CN109820866A - 一种c-Myc基因表达抑制剂及其应用 - Google Patents
一种c-Myc基因表达抑制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种c‑Myc基因表达抑制剂，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的c‑Myc基因表达抑制剂为吡咯咪唑聚酰胺小分子，所述吡咯咪唑聚酰胺小分子通过识别配对的方式靶向c‑Myc基因启动子序列，并且沉默c‑Myc基因的表达，本发明的聚酰胺PA6体现出较好的肿瘤细胞毒性，并且能够抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。
Description
技术领域
本发明涉及一种c-Myc基因表达抑制剂及其应用。
背景技术
聚酰胺一般是由2-3个不同的五元芳香杂环：N-甲基吡咯(Py，芳香残基)、N-甲基咪唑(Im，芳香残基)及3-羟基-N-甲基吡咯(Hp，芳香残基)组成；在DNA小沟中，二个聚酰胺或发卡聚酰胺反平行，边靠边与预先确定的DNA碱基序列以1:1比例紧密、特异性识别碱基的合成小分子化合物，即N-甲基吡咯(Py)倾向于识别T、A和C碱基；N-甲基咪唑(Im)是G碱基的读取元素；3-羟基-N-甲基吡咯(Hp)能特异性识别T碱基。到目前为止其中Im/Py和Py/Im配对分别识别G·C和C·G，而Hp/Py配对能把碱基对T·A、A·T区分开。而且聚酰胺具有良好的细胞渗透性，能够进入细胞核中，并且不易被核酸酶水解，相对转录因子能较强的键合特定靶基因。研究证明：它能通过在启动子区和增强子上干涉转录系统，调控与疾病相关突变基因的表达。
尽管人们利用聚酰胺中不同芳香残基的配对能将DNA中的四个Watson-Crick碱基对特异性的区分开；但是，由五元芳香环组成的长链聚酰胺存在刚性过强，曲率过大，不能很好的与DNA小沟曲率相匹配的不足；尤其是用Hp作为T碱基的识别元素尚存在一些缺点。之前，本实验室成功研发利用(S)-β-羟基-γ-氨基酸残基(sγβ-OH)与β-丙氨酸残基(β)配对sγβ-OH/β能很好地将T·A、A·T、C·G、G·C区分开；而且，这样的氨基酸残基(sγβ-OH)具有柔韧性，起到‘弹簧’一样的作用，能够用于设计较长聚酰胺，使其有效识别人类基因中重复率较低的较长的DNA序列，即解决使用较长聚酰胺识别较长DNA序列的专一性问题。
因此，本实验室将在之前的基础上发明一种聚酰胺作为c-Myc基因表达抑制剂，而且这种聚酰胺通过采用(S)-β-羟基-γ-氨基酸残基(sγβ-OH)与β-丙氨酸残基(β)配对(sγβ-OH/β)特异性识别碱基对T·A。
另一方面，20年之前，c-Myc基因在人类伯基特淋巴瘤中发现，是禽类逆转录病毒的v-Myc基因的细胞同源序列。在v-Myc基因的研究基础上发现，c-Myc基因是一种原癌基因，在许多癌症中表达出现异常。目前认为乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、髓系白血病、黑色素瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤及小细胞肺癌等恶性肿瘤都存在c-Myc基因的失调、高表达。人c-Myc基因位于8号染色体q24.1，包括两个内含子和三个外显子。
c-Myc基因的转录由多个启动子调控。核酸超敏感元件III1(NHE III1)也叫作Pu27(27bp)控制c-Myc基因80％～90％的转录活性。NHE III1富含鸟嘌呤(G)，位于P1启动子上游-142bp～-115bp，能够形成具有转录活性的双螺旋结构。同时NHE III1在一定条件下可以形成分子内G-四链体结构，以无活性的沉默子结构形式抑制c-Myc基因的转录。因此，NHEIII1被认为通过下调c-Myc基因的表达水平治疗肿瘤的潜在靶标。
c-Myc原癌基因不仅调控15％的其他人类基因的表达，还参与调控细胞周期、新陈代谢、蛋白质生物合成和microRNA调控等多种生理过程。除此之外，c-Myc基因还参与调控细胞凋亡，细胞衰亡和DNA损伤反应。通过活性氧和异常的DNA复制中间体的生成，c-Myc基因的过度表达会诱导产生DNA损伤反应。DNA损伤反应在肿瘤进展中具有双重作用，一方面能够抑制肿瘤的生长，而另一方面也能维护肿瘤的生长。因此，内源性c-Myc基因具有内在矛盾性的特征。
c-Myc在大多数人类干细胞中表达，并在正常和肿瘤细胞中都密切参与细胞周期、细胞分化、蛋白质合成和细胞凋亡的调控。因此，c-Myc基因是癌症治疗发展中重要的基因靶标。目前以c-Myc为靶标治疗肿瘤的小分子主要分为两类，一类是通过诱导并稳定c-Myc基因启动子区域形成G-四链体来抑制肿瘤细胞的增殖；另一类是通过抑制c-Myc/max二聚体的形成达到抑制肿瘤的作用。但是，到目前为止，人类还没有成功开发出以c-Myc基因为靶标的临床抗肿瘤药物。
有关使用聚酰胺调控与疾病相关基因的报道：
2000年，Chiang et al体外实验研究表明：聚酰胺有效抑制Her-2/neu启动子区转录因子与DNA的作用，从而抑制Her-2/neu基因转录。2006年，Matsuda et al首次应用小鼠动物模型研究表明：聚酰胺下调TGF-betal基因mRNA及蛋白的表达，预示着聚酰胺有治疗TGF-betal基因高度表达的相关疾病的潜力，包括进展性肾炎、心瓣手术再狭窄。2010年，Wang等人发现以鼠为动物模型研究聚酰胺下调MMP-9基因，能够抑制肿瘤的侵入和转移；表明MMP-9基因是聚酰胺抗肿瘤细胞转移的作用靶点。2007年，Ueno T等人报道利用聚酰胺调控结合组织生长因子CTGF基因。
通过以上对本发明相关的背景资料的检索分析发现：利用聚酰胺作为一种c-Myc基因抑制剂；使用含有(S)-β-羟基-γ-氨基酸残基(sγβ-OH)的聚酰胺对c-Myc启动子区序列特异性识别作用，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡，是有一定依据的。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种c-Myc基因表达抑制剂及其应用。
一种c-Myc基因表达抑制剂，其特征在于包含吡咯-咪唑聚酰胺类化合物，所述吡咯-咪唑聚酰胺类化合物的发夹结构如PA1～PA6中的任意一种所示；
其中，●：N-甲基咪唑残基；○：N-甲基吡咯残基；
β表示β-丙氨酸残基；γ表示γ-氨基酸残基；
sγβ-OH表示(S)-β-羟基-γ-氨基酸残基；
Ac表示乙酰基；Dp表示N,N-二甲氨基丙二胺残基。
所述的一种c-Myc基因表达抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：
自主设计合成了吡咯咪唑聚酰胺小分子，首次通过识别配对的方式靶向c-Myc基因启动子序列，并且沉默c-Myc基因的表达，其中发夹结构如PA6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物体现出较好的细胞毒性，并且能够抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。发夹结构如PA6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物抑制肿瘤细胞生长的具体过程如图1所示。
本发明的发夹结构如PA1～PA6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物与靶c-Myc基因启动子区DNA序列作用模式如图2所示。
附图说明
图1为本发明的聚酰胺抑制肿瘤细胞生长的过程示意图；
图2为本发明的聚酰胺与靶c-Myc基因启动子区DNA序列作用的模式图；
图3A为化合物PA1的制备路线图；
图3B为制备化合物PA1～PA6所使用的单体或二聚体的结构示意图；
图4为本发明的聚酰胺对A549细胞的生长抑制曲线图；
图5为本发明的聚酰胺对A549细胞的杀伤作用图；
图6为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞的生长抑制曲线图；
图7为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞的杀伤作用图；
图8A为本发明的聚酰胺对A549细胞的c-Myc基因RT-PCR扩增产物电泳图；
图8B为本发明的聚酰胺对A549细胞内c-Myc mRNA水平的抑制图；
图8C为本发明的聚酰胺对A549细胞内c-Myc基因蛋白免疫印迹试验产物电泳图；
图8D为本发明的聚酰胺对A549细胞内c-Myc蛋白质水平的抑制；
图9A为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞的c-Myc基因RT-PCR扩增产物电泳图；
图9B为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞内c-Myc mRNA水平的抑制图；
图9C为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞内c-Myc基因蛋白免疫印迹试验产物电泳图；
图9D为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞内c-Myc蛋白质水平的抑制；
图10为本发明的聚酰胺对A549细胞迁移的抑制作用图；
图11为本发明的聚酰胺对A549细胞迁移的抑制率图；
图12为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞迁移的抑制作用图；
图13为本发明的聚酰胺对SGC7901细胞迁移的抑制率图；
图14A为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞A549凋亡图之一；
图14B为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞A549凋亡图之二；
图15A为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞SGC7901凋亡图之一；
图15B为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞SGC7901凋亡图之二；
图16A为本发明的聚酰胺阻滞A549细胞周期图之一；
图16B为本发明的聚酰胺阻滞A549细胞周期图之二；
图17A为本发明的聚酰胺阻滞SGC7901细胞周期图之一；
图17B为本发明的聚酰胺阻滞SGC7901细胞周期图之二。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：化合物PA1的制备
主要合成步骤：活化树脂、脱去树脂上保护基团、活化羧基基团、耦合、盖帽、切割树脂等部分。
活化树脂：将树脂用DMF进行充分溶胀。
脱保护：将Fmoc保护基团从Fmoc保护的树脂上通过哌啶/DMF溶液去保护，释放出游离氨基。
活化羧基：将参与下一个耦合反应的氨基酸羧基部分通过活化试剂HBTU进行活化，形成活化酯，从而高效的与氨基耦合。
耦合：活化好氨基酸与树脂上游离氨基反应，形成肽键。
盖帽：在反应中存在部分未完全反应的氨基结构，必须进行封盖，避免在下次耦合中引起副反应，从而保证合成目标聚酰胺的纯度。
切割：当目标聚酰胺合成结束，需要用Dp作为切割试剂将其从树脂上切割下来。
所使用的初始原料和试剂试剂的缩写如表1。
表1：固相合成反应中所用试剂及其缩写
步骤如下：合成步骤如图3A。
1)活化：称取图3B如式(12)所示的Fmoc保护β-丙氨酸-Clear树脂(SPS-1，1.00g，0.4mmol，Peptides International)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5mL的DMF，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；
2)脱保护：先配制3mL的20％(v/v)哌啶/DMF(哌啶、DMF均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
3)偶合：称取图3B中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
4)盖帽：配制5mL的5％乙酸酐+5％吡啶/DMF溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。
这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液进行HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
5)重复步骤2)，进行脱保护；
6)偶合：称取图3B中如式(4)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液金星HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
8)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
10)偶合：称取图3B中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
12)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
13)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤12)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
14)偶合：称取图3B中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
15)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤14)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
16)偶合：称取图3B中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
17)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤16)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(PA1-a)；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
18)将步骤17)的中间体，连有目标聚酰胺(PA 1)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20mL的Dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去Dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(PA1)的中间体(PA1-b)；
19)在氮气保护下，向步骤18)的中间体加入3mL脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的TFA/TMS/TIS/H2O混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/L的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到白色的目标产物，含手性(S)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(PA 1)。收率15.6％，HPLC 97.6％，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):10.42(s，1H，芳香NH)，10.38(s，1H，芳香NH)，10.14(s，2H，芳香NH)，9.81(s，1H，芳香NH)，9.67(br，2H，芳香NH)，8.04-7.47(m，3H，脂肪NH)，7.83-7.71(m，2H，脂肪NH)，7.64(s，1H，芳香CH)，7.50(s，1H，芳香CH)，7.58(s，1H，芳香CH)，7.48(s，1H，芳香CH)，7.44(m，2H，芳香CH)，7.39(s，1H，芳香CH)，7.27(m，2H，芳香CH)，5.53(br，1H，OH)，3.98(m，1H，HOCH)，3.94(s，6H，2×NCH3)，3.90(s，3H，NCH3)，3.86(s，6H，2×NCH3)，3.80(s，3H，NCH3)，3.64(m，2H，NHCH2)，3.51(m，2H，NHCH2)，3.50-3.41(m，2H，NHCH2)，3.32-3.25(m，4H，2×NHCH2)，2.68(m，2H，NMe2CH2)，2.46(d，3JH，H＝7.2Hz，2H，COCH2)，2.33(t，3JH，H＝6.8Hz，2H，COCH2)，2.25-2.20(m，4H，2×COCH2)，2.02(s，6H，N(CH3)2)，1.96(s，1H，COCH3)，1.76(m，2H，CHCH2CH2)，1.51(m，2H，CH2CH2CH2)。ESI-Mass:m/z calcd for C54H74N21O12[M+H]+:1208.58；found:1208.47[M+H]+。
实施例2：化合物PA2的制备
合成步骤类似合成PA1(图3A)。步骤如下：
1)活化：与制备PA 1第一步1)活化操作相同。称取图3B如式(12)所示的Fmoc保护β-丙氨酸-Clear树脂(SPS-1，1.00g，0.4mmol，Peptides International)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5mL的DMF，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；
2)脱保护：先配制3mL的20％(v/v)哌啶/DMF(哌啶、DMF均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
3)偶合：称取图3B中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
4)盖帽：配制5mL的5％乙酸酐+5％吡啶/DMF溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。
这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液进行HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
5)重复步骤2)，进行脱保护；
6)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液金星HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
8)偶合：称取图3B中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
10)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
12)偶合：称取图3B中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
13)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤12)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
14)偶合：称取图3B中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
15)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤14)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(PA2-a)；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
16)将步骤15)的中间体，连有目标聚酰胺(PA2)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20mL的Dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去Dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(PA2)的中间体(PA2-b)；
17)在氮气保护下，向步骤16)的中间体加入3mL脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的TFA/TMS/TIS/H2O混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/L的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(S)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(PA 2)。收率13.6％，HPLC 98.1％，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):10.23(s，1H，芳香NH)，10.01(s，1H，芳香NH)，9.90-9.98(br，2H，芳香NH)，9.75(s，1H，芳香NH)，9.86(br，2H，芳香NH)，8.15-7.89(m，3H，脂肪NH)，7.63-7.41(m，2H，脂肪NH)，7.39-7.35(br，2H，芳香CH)，7.30(s，1H，芳香CH)，7.27(s，1H，芳香CH)，7.16(s，1H，芳香CH)，7.13(m，2H，芳香CH)，7.10(m，2H，芳香CH)，5.52(br，1H，OH)，3.99(m，1H，HOCH)，3.91(s，6H，2×NCH3)，3.87(s，3H，NCH3)，3.83(s，6H，2×NCH3)，3.80(s，3H，NCH3)，3.76(s，6H，2×NCH3)，3.72(s，3H，NCH3)，3.64(m，2H，NHCH2)，3.50(m，2H，NHCH2)，3.46-3.40(m，2H，NHCH2)，3.34-3.20(m，4H，2×NHCH2)，2.46(d，3JH，H＝7.2Hz，2H，COCH2)，2.36(t，3JH，H＝6.8Hz，2H，COCH2)，2.28-2.23(t，3JH，H＝6.8Hz，2H，COCH2)，2.01(s，6H，N(CH3)2)，1.95(s，1H，COCH3)，1.79(m，2H，CHCH2CH2)，1.53(m，2H，CH2CH2CH2)。ESI-Mass:m/z calcdfor C57H75N22O12[M+H]+:1259.59；found:1259.62[M+H]+。
实施例3：化合物PA3的制备
合成步骤类似合成PA1(图3A)。步骤如下：
1)活化：与制备PA 1第一步1)活化操作相同。称取图3B如式(12)所示的Fmoc保护β-丙氨酸-Clear树脂(SPS-1，1.00g，0.4mmol，Peptides International)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5mL的DMF，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；
2)脱保护：先配制3mL的20％(v/v)哌啶/DMF(哌啶、DMF均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
3)偶合：称取图3B中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
4)盖帽：配制5mL的5％乙酸酐+5％吡啶/DMF溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。
这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液进行HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
5)重复步骤2)，进行脱保护；
6)偶合：称取图3B中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液金星HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
8)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
10)偶合：称取图3B中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
12)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
13)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤12)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
14)偶合：称取图3B中如式(4)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
15)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
16)偶合：称取图3B中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
17)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤16)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(PA3-a)；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
18)将步骤17)的中间体，连有目标聚酰胺(PA3)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20mL的Dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去Dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(PA3)的中间体(PA3-b)；
19)在氮气保护下，向步骤18)的中间体加入3mL脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的TFA/TMS/TIS/H2O混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/L的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(S)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(PA3)。收率16.1％，HPLC 98.3％，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):10.40(s，1H，芳香NH)，10.37(s，1H，芳香NH)，10.12(s，2H，芳香NH)，9.80(s，1H，芳香NH)，9.69(br，2H，芳香NH)，8.08-7.45(m，3H，脂肪NH)，7.81-7.70(m，2H，脂肪NH)，7.66(s，1H，芳香CH)，7.52(s，1H，芳香CH)，7.57(s，1H，芳香CH)，7.49(s，1H，芳香CH)，7.41(m，2H，芳香CH)，7.36(s，1H，芳香CH)，7.26(m，2H，芳香CH)，5.52(br，1H，OH)，3.97(m，1H，HOCH)，3.93(s，6H，2×NCH3)，3.91(s，3H，NCH3)，3.87(s，6H，2×NCH3)，3.82(s，3H，NCH3)，3.63(m，2H，NHCH2)，3.50(m，2H，NHCH2)，3.48-3.40(m，2H，NHCH2)，3.31-3.25(m，4H，2×NHCH2)，2.69(m，2H，NMe2CH2)，2.45(d，3JH，H＝7.2Hz，2H，COCH2)，2.36(t，3JH，H＝6.8Hz，2H，COCH2)，2.26-2.20(m，4H，2×COCH2)，2.01(s，6H，N(CH3)2)，1.94(s，1H，COCH3)，1.76(m，2H，CHCH2CH2)，1.50(m，2H，CH2CH2CH2)。ESI-Mass:m/z calcd for C54H74N21O12[M+H]+:1208.58；found:1208.53[M+H]+。
实施例4：化合物PA4的制备
合成步骤类似合成PA1(图3A)。步骤如下：
1)活化：与制备PA 1第一步1)活化操作相同。称取图3B如式(12)所示的Fmoc保护β-丙氨酸-Clear树脂(SPS-1，1.00g，0.4mmol，Peptides International)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5mL的DMF，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；
2)脱保护：先配制3mL的20％(v/v)哌啶/DMF(哌啶、DMF均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
3)偶合：称取图3B中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
4)盖帽：配制5mL的5％乙酸酐+5％吡啶/DMF溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。
这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液进行HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
5)重复步骤2)，进行脱保护；
6)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液金星HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
8)偶合：称取图3B中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
10)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
12)偶合：称取图3B中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
13)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤14)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(PA4-a)；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
14)将步骤13)的中间体，连有目标聚酰胺(PA4)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20mL的Dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去Dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(PA4)的中间体(PA4-b)；
15)在氮气保护下，向步骤14)的中间体加入3mL脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的TFA/TMS/TIS/H2O混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/L的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(S)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(PA4)。收率11.4％，HPLC 98.3％，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):10.20(s，1H，芳香NH)，10.00(s，1H，芳香NH)，9.92-9.99(br，2H，芳香NH)，9.76(s，1H，芳香NH)，9.87(br，2H，芳香NH)，8.17-7.89(m，3H，脂肪NH)，7.65-7.42(m，2H，脂肪NH)，7.39-7.33(br，2H，芳香CH)，7.35(s，1H，芳香CH)，7.28(s，1H，芳香CH)，7.16(s，1H，芳香CH)，7.11(m，2H，芳香CH)，7.06(m，2H，芳香CH)，5.51(br，1H，OH)，3.98(m，1H，HOCH)，3.90(s，6H，2×NCH3)，3.86(s，3H，NCH3)，3.82(s，6H，2×NCH3)，3.79(s，3H，NCH3)，3.76(s，6H，2×NCH3)，3.71(s，3H，NCH3)，3.66(m，2H，NHCH2)，3.51(m，2H，NHCH2)，3.44-3.38(m，2H，NHCH2)，3.32-3.22(m，4H，2×NHCH2)，2.44(d，3JH，H＝7.2Hz，2H，COCH2)，2.34(t，3JH，H＝6.8Hz，2H，COCH2)，2.27-2.21(t，3JH，H＝6.8Hz，2H，COCH2)，2.00(s，6H，N(CH3)2)，1.96(s，1H，COCH3)，1.79(m，2H，CHCH2CH2)，1.52(m，2H，CH2CH2CH2)。ESI-Mass:m/z calcdfor C57H75N22O12[M+H]+:1259.59；found:1259.55[M+H]+。
实施例5：化合物PA5的制备
合成步骤类似合成PA1(图3A)。步骤如下：
1)活化：与制备PA1第一步1)活化操作相同。称取图3B如式(12)所示的Fmoc保护β-丙氨酸-Clear树脂(SPS-1，1.00g，0.4mmol，Peptides International)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5mL的DMF，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；
2)脱保护：先配制3mL的20％(v/v)哌啶/DMF(哌啶、DMF均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
3)偶合：称取图3B中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
4)盖帽：配制5mL的5％乙酸酐+5％吡啶/DMF溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。
这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液进行HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
5)重复步骤2)，进行脱保护；
6)偶合：称取图3B中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液金星HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
8)偶合：称取图3B中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应。
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
10)重复步骤3)、步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行偶合、盖帽和脱保护反应。
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
11)偶合：称取图3B中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
12)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤11)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
13)偶合：称取图3B中如式(6)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
14)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤13)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
15)偶合：称取图3B中如式(11)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
16)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤15)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
17)偶合：称取图3B中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
18)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤17)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
19)偶合：称取图3B中如式(4)所示的单体(1.6mmol)(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
20)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤19)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
21)重复步骤15)、步骤4)、步骤2)的操作，对步骤20)中的相反应管中的反应物进行偶合、盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
22)重复步骤15)、步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤21)的反应液进行同样的偶合、盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(PA 5-a)；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
23)将步骤22)的中间体(PA5-a)，连有目标聚酰胺的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20mL的Dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去Dp，得到手性羟基和氨基保护的发夹聚酰胺(PA5)的中间体(PA5-b)；
24)在氮气保护下，向步骤23)的中间体加入3mL脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的TFA/TMS/TIS/H2O混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基和氨基上的叔丁氧羰基保护，真空下移除溶剂；二氯甲烷溶解产物，用5mol/L的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(S)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(PA5)。收率10.9％，HPLC 97.3％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):δ10.35(s，1H，芳香NH)，10.31(s，1H，芳香NH)，10.27(s，2H，芳香NH)，10.22(s，1H，芳香NH)，10.16(s，2H，芳香NH)，9.98(s，1H，芳香NH)，9.94(s，2H，芳香NH)，9.88(s，1H，芳香NH)，9.80(s，2H，芳香NH)，9.86(s，1H，芳香NH)，8.23-7.87(m，3H，脂肪NH)，7.82-7.75(m，2H，脂肪NH)，7.66(s，1H，芳香CH)，7.59(s，1H，芳香CH)，7.52(m，2H，芳香CH)，7.47(s，1H，芳香CH)，7.40-7.34(m，2H，芳香CH)，7.30(s，2H，芳香CH)，7.26-7.21(m，3H，芳香CH)，7.17-7.00(m，4H，芳香CH)，6.94-6.90(m，2H，芳香CH)，6.86-6.80(m，4H，芳香CH)，5.50(br，1H，OH)，3.95(m，1H，HOCH)，3.91(s，3H，NCH3)，3.89(s，3H，NCH3)，3.87(s，6H，2×NCH3)，3.84(s，3H，NCH3)，3.79(s，6H，2×NCH3)，3.76(s，6H，2×NCH3)，3.72(s，3H，NCH3)，3.68(s，6H，2×NCH3)，3.64(s，6H，2×NCH3)，3.60(m，2H，NHCH2)，3.54(m，2H，NHCH2)，3.48-3.40(m，3H，NHCH2+CH2CH2CHNH3)，3.34-3.20(m，4H，2×NHCH2)，2.63(m，2H，NMe2CH2)，2.45(d，3JH，H＝7.4Hz，2H，COCH2)，2.35(t，3JH，H＝7.2Hz，2H，COCH2)，2.29-2.23(m，2H，COCH2)，2.01(s，6H，N(CH3)2)，1.96(s，1H，COCH3)，1.77(m，2H，CHCH2CH2)，1.53(m，2H，CH2CH2CH2)。ESI-Mass:m/z calcd for C98H120N42O20[M+2H]2+:2204.97；found:1102.47[M+2H]2+.
实施例6：化合物PA6的制备
合成步骤类似合成PA1(图3A)。步骤如下：
1)活化：与制备PA1第一步1)活化操作相同。称取图3B如式(12)所示的Fmoc保护β-丙氨酸-Clear树脂(SPS-1，1.00g，0.4mmol，Peptides International)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5mL的DMF，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；
2)脱保护：先配制3mL的20％(v/v)哌啶/DMF(哌啶、DMF均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
3)偶合：称取图3B中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
4)盖帽：配制5mL的5％乙酸酐+5％吡啶/DMF溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。
这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液进行HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
5)重复步骤2)，进行脱保护；
6)偶合：称取图3B中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5mL的反应瓶中，加入500μL的Dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μL的样品液金星HPLC分析(254nm，0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0mL/min)。
8)偶合：称取图3B中如式(6)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应。
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
10)偶合：称取图3B中如式(11)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5mL无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
11)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤10)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
12)偶合：称取图3B中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
13)依次重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤12)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(PA6-a)。
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
14)向步骤13)所获得的中间体，连有目标聚酰胺的树脂中加入脱保护试剂重量配比为10：90的TFA/CH2Cl2混合液后，室温氮气鼓泡反应0.5h，抽干反应液，分别无水二氯甲烷、无水DMF淋洗，每次淋洗后都抽干溶剂，获得脱去氨基上的叔丁氧羰基的发夹聚酰胺(PA6)的中间体(PA6-b)；
15)重复步骤10)、步骤4)、步骤2)的操作，对步骤14)中的相反应管中的反应物进行偶合、盖帽和脱保护反应；
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
16)偶合：称取图3B中如式(1)所示的单体(1.6mmol)和HBTU(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5mL等量无水DMF，振摇至化合物完全溶解，再加入1mL的DIEA，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3mL无水二氯甲烷淋洗两次，2mL无水DMF淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；
17)重复步骤4)，对步骤16)的反应液进行同样的盖帽反应；获得发夹聚酰胺(PA6)中间体的树脂(PA6-c)。
为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。
18)将步骤17)的中间体，连有目标聚酰胺(PA 6)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20mL的Dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去Dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(PA6)的中间体(PA6-d)；
19)在氮气保护下，用二氯甲烷溶解步骤18)产物，用5mol/L的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到白色的目标产物(PA6)。收率12.8％，HPLC 98.6％，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):δ10.56(s，1H，芳香NH)，10.47(s，1H，芳香NH)，10.35(s，1H，芳香NH)，10.23(s，2H，芳香NH)，9.14(s，1H，芳香NH)，9.90(s，1H，芳香NH)，9.76(br s，1H，芳香NH)，8.44-8.31(m，1H，脂肪NH)，7.88-7.76(m，3H，脂肪NH)，7.63(s，1H，芳香CH)，7.57(s，1H，芳香CH)，7.52(s，1H，芳香CH)，7.46(m，2H，芳香CH)，7.40(s，1H，芳香CH)，7.34(m，1H，芳香CH)，7.27(s，1H，芳香CH)，7.14-7.10(m，3H，芳香CH)，6.98-6.96(m，2H，芳香CH)，3.92(s，6H，2×NCH3)，3.89(s，3H，NCH3)，3.86(s，6H，2×NCH3)，3.80(s，3H，NCH3)，3.75(s，3H，NCH3)，3.70(s，3H，2×NCH3)，3.61(m，2H，NHCH2)，3.56(m，2H，NHCH2)，3.38-3.26(m，3H，NHCH2+CH2CH2CHNH3)，2.62(m，2H，NMe2CH2)，2.31(t，3JH，H＝6.8Hz，2H，COCH2)，2.01(s，6H，N(CH3)2)，1.99(s，1H，COCH3)，1.79(m，2H，CHCH2CH2)，1.47(m，2H，CH2CH2CH2)。ESI-Mass:m/z calcd forC62H77N28O12[M+H]+:1405.63；found:1405.58[M+H]+.
实施例7:聚酰胺对c-Myc基因高表达的肿瘤细胞的生长抑制
用RTCA技术考查六种聚酰胺对c-Myc基因高表达的A549和SGC7901两种肿瘤细胞的细胞毒性，以筛选出几种对肿瘤细胞毒性强的聚酰胺，获得较低IC50值(使细胞50％致死的药物浓度)的预选药物分子。
实验材料与方法(一)
材料：
a.化合物：发夹结构如PA1～PA6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物
b.细胞株：A549(人肺腺癌细胞)，SGC-7901(胃低分化腺癌细胞)。
c.培养基组成：RPMI1640培养基(Invitrogen Gibco，美国)，小牛血清(Invitrogen Gibco，美国)，青霉素-链霉素双抗(Invitrogen Gibco，美国)，L-谷氨酰胺(Invitrogen Gibco，美国)，肝素(Invitrogen Gibco，美国)。
肿瘤细胞的培养和收集:从液氮罐中取出肿瘤细胞，迅速置于水浴锅内，并不停摇动使其尽量融化。将解冻后的肿瘤细胞转移到离心管中，补充RPMI-1640全培养基至合适体积，混匀，低温低速离心除去上清液。重复使用全培养液洗涤一次，再用培养基悬浮细胞，按细胞密度接种至含全培养基的培养瓶中。至于合适的温度、CO2、湿度的培养箱中培养。待细胞铺满培养瓶底，用胰酶消化为单个细胞，并转移到离心管中，补充全培养基，混匀，低温低速离心，除去上清液，重复洗涤一次，收集细胞沉淀。
实验方法：
RTCA实验：E-plate实验所用的孔内加入全培养基，其余孔及所有孔间间隙中加入PBS溶液，室温孵育后，加入细胞稀释液，使每个孔的细胞数大约为5000-10000个，室温孵育后，取出E-plate，于实验孔内加入预先配置好的不同浓度的化合物，每个浓度设置一个重复孔。0.5％DMSO作为对照；”0”只有培养液，为空白对照。
聚酰胺PA1～PA6对A549细胞的生长抑制曲线如图4所示。
对比6种聚酰胺药物对c-Myc基因高表达的A549(肺腺癌)细胞的生长抑制作用，由图4中可以看出聚酰胺PA1、PA3、PA5和PA6对A549细胞的抑制作用都比较明显，尤其聚酰胺PA5和PA6有较好的浓度依赖性，其余2种聚酰胺药物只有当浓度达到一定值时，实验条件是16μM时，对靶细胞的抑制作用明显增强。
聚酰胺PA1～PA6对A549细胞的杀伤作用：通过数据分析加入聚酰胺PA1～PA6处理24小时后A549细胞的存活率如图5和表2所示。
图5显示了在加入聚酰胺PA1～PA6处理24小时后对A549的杀伤作用。对比这6种聚酰胺PA1～PA6在24小时内对A549杀伤作用，其中聚酰胺PA1～PA6的使用浓度为1μM，2μM，4μM，8μM，16μM。六种聚酰胺PA1～PA6在24小时内对A549细胞的杀伤作用基本上呈浓度依赖关系，其中聚酰胺PA5和PA6在16μM时的细胞的存活率仅分别为31.05％和7.14％，而聚酰胺PA2和PA4对细胞的杀伤作用比较弱，分别为51.55％和72.64％。综合图5的结果，聚酰胺PA5和PA6对A549的毒性作用较强，尤其是聚酰胺PA6；而聚酰胺PA4在实验浓度下对A549细胞没有明显的抑制作用。
六种聚酰胺PA1～PA6对c-Myc基因高表达的SGC7901(肺腺癌)细胞的生长抑制作用，实验材料与方法同上述实验材料与方法，实验结果如图6所示。
从图6中可以看出聚酰胺PA1、聚酰胺PA3、聚酰胺PA5、聚酰胺PA6对SGC7901细胞呈现良好的细胞毒性，在浓度为16μM时，细胞指数曲线基本持平，说明SGC7901细胞的生长受到强烈的抑制。而聚酰胺PA2和聚酰胺PA4在8μM时，细胞生长并没有受到明显抑制。
聚酰胺对SGC7901细胞的杀伤作用：通过数据分析加入化合物PA1～PA6处理24小时后SGC7901细胞的存活率如图7和表2所示。
图7显示了在加入聚酰胺PA1～PA6处理24小时后SGC7901的存活率，在最大浓度16μM下，聚酰胺PA5和PA6对SGC7901细胞的存活率均在40％以下，而聚酰胺PA2和PA4存活率均在50％以上。经过对比得出聚酰胺PA1、PA3、PA5和PA6对SGC7901细胞的抑制作用都比较明显，而浓度依赖性较好的是聚酰胺PA5和PA6，其余4种聚酰胺都是当浓度增大到16μM时，对细胞的抑制作用明显增强。
RTCA实验表明六种聚酰胺在不同程度上都促进A549细胞和SGC7901细胞的凋亡，其中聚酰胺PA5和PA6的作用效果比较好，聚酰胺PA6比PA5的作用强；对SGC7901细胞作用效果更好。这说明聚酰胺具有靶向基因、治疗多种与c-Myc基因相关的肿瘤的潜力。
表2：聚酰胺1-6处理的A549和SGC7901细胞系的IC50值(μM)。
实施例8：聚酰胺对肿瘤细胞c-Myc基因表达的影响
(1)通过RT-PCR技术，考查6种聚酰胺PA1～PA6对A549，SGC7901肿瘤细胞c-Myc基因的mRNA表达情况。
实验材料与方法(二)
材料:核酸提取试剂盒(RNeasy mini kit试剂盒，QIAGEN,德国)，One stepRNAPCR Kit试剂盒(RR024B，Takara，日本)试剂盒，胰酶(Invitrogen，美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司)。
培养基的组成：同实验材料与方法(一)
肿瘤细胞的培养与收集：同实验材料与方法(一)
RNA的提取：RNA提取完全参照RNeasy mini kit(QIAGEN说明书)。每种肿瘤细胞分别提取两次，提取完成后测定RNA浓度并用DEPC处理过后调节合适浓度。
RT-PCR反应：RT-PCR反应采用One Step RNA PCR Kit(Takara，RR024B)试剂盒。进行两次独立实验。
1.5％琼脂糖凝胶电泳，各取同样体积的RT-PCR反应产物，电泳30-60min，在紫外凝胶成像系统进行拍照，用图像分析软件进行数据分析。
(2)蛋白免疫印迹试验，考查6种聚酰胺PA1～PA6对A549，SGC7901肿瘤细胞c-Myc基因的蛋白质表达情况。
表3：SDS-聚丙烯酰胺凝胶配方
SDS-聚丙烯酰胺凝胶凝电泳条件：SDS-聚丙烯酰胺凝胶按表3制备；接通电源；在上样孔中加入Maker和样品浓缩胶恒压80-100V，分离胶恒压100-140V，至溴酚蓝的条带刚跑出分离胶前沿后，停止电泳，然后，进行数据分析。
聚酰胺PA1～PA6分别加入A549，SGC7901细胞内，c-Myc mRNA水平的表达情况：在A549细胞内如图8A和图8B所示，在SGC7901细胞内如图9A和图9B所示，β-actin基因为对照基因。图8A和图9A为c-Myc基因RT-PCR扩增产物电泳图。c-Myc蛋白水平的表达情况：在A549细胞内如图8C和图8D所示，在SGC7901细胞内如图9C和图9D所示，β-actin基因为对照基因，图8C和图9C为c-Myc基因蛋白免疫印迹试验产物电泳图。
从图8A和图8C可以看出，随着浓度增加聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对应的c-MycmRNA和蛋白表达的条带相对变暗，采用Quantity One软件对图8A和图8C进行分析，结果分别见图8B和8D。
从图8A、图8B、图8C和图8D中的结果可知，在聚酰胺PA1～PA6存在下，与不加聚酰胺的对照组相比，A549细胞的c-Myc基因的转录水平呈现不同程度的下调。通过进一步数据分析(图8B)，聚酰胺PA1～PA6在1μM浓度时，对A549细胞中c-Myc基因的转录并没有明显的抑制作用。但当聚酰胺的浓度达到10μM时，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对c-Myc基因的转录的抑制作用明显增强，c-Myc的mRNA表达水平分别下降了：54.60％，44.95％，60.97％，63.81％。而聚酰胺PA2和PA4在所有浓度下对c-Myc基因的转录的抑制作用都较弱。
聚酰胺PA1～PA6对A549细胞内c-Myc蛋白水平的抑制(图8C和图8D)。根据WesternBlot实验结果显示，聚酰胺PA1～PA6对c-Myc蛋白水平的影响情况与PCR的结果一致。在1μM浓度下，聚酰胺的抑制作用除PA5和PA6外不明显。在聚酰胺PA1～PA6的加药浓度为10μM时，A549细胞中c-Myc蛋白水平分别下调了53.2％、35.7％、60.4％、30.0％、75.7％和85.6％。综合聚酰胺PA1～PA6对c-Myc mRNA和蛋白水平的影响，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对c-MycmRNA和蛋白水平的抑制最明显，尤其，聚酰胺PA5和PA6，而聚酰胺PA2和PA4的作用较弱。
聚酰胺PA1～PA6对SGC7901细胞内c-Myc表达的影响见图9A和图9B；从图9A和图9B中的结果可知，在聚酰胺PA1～PA6存在下，与不加聚酰胺的对照组相比，SGC7901细胞的c-Myc基因的转录水平呈现不同程度的下调，且呈现浓度依赖的关系。低浓度时聚酰胺对SGC7901细胞中c-Myc基因转录的抑制作用并不明显。通过进一步数据分析(图9B)，聚酰胺PA2和PA4对SGC7901细胞中c-Myc基因转录的抑制作用不明显。当加药浓度达到10μM时，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对c-Myc基因转录的抑制作用明显增强，c-Myc基因转录水平分别下降了40.9％，45.6％，74.8％和85.6％。
聚酰胺PA1～PA6对SGC7901细胞内c-Myc蛋白水平抑制的影响见图9A和图9B。从图9C和图9D中可以看出，当加药浓度为5μM时，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对SGC7901细胞中c-Myc蛋白的表达有明显的抑制作用，而且抑制作用呈现浓度依赖性。当浓度达到最大10μM时，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6作用后的SGC7901细胞中的c-Myc蛋白水平分别下降了72.2％、90.5％、90％和95.9％。聚酰胺PA2在最大加药浓度下才出现了抑制作用，而聚酰胺PA4在任何浓度下都没有明显的抑制作用。
通过RT-PCR实验和Western Blot实验，探究聚酰胺PA1～PA6对A549细胞和SGC7901细胞中原癌基因c-Myc转录和表达的影响情况。从图结果说明聚酰胺PA1～PA6对靶标细胞中c-Myc基因表达有不同程度的抑制作用，且抑制作用基本呈现浓度依赖的特性。聚酰胺PA2和PA4在低浓度下对细胞c-Myc mRNA水平并没有明显的抑制效果，但当浓度增加到10μM时，聚酰胺PA2和PA4对细胞内的c-Myc蛋白水平表达起到了微弱的抑制作用。而聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6在加药浓度达到5μM就能够明显地抑制c-Myc基因的转录和表达。结果表明聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对SGC7901细胞c-Myc的表达有更好的抑制作用。
实施例9：聚酰胺对A549细胞和SGC7901肿瘤细胞迁移的影响
划痕实验材料与方法(三)：
(1)A549，SGC7901肿瘤细胞的培养同实验材料与方法(一)。
(2)划痕实验的方法：待肿瘤细胞至对数生长期，接种于合适的细胞培养孔板，用枪头在孔板底部划直线，记录并记录划痕的位子，然后加入无血清的培养液和不同浓度的化合物，合适温度培养24小时，用倒置显微镜拍照记录肿瘤细胞向划痕区迁移的相对距离。实验结果如图10、图11、图12和图13所示。
其中在图10中，图片A～F分别为聚酰胺PA1～PA6对A549细胞迁移的抑制作用的图片。在图12中，图片A～F分别为聚酰胺PA1～PA6对SGC7901细胞迁移的抑制作用的图片。
通过细胞划痕实验结果表明，在0.1μM浓度下，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对A549细胞和SGC7901细胞的迁移有一定的抑制作用，当浓度为0.5μM时，抑制两种肿瘤细胞迁移的能力较明显，抑制率都在60％以上，其中聚酰胺PA6对SGC7901细胞的迁移抑制率达到了96.5％以上。
实施例10：聚酰胺对A549细胞和SGC7901肿瘤细胞凋亡和周期的影响
应用流式细胞术考查六种聚酰胺对c-Myc基因高表达的A549和SGC7901两种肿瘤细胞的杀伤及抑制增殖的方式。
实验材料与方法(四)
材料:凋亡试剂盒(BD，美国)
培养基的组成：同实验材料与方法(一)
肿瘤细胞的培养与收集：同实验材料与方法(一)
实验材料与方法：
(1)A549，SGC7901肿瘤细胞的培养同实验材料与方法(一)。
(2)细胞凋亡的实验方法：将细胞(A549和SGC7901)细胞以每孔1×105个细胞接种在12孔板上，并在含有10％FBS的1mL 1640补充物中生长。将细胞维持在37℃和5％CO2。20小时后，更换培养基，向各孔中加入1mL不同浓度的聚酰胺。将细胞在37℃及5％CO2下孵育24小时。然后弃去培养基。用PBS(含2％FBS)洗涤细胞。用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，并收集在离心管中。用冷PBS离心并洗涤细胞。添加染料结合缓冲液，使最终细胞浓度为1×106个细胞/mL。将100μL细胞悬浮液转移至新的流式管。然后加入染料A。在室温下孵育15分钟，避光。加入染料B并孵育10分钟。最后添加400μL染料结合缓冲液。使用流式细胞术检测和记录625nm和488nm的7-AAD荧光和PI荧光。所有组都有三组作为并行测试。
(3)检测细胞周期的方法：将细胞以每孔2×105个细胞接种在六孔板上，并在含有10％FBS的2mL细胞培养液补充物中生长。将细胞维持在37℃及5％CO2。20小时后，通过使用不含FBS的培养基替换细胞培养液，对细胞进行饥饿。一夜后，用PBS冲洗培养基和碎片，并用含有不同浓度的化合物的新鲜细胞培养液代替。对照组由1％DMSO表示。将细胞在37℃及5％CO2的饱和湿度下培养36小时。接下来，收集细胞并用PBS洗涤两次。将细胞用合适浓度的乙醇(预冷)在4℃下固定过夜。通过离心除去乙醇并用PBS洗涤两次。将细胞转移到流式管中。加入RNA酶后，将试管加入37℃水浴中水浴。最后，向每个管中加入周期染料，并在4℃在黑暗中染色25分钟。使用流式细胞术检测和记录488nm的细胞周期。(FACS calibur，BD，USA)。所有组都有三组作为平行测试。
聚酰胺PA1～PA6分别加入，药物干预后的A549，SGC7901经过流式细胞仪检测，用ModFit软件分析数据(结果见图14A、图14B、图15A和图15B)，可以看出随着聚酰胺浓度的增加肿瘤细胞凋亡比例逐渐增加，表明聚酰胺能够通过诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞，其中PA5和PA6诱导凋亡的作用最为显著。
从图14A和图14B中可以看出，当加药浓度为6μM时，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对A549细胞具有明显的杀伤作用，而且抑制作用呈现浓度依赖性。当浓度达到最大12μM时，聚酰胺PA6作用后的A549细胞的总体凋亡率在60％以上。
从图15A和图15B中可以看出，当加药浓度为6μM时，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对SGC7901细胞具有明显的杀伤作用，与对照组相比，早期凋亡和晚期凋亡的比例均有增加，而且抑制作用呈现浓度依赖性。当浓度达到最大12μM时，聚酰胺PA5和PA6作用后的SGC7901细胞的总体凋亡率都在60％以上。聚酰胺PA2和PA4在最大加药浓度下也显示了一定的杀伤作用，不过作用效果较弱。而聚酰胺PA1和PA3的杀伤作用在两者之间。并且与A549细胞相比，聚酰胺的杀伤作用普遍偏强。
肿瘤细胞凋亡周期检测：聚酰胺PA1～PA6分别加入，药物干预后的A549，SGC7901经过流式细胞仪对药物干预后的肿瘤细胞进行细胞周期检测，用周期软件分析数据(结果见图16A、图16B、图17A和图17B)，可以看出随着聚酰胺浓度的增加肿瘤细胞G1期比例逐渐增加，药物的加入使得肿瘤细胞阻滞在G1期，结果表明聚酰胺能够干预细胞周期，并通过将细胞周期阻滞在G1期的方式抑制肿瘤细胞的增殖。
细胞周期的实验结果显示，聚酰胺在3μM浓度下，对A549细胞的周期开始干预，与对照组相比，聚酰胺加入后，处于G1期的A549的细胞比例明显增加，表明周期阻滞在G1期。通过图16B可以看出，在聚酰胺PA1～PA6的加药浓度为6μM时，与对照组相比A549G1期的细胞比例增加30％以上。聚酰胺PA5和PA6G1增加的比例在40％左右，作用最为显著。
图17A和图17B的实验结果显示，聚酰胺在3μM浓度下，SGC7901细胞G1期比例增加，由图17A可以看出，当聚酰胺的浓度为6μM时S期和G2期的峰值很低，细胞基本集中在G1期。通过图16B可以看出，在聚酰胺PA1～PA6的加药浓度为6μM时，与对照组相比SGC7901G1期的细胞比例增加在40％左右。
本发明研究结果表明：聚酰胺作为c-Myc基因表达抑制剂，聚酰胺PA1，PA3，PA5和PA6对A549细胞和SGC7901细胞的DNA分子水平还是细胞水平上都有一定的抑制和杀伤作用，其中聚酰胺PA6为最佳的靶基因调控剂和靶细胞抑制剂。聚酰胺PA6不仅具有较强的抗肿瘤活性，而且具有较好的特异性，因此聚酰胺PA6具有潜力被开发成靶向c-Myc基因的抗肿瘤药物。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
Claims (2)
1.一种c-Myc基因表达抑制剂，其特征在于包含吡咯-咪唑聚酰胺类化合物，所述吡咯-咪唑聚酰胺类化合物的发夹结构如PA1～PA6中的任意一种所示；
其中，●：N-甲基咪唑残基；○：N-甲基吡咯残基；
β表示β-丙氨酸残基；γ表示γ-氨基酸残基；
sγβ-OH表示(S)-β-羟基-γ-氨基酸残基；
Ac表示乙酰基；Dp表示N,N-二甲氨基丙二胺残基。
2.如权利要求1所述的一种c-Myc基因表达抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN110283132A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-09-27 | 深圳大学 | 一种喹喔啉类c-MYC G-四链体的制备方法及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103214468A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-07-24 | 浙江工业大学 | 手性（S）-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺及其应用 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103214468A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-07-24 | 浙江工业大学 | 手性（S）-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺及其应用 |
Non-Patent Citations (7)
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110283132A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-09-27 | 深圳大学 | 一种喹喔啉类c-MYC G-四链体的制备方法及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用 |
| CN110283132B (zh) * | 2019-06-26 | 2023-05-16 | 深圳大学 | 一种喹喔啉类c-MYC G-四链体的制备方法及其在治疗三阴性乳腺癌中的应用 |
| CN113105623A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-13 | 杭州庆正鸿科技有限公司 | 一种靶向pd-l1基因的小分子抑制剂及其应用 |
| CN113105623B (zh) * | 2021-03-30 | 2022-08-12 | 杭州庆正鸿科技有限公司 | 一种靶向pd-l1基因的小分子抑制剂及其应用 |
| CN113387934A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-09-14 | 中山大学 | 一种多芳基取代咪唑衍生物及其制备方法与应用 |
| CN113387934B (zh) * | 2021-06-07 | 2023-03-07 | 中山大学 | 一种多芳基取代咪唑衍生物及其制备方法与应用 |
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