CN114702509A - 一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物及其合成工艺和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物及其合成工艺和应用，所述苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物的合成路线是，以4‑溴‑1,8‑萘酐为起始底物，经过硝化、芳环取代、还原反应、重氮化、Pschorr环合获得重要中间体‑‑苯并噻吩并萘酐中间体，然后这个中间体与不同的胺反应得到目标产物，然后与氯化氢气体反应制成对应化合物盐酸盐的形式。所有目标化合物经1H‑NMR、质谱等结构鉴定。这些化合物通过CCK‑8，细胞划痕实验技术和细胞克隆实验技术评估其在细胞水平具有显著的抗肿瘤活性。这项发明对发现新的抗肿瘤小分子药物，尤其为1,8萘酰亚胺衍生物的临床药物研发提供了方向。

Description

一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物及其合成工艺和应用
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物及其合成工艺和应用。
背景技术
两个代表性的萘酰亚胺小分子，amonafide和mitonafide，在抗肿瘤方面进入了临床试验。长期以来，许多学者和研究人员都对其抱有很大的希望。然而，在体内amonafide会被N-乙酰基转移酶II(NAT2)乙酰化生成N-乙酰氨萘非特，这个代谢产物会引起不可预测的毒性和神经肌肉剂量限制性毒性；并且其口服较差，生物利用度低，这使其退出了临床应用。因此，人们做了大量的工作来改善萘酰亚胺类抗肿瘤小分子的不良反应。发现通过修饰萘酰亚胺的骨架可以提高其治疗效果，减少毒副作用，主要修饰方法包括修改连接的侧链、芳香环和环取代基。另一方面，众所周知，萘酰亚胺环也是荧光基团，主要靶标被认为是细胞核内DNA，但一些用作染料的荧光萘酰亚胺可以定位于其他亚细胞器，如溶酶体和线粒体，而不是细胞核。这暗示着一些萘酰亚胺衍生物可能具有不同于核DNA的细胞靶标。
由连续的鸟嘌呤碱基(G)组成的真核生物端粒区域、基因启动子区域和免疫球蛋白开关区域的DNA序列被证实可以形成非B-DNA结构。其中，一种目前被认为非常重要的一种核酸二级结构--G-四链体(G4)，G4在生物进程中具有关键性作用，比如DNA的转录、端粒的稳定性以及组蛋白的修饰，尤其近些年来被发现在癌症发生、发展中也有显著作用。在古菌、细菌和真核生物的基因组和线粒体中被发现存在潜在的G4序列，在人类基因组中其存在超过716310个，并且在人类染色质中总共发现了10000个。线粒体具有自己的DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，并具有复制、转录和翻译的能力。除了在染色质中，G4被认为存在于线粒体DNA中，可能参与线粒体代谢的调节。线粒体功能障碍在肿瘤细胞中很普遍，线粒体基因组不稳定性在广泛的人类癌症中得到充分证明。mtDNA缺失在各种人类恶性肿瘤中的普遍性，这促使研究人员探索线粒体序列的缺失对癌症诊断和治疗中个性化医疗的潜在用途。mtDNA由富含G碱基的重链和富含C碱基的轻链组成。G-四链体DNA扰乱了mtDNA复制机制的进程，其机制可能通过在DNA合成过程中导致停滞和/或在复制中间体加工过程中形成双链断裂。线粒体DNA缺失的位置主要是在基因组区域，还发现其两侧是串联重复序列。至少一种可能导致缺失的线粒体基因组不稳定性基础的机制是复制过程中线粒体DNA合成机制的停滞。
在过去的二十年中，大量证据表明G4具有临床相关性，尤其是在抗癌药物设计中。大多数靶向G4的小分子通常具有一些相似的结构特征：(1)具有可以与G4形成π-π堆积作用的芳香环；(2)具有与环槽界面相互结合的侧链；(3)具有与带负电荷的DNA/RNA骨架产生静电相互作用的正电荷。尽管在开发选择性靶向一种特定G4结构的药物方面还有很长的路要走，但已经提出了在细胞中起作用、有前景的先导化合物，并且已经广泛研究了它们与G4的相互作用。其中，萘酰亚胺类也被广泛的进行研究，其能够通过π-π堆积相互作用以高亲和力识别、诱导和稳定G4结构。开发用于靶向mtDNA的G4配体首先需要其能够到达细胞线粒体。目前报道的具有靶向键合线粒体G4的化合物，主要用途是作为荧光染料，而不是抗癌剂，因此，开发靶向线粒体G4小分子抗癌药物具有显著意义与价值。本发明涉及萘酰亚胺类衍生物具有很好的靶向mtDNA G4抗肿瘤的活性。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物及其合成工艺和应用，本发明考察了苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物进行体内外抗肿瘤活性，发现此类化合物在体内外能够很好地抑制肿瘤细胞的生长，这项发明对研发新的抗肿瘤小分子药物具有重要价值。
一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物，其结构通式如下所示：
Figure BDA0003601829000000031
上式中，R＝N’,N’–二甲基氨基、N’,N’–二乙基氨基、N’,N’–二乙醇氨基、3-(1-吡咯烷基)、3-(1-哌啶基)、3-(1-吗啉基)或3-(1-哌嗪基)。本发明中：
7a对应：R＝N’,N’–二甲基氨基，
7b对应：R＝N’,N’–二乙基氨基，
7c对应：R＝N’,N’–二乙醇氨基，
7d对应：R＝3-(1-吡咯烷基)，
7e对应：R＝3-(1-哌啶基)，
7f对应：R＝3-(1-吗啉基)，
7g对应：R＝3-(1-哌嗪基)。
所述的一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物的合成工艺，工艺路线如下：以4-溴-1,8萘酐(化合物1)为起始原料，通过硝化反应在4-溴-1,8萘酐的萘环的3位加入一个硝基，得到化合物2；然后化合物2与二苯基二硫醚反应得到化合物3，化合物3在SnCl2·H2O/浓盐酸存在下，化合物3的硝基被还原为氨基，得到化合物4；化合物4的氨基再经重氮化反应得到中间体5，然后通过Pschorr反应环化得到关键中间体6。然后化合物6与不同胺的反应，最终获得苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物7a-7g，最后与氯化氢气体反应能够合成它们对应的盐酸盐8a-8g；反应方程式如下：
Figure BDA0003601829000000041
本发明苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物的具体合成步骤如下：
1)4-溴-3-硝基-1,8萘酐(即化合物2)的制备：
将4-溴-1,8萘酐慢慢加入浓硫酸和硝酸钠，搅拌溶解；随后将混合物冰浴下反应，反应后固体经过滤后用水冲洗；将得到的固体加入二氯甲烷(DCM)中搅拌，过滤得到黄色粗产物，即为化合物2的粗制品。
2)3-硝基-4-苯硫基-1,8-萘酐(即化合物3)的制备：
化合物2的粗制品与叔丁醇钾和二苯基二硫醚溶解在DMSO溶液中搅拌反应，反应结束后旋蒸除去溶剂，合成的残留物用水冲洗，然后过滤，得到红色粗品，即为化合物3粗产物；
3)3-氨基-4-苯硫基-1,8-萘酐(即化合物4)的制备：
将化合物3粗产物，溶于浓盐酸中，加入SnCl2·H2O后搅拌，加热反应后，冷却至室温，过滤得到黄绿色粗品，即为化合物4粗品。
4)苯并噻吩并萘酐(即化合物6)的制备
将亚硝酸钠和冰醋酸滴加到浓硫酸中，混合物冷却后，加入化合物4粗品搅拌反应后，将生成的暗红色粘稠液加入硫酸铜水溶液和冰醋酸的溶液中，加入完成后，再回流反应，冷却、过滤、干燥，收集橙红色固体粗产物，即为化合物6粗品。
然后化合物6粗品与不同的胺反应，最终获得苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物7a-7g，最后合成了它们的盐酸盐8a-8g。
本发明提供的苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物能够很好的应用在抗肿瘤中。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的成果如下：
1)本发明对边链进行特异性改造，设计、合成了14个新型的具有荧光的萘酰亚胺类化合物，其制备方法简单、对设备要求低，且14个化合物收率和纯度高，其结构通过核磁和质谱均得以验证；
2)本发明通过应用14个新型化合物对16株肿瘤细胞的抗肿瘤活性进行了考察，发现部分化合物具有显著的抗肿瘤活性，尤其是化合物7c和其盐8c具有强抗肿瘤活性，还表现出广谱作用。
3)本发明通过从细胞水平对人肝癌细胞HepG2细胞进行了细胞划痕实验和细胞克隆实验，结果表明：化合物7c对人肝癌细胞HepG2细胞的迁移率和增殖能力具有显著的抑制作用。
4)本发明通过裸鼠体内进行了化合物的抗肿瘤活性评价。在体内依旧呈现了显著的抗肿瘤活性。
附图说明
图1A为CCK-8法测定化合物对不同细胞的抗肿瘤初筛结果；
图1B为CCK-8法测定化合物对正常细胞活性影响的初筛结果；
图1C为是挑选出来的化合物和细胞进行抗肿瘤精筛结果。
图2为化合物7c抑制HepG2细胞增殖和迁移的结果；图2中：(A)HepG2细胞以浓度为0.05、0.1、0.2μM的7c处理12天，测定其克隆形成率。(B)采用伤口愈合法，检测浓度为0.05、0.1和0.2μM的化合物7c对HepG2细胞48h和72h的影响。数据表示为平均±SD；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3为amonafide和化合物8c在体内抑制肝癌异种移植瘤生长测试对比结果；图3中：(A)每3天测量肿瘤体积。(B)和(C)21天后，取下异种移植瘤，并测量肿瘤重量。(D)动物的体重每两天测量一次。统计数据以平均数±SD表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
空白例1：
本发明中苯并噻吩并萘甲酸酐(化合物6)的制备步骤如下：
1)4-溴-3-硝基-1,8萘酐的制备
在0℃下，4-溴-1,8萘酐(22.16g,80mmoL)中慢慢加入浓硫酸(18M，10mL)和硝酸钠(8.16g，96mmoL)，搅拌溶解1小时。随后将混合物冰浴下反应3小时。固体经过滤后用水冲洗。将得到的固体加入600mL二氯甲烷(DCM)中，搅拌半小时，过滤得到16.00g黄色粗产物。
2)3-硝基-4-苯硫基-1,8-萘酐的制备
14.00g 4-溴-3-硝基-1,8-萘酐粗制品与叔丁醇钾(12.19g，108mmoL)和二苯基二硫醚(5.22g，23mmoL)溶解在140mL的DMSO溶液，在80℃内反应3h。然后，用油泵除去溶剂，合成的残留物用水冲洗，然后过滤，得到15g红色粗品。
3)3-氨基-4-苯硫基-1,8-萘酐的制备
将14.00g 3-硝基-4-苯硫基-1,8-萘酐粗产物，在40℃下溶于140mL浓盐酸(12M)中，加入SnCl2·H2O(9.92g)搅拌，加热至85℃反应2小时，冷却至室温，过滤得到12g黄绿色粗品。
4)苯并噻吩并萘酐的制备
将亚硝酸钠(1.07g,15.58mmoL)和冰醋酸(3mL)滴加到浓硫酸(10mL)中。混合物冷却至5℃后，加入2.5g 3-氨基-4-苯硫基-1,8-萘酐粗品。搅拌2小时后，将生成的暗红色粘稠液加入硫酸铜水溶液(9.36g硫酸铜，100mL水)和冰醋酸(5mL)的溶液中。加入完成后，再回流反应(98℃)1小时，冷却、过滤、干燥，收集粗产物，最后经硅胶柱层析纯化(用4-7％的甲醇在CH2Cl2中洗脱)得到产物为2.04g橙红色固体产物6(以4-溴-1,8萘酐为起始化合物计，苯并噻吩并萘酐的总收率62.0％)。熔点：267-269℃，HPLC纯度：97.6％。
实施例1.N-(3-二甲氨基丙基)-苯并噻吩萘酰亚胺(即化合物7a)制备
将空白例1制得的500mg苯并噻吩并萘甲酸酐(化合物6)和N,N-二甲基-1,3-丙二胺(252mg,2.54mmoL)在乙醇(10mL)中回流搅拌1小时。反应结束后，在减压下浓缩反应物，最后经硅胶柱层析纯化(用2-5％的甲醇在CH2Cl2中洗脱)得到542mg产物为黄色固体7a(化合物7a,收率：85.0％)。熔点：146-147℃，HPLC纯度：98.7％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ9.04(s,1H),8.54(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.31(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),8.24-8.15(m,1H),7.94-7.86(m,1H),7.76(dd,J＝8.2,7.3Hz,1H),7.54(dd,J＝6.0,3.1Hz,2H),4.29-4.20(m,2H),2.48(t,J＝7.2Hz,2H),2.30(s,6H),2.01-1.92(m,2H).MS(ESI)calculatedfor C23H20N2O2S：388.1,found：389.1[M+H]+.
实施例2.N-(3-二甲氨基丙基)-苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8a)的制备
然后将化合物7a(50mg)加入到二氯甲烷中，在室温下通入干燥的氯化氢气体1.5h。最后经浓缩除去溶剂后，得到的混合物经硅胶层析纯化(CH2Cl2：甲醇＝12：1，v/v)制得N-(3-二甲氨基丙基)-苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8a)为黄色固体(54mg，收率：99％)。熔点：240-241℃，HPLC纯度：96.7％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ9.23(s,1H),8.66-8.52(m,3H),8.23-8.17(m,1H),8.03-7.96(m,1H),7.70-7.63(m,2H),4.15(t,J＝6.7Hz,2H),3.11(t,J＝8.1Hz,2H),2.71(s,6H),2.13-2.01(m,2H).
参照实施例1中化合物7a的合成方法，将化合物6与同等摩尔量不同的胺反应，分别制备了化合物7b-7g，其余步骤同实施例1。同时，参照实施例2中化合物8a的合成方法，用不同的化合物7b-7g为原料分别制备了化合物8b-8g。
实施例3.N-(3-二乙基氨丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺(化合物7b)的制备
产物为黄色固体(596mg，收率:87.3％)。熔点：126-127℃，HPLC纯度：96.4％。1HNMR(500MHz,Chloroform-d):δ9.23(s,1H),8.64(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.44(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H),8.38-8.31(m,1H),8.03-7.96(m,1H),7.84(dd,J＝8.2,7.3Hz,1H),7.65-7.55(m,2H),4.31-4.21(m,2H),2.66(dd,J＝8.4,6.4Hz,2H),2.59(q,J＝7.2Hz,4H),2.01-1.92(m,2H),1.06(t,J＝7.1Hz,6H).MS(ESI)calculated for C25H24N2O2S:416.2,found：417.2[M+H]+.
实施例4.N-(3-二乙基氨丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8b)的制备
化合物8b以黄色固体形式合成。熔点：247-248℃，HPLC纯度：96.1％。1H NMR(500MHz,Deuterium Oxide):δ7.32(d,J＝7.0Hz,1H),7.15(dd,J＝14.8,7.7Hz,2H),7.08(t,J＝7.2Hz,1H),6.97(dt,J＝13.1,7.2Hz,3H),6.87(d,J＝7.7Hz,1H),3.43(t,J＝7.3Hz,2H),3.19(q,J＝7.4Hz,4H),3.14-2.99(m,2H),1.80(s,2H),1.26(t,J＝7.3Hz,6H).
实施例5.N-(3-二乙醇氨基丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺(化合物7c)的制备
产物为黄色固体(576mg，收率78.3％)。熔点：156-157℃，HPLC纯度：96.7％。1HNMR(500MHz,Chloroform-d):δ9.16(s,1H),8.61(d,J＝7.3Hz,1H),8.40(d,J＝8.2Hz,1H),8.31(dd,J＝6.8,2.0Hz,1H),8.03-7.93(m,1H),7.81(t,J＝7.8Hz,1H),7.60(tt,J＝7.6,5.9Hz,2H),4.33(t,J＝7.6Hz,2H),3.71(t,J＝5.1Hz,4H),2.73(t,J＝5.1Hz,4H),2.70(t,J＝6.3Hz,2H),1.98(t,J＝7.3Hz,2H).13C NMR(500MHz,DMSO-d6):δ163.78,142.93,138.52,135.61,132.93,130.64,130.40,128.38,128.18,126.86,124.90,123.74,123.40,123.02,120.08,55.78,55.07,51.71,37.66,22.60.MS(ESI)calculated for C25H24N2O4S:448.1457,found:449.1535[M+H]+,471.1352[M+Na]+.
实施例6.N-(3-二乙醇氨基丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8c)的制备
化合物8c为黄色固体。熔点：180-181℃，HPLC纯度：97.5％。1HNMR(500MHz,Deuterium Oxide):δ7.36(d,J＝7.1Hz,1H),7.20(d,J＝7.8Hz,1H),7.15(d,J＝7.7Hz,1H),7.11-6.92(m,3H),6.89(d,J＝7.7Hz,1H),3.88(t,J＝5.2Hz,4H),3.45(d,J＝7.6Hz,2H),3.35(s,4H),3.31-3.20(m,2H),1.89(s,2H).
实施例7.N-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺(化合物7d)的制备
产物为化合物7d为黄色固体(525mg，收率77.2％)。熔点：148-149℃，HPLC纯度：98.2％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.16(s,1H),8.60(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.39(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H),8.33-8.25(m,1H),8.01-7.92(m,1H),7.81(t,J＝7.8Hz,1H),7.65-7.51(m,2H),4.36-4.23(m,2H),2.68(t,J＝7.4Hz,2H),2.58(d,J＝5.7Hz,4H),2.05(d,J＝7.5Hz,2H),1.83-1.70(m,4H).MS(ESI)calculated for C25H22N2O2S:414.1,found:415.1[M+H]+.
实施例8.N-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8d)的制备
盐酸盐8d为黄色固体。熔点：234-235℃，HPLC纯度：98.0％。1HNMR(500MHz,Deuterium Oxide)δ7.31(d,J＝6.9Hz,1H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),7.11(d,J＝7.6Hz,1H),7.05(t,J＝7.1Hz,1H),6.95(dt,J＝27.4,7.4Hz,3H),6.84(d,J＝7.7Hz,1H),3.61(s,2H),3.44(d,J＝8.1Hz,2H),3.15(t,J＝7.5Hz,2H),3.02(s,2H),2.10(s,2H),1.98(s,2H),1.80(s,2H).
实施例9.N-(3-(哌啶-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺(化合物7e)的制备
产物为化合物7e为黄色固体(637mg，收率90.7％)。熔点：139-140℃，HPLC纯度：96.6％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.15(s,1H),8.59(dd,J＝7.4,1.1Hz,1H),8.38(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H),8.32-8.24(m,1H),8.00-7.91(m,1H),7.80(dd,J＝8.2,7.3Hz,1H),7.62-7.50(m,2H),4.26(dd,J＝8.3,6.6Hz,2H),2.56-2.49(m,2H),2.42(s,4H),2.01(tt,J＝9.0,6.5Hz,2H),1.54(p,J＝5.6Hz,4H),1.40(t,J＝5.7Hz,2H).MS(ESI)calculated for C26H24N2O2S:428.2,found:429.2[M+H]+.
实施例10.N-(3-(哌啶-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8e)的制备
盐酸盐8e以黄色固体形式合成。熔点：240-241℃，HPLC纯度：95.9％。1H NMR(500MHz,Deuterium Oxide):δ7.30(d,J＝6.9Hz,1H),7.13(dd,J＝16.4,7.7Hz,2H),7.05(t,J＝7.2Hz,1H),6.94(dt,J＝14.7,7.3Hz,3H),6.84(d,J＝7.5Hz,1H),3.54-3.31(m,4H),3.03(t,J＝7.8Hz,2H),2.94-2.77(m,2H),1.91(d,J＝15.0Hz,2H),1.85-1.34(m,6H).
实施例11.N-(3-(吗啉-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺(化合物7f)的制备
化合物7f为黄色固体(539mg，收率：76.4％)。熔点：205-206℃，HPLC纯度：97.4％。1HNMR(500MHz,Chloroform-d):δ9.19(s,1H),8.61(dd,J＝7.3,1.1Hz,1H),8.43(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H),8.35-8.27(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.83(t,J＝7.8Hz,1H),7.64-7.53(m,2H),4.38-4.26(m,2H),3.62(t,J＝4.7Hz,4H),2.55(t,J＝7.0Hz,2H),2.47(s,4H),2.08-1.94(m,2H).MS(ESI)calculated for C25H22N2O3S:430.1,found:431.1[M+H]+.
实施例12.N-(3-(吗啉-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8f)的制备
盐酸盐8f被合成为黄色固体。熔点：248-249℃，HPLC纯度：98.1％。1H NMR(500MHz,Deuterium Oxide):δ7.39(d,J＝7.1Hz,1H),7.27(d,J＝7.8Hz,1H),7.17(d,J＝7.7Hz,1H),7.06(dt,J＝18.4,6.8Hz,3H),7.00-6.88(m,2H),3.94(s,4H),3.49(t,J＝7.4Hz,2H),3.27(d,J＝27.8Hz,4H),3.15(t,J＝7.8Hz,2H),1.86(d,J＝14.6Hz,2H).
实施例13.N-(3-(哌嗪-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺(化合物7g)的制备
苯并噻吩并萘酐产品(500mg)和叔丁基4-(3-氨丙基)哌嗪-1-羧酸(599mg，2.46mmoL)在乙醇(10mL)中回流搅拌1h。反应结束后，在减压下浓缩反应物，最后经硅胶柱层析法纯化(以甲醇淋洗)，取产物为黄色固体，加入3mL三氟乙酸中，搅拌4h，除去溶剂，得到黄色固体(518mg，收率73.6％)。熔点：146-147℃，HPLC纯度：96.9％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ9.19(s,1H),8.61(d,J＝7.3Hz,1H),8.41(d,J＝8.1Hz,1H),8.35-8.27(m,1H),8.03-7.95(m,1H),7.82(t,J＝7.8Hz,1H),7.59(tt,J＝7.2,5.5Hz,2H),4.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.81(t,J＝4.9Hz,4H),2.53(t,J＝7.1Hz,2H),2.47-2.40(m,5H),2.00(p,J＝7.3Hz,2H).MS(ESI)calculated for C25H23N3O2S:429.2,found:430.2[M+H]+.
实施例14.N-(3-(哌嗪-1-基)丙基)苯并噻吩并萘酰亚胺盐酸盐(化合物8g)的制备
盐酸盐8g为黄色固体。熔点：242-243℃，HPLC纯度：96.8％。1H NMR(500MHz,Deuterium Oxide):δ7.58(d,J＝7.1Hz,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.44-7.31(m,2H),7.19(ddt,J＝22.2,14.7,7.5Hz,3H),7.08(t,J＝7.3Hz,1H),3.61(t,J＝7.5Hz,2H),3.55(s,4H),3.50(s,4H),3.19(t,J＝7.8Hz,2H),2.00-1.86(m,2H).
实施例15.本发明中14个化合物(即化合物7a～g、8a～g)对肿瘤细胞活性的影响
CCK-8实验所选用的肿瘤细胞涵盖2020年十大癌症高发病率的癌症报告中的肿瘤细胞，包括肾癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌，和选取儿童神经母细胞瘤发病率较高的5种神经母细胞瘤细胞株进行研究，以人正常胚肺细胞作为对照。
CCK-8实验方法：
(1)预实验探索：在正式实验之前应进行预实验，探索最合适铺板的细胞数量(对照组细胞长至接近80％-90％的每个孔的底面积)和CCK-8试剂孵育时间(OD450值稳定在1.0-1.8)。
(2)细胞铺板：收集正处于对数生长期的肿瘤细胞，消化离心重悬后，取10uL细胞液用细胞计数板计数，从而通过计算(所数细胞数/所数细胞数的格子数×V(mL)×104＝所铺板需要的孔数×每孔细胞铺板的数目，V＝所需细胞总数的体积)得到铺板细胞总数的细胞液体积。采用反吸法，将95μL细胞悬液接种至96孔板内。另外设置只含有培养基空白组(目的是去除背景吸收)和不加化合物的对照组，将接种好细胞的96孔板小心放入至细胞培养箱内培养24小时。
(3)给药：用DMSO进行梯度稀释，每孔加入DMSO或者化合物溶液的总体积为1μL。配化合物时通常需要多配置1个孔的量。也就是4μL含化合物溶液(实验组)或者DMSO(对照组)中，加入16μL完全培养基补齐体积至20μL，混匀，每孔加入5μL混合液。同样使用反吸法加入化合物，这样就可以尽量避免加入化合物时孔里培养基的气泡产生。随后将孔板转移至培养箱内继续培养48小时。
(3)加入CCK-8，检测吸光度：首先计算以每孔加入10μL的CCK-8试剂，计算所需要的试剂量，并多算一个孔的量，进行分装。取出96孔板，用反吸法快速加入CCK-8试剂，随后将96孔板放置在37℃细胞培养箱内孵育。按孵育结束后，使用酶标仪测试样本在450nm处吸光度，当对照组吸光度稳定至1.0-1.8范围内即可结束检测。用下述公式进行计算细胞存活率，最终结果将数据导入Prism 8软件进行作图，处理数据。
Figure BDA0003601829000000141
A＝实验组吸光度；B＝空白组吸光度；C＝对照组吸光度
按照上述处理方法，化合物7a～7g、化合物8a～8g以及paclitaxel(紫杉醇)在4μM浓度下对不同细胞的抗肿瘤活性进行了初步筛选，结果分别见图1A-1B中。经过初筛结果，本发明根据肿瘤细胞肿瘤、初筛抗肿瘤效果等选择较佳合适化合物进行了在化合物浓度梯度：0.125μM，0.25μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM下进一步抗肿瘤活性测试，以确定其抗肿瘤的IC50值，其它化合物没有进一步检测IC50，抗肿瘤活性结果分别见图1C和表1-表2(不同化合物对细胞抗肿瘤的IC50值结果)中。其中，图1A-1C中测试数据表示为平均数±SD；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。amonafide(氨萘非特)andpaclitaxel(紫杉醇)为阳性对照；表1-2中ND表示未确定。
表1
Figure BDA0003601829000000151
表2
Figure BDA0003601829000000161
根据上述CCK-8实验结果，该系列化合物具有广泛的抗肿瘤活性，并且存在一定的选择性。在初筛浓度为4μM时，这一系列的化合物对HepG2，MDA-MB-231，PC-3，SK-N-SH，SN-SY5Y，BE(2-M17)，IMR-32的作用效果最好。对正常细胞毒性，相对于其他化合物而言，化合物7c和8c存在较低的毒性。其中，发现化合物7c及其盐酸盐8c具有更普遍的抗肿瘤效果。
实施例16.本发明中化合物7c对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响
细胞克隆实验方法：
(1)细胞收集，铺板：将细胞消化离心后，弃去上清液，重悬细胞，计数，按每孔细胞数为500个的密度接种至6孔板内，细胞培养箱中培养24小时。
(2)化合物孵育：弃除原有的DMEM完全培养基，用PBS冲洗。化合物终浓度设定为0.05，0.1，0.2μM，对照组则加入含对应体积的DMSO，继续培养24小时。
(3)数据收集：化合物孵育结束后，将6孔板中含有化合物的原有培养基弃除，用PBS冲洗2-3次，更换不含化合物的完全DMEM培养基继续培养12天。单个细胞克隆群体长至50个细胞以上时，就可以吸除6孔板中的原有的DMEM培养基，然后用PBS冲洗。在每孔中沿壁轻轻地加入结晶紫染液，避光染色，最后用PBS冲洗2-3次，目的是为了保持培养板中背景干净，细胞集落清晰。用白色A4纸为背景，放在墙壁上，对着墙壁，用手机拍照记录数据。
细胞划痕实验方法：
(4)铺板：将细胞接种至12孔板内，稳定细胞，待细胞生长至无肉眼可见缝隙时就可以准备进行划痕实验。
(5)划细胞线：舍去培养板内原有DMEM培养基，吸干培养基，倒扣培养的12孔板，在培养板背面用马克笔画一条黑色的标志线。使用10μL枪头自上而下均匀有力的划下，使枪头和培养板底部成45°，尽量保证划痕界线光滑，宽度均匀，随后用PBS缓冲液冲洗2-3次，目的是为了弃掉皿里被划掉的细胞以及之前的死细胞，保持皿内干净。
(6)化合物孵育：将化合物按浓度配置好，使用无血清培养基(排除血清对细胞迁移能力的干扰)。将配置好的化合物溶液均匀加入，化合物终浓度为0.05，0.1，0.2μM，对照组则加入同样体积的DMSO以消除误差，混合均匀，随后在显微镜拍照记录0时细胞划痕的距离。拍照结束随后将培养板小心转移至培养箱。
(7)收集数据：根据实验计划在48小时，60小时分别拍照检查细胞划痕愈合情况(注意保证拍照位置不变，在十字交叉点记录上下划痕距离)，记录数据，用Prism 8进行分析作图。
细胞克隆和细胞划痕的实验结果如图2所示。为了考察化合物是否影响肿瘤细胞的增殖和迁移，进行了细胞划痕实验和细胞克隆实验。集落形成试验是检测抗肿瘤药物作用后细胞长期增殖的有效方法之一。结果显示，与对照组相比，化合物7c处理HepG2细胞后的肿瘤细胞集落数量明显减少(图2(A))；当化合物浓度为0.05μM时，菌落数为对照组的37.2％；当化合物浓度为0.2μM时，菌落数为对照组的6.6％。这说明化合物7c在抑制HepG2细胞的增殖方面具有明显的作用。
肿瘤细胞的迁移被认为是肿瘤进展和转移的关键因素，通过细胞划痕实验检测化合物7c对HepG2细胞迁移的影响。与对照组相比，随着化合物浓度的增加，HepG2细胞的迁移能力显著被抑制；在0.2μM浓度下，与对照组相比，肿瘤细胞迁移率达到50％以下，36小时细胞迁移率为41.6％，72小时细胞迁移率为33.9％(图2(B))；随着实验时间的延长，对照组细胞中间的距离逐渐减小；在浓度为0.1μM和0.2μM时，化合物处理72小时的肿瘤的迁移率均小于处理48小时，这说明化合物对HepG2细胞的迁移速率的抑制作用具有浓度和时间依赖性。综上所述，化合物7c对HepG2细胞的迁移抑制有明显的作用。
实施例17.本发明中化合物7c的盐酸盐8c的体内抗肿瘤研究
种瘤及化合物处理的方法：
小鼠适应性饲养一周后，将对数期生长的HepG2细胞用PBS调整浓度为2×107个/ml，每只小鼠皮下注射细胞悬液100μL。当肿瘤的平均体积达到100mm3时，将小鼠随机分组。小鼠腹腔注射溶媒对照(5％DMSO+30％PEG400+65％saline)，阳性对照氨萘非特的注射浓度(5mg/kg)，化合物8c的注射浓度(5mg/kg或15mg/kg)，注射体积1kg/10mL。给药频率为每天一次，每两天测量小鼠体重，并使用数字卡尺每隔2天监测肿瘤体积。21天后，处死小鼠，解剖内脏和肿瘤并称重。
使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积V(mm3)；肿瘤长度L(mm)；肿瘤宽度W(mm)。
Figure BDA0003601829000000191
使用以下公式计算肿瘤体积或重量的抑制率：A(阴性对照组的平均肿瘤体积或重量)；B(药物治疗组或阳性对照组的平均肿瘤体积或重量)。
Figure BDA0003601829000000192
体内抗肿瘤活性的实验结果如图3所示。鉴于化合物7c在细胞水平上具有明显的抗肿瘤活性，故有必要评估其体内疗效。其盐酸盐8c对HepG2细胞也有较强的抗肿瘤活性，IC50值为0.80±0.06μM，近似于化合物7c。考虑到化合物7c在溶剂中的溶解度较差，选择其盐酸盐8c进行动物实验。如图3(A)、(B)和(C)所示，化合物8c具有明显的抑制肿瘤生长的作用，且呈剂量依赖性。与对照组相比，给5mg/kg化合物8c治疗后肿瘤体积明显减小，抑制率为26％。相比之下，阳性对照组5mg/kg氨萘非特的肿瘤抑制率为20％。当给药剂量增加到15mg/kg时，化合物8c对肿瘤体积的抑制作用增加到48％。观察21天后，处死小鼠。肿瘤被切除并称重。与对照组相比，5mg/kg化合物8c治疗后肿瘤重量减轻，抑制率为23％。而5mg/kg氨萘非特的抑瘤率与化合物8c相同，均为25％。当给药剂量增加到15mg/kg时，化合物8c对肿瘤重量的抑制作用增加到51.4％。观察到，与对照组相比，两种剂量的化合物8c治疗显著降低了肿瘤重量。此外，用化合物8c和阳性对照(amonafide)处理的动物与溶媒组相比，体重没有显著减轻(图3(D))。

Claims (3)

1.一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物，其特征在于其结构通式如下所示：
Figure FDA0003601828990000011
上式中，R＝N’,N’–二甲基氨基、N’,N’–二乙基氨基、N’,N’–二乙醇氨基、3-(1-吡咯烷基)、3-(1-哌啶基)、3-(1-吗啉基)或3-(1-哌嗪基)。
2.如权利要求1所述的一种苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物的合成工艺，其特征在于合成的工艺路线如下：
以式(1)所示的4-溴-1,8萘酐为起始原料，通过硝化反应在4-溴-1,8萘酐的萘环的3位加入一个硝基，得到化合物2；然后化合物2与二苯基二硫醚发生芳环取代反应得到化合物3，化合物3在SnCl2·H2O/浓盐酸存在下，化合物3的硝基被还原为氨基，得到化合物4；化合物4的氨基再经重氮化反应得到中间体5，然后通过Pschorr反应环化得到关键中间体6；然后中间体6与不同胺的反应，最终获得苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物7a-7g，最后与氯化氢气体反应能够合成它们对应的盐酸盐8a-8g；反应方程式如下：
Figure FDA0003601828990000021
3.如权利要求1所述的苯并噻吩并萘酰亚胺衍生物在抗肿瘤中的应用。
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