KR20230120908A - 신경교종의 악성도 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

신경교종의 악성도 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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임재준
박영준
심정민
안주원
박정만
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차의과학대학교 산학협력단
순천향대학교 산학협력단
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Abstract

신경교종의 악성도 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 신경교종의 악성도(등급)을 비침습적으로 진단할 수 있으므로, 악성교종 환자의 예후를 예측하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

신경교종의 악성도 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers for the diagnosis of high-grade gliomas and uses thereof}
신경교종의 악성도 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
뇌종양은 종양의 발생 위치 및 발견 시점 당시의 종양 크기 등에 따라 그 예후가 크게 달라지므로, 정확한 진단이 매우 중요하다. 그러나, 뇌종양의 증상은 두통, 구토, 언어장애, 기억력 감퇴, 시력 저하 등으로 매우 다양하여 환자가 조기에 발병을 인지하기 어려운 바, 조기 진단에 어려움이 있다.
현재 뇌종양의 발병 및 악성도를 진단하는 방법으로는 생검에 의한 조직학적 검사와 자기공명영상(MRI) 및/또는 컴퓨터 단층촬영(CT)을 통한 형태학적 검사 방법이 존재한다. 그러나, 상기 방법은 환자의 신체에 부담을 줄 뿐만 아니라 종양의 확인 및 등급 책정에 일정시간이 필요하다는 문제가 있다. 또한, 현재 시행되고 있는 비침습적 방법을 통한 신경교종 검사는 단순히 예후 예측용 지표로만 활용될 뿐이므로, 신경교종의 악성도 진단에 한계가 있다.
따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 임상적 접근이 용이한 진단 방법을 개발할 필요가 있다.
일 양상은 NOX2(NADPH oxidase 2) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경교종의 등급 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 신경교종의 등급 진단용 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 NOX2(NADPH oxidase 2) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는 신경교종의 등급 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 NOX2(NADPH oxidase 2) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경교종의 등급 진단용 조성물을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 NOX2(NADPH oxidase 2), HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및/또는 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)는 신경교종의 악성도에 따라 저 등급의 신경교종과 고 등급의 신경교종에서 차별적으로 발현하는 바, 상기 단백질의 검출을 통해 신경교종의 진단 및 악성도에 따른 신경교종의 진행 수준을 진단 및 예측할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "신경교종"이란, 신경교세포에서 발생하는 종양을 의미한다. 일 구체예에 있어서, 상기 신경교종은 1 등급의 신경절신경아교종(ganglioglioma), 모양성 성상세포종(pilocytic astrocytoma), 또는 뇌실막밑거대성상세포종(subependymal giantell astrocytoma), 2 등급의 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 미만성 성상교종(diffuse astrocytoma), 3 등급의 역형성별아교세포종(anaplastic astrocytoma), 악성뇌교종(anaplastic oligodendroglioma) 및 4등급의 교모세포종(glioblastoma)을 포함할 수 있다. 1 등급의 신경교종은 양성 종양으로서 비침윤성 경향을 나타내고, 예후가 좋은 특징이 있으며, 2등급 내지 4등급의 신경교종은 악성 종양에 해당한다. 상기 신경교종은 1등급 내지 4등급의 광의의 신경교종을 의미하며, 2등급 내지 4등급의 악성 종양인 협의의 신경교종인 것일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 신경교종은 원발성 신경교종 및 재발성 신경교종을 모두 포함할 수 있다. 상기 원발성 신경교종은 신경교세포 자체에서 발생하는 종양으로, 처음부터 두개강 내에 형성되며, 상기 재발성 신경교종은 뇌 이외의 장기나 기관에서 발생하여 뇌의 신경교세포로 이동하여 종양을 형성하는 경우를 의미한다.
일 실시예에서는 신경교종 환자의 NOX 발현량을 측정한 결과, 신경교종의 등급이 증가할수록 NOX 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 1등급 신경교종 환자와 비교하여 2등급, 3등급 및 4등급의 신경교종 환자에서 NOX 발현량이 유의하게 높았으며, 1등급, 및 2등급에서 3등급 및 4등급으로 진행할수록 NOX 발현량의 차이가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한, NOX2에 의해 유도된 고 해당 활성은 신경교종에서 전-섬유화 표현형 및 면역억제 성질에 의해 이질성을 촉진하는 것을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은 NOX2 발현량 또는 NOX2 발현량과 HK2, COL5A1 및 HAVCR2 발현량의 상관 관계에 따른 신경교종의 악성도를 진단할 수 있으며, 2등급 내지 4등급의 신경교종 환자를 악성 신경교종인 것을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 신경교종의 발병 여부, 신경교종의 등급(악성도)를 확인, 또는 신경교종 등급에 따른 예후를 예측하는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 신경섬유화의 진행 단계에 따라 신경교종의 등급을 결정할 수 있고, 상기 등급에 따른 예후를 예측할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "위험도"는 "위험비"와 혼용될 수 있으며, 위험도 및/또는 위험비의 증가는 생존율의 감소 및/또는 종양의 크기 및/또는 수의 증가를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "마커(marker)"란 정상군 개체와 신경교종을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 신경교종을 가지는 개체에서 증가를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 상기 신경교종을 가지는 개체의 생물학적 시료에서 상기 마커의 단백질 또는 이의 mRNA 수준을 측정함으로써 신경교종의 등급을 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간 (Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 한국인일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있다.
본 명세서에 용어, "mRNA 수준 측정"이란 혈관 협착 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다. 따라서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하고, 상세하게는 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 용어, "단백질 수준 측정"이란 신경교종의 등급 진단을 위하여 생물학적 시료에서 신경교종 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 또한, 예를 들면, 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정할 수 있다.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있다. 따라서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 에스트로겐 수용체, MUCIN5AC, 또는 아로마타제 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 NOX2(NADPH oxidase 2), HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및/또는 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한 본 명세서의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 신경교종의 등급 진단용 키트를 제공한다. 상기 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 상기 신경교종의 등급 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 LISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 키트는 질량 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 MS/MS 모드인 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다. SIM(Selected Ion Monitoring)이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 충돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면, MRM은 상기 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 충돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다. 상기 MRM(Multiple reaction monitoring) 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군, 또는 동일 개체의 단백질 발현 수준과 신경교종이 있는 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고, 또한, 신경교종 관련 질환 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 신경교종의 발병 여부 또는 신경교종의 등급을 진단할 수 있다.
다른 양상은 NOX2(NADPH oxidase 2) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는 신경교종의 등급 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 신경교종은 정상 대조군(신경교종이 없는 개체, 또는 동일 개체에서 신경교종과 관련이 없는 시료)과 비교하여, 신경교종을 갖는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 증가하므로, 상기 수준이 증가하면 신경교종으로 진단할 수 있다. 또한, 상기 신경교종은 신경교종의 위험도가 증가함에 따라 NOX2 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준이 증가하므로, 신경교종의 등급을 진달할 수 있다. 예를 들어, 신경교종 환자에서 등급이 2 등급에서 3등급 및 4등급으로 발전함에 따라 NOX2 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준이 증가할 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 방법은 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 신경교종으로 판단하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 신경교종의 등급에 따라 차등적으로 발현되므로, 2이상 환자 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 비교함으로써, 신경교종의 등급(예를 들어, 2등급, 3등급 및 4등급)을 판단하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 NOX2(NADPH oxidase 2); 및 HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)로 구성된 군에서 선택되는 단백질과 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및 무처리 대조군에 비하여 상기 NOX2(NADPH oxidase 2); 및 HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)로 구성된 군에서 선택되는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 감소시킨 피검 물질을 신경교종의 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 신경교종의 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
상기 피검 물질, 예를 들면, 약물 후보 물질, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있다.
상기 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질들을 발현하는 벡터를 세포에 형질전환 하는 단계; 상기 형질전환된 세포에 약물 후보물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 마커는 신경교종에서 발현이 증가하므로, 상기 마커의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 물질은 신경교종의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 신경교종의 악성도(등급)을 비침습적으로 진단할 수 있으므로, 환자의 신체에 부담이 덜할 뿐만 아니라, 악성교종 환자의 예후를 예측하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도 1a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 조직에서 분리한 GFAP-양성 신경교종세포에서의 NOX2 단백질 발현(녹색)을 확인한 결과이다.
도 1b는 저-등급 및 고-등급 신경교종 환자의 조직에서 NOX2-양성 염색된 세포의 강도를 나타낸다.
도 1c는 저-등급 및 고-등급 신경교종 환자의 조직에서 NOX2-양성 신경교종 세포를 정량화한 결과이다.
도 1d는 저-등급 및 고-등급 신경교종 환자의 NOX2 mRNA 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 1e는 NOX2 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
도 2a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 뇌의 18F-FDG PET/CT 이미지를 나타낸다.
도 2b는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 뇌의 18F-FDG PET/MRI에서 최대 종양 대 배경 비율(최대 TBR)의 수준을 측정한 결과이다.
도 2c는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HK2 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 2d는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HK2-양성 염색된 세포의 강도를 나타낸다.
도 2e는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 NOX2 및 HK2 양성 교모세포종을 확인한 결과이다.
도 3a는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 NOX2 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 3b는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 NOX2-양성 신경교종세포의 염색 강도를 나타낸 결과이다.
도 3c는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 NOX2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
도 3d는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 3e는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HK2-양성 신경교종세포의 염색 강도를 나타낸 결과이다.
도 3f는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HK2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
도 4a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 HK2 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4b는 저-등급 및 고-등급(G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 HK2 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4c는 HK2 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
도 4d는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HK2 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 5a는 NOX2 넉다운된 신경교종세포에서 ECAR 수준을 측정한 결과이다.
도 5b는 NOX2 넉다운된 신경교종세포에서 NOX2, HK2 및 LDH-A 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 5c는 NOX2의 선택적 억제제로 처리한 신경교종세포에서 ECAR 수준을 측정한 결과이다.
도 5d는 NOX2의 선택적 억제제로 처리한 신경교종세포에서 NOX2, HK2 및 LDH-A 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 5e는 NOX2를 과발현하는 신경교종세포에서 ECAR 수준을 측정한 결과이다.
도 5f는 NOX2를 과발현하는 신경교종세포에서 NOX2, HK2 및 LDH-A 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 6a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직을 H&E 및 M/T로 염색한 결과이다.
도 6b는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 M/T 염색 양성 영역을 측정한 결과이다.
도 6c는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 관류 MRI 분석 결과이다.
도 7a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 COL5A1 mRNA 발현 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 7b는 신경교종 환자에서 COL5A1 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 7c는 NOX2 넉다운된 신경교종세포에서 COL5A1, α-SMA 및 FN1 mRNA 수준을 확인한 결과이다.
도 7d는 NOX2 과발현하는 신경교종세포에서 COL5A1, α-SMA 및 FN1 mRNA 수준을 확인한 결과이다.
도 7e는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 GFAP-양성 신경교종세포에서 COL5A1 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 7f는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 COL5A1 양성 세포를 정량화한 결과이다.
도 7g는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 NOX2-양성 신경교종세포에서 COL5A1 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 7h는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 COL5A1 및 NOX2 양성 세포를 정량화한 결과이다.
도 7i는 COL5A1 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
도 8a는 교모세포종 환자에서 CHI3L1 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 8b는 교모세포종 환자에서 OLIG2 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 8c는 NOX2 과발현 신경교종세포에서 CHI3L1 및 OLIG2 mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 8d는 NOX2 과발현 신경교종세포에서 세포 형태를 나타낸 사진 및 세포체 길이를 측정한 결과이다.
도 8e는 저-등급 및 고-등급(G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 CHI3L1 mRNA 발현 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 8f는 CHI3L1 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
도 9a는 신경교종 환자에서 HAVCR2 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 9b는 저-등급 및 고-등급(G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 HAVCR2 mRNA 발현 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 9c는 HAVCR2 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
도 9d는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 HAVCR2 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 9e는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HAVCR2 양성 세포를 정량화한 결과이다.
도 9f는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 NOX2-양성 신경교종세포에서 HAVCR2 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 9g는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HAVCR2 및 NOX2 양성 세포를 정량화한 결과이다.
도 10a는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 COL5A1 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 10b는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 COL5A1-양성 신경교종세포의 염색 강도 및 NOX2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
도 10c는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HAVCR2 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 10d는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HAVCR2-양성 신경교종세포의 염색 강도 및 NOX2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 신경 교종 환자에서 NOX2 발현 수준 확인
1-1. NOX2 단백질 발현 수준 확인
신경 교종의 등급에 따른 NOX2 단백질의 발현 수준을 확인하기 위하여, 신경교종 환자의 GFAP-양성 신경교종세포를 면역형광염색 하였다. 먼저, 분당차병원으로부터 신경절신경아교종(ganglioglioma)(등급 Ⅰ, n=2), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma)(등급 Ⅱ. n=1), 미만성 성상교종(diffuse astrocytoma)(등급 Ⅱ, n=2), 역형성별아교세포종(anaplastic astrocytoma)(등급 Ⅲ, n=2), 악성뇌교종(anaplastic oligodendroglioma)(등급 Ⅲ, n=1) 및 교모세포종(glioblastoma) (등급 Ⅳ, n=3)을 포함하는 코호트 Ⅰ 환자 총 11명으로부터 조직을 입수하였고, 환자의 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
환자 진단 등급 나이 성별 Ki-67 IDH 변이 1p19q 공-결실 MGMT 메틸화 전체 생존기간
(개월)
1 신경절신경아교종 Ⅰ 28 남 1% Wild-type 음성 음성 56+
2 신경절신경아교종 Ⅰ 45 남 5% Wild-type 음성 음성 30+
3 희소돌기아교세포종 Ⅱ 40 남 5% Mutation 양성 음성 78+
4 미만성 성상교종 Ⅱ 33 남 5% Wild-type 음성 음성 69+
5 미만성 성상교종 Ⅱ 75 여 7% Wild-type 음성 음성 18
6 역형성별아교세포종 Ⅲ 34 남 5% Wild-type 음성 양성 5
7 역형성별아교세포종 Ⅲ 56 여 20% Wild-type 음성 음성 19
8 악성뇌교종 Ⅲ 46 남 10% Mutation 양성 양성 86+
9 교모세포종 Ⅳ 37 여 20% Wild-type 음성 양성 27+
10 교모세포종 Ⅳ 70 여 30% Wild-type 음성 양성 9
11 교모세포종 Ⅳ 59 여 10% Wild-type 음성 양성 26+
* MGMT; O-6-methylguanine DNA methyltransferase
또한, Novus Biologicals (Minneapolis, MN, USA)로부터 성상세포종(astrocytoma)(등급 I, NBP2-77872, n=1), 성상세포종(등급 II, NBP2-77873, n=1), 성상세포종(등급 III, NBP2-77874, n=1)을 포함하는 코호트 Ⅱ 환자 총 3명으로부터 조직을 입수하였고, 환자의 정보를 하기 표 2에 나타내었다.
환자 진단 등급 나이 성별 위치
1 성상세포종 I 29 여 오른쪽 전두엽
2 성상세포종 II 50 남 오른쪽 전두엽
3 성상세포종 III 41 남 오른쪽 전두엽
이후, 환자의 뇌조직을 파라핀이 포매된(embedded) 조직 블록에서 4㎛의 두께로 절단하였다. 뇌 조직 절편을 0.5% Triton-X (T8787, Sigma-Aldrich)로 투과하고 CAS-Block?? Histochemical Reagent (008120, Thermo Fisher Scientific)으로 차단한 후, polyclonal rabbit anti-NOX2 (1:100)(ab129068, Abcam) 및 polyclonal rabbit anti-GFAP (1:100) (SAB5700611, Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 이후, 2차 항체인 goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 (1:100) (A11008, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 25℃에서 2시간 동안 염색하였다. 핵 염색은 DAPI (F6057, Sigma-Aldrich)가 있는 Fluoroshield™를 사용하였다. 염색된 뇌 절편을 THUNDER Imager Tissue (Leica Microsystems Ltd., Wetzlar, Germany)를 사용하여 분석하였고, LAS X image-processing software (Leica Microsystems Ltd.) 및 ImageJ software v1.52a (Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화 하였다.
도 1a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 조직에서 분리한 GFAP-양성 신경교종세포에서의 NOX2 단백질 발현(녹색)을 확인한 결과이다.
도 1b는 저-등급 및 고-등급 신경교종 환자의 조직에서 NOX2-양성 염색된 세포의 강도를 나타낸다.
도 1c는 저-등급 및 고-등급 신경교종 환자의 조직에서 NOX2-양성 신경교종 세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자의 GAFP-양성 성상교세포에서 NOX 양성 염색의 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 NOX 및 GFAP의 세포 내 공동 국소화를 갖는 세포 수가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 즉, NOX 단백질은 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 발현이 증가하는 것을 알 수 있다.
1-2. TCGA 데이터 세트 분석
TCGA 데이터 세트를 이용하여 신경 교종의 등급에 따른 NOX2 유전자 발현 및 생존율 분석을 수행하였다. 구체적으로, Xena TCGA database (https://xenabrowser.net/접속 날짜: 2020년 10월 10일부터 2021년 2월 15일까지)로부터 저-등급 신경교종(lower grade glioma, LGG) 및 교모세포종(glioblastoma, GBM)의 RNA-seq 및 생존 데이터를 다운 받았다. 상기 데이터 중에서, 2등급 및 3등급 환자는 각각 257명 및 270명이고, 4등급 환자는 166명이다. 유전자 발현 값을 0-1 표준 척도로 변환하고, 생존 및 병리학적 등급 데이터와 병합하였다. 생존 데이터는 전체 생존 시간 및 사건을 나타내고, 상기 과정은 Python 2.7에서 수행되었다.
도 1d는 저-등급 및 고-등급 신경교종 환자의 NOX2 mRNA 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 1e는 NOX2 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, GBM 및 LGG 데이터 세트 분석에서도 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 NOX2 유전자의 발현 수준이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1e에 나타낸 바와 같이, NOX2 유전자의 발현 수준이 높은 환자는 NOX2 유전자의 발현 수준이 낮은 환자와 비교하여 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다.
즉, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 NOX2 유전자의 발현 수준이 증가하였으며, NOX2 유전자의 발현 수준이 증가함에 따라 신경교종 환자의 예후가 불량한 것을 알 수 있다.
실시예 2. 고-등급 신경교종 환자에서 NOX2와 HK2-의존성 해당 표현형(HK2-dependent glycolytic phenotype)과의 관계 확인
2-1. 포도당 이용 측정
고-등급 신경교종 환자에서 NOX2에 의한 고 해당 활성을 조절하는지 여부를 확인하기 위하여, 18F-FDG/PET을 사용하여 신경교종 환자의 포도당 섭취에 의한 포도당 이용을 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 환자를 6시간 동안 금식하도록 한 후, 18F-FDG를 환자에게 정맥 주사(185 MBq)하였다. 60분 후, PET/CT 스캔(Biograph mCT 128 scanner: Siemens Medical Solutions, Knoxville, TN, USA) 을 수행하였다. 감쇠보정 및 병변 위치 파악을 위해 정점에서 두개골 기저부까지 비조영 CT 이미지(120 kV, 120 mA, 3 mm section width, 3mm collimation) 를 획득하였다. CT 스캔 후, 동일한 영역의 PCT 이미지를 3차원 모드(7 min per bed position, 21.6 cm increments)에서 획득하였다. TrueX 알고리즘과 TOF(Time-of-Flight) 정보(TrueX + TOF, UltraHD PET, Siemens)를 사용하여 400x400 매트릭스에서 이미지를 재구성했다. 이미지는 전용 워크스테이션(Syngo.via, Siemens Medical Solutions)을 사용하여 분석하였다. 관심 부피(VOI)는 종양 및 반대쪽 정상 뇌 조직을 식별하기 위해 MR 이미지와 함께 등록된 PET/CT 이미지 또는 PET 이미지에서 결정하였다. 최대 종양 대 배경 비율(maximum tumor to background ratio)(최대 TBR; 종양의 최대 활성을 반대쪽 뇌의 평균 활성으로 나눈 값)을 18F-FDG PET/CT 이미지에서 측정하였다.
도 2a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 뇌의 18F-FDG PET/CT 이미지를 나타낸다.
도 2b는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 뇌의 18F-FDG PET/MRI에서 최대 종양 대 배경 비율(최대 TBR)의 수준을 측정한 결과이다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 18F-FDG PET 이미지에 의해 검출된 방사성 신호가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 18F-FDG 흡수값이 높은 것을 확인할 수 있었다. 즉, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 포도당 이용이 현저히 증가한 것을 알 수 있다.
2-2. 고-등급 신경교종에서 고 해당 활성 조절에 관여하는 메커니즘 확인
NOX2가 고-등급 신경교종에서 HK2(hexokinase 2)의 발현을 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 고-등급 신경교종 환자의 NOX2-양성 세포에서 HK2 단백질의 수준을 분석하였다. 구체적으로, 1차 항체로 polyclonal mouse anti-NOX2 (1:100) (NBP1-41012, Novus), 및 monoclonal rabbit anti-HK2 antibody (1:100) (#2024, Cell Signaling Technology)를 사용하고, 2차 항체로 goat anti-mouse IgG H&L Texas Red (1:100) (ab6787, Abcam)를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 면역형광염색을 수행하였다.
도 2c는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HK2 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 2d는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HK2-양성 염색된 세포의 강도를 나타낸다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자의 NOX2-양성 세포에서 HK2-양성 염색 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 HK2 및 NOX2의 세포 내 공국소화(co-localization)를 갖는 세포 수가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 코호트 Ⅰ(표 1)과 유사하게, 코호트 Ⅱ(표 2)의 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 HK2 및 NOX2의 면역형광염색 수준이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
2-3. TCGA 데이터 세트 분석
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 TCGA 데이터 세트를 이용하여 NOX2 및 HK2 유전자 발현 수준을 확인하였다.
도 2e는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 NOX2 및 HK2 양성 교모세포종을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 신경교종의 악성도가 증가함에 따라 NOX2 및 HK2 유전자의 발현 수준이 양의 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
2-4. 동소 이종이식(orthotopic xenograft) 마우스 모델 분석
동소 이종이식(orthotopic xenogrft) 마우스 모델에서 NOX2가 HK2의 발현을 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다. 모든 동물 실험은 아주대학교 의과대학 기관동물보호 및 이용위원회와 순천향대학교의 승인 하에 수행되었다. 구체적으로, 8주령의 C57BL/6 마우스(ORIENT BIO INC, Korea)를 마취시키고, 선조체(striatum)(전후방, +0.05 ㎝; 중앙외측, -0.18 ㎝; 등복측, -0.3 ㎝)에 정위수술(stereotaxic) 기구(Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA)를 이용하여 마우스 신경교종 GL261/GFP 세포(1 x 104 cells) 또는 PBS를 주사하였다. 이후, 마우스의 뇌를 추출하여 4℃에서 0% NFB로 밤새 인큐베이션 하였다. 표준 절차에 따라 뇌를 파라핀(Merck, Darmstadt, Germany)에 포매(embedded in)하고, 5 ㎛ 두께의 조각으로 잘라내었다. 이후, 1차 항체로 polyclonal mouse anti-NOX2 (1:100) (NBP1-41012, Novus) 및 monoclonal rabbit anti-HK2 antibody (1:100) (#2024, Cell Signaling Technology)를 사용하고 2차 항체로 goat anti-mouse IgG H&L Texas Red (1:100) (ab6787, Abcam) 및 anti-rabbit IgG(H+L) Alexa Fluor 488 (1:100) (A11008, Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 면역형광염색을 수행하였다.
도 3a는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 NOX2 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 3b는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 NOX2-양성 신경교종세포의 염색 강도를 나타낸 결과이다.
도 3c는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 NOX2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이, 동소 이종이식 마우스모델의 신경교종세포에서 NOX2 단백질 수준과 신경교종 조직에서 NOX2-양성 세포 수는 비-신경교종 조직에 비해 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 3d는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 3e는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HK2-양성 신경교종세포의 염색 강도를 나타낸 결과이다.
도 3f는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HK2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 3d 내지 도 3f에 나타낸 바와 같이, 비신경교종 조직과 비교하여 신경교종 세포에서 HK2 단백질 수준과 신경교종 조직에서 HK2 양성 세포수가 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
즉, 고-등급 신경교종 환자에서 NOX2는 HK2-의존적 해당 표현형과 관계가 있음을 알 수 있다.
실시예 3. HK2-의존성 고 해당 표현형(HK2-dependent high glycolytic phenotype)과 신경교종 세포의 이질성과(heterogeneity)의 관계 확인
3-1. HK2가 고 해당 표현형에 중요한 분자인지 여부 확인
HK2가 고-등급 신경교종 환자의 고 해당 표현형에 중요한 분자인지 여부를 확인하기 위하기 위하여, 고-등급 신경교종 환자의 신경교종 조직에서 NOX2 및 HK2 유전자의 발현 수준을 NanoString을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1의 11명 환자로부터 총 mRNA를 추출하였다. 이후, 추출된 mRNA를 nCounter PanCancer IO 360TM Panel (NanoString nCounter Analysis System, NanoString Technologies Inc., WA, USA)을 이용하여 분석하였다. 총 750개의 유전자가 플랫폼에 포함되었고, GeNorm algorithm nCounter Advanced Analysis (Version 2.0.115)을 이용하여 유전자의 가공되지 않은 발현량 값을 표준화하였다. 이후, 표준화된 값을 log2 값으로 변형하였다.
도 4a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 HK2 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종에 비해 고-등급 신경교종 환자에서 HK2 mRNA의 발현 수준이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
3-2. TCGA 데이터 세트 분석
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 TCGA 데이터 세트를 이용하여 HK2 유전자 발현 수준을 확인하였다.
도 4b는 저-등급 및 고-등급(G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 HK2 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4c는 HK2 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, TCGA의 GBM 및 LGG 데이터 세트 분석에서 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 HK2 유전자의 수준이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, TCGA의 GBM 및 LGG 데이터 세트 분석에서 HK2 유전자의 발현 수준이 높은 환자는 HK2 유전자의 발현 수준이 낮은 환자와 비교하여 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다.
3-3. HK2-의존성 고 해당 표현형의 신경교종세포 이질성 유도 여부 확인
HK2-의존성 고 해당 표현형이 고-신경교종 환자에서 신경교종 세포의 이질성을 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 고-신경교종 환자의 넓은 조직 영역에서 높은 수준의 HK2 단백질 발현을 갖는 신경교종 세포의 분포를 면역조직화학으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-1의 신경교종 환자 뇌 조직을 항-HK2 항체로 염색하고, 비오틴화된 goat anti-rabbit IgG (Vector Laboratories)를 2차 항체로 사용하였다. 이후, 스트렙타비딘 퍼옥시다제 복합체(Vector Laboratories)를 25℃에서 2시간 동안 비오틴화하였다. 염색 후, 슬라이드를 Eukitt® Quick-hardening mounting medium(03989, Sigma- Aldrich)에 장착하고, Masson's Trichrome Stain Kit(Cat.no. 25088-1, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)로 Masson's trichrome (M/T) 염색하였다. 염색된 부분을 Olympus BX53M microscope (Olympus, Tokyo, Japan)로 분석하고, Olympus Stream software 및 ImageJ software v1.52a (NIH, USA)로 정량화 하였다.
도 4d는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HK2 단백질 발현을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자의 조직의 넓은 영역에서 HK2-양성 신경아교종 세포의 분포가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 고-등급 신경교종 중에서도 4등급 환자가 등급 3등급 환자에 비해 HK2-양성 신경교종세포의 세포체가 더 크게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 또한, 2등급 또는 3등급에 비해 4등급 환자에서 HK2-양성 신경교종 세포의 모양이 변화한 것을 확인할 수 있었다.
즉, HK2-의존성 고 해당 표현형은 고-등급 신경교종 환자에서 신경교종 세포의 이질성에 기여할 수 있다.
실시예 4. NOX2에 의한 HK2-의존적 해당 활성 조절
4-1. NOX2 넉다운에 의한 해당 흐름 및 지표(ECAR) 측정
NOX2가 신경교종세포에서 HK2 의존적 해당 활성을 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, NOX2가 넉다운된 신경교종세포의 해당 흐름(flux) 및 활성의 지표인 ECAR를 측정하였다. 구체적으로, 인간 신경교종 U87MG 세포 (ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% FBX, 100 unit/mL 페니실린, 100 ㎎/mL 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 이후, 상기 세포를 6웰 플레이트에 2x105 세포로 분주하고, MISSION® siRNA targeting human NOX2 (EHU010941, Sigma-Aldrich, St. Louis,MO, USA)로 형질감염 시켰다. 이후, 상기 형질감염된 세포(5x104 세포/웰)를 XF96 세포 배양 마이크로플레이트에 플레이팅한 후, Seahorse XF96ebioanalyzer 및 XF Glycolysis Stress Test Kit (102194-100, Agilent Technologies, Inc.)를 사용하여 ECAR를 측정하였다.
도 5a는 NOX2 넉다운된 신경교종세포에서 ECAR 수준을 측정한 결과이다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, NOX2 넉다운된 세포는 대조군에 비해 ECAR의 수준을 유의하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
4-2. NOX2 넉다운에 의한 HK2 및 LDH-A 단백질 수준 확인
NOX2가 신경교종세포에서 HK2 의존적 해당 활성을 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, NOX2가 넉다운된 신경교종세포의 단백질면역블랏(Immunoblot analysis)을 수행하였다. 상기 실시예 4-1에서 형질감염된 상기 세포를 수확하고, NP40 Cell Lysis Buffer (FNN0021, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 용해시켰다. 용해물을 4℃, 15,300 x g에서 10분 동안 원리분리하여 상층액을 수득하였다. Bradford assay kit (500-0006, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 이후, 단백질을 NuPAGE 4 % - 12 % Bis-Tris gels (Thermo Fisher Scientific)에서 전기영동하고, Protran nitrocellulose membranes (10600001, GE Healthcare Life science, Pittsburgh, PA, USA)으로 옮겼다. 막을 TBS-T (TBS (170 6435, Bio-Rad Laboratories)에서 5% BSA 및 1%(v/v) Tween-20으로 25℃에서 30분 동안 차단하였다. 이후, 상기 막을 4℃에서 16시간 동안 TBS-T 중 1%(w/v) BSA에서 희석한 1차 항체(1:1000)로 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 한 후, HRP-컨쥬게이트된 2차 항체로 25℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (34078, Thermo Scientific)를 이용하여 면역형성밴드를 검출하였다.
도 5b는 NOX2 넉다운된 신경교종세포에서 NOX2, HK2 및 LDH-A 단백질 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, NOX2 넉다운된 세포는 대조군에 비해 HK2 단백질 수준을 유의하게 감소시킨 반면, 해당 과정의 최종 단계를 위한 효소인 LDH-A의 단백질 수준은 유사한 것을 확인할 수 있었다.
4-3. NOX2 활성 억제에 의한 해당 활성 및 단백질 수준 변화 확인
NOX2의 선택적 억제제인 GSK2795039에 의한 NOX2 활성의 억제가 인간 신경교종 세포에서 해당 활성과 단백질 수준을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 인간 신경교종 U87MG 세포를 10% FBX, 100 unit/mL 페니실린, 100 ㎎/mL 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 이후, 상기 세포를 6웰 플레이트에 2x105 세포로 분주하고, NOX2의 선택적 억제제인 GSK2795039가 포함된 배지에서 배양한 후, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 신경교종세포의 ECAR 수준을 측정하였다. 또한, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 단백질 수준을 측정하였다.
도 5c는 NOX2의 선택적 억제제로 처리한 신경교종세포에서 ECAR 수준을 측정한 결과이다.
도 5d는 NOX2의 선택적 억제제로 처리한 신경교종세포에서 NOX2, HK2 및 LDH-A 단백질 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, GKS2795039가 처리된 세포는 대조군에 비해 ECAR의 수준을 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5d에 나타낸 바와 같이, GSK2795039가 처리된 세포는 대조군과 비교하여 HK2 단백질의 수준을 유의하게 감소시킨 반면, LDH-A의 단백질 수준은 유사한 것을 확인할 수 있었다.
4-4. NOX2 활성 증가에 의한 해당 활성 및 단백질 수준 변화 확인
NOX2 활성의 증가가 인간 신경교종 세포에서 해당 활성과 단백질 수준을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 인간 신경교종 U87MG 세포를 6웰 플레이트에 2x105 세포로 분주하고, 인간 NOX2 컨스트럭트에 대한 pCMV6-AC-GFP로 형질감염 시켰다. 이후, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 신경교종세포의 ECAR 수준을 측정하였다. 또한, 상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 단백질 수준을 측정하였다.
도 5e는 NOX2가 과발현하는 신경교종세포에서 ECAR 수준을 측정한 결과이다.
도 5f는 NOX2를 과발현하는 신경교종세포에서 NOX2, HK2 및 LDH-A 단백질 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, NOX2 과발현 세포는 대조군에 비해 ECAR 수준을 유의하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5f에 나타낸 바와 같이, NOX2 과발현 세포는 대조군에 비해 HK2 단백질 수준을 유의하게 증가시켰으나, LDH-A 단백질 수준은 변화되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
즉, NOX2는 인간 신경교종세포에서 HK2 의존적 해당 활성을 조절할 수 있다.
실시예 5. NOX2에 의해 유도된 고 해당 활성과 신경교종세포의 섬유화 촉진과의 관계 확인
5-1. NOX2-의존성 고 해당 활성에 의한 전-섬유화 표현형(pro-fibrotic phenotype) 유도 확인
NOX2-의존성 고 해당 활성이 고-등급 신경교종 환자에서 신경교종세포의 이질성에 대한 전-섬유화 표현형을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, 화학제제의 투여 이력이 없는 신경교종환자의 신경교종세포가 풍부한 영역에서 콜라겐-양성 염색의 강도를 측정하였다.
도 6a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직을 H&E 및 M/T로 염색한 결과이다.
도 6b는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 M/T 염색 양성 영역을 측정한 결과이다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자의 신경교종세포에서 콜라겐 양성-염색 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자에서 콜라겐 양성-염색된 신경교종세포의 면적이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
5-2. 전-섬유화 표현형에 의한 신경교종세포의 이질성 기여 여부 확인
고-등급 신경교종 환자의 콜라겐-양성 염색된 신경교종세포에서 콜라겐 염색의 강도가 가변적이기 때문에, 신경교종세포의 전-섬유화 표현형이 고-등급 신경교종에서 신경교종세포의 이질성에 기여할 수 있는지 여부를 고-등급 신경교종 환자의 관류(perfusion) MRI 영상을 분석을 통해 추가로 확인하였다. 구체적으로, 상기 관류 MRI는 수술 전 환자에 대하여 수행하였으며, 혈액량(blood volume, BV), 혈류(blood flow, BF), 평균 통과시간(mean transit time, MTT) 및 정점까지의 시간(time to peak, TTP)과 같은 다양한 매개변수를 이용하여 관류 지도를 획득하였다.
도 6c는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 관류 MRI 분석 결과이다.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 고-등급 신경교종 환자의 신경교종 세포는 저-등급 신경교종에 비해 높은 표현형 이질성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 신경교종 4등급 환자의 신경교종 세포는 가장 높은 표현형 이질성을 나타내었다.
즉, NOX2에 의해 유도된 고 해당 활성은 고-등급 신경교종 환자의 신경교종세포의 전-섬유화 표현형에 관여할 수 있다.
실시예 6. NOX2에 의한 신경교종세포의 전-섬유화 촉진 확인
6-1. 신경교종세포의 전-섬유화 표현형을 조절하는 분자 메커니즘 확인
NOX2가 신경교종 환자의 신경교종세포에서 전-섬유화 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 실시예 3-1과 동일한 방법으로 고-등급 신경교종 환자 및 저-등급 신경교종환자의 신경교종 조직에서의 섬유증 관련 유전자의 발현을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 TCGA 데이터 세트를 이용하여 COL5A1 유전자 발현 수준을 확인하였다.
도 7a는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 COL5A1 mRNA 발현 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 7b는 신경교종 환자에서 COL5A1 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 전-섬유화 유전자 중, COL5A1 유전자의 수준이 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자에서 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, COL5A1 유전자 발현은 NOX2 유전자 발현과 양의 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
6-2. NOX2 발현에 의한 전-섬유화 촉진 유전자의 발현 변화 확인
NOX2가 인간 신경교종세포에서 전-섬유화 촉진 유전자의 발현을 조절할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 상기 실시예 4-1에서 NOX2 siRNA로 형질감염한 신경교종세포 및 실시예 4-4에서 인간 NOX2 컨스트럭트에 대한 pCMV6-AC-GFP로 형질감염된 신경교종세포에서 COL5A1, α-smooth muscle actin (α-SMA) 및 피브로넥틴 1(FN1)을 포함한 전-섬유화 유전자 변화를 분석하였다.
도 7c는 NOX2 넉다운된 신경교종세포에서 COL5A1, α-SMA 및 FN1 mRNA 수준을 확인한 결과이다.
도 7d는 NOX2 과발현하는 신경교종세포에서 COL5A1, α-SMA 및 FN1 mRNA 수준을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, NOX2 siRNA에 의해 NOX2 넉다운된 세포는 대조군과 비교하여 COL5A1, α-SMA 및 FN1의 유전자 수준이 유의하게 감소되었으며, 도 7d에 나타낸 바와 같이, NOX2 과발현 세포는 대조군에 비해 COL5A1, α-SMA 및 FN1의 유전자 수준이 유의하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
6-3. 신경교종세포에서 전-섬유화 마커 발현 확인
고-등급 신경교종 및 저-등급 신경교종 환자의 조직의 GFAP-양성 신경교종세포 및 NOX2-양성 신경교종세포에서 COL5A1의 단백질 수준을 면역형광염색을 통해 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 TCGA 데이터 세트를 이용하여 COL5A1 유전자 발현 수준을 확인하였다.
도 7e는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 GFAP-양성 신경교종세포에서 COL5A1 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 7f는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 COL5A1 양성 세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 7e에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자의 GFAP-양성 신경교종세포에서 COL5A1 양성-염색 강도가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7f에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자에서 COL5A1 및 GFAP의 세포 내 공 국소화를 나타내는 세포 수가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 7g는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 NOX2-양성 신경교종세포에서 COL5A1 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 7h는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 COL5A1 및 NOX2 양성 세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 7g에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자의 NOX2-양성 신경교종세포에서 COL5A1 양성 염색의 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7h에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자에서 COL5A1 및 NOX2의 세포 내 공국소화를 나타내는 세포 수가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 7i는 COL5A1 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
그 결과, 도 7i에 나타낸 바와 같이, TCGA의 GBM 및 LGG 데이터 세트 분석에서 COL5A1 유전자의 발현 수준이 높은 환자는 COL5A1 유전자의 발현 수준이 낮은 환자와 비교하여 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다.
즉, NOX2는 고-등급 신경교종 환자 및 인간 신경교종 세포에서 COL5A1의 발현을 유도함으로써 전-섬유화 표현형을 조절할 수 있다.
실시예 7. NOX2에 의한 신경교종세포의 중간엽 아형(mesenchymal subtype) 진행 유도 확인
7-1. NOX2에 의한 신경교종세포의 중간엽 아형 진행 여부 확인
NOX2가 신경교종 세포의 이질성에서 중간엽 아형의 진행에 기여할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 TCGA 데이터 세트를 이용하여 NOX2를 고발현하는 GBM에서 중간엽 유전자인 chitinase 3-like 1 (CHI3L1) 및 전-신경 유전자인 oligodendrocyte transcription factor 2 (OLIG2)의 수준을 분석하였다.
도 8a는 교모세포종 환자에서 CHI3L1 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 8b는 교모세포종 환자에서 OLIG2 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
그 결과, 도 8a에 나타내 바와 같이, TCGA의 GBM 데이터 세트 분석에서 CHI3L1 유전자 수준은 NOX2 유전자의 수준과 양의 상관관계를 나타내었다. 또한, NOX2의 높은 수준은 다른 서브타입에 비해 중간엽 서브타입과 연관이 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8b에 나타낸 바와 같이, TCGA의 GBM 데이터 세트 분석에서 OLIG2의 전사 수준은 NOX2 유전자의 수준과 음의 상관관계를 나타내었다.
7-2. NOX2에 의한 신경교종세포의 중간엽 아형 진행 조절 여부 확인
NOX가 인간 신경교종세포에서 중간엽 아형의 진행을 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-4에서 인간 NOX2 컨스트럭트에 대한 pCMV6-AC-GFP로 형질감염된 신경교종세포의 CHI3L1 및 OLIG2 수준을 측정하였다.
도 8c는 NOX2 과발현 신경교종세포에서 CHI3L1 및 OLIG2 mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 8d는 NOX2 과발현 신경교종세포에서 세포 형태를 나타낸 사진 및 세포체 길이를 측정한 결과이다.
도 8e는 저-등급 및 고-등급(G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 CHI3L1 mRNA 발현 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 8f는 CHI3L1 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
그 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, NOX2 과발현 세포는 대조군과 비교하여 CHI3L1 유전자 발현을 유의하게 증가시켰으며 OLIG2 유전자 발현은 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 도 8d에 나타낸 바와 같이, NOX2 과발현 세포는 대조군과 비교하여 CHI3L1 유전자의 증가를 통해 세포체 및 중간엽 아형 유사 형태의 상승을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8e에 나타낸 바와 같이, CHI3L1 유전자 수준은 고-등급 신경교종 환자에서 더 높게 나타났고, 8f에 나타낸 바와 같이, TCGA의 GBM 및 LGG 데이터 세트에서 CHI3L1 유전자 발현 수준이 높은 환자는 CHI3L1 유전자의 발현 수준이 낮은 환자와 비교하여 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다.
즉, NOX2는 고-등급 신경교종 환자 및 인간 신경교종세포에서 중간엽 아형의 진행을 조절할 수 있다.
실시예 8. NOX2에 의한 NAVCR2 매개 면역억제 특성 확인
8-1. NOX2에 의한 면역억제 특성 확인
NOX2가 고-등급 신경교종 환자에서 면역억제 특성의 발달에 기여하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 TCGA 데이터 세트를 이용하여 HAVCR2, PDCD1, LAG3 및 LGLAS9와 같은 면역 체크포인트 유전자와 NOX2의 관계를 분석하였다.
도 9a는 신경교종 환자에서 HAVCR2 및 NOX2 유전자의 상관관계를 확인한 결과이다.
도 9b는 저-등급 및 고-등급(G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자의 HAVCR2 mRNA 발현 수준을 나타내는 박스 플롯(box plot)이다.
도 9c는 HAVCR2 mRNA의 발현 수준에 따른 신경교종 환자의 생존 곡선이다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 면역체크포인트 유전자 중 HAVCR2 유전자의 수준은 NOX2 수준과 가장 강한 양의 상관관계를 나타내었다. 또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, TCGA의 GBM 및 LGG 데이터 세트 분석에서 HAVCR2 유전자 수준은 저-등급 신경교종 환자와 비교하여 고-등급 신경교종 환자에서 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 9c에 나타낸 바와 같이, TCGA의 GBM 및 LGG 데이터 세트에서 HAVCR2 유전자 발현 수준이 높은 환자는 HAVCR2 유전자의 발현 수준이 낮은 환자와 비교하여 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있었다.
8-2. NOX2에 의한 HAVCR2-매개 면역억제 특성 확인
고-등급 신경교종 및 저-등급 신경교종 환자의 조직의 GFAP-양성 신경교종세포 및 NOX-양성 신경교종세포에서 HAVCR2의 단백질 수준을 면역형광염색을 통해 확인하였다.
도 9d는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 HAVCR2 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 9e는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HAVCR2 양성 세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 9f에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자의 NOX2-양성 신경교종세포에서 HAVCR2 양성-염색 강도가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 9e에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자에서 HAVCR2 및 GFAP의 세포 내 공 국소화를 나타내는 세포 수가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 9f는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직의 NOX2-양성 신경교종세포에서 HAVCR2 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 9g는 저-등급 및 고-등급(G1: 1등급, G2: 2등급, G3: 3등급, G4: 4등급) 신경교종 환자 조직에서 HAVCR2 및 NOX2 양성 세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 9f에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자의 NOX2-양성 신경교종세포에서 COL5A1 양성 염색의 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 9g에 나타낸 바와 같이, 저-등급 신경교종 환자에 비해 고-등급 신경교종 환자에서 HAVCR2 및 NOX2의 세포 내 공국소화를 나타내는 세포 수가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
8-3. 동소 이종이식(orthotopic xenograft) 마우스 모델 분석
동소 이종이식(orthotopic xenogrft) 마우스 모델에서 COL5A1 및 HAVCR2의 발현 조절에 의해 HAVCR2 매개 면역억제 특성을 확인하였다. 구체적으로, 1차 항체로 polyclonal rabbit anti-COL5A1 antibody (1:100) (#37304, Cell Signaling Technology), polyclonal mouse anti-HAVCR2 (TIM3) antibody (1:100) (MA5-32841, Thermo Fisher Scientific)를 사용하고, 2차 항체로 goat anti-mouse IgG H&L Texas Red (1:100) (ab6787, Abcam)를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2-4와 동일한 방법으로 확인하였다.
도 10a는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 COL5A1 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 10b는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 COL5A1-양성 신경교종세포의 염색 강도 및 NOX2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
도 10c는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HAVCR2 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 10d는 신경교종 마우스 모델의 뇌조직에서 신경교종 유무에 따른 HAVCR2-양성 신경교종세포의 염색 강도 및 NOX2-양성 신경교종세포를 정량화한 결과이다.
그 결과, 도 10a 및 도 10b에 나타낸 바와 같이, 동소 이종이식마우스 모델에서 신경교종세포의 COL5A1 단백질 수준 및 신경교종 조직의 COL5A1-양성 세포 수는 비-신경교종 조직에 비해 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 10c 및 도 10d에 나타낸 바와 같이, 신경교종세포의 HAVCR2 단백질 수준과 신경교종 조직에서의 HAVCR2-양성 세포 수는 비-신경교종 조직에 비해 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
즉, NOX2는 고-등급 신경교종 환자에서 HAVCR2-매개 면역억제 특성에 기여할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. NOX2(NADPH oxidase 2) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경교종의 등급 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인 신경교종의 등급 진단용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 신경교종의 등급 진단용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 신경교종의 등급 진단용 조성물.
  5. 청구항 1의 조성물을 포함하는 신경교종의 등급 진단용 키트.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것인 신경교종의 등급 진단용 키트.
  7. NOX2(NADPH oxidase 2) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는 신경교종의 등급 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 청구항 7에 있어서, HK2(hexokinase 2), COL5A1(collagen type V alpha 1 chain) 및 HAVCR2(hepatitis A virus cellular receptor 2)로 구성된 군에서 선택되는 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 신경교종의 등급 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 측정된 단백질 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질 또는 유전자의 발현 수준보다 높은 경우, 신경교종의 위험도가 높은 것으로 판단하는 것인 신경교종의 등급 진단을 위한 정보제공방법.
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