料，但具体可以选自血液、血清、血浆、唾液、尿液和组织样品，但不限于此。
所述方法可以包括当测得的个体适配体-KRAS复合体的水平高于未患有癌症的对照组试料的适配体-KRAS复合体的水平时，将所述个体确定为患有癌症。此外，在所述方法中，对照组是指从未患有癌症且不含癌细胞的正常人中分离出来的试料。
所述提供用于诊断癌症的信息的方法可以通过检测KRASG12D被激活的癌细胞并测量检测水平来被代替，而不是通过在癌细胞中表达的KRAS突变体检测癌细胞生长和癌症发生信号传导活性被激活的KRASG12D，从而测量适配体-KRAS复合体的水平。在此情况下，在确定为癌症的步骤中，当测得的KRASG12D被激活的水平高于作为未患有癌症的个体的对照组试料的平均检测水平时，可以将其个体确定为患有癌症。所述测得的癌细胞的检测、所述被激活的KRASG12D的检测和定量方法可以通过与免疫学方法相同的方法进行，不同之处在于使用本发明的适配体代替抗体。因此，通过使用本发明的适配体代替抗体来可以通过与酶免疫分析法(EIA)(例如，直接竞争ELISA、间接竞争ELISA、夹心ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、荧光免疫分析法(FIA)、免疫印迹检测法(例如，用作免疫印迹检测的二抗的替代品)、免疫组织化学染色法、细胞分选(cell sorting)等方法相同的方法进行检测和定量。这种方法可用于，例如测量活体或生物样品中的KRAS突变量或诊断与KRAS信号传导相关的疾患，并且通过使用本发明的适配体代替抗体来使用来自人类或非人类动物的活体样品，或使用活体以外的样品，从而可用于检测或定量KRAS的科学目的，或实验或研究目的等疾病诊断目的。
再一方面涉及一种包括向有需要的个体施用所述适配体的预防或治疗癌症的方法。
考虑本说明书的复杂性，将省略重复的内容，本说明书中未定义的术语具有本发明所属领域的通用含义。
有益效果
由于一方面的适配体对用于调节体内细胞生长信号传导系统的主要因素KRAS具有优异的结合强度，因此阻断癌细胞中的KRAS突变与构成细胞生长信号传导系统的亚蛋白Raf-1激酶蛋白的结合，从而能够有效地抑制癌细胞生长和癌症发生。此外，由于所述适配体能够与癌细胞中的KRAS特异性结合，因此可以被广泛地使用于治疗或预防癌症的药物组合物、诊断剂和试剂等的领域中。
附图说明
图1为示出当使用KRAS蛋白特异性适配体时，可以调节KRAS与Raf-1的相互作用诱导的肿瘤生长信号传导系统的模式图。
图2A、图2B和图2C为示出确认KRASG12D蛋白与筛选的适配体之间的结合强度并示出的ELISA实验结果的图。
图3A、图3B、图3C和图3D为示出由作为最终筛选的四种适配体的NBK1(图3A)、NBK1-1(图3B)、NBK2(图3C)、NBK2-1(图3D)核苷酸序列预测的二级结构的模式图。
图4为示出确认KRASG12D与Raf-1蛋白之间的结合可以被筛选的四种适配体阻断的ELISA实验结果的图。
图5为示出将NBK1和NBK2适配体转导到胰腺癌细胞系BxPC-3中，并且通过使用通过荧光检测法确认与实际KRAS蛋白的结合强度的图像(图5的顶部)和通过使用CellTiter-Glo测量细胞存活率的结果(图5的底部)的图。
具体实施方式
以下，将通过实施例和实验例更详细描述一方面。但是，这些实施例和实验例用于描述一方面，并且一方面的范围不限于这些实施例和实验例，并且一方面的实施例和实验例是为了向本领域普通技术人员更完整地描述一方面。
实施例1.KRAS蛋白和Raf-1(RAS binding domain)蛋白的量产和分离
为了KRAS的表达，购买了在N-端具有6-组氨酸标记且编码KRAS野生型基因的pReceiver-B01(Genecopiea)的基因，并且为了制备用于KRASG12D突变蛋白表达的载体，使用正向引物(F:GTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAG)和反向引物(R:CTTGCCTACGCCATCAGCTCCAACTAC)通过聚合酶链反应(PCR)扩增基因。结果，获得了载有包括6-组氨酸标记的GDP的人类KRAS野生型和载有GMPPNP的KRASG12D突变蛋白。对于蛋白表达，将其转导到大肠杆菌(E.coli)Rosetta DE3中，并且在37℃下孵育，直到使用luria-bertani(LB)在OD600下具有约0.6的值。之后，添加0.1mMβ-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(β-D-1-thiogalactopyranoside:IPTG)以诱导蛋白的表达，然后在37℃下孵育2小时30分钟，然后收获细胞(pellet)。收获的大肠杆菌细胞在使用包括50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、0.1％曲拉通X-100、14.3mMβ-巯基乙醇以及1mM PMSF、10％甘油的裂解缓冲液通过超声波破碎机粉碎后进行离心以获得可溶性(soluble)级分，然后通过使用HisTrap HP柱进行亲和层析。之后，用脱盐柱脱盐柱进行透析，并且通过使用离子交换色谱柱(ion-exchange chromatography)进行额外纯化。
实施例2.获得KRAS野生型和KRASG12D(GMPPNP loaded form)蛋白
使用所述实施例1中纯化的蛋白，KRAS野生型蛋白用包括50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH 8)、1mM DTT以及2mM MgCl2的GDP交换缓冲液进行透析，然后添加45倍的GDP和约20mM的EDTA，然后在30℃下孵育30分钟，并且额外添加50mM MgCl2，然后在4℃孵育30分钟。之后，用包括25mM三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH 7.5)、100mM NaCl、2mM MgCl2、1mM DTT以及10％甘油的缓冲液进行透析。KRASG12D蛋白用包括40mM三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH 7.5)、200mM(NH4)2SO4、10μM ZnCl2、以及5mM DTT GMPPNP的交换缓冲液进行透析，然后添加45倍的GMPPNP和碱性磷酸盐珠，并且在25℃下孵育90分钟，然后取出珠，并且用与KRAS野生型蛋白相同的缓冲液进行透析。
实施例3.筛选与KRAS特异性结合的适配体并确认其结构
进行了一项实验以有效地筛选仅与KRAS蛋白特异性结合的适配体。通过SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)方法来从由8×1014个DNA分子组成的随机文库中筛选能够与KRAS突变蛋白(KRASG12D)特异性结合的单链DNA适配体。此时，购买并使用了由40个随机序列的在5'和3'端的23个连续引物序列组成的单链DNA文库(Trilink Biotechnologies USA)，并且通过PCR扩增所需的template DNA。之后，通过改变所述PCR所扩增的产物的KRAS浓度来进行筛选KRAS特异性适配体的实验，并且各轮实验条件如下表2所示。
【表2】
Figure BDA0003366967890000121
与所述相同条件的筛选和PCR扩增过程重复10次，并且包括与所述文库中KRAS突变蛋白(KRASG12D)的结合强度最强的两种和通过修剪每个适配体来额外获得的两种，然后通过ELISA实验来确定总共四种之间的结合强度，并且其结果如图2所示。
如图2所证实，确认了与随机文库的序列相比，最终筛选的四种适配体候选物都表现出显著程度的与KRASG12D蛋白的结合强度，并且确认了其依赖于适配体浓度而上升。尤其是，确认了KRAS突变蛋白与NBK2-1、2的结合强度显著地强。如上所述，确认了能够与KRAS良好结合的最终四个适配体测序仪，并且其如图3所示。
【表3】
Figure BDA0003366967890000131
(在所述通式中，N分别独立地选自A、T、G和C，并且下划线以外的部分表示引物序列。)
通过RNA预测了所述序列所代表的筛选的DNA适配体的二级结构，并且其结构分别如图3A、3B、3C和3D所示。
如图3A、3B、3C和3D所示，确认了最终筛选的KRAS特异性适配体具有四种不同的二级结构。
实施例4.确认KRAS-特异性结合适配体抑制生物抗癌活性的效果
进行了ELISA，以确认所述实施例3中筛选的四种适配体是否与KRAS相互作用，并且与作为肿瘤发生信号传导物质的Raf-1竞争，从而抑制癌细胞的过度增殖信号，并且表现出抗癌活性。最终筛选的四种适配体以1、5倍的KRAS蛋白浓度进行处理，并且在37℃下用PBS缓冲液反应，然后进行了ELISA分析。为了有效地确认实际阻断反应，将KRASG12D蛋白和DNA适配体与GST标签结合的Raf-1蛋白一起处理，并且以对失活野生型KRAS蛋白进行处理的组作为阴性对照组，并且以仅用被激活的KRASG12D蛋白处理的组作为阳性对照组，其比例为100％，然后其余各组以此为准进行确定相对值的实验，其实验结果如图4所示。
如图4所证实，与阳性对照组相比，当用最终筛选的四种适配体处理时，以浓度依赖的方式与KRAS有效结合，从而有效地抑制Raf-1的肿瘤发生信号。尤其是，确认了当以5倍的KRAS蛋白浓度处理四种适配体时，与阳性对照组相比，KRAS活性可显著地抑制至平均约1/2水平。
实施例5.确认KRAS-特异性结合适配体体外杀死癌细胞的效果
如所述实施例4所证实，确认了所述最终筛选的适配体阻断纯化的KRAS蛋白之间的相互作用，并且确认了适配体抑制KRAS活性的能力，因此进行了验证所述适配体对实际癌细胞的功效。具体地，通过处理表达KRAS的细胞BxPC-3胰腺癌细胞系中的所述适配体，进行了确认适配体是否真正表现出癌细胞杀死功效的实验。
将以Cy3标记的NBK1和NBK2适配体60nM和具有癌细胞靶向功能的适配体AS1411设置为对照组，并且先接种细胞以其与BxPC-3反应，在24小时后使用Lipofectamine 3000试剂并转染到细胞中。24小时后，取出细胞，再次将细胞接种在96孔板中，转然后第3天，通过使用荧光显微镜来确认细胞的结果如图5的顶部所示，并且对于通过使用荧光显微镜来确认的结果，通过使用CellTiter-Glo测量细胞存活率来确认癌细胞的存活率的结果如图5的底部所示。
如所述图5的顶部和图5的底部所证实，当最终筛选的适配体NBK1和NBK2适配体与BxPC-3胰腺癌细胞系接触时，确认了癌细胞的存活率降低了1/2以上。已证实，即使与适配体AS1411相比，存活率也降低了约50％以上。总的来说，已证实，使用最终筛选的NBK1和NBK2适配体可以与癌细胞中的KRAS特异性结合并有效地抑制肿瘤发生信号，从而显著地杀死癌细胞。
序列表
<110> 核酸制药公司(Nuclixbio)
<120> 一种与KRAS蛋白特异性结合的适配体及其使用方法
<130> PX062311
<150> KR 10-2019-0083440
<151> 2019-07-10
<160> 8
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> NBK1和NBK1-1的适配体序列的共同序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
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<223> NBK2和NBK2-1的适配体序列的共同序列
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<223> NBK2-1的适配体序列
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<222> (1)..(1)
<223> 每个n是A、T、G或C
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<222> (50)..(50)
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<222> (62)..(64)
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<222> (69)..(69)
<223> 每个n是A、T、G或C
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<212> DNA
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<220>
<223> 正向引物序列
<400> 7
gtagttggag ctgatggcgt aggcaag 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 反向引物序列
<400> 8
cttgcctacg ccatcagctc caactac 27

Claims (14)

1.一种适配体，其包括由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成的核苷酸序列，并且与KRAS蛋白特异性结合。
2.根据权利要求1所述的适配体，其进一步包括：在所述适配体的5'端和3'端中的任何一个或多个处的5至50个核苷酸的连续多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的适配体，其中，所述连续多核苷酸为引物序列。
4.根据权利要求2所述的适配体，其中，所述适配体包括由SEQ ID NO:3至6组成的核苷酸序列中的任何一个。
5.根据权利要求2所述的适配体，其中，所述适配体包括两个或多个茎-环结构。
6.根据权利要求5所述的适配体，其中，所述环结构由4个至10个核苷酸组成。
7.根据权利要求1所述的适配体，其中，所述适配体为在5'端和3'端中的任何一个或多个处标记选自由荧光染料、半导体纳米晶体、镧系元素螯合物以及绿色荧光蛋白组成的组的一个或多个荧光体。
8.根据权利要求1所述的适配体，其中，所述适配体阻断KRAS蛋白与Raf-1蛋白之间的结合。
9.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括权利要求1的适配体作为活性成分。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述癌症为选自由肺癌、喉癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、肌肉癌、脂肪癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、血液癌和发生在神经组织中的肿瘤组成的组的一种或多种癌症。
11.一种用于检测癌细胞的组合物，其包括权利要求1的适配体。
12.一种用于检测癌细胞的试剂盒，其包括权利要求1的适配体。
13.一种提供用于诊断癌症的信息的方法，其包括：
通过将生物试料与权利要求1的适配体接触来形成适配体-KRAS复合体；
测量所述适配体-KRAS复合体的水平；以及
将所述测得的适配体-KRAS复合体与对照组的水平进行比较，如果测得的水平高于对照组，则将其确定为癌症。
14.一种预防或治疗癌症的方法，其包括：向有需要的个体施用权利要求1的适配体。
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