CN105061315B - 一类1,5‑二苯基吡唑‑3‑羧酸类化合物及其应用 - Google Patents

一类1,5‑二苯基吡唑‑3‑羧酸类化合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类1,5‑二苯基吡唑‑3‑羧酸类化合物及其应用，所述化合物具有通式I的结构，其中：R1选自‑H、卤素、C1～C6的饱和烷基或‑X1‑R4；R2选自H、卤素、C1～C6的饱和烷基或‑X2‑R5；R3选自H、‑NH2或‑NH‑CO‑Ph‑(o﹑m﹑p)R6；R6选自H、卤素、C1～C6的饱和烷基或‑O‑R7；X1和X2分别独立选自O或S；R4、R5和R7分别独立选自H、C1～C6的饱和烷基、苄基或C1～C6的饱和烷基取代的苯基。本发明的化合物同时模拟BH3‑only和p53TAD蛋白α‑螺旋，竞争性结合和拮抗Mcl‑1、Bcl‑2和MDM2蛋白，特异性引起肿瘤细胞凋亡，实现其作为抗癌化合物的应用。

Description

一类1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一类新的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物，还涉及该类化合物在体外、体内同时模拟BH3-only蛋白和p53TAD结构域的α-螺旋，竞争性结合和拮抗Bcl-2、Mcl-1和MDM2蛋白，从而诱导细胞凋亡和作为抗癌化合物的应用。
背景技术
Bcl-2家族蛋白(B-cell lymphoma 2family of proteins)是內源细胞凋亡通路又称作线粒体通路的顶点和核心因子。大量肿瘤细胞高表达Bcl-2蛋白，逃避凋亡，获得永生。
p53是细胞内的转录因子，在细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA修复等细胞内生理过程中发挥着关键的作用，是细胞内最重要的抑癌因子。
因此，使用多靶点药物同时抑制Bcl-2家族蛋白中的抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2，和促进p53降解的泛素化E3连接酶MDM2，可以同时释放p53和下调Bcl-2蛋白，释放促凋亡蛋白Bax、Bak，通过它们之间的正协同效应增强药物杀伤肿瘤细胞的能力。
其中，Bcl-2家族蛋白和p53/MDM2的相互作用的核心结构都为一段含两亲性残基的α-螺旋，因此可以设计小分子同时模拟BH3-only蛋白和p53TAD区域的α-螺旋，同时竞争结合Mcl-1和Bcl-2蛋白的BH3沟槽和MDM2的p53TAD结合区域，达到同时释放p53和Bax、Bak，从而杀伤肿瘤细胞的目的。
发明内容
本发明旨在获得可作为BH3、p53TAD的α-螺旋模拟物，能够同时靶向性和高亲和力的抑制Bcl-2家族蛋白、p53/MDM2蛋白相互作用的化合物。
本发明的目的之一在于提供一类1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物，所述化合物具有下述通式I的结构：
其中：
R1选自-H、卤素、C1～C6的饱和烷基或-X1-R4；
R2选自-H、卤素、C1～C6的饱和烷基或-X2-R5；
R3选自-H、-NH2或-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6；
R6选自-H、卤素、C1～C6的饱和烷基或-O-R7；
X1和X2分别独立选自O或S；
R4、R5和R7分别独立选自-H、C1～C6的饱和烷基、苄基或C1～C6的饱和烷基取代的苯基。
进一步地，所述R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6。
进一步地，所述R3和R4分别独立选自C1～C6的饱和烷基，R5选自C1～C6饱和烷基取代的苯基。
进一步地，所述R5和R6分别独立选自C1～C6的饱和烷基。
进一步地，所述C1～C6的饱和烷基选自甲基、乙基、异丙基、仲丁基或异丁基。
本发明中，所述NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6中的o﹑m﹑p是分别指邻位取代、间位取代和对位取代。
本发明中，所述“C1～C6的饱和烷基”，优选C1～C5的饱和烷基、C1～C4的饱和烷基、C1～C3的饱和烷基、甲基、乙基，其中所述烷基为直链烷基或支链烷基。
进一步地，在上述所述的技术方案中，具有通式I的结构的化合物包括如下的化合物：
1-苯基-5-(-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
1-(4-异丙基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
4-苯甲酰胺基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
4-(4-异丙氧基苯甲酰氨基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
4-(4-异丙氧基苯甲酰氨基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
4-(4-异丙氧基苯甲酰氨基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸；
1,5-二(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸；
4-(4-氯苯甲酰胺基)-1,5-二(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸；
4-(4-苯基苯甲酰氨基)-1-(4-苯琉基苯基)-5-(4-异丙基苯基)吡唑-3-羧酸；
4-(4-叔丁基苯甲酰氨基)-1-(4-甲基苯基)-5-(4-异丙基苯基)吡唑-3-羧酸；
本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将4-R1-苯乙酮与乙二酸二甲酯按投料摩尔比1:1.2-1.5，在碱性试剂存在下，冰浴中反应5-8h，制备得2,4-二氧代-4-(4-R1-苯基)-丁酸甲酯，其中反应溶剂为四氢呋喃，碱性试剂为叔丁醇钾；
(2)将4-R2-苯胺与NaNO2按摩尔投料比1:1:2-1.5，冰浴下反应0.5小时，并直接加入还原剂反应4-6h，得4-R2-苯肼盐酸盐；其中反应溶剂为浓盐酸，还原剂为SnCl2；
(3)2,4-二氧代-4-(4-R1-苯基)-丁酸甲酯与4-R2-苯肼盐酸盐按摩尔投料比1:1.4-1.6经环化反应制得R3为H的化合物Ⅱ，其中溶剂为甲醇，反应温度60-65℃；
(4)化合物Ⅱ经碱性水解反应得R3为H的化合物I，其中碱为KOH或NaOH，化合物Ⅱ与所述碱的摩尔投料比1:5-10，溶剂为甲醇，反应温度60-65℃；
(5)2,4-二氧代-4-(4-R1-苯基)-丁酸甲酯先由N2O3取代，再在原反应容器中直接加入4-R2-苯肼盐酸盐，经环化、还原反应得到R3为NH2的化合物Ⅱ，其中2,4-二氧代-4-(4-R1-苯基)-丁酸甲酯与4-R2-苯肼盐酸盐的摩尔投料比为1:3，溶剂为甲醇，还原剂为连二亚硫酸钠，环化反应温度60-65℃，取代、还原反应温度为室温；
(6)将R3为NH2的化合物Ⅱ与R6COCl按摩尔投料比1:1.2-1.5，在缚酸剂存在下，冰浴反应3-6h；得R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6的化合物Ⅱ，其中反应溶剂为四氢呋喃，缚酸剂为三乙胺；
(7)R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6的化合物Ⅱ和NaOH按摩尔投料比1:10-1:20，在冰浴下反应10-20h，得R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6的化合物I，反应溶剂为质量比为1:1-2:1的四氢呋喃和水的混合溶剂；
(8)R3为NH2的化合物Ⅱ和NaOH按摩尔投料比1:10-1:20，在0℃下反应10-20h，得R3为NH2的化合物I，反应溶剂为质量比为1:1-2:1的四氢呋喃和水的混合溶剂。
在上述制备方法的描述中，各个取代基的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。
对通过上述方法获得的化合物，通过多种手段检测了它们的BH3、p53TAD结构域的α-螺旋类似程度，以及他们对Mcl-1、Bcl-2和MDM2的抑制能力。结果表明，本发明的上述具有新的结构的化合物具有极高的BH3和p53TAD结构域的α-螺旋类似程度，可以有效的抑制Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白。
对上述化合物，通过细胞实验检测了它们对多种肿瘤细胞系的抑制作用。结果表明，本发明的上述化合物可以很好的诱导多种肿瘤细胞系凋亡，而对正常细胞没有杀伤作用。
基于此，本发明还提供上述1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物可以用于制备BH3、p53TAD结构域的α-螺旋模拟物，应用于Bcl-2、MDM2家族蛋白抑制剂，并进一步用于制备抗肿瘤药物。所述的Bcl-2、MDM2家族蛋白抑制剂或相应的抗肿瘤药物可以是化合物的单质剂型也可以是有效量的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物与适量的药用辅剂混合形成的组合制剂。
本发明所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物同时模拟BH3-only和p53TAD蛋白α-螺旋，竞争性结合和拮抗Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白，从而诱导细胞凋亡作用，实现其作为抗癌化合物的应用。本发明化合物特异性的引起肿瘤细胞凋亡，而且对正常细胞没有杀伤力，有望被开发成为同时靶向Bcl-2家族蛋白和MDM2蛋白的安全、高效的多靶点蛋白抑制剂类抗癌药物。
附图说明
图1是荧光偏振方法检测化合物7与FAM-Bid肽段竞争结合Mcl-1蛋白的动力学曲线。
图2是荧光偏振方法检测化合物7与FAM-p53肽段竞争结合MDM2蛋白的动力学曲线。
图3是化合物7与Mcl-1蛋白结合的Autodock结果示意图。
图4是化合物7与MDM2蛋白结合的Autodock结果示意图。
图5是化合物7滴定Mcl-1蛋白的1H-15N HSQC，化学位移较大的氨基酸残基示意图。
图6是化合物7与其模拟的BH3-only蛋白的α-螺旋的叠加图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。
实施例1 1-苯基-5-(-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物1)的制备
量取0.913mL(0.01mol)苯胺，滴入50mL浓盐酸，在冰浴下搅拌10min。缓慢滴加2mol/L的亚硝酸钠水溶液7.5mL(0.15mol)。溶液变为红褐色，冰浴反应1h。在原反应容器中直接滴加1mol/L的氯化亚锡的浓盐酸溶液30mL，冰浴搅拌3h。析出大量白色固体，过滤，水洗，自然风干，不进行进一步提纯，得白色粉末状苯肼盐酸盐1.36g，产率94.1％。
称取2.83g(0.024mol)草酸二甲酯，2.92g叔丁醇钾(0.026mol)溶于100mL分子筛除过水的四氢呋喃中，氮气保护下冰浴反应20min。再取产率3.28g(0.02mol)4-乙氧基苯乙酮，溶于20mL四氢呋喃，冰浴下缓慢滴加入原反应容器中，冰浴下搅拌反应6h。析出大量黄色固体，抽滤，将所得固体用250mL水溶解，用1mol/L的盐酸调整pH＝2，析出淡黄色固体，抽滤，烘干。得淡黄色粉末状4-(4-乙氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯4.28g，产率85.6％。
称取125mg(0.5mmol)4-(4-乙氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，101mg(0.7mmol)苯肼盐酸盐加入25ml的圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，在60-65℃下回流反应3h。溶剂蒸干，粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得白色固体1-苯基-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯86.9mg，产率54％.
称取86.9mg(0.27mmol)1-苯基-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯，54mg氢氧化钠加入25mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，在60-65℃下回流反应2小时。冷却到室温，将反应溶液倒入100mL水中，用1mol/L盐酸调节pH＝2，析出白色固体，过滤，烘干，得白色粉末1-苯基-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸。
产品产量77.4mg,产率为93％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.205(s,1H),7.603(m,4H),7.548(t,2H),7.487(t,1H),7.171(s,1H),7.051(t,2H),4.050(m,2H),1.338(t,3H).TOF MS(EI+):C18H16N2O3,found 308.1.
实施例2 1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物2)的制备
称取3.70g(0.02mol)4-苯氧基苯胺，滴入50mL浓盐酸，在冰浴下搅拌10min。缓慢滴加2mol/L的亚硝酸钠水溶液7.5mL(0.15mol)。溶液变为红褐色，冰浴反应1h。在原反应容器中直接滴加1mol/L的氯化亚锡的浓盐酸溶液30mL，冰浴搅拌3h。析出大量固体，过滤，水洗，自然风干，不进行进一步提纯，得浅黄色粉末状4-苯氧基苯肼盐酸盐4.39g，产率92.8％。
称取125mg(0.5mmol)4-(4-乙氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，166mg(0.7mmol)4-苯氧基苯肼盐酸盐加入25ml的圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，在60-65℃下回流反应3h。溶剂蒸干，粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯(按体积比4:1)，得淡黄色固体1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯114mg，产率55％.
称取112mg(0.27mmol)1-苯基-5-(-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯，54mg氢氧化钠加入25mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，在60-65℃下反应回流2小时。冷却到室温，将反应溶液倒入100mL水中，用1mol/L盐酸调节pH＝2，析出白色固体，过滤，烘干，得白色粉末1-苯基-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸。
产品产量101mg,产率为93.5％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.002(s,1H),7.422(t,2H),7.299(d,2H),7.205(m,3H),7.171(s,1H),7.048(d,2H),6.985(m,4H),4.040(d,2H),1.325(t,3H).TOF MS(EI+):C24H20N2O4,found 400.1.
实施例3 1-(4-异丙基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物3)的制备
量取1.37mL(0.02mol)4-异丙基苯胺，滴入50mL浓盐酸，在冰浴下搅拌10min。缓慢滴加2mol/L的亚硝酸钠水溶液7.5mL(0.15mol)。溶液变为红褐色，冰浴反应1h。在原反应容器中直接滴加1mol/L的氯化亚锡的浓盐酸溶液30mL，冰浴搅拌3h。析出大量固体，过滤，水洗，自然风干，不进行进一步提纯，得淡棕色粉末状4-异丙基苯肼盐酸盐1.72g，产率92.2％。
称取2.83g(0.024mol)草酸二甲酯，2.92g叔丁醇钾(0.026mol)溶于100mL分子筛除过水的四氢呋喃中，氮气保护下冰浴反应20min。再取3.56g(0.02mol)4-异丙氧基苯乙酮，溶于20mL四氢呋喃，冰浴下缓慢滴加入原反应容器中，冰浴下搅拌反应6h。析出大量黄色固体，抽滤，将所得固体用250mL水溶解，用1mol/L的盐酸调整pH＝2，析出淡黄色固体，抽滤，烘干。得淡黄色粉末状4-(4-异丙氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯4.13g，产率78.2％。
称取132mg(0.5mmol)4-(4-异丙氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，131mg(0.7mmol)4-异丙基苯肼盐酸盐加入25ml的圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，在60-65℃下回流反应3h。溶剂蒸干，粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯(4:1)，得白色固体1-(4-异丙基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯94.4mg，产率49.9％.
称取94.4mg(0.25mmol)1-苯基-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯，50mg氢氧化钠(1.25mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，在60-65℃下反应回流2小时。冷却到室温，将反应溶液倒入100mL水中，用1mol/L盐酸调节pH＝2，析出白色固体，过滤，烘干，得白色粉末1-(4-异丙基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸。
产品产量88.2mg,产率为96.9％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.205(s,1H),7.603(m,2H),7.548(t,2H),7.312(d,2H),7.171(s,1H),7.051(t,2H),4.120(m,1H),2.872(m,1H),1.328(t,6H),1.205(d,6H).TOF MS(EI+):C19H18N2O2,found 364.2.
实施例4 1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物4)的制备
称取2.83g(0.024mol)草酸二甲酯，2.92g叔丁醇钾(0.026mol)溶于100mL分子筛除过水的四氢呋喃中，氮气保护下冰浴反应20min。再取4.52g(0.02mol)4-苄氧基苯乙酮，溶于20mL四氢呋喃，冰浴下缓慢滴加入原反应容器中，冰浴下搅拌反应6h。析出大量黄色固体，抽滤，将所得固体用250mL水溶解，用1mol/L的盐酸调整pH＝2，析出淡黄色固体，抽滤，烘干。得淡黄色粉末状4-(4-苄氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯5.44g，产率87.2％。
称156mg(0.5mmol)4-(4-苄氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，166mg(0.7mmol)4-苯氧基苯肼盐酸盐加入25ml的圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，在60-65℃下回流反应3h。溶剂蒸干，粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯(按体积比4:1)，得白色固体1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯128mg，产率53.8％.
称取119mg(0.25mmol)1-苯基-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯，50mg氢氧化钠(1.25mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，反应回流2小时。冷却到室温，将反应溶液倒入100mL水中，用1mol/L盐酸调节pH＝2，析出白色固体，过滤，烘干，得白色粉末1-(4-异丙基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸。
产品产量107mg,产率为93.0％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.002(s,1H),7.422(t,2H),7.254(t,2H),7.299(d,2H),7.205(m,3H),7.181(m,4H),7.048(d,2H),6.985(m,4H),5.165(s,2H).TOF MS(EI+):C24H20N2O4,found 400.1.
实施例5 4-苯甲酰胺基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物5)的制备
称取1.50g(6mmol)4-(4-乙氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，溶于30mL甲醇中，40℃搅拌下持续通入N2O3，反应1h。溶液变为淡红色，减压蒸馏除去溶剂，得粉红色液体粗产物，不进行进一步提纯直接进行下一步反应。
取上步所得的全部淡粉色液体产品，加入4-苯氧基苯肼盐酸盐4.25g(18mmol),溶于30mL甲醇中，氮气保护下回流反应2.5h，溶液变为红褐色。冷却至室温，向反应液中滴加饱和连二亚硫酸钠水溶液至红褐色完全褪去。将反应液倒入150ml水中，析出大量固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得土黄色固体4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯0.55g，两步反应总产率21.9％。
称取4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯129mg(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，苯甲酰氯68.9μL(0.6mmol)，冰浴下搅拌反应6h。将反应液将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯(2:1)，得白色固体4-苯甲酰胺基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯132mg，产率82.5％。
称取4-苯甲酰胺基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯107mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量99mg,产率为95.2％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.002(s,1H),9.851(s,1H),7.890(d,2H),7.577(t,1H),δ7.521(t,2H),7.422(t,2H),7.323(d,2H),7.202(m,3H),7.062(m,4H),6.921(d,2H),4.010(m,2H),1.295(t,3H).TOF MS(EI+):C31H25N3O5,found519.2.
实施例6 4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物6)的制备
称取4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯129mg(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，4-异丙氧基苯甲酰氯100μL，冰浴下搅拌反应6h。将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比2:1)，得白色固体4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯134mg，产率75.6％。
称取4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯118mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量100mg,产率为84.7％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.002(s,1H),9.851(s,1H),7.890(d,2H),7.577(t,1H),δ7.521(t,2H),7.422(t,2H),7.323(d,2H),7.202(d,2H),7.062(m,4H),6.921(d,2H),4.692(m,1H),4.010(m,2H),1.295(t,3H),1.256(t,6H).TOFMS(EI+):C34H31N3O6,found 577.2.
实施例7 4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物7)的制备
称取1.58g(6mmol)4-(4-乙氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，溶于30mL甲醇中，40℃搅拌下持续通入N2O3，反应1h。溶液变为淡红色，减压蒸馏除去溶剂，得粉红色液体粗产物，不进行进一步提纯直接进行下一步反应。
取上步所得的全部淡粉色液体产品，加入4-苯氧基苯肼盐酸盐4.25g(18mmol),溶于30mL甲醇中，氮气保护下回流反应2.5h，溶液变为红褐色。冷却至室温，向反应液中滴加饱和连二亚硫酸钠水溶液至红褐色完全褪去。将反应液倒入150ml水中，析出大量固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯(4:1)，得橙黄色固体4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯0.67g，两步反应总产率25.2％。
称取4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯133mg(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，4-异丙氧基苯甲酰氯100μL，冰浴下搅拌反应6h。将反应液将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比2:1)，得白色固体4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯145mg，产率79.8％。
称取4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-异丙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯121mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量112mg，产率为94.9％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.002(s,1H),9.851(s,1H),7.890(d,2H),7.577(t,1H),δ7.521(t,2H),7.422(t,2H),7.323(d,2H),7.202(d,2H),7.062(m,4H),6.921(d,2H),4.692(m,1H),4.010(m,2H),1.259(m,12H).TOF MS(EI+):C35H33N3O6,found 591.2.
实施例8 4-(4-异丙氧基苯甲酰氨基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物8)的制备
称取1.87g(6mmol)4-(4-苄氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，溶于30mL甲醇中，40℃搅拌下持续通入N2O3，反应1h。溶液变为淡红色，减压蒸馏除去溶剂，得粉红色液体粗产物，不进行进一步提纯直接进行下一步反应。
取上步所得的全部淡粉色液体产品，加入4-苯氧基苯肼盐酸盐4.25g(18mmol),溶于30mL甲醇中，氮气保护下回流反应2.5h，溶液变为红褐色。冷却至室温，向反应液中滴加饱和连二亚硫酸钠水溶液至红褐色完全褪去。将反应液倒入150ml水中，析出大量固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得橙红色固体4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯0.61g，两步反应总产率20.7％。
称取4-氨基-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯147mg(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，4-异丙氧基苯甲酰氯100μL，冰浴下搅拌反应6h。将反应液将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比2:1)，得白色固体4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯150mg，产率76.9％。
称取4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-苯氧基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯131mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量119mg,产率为92.7％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.002(s,1H),9.851(s,1H),7.890(d,2H),7.577(t,1H),δ7.521(t,2H),7.422(t,2H),7.323(d,2H),7.299(d,2H),7.210(m,3H),7.202(d,2H),7.062(m,4H),6.921(d,2H),5.156(s,2H),4.692(m,1H),1.256(d,6H).TOF MS(EI+):C39H33N3O6,found 639.1.
实施例9 4-(4-异丙氧基苯甲酰氨基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物9)的制备
称取1.97g(6mmol)4-(4-苄氧基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，溶于30mL甲醇中，40℃搅拌下持续通入N2O3，反应1h。溶液变为淡红色，减压蒸馏除去溶剂，得粉红色液体粗产物，不进行进一步提纯直接进行下一步反应。
取上步所得的全部淡粉色液体产品，加入4-异丙基苯肼盐酸盐3.36g(18mmol)，溶于30mL甲醇中，氮气保护下回流反应2.5h，溶液变为红褐色。冷却至室温，向反应液中滴加饱和连二亚硫酸钠水溶液至红褐色完全褪去。将反应液倒入150ml水中，析出大量固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得橙黄色固体4-氨基-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯0.60g，两步反应总产率22.6％。
称取4-氨基-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯132mg(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，4-异丙氧基苯甲酰氯100μL，冰浴下搅拌反应6h。将反应液将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比2:1)，得淡黄色固体4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯156mg，产率86.2％。
称取4-(4-异丙氧基苯甲酰胺基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苄氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯121mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量107mg,产率为90.1％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.205(s,1H),7.603(m,2H),7.548(t,2H),7.312(d,2H),7.210(m,3H),7.202(d,2H),7.171(s,1H),7.051(t,2H),5.156(s,2H),4.692(m,1H),2.872(m,1H),1.256(d,6H),1.205(d,6H).TOF MS(EI+):C19H18N2O2,found 364.2.
实施例10 1,5-二(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸(化合物10)的制备
称取1.70g(0.01mol)4-溴苯胺，滴入50mL浓盐酸，在冰浴下搅拌10min。缓慢滴加2mol/L的亚硝酸钠水溶液7.5mL(0.15mol)。溶液变为红褐色，冰浴反应1h。在原反应容器中直接滴加1mol/L的氯化亚锡的浓盐酸溶液30mL，冰浴搅拌3h。析出大量白色固体，过滤，水洗，自然风干，不进行进一步提纯，得淡黄色粉末状4-溴苯肼盐酸盐1.96g，产率87.9％。
称取2.83g(0.024mol)草酸二甲酯，2.92g叔丁醇钾(0.026mol)溶于100mL分子筛除过水的四氢呋喃中，氮气保护下冰浴反应20min。再取产率3.98g(0.02mol)4-溴苯乙酮，溶于20mL四氢呋喃，冰浴下缓慢滴加入原反应容器中，冰浴下搅拌反应6h。析出大量黄色固体，抽滤，将所得固体用250mL水溶解，用1mol/L的盐酸调整pH＝2，析出淡黄色固体，抽滤，烘干。得淡黄色粉末状4-(4-溴苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯4.88g，产率85.6％。
称取143mg(0.5mmol)4-(4-溴苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，156mg(0.7mmol)4-溴苯肼盐酸盐加入25ml的圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，回流反应3h。溶剂蒸干，粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得白色固体1,5-二(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸甲酯109mg，产率50％。
称取109mg(0.25mmol)1-苯基-5-(4-乙氧基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯，54mg氢氧化钠加入25mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，反应回流2小时。冷却到室温，将反应溶液倒入100mL水中，用1mol/L盐酸调节pH＝2，析出白色固体，过滤，烘干，得白色粉末1,5-二(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸。
产品产量101mg,产率为95.7％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.205(s,1H),7.705(d,2H),7.548(d,2H),7.487(d,2H),7.471(d,2H),7.151(s,1H).TOF MS(EI+):C18H16Br2N2O3,found 422.1.
实施例11 4-(4-氯苯甲酰胺基)-1,5-二(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸(化合物11)的制备
称取1.71g(6mmol)4-(4-溴苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，溶于30mL甲醇中，40℃搅拌下持续通入N2O3，反应1h。溶液变为淡红色，减压蒸馏除去溶剂，得粉红色液体粗产物，不进行进一步提纯直接进行下一步反应。
取上步所得的全部淡粉色液体产品，加入4-溴苯肼盐酸盐4.02g(18mmol)，溶于30mL甲醇中，氮气保护下回流反应2.5h，溶液变为红褐色。冷却至室温，向反应液中滴加饱和连二亚硫酸钠水溶液至红褐色完全褪去。将反应液倒入150ml水中，析出大量固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得土黄色固体4-氨基-1,5-(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸甲酯0.54g，两步反应总产率19.9％。
称取4-氨基-1，5-(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸甲酯(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，4-氯苯甲酰氯100μL，冰浴下搅拌反应6h。将反应液将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯(2:1)，得白色固体4-(4-氯苯甲酰胺基)-1，5-(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸甲酯132mg，产率74.6％。
称取4-(4-氯苯甲酰胺基)-1，5-(4-溴苯基)吡唑-3-羧酸甲酯118mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量103mg,产率为89.6％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.205(s,1H),7.903(d,2H),7.705(d,2H),7.556(d,2H),7.548(d,2H),7.487(d,2H),7.471(d,2H),7.151(s,1H).TOF MS(EI+):C23H14Br2ClN3O3,found 572.9.
实施例12 4-(4-苯基苯甲酰氨基)-1-(4-苯琉基苯基)-5-(4-异丙基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物12)的制备
称取2.83g(0.024mol)草酸二甲酯，2.92g叔丁醇钾(0.026mol)溶于100mL分子筛除过水的四氢呋喃中，氮气保护下冰浴反应20min。再取4.57g(0.02mol)4-苯琉基苯乙酮，溶于20mL四氢呋喃，冰浴下缓慢滴加入原反应容器中，冰浴下搅拌反应6h。析出大量黄色固体，抽滤，将所得固体用250mL水溶解，用1mol/L的盐酸调整pH＝2，析出黄色固体，抽滤，烘干。得淡黄色粉末状4-(4-苯琉基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯5.37g，产率85.4％。
称取1.89g(6mmol)4-(4-苯琉基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，溶于30mL甲醇中，40℃搅拌下持续通入N2O3，反应1h。溶液变为淡红色，减压蒸馏除去溶剂，得粉红色液体粗产物，不进行进一步提纯直接进行下一步反应。
取上步所得的全部淡粉色液体产品，加入4-异丙基苯肼盐酸盐3.36g(18mmol),溶于30mL甲醇中，氮气保护下回流反应2.5h，溶液变为红褐色。冷却至室温，向反应液中滴加饱和连二亚硫酸钠水溶液至红褐色完全褪去。将反应液倒入150ml水中，析出大量固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得红色固体4-氨基-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苯琉基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯0.79g，两步反应总产率31.0％。
称取4-氨基-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苯琉基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯132mg(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，4-苯基苯甲酰氯100μL，冰浴下搅拌反应6h。将反应液将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比2:1)，得白色固体4-(4-苯基苯甲酰胺基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苯琉基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯155mg，产率82.8％。
称取4-(4-苯基苯甲酰胺基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-苯琉基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯125mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量113mg,产率为93.1％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.002(s,1H),9.851(s,1H),7.890(d,2H),7.577(t,1H),δ7.521(t,2H),7.422(t,2H),7.323(d,2H),7.299(d,2H),7.210(m,3H),7.202(d,2H),7.062(m,4H),6.921(d,2H),5.156(s,2H),4.692(m,1H),1.256(d,6H).TOF MS(EI+):C38H31N3O3S,found 609.1.
实施例13 4-(4-叔丁基苯甲酰氨基)-1-(4-甲基苯基)-5-(4-异丙基苯基)吡唑-3-羧酸(化合物13)的制备
称取2.83g(0.024mol)草酸二甲酯，2.92g叔丁醇钾(0.026mol)溶于100mL分子筛除过水的四氢呋喃中，氮气保护下冰浴反应20min。再取2.68g(0.02mol)4-甲基苯乙酮，溶于20mL四氢呋喃，冰浴下缓慢滴加入原反应容器中，冰浴下搅拌反应6h。析出大量黄色固体，抽滤，将所得固体用250mL水溶解，用1mol/L的盐酸调整pH＝2，析出淡黄色固体，抽滤，烘干。得淡黄色粉末状4-(4-甲基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯4.04g，产率91.8％。
称取1.32g(6mmol)4-(4-甲基苯基)-2,4-二氧代丁酸甲酯，溶于30mL甲醇中，40℃搅拌下持续通入N2O3，反应1h。溶液变为淡红色，减压蒸馏除去溶剂，得粉红色液体粗产物，不进行进一步提纯直接进行下一步反应。
取上步所得的全部淡粉色液体产品，加入4-异丙基苯肼盐酸盐3.36g(18mmol),溶于30mL甲醇中，氮气保护下回流反应2.5h，溶液变为红褐色。冷却至室温，向反应液中滴加饱和连二亚硫酸钠水溶液至红褐色完全褪去。将反应液倒入150ml水中，析出大量固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比4:1)，得土黄色固体4-氨基-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-甲基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯0.63g，两步反应总产率30.7％。
称取4-氨基-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-甲基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯105mg(0.3mmol)，溶于10mL干燥过的四氢呋喃，冰浴下先后分别滴加分子筛干燥的三乙胺209μL(1.5mmol)，4-叔丁基苯甲酰氯100μL，冰浴下搅拌反应6h。将反应液将反应液倒入100ml水中，析出白色固体，抽滤，烘干。粗产品用硅胶柱分离，流动相为石油醚:乙酸乙酯(按体积比2:1)，得白色固体4-(4-叔丁基苯甲酰胺基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-甲基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯133mg，产率86.9％。
称取4-(4-叔丁基苯甲酰胺基)-1-(4-异丙基苯基)-5-(4-甲基苯基)吡唑-3-羧酸甲酯102mg(0.2mmol)，氢氧化钠80mg(2.0mmol)，溶于10mL四氢呋喃与5mL水的混合溶剂，冰浴搅拌15h。将反应液倒入100mL中，用浓盐酸调节pH＝2，析出大量白色固体。抽滤，烘干。
产品产量92mg,产率为92.8％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.010(s,1H),7.890(d,2H),δ7.521(t,2H),7.422(t,2H),7.323(d,2H),7.299(d,2H),7.202(d,2H),6.921(d,2H),5.156(s,1H),2.869(m,1H),2.342(s,3H),1.331(s,9H),1.256(d,6H).TOF MS(EI+):C31H33N3O3,found 495.6.
实施例14 通过荧光偏振分析法检测化合物的BH3、p53TAD类似程度
合成一个带有21个氨基酸残基的Bid BH3肽段(氨基酸:QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在N端标记上6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(FAM)作为荧光标签(FAM-Bid)，再用相同方法合成带有16个氨基酸残基的p53TAD肽段(氨基酸:SQETFSDLWKLLPENNVC)，并在C端标记上6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(FAM)作为荧光标签(FAM-Bid)。Bcl-2家族蛋白竞争结合实验中所用的反应体系为GST-Bcl-2蛋白(140nM)或Mcl-1(55nm)蛋白，和FAM-Bid多肽(10nM)溶于反应缓冲液中(100mM K3PO4,pH 7.5；100μg/mL牛γ白蛋白；0.02％叠氮化钠)；p53/MDM2竞争结合实验中所用的反应体系为GST-MDM2蛋白(7200nM)，和FAM-p53多肽(20nM)溶于反应缓冲液中(100mM K3PO4,pH 7.5；100μg/mL牛γ白蛋白；0.02％叠氮化钠)。在96孔板中，每孔加入100μL反应体系，然后加入溶于DMSO的检测化合物7，化合物在体系中的终浓度分别为100μM、10μM、1μM、100nM、10nM，每个浓度设3个平行孔。同时设立两个对照组，一个对照组为反应体系中只含有Bcl-2和FAM-Bid或Mcl-1和FAM-Bid或MDM2和FAM-p53(相当于0％抑制率)，另一对照组中的反应体系只含有FAM-Bid或FAM-p53肽段。96孔板经过4个小时的避光孵育后，进行酶标仪上检测。荧光极化值(mP)在由530nm波长激发产生的485nm发射波长下测量。用蛋白抑制率对化合物剂量对数作图求出IC50值(如图1、图2)，根据公式Ki＝[I]50/([L]50/Kd+[P]0/Kd+1)推导计算得出化合物与蛋白的竞争结合常数Ki值，在公式中[I]50为蛋白抑制率为50％时的化合物浓度,[L]50为蛋白抑制率为50％时的游离FAM标记肽段的浓度，Kd为蛋白与FAM标记肽段复合物的解离常数，[P]0为蛋白抑制率为0％时的游离蛋白的浓度。
按照上述相同的试验方法检测其他化合物的BH3和p53TAD类似程度，它们与Bcl-2、Mcl-1和MDM2蛋白的结合常数在也多是nM级，以(-)-Gossypol和Nutlin-3为参照物。具体结果如表1所示。
表1.本发明化合物对Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白的竞争结合常数(Ki)
从表1中，我们可以发现随着R1，R2，R3三个取代基疏水性的增加，化合物对Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白的亲和力有不同程度的增加。其中较优化合物为6(R1＝乙氧基，R2＝苯氧基，R3＝4-异丙氧基苯甲酰氨基)对Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白的亲和力Ki分别为0.081μM，0.028μM和0.301μM；7(R1＝乙氧基,R2＝苯氧基，R3＝4-异丙氧基苯甲酰氨基)对Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白的亲和力Ki分别为0.161μM，0.140μM和0.107μM。
实施例15 利用MTT实验检测化合物7对多个细胞系的细胞毒性
将要检测的细胞(K562，U937，NCI-H1688，SMMC-7721，MCF-7，Hela和Hek293)用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μL；将培养板移入CO2孵箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度下培育24小时后，加入化合物7浓度从100μM到1μM(对照组选择加入相同体积的DMSO)，继续培养72小时；每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，孵育4小时后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。然后，每孔加入150μL的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解；选择550nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。计算细胞存活率：试验组光吸收值/对照组光吸收值×100％，用细胞存活率对化合物剂量对数作图求出IC50值(细胞数量减少一半时所需化合物浓度)。
使用MTT方法检测化合物7在细胞培养液中，对癌细胞K562，U937，NCI-H1688，SMMC-7721，MCF-7，Hela和正常细胞Hek293的杀伤能力。如表2所示，化合物7能够对检测6种细胞系都保持较高的(1-10μM)杀伤能力，而对正常细胞Hek293没有毒性。MTT实验在细胞水平上进一步证明，化合物7可以靶向Bcl-2家族抗凋亡蛋白行使其抗癌功能。
表2.化合物7对多个细胞系的细胞毒性(IC50)
细胞系 IC50[μM] 细胞系 IC50[μM]
K562 3.25±0.33 SMMC-7721 6.85±0.18
U937 4.06±0.15 Hela 5.24±0.29
MCF-7 6.12±0.26 HEK293 50.33±2.17
NCI-H1688 4.37±0.08
其它化合物也具有与化合物7相似的作用，尤其化合物2、4和6等均对不同肿瘤细胞系表现出较高的杀伤能力，可以靶向Bcl-2家族抗凋亡蛋白行使其抗癌功能。
实施例16：使用Autodock软件模拟计算化合物7与Mcl-1、MDM2蛋白的结合模式
Mcl-1(hMcl-1；PDB ID:2NLA)、MDM2(hDM2；PDB ID:3V3B)蛋白结构由蛋白质数据库RCSB中获得，化合物7的三维结构利用Chembio3D Ultra 11.0进行能量优化获得最优构象。使用AutoDockTools软件对蛋白文件和小分子配体进行预处理，并使用AutoDock 4.0软件的Lamarckian Genetic Algorithm(GA)算法进行分子对接计算，AutoDock对接结果用ADT软件显示。
模拟对接结果(图3、图4)显示，化合物7可以很好的模拟Bim螺旋的D67与Mcl-1蛋白的R263和N260形成氢键，模拟Bim螺旋的L62占据Mcl-1的P2口袋，模拟Bim螺旋的I65占据Mcl-1的P3口袋，模拟Bim螺旋的F69占据Mcl-1的P4口袋；同时，化合物7可以很好的模拟p53TAD螺旋上的F19，W23，I26三个重要疏水氨基酸残基，占据MDM2的三个疏水口袋。综上所述，化合物7是α-螺旋的模拟物，可以很好的占据Mcl-1蛋白的BH3沟槽和MDM2的p53TAD结合区，实现同时抑制Mcl-1、MDM2蛋白的功能。
实施例17 1H-15N HSQC实验确定化合物7与Mcl-1的结合位置
首先扫描未加小分子的Mcl-1蛋白的1H-15N HSQC图谱，检测蛋白质所有氨基酸的共振峰和谱峰分布情况，温度25或者35度，根据蛋白浓度不同扫描不同时间，记录数据，对靶蛋白分子的主链酰胺的1H 15N信号进行化学位移归属，且结合已知蛋白质的三维空间结构来分析，接着，按1:1的浓度配比，滴定小分子抑制剂化合物7与15N标记的Mcl-1蛋白中，利用上述条件，再次扫描记录一系列的1H-15N HSQC谱，检测每个HSQC谱图中谱峰化学位移的变化。用NMRViewJ软件分析HSQC图谱，将前后两次扫描图谱叠加，分析Mcl-1蛋白氨基酸位移情况。随着配体小分子(化合物7)的滴定，谱峰发生化学位移的变化。蛋白质主链酰胺1H-15N化学位移变化较大的谱峰，表示这些氨基酸残基参与了相互作用。通过对化学位移较为明显的峰进行统计分析，然后标定在已知三维结构的蛋白上，就可以明确的分析出小分子具体的结合位置和结合特点(图5)。
如附图5所示，随着化合物7的加入，22个氨基酸残基发生了明显的位移(位移大于0.05ppm)，并且80％发生较大位移的氨基酸残基位于Mcl-1蛋白的BH3沟槽中。R263和其周围的氨基酸残基(V253、D256、G257和N260)、组成P2口袋的氨基酸残基(F228、F270、L235、V249、V253和T266)、组成P3口袋的氨基酸残基(F228、H224、T266和V220)和P4口袋的氨基酸残基(H224、N223、V220、G219和V216)发生了明显的化学位移，说明化合物7可以与Mcl-1蛋白的这些区域进行相互作用。综上所述，蛋白质的二维核磁结果从分子水平上说明化合物7可以很好的模拟Bim螺旋的D67、L62、I65和F69(图6)占据Mcl-1蛋白的R263、P2口袋、P3口袋和P4口袋。

Claims (8)

1.一类1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物，具有如下结构通式Ⅰ：
其中：
R1选自-X1-R4；
R2选自-X2-R5；
R3选自-NH2或-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6；
R6选自-H、卤素、C1～C6的饱和烷基或-O-R7；
X1和X2分别独立选自O或S；
R4选自-H、C1～C6的饱和烷基；
R5和R7分别独立选自-H、C1～C6的饱和烷基、苄基或C1～C6的饱和烷基取代的苯基。
2.根据权利要求1所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物，其特征在于R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6。
3.根据权利要求1所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物，其特征在于C1～C6的饱和烷基选自甲基、乙基、异丙基、仲丁基或异丁基。
4.权利要求1～3的任一项所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物在制备α-螺旋模拟物制剂中的应用。
5.权利要求1～3的任一项所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。
6.权利要求1～3的任一项所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物在制备MDM2家族蛋白抑制剂中的应用。
7.权利要求1～3的任一项所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物在制备Bcl-2、MDM2家族蛋白双抑制剂中的应用。
8.权利要求1～3的任一项所述的1,5-二苯基吡唑-3-羧酸类化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将4-R1-苯乙酮与乙二酸二甲酯按投料摩尔比1:1.2-1.5，在碱性试剂存在下，冰浴中反应5-8h，制备得2,4-二氧代-4-(4-R1-苯基)-丁酸甲酯，其中反应溶剂为四氢呋喃，碱性试剂为叔丁醇钾；
(2)将4-R2-苯胺与NaNO2按摩尔投料比1:1:2-1.5，冰浴下反应0.5小时，并直接加入还原剂反应4-6h，得4-R2-苯肼盐酸盐；其中反应溶剂为浓盐酸，还原剂为SnCl2；
(3)2,4-二氧代-4-(4-R1-苯基)-丁酸甲酯先由N2O3取代，再在原反应容器中直接加入4-R2-苯肼盐酸盐，经环化、还原反应得到R3为NH2的化合物Ⅱ，其中2,4-二氧代-4-(4-R1-苯基)-丁酸甲酯与4-R2-苯肼盐酸盐的摩尔投料比为1:3，溶剂为甲醇，还原剂为连二亚硫酸钠，环化反应温度60-65℃，取代、还原反应温度为室温；
(4)将R3为NH2的化合物Ⅱ与Cl-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6按摩尔投料比1:1.2-1.5，在缚酸剂存在下，冰浴反应3-6h；得R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6的化合物Ⅱ，其中反应溶剂为四氢呋喃，缚酸剂为三乙胺；
(5)R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6的化合物Ⅱ和NaOH按摩尔投料比1:10-1:20，在冰浴下反应10-20h，得R3为-NH-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R6的化合物I，反应溶剂为质量比为1:1-2:1的四氢呋喃和水的混合溶剂；
(6)R3为NH2的化合物Ⅱ和NaOH按摩尔投料比1:10-1:20，在0℃下反应10-20h，得R3为NH2的化合物I，反应溶剂为质量比为1:1-2:1的四氢呋喃和水的混合溶剂。
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