CN113461684B - 一种PPAR-γ配体—4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物及其制备方法和抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PPAR‑γ配体—4,5‑二氮芴‑罗丹宁轭合物及其制备方法和抗肿瘤应用,4,5‑二氮芴‑罗丹宁轭合物的结构式为:R的结构式如YINQ‑1、YINQ‑2、YINQ‑3、YINQ‑4、YINQ‑5、YINQ‑6、YINQ‑7、YINQ‑8、YINQ‑9、YINQ‑10中的一种;。经体外抗肿瘤活性实验证明,本发明的化合物对多种肿瘤细胞具有广泛的杀伤力和一定选择性,其中抗肿瘤效果最好的化合物YINQ‑9对人黑色素瘤A375细胞、人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞、人前列腺癌PC‑3细胞、人胃腺癌AGS细胞和人肺癌HCC827细胞等肿瘤细胞系的IC50值分别为4.11μM,8.50μM,8.70μM,5.25μM和5.58μM。本发明的化合物可以通过诱导肿瘤细胞发生凋亡并抑制肿瘤细胞迁移能力发挥抗肿瘤作用,对进一步开发4,5‑二氮芴‑罗丹宁轭合物类抗肿瘤药物具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域,具体涉及一种PPAR-γ配体—4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物及其制备方法和抗肿瘤应用。
背景技术
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一类属于核激素受体超家族,由配体激活的转录因子,在人体内PPARs参与调节人体糖脂代谢、细胞分化、炎症和肿瘤发生发展过程。其中PPAR-γ是研究最广泛的PPARs亚型,其主要在脂肪组织中表达,但在心脏、结肠、肾脏、脾、肠、骨骼肌、肝脏等组织中也有较低水平的表达。PPAR-γ是控制脂肪形成的关键因子,同时也被证明可以通过改善细胞对胰岛素敏感性参与糖代谢,是临床中Ⅱ型糖尿病的主要治疗靶点。
现有研究也发现,PPAR-γ在多种肿瘤细胞中均有不正常表达,配体调控PPAR-γ活性可抑制不同肿瘤细胞系增殖或诱导细胞凋亡,使用激动剂或抑制剂均有报道。人体内存在PPAR-γ天然配体,同时目前人们针对PPAR-γ已经发现数种类型、数十种结构的合成配体,包括激动剂和抑制剂。
(1)PPAR-γ天然配体及合成配体
人体内天然存在有PPAR-γ的配体对其活性进行调节,主要包括脂肪酸及其代谢物,二十烷类轭合物等。然而,这些配体的亲和力相对较低,并且在高于生理水平的微摩尔浓度(Kd≈2-50μM)下激活受体。
自PPAR-γ发现以来,人们已经报道了很多合成配体,尤其晶体学的进步使配体与PPAR-γ蛋白结合的细节更加清晰,配体设计愈加理性。目前人们已经发现数种类型、数十种结构的PPAR-γ合成激动剂和抑制剂。根据结构不同,合成激动剂主要分为两大类:格列酮类和非格列酮类。由于PPAR-γ在体内作用十分复杂,各种合成配体由于结构不同对PPAR-γ的影响也不同,因此PPAR-γ作用具有配体依赖性。
(2)PPAR-γ激动剂与肿瘤
PPAR-γ激动剂(如TZDs)已被证明可诱导多种肿瘤细胞凋亡,对多种癌症具有潜在的治疗效果,包括淋巴瘤、多发性骨髓瘤、膀胱癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌和肺癌等。根据肿瘤细胞系的不同,PPAR-γ激动剂发挥抗肿瘤功能具有PPAR-γ依赖型和PPAR-γ非依赖型,这意味着PPAR-γ激动剂在细胞内可能存在其他作用靶点。进一步的研究发现,PPAR-γ激动剂主要通过诱导肿瘤细胞经过死亡受体途径发生凋亡,在这一过程中的作用可能是多方面的,通过不同靶点共同促进。死亡受体凋亡途径的核心是死亡诱导信号复合体(DISC)的形成,抑凋亡蛋白c-FLIP可以抑制该复合体的形成,凋亡抑制蛋白(IAPs)如survivin等可以抑制caspase家族的活化,从而抑制凋亡过程的发生。以曲格列酮为例,PPAR-γ激动剂可以通过拮抗抑凋亡蛋白c-FLIP,survivin等,诱导死亡诱导信号复合体形成等多方面促进肿瘤细胞发生凋亡。
(3)PPAR-γ抑制剂与肿瘤
由于PPAR-γ在多种肿瘤细胞中高表达,人们推测这些肿瘤细胞生存是否依赖于PPAR-γ活性。后续的研究发现,在不同的肿瘤模型中,PPAR-γ活性的降低对肿瘤细胞增殖和迁移具有抑制活性,特别是在过度表达PPAR-γ的肿瘤中,这为PPAR-γ抑制剂在抗肿瘤方向的应用提供了新的可能。然而,与PPAR-γ激动剂类似,PPAR-γ抑制剂的抗癌效果可能同样复杂,因为作用结果与所使用的特定肿瘤细胞系或动物模型、特定的肿瘤微环境、所使用的培养条件(包括相对血清水平)以及所测试化合物的特性密切相关。
尤其是,PPAR-γ抑制剂GW9662和T0070907被报道可以阻止肝癌细胞系与细胞外基质粘附,诱导肝癌细胞发生凋亡。并且抑制剂T0070907在导致癌细胞死亡方面明显比PPAR-γ激活剂曲格列酮和罗格列酮更有效,T0070907通过减少细胞与细胞外基质黏附诱导随后的细胞凋亡,而激活剂罗格列酮对黏附没有直接影响,而是在更高浓度时引起细胞凋亡,这两种化合物对于凋亡的诱导可能是不一样的。同时发现,肝癌细胞与细胞外基质黏附依赖PPAR-γ活性,使用siRNA沉默PPAR-γ表达同样可以诱导其脱离细胞外基质。随后,PPAR-γ抑制剂诱导鳞状细胞癌,结肠癌,卵巢癌,黑色素瘤发生凋亡的研究结果也被报道。综上所述,PPAR-γ在多种肿瘤细胞中存在过度表达,肿瘤细胞的存活依赖PPAR-γ活性,抑制其功能可以阻止肿瘤细胞与细胞外基质粘附,诱导肿瘤细胞发生凋亡,该作用结果具有配体依赖性。这为PPAR-γ在癌症治疗方面的应用提供了新的思路。
(4)PPAR-γ配体设计策略
PPAR-γ蛋白作为抗糖尿病格列酮类药物的作用靶点,已经在临床中应用数十年,针对该靶点的配体设计经验较为成熟。在人体内,15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)作为PPAR-γ蛋白天然存在的配体,可以激活PPAR-γ蛋白的活性,调控下游靶基因的转录。但其作用浓度在微摩尔级别,激活效率较低[7]。人工合成配体以噻唑烷二酮类化合物(TZDs)为主,例如曲格列酮,吡格列酮,罗格列酮等。值得注意的是,临床使用中发现曲格列酮具有积累的肝毒性,心脏毒性等较严重副作用,已经撤出临床使用,而其他格列酮类药物尚未发现类似的毒性。对格列酮类药物进行构效关系分析发现,分子尾部的噻唑烷二酮环是其核心结构,苄基与噻唑烷二酮环相连这一结构也非常保守,同时醚键将头部与尾部连接对活性的保持具有重要影响,绝大多数格列酮类药物的这一部分保持不变。真正的区别出现在分子头部,与PPAR-γ蛋白活性位点开口处大空腔相比,格列酮类药物分子头部空间结构显得非常小。正是头部结构赋予了每一种格列酮类药物在化学方面的独特性,也赋予了它们特殊的生物活性。这个模块是解释非常相似的格列酮类药物之间靶标亲和力和效力差异的最有可能的地方,意味着可以通过针对这一部分结构进行改造从而对PPAR-γ蛋白的功能产生不同的影响(例如募集不同的共激活因子,或诱导其泛素化降解等)。
PPAR-γ蛋白活性位点结构域整体呈现三个空腔构成的正交口袋,类似横向的Y字形,Y字形头部形成开口处的大裂缝,这使得配体分子头部设计可以朝向上方的口袋,也可以朝向下方的口袋。Y字形尾部绕过H3螺旋,深入到蛋白结构域深处,这意味着PPAR-γ蛋白的配体整体空间结构需弯折成U型围绕H3螺旋,该蛋白特殊的活性位点结构对配体小分子设计提出了一定要求,需要按照头部-连接部分-尾部的模式。尾部结构和连接部分的结构相对保守,在保持对活性位点空腔填充的同时还要兼顾分子的长度,避免对分子头部的结合造成影响,活性位点开口处的裂缝则给小分子设计提供了很大的自由度。
基于以上研究背景,本发明设计合成了一系列4,5-二氮芴-罗丹宁的轭合物作为PPAR-γ蛋白潜在的配体及评价其在抗肿瘤方面的应用,其中4,5-二氮芴-罗丹宁核心骨架在开口裂缝处以氢键和疏水作用力结合,罗丹宁结构上所连侧链则深入到蛋白结构域中,以疏水作用力和范德华力结合。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类新型PPAR-γ配体—4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物及其在药学上可接受的盐,具有如下结构通式:
其中:R的结构式如下YINQ-1、YINQ-2、YINQ-3、YINQ-4、YINQ-5、YINQ-6、YINQ-7、YINQ-8、YINQ-9、YINQ-10所示:
本发明提供了下述优选化合物:
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(二甲胺基)-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-1)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(二乙胺基)-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-2)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(二乙醇胺基)-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-3)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(吗啡啉-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-4)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-5)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(哌啶-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-6)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(哌嗪-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-7)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-苯基-1-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-8)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(4-苄基哌啶-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-9)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮(YINQ-10)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(二甲胺基)-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-1Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(二乙胺基)-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-2Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(二乙醇胺基)-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-3Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(吗啡啉-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-4)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-5Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(哌啶-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-6Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(哌嗪-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-7Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-苯基-1-丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-8Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(4-苄基哌啶-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-9Y)
5-(4,5-二氮芴)-3-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)-2-硫酮-4-噻唑烷二酮盐酸盐(YINQ-10Y)。
本发明提供一类新型PPAR-γ配体—4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物及其在药学上可接受的盐的制备方法,通过以下步骤实现:
反应式:
其中:R的结构式如下YINQ-1、YINQ-2、YINQ-3、YINQ-4、YINQ-5、YINQ-6、YINQ-7、YINQ-8、YINQ-9、YINQ-10所示:
1)将取代氨基化合物5与二硫化碳在溶剂A中于冰浴条件下发生取代反应,生成白色或微黄色固体化合物6;随后将化合物6与氯乙酰氯在溶剂B中于室温下反应,生产含不同侧链取代基的罗丹宁杂环化合物7,备用;
2)一水合菲啰啉8在碱性条件下,被高锰酸钾氧化生成4,5-二氮芴酮9;4,5-二氮芴酮9再与化合物7在乙醇中回流发生偶联反应,产物经重结晶纯化后得到目标化合物YINQ1-10;其中,通过将HCl气体通入目标化合物YINQ 1-10的二氯甲烷溶液中,过滤得到目标化合物相应的盐酸盐YINQ 1Y-10Y;
其中,当取代氨基化合物5为3-(4-苄基-哌啶)丙胺时,其制备方法为:苄基哌啶1与N-(3-溴丙基)苯二胺2在乙腈中回流反应生成关键中间体3,中间体3再与水合肼在甲醇中反应,生成如式4所示的3-(4-苄基-哌啶)丙胺。
本发明的另一个目的是提供所述的新型PPAR-γ配体—4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物及其在药学上可接受的盐在抗肿瘤方向中的应用,所述肿瘤细胞为人黑色素瘤A375细胞、人非小细胞型肺癌H1299细胞、HCC827细胞、人胃腺癌AGS细胞、人卵巢癌SK-OV-3细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人前列腺癌PC-3细胞或人白血病K562细胞。
相对于现有技术,本发明取得的有益效果是:本发明的新型PPAR-γ配体—4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物及其在药学上可接受的盐对多种肿瘤细胞具有广泛的杀伤力和一定选择性,其中抗肿瘤效果最好的化合物YINQ-9对人黑色素瘤A375细胞,人乳腺癌MDA-MB-231细胞,人前列腺癌PC-3细胞,人胃腺癌AGS细胞和人肺癌HCC827细胞等肿瘤细胞系的IC50值分别为4.11μM,8.50μM,8.70μM,5.25μM和5.58μM,对进一步开发4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物类抗肿瘤药物具有重要价值。
附图说明
图1a为通过CCK-8实验测定不同浓度化合物作用下,对所测试肿瘤细胞系细胞活性的抑制效果图之一;
图1b为通过CCK-8实验测定不同浓度化合物作用下,对所测试肿瘤细胞系细胞活性的抑制效果图之二;
图2a为细胞划痕实验检测化合物YINQ-5对A375细胞划痕愈合的影响;
图2b为细胞划痕实验检测化合物YINQ-6对A375细胞划痕愈合的影响;
图2c为细胞划痕实验检测化合物YINQ-9对A375细胞划痕愈合的影响;
图2d为细胞划痕实验检测化合物YINQ-9Y对A375细胞划痕愈合的影响;
图3为化合物YINQ-5,YINQ-6,YINQ-9,YINQ-9Y对A375细胞划痕实验结果统计图;
图4为化合物YINQ-9对A375细胞凋亡情况影响结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1:目标化合物YINQ-1的制备
将3-二甲氨基-1-丙胺(500mg,4.89mmol)溶于预冷的乙醚中,保持冰浴。随后缓慢滴入过量的二硫化碳试剂(447mg,5.87mmol),控制温度不要超过5℃,搅拌反应3小时,反应液中逐渐生成白色沉淀。将白色沉淀过滤,用乙醚洗涤滤饼,随后干燥得到白色粉末状固体820mg,收率94.0%。随后将白色粉末状固体(300mg,1.68mmol)溶于30mL甲醇/水(甲醇:水=1:4,v/v)混合溶液中,缓慢滴加氯乙酰氯试剂(190mg,1.68mmol),氮气保护下35℃搅拌反应5-6小时。待检测反应结束后,将反应液中的溶剂蒸干,得到淡黄色油状液体。将该油状液体直接溶于乙醇中,搅拌加热至83℃后加入过量4,5-二氮芴酮(546mg,3mmol)和催化量的哌啶(20μL),回流反应8-10小时。待检测反应结束后,使用旋蒸仪将溶剂蒸干得到棕褐色油状液体,然后使用硅胶柱层析法(200目硅胶)分离提纯(洗脱剂DCM:MeOH=50:1,v/v)得到黄色粉末状固体340mg,该黄色粉末为混合物。随后用乙醇重结晶得到目标化合物YINQ-1(黄色粉末状固体,270mg),收率22.8%。熔点:243-245℃,纯度:98.2%(HPLC)。TLC:Rf=0.64(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ9.60-9.58(dd,J=8.2,1.5Hz,1H),8.76-8.71(m,2H),8.14-8.16(dd,J=8.0,1.3Hz,1H),7.40-7.36(m,2H),4.29(t,J=7.0Hz,2H),2.45(t,J=6.8Hz,2H),2.26(s,6H),1.99-1.91(m,2H).MS(ESI)calcd for C19H18N4OS2:382.1,found:383.1(M+H+).
实施例2:目标化合物YINQ-2的制备
合成步骤同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的3-二乙氨基-1-丙胺代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-2(黄色粉末状固体,405mg),收率20.2%。熔点:239-240℃,纯度:96.2%(HPLC)。TLC:Rf=0.65(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ9.51-9.49(dd,J=8.2,1.5Hz,1H),8.77-8.82(m,2H),8.12-8.10(dd,J=8.1,1.3Hz,1H),7.40-7.28(m,2H),4.35(t,J=7.1Hz,2H),3.17-3.14(m,6H),2.45-2.39(m,2H),1.44(t,J=7.3Hz,6H).MS(ESI)calcdfor C21H22N4OS2:410.1,found:411.1(M+H+).
实施例3:目标化合物YINQ-3的制备
合成步骤同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的3-二乙醇氨基-1-丙胺代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-3(黄色粉末状固体,537mg),收率24.8%。熔点:202-203℃,纯度:95.2%(HPLC)。TLC:Rf=0.52(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Deuterium Oxide,600MHz,ppm):δ8.27-8.26(d,J=7.8Hz,1H),8.09-8.04(m,2H),7.12-7.11(d,J=7.7Hz,1H),6.90-6.87(m,2H),3.89-3.84(m,4H),3.39-3.25(m,6H),2.07-2.02(m,2H).MS(ESI)calcd for C21H22N4O3S2:442.1,found:443.1(M+H+),465.1(M+Na+).
实施例4:目标化合物YINQ-4的制备
试验方法同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的N-(3-氨丙基)吗啉代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-4(黄色粉末状固体,784mg),收率37.8%。熔点:223-224℃,纯度:99.5%(HPLC)。TLC:Rf=0.62(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ9.60-9.58(dd,J=8.2,1.4Hz,1H),8.77-8.72(m,2H),8.17-8.15(dd,J=8.0,1.2Hz,1H),7.41-7.36(m,2H),4.33(t,J=7.3Hz,2H),3.61(t,J=4.5Hz,4H),2.51(t,J=6.5Hz,2H),2.43-2.39(m,4H),2.01-1.96(m,2H).MS(ESI)calcd for C21H20N4O2S2:424.1,found:425.1(M+H+).
实施例5:目标化合物YINQ-5的制备
试验方法同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的N-(3-氨丙基)吡咯代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-5(黄色粉末状固体,521mg),收率26.1%。熔点:246-248℃,纯度:96.6%(HPLC)。TLC:Rf=0.65(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ9.59-9.57(dd,J=8.1,1.5Hz,1H),8.75-8.71(m,2H),8.15-8.13(dd,J=8.1,1.3Hz,1H),7.39-7.36(m,2H),4.31(t,J=7.2Hz,2H),2.69(t,J=6.9Hz,2H),2.61-2.56(m,4H),2.06-2.01(m,2H),1.75-1.70(m,4H).MS(ESI)calcd for C21H20N4OS2:408.1,found:409.1(M+H+).
实施例6:目标化合物YINQ-6的制备
试验方法同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的N-(3-氨丙基)哌啶代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-6(黄色粉末状固体,473mg),收率22.9%。熔点:259-261℃,纯度:95.2%(HPLC)。TLC:Rf=0.65(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,600MHz,ppm):δ9.55-9.54(d,J=8.1Hz,1H),8.70-8.66(m,2H),8.15-8.13(d,J=8.0Hz,1H),7.39-7.36(m,2H),4.27(t,J=7.3Hz,2H),3.14-3.10(m,4H),2.68-2.62(m,4H),2.55(t,J=6.3Hz,2H),1.94-1.89(m,2H).MS(ESI)calcd for C22H22N4OS2:422.1,found:423.1(M+H+).
实施例7:目标化合物YINQ-7的制备
将4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(4.89mmol)溶于30mL预冷的乙醚中,保持冰浴。随后缓慢滴入过量的二硫化碳试剂(447mg,5.87mmol),控制温度不要超过5℃,搅拌反应3小时,反应液中逐渐生成白色沉淀。将白色沉淀过滤,用乙醚洗涤滤饼,随后干燥。将所得固体溶于30mL甲醇/水(甲醇:水=1:4,v/v)混合溶液中,缓慢滴加氯乙酰氯试剂(190mg,1.68mmol),氮气保护下35℃搅拌反应5-6小时。待检测反应结束后,将反应液蒸馏浓缩,浓缩物直接溶于50mL乙醇中,搅拌加热至83℃后加入过量4,5-二氮芴酮(546mg,3mmol)和催化量的哌啶(20μL),回流反应8-10小时。使用TLC检测反应进程,待检测反应结束后,使用旋蒸仪将溶剂蒸干得到黄色粉末状固体(此时化合物哌嗪基团上含有Boc结构)。将该黄色固体溶于10mL二氯甲烷,滴加过量三氟乙酸(1mL),室温搅拌2小时,随后使用氮气吹干溶液得到橙红色油状液体。用少量水溶解该红色油状液体,随后用NaHCO3溶液将pH调至7左右,使用二氯甲烷溶液萃取(30mL×3),将萃取液集中加入无水硫酸钠(15g)干燥,过滤,蒸干后得到黄色片状固体。将固体溶解于10mL乙腈中,经半制备高效液相色谱法(流动相乙腈:水=1mL/min:3mL/min,色谱柱为Agilent Prep 100AC18)纯化后得到目标化合物YINQ-7(黄色粉末状固体,335mg),收率16.2%。熔点:264-266℃,纯度:96.9%(HPLC)。TLC:Rf=0.3(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,600MHz,ppm):δ9.55-9.54(d,J=8.1Hz,1H),8.70-8.66(m,2H),8.15-8.13(d,J=8.0Hz,1H),7.39-7.36(m,2H),4.27(t,J=7.5Hz,2H),3.15-3.10(m,4H),2.68-2.62(m,4H),2.56-2.54(t,J=6.3Hz,2H),1.95-1.89(m,2H).MS(ESI)calcd for C21H21N5OS2:423.1,found:424.1(M+H+),446.1(M+Na+).
实施例8:目标化合物YINQ-8的制备
试验方法同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的3-苯基-1-丙胺代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-8(黄色粉末状固体,465mg),收率22.9%。熔点:256-258℃,纯度:99.9%(HPLC)。TLC:Rf=0.7(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,600MHz,ppm):δ9.59-9.58(d,J=8.1Hz,1H),8.77-8.74(m,2H),8.15-8.14(d,J=8.0Hz,1H),7.40-7.38(m,2H),7.28-7.26(d,J=7.5Hz,2H),7.24-7.23(d,J=7.6Hz,2H),7.17(t,J=7.2Hz,1H),4.28(t,J=6Hz,2H),2.79(t,J=7.7Hz,2H),2.18-2.13(m,2H).MS(ESI)calcd for C23H17N3OS2:415.1,found:416.3(M+H+).
实施例9:目标化合物YINQ-9的制备
试验方法同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的3-(4-苄基-哌啶-1-基)-丙胺代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-9(黄色粉末状固体,290mg),收率11.6%。熔点:244-245℃,纯度:99.5%(HPLC)。TLC:Rf=0.62(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,600MHz,ppm):δ9.52-9.51(d,J=8.1Hz,1H),8.76-8.72(m,2H),8.14-8.13(d,J=8.0Hz,1H),7.40-7.37(m,2H),7.32-7.31(d,J=6.4Hz,2H),7.24(t,J=6.9Hz,1H),7.15-7.14(d,J=7.4Hz,2H),4.31(t,J=6.7Hz,2H),3.68-3.66(d,J=12.5Hz,2H),3.14(t,J=6.4Hz,2H),2.62-2.55(m,4H),2.35-2.30(m,2H),1.88-1.82(m,5H).13C-NMR(DMSO-d6,151MHz,ppm):δ191.74,166.41,158.70,158,56,151.99,151.78,139.77,136.53,134.41,133.03,132.29,130.82,129.50,128.81,128.73,126.52,124.53,124.50,53.79,52.36,42.47,41.84,35.26,29.27,22.23.MS(ESI)calcdfor C29H28N4OS2:512.1705,found:513.1784(M+H+).
实施例10:目标化合物YINQ-10的制备
试验方法同实施例1,不同之处在于“用4.89mmol的3-(4-苄基-哌啶-1-基)-丙胺代替4.89mmol的3-二甲氨基-1-丙胺”,其余步骤相同。重结晶后得到目标化合物YINQ-10(黄色粉末状固体,344mg),收率16.1%。熔点:210-212℃,纯度:99.5%(HPLC)。TLC:Rf=0.58(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Deuterium Oxide,600MHz,ppm):δ8.62-8.60(d,J=8.0Hz,1H),8.27-8.21(m,2H),7.44-7.43(d,J=7.9Hz,1H),7.12-7.08(m,2H),4.00(t,J=6.9Hz,2H),3.89-3.40(m,8H),3.36(t,J=6.2Hz,2H),2.95(s,3H),2.13-2.08(m,2H).MS(ESI)calcd for C22H23N5OS2:437.1,found:438.3(M+H+).
实施例11:目标化合物YINQ-1Y的制备
将化合物YINQ-1(50mg,0.13mmol)溶解于25mL二氯甲烷中,随后通入干燥HCl气体,室温搅拌半小时产生橙红色沉淀。将沉淀过滤,用二氯甲烷洗涤滤饼,干燥后得到目标化合物YINQ-1Y(橙红色粉末状固体,37mg),收率62.0%。熔点:164-165℃,纯度:95.3%(HPLC)。TLC:Rf=0.16(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ8.94-8.92(d,J=8.2Hz,1H),8.46-8.45(d,J=4.9Hz,2H),7.77-7.76(d,J=8.0Hz,1H),736-7.32(m,2H),4.13(t,J=7.3Hz,2H),3.33(t,J=7.7Hz,2H),2.97(s,6H),2.21-2.15(m,2H).MS(ESI)calcd for C19H18N4OS2:382.1,found:383.1(M+H+).
实施例12:目标化合物YINQ-2Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-2”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-2Y(橙红色粉末状固体,27mg),收率46.1%。熔点:169-170℃,纯度:95.5%(HPLC)。TLC:Rf=0.17(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ8.71-8.70(d,J=8.0Hz,1H),8.29-8.28(d,J=5.1Hz,2H),7.55-7.54(d,J=7.9Hz,1H),7.18-7.14(m,2H),3.97(t,J=7.4Hz,2H),3.22-3.12(m,6H),2.05-1.99(m,2H),1.24(t,J=7.3Hz,6H).MS(ESI)calcd forC21H22N4OS2:410.1,found:411.1(M+H+).
实施例13:目标化合物YINQ-3Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-3”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-3Y(橙红色粉末状固体,26mg),收率42.7%。熔点:164-166℃,纯度:99.7%(HPLC)。TLC:Rf=0.12(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ8.60-8.59(d,J=8.1Hz,1H),8.26-8.23(m,2H),7.45-7.44(d,J=8.0Hz,1H),7.10-7.05(m,2H),3.98(t,J=7.2Hz,2H),3.88(t,J=5.1Hz,4H),3.41-3.37(m,6H),2.15-2.18(m,2H).MS(ESI)calcd for C21H22N4O3S2:442.1,found:443.1(M+H+).
实施例14:目标化合物YINQ-4Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-4”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-4Y(橙红色粉末状固体,34mg),收率58.1%。熔点:154-156℃,纯度:95.7%(HPLC)。TLC:Rf=0.12(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ9.57(d,J=8.1Hz,1H),8.76-8.71(m,2H),8.14(d,J=8.1Hz,1H),7.40-7.35(m,2H),4.34-4.31(t,J=7.2Hz,2H),3.66-3.61(m,4H),2.52-2.51(t,J=6.5Hz,2H),2.45-2.37(m,4H),2.01-1.96(m,2H).MS(ESI)calcd forC21H20N4O2S2:424.1,found:425.1(M+H+).
实施例15:目标化合物YINQ-5Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-5”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-5Y(橙红色粉末状固体,29.4mg),收率50.1%。熔点:146-148℃,纯度:99.6%(HPLC)。TLC:Rf=0.14(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ8.74-8.72(d,J=8.5Hz,1H),8.30-8.29(m,2H),7.55-7.54(d,J=1.2Hz,1H),7.20-7.17(m,2H),3.99-3.96(t,J=7.4Hz,2H),3.65-3.61(m,2H),3.26(t,J=7.5Hz,2H),3.08-3.00(m,2H),2.14-1.99(m,4H),1.99-1.87(m,2H).MS(ESI)calcd for C21H20N4OS2:408.1,found:409.1(M+H+).
实施例16:目标化合物YINQ-6Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-6”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-6Y(橙红色粉末状固体,36mg),收率62.4%。熔点:144-146℃,纯度:99.5%(HPLC)。TLC:Rf=0.15(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Methanol-d4,400MHz,ppm):δ9.35-9.33(d,J=8.1Hz,1H),8.74-8.68(m,2H),8.25-8.23(d,J=8.0Hz,1H),7.63-7.45(m,2H),4.31(t,J=6.5Hz,2H),3.76-3.73(d,J=12.1Hz,2H),3.43-3.39(t,J=8.0Hz,2H),3.04(t,J=12.3Hz,2H),2.43-2.34(m,2H),2.02-1.98(d,J=15.1Hz,2H),1.86-1.71(m,3H),1.57(t,J=11.8Hz,1H).MS(ESI)calcdfor C22H22N4OS2:422.1,found:423.1(M+H+),445.1(M+Na+).
实施例17:目标化合物YINQ-7Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-7”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-7Y(橙红色粉末状固体,24mg),收率38.2%。熔点:149-151℃,纯度:99.4%(HPLC)。TLC:Rf=0.12(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ8.94-8.92(d,J=8.2Hz,1H),8.38-8.37(d,J=4.7Hz,2H),7.78-7.76(d,J=8.0Hz,1H),7.30-7.27(m,2H),4.05(t,J=7.0Hz,2H),3.58-3.51(d,J=29.9Hz,8H),3.35-3.32(m,2H),2.14-2.08(m,2H).MS(ESI)calcd forC21H21N5OS2:423.1,found:424.1(M+H+).
实施例18:目标化合物YINQ-8Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-8”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-8Y(橙红色粉末状固体,40mg),收率69%。熔点:153-155℃,纯度:99.4%(HPLC)。TLC:Rf=0.16(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,600MHz,ppm):δ9.76-9.74(d,J=8.1Hz,1H),8.82-8.79(d,J=17.3Hz,2H),8.22-8.15(m,1H),7.51-7.44(m,2H),7.24-7.14(m,4H),7.11(t,J=6.7Hz,1H),4.24-4.22(t,J=6.7Hz,2H),2.75-2.73(t,J=7.1Hz,2H),2.13-2.09(m,2H).MS(ESI)calcd for C23H17N3OS2:415.1,found:416.3(M+H+).
实施例19:目标化合物YINQ-9Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-9”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到目标化合物YINQ-9Y(橙红色粉末状固体,24mg),收率42%。熔点:136-137℃,纯度:97.3%(HPLC)。TLC:Rf=0.14(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Chloroform-d,500MHz,ppm):δ9.38-9.36(d,J=8.2Hz,1H),8.68-8.66(m,2H),7.80-7.98(d,J=8.0Hz,1H),7.36-7.20(m,5H),7.13-7.11(d,J=7.0Hz,2H),4.27-4.25(t,J=6.7Hz,2H),3.71-3.68(d,J=11.6Hz,2H),3.26-3.19(m,2H),2.71-2.56(m,4H),2.35-2.28(m,2H),1.87-1.72(m,5H).13C-NMR(DMSO-d6,151MHz,ppm):13C-NMR(DMSO-d6,151MHz,ppm)δ191.64,166.30,158.65,158.50,151.94,151.72,139.78,136.50,134.36,132.98,132.21,130.74,129.48,128.72,128.68,126.51,124.51,124.47,53.78,52.34,42.47,41.86,35.28,29.27,22.23.MS(ESI)calcd for C29H28N4OS2:512.1705,found:513.1775(M+H+),535.1593(M+Na+).
实施例20:目标化合物YINQ-10Y的制备
试验方法同实施例11,不同之处在于“将化合物YINQ-1替换为同等质量的化合物YINQ-10”,最后过滤沉淀洗涤干燥后得到得到目标化合物YINQ-10Y(橙红色粉末状固体,36mg),收率58%。熔点:121-123℃,纯度:95.4%(HPLC)。TLC:Rf=0.15(DCM:MeOH=10:1,v/v),1H-NMR(Deuterium Oxide,600MHz,ppm):δ8.71-8.70(d,J=8.1Hz,1H),8.29-8.23(m,2H),7.52-7.51(d,J=7.9Hz,1H),7.19-7.12(m,2H),4.03-4.01(t,J=7.2Hz,2H),3.96-3.42(m,8H),3.1(t,J=7.8Hz,2H),2.97(s,3H),2.16-2.11(m,2H).MS(ESI)calcdfor C22H23N5OS2:437.1,found:438.3(M+H+).
实施例21:体外抗肿瘤活性实验使用CCK-8,细胞划痕和流式细胞术等实验方法测试目标化合物对人黑色素瘤A375细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人前列腺癌PC-3细胞、人胃腺癌AGS细胞和人肺癌HCC827细胞等肿瘤细胞系的细胞毒性、迁移能力和细胞凋亡情况的影响。
(1)实验材料
实验所使用的主要实验设备及实验试剂如表21-1、表21-2所示:
表21-1实验设备
表21-2实验试剂
(2)实验方法
本实验室所采用的所有细胞均来自中科院典型培养物保藏委员会细胞库,具备STR报告。实验过程中所使用的器材及耗材均经过严格灭菌,实验全程在标准细胞房和超净台内操作,确保实验环境无菌,实验结果无干扰,可重复。
(Ⅰ)细胞复苏
①将水浴锅提前升温至37℃,打开准备好的超净台,点燃酒精灯,将所需材料全部放入其中。准备15ml无菌离心管,加入3mL预热过的完全培养基备用。
②将储存于液氮中的冻存管取出,迅速转移至预冻的冻存盒中。取出冻存管,在水浴锅中快速摇晃解冻,待冻存管中尚余少量冰渣时转移至超净台内。使用移液枪将冻存管中含有肿瘤细胞的细胞悬液吹打均匀尽快转移至15mL离心管中,随后在预冷至4℃的离心机中离心,200×g,5分钟。
③小心取出离心管转移至超净台内,使用移液枪吸取上清液丢弃,加入2mL完全培养基重悬细胞。在准备好的培养皿中提前加入6mL完全培养基,随后将细胞悬液均匀添加到培养皿中摇匀。
④将培养皿小心转移至37℃细胞培养箱中培养,待24小时后视情况更换一次完全培养基。
(Ⅱ)细胞传代
①当细胞长至密度80%-90%时,此时由于接触抑制细胞增殖会受到影响。将培养皿内原有培养基弃去,使用PBS缓冲液冲洗两遍以洗去死亡细胞和残留培养基。
②在培养皿内加入1mL胰酶,摇匀放置到37℃细胞培养箱内消化2-3分钟。待细胞形态变圆,轻敲即可脱离皿底时,将培养皿转移至超净台内,加入2mL含血清的完全培养基以终止消化。使用移液枪轻轻吹打皿底将所有细胞悬液全部转移至离心管中,使用PBS缓冲液冲洗培养皿2-3次以洗去残留细胞。随后在预冷至4℃的离心机中离心,200×g,5分钟。
③离心结束后将离心管转移至超净台内,弃去上清液,加入4mL完全培养基吹打均匀。提前在培养皿中加入完全培养基,按照试验所需将细胞悬液添加到培养皿中,摇匀后转移37℃细胞培养箱内培养。
根据测试细胞种类的不同,进行实验时选择1640、DMEM或IMEM培养基。其中,进行A375细胞、AGS细胞或MDA-MB-231细胞测试时,选择DMEM完全培养基;进行PC-3细胞、HCC827细胞、H1299细胞、SK-OV-3细胞或K562细胞测试时,选择1640完全培养基。
(Ⅲ)细胞冻存
①选取生长状态良好的细胞进行冻存,待细胞生长至密度80%-90%时将细胞消化,离心收集到离心管中。
②提前配置10%DMSO的细胞冻存液(溶剂为胎牛血清,DMSO在溶剂中的浓度是10%),使用冻存液重悬细胞并转移至冻存管中,做好细胞名称,代数,冻存人,冻存时间等标记以便下次使用。
③将冻存管暂存在冻存盒中,在-80℃超低温冰箱中预冻24小时后转移至液氮中保存,冻存的细胞距离下次使用应超过一个月时间。
(Ⅳ)CCK-8实验
①在正式实验之前应进行预实验,探索最佳细胞铺板数量和CCK-8试剂孵育时间。将所测试细胞按5000-20000/孔不同细胞数接种至96孔板内,放置在37℃细胞培养箱中培养48小时后加入CCK-8试剂。使用酶标仪检测在450nm处吸光度,测试不同孵育时间使最终结果OD450值稳定在1.0-1.8范围内。
②开始正式实验,收集正处于对数生长期的细胞,向大皿中加入1mL胰酶,摇晃均匀后放入细胞培养箱中孵育2-5分钟,随后加入含血清的培养基终止消化,收集细胞离心重悬后统计细胞悬液中细胞密度。按预实验确定的每孔细胞数量将细胞悬液接种至96孔板内,每孔细胞悬液体积95μL。另外设置空白组(只含有培养基,去除背景吸收)和对照组(不加化合物,细胞正常生长),将接种好的96孔板小心转移至37℃细胞培养箱内,培养20小时使细胞恢复正常状态。
③细胞恢复正常后,准备加入化合物。按实验设置用DMSO稀释化合物,配置相应浓度的化合物,每孔加入含化合物的DMSO溶液的总体积为1μL。配药时通常在三个重复孔的基础上多配一孔,即将四孔所需化合物总量用DMSO稀释至4μL,随后加入16μL完全培养基补齐体积至20μL,向96孔板实验组中每孔加入5μL。对照组加入同样比例的DMSO,保证DMSO含量不变,消除误差。随后将96孔板小心转移至37℃细胞培养箱内,按实验所需继续培养48小时。
④细胞与化合物共同孵育48小时后,取出96孔板。按10μL/孔体积用反吸法快速均匀加入CCK-8试剂。混匀后将96孔板放置在37℃细胞培养箱内孵育半小时。
⑤按预实验时间孵育结束后,取出96孔板轻拍,使孔内溶液混合均匀。使用酶标仪测试样本在450nm处吸光度,当对照组吸光度稳定至1.0-1.8范围内结束,记录数据准备分析作图。
(Ⅴ)细胞划痕实验
①将细胞按所需数量接种至12孔板内,小心转移至37℃细胞培养箱中培养。待细胞长至密度85%以上,无肉眼可见空隙时准备进行划痕实验。
②弃去培养板内原有培养基,用PBS缓冲液冲洗2-3次以去除死亡细胞,并在培养板背面用马克笔横向画一条标志线。使用10μL枪头自上而下均匀有力的划下,尽量保证划痕界线光滑,宽度均匀,随后用PBS缓冲液冲洗2-3次。
③按实验设置用DMSO稀释化合物,配置相应浓度的化合物溶液,使用无血清培养基或根据实验所需。提前在培养板中加入1mL培养基,将配置好的化合物溶液均匀加入其中并混合均匀,对照组加入同样比例的DMSO以消除误差,随后将培养板放置在显微镜下观察并拍照。
④将培养板小心转移至37℃细胞培养箱内继续培养,根据实验计划在0,24,48小时分别拍照检查细胞划痕愈合情况(注意保证拍照位置不变),记录数据以进行分析作图。
(Ⅵ)流式细胞术检测细胞凋亡实验
①将细胞消化离心后,按2×105/孔密度接种于6孔板中,放置在37℃细胞培养箱中培养24小时,等待细胞恢复正常状态。
②吸出6孔板中原有培养基,用PBS缓冲液冲洗2-3次。随后将化合物按设定浓度混合在完全培养基中,加入6孔板,对照组加入含同样比例DMSO的培养基,培养36小时。
③结束后弃去原有培养基,每孔中加入200μL不含EDTA的胰酶消化细胞,随后将实验组和对照组所有细胞分别收集至离心管中离心,结束后弃去上清液。用PBS缓冲液重悬离心冲洗2-3次后,每孔使用300μL Binding Buffer重悬细胞,转移至流式管中。
④每管依次加入5μL Annexin V FITC,5μLPI荧光染料,各避光染色15分钟。结束后按照实验流程使用流式细胞仪检测荧光染料信号强度,区分细胞凋亡情况。使用流式数据分析软件FlowJo处理数据,分析数据并制作统计图。
实施例22:CCK-8实验测试目标化合物对所选择肿瘤细胞系体外细胞毒性
以广谱抗癌药物紫杉醇作为阳性对照,选用人黑色素瘤A375细胞,人非小细胞型肺癌H1299细胞、HCC827细胞,人胃腺癌AGS细胞,人卵巢癌SK-OV-3细胞,人乳腺癌MDA-MB-231细胞,人前列腺癌PC-3细胞和人白血病K562细胞等8种不同细胞系的肿瘤细胞,以20μmol/L为初浓度(即是体系混合均匀后,作用于细胞的化合物浓度),将化合物作用于各细胞系48小时,使用CCK-8试剂盒对化合物体外细胞毒性进行初步筛选。具体实验方法参见实施例21的(Ⅳ)CCK-8实验。
选出细胞毒性较好的化合物YINQ-5,YINQ-6,YINQ-9和YINQ-9Y,按照浓度梯度:0.5、1、2、4、8、16μmol/L进一步考察化合物对肿瘤细胞的杀死和生长抑制程度,对各肿瘤细胞系的IC50值,结果如图1a、图1b和表22-1所示。
表22-1.化合物YINQ-5,YINQ-6,YINQ-9,YINQ-9Y对A375,AGS,PC-3,HCC827,MDA-MB-231,H1299等各肿瘤细胞系IC50,紫杉醇作为阳性对照。
(实验重复3次,IC50取3次实验平均值,ND意味着未检测)
综合来看,该系列化合物具有广泛的抗肿瘤活性和一定的选择性,对多种肿瘤细胞都具有显著的细胞毒性,其中A375,AGS,PC-3和H1299细胞系对该系列化合物最敏感。对于所有的测试细胞,化合物YINQ-9及其盐酸盐YINQ-9Y在所测试化合物中均表现出最强的细胞毒性,其中化合物YINQ-9对A375,MDA-MB-231,PC-3,AGS和HCC827等细胞系的IC50值分别为4.11μM,8.50μM,8.70μM,5.25μM和5.58μM,活性其次的是化合物YINQ-6和YINQ-5。该系列化合物整体表现出很强的体外细胞毒性,具有进一步开发的潜力。
实施例23:细胞划痕实验检测目标化合物对黑色素瘤A375细胞迁移能力的影响
黑色素瘤由于具有高转移性,容易复发导致预后效果极差,因此虽然在皮肤肿瘤中占比不大,但致死率最高。若抑制其迁移和侵袭能力会对黑色素瘤的治疗具有显著的效果。本发明使用细胞划痕实验检测化合物YINQ-5,YINQ-6,YINQ-9和YINQ-9Y对黑色素瘤A375细胞迁移能力的影响,具体实验方法参见实施例21的(Ⅴ)细胞划痕实验,结果如图2a、图2b、图2c、图2d和图3所示。
图2a为化合物YINQ-5分别作用A375细胞24h,48h,抑制其划痕愈合情况实验图,图2b为化合物YINQ-6分别作用A375细胞24h,48h,抑制其划痕愈合情况实验图,图2c为化合物YINQ-9分别作用A375细胞24h,48h,抑制其划痕愈合情况实验图,图2d为化合物YINQ-9Y分别作用A375细胞24h,48h,抑制其划痕愈合情况实验图。对图2a-d中A375细胞划痕愈合情况进行测算后制作统计图,化合物YINQ-5,YINQ-6,YINQ-9,YINQ-9Y对A375细胞划痕实验结果统计图如图3所示。
细胞划痕实验结果证明,化合物YINQ-5,YINQ-6,YINQ-9和YINQ-9Y均可以抑制A375细胞划痕的愈合,且抑制效果随化合物作用浓度的增加而增加,具有浓度依赖性。在0h,24h,48h拍照分析发现,随着化合物作用时间的延长,对A375细胞划痕愈合的抑制愈加明显,这表明该系列化合物可以有效抑制A375细胞的迁移能力,对防止高转移性的肿瘤细胞发生远端转移具有潜在的效果。
实施例24:流式细胞术检测化合物YINQ-9对A375细胞凋亡情况影响
细胞凋亡是一种非常重要的细胞程序化死亡方式,在调控肿瘤发展过程中具有重要的作用。本发明使用流式细胞术检测化合物YINQ-9对A375细胞凋亡情况的影响,验证目标化合物是否可以引起A375肿瘤细胞凋亡,具体实验方法参见实施例21的(Ⅵ)流式细胞术检测细胞凋亡实验,结果如图4所示(在图4的直角坐标系中,第一象限为晚期凋亡细胞,特征为Annexin V FITC染料和PI染料双阳性;第二象限为坏死细胞,特征为PI染料阳性;第三象限为正常细胞,特征为Annexin V FITC染料和PI染料双阴性;第四象限为早期凋亡细胞,特征为Annexin V FITC染料阳性)。
结果如图4所示,当化合物YINQ-9作用36小时后,实验组A375细胞呈现明显凋亡现象。此时对照组有不到4%的细胞处于凋亡状态,而化合物YINQ-9浓度为6μmol/L的实验组中,有超过50%的细胞处于凋亡状态;化合物浓度为12μmol/L时,有超过85%的细胞处于凋亡状态。这表明化合物YINQ-9可以显著诱导A375细胞发生凋亡,且作用效果具有浓度依赖性,这一结果证明化合物YINQ-9对A375细胞具有重要的潜在治疗效果。
Claims (5)
3.如权利要求2所述的一种4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物的制备方法,其特征在于取代氨基化合物5为N-(3-氨丙基)哌啶或3-(4-苄基-哌啶)丙胺。
5.如权利要求1所述的一种4,5-二氮芴-罗丹宁轭合物的药学上可接受的盐的制备方法,其特征在于选用HCl气体作为成盐试剂,通过将干燥HCl气体通入目标化合物YINQ 6或9的二氯甲烷溶液中,过滤,即可得到目标化合物相应的盐酸盐。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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WO2006126177A2 (en) * | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Genesense Technologies Inc. | 2-indolyl imidazo[4,5-d]phenanthroline derivatives and their use in the treatment of cancer |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1223659A (zh) * | 1996-04-24 | 1999-07-21 | 武田药品工业株式会社 | 作为抗血脂过多剂的稠合咪唑并吡啶衍生物 |
WO2006126177A2 (en) * | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Genesense Technologies Inc. | 2-indolyl imidazo[4,5-d]phenanthroline derivatives and their use in the treatment of cancer |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
A novel one-pot solvent-free synthesis of 3-alkyl-2-thioxo-1,3- thiazolidine-4-ones;Nasiri, F.a;Zolali, A.b;Azimian, Z.b;《Journal of Sulfur Chemistry》;20141231;第35卷(第1期);第2页Scheme 1 * |
Design, synthesis of 4,5-diazafluorene derivatives and their anticancer activity via targeting telomeric DNA G-quadruplex.;Kang Zhou;《European journal of medicinal chemistry》;20190605;第178卷;第485页第4段,第486页scheme 1,第487页scheme 2 * |
Kang Zhou.Design, synthesis of 4,5-diazafluorene derivatives and their anticancer activity via targeting telomeric DNA G-quadruplex..《European journal of medicinal chemistry》.2019,第178卷第484-499页. * |
罗格列酮对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外抗肿瘤作用;章涛等;《第四军医大学学报》;20070615;第28卷(第11期);971-974 * |
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