JP5863926B2

JP5863926B2 - ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート

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Publication number: JP5863926B2
Application number: JP2014215935A
Authority: JP
Inventors: シャーロットマクドナフ; マイケルフェルドハウス; アレクサンドラフハロフ
Original assignee: メリマックファーマシューティカルズインコーポレーティッド
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2029-04-10
Also published as: CA2721093A1; EP2288715A2; BRPI0911652A2; EP2288715A4; ES2525065T3; IL208598A0; IL208598A; JP2015057401A; EP2860260A1; AU2009234253C1; JP2011518137A; NZ589086A; ZA201008048B; CN102057054A; CN102057054B; KR20110008086A; WO2009126920A3; AU2009234253A1; PL2288715T3; MX2010011145A

Description

発明の分野
本発明は、ヒト血清アルブミン（HSA）リンカー、ならびにその結合、診断および治療のコンジュゲートを提供する。一態様では、HSAリンカーは、2つのアミノ酸置換を包含する。本発明はさらに、診断および治療のHSAリンカーコンジュゲートの製造および投与のための方法を提供する。

発明の背景
血清アルブミンは、ビタミンD結合タンパク質としても公知のα-フェトプロテインおよびヒト群に特異的な成分を含むタンパク質ファミリーに属する。この血清アルブミンは循環系の主な可溶性タンパク質であって、多くの生命生理学的プロセスに寄与する。血清アルブミンは一般には、乾燥重量あたり総血液成分の約50％を含む。このアルブミンおよびそれらの関連の血液タンパク質はまた、種々の化学的に多様な分子、例えば、脂肪酸、アミノ酸、ステロイド、カルシウム、金属、例えば、銅および亜鉛、ならびに種々の薬剤を含む、ヒトの身体における多くの内因性および外因性のリガンドの輸送、分布および代謝において重要な役割を果たす。アルブミンファミリーの分子は一般には、肝臓、腸、腎臓および脳などの器官循環の境界にまたがるこれらの多くのリガンドの輸送を促進すると考えられている。従って、アルブミンは広範な循環機能および代謝機能に関与する。

ヒト血清アルブミン（HSA）は、約66,500kDのタンパク質であって、少なくとも17個のジスルフィド架橋を含む585個のアミノ酸から構成される。アルブミンファミリーの多くのメンバーと同様に、ヒト血清アルブミンはヒトの生理学に重要な役割を果たし、かつ実質的にあらゆるヒトの組織および身体分泌物に位置する。上記で示すとおり、HSAは循環系全体にわたって広範なスペクトルのリガンドを結合して輸送する能力を有しており、このリガンドとしては長鎖脂肪酸（そうでなければ循環する血漿中で不溶である）が挙げられる。

発明の概要
第一の局面では、本発明は、配列番号6〜10のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有しているヒト血清アルブミン（HSA）リンカー、ならびに抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、レセプター（例えば、細胞表面レセプター）、リガンド、アプタマー、およびその生物学的に活性なフラグメントから選択される第一の結合部分および第二の結合部分であって、ここでこの第一の結合部分は、このHSAリンカーのアミノ末端に結合され、この第二の結合部分は、このHSAリンカーのカルボキシ末端に結合される、結合部分を含む剤を特徴とする。一態様では、この第一の結合部分は具体的には、ErbB3に結合し、かつこの第二の結合部分は具体的には、ErbB2に結合する。他の態様では、HSAリンカーは配列番号9または10に示されるアミノ酸配列を有する。

第二の局面では、本発明は、配列番号11〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を有するHSAリンカー、ならびに抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、レセプター（例えば、細胞表面レセプター）、リガンド、アプタマー、およびその生物学的に活性なフラグメントから選択され得る少なくとも第一の結合部分および第二の結合部分であって、ここでこの第一の結合部分は、この配列のアミノ末端に結合され、この第二の結合部分は、この配列のカルボキシ末端に結合される、結合部分を含む剤を特徴とする。ある態様では、3つ以上の結合部分（例えば、4、5、6、7、8、9、10以上）がこの剤に含まれてもよい;これらの追加の結合部分は、この剤に、例えば、縦一列に（例えば、2、3、4もしくは5以上の縦一列に）第一または第二の結合部分と組み合わせて追加されてもよい。一態様では、この第一の結合部分は具体的には、ErbB3に結合し、かつこの第二の結合部分は具体的には、ErbB2に結合する。他の態様では、このHSAリンカーは配列番号14または15に示されるアミノ酸配列を有する。

第三の局面では本発明は、配列番号1に示される配列に対して少なくとも90％の同一性を有しているアミノ酸配列を、ならびに配列番号1に示されるアミノ酸配列の34位置にセリン残基を、および503位置にグルタミン残基を有するHSAリンカーを提供する。一態様では、このアミノ酸配列は配列番号1に示される配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する。別の態様では、このHSAリンカーは配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。

第四の局面では、本発明は、配列番号1に示される配列に対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するHSAリンカーおよび少なくとも第一の結合部分を含む剤を特徴とする。一態様では、この剤は、第一の結合部分をHSAリンカーに対して結合する第一のポリペプチドコネクターを含む。

第五の局面では、本発明は、配列番号11〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列、またはこれらの配列のいずれか一つのフラグメントもしくは変異体を有しているHSAリンカー、および少なくとも第一の結合部分を含む剤を特徴とする。

本発明の第四または第五のいずれかの局面では、この剤は、第一の結合部分をHSAリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端に対して結合する第一のポリペプチドコネクター（例えば、AAS、AAQまたはAAAL）をさらに含む。ある態様では、この第一のコネクターは、第一の結合部分をHSAリンカーに対して共有結合させる。

本発明の第四または第五のいずれかの局面では、この剤はさらに少なくとも第二の結合部分を含む。ある態様では、この剤は第二の結合部分をHSAリンカーに結合させる第二のポリペプチドコネクター（例えば、AAS、AAQまたはAAAL）をさらに含む。他の態様では、この第二のコネクターは第二の結合部分をHSAリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端に結合させる。さらなる態様ではこの第二のコネクターは、第二の結合部分をHSAリンカーに対して共有結合させる。他の態様では、この剤はさらに、この第一または第二の結合部分と縦一列に含まれる3つ以上の結合部分を含み;この3つ以上の結合部分は、3つ以上の結合部分を第一または第二の結合部分に対して、およびお互いに対して結合させるコネクター配列をさらに含み得る。

本発明の第四または第五の局面のいずれかでは、この剤は、第一の結合部分をHSAリンカーのアミノ末端に対して共有結合させる第一のポリペプチドコネクターと第二の結合部分をHSAリンカーのカルボキシ末端に対して共有結合させる第二のポリペプチドコネクターとを含む。一態様では、この第一のコネクターはアミノ酸配列AASまたはAAQを有し、かつこの第二のコネクターは配列番号5に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明の第四または第五のいずれかの局面では、この第一の結合部分または第二の結合部分（または第三以降の結合部分）が、抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、レセプター（例えば、細胞表面レセプター）、リガンド、アプタマー、またはその生物学的に活性なフラグメントである。他の態様では、本発明の剤はこれらの異なるタイプの結合部分の組み合わせを包含する。一態様では、少なくとも第一または第二の結合部分はヒトまたはヒト化単鎖Fv分子である。

本発明の第一、第二、第三、第四または第五の局面のいずれか一つの態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数が、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met:肝細胞成長因子レセプター（HGFR）としても公知）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、インテグリン（例えば、α4インテグリンまたはβ-1インテグリン）、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAMl）、CD166（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるタンパク質であるかまたはそれらのタンパク質に特異的に結合する。さらなる態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数が赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ErbB）レセプター（例えば、ErbB1レセプター;ErbB2レセプター;ErbB3レセプター;およびErbB4レセプター）であるか、またはそれらのレセプターに特異的に結合する。別の態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数は、α-フェトプロテイン（AFP）もしくはインターフェロン、またはその生物学的に活性なフラグメントであるか、あるいはそれらに特異的に結合する。さらなる態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数は、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、またはアナキンラである。

本発明の第一、第二、第三、第四または第五の局面のうちのいずれか一つでは、この剤は診断剤、治療剤またはその両方に結合される。一態様では、この診断剤は検出可能標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、または重金属標識である。別の態様では、この治療剤は細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または免疫調節剤である。この細胞毒性剤としてはアルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、チューブリンインヒビター、トポイソメラーゼIもしくはIIのインヒビター、ホルモンのアゴニストもしくはアンタゴニスト、免疫調節剤、DNAマイナー・グルーブ・バインダー、および放射性剤、または腫瘍細胞に結合して殺傷するか、もしくは腫瘍細胞増殖を阻害し得る任意の剤が挙げられる。抗腫瘍剤としてはシクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体が挙げられる。

本発明の第一、第二、第三、第四または第五の局面のうちのいずれか一つでは、この剤は薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と混合される。一態様では、この剤は6時間〜7日間というインビボ半減期を呈する。別の態様では、この剤は、8時間より長いインビボ半減期を呈する。

第六の局面では、本発明は、最初の5つの局面で記載されたHSA剤のいずれか一つを投与することによって疾患または障害を有している哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。一態様では、この疾患または障害は、細胞表面レセプターを通じた細胞シグナル伝達に関連する。別の態様では、この哺乳動物はヒトである。さらなる態様では、この疾患または障害は増殖性疾患または自己免疫疾患である。増殖性疾患としては黒色腫、明細胞癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌および脳腫瘍が挙げられる。自己免疫疾患としては、多発性硬化症、乾癬、重症筋無力症、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチが挙げられる。一態様では、HSA剤は、一つまたは複数の治療剤、例えば、抗腫瘍剤と組み合わせて投与される。

第七の局面では、本発明は、配列番号1、3または6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列、または配列番号1、3もしくは6〜15のいずれか一つに示される配列に対して少なくとも90％、95％、97％もしくは100％の配列同一性を有する配列のアミノ末端に対して少なくとも第一の結合部分、およびカルボキシ末端に対して第二の結合部分を結合することによってHSAリンカー剤を作製するための方法を特徴とする。一態様では、この第一または第二の結合部分はHSAリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端に共有結合される。他の態様では、第三または追加の結合部分（例えば、第四、第五、第六、第七、第八、第九、または第十の結合部分）はHSAリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端に対して第一の結合部分または第二の結合部分と縦一列に共有結合される。別の態様では、この第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在する場合は、この第三以降の結合部分）の一つまたは複数が、抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、レセプター（例えば、細胞表面レセプター）、リガンド、またはアプタマーである。別の態様では、この第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在する場合は、この第三以降の結合部分）はヒトまたはヒト化単鎖Fv分子である。さらに別の態様では、この第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在する場合は、この第三以降の結合部分）の一つまたは複数は、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met:肝細胞成長因子レセプター（HGFR）としても公知）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、インテグリン（例えば、α4インテグリンまたはβ-1インテグリン）、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAM1）、CD166（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン、（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびそれらのフラグメントであるか、またはそれらに特異的に結合する。さらなる態様では、この第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在する場合は、この第三以降の結合部分）の一つまたは複数は赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ErbB）レセプター（例えば、ErbBlレセプター;ErbB2レセプター;ErbB3レセプター;およびErbB4レセプター）であるか、またはそれらのレセプターに特異的に結合する。別の態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数は、α-フェトプロテイン（AFP）もしくはインターフェロン、またはその生物学的に活性なフラグメントであるか、あるいはそれらに特異的に結合する。さらなる態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数は、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、またはアナキンラである。別の態様では、この剤は、診断剤、治療剤またはその両方に結合される。一態様では、この診断剤は検出可能標識、例えば、放射性標識、生物発光標識、蛍光標識、重金属標識、またはエピトープタグである。別の態様では、この治療剤は細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または免疫調節剤である。細胞毒性剤としてはアルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、チューブリンインヒビター、トポイソメラーゼIもしくはIIのインヒビター、ホルモンのアゴニストもしくはアンタゴニスト、免疫調節剤、DNAマイナー・グルーブ・バインダー、および放射性剤、または腫瘍細胞に結合して殺傷するか、もしくは腫瘍細胞増殖を阻害し得る任意の剤が挙げられる。抗腫瘍剤としてはシクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体が挙げられる。さらなる態様では、この剤は薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と混合される。

第八の局面では、本発明は、配列番号1、3または6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列中の一つまたは複数の表面露出アミノ酸残基を、診断剤または治療剤のコンジュゲーションを可能にする化学修飾できる置換アミノ酸で置換することによってHSA剤を作製するための方法を特徴とする。一態様では、この置換アミノ酸は、システインであり、表面露出アミノ酸残基はセリンまたはトレオニンである。別の態様では、この化学修飾によって、置換アミノ酸と診断剤または治療剤との間の共有結合が生じる。さらなる態様では、この表面露出アミノ酸残基は、496位置のトレオニン、58位置のセリン、76位置のトレオニン、79位置のトレオニン、83位置のトレオニン、125位置のトレオニン、236位置のトレオニン、270位置のセリン、273位置のセリン、304位置のセリン、435位置のセリン、478位置のトレオニン、506位置のトレオニン、または508位置のトレオニンである。

第九の局面では、本発明は、配列番号1、3および6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列における残基のうち一つまたは複数をアスパラギン、セリンまたはトレオニンで置換して、これによってHSA剤内にグリコシル化部位を組み込むことによってHSA剤を作製するための方法を特徴とする。

第十の局面では、本発明は配列番号1、3および6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列におけるアスパラギン、セリンまたはトレオニン残基のうちの一つまたは複数をアスパラギン、セリンまたはトレオニン以外の任意のアミノ酸で置換しこれによって、このHSA剤からグリコシル化部位を取り除くことよって、HSA剤を作製するための方法を特徴とする。

第十一の局面では、本発明は、配列番号16〜25に示されるアミノ酸配列の一つに対して少なくとも90％の配列同一性を有する剤を特徴とする。一態様では、この剤は配列番号16〜25に示されるアミノ酸配列のうちの一つに対して少なくとも95％の配列同一性を有する。別の態様では、この剤は、配列番号16〜25に示されるアミノ酸配列のうち一つを有する。さらなる態様では、この剤は、診断剤または治療剤に対して結合される。診断剤としては、検出可能標識、例えば、放射性標識、生物発光標識、蛍光標識、または重金属の標識またはエピトープタグが挙げられる。検出可能標識として機能し得る蛍光分子としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）、増強GFP（eGFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）およびdsRedが挙げられる。一態様では、この生物発光分子はルシフェラーゼである。別の態様では、このエピトープタグはc-myc、赤血球凝集素、またはヒスチジンタグである。さらなる態様では、この治療剤はシトクロムc、カスパーゼ1〜10、グランザイムAまたはB、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、TNF-β、Fas、Fasリガンド、Fas関連死ドメイン様IL-lβ変換酵素（FLICE）、TRAIL/APO2L、TWEAK/APO3L、Bax、Bid、Bik、Bad、Bak、RICK、血管アポトーシス誘発性タンパク質1および2（VAPlおよびVAP2）、ピエリシン、アポトーシス誘発性タンパク質（AIP）、IL-1αプロピース（propiece）ポリペプチド、アポプチン、アポプチン関連タンパク質1（AAP-1）、エンドスタチン、アンギオスタチン、およびその生物学的に活性なフラグメントなどの細胞毒性ポリペプチドである。本発明の剤は、一つまたは複数の治療剤、例えば、シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体と組み合わされてもよい。

本発明の任意の局面のある態様では、上記第一の結合部分および第二の結合部分（および、存在する場合は、第三以降の結合部分のうちの一つまたは複数）が同じ標的分子に特異的に結合する。本発明の任意の局面の別の態様では、この第一の結合部分および第二の結合部分（および、存在する場合は、第三以降の結合部分のうちの一つまたは複数）が異なる標的分子に特異的に結合する。本発明の任意の局面のさらなる態様では、この第一の結合部分および第二の結合部分（および、存在する場合は、第三以降の結合部分のうちの一つまたは複数）が同じ標的分子上の異なるエピトープに特異的に結合する。

第十二の局面では、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸残基25〜44および494〜513を有するポリペプチドリンカーを特徴とする。一態様では、このポリペプチドリンカーは、配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基25〜70および450〜513を有する。別の態様では、このポリペプチドリンカーは、配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基15〜100および400〜520を有する。さらなる態様では、このポリペプチドリンカーは配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基10〜200および300〜575を有する。別の態様では、このポリペプチドリンカーは、配列番号1に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基5〜250および275〜580を有する。

本発明の第十二の局面では、上記ポリペプチドリンカーは、少なくとも第一の結合部分を含む。一態様では、このポリペプチドリンカーは、このポリペプチドリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端に対して第一の結合部分を結合させる第一のポリペプチドコネクターを少なくとも含む。別の態様では、この第一のポリペプチドコネクターは、この第一の結合部分をポリペプチドリンカーに共有結合させる。さらなる態様では、このポリペプチドリンカーは、第二の結合部分を含む。一態様では、このポリペプチドリンカーは、この第二の結合部分をポリペプチドリンカーに結合させる第二のポリペプチドコネクターを含む。他の態様では、この第二のコネクターは、この第二の結合部分をポリペプチドリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端に結合させる。さらなる態様では、この第二のコネクターは、この第二の結合部分をポリペプチドリンカーに共有結合させる。他の態様では、このポリペプチドリンカーは、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、または第十の結合部分を含む。他の態様では、これらの追加の結合部分は、第一または第二の結合部分のうちの一つまたは両方と縦一列に存在する。さらに他の態様では、ポリペプチドコネクター（例えば、AAS、AAQまたはAAAL）は、これらの追加の結合部分のうちの一つまたは複数をお互いから、第一のもしくは第二の結合部分から、またはポリペプチドリンカーから隔てる。

本発明の第十二の局面では、このポリペプチドリンカーは、このポリペプチドリンカーのアミノ末端に対して第一の結合部分を共有結合させる第一のポリペプチドコネクターとこのポリペプチドリンカーのカルボキシ末端に対して第二の結合部分を共有結合させる第二のポリペプチドコネクターとを含む。一態様では、この第一のコネクターはアミノ酸配列AASまたはAAQを有し、かつこの第二のコネクターは配列番号5に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明の第十二の局面では、この第一の結合部分および第二の結合部分（または、存在する場合は、第三以降の結合部分）の一つまたは複数は、抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、レセプター（例えば、細胞表面レセプター）、リガンド、アプタマー、またはその生物学的に活性なフラグメントである。一態様では、この第一の結合部分および第二の結合部分（または、存在する場合は、第三以降の結合部分）のうちの一つまたは複数が、ヒトまたはヒト化単鎖Fv分子である。

本発明の第十二の局面では、この第一の結合部分および第二の結合部分（または、存在する場合は、第三以降の結合部分）のうちの一つまたは複数が、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met;肝細胞成長因子レセプター（HGFR）としても公知）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、インテグリン（例えば、α4インテグリンまたはβ-1インテグリン）、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAMl）、CDl66（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるタンパク質であるかまたはそれらのタンパク質に特異的に結合する。さらなる態様では、この第一または第二の結合部分は、赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ErbB）レセプター（例えば、ErbB1レセプター;ErbB2レセプター;ErbB3レセプター;およびErbB4レセプター）であるか、またはそれらのレセプターに特異的に結合する。別の態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数は、α-フェトプロテイン（AFP）もしくはインターフェロン、またはその生物学的に活性なフラグメントであるか、あるいはそれらに特異的に結合する。さらなる態様では、上記第一の結合部分または第二の結合部分（または、存在するならば第三以降のさらなる結合部分）の一つまたは複数は、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、またはアナキンラである。

本発明の第十二の局面では、このポリペプチドリンカーは、診断剤、治療剤またはその両方に結合される。一態様では、この診断剤は検出可能標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、または重金属標識である。別の態様では、この治療剤は細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または免疫調節剤である。この細胞毒性剤としてはアルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、チューブリンインヒビター、トポイソメラーゼIもしくはIIのインヒビター、ホルモンのアゴニストもしくはアンタゴニスト、免疫調節剤、DNAマイナー・グルーブ・バインダー、および放射性剤、または腫瘍細胞に結合して殺傷するか、もしくは腫瘍細胞増殖を阻害し得る任意の剤が挙げられる。抗腫瘍剤としてはシクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カルカキマイシン（calcachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体が挙げられる。一態様では、このポリペプチドリンカーは薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と混合される。別の態様では、このポリペプチドリンカーは、6時間〜7日間というインビボ半減期を呈する。さらなる態様では、このポリペプチドリンカーは8時間を超えるインビボ半減期を呈する。

本発明の第十三の局面は、本発明の任意の以前の局面（一〜十二）の剤であって、HSAポリペプチドリンカー配列が別のポリペプチドリンカー配列で置き換えられている剤を特徴とする。例えば、ポリペプチドリンカー配列は、哺乳動物、非ヒト血清アルブミンポリペプチド配列、例えば、ウシ、マウス、ネコおよびイヌの血清アルブミン（BSA）ポリペプチド配列などであってもよい。他の態様では、このポリペプチドリンカー配列は、5〜1,000アミノ酸長、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、もしくは900アミノ酸長、またはこの範囲内の任意の数のアミノ酸である。他の態様では、このポリペプチドリンカー配列は、単一のアミノ酸（例としては、限定するものではないが、例えば、グリシン、アラニン、セリン、グルタミン、ロイシン、およびバリン）を含んでも、またはアミノ酸の組み合わせを含んでもよい。

別の態様では、HSAポリペプチドリンカー配列は、α-フェトプロテインポリペプチド（AFP）のポリペプチド配列、例えば、哺乳動物AFPポリペプチド配列、例えば、ヒト、マウス、ウシまたはイヌのAFPポリペプチド配列によって置き換えられる。ある態様では、上記の剤のAFPリンカー配列は、全長ヒトAFPポリペプチド配列（アミノ酸1〜609;配列番号58）、シグナル配列のアミノ酸1〜18を欠いている成熟ヒトAFPポリペプチド配列（アミノ酸、配列番号58の19〜609）、またはそれらのフラグメントに相当し得る。他の態様では、このAFPポリペプチドリンカー配列は、配列番号58の少なくとも5〜8個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも10、20、または50連続のアミノ酸、より好ましくは少なくとも100連続のアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも200、300、400もしくはそれ以上連続のアミノ酸を含むか、あるいはこれらの長さのうちの一つまたは複数を有している配列番号58の連続のポリペプチド配列に対して少なくとも90％配列同一性（例えば、少なくとも95％、97％、99％、またはそれ以上の配列同一性）を有する。例えば、配列番号58のアミノ酸446〜479に対応する34-マーのヒトAFPペプチドに対して90％の配列同一性を有するAFPポリペプチドリンカー配列

は配列番号58の446〜479セグメントから比べて最大3個のアミノ酸変化を含んでもよい。生物学的に活性なヒトAFPフラグメントにおける配列偏差のこのような例の一つは、例えば、2つのアミノ酸残基で可塑性を有する（配列番号59のアミノ酸9および22）ヒトAFPの34個のアミノ酸フラグメント（配列番号59）を開示する米国特許第5,707,963号（参照により本明細書に組み入れられる）に見出される。AFPポリペプチドリンカー配列の他の例としては、例えば、配列番号58のアミノ酸19〜198（ヒトAFPドメインI）、配列番号58のアミノ酸217〜408（ヒトAFPドメインII）、配列番号58のアミノ酸409〜609（ヒトAFPドメインIII）、配列番号58のアミノ酸19〜408（ヒトAFPドメインI＋II）、配列番号58のアミノ酸217〜609（ヒトAFPドメインII＋III）、および配列番号58のアミノ酸285〜609（ヒトAFPフラグメントI）が挙げられる。別の態様では、このヒトAFPポリペプチドリンカー配列は配列番号58のアミノ酸489〜496を含む8アミノ酸の配列（すなわち、EMTPVNPG）である。

本発明の第十四の局面は、任意のHSAリンカー、HSAリンカー剤、または本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第十一、第十二および第十三の局面に記載される任意の他の剤を包含するキットを特徴とする。このキットはさらに、施術者（例えば、医師、看護士、または患者）がそこに含まれる組成物および剤を投与することを可能にする説明書を備える。一態様では、このキットは、例えば、一つまたは複数の結合部分（例えば、抗体または抗体フラグメント（例えば、scFv））、診断剤（例えば、放射性核種またはキレート剤）、および/または治療剤（例えば、細胞毒性剤または免疫調節剤）を含む本発明の剤（例えば、本発明のHSAリンカー）の有効量を含む単一または複数用量の薬学的組成物の複数のパッケージを備える。任意で、薬学的組成物（単数または複数）を投与するために必要な説明書またはデバイスがキットに含まれてもよい。例えば、本発明のキットは、本発明のHSAリンカー、またはそこにコンジュゲートされた任意の結合剤、診断剤および/もしくは治療剤の有効量を含む一つまたは複数の充填済み注射器を提供し得る。さらにこのキットはまた、例えば、本発明のHSAリンカーまたはそこにコンジュゲートされた任意の結合剤、診断剤および/もしくは治療剤を含む薬学的組成物（単数または複数）を用いるための疾患または病状（例えば、癌、自己免疫疾患または心血管系疾患）に罹患している患者のための説明または投与スケジュールなどの追加の構成要素を備えてもよい。

定義
「抗体」という用語は、本明細書において互換的に用いる場合、全抗体または免疫グロブリンおよび任意の抗原結合フラグメントまたはその単鎖を包含する。抗体とは本明細書において用いる場合、哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）、ヒト化、キメラ、組み換え、合成で作製されても、または天然に単離されてもよい。ヒトを含めてほとんどの哺乳動物では、抗体は、ジスルフィド結合によって接続された少なくとも2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖を有する。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてV_Hと省略される）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、3つのドメインであるC_H1、C_H2およびC_H3、ならびにC_H1とC_H2との間のヒンジ領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてV_Lと省略される）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、一つのドメインであるCLからなる。V_HおよびV_L領域は、さらに、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、より保存された領域が散在した、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域に細分することができる。各々のV_HおよびV_Lは、3つのCDRと4つのFRから構成され、それらは、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で、アミノ末端からカルボキシ末端に整列されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）、および古典的な補体系の第1成分（Clq）などの宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。本発明の抗体としては、抗体様特性を有する全ての公知の抗体型および他のタンパク質骨格が挙げられる。例えば、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、または抗体様特性を有するタンパク質骨格、例えば、フィブロネクチンまたはアンキリンリピートであってもよい。この抗体はまた、Fab、Fab'2、scFv、SMIP、ダイアボディ、ナノボディ、アプタマー、またはドメイン抗体であってもよい。この抗体は、任意の以下のアイソタイプを有してもよい:IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4）、IgM、IgA（例えば、IgA1、IgA2、およびIgAsec）、IgD、またはIgE。本発明のHSAリンカーと組み合わせて、本明細書において規定されるような、結合部分として用いられ得る抗体としては、限定するものではないが、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、およびパニツムマブが挙げられる。

「抗体フラグメント」という用語は、本明細書において用いる場合、抗原（例えば、ErbB2）に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって行われ得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合フラグメントの例としては限定するものではないが以下が挙げられる:（i）Fabフラグメント、V_L、V_H、CLおよびC_H1ドメインからなる単価フラグメント;（ii）F（ab'）₂、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント;（iii）V_HおよびC_H1ドメインからなるFdフラグメント;（iv）抗体の単独のアームのV_LおよびV_HドメインからなるFvフラグメント;（v）V_HおよびV_Lドメインを含むdAb;（vi）V_HドメインからなるdAbフラグメント（Wardら、Nature 341:544〜546（1989）;（vii）V_HまたはV_LドメインからなるdAb;（viii）単離された相補性決定領域（CDR）;ならびに（ix）任意で合成リンカーによって接続され得る2つ以上の単離されたCDRの組み合わせ。さらに、Fvフラグメントの2つのドメインであるV_LおよびV_Hは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、V_LおよびV_H領域が対となって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Fv（scFv）として公知;例えば、Birdら、Science 242:423〜426（1988）;ならびに、Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883(1988)を参照のこと）としてそれらを作製することができる合成リンカーによって接続されてもよい。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、そのフラグメントは、インタクトな抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングされる。抗体フラグメントは、組み換えDNA技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素切断もしくは化学切断によって作製されてもよい。

「自己免疫疾患」とは、自己のエピトープまたは抗原に対して免疫系応答が生成される疾患を意味する。自己免疫疾患の例としては、限定するものではないが、円形脱毛症、強直性脊髄炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多内分泌腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ−マン症候群、全身性エリテマトーデス（SLE）、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎（例えば、散弾状脈絡網膜炎およびサルコイドブドウ膜炎）、脈管炎、白斑、ウェゲネル肉芽腫症および重症筋無力症が挙げられる。

「結合部分」とは標的のエピトープ、抗原、リガンドまたはレセプターに特異的に結合する任意の分子を意味する。結合部分としては限定するものではないが抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体）、抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'2、scFv抗体、SMIP、ドメイン抗体、ダイアボディ、ミニボディ、scFv-Fc、アフィボディ、ナノボディおよびドメイン抗体）、レセプター、リガンド、アプタマーおよび公知の結合パートナーを有している他の分子が挙げられる。

「生物学的に活性な」とは、生物学的な分子、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含めて分子がそれ自体または他の分子に対して物理的または化学的な活性を発揮することを意味する。例えば、「生物学的に活性な」分子は、例えば、酵素的な活性を保有しても、タンパク質結合活性（例えば、抗体相互作用）を保有しても、または細胞毒性活性を保有してもよく、「生物学的に活性」である。

「キメラ抗体」という用語は、可変領域が第一の種に由来し、定常領域が第二の種に由来する免疫グロブリンまたは抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、種々の種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから（例えば、マウスおよびヒトから）遺伝子操作によって構築され得る。

「コネクター」または「ポリペプチドコネクター」とは、本発明のHSAリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端の一方もしくは両方に共有結合されているか、または本発明のHSAリンカーの一つまたは複数の残基（例えば、アミノ末端残基とカルボキシ末端残基の間の残基）に共有結合されている2〜20残基長のアミノ酸配列を意味する。好ましい態様では、HSAリンカーのアミノ末端に結合されたポリペプチドコネクターはアミノ酸配列「AAS」または「AAQ」を有し、かつカルボキシ末端に結合されたコネクターはアミノ酸配列「AAAL」（配列番号5）を有する。

「有効量」または「に有効な量」または「治療有効量」という用語は、所望の結果、例えば、癌細胞を殺傷するか、腫瘍細胞増殖を軽減するか、疾患の組織もしくは器官で炎症を軽減するか、または組織、器官もしくは生物体（例えば、ヒト）で細胞の特異的な集団を標識することをもたらすのに十分な量の本発明の剤（例えば、コネクター配列の有無に関らず一つまたは複数の結合部分または診断剤もしくは治療剤と結合されたHSAリンカー）を意味する。

「ヒト抗体」という用語は、本明細書において用いる場合、フレームワーク領域とCDR領域との両方が、例えば、Kabatら、（Sequences of proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91〜3242(1991)）によって記載されるヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体、またはそのフラグメントを含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来である。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において用いるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のCDR配列がヒトのフレームワーク配列（すなわち、ヒト化抗体または抗体フラグメント）に移植された抗体を含むとは意図しない。

「ヒト化抗体」という用語は、ヒトの免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する可変フレームワーク領域を含む可変領域を有する少なくとも一つの免疫グロブリンドメインと、非ヒト免疫グロブリンまたは抗体に実質的に由来する相補性決定領域（例えば、少なくとも一つのCDR）とを含む、任意の抗体または抗体フラグメントを指す。

本明細書において用いる場合、「炎症性シグナル伝達インヒビター」または「ISI」とは、炎症促進性サイトカイン（例えば、TNF-α、TNF-β、またはIL-1）とそのレセプター（例えば、それぞれ、TNFレセプター1もしくは2、またはIL-1レセプター）との間の結合を低減する剤;炎症促進細胞表面シグナル伝達分子（例えば、CD20、CD25、CTLA-4、CD80/CD86、またはCD28）に対する活性化分子の結合を低減する剤;または炎症促進性サイトカインのそれらのレセプターへの結合、もしくは活性化分子の炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子への結合後に活性化される細胞内シグナル伝達分子の下流の活性化または活性を低減する剤（例えば、p38MAPKシグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子の活性化または活性を低下する剤）である。好ましくは、炎症促進性サイトカインとそのレセプターとの間の結合の低下、炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子への活性化分子の結合の低下、または炎症促進性サイトカインのそのレセプターへのもしくは活性化分子の炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子への結合後に生じる細胞内シグナル伝達の低下は、少なくとも約10％まで、好ましくは20％、30％、40％、または50％、より好ましくは60％、70％、80％、90％以上（最大100％）までである。ISIはレセプターに対して自由に結合できる炎症促進性サイトカイン（例えば、TNF-α、TNF-β、またはIL-1）の量を減らすことによって作用し得る。例えば、ISIは、可溶性の炎症促進性サイトカインレセプタータンパク質（例えば、可溶性のTNFレセプター融合タンパク質、例えば、エタネルセプト（ENBREL（登録商標））またはレネルセプト）、または可溶性炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子（例えば、可溶性CTLA-4（アバタセプト））、または炎症促進性サイトカインもしくは炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子（例えば、抗TNF抗体、例えば、アダリムマブ、セルトリズマブ、インフリキシマブ（inflixamab）、またはゴリムマブ;抗CD20抗体、例えば、リツキシマブ;またはTRU-015（TRUBION（登録商標）））に対する抗体であってもよい。さらに、ISIは、内因性の野性型炎症促進性サイトカインまたは炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子がそのレセプター（例えば、TNFレセプター1もしくは2、IL-1レセプター、またはCD11a（例えば、エファリズマブ（RAPTIVA（登録商標）、Genentech）））に結合する能力を破壊することによって作用し得る。ドミナントネガティブなTNF-α変異体の例は、XENP345（TNF変異体A145R/I97Tのペグ化バージョン）およびXproTM1595であり、さらに参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20030166559号および同第20050265962号に開示される変異体である。ドミナントネガティブなIL-1変異体の例はアナキンラ（KINERET（登録商標））であって、これは細胞内のシグナル伝達経路を活性化することなくIL-1レセプターに結合するIL-1の可溶型である。本発明で用いられ得る炎症性シグナル伝達のインヒビターはまた、炎症促進性サイトカインまたは炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子（例えば、DE096）の下流のシグナル伝達経路を阻害または低減する低分子である。この種のISIの例としてはp38 MAPキナーゼのインヒビター、例えば、5-アミノ-2-カルボニルチオペン（thiopene）誘導体（本明細書に組み入れられる、WO 04/089929に記載）;ARRY-797;BIRB 796 BS、（1-5-tert-ブチル-2-p-トリル-2H-ピラゾール-3-イル）-3-［4-2（モルホリン-4-イル-エトキシ）-ナフタレン-1-イル］-ウレア）;CHR-3620;CNI-1493;FR-167653（藤沢薬品、日本、大阪）;ISIS 101757（Isis Pharmaceuticals）;ML3404;NPC31145;PD169316;PHZ1112;RJW67657、（4-（4-（4-フルオロフェニル）-1-（3-フェニルプロピル）-5-（4-ピリジニル）-1H-イミダゾール-2-イル）-3-ブチン-1-オール;SCIO-469;SB202190;SB203580、（4-（4-フルオロフェニル）-2-（4-メチルスルフィニルフェニル）-5-（4-ピリジル）1H-イミダゾール）;SB239063、トランス-1-（4-ヒドロキシシクロヘキシル）-4-（4-フルオロフェニル-メトキシピリジミジン-4-イル）イミダゾール;SB242235;SD-282;SKF-86002;TAK715;VX702;およびVX745が挙げられる。さらに、ISIは炎症促進性サイトカイン（例えば、TNF-αおよびTNF-β）がその膜結合型から可溶性型にプロセシングされることを妨げ得る。TACEのインヒビターはこのクラスのISIである。TACEのインヒビターの例としては、BB-1101、BB-3103、BMS-561392、ブチニルオキシフェニルβ-スルホンピペリジンヒドロキサマート（hydroxomate）、CH4474、DPC333、DPH-067517、GM6001、GW3333、Ro32-7315、TAPI-1、およびTAPI-2、およびTMI005が挙げられる。ISIの追加の例としては、疾患特異的な免疫調節活性について操作した大腸菌の熱ショックタンパク質由来の短いペプチドが挙げられる（例えば、dnaJP1）。

「インテグリンアンタゴニスト」とは、インテグリン分子の生物学的活性を低減または阻害する（例えば、インテグリンアンタゴニストの非存在下の生物学的活性に比べて少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、またはそれ以上の低減または阻害）任意の剤、例えば、インテグリン分子のα4サブユニットを意味する。この剤はα4インテグリンサブユニットの活性または発現を阻害することによって、α4インテグリンサブユニット上で直接または間接的に作用する場合もあるし（NCBIアクセッション番号P13612;Takadaら、EMBO J. 8:1361〜1368(1989)）、またはα4サブユニットを含むインタクトなインテグリンが結合する標的上で作用する場合もある。例えば、血管細胞接着分子-1（VCAM-1）に結合し、これによってα4β1インテグリンがVCAM-1に結合することを妨げる抗体またはブロッキングペプチドは、本発明の目的のインテグリンアンタゴニストとみなされる。本発明での使用に適切な非限定的な例示的なインテグリンアンタゴニストとしては、タンパク質、ブロッキングペプチド、抗体、例えば、ナタリズマブ（TYSABRI（登録商標））、および低分子インヒビターを挙げることができる。α4インテグリンアンタゴニストの例としては限定するものではないが、ナタリズマブ（Elan/Biogen Idec;例えば、以下を参照のこと、米国特許第5,840,299号;同第6,033,665号;同第6,602,503号;同第5,168,062号;同第5,385,839号;および同第5,730,978号;参照により本明細書に組み入れられる）、oMEPUPA-V（Biogen;米国特許第6,495,525号;参照により本明細書に組み入れられる）、アレファセプト、CDP-323（Celltech）;フィラテグラスト（SB-68399;GlaxoSmithKline）;TR-9109（Pfizer）;ISIS-107248（Antisense Therapeutics）;R-1295（Roche）;およびTBC-4746（Schering-Plough）が挙げられる。α4インテグリンアンタゴニストの追加の非限定的な例としては、米国特許第5,821,231号;同第5,869,448号;同第5,936,065号;同第6,265,572号;同第6,288,267号;同第6,365,619号;同第6,423,728号;同第6,426,348号;同第6,458,844号;同第6.479,666号;同第6,482,849号;同第6,596,752号;同第6,667,331号;同第6,668,527号;同第6,685,617号;同第6,903,128号;および同第7,015,216（各々が参照により本明細書に組み入れられる）;米国特許出願公開第2002/0049236号;同第2003/0004196号;同第2003/0018016号;同第2003/0078249号;同第2003/0083267号;同第2003/0100585号;同第2004/0039040号;同第2004/0053907号;同第2004/0087574号;同第2004/0102496号;同第2004/0132809号;同第2004/0229858号;同第2006/0014966号;同第2006/0030553号;同第2006/0166866号;同第2006/0166961号;同第2006/0241132号;同第2007/0054909号;および同第2007/0232601号（各々が参照により本明細書に組み入れられる）;欧州特許第0842943号;欧州特許第0842944号;欧州特許第0842945号;欧州特許第0903353号;および欧州特許第0918059号;ならびにPCT国際公開公報番号WO 95/15973;WO 96/06108;WO 96/40781;WO 98/04247;WO 98/04913;WO 98/42656;WO 98/53814;WO 98/53817;WO 98/53818;WO 98/54207;WO 98/58902;WO 99/06390;WO 99/06431;WO 99/06432;WO 99/06433;WO 99/06434;WO 99/06435;WO 99/06436;WO 99/06437;WO 99/10312;WO 99/10313;WO 99/20272;WO 99/23063;WO 99/24398;WO 99/25685;WO 99/26615;WO 99/26921;WO 99/26922;WO 99/26923;WO 99/35163;WO 99/36393;WO 99/37605;WO 99/37618;WO 99/43642;WO 01/42215;およびWO 02/28830（その全てが参照により本明細書に組み入れられる）に記載される低分子が挙げられる。α4インテグリンアンタゴニストの追加の例としては、米国特許第6,197,794号;同第6,229,011号;同第6,329,372号;同第6,388,084号;同第6,348,463号;同第6,362,204号;同第6,380,387号;同第6,445,550号;同第6,806,365号;同第6,835,738号;同第6,855,706号;同第6,872,719号;同第6,878,718号;同第6,911,451号;同第6,916,933号;同第7,105,520号;同第7,153,963号;同第7,160,874号;同第7,193,108号;同第7,250,516号;および同第7,291,645（各々が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるフェニルアラニン誘導体が挙げられる。α4インテグリンアンタゴニストである追加のアミノ酸誘導体としては、例えば、米国特許出願公開第2004/0229859号および同第2006/0211630号（参照により本明細書に組み入れられる）、ならびにPCT国際公開公報番号WO 01/36376;WO 01/47868;およびWO 01/70670（その全てが参照により本明細書に組み入れられる）に記載のものが挙げられる。α4インテグリンアンタゴニストの他の例としては、例えば、PCT国際公開公報番号WO 94/15958;WO 95/15973;WO 96/00581;WO 96/06108;WO 96/22966（Leu-Asp-Valのトリペプチド;Biogen,Inc.）;WO 97/02289;WO 97/03094;およびWO 97/49731に記載のペプチド類、ならびにペプチドおよびセミ・ペプチド化合物が挙げられる。α4インテグリンアンタゴニストの追加の例は、米国特許出願公開第2007/066533号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載のペグ化分子である。α4インテグリンアンタゴニストである抗体の例としては、例えば、PCT国際公開公報番号WO 93/13798;WO 93/15764;WO 94/16094;およびWO 95/19790に記載の抗体が挙げられる。α4インテグリンアンタゴニストのさらなる例は本明細書において記載される。

「インターフェロン」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）のインターフェロン-α、-β、-γもしくは-τポリペプチド、またはその生物学的に活性なフラグメント、例えば、IFN-α（例えば、IFN-α-1a;その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20070274950号を参照のこと）、IFN-α-1b、IFN-α-2a（その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT国際公開公報番号WO 07/044083を参照のこと）、およびIFN-α-2b）、IFN-β（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,238,344に記載される;IFN-b-1a（AVONEX（登録商標）およびREBIF（登録商標））、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,962,978号に記載される、およびIFN-β-1b（BETASERON（登録商標）、米国特許第4,588,585号;同第4,959,314号;同第4,737,462号;および同第4,450,103（その全体が参照により組み入れられる）に記載される）、IFN-g、およびIFN-t（米国特許第5,738,845号および米国特許出願公開第20040247565号および同第20070243163号（その全体が参照により組み入れられる）に記載のとおり）を意味する。

「HSAリンカーコンジュゲート」とは、一つまたは複数の結合部分、ポリペプチドコネクター、診断剤または治療剤と組み合わせた本発明のヒト血清アルブミン（HSA）リンカータンパク質を意味する。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であって、単一の抗原部位に対して指向される。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対して指向される。モノクローナル抗体は、任意の従来認識されている技術、および本明細書において記載されている技術、例えば、Kohlerら、Nature,256:495（1975）に記載されるハイブリドーマ法、トランスジェニック動物（例えば、Lonbergら、Nature 368（6474）:856〜859（1994））、組換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号）を用いて、または、例えば、Clacksonら、Nature、352:624〜628（1991）、並びに、Marksら、J.Mol.Biol,222:581〜597（1991）に記載される技術を用いるファージ、酵母もしくは合成の足場（scaffold）抗体ライブラリーを用いて調製することができる。

「薬学的に許容される担体」とは、一緒に投与される化合物の治療特性を保持したままで治療される哺乳動物に対して薬学的に許容される担体を意味する。一つの例示的な薬学的に許容される担体は生理食塩水である。他の生理学的に受容可能な担体およびそれらの製剤は当業者に公知であって、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、（第18版）、編集 A.Gennaro、1990、Mack Publishing Company、Easton、PA（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。

「増殖性疾患」または「癌」とは、異常なまたは未調節の細胞増殖によって特徴付けられる任意の病態を意味する。増殖性疾患の例としては例えば、固形腫瘍、例えば、肉腫（例えば、明細胞肉腫）、癌腫（例えば、腎細胞癌）、およびリンパ腫;乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、泌尿器系（腎臓、膀胱および尿管の上皮を含む）の癌、女性生殖器系（子宮頸、子宮、卵巣、絨毛癌および妊娠性栄養膜）の癌、男性生殖器系（前立腺、精嚢および精巣を含む）の癌、内分泌腺（甲状腺、副腎および下垂体を含む）の癌、皮膚（血管腫、黒色腫、骨または軟部組織由来の肉腫およびカポジ肉腫を含む）の癌;脳および髄膜（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫および神経芽腫を含む）の癌、神経の癌、眼の癌、造血系の癌（緑色白血病、プラズマ細胞腫、および真皮T細胞リンパ腫/白血病を含む）、ならびに免疫系の癌（リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキン病リンパ腫を含む）が挙げられる。非固形腫瘍増殖性疾患の例は白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病）である。

「組み換え抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体、例えば、（a）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）についてトランスジェニックであるかもしくは導入染色体である動物（例えば、マウス）から単離された抗体、またはそれから調製されたハイブリドーマ、（b）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（c）ファージ、酵母または合成足場ディスプレイを用いる組み換え、コンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含む）から単離された抗体、ならびに（d）他のDNA配列に対する免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離される抗体を指す。

「特異的に結合する」とは、標的分子（例えば、分泌された標的分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、レセプターまたはリガンド）に対する、または標的分子（例えば、細胞表面抗原、例えば、レセプターまたはリガンド）を保有している細胞もしくは組織に対する、および非標的細胞もしくは標的分子を欠いている組織に対してではない、結合部分（例えば、本発明の抗体、抗体フラグメント、レセプター、リガンド、または剤の低分子部分）の優先的な会合を意味する。特定の程度の非特異的な相互作用が、結合部分と非標的分子（単独でまたは細胞もしくは組織と組み合わせて存在する）との間に存在し得ることが認識される。それにもかかわらず、特定の結合は、標的分子の特異的な認識を通じて媒介される場合、識別され得る。特異的な結合は、結合部分（例えば、抗体）と例えば、標的分子（例えば、抗原）を保有する細胞との間に、結合部分と例えば、標的分子を欠いている細胞との間よりも強力な会合を生じる。特異的な結合は典型的には、標的分子またはマーカーを保有している、例えば、細胞または組織に対して、その標的分子またはマーカーを欠いている細胞または組織に比較した場合、結合部分の結合量（単位時間あたり）を2倍を超えて、好ましくは5倍を超えて、さらに好ましくは10倍を超えて、最も好ましくは100倍を超えて増大する。結合部分は標的分子またはマーカーに対して、例えば、10^-6M未満、より好ましくは10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、または10^-12M未満、そして最も好ましくは10^-13M、10^-14M、もしくは10^-15M未満の解離定数で結合する。このような条件下でのタンパク質に対する特異的結合には、特定のタンパク質に関するその特異性について選択される結合部分を必要とする。種々のアッセイ形式が、特定の標的分子に特異的に結合できる結合部分（例えば、抗体）を選択するのに適切である。例えば、固相ELISAイムノアッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクロナール抗体を選択するのに常用される。特異的免疫反応性を特定するために用いることができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載については、Harlow & Lane、Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publications、New York(1988)を参照のこと。

「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を参照配列と比較する状況において使用される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が参照配列と同一であるか、または二つの配列が最適に整列された場合に、参照配列内の対応する位置において同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基が特定の割合を有するということを意味する。例えば、デフォルトパラメーターでBLASTまたはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いるか、または手作業での整列および目視での検査（例えば、NCBIのウェブサイトを参照のこと）によって測定した場合、参照配列の全長にわたる最大限の一致のために比較および整列された場合に、参照配列と「実質的に同一」なアミノ酸配列は、参照配列（例えば、配列番号1に示すHSAアミノ酸配列、またはそのフラグメント）に対して少なくとも約60％の同一性、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはより高い割合の同一性（最大100％まで）を有する。

「表面露出アミノ酸残基」または「表面露出した」とは、HSAポリペプチドの折り畳まれて立体配置的に正確な三次構造の外面上に存在するアミノ酸残基を意味する。このような残基は、診断剤または治療剤の部位特異的なコンジュゲーションを可能にする例えば、他の化学的に反応性のアミノ酸（例えば、システイン）で置換されてもよい。さらに、表面露出アミノ酸残基は、グリコシル化を可能にするように（例えば、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン残基、またはグリコシル化モチーフの追加によって）、または妨げるように（例えば、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン残基、またはグリコシル化モチーフの除去によって）置換されてもよい。表面露出アミノ酸残基としては限定するものではないが、496位置のトレオニン、58位置のセリン、76位置のトレオニン、79位置のトレオニン、83位置のトレオニン、125位置のトレオニン、236位置のトレオニン、270位置のセリン、273位置のセリン、304位置のセリン、435位置のセリン、478位置のトレオニン、506位置のトレオニン、および508位置のトレオニンが挙げられる（アミノ酸の番号付けは、例えば、配列番号1に示されるHSAリンカーの配列に対する）。他の表面露出残基は、HSA結晶構造を用いて当業者によって特定され得る（Sugioら、「Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution」Protein Eng.12:439〜446（1999））。

「標的分子」または「標的細胞」とは、結合部分（例えば、抗体）または一つまたは複数の結合部分を含むHSAコンジュゲート（例えば、一つまたは複数の抗体または抗体フラグメントに結合されるHSAリンカー）が特異的に結合し得る分子（例えば、タンパク質、エピトープ、抗原、レセプターまたはリガンド）または細胞を意味する。標的分子は、標的細胞の外に存在してもよく（例えば、細胞表面タンパク質または分泌タンパク質）、または標的細胞の内部に存在してもよい。

「治療」とは、ヒトの疾患もしくは障害（例えば、自己免疫疾患または増殖性疾患）の進行もしくは重症度における、またはヒト患者におけるヒトの疾患または障害の一つまたは複数の症状の進行、重症度もしくは頻度における、低減（例えば、少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、またはさらに100％まで）を意味する。
[請求項1001]
i）配列番号6〜10のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むヒト血清アルブミン（HSA）リンカーと;
ii）抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、レセプター、リガンド、アプタマー、およびその生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される、第一および第二の結合部分であって、該第一の結合部分は、該HSAリンカーのアミノ末端に結合され、かつ該第二の結合部分は、該HSAリンカーのカルボキシ末端に結合される、前記第一および第二の結合部分、
を含む剤。
[請求項1002]
i）配列番号11〜15のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含むヒト血清アルブミン（HSA）リンカーと;
ii）抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、レセプター、リガンド、アプタマー、およびその生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される、第一および第二の結合部分であって、該第一の結合部分は、アミノ末端に結合され、かつ該第二の結合部分は、該配列のカルボキシ末端に結合される、前記第一および第二の結合部分、
を含む剤。
[請求項1003]
第一の結合部分がErbB3に特異的に結合し、かつ第二の結合部分がErbB2に特異的に結合する、請求項1001または1002記載の剤。
[請求項1004]
配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1001記載の剤。
[請求項1005]
配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1001記載の剤。
[請求項1006]
配列番号14に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1002記載の剤。
[請求項1007]
配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1002記載の剤。
[請求項1008]
配列番号1に示される配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでおり、かつ配列番号1の34位置にセリン残基、および配列番号1の503位置にグルタミン残基を含む、ヒト血清アルブミン（HSA）リンカー。
[請求項1009]
配列番号1に示される配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含む、請求項1008記載のHSAリンカー。
[請求項1010]
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1008記載のHSAリンカー。
[請求項1011]
請求項1008記載のHSAリンカーと少なくとも一つの第一の結合部分とを含む剤。
[請求項1012]
第一の結合部分をHSAリンカーに結合する第一のポリペプチドコネクターをさらに含む、請求項1011記載の剤。
[請求項1013]
コネクターが第一の結合部分をHSAリンカーのアミノ末端に結合する、請求項1012記載の剤。
[請求項1014]
コネクターが第一の結合部分をHSAリンカーのカルボキシ末端に結合する、請求項1012記載の剤。
[請求項1015]
コネクターが第一の結合部分をHSAリンカーに共有結合する、請求項1012記載の剤。
[請求項1016]
第二の結合部分をさらに含む、請求項1011記載の剤。
[請求項1017]
第二の結合部分をHSAリンカーに結合する第二のポリペプチドコネクターをさらに含む、請求項1016記載の剤。
[請求項1018]
コネクターが第二の結合部分をHSAリンカーのアミノ末端に結合する、請求項1017記載の剤。
[請求項1019]
コネクターが第二の結合部分をHSAリンカーのカルボキシ末端に結合する、請求項1017記載の剤。
[請求項1020]
コネクターが第二の結合部分をHSAリンカーに共有結合する、請求項1017記載の剤。
[請求項1021]
第一の結合部分をHSAリンカーのアミノ末端に共有結合する第一のコネクターと、第二の結合部分を前記HSAリンカーのカルボキシ末端に共有結合する第二のコネクターとをさらに含む、請求項1016記載の剤。
[請求項1022]
第一のコネクターがアミノ酸配列AASまたはAAQを含み、かつ第二のコネクターが配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1021記載の剤。
[請求項1023]
第一の結合部分または第二の結合部分が、抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、細胞表面レセプターまたはそのリガンド、アプタマー、およびそれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される、請求項1016記載の剤。
[請求項1024]
第一または第二の結合部分が、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、α4インテグリン、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAM1）、CD166（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、レセプターαおよびβ、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合する、請求項1016記載の剤。
[請求項1025]
EGFRが赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ErbB）レセプターである、請求項1024記載の剤。
[請求項1026]
第一または第二の結合部分が、α-フェトプロテイン（AFP）もしくはインターフェロン、またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項1016記載の剤。
[請求項1027]
第一または第二の結合部分が、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、およびアナキンラからなる群より選択される、請求項1016記載の剤。
[請求項1028]
第一または第二の結合部分が単鎖Fv分子である、請求項1016記載の剤。
[請求項1029]
単鎖Fv分子がヒトであるかまたはヒト化される、請求項1028記載の剤。
[請求項1030]
診断剤または治療剤をさらに含む、請求項1011記載の剤。
[請求項1031]
診断剤が検出可能標識である、請求項1030記載の剤。
[請求項1032]
検出可能標識が、放射性標識、蛍光標識、または重金属標識である、請求項1031記載の剤。
[請求項1033]
治療剤が、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または免疫調節剤である、請求項1030記載の剤。
[請求項1034]
細胞毒性剤が、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、チューブリンインヒビター、トポイソメラーゼIもしくはIIのインヒビター、ホルモンのアゴニストもしくはアンタゴニスト、免疫調節剤、DNAマイナー・グルーブ・バインダー、または放射性剤である、請求項1033記載の剤。
[請求項1035]
抗腫瘍剤が、シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1034記載の剤。
[請求項1036]
腫瘍細胞に結合して殺傷するか、または腫瘍細胞増殖を阻害することができる、請求項1033記載の剤。
[請求項1037]
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と混合された、請求項1011記載の剤。
[請求項1038]
6時間から7日間のインビボ半減期を呈する、請求項1011記載の剤。
[請求項1039]
剤が8時間より長いインビボ半減期を呈する、請求項1011記載の剤。
[請求項1040]
i）配列番号11〜15のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むヒト血清アルブミン（HSA）リンカー、またはそのフラグメントもしくは変異体と
ii）少なくとも第一の結合部分と
を含む剤。
[請求項1041]
第一の結合部分がHSAリンカーのアミノ末端に結合される、請求項1040記載の剤。
[請求項1042]
第一の結合部分がHSAリンカーのカルボキシ末端に結合される、請求項1040記載の剤。
[請求項1043]
第一の結合部分がHSAリンカーに共有結合される、請求項1040記載の剤。
[請求項1044]
第二結合部分をさらに含む、請求項1040記載の剤。
[請求項1045]
第二結合部分がHSAリンカーのアミノ末端に結合される、請求項1044記載の剤。
[請求項1046]
第二の結合部分がHSAリンカーのカルボキシ末端に結合される、請求項1044記載の剤。
[請求項1047]
第二の結合部分がHSAリンカーに共有結合される、請求項1044記載の剤。
[請求項1048]
第一の結合部分または第二の結合部分が、抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、細胞表面レセプターまたはそのリガンド、アプタマー、およびその生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される、請求項1044記載の剤。
[請求項1049]
第一または第二の結合部分が、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、α4インテグリン、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAM1）、CD166（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、レセプターαおよびβ、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合する、請求項1044記載の剤。
[請求項1050]
EGFRが赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ErbB）レセプターである、請求項1049記載の剤。
[請求項1051]
第一または第二の結合部分が、α-フェトプロテイン（AFP）もしくはインターフェロン、またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項1044記載の剤。
[請求項1052]
第一または第二の結合部分が、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、およびアナキンラからなる群より選択される、請求項1044記載の剤。
[請求項1053]
第一の結合部分または第二の結合部分が単鎖Fv分子である、請求項1044記載の剤。
[請求項1054]
単鎖Fv分子が、ヒトであるかまたはヒト化される、請求項1053記載の剤。
[請求項1055]
診断剤または治療剤をさらに含む、請求項1040記載の剤。
[請求項1056]
診断剤が検出可能標識である、請求項1055記載の剤。
[請求項1057]
検出可能標識が、放射性標識、蛍光標識、または重金属標識である、請求項1056記載の剤。
[請求項1058]
治療剤が、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または免疫調節剤である、請求項1055記載の剤。
[請求項1059]
細胞毒性剤が、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、チューブリンインヒビター、トポイソメラーゼIもしくはIIのインヒビター、ホルモンのアゴニストもしくはアンタゴニスト、免疫調節剤、DNAマイナー・グルーブ・バインダー、または放射性剤である、請求項1058記載の剤。
[請求項1060]
抗腫瘍剤が、シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1059記載の剤。
[請求項1061]
腫瘍細胞に結合して殺傷するか、または腫瘍細胞増殖を阻害することができる、請求項1058記載の剤。
[請求項1062]
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と混合された、請求項1040記載の剤。
[請求項1063]
6時間から7日間のインビボ半減期を呈する、請求項1040記載の剤。
[請求項1064]
8時間より長いインビボ半減期を呈する、請求項1040記載の剤。
[請求項1065]
請求項1011または1040の剤を哺乳動物に投与する工程を含む、疾患または障害を有している哺乳動物を治療するための方法。
[請求項1066]
疾患または障害が、細胞表面レセプターを通じた細胞シグナル伝達に関連している、請求項1065記載の方法。
[請求項1067]
哺乳動物がヒトである、請求項1065記載の方法。
[請求項1068]
疾患または障害が増殖性疾患または自己免疫疾患である、請求項1065記載の方法。
[請求項1069]
増殖性疾患が黒色腫、明細胞癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌または脳腫瘍である、請求項1068記載の方法。
[請求項1070]
自己免疫疾患が、多発性硬化症、乾癬、重症筋無力症、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、または関節リウマチである、請求項1068記載の方法。
[請求項1071]
配列番号1、3または6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列のアミノ末端に第一の結合部分、およびカルボキシ末端に第二の結合部分を結合する工程を含む、ヒト血清アルブミン（HSA）剤を作製する方法。
[請求項1072]
結合が、第一の結合部分と第二の結合部分との間、およびアミノ末端とカルボキシ末端との間に、それぞれ共有結合を形成する工程を含む、請求項1071記載の方法。
[請求項1073]
第一の結合部分または第二の結合部分が、抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、細胞表面レセプターまたはそのリガンド、アプタマー、およびその生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される、請求項1071記載の方法。
[請求項1074]
第一または第二の結合部分が、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、α4インテグリン、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAM1）、CD166（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、レセプターαおよびβ、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合する、請求項1071記載の方法。
[請求項1075]
EGFRが赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ErbB）レセプターである、請求項1074記載の方法。
[請求項1076]
第一または第二の結合部分が、α-フェトプロテイン（AFP）もしくはインターフェロン、またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項1071記載の方法。
[請求項1077]
第一または第二の結合部分が、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、およびアナキンラからなる群より選択される、請求項1071記載の方法。
[請求項1078]
第一または第二の結合部分が単鎖Fv分子である、請求項1071記載の方法。
[請求項1079]
単鎖Fv分子がヒトであるかまたはヒト化される、請求項1071記載の方法。
[請求項1080]
一つまたは複数の検出可能標識を剤にコンジュゲートする工程をさらに含む、請求項1071記載の方法。
[請求項1081]
検出可能標識が、放射性標識、蛍光標識、または重金属標識である、請求項1080記載の方法。
[請求項1082]
一つまたは複数の細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または免疫調節剤を剤にコンジュゲートする工程をさらに含む、請求項1071記載の方法。
[請求項1083]
細胞毒性剤が、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、チューブリンインヒビター、トポイソメラーゼIもしくはIIのインヒビター、ホルモンのアゴニストもしくはアンタゴニスト、免疫調節剤、または放射性剤である、請求項1082記載の方法。
[請求項1084]
抗腫瘍剤が、シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1083記載の方法。
[請求項1085]
剤と薬学的に許容される担体とを混合する工程をさらに含む、請求項1071〜1084のいずれか一項記載の方法。
[請求項1086]
配列番号1、3および6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列における一つまたは複数の表面露出アミノ酸残基を化学修飾し得る置換アミノ酸で置換する工程であって、該修飾によって診断剤または治療剤のコンジュゲーションが可能になる前記工程を含む、ヒト血清アルブミン（HSA）剤を作製するための方法。
[請求項1087]
置換アミノ酸がシステインであり、表面露出アミノ酸残基がセリンまたはトレオニンである、請求項1086記載の方法。
[請求項1088]
化学修飾が置換アミノ酸と診断剤または治療剤との間に共有結合を生じる、請求項1086記載の方法。
[請求項1089]
表面露出アミノ酸残基が、496位置のトレオニン、58位置のセリン、76位置のトレオニン、79位置のトレオニン、83位置のトレオニン、125位置のトレオニン、236位置のトレオニン、270位置のセリン、273位置のセリン、304位置のセリン、435位置のセリン、478位置のトレオニン、506位置のトレオニン、および508位置のトレオニンからなる群より選択される、請求項1086記載の方法。
[請求項1090]
配列番号1、3および6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の一つまたは複数をアスパラギン、セリンまたはトレオニンで置換する工程であって、該置換がHSA剤上にグリコシル化部位を組み込む工程を含む、ヒト血清アルブミン（HSA）剤を作製するための方法。
[請求項1091]
配列番号1、3および6〜15のいずれか一つに示されるアミノ酸配列における一つまたは複数のアスパラギン、セリンまたはトレオニン残基をアスパラギン、セリンまたはトレオニン以外の任意のアミノ酸で置換する工程であって、該置換がHSA剤からグリコシル化部位を取り除く工程を含む、ヒト血清アルブミン（HSA）剤を作製するための方法。
[請求項1092]
請求項1008〜1010記載のHSAリンカーを含むキット。
[請求項1093]
請求項1001、1002、1011または1040記載の剤を含むキット。
[請求項1094]
配列番号16〜25に示されるアミノ酸配列のいずれか一つに少なくとも90％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含む剤。
[請求項1095]
配列番号16〜25に示されるアミノ酸配列のいずれか一つに少なくとも95％の配列同一性を有しているアミノ酸配列を含む、請求項1094記載の剤。
[請求項1096]
配列番号16〜25に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む、請求項1094記載の剤。
[請求項1097]
検出可能標識または治療剤をさらに含む、請求項1094記載の剤。
[請求項1098]
検出可能標識が、放射性、蛍光、生物発光または重金属の分子、またはエピトープタグである、請求項1097記載の剤。
[請求項1099]
蛍光分子が緑色蛍光タンパク質（GFP）、増強GFP（eGFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）またはdsRedである、請求項1098記載の剤。
[請求項1100]
生物発光分子が、ルシフェラーゼである、請求項1098記載の剤。
[請求項1101]
エピトープタグが、c-myc、赤血球凝集素、またはヒスチジンタグである、請求項1098記載の剤。
[請求項1102]
治療剤がシトクロムc、カスパーゼ1-10、グランザイムAまたはB、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、TNF-β、Fas、Fasリガンド、Fas関連死ドメイン様IL-1β変換酵素（FLICE）、TRAIL/APO2L、TWEAK/APO3L、Bax、Bid、Bik、Bad、Bak、RICK、血管アポトーシス誘導性タンパク質1および2（VAP1およびVAP2）、ピエリシン、アポトーシス誘発性タンパク質（AIP）、IL-1αプロピースポリペプチド、アポプチン、アポプチン-関連タンパク質1（AAP-1）、エンドスタチン、アンギオスタチン、およびその生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される細胞毒性ポリペプチドである、請求項1097記載の剤。
[請求項1103]
シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、一つまたは複数の治療剤と組み合わせた、請求項1094記載の剤。
[請求項1104]
第一および第二の結合部分が、同じ標的分子に特異的に結合する、請求項1001、1002、1016または1044記載の剤。
[請求項1105]
第一および第二の結合部分が異なる標的分子に特異的に結合する、請求項1001、1002、1016または1044記載の剤。
[請求項1106]
第一および第二の結合部分が、同じ標的分子上の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項1001、1002、1016または1044記載の剤。
[請求項1107]
第一および第二の結合部分が同じ標的分子に特異的に結合する、請求項1065記載の方法。
[請求項1108]
第一および第二の結合部分が、異なる標的分子に特異的に結合する、請求項1065記載の方法。
[請求項1109]
第一および第二の結合部分が、同じ標的分子上の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項1065記載の方法。
[請求項1110]
第一および第二の結合部分が、同じ標的分子に特異的に結合する、請求項1071記載の方法。
[請求項1111]
第一および第二の結合部分が、異なる標的分子に特異的に結合する、請求項1071記載の方法。
[請求項1112]
第一および第二の結合部分が、同じ標的分子上の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項1071記載の方法。
[請求項1113]
配列番号1のアミノ酸残基25〜44およびアミノ酸残基494〜513を含むポリペプチドリンカー。
[請求項1114]
配列番号1のアミノ酸残基25〜70およびアミノ酸残基450〜513を含む、請求項1113記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1115]
配列番号1のアミノ酸残基15〜100およびアミノ酸残基400〜520を含む、請求項1114記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1116]
配列番号1のアミノ酸残基10〜200およびアミノ酸残基300〜575を含む、請求項1115記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1117]
配列番号1のアミノ酸残基5〜250およびアミノ酸残基275〜580を含む、請求項1116記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1118]
少なくとも第一の結合部分をさらに含む、請求項1113記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1119]
ポリペプチドリンカーに第一の結合部分を結合する第一のポリペプチドコネクターをさらに含む、請求項1118記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1120]
コネクターが、第一の結合部分をポリペプチドリンカーのアミノ末端に結合する、請求項1119記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1121]
コネクターが、第一の結合部分をポリペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合する、請求項1119記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1122]
コネクターが、第一の結合部分をポリペプチドリンカーに共有結合する、請求項1119記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1123]
第二の結合部分をさらに含む、請求項1118記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1124]
ポリペプチドリンカーに第二の結合部分を結合する第二のポリペプチドコネクターをさらに含む、請求項1123記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1125]
コネクターが第二の結合部分をポリペプチドリンカーのアミノ末端に結合する、請求項1124記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1126]
コネクターが第二の結合部分をポリペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合する、請求項1124記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1127]
コネクターが第二の結合部分をポリペプチドリンカーに共有結合する、請求項1124記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1128]
第一の結合部分をポリペプチドリンカーのアミノ末端に共有結合する第一のコネクターと、第二の結合部分を前記ポリペプチドリンカーのカルボキシ末端に共有結合する第二のコネクターをさらに含む、請求項1123記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1129]
第一のコネクターがアミノ酸配列AASまたはAAQを含み、かつ第二のコネクターが配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1128記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1130]
第一または第二の結合部分が、抗体、単鎖Fv分子、二重特異性単鎖Fv（（scFv'）₂）分子、ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ホルモン、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、タンデムscFv（taFv）フラグメント、細胞表面レセプターまたはそのリガンド、アプタマー、およびその生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される、請求項1123記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1131]
第一の結合部分または第二の結合部分が、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、α4インテグリン、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAM1）、CD166（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、レセプターαおよびβ、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびそれらのフラグメントからなる群より選択されるタンパク質に特異的に結合する、請求項1123記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1132]
EGFRが赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ErbB）レセプターである、請求項1131記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1133]
第一または第二の結合部分が、α-フェトプロテイン（AFP）もしくはインターフェロン、またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項1123記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1134]
第一または第二の結合部分が、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トラスツズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、およびアナキンラからなる群より選択される、請求項1123記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1135]
第一または第二の結合部分が単鎖Fv分子である、請求項1123記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1136]
単鎖Fv分子が、ヒトであるかまたはヒト化される、請求項1135記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1137]
診断剤または治療剤をさらに含む、請求項1118記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1138]
診断剤が検出可能標識である、請求項1137記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1139]
検出可能標識が、放射性、蛍光、または重金属の標識である、請求項1138記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1140]
治療剤が、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または免疫調節剤である、請求項1137記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1141]
細胞毒性剤が、アルキル化剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗増殖剤、代謝拮抗剤、チューブリンインヒビター、トポイソメラーゼIもしくはIIのインヒビター、ホルモンのアゴニストもしくはアンタゴニスト、免疫調節剤、DNAマイナー・グルーブ・バインダー、または放射性剤である、請求項1140にポリペプチドリンカー。
[請求項1142]
抗腫瘍剤が、シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項1141記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1143]
剤が、腫瘍細胞に結合しかつ殺傷するか、または腫瘍細胞増殖を阻害することができる、請求項1140記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1144]
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と混合された、請求項1118記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1145]
剤が、6時間から7日間のインビボ半減期を呈する、請求項1118記載のポリペプチドリンカー。
[請求項1146]
剤が、8時間より長いインビボ半減期を呈する、請求項1118記載のポリペプチドリンカー。

図1は例示的なHSAリンカーコンジュゲートの模式図を示している図である。アミノ末端結合部分とHSAリンカーとの間のコネクターは、アラニン、アラニンおよびセリンの配列を有する。HSAリンカーとカルボキシ末端結合部分との間のコネクターはアラニン、アラニン、アラニン、ロイシンの配列を有する（配列番号5）。図2はB2B3変異体がZR75-1乳癌細胞におけるHRG誘導性pErbB3を阻害することを示しているグラフである。図3A〜図3Dは、B2B3の変異体A5-HSA-B1D2（図3A）、H3-HSA-B1D2（図3B）、H3-HSA-F5B6H2（図3C）、およびF4-HSA-F5B6H2（図3D）での24時間の前処理後のBT474乳癌細胞におけるリン酸化ErbB3の阻害を示しているグラフである。図4A〜図4Dは、B2B3の変異体A5-HSA-B1D2（図4A）、H3-HSA-B1D2（図4B）、H3-HSA-F5B6H2（図4C）、およびF4-HSA-F5B6H2（図4D）での24時間の前処理後のBT474乳癌細胞におけるリン酸化AKTの阻害を示しているグラフである。図5A〜図5Dは、B2B3の変異体A5-HSA-B1D2（図5A）、H3-HSA-B1D2（図5B）、H3-HSA-F5B6H2（図5C）、F4-HSA-F5B6H2（図5D）での24時間の前処理後のBT474乳癌細胞におけるリン酸化ERKの阻害を示しているグラフである。図6は、B2B3-1変異体でのBT474乳癌細胞の処理がG1停止およびS期の細胞の数の減少を生じることを示しているグラフである。図7は、1μMのB2B3-1とのBT-474-M3細胞のプレインキュベーションがHRGの結合を実質的にブロックすることを示しているフロー・サイトメトリー・ヒストグラムである。図8A〜図8Dは、B2B3-1がB-T474-M3およびZR75-30細胞株においてErbB3およびAKTリン酸化を阻害することを示しているグラフである。乳癌細胞株BT-474-M3（図8Aおよび図8C）およびZR75-30（図8Bおよび図8D）をB2B3-1の用量滴定によって24時間前処理し、次いで5nMのHRG 1β EGFドメインを用いて10分間刺激した。次いでErbB3およびAKTのリン酸化状態をELISAアッセイを用いて検査した。図9はBT474乳癌細胞におけるシグナル伝達タンパク質に対するB2B3-1処理の効果を示すウエスタンブロットの写真である。図10はB2B3-1処理したBT474乳癌細胞の免疫沈降を示すウエスタンブロットの写真である。図11A〜図11CはBT-474細胞株のB2B3-1処理がG1停止およびS期の細胞の集団の減少を生じ（図11A）、かつ未処理の細胞に比較してBT-474細胞およびSKBr3細胞の両方でコロニー形成を阻害する（図11B）ことを示しているグラフである。さらに、B2B3-1は細胞インピーダンスアッセイにおいてBT-474-M3細胞の増殖を阻害する（図11C）。図12はB2B3-1がZR75-1細胞でErbB3リン酸化を刺激しないことを示しているグラフである。図13A〜図13BはB2B3-1がErbB3（図13A）およびErbB2（図13B）に特異的に結合することを示しているグラフである。図14は、MALME-3細胞に対するB2B3-1の結合力活性がErbB2のみの結合変異体であるSKO-3、およびErbB3のみの結合変異体であるSKO-2に比較してみかけの結合親和性の有意な増大を生じることを示しているグラフである。図15A〜図15Cは、マウス、カニクイザルおよびヒトの血清におけるB2B3-1の安定性を示しているグラフである。100nMのB2B3-1をマウス（図15A）、カニクイザル（図15B）、またはヒト（図15C）の血清中で37℃で120分間インキュベートした。サンプルを0、24、48、72、96および120時間で取り出し、B2B3-1がErbB2およびErbB3の両方に結合する能力をELISAによって測定した（RLU＝相対的発光量）。図16はBT-474-M3乳癌異種移植片モデルにおけるB2B3-1の用量応答を示しているグラフである。腫瘍応答に対するB2B3-1用量の関係を、示した用量でBT-474-M3乳房腫瘍株で評価した。HSAを90mg/kgのB2B3-1用量と等モル用量である52.5mg/kgで与えた。図17A〜図17Eは、B2B3-1がErbB2依存性の方式での多重異種移植片モデルで有効であることを示しているグラフである。Calu-3（ヒト肺腺癌;図17A）、SKOV-3（ヒト卵巣腺癌;図17B）、NCI-N87（ヒト胃癌;図17C）、ACHN（ヒト腎臓腺癌;図17D）、およびMDA-MB-361（ヒト乳房腺癌;図17E）異種移植片モデルを示す。マウスを30mg/kgのB2B3-1を用いて3日ごと、またはHASの対照をB2B3-1と等モルで用いて処置した。図18A〜図18Bは、ErbB2の過剰発現がB2B3-1無応答のADRr乳癌異種移植片モデルを応答者に変換することを示しているグラフである。ErbB2は、レトロウイルス発現系を用いて野性型ADRr異種移植片（図18A）およびADRr-E2異種移植片（図18B）で過剰発現された。図19A〜図19BはB2B3-1活性が、インビトロ（図19A）およびインビボ（図19B）でErbB2発現レベルと正に相関することを示しているグラフである。図20A〜図20Bは、B2B3-1処置が腫瘍細胞の周期を改変することを示す。図20Aは、BT474-M3乳房腫瘍細胞の6時間のB2B3-1処置が核への細胞周期インヒビターp27^kip1の移行を生じることを示している蛍光顕微鏡写真を含む。ヘキスト（Hoechst）染色を用いて核を特定した。図20BはB2B3-1で72時間処理したBT-474-M3細胞のウエスタンブロットであり、ここでは細胞周期調節因子Cyclin D1のレベルの低下を生じた。細胞骨格タンパク質ビンクリンをこの実験ではタンパク質ローディング対照としてプローブした。図21A〜図21Bは、BT474乳房腫瘍異種移植片のB2B3-1処理が核へのp27^kiplの移行を生じることを示している顕微鏡写真である。BT474乳房腫瘍異種移植片を、B2B3-1（図21A）を30mg/kgの用量で用いて、または等モル用量のHSA（図21B）を用いて3日ごとに全部で4用量で処理してp27^kiplについて染色した。図22A〜図22Bは、B2B3-1処置がBT474-M3乳癌異種移植片で増殖マーカーKi67の減少を生じることを示している蛍光顕微鏡写真である。BT474-M3乳房腫瘍異種移植片を、B2B3-1（図22A）を30mg/kgの用量で用いて、または等モル用量のHSA（図22B）を用いて3日ごとに全部で4用量で処置した。図23A〜図23Bは、B2B3-1処置がBT474-M3乳癌異種移植片腫瘍で血管密度の減少を生じることを示している蛍光顕微鏡写真である（CD31染色の減少で測定される）。BT474-M3乳房腫瘍異種移植片を、B2B3-1（図23A）を30mg/kgの用量で用いて、または等モル用量のHSA（図23B）を用いて3日ごとに全部で4用量で処置した。図24A〜図24Bは、B2B3-1がインビボでErbB3のリン酸化を阻害することを示しているグラフである。B2B3-1（M1-M5）または対照のHSA（H1〜H2）で処理した個体のBT-474-M3異種移植片腫瘍由来の溶解液をSDS-PAGEに供して、pErbB3およびβチューブリンについてウエスタンブロット分析を用いてプローブした（図24A）。平均βチューブリンシグナルに対する平均pErbB3シグナルの正規化によって、B2B3-1処置した腫瘍は含むpErbB3がHSA腫瘍よりも有意に少なかったことが示された（図24B）。図25Aおよび図25Bは、PTEN活性が低下しているBT-474-M3異種移植片におけるB2B3-1のインビボ活性を示しているグラフである。培養されたBT-474-M3腫瘍細胞を対照のベクター（図25A）で、またはshPTENをコードするレトロウイルスベクター（図25B）でトランスフェクトしてPTEN活性をノックアウトする。PTEN活性をノックアウトするように操作されたBT-474-M3乳癌細胞をマウスの右脇腹に注射し、対照のベクターでトランスフェクトされた細胞を同じマウスの左脇腹に注射した。マウスを30mg/kgのB2B3-1を用いて3日ごとに、または10mg/kgのハーセプチンを用いて毎週処置し、HSAをB2B3-1と等モル用量で対照として注射した。B2B3-1およびハーセプチンは、対照のBT-474-M3乳癌細胞によって形成された腫瘍の大きさの低下を促進させた（図25A）が、一方、B2B3-1だけ（ハーセプチンなし）では、PTENの発現を欠いているBT-474-M3乳癌細胞によって形成される腫瘍の大きさの低下を促進させた（図25B）。図26A〜図26Bは、B2B3-1が、PTEN活性が低下しているBT-474-M3異種移植片におけるAKTのリン酸化を阻害することを示す。腫瘍を処置（q3dx11）の完了後に溶解して、ウエスタンブロット分析によってPTEN、pErbB3、およびpAKTの発現レベルについて試験した（図26）。総AKTおよび総タンパク質に対して正規化したpAKTのバンド強度に対する濃度測定によって、ハーセプチンができないとき、B2B3-1はこのタンパク質のリン酸化を阻害できたことが示される（図26B）。図27A〜図27Dは、nu/nuマウスでのB2B3-1の5mg/kg（図27A）、15mg/kg（図27B）、30mg/kg（図27C）、および45mg/kg（図27D）のボーラス用量の単一用量の薬物速度論的特性を示しているグラフである。B2B3-1血清濃度は、HSAアッセイまたはErbB2/ErbB3アッセイで匹敵して測定され、このことはB2B3-1の抗原結合活性が、循環中で保持されることを示している。図28は、ヌードマウスにおけるB2B3-1の5、15、30および45mg/kgのボーラス用量の用量-曝露の関係を示しているグラフである。用量の増大は、B2B3-1に対する全体的曝露の直線的な増大を生じる。図29は、3日ごとに4用量で4mg/kg（n＝2）、20mg/kg（n＝2）および200mg/kg（最大336時間でn＝4、384時間、552時間および672時間の時点について、n＝2）を投与したカニクイザルで測定したB2B3-1血清濃度を示しているグラフである。図30は、B2B3-1発現プラスミドpMP10k4H3-mHSA-B1D2の図である。図31は、ネオマイシン耐性プラスミドpSV2-neoの図である。図32は、ハイグロマイシン耐性プラスミドpTK-IIygの図である。

発明の詳細な説明
本発明は、本発明の剤（例えば、結合剤、診断剤または治療剤）を産生するために用いられる場合、例えば、6時間〜7日というインビボ半減期の増大を呈し、哺乳動物（例えば、ヒト）に対してインビボで投与される場合有意な体液性または細胞媒介性の免疫応答を誘導しないヒト血清アルブミン（HSA）リンカーを提供する。一局面では、本発明は、2つの規定のアミノ酸置換（すなわち、配列番号1に示される「C34S」および「N503Q」の置換）を有する変異されたHSAリンカーを提供する。別の局面では、本発明はインビボでの哺乳動物（例えば、ヒト）での診断適用もしくは治療適用のために、または哺乳動物の細胞、組織もしくは器官と関連してインビトロでの使用のために一つまたは複数の結合部分（例えば、抗体、抗体フラグメント、レセプター/リガンド、または低分子）に結合されたHSAリンカーを提供する。さらなる局面ではHSAリンカーは、哺乳動物における（または哺乳動物の細胞、組織または器官と関連して）診断適用または治療適用のために一つまたは複数の免疫調節剤、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤、検出可能標識、または放射性剤にカップリングされてもよい。HSAリンカーを含む本発明の剤は任意で、一つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合されてもよく、静脈内、筋肉内、経口的に、吸入によって、非経口的に、腹腔内に、動脈内に、経皮的に、舌下に、経鼻的に、座剤の使用を通じて、口腔に（transbuccally）、リポソームで、脂肪内に（adiposally）、眼内に、皮下に、髄腔内に、外用で、または、局所的に投与されるように処方されてもよい。HSAリンカーを含む本発明の剤は、一つまたは複数の生物学的に活性な剤（例えば、生物学的剤または化学的な剤、例えば、化学療法剤および抗腫瘍剤）と組み合されてもまたは同時投与されてもよい。さらなる局面では、本発明は、診断または治療の適用のために用いられ得る本発明の剤を調製するために、本発明のHSAリンカーへの結合部分（例えば、抗体、抗体フラグメント、レセプターまたはリガンド）、免疫調節剤、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤、検出可能標識、または放射性剤のコンジュゲーションのための説明書を備えたキットを提供する。

変異したヒト血清アルブミン（HSA）リンカー
本発明の変異したHSAリンカーは配列番号3に示される野性型HSAアミノ酸配列に対して位置34および503で2つのアミノ酸変異を含む。このシステイン残基は34位置（すなわち、C34）でシステイン以外の任意のアミノ酸残基（例えば、セリン、トレオニン、またはアラニン）に変異されてもよい。同様に、アスパラギン残基は503位置で（すなわち、N503）アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基（例えば、グルタミン、セリン、ヒスチジン、またはアラニン）に変異されてもよい。一態様では、本発明のHSAリンカーは、それぞれ配列番号1および配列番号2に示されるアミノ酸および対応するヌクレオチド配列を有する。本発明のこの変異したHSAリンカーは、2つのアミノ酸置換（すなわち、アミノ酸残基34でシステインの代わりにセリン（「C34S」）およびアミノ酸残基503でアスパラギンの代わりにグルタミン（「N503Q」））を含む。HSAリンカーは、一つまたは複数の結合部分（例えば、抗体、抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体）、または他の標的化剤もしくは生物学的に活性な剤（例えば、レセプターおよびリガンド））に結合される場合、本発明のHSAリンカーの非存在下におけるこれらの剤の薬理学的特性に対して、これらのコンジュゲートに対して、および、結合された追加の診断剤もしくは治療剤（例えば、免疫調節剤、細胞毒性剤、または細胞増殖抑制剤、検出可能標識、または放射性剤）に対しても、いくつかの有益な薬理学的特性を付与する。これらの利点としては哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合、免疫原性の低下（例えば、リンカー-抗体コンジュゲートの宿主抗体中和の低下）、HSAリンカーコンジュゲートの検出の増強（例えば、質量分析による）および薬理学的半減期の増大（例えば、6時間、8時間、12時間、24時間、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、または7日）が挙げられる。具体的には、アミノ酸残基34でのシステインに代わったセリンの置換は酸化の低下およびHSAリンカーのタンパク質異質性を生じる。野性型HSAでは、アミノ酸残基503でのアスパラギンは、脱アミノ化に感受性であって、薬理学的半減期の低下を生じる可能性が高い。アミノ酸残基503でのアスパラギンのグルタミンでの置換は、本発明のHSAリンカーの薬理学的半減期の増大、およびそれに対応して哺乳動物（例えば、ヒト）またはその細胞、組織または器官に投与される場合HSAリンカーを含むコンジュゲート剤の薬理学的半減期の増大を生じる。

他の態様では、本発明の変異したHSAリンカーは、HSAのドメインI（配列番号53;配列番号1の残基1〜197）、HSAのドメインIII（配列番号55;配列番号1の残基381〜585）、HSAのドメインIおよびIIIの組み合わせ、またはHSAのドメインIまたはIIIとHSAのドメインIIとの組み合わせ（配列番号54;配列番号1の残基189〜385）を含む。例えば、本発明のHSAリンカーはドメインIとII、IとIII、またはIIとIIIを含んでもよい。さらに、ドメインI（配列番号53）の34位置のシステイン残基（すなわち、C34）は、システイン以外の任意のアミノ酸残基（例えば、セリン、トレオニン、またはアラニン）に変異されてもよい。同様に、ドメインIII（配列番号55）の503位置のアスパラギン残基（すなわち、N503）はアスパラギン以外の任意のアミノ酸残基（例えば、グルタミン,セリン、ヒスチジン、またはアラニン）に変異されてもよい。これらのHSAリンカーは、各々が下記に詳細に記載されている一つまたは複数のポリペプチドコネクター、結合部分、および治療剤または診断剤を含む本発明のHSAリンカーコンジュゲート中に組み込まれてもよい。

ポリペプチドコネクター
本発明のHSAリンカーに対する、本明細書において定義されるような、結合部分のコンジュゲーションを容易にするために、短い（例えば、2〜20アミノ酸長）のポリペプチドコネクターが、HSAリンカーのアミノ末端またはカルボキシ末端に対して結合されてもよい（例えば、共有結合的に（例えば、ペプチド結合）、イオン的にまたは疎水性に結合されるか、または高い親和性のタンパク質-タンパク質結合相互作用を介して（例えば、ビオチンおよびアビジン））。これらのコネクターは本明細書において記載される任意の結合部分が結合され得る可塑性の係留（tether）をもたらす。ポリペプチドコネクターは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。一態様では、このコネクターは、例えば、グリシン、アラニン、セリン、グルタミン、ロイシン、またはバリン残基の配列である。本明細書において具体的には列挙されていないが、本発明のコネクターは、単独でグリシン、アラニン、セリン、グルタミン、ロイシンもしくはバリン残基であってもよく、または最大約20アミノ酸長までのこれらの残基の任意の組み合わせであってもよい。好ましい態様では、HSAリンカーのアミノ末端に結合されたコネクターは、アミノ酸配列「AAS」または「AAQ」を有し、このカルボキシ末端に結合されたコネクターはアミノ酸配列「AAAL」（配列番号5）を有する。このコネクターは、HSAリンカー内のアミノ酸残基に対して、HSAリンカーのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に共有結合されてもよいし、または存在する場合、一つまたは複数の結合部分の間に含まれてもよい。

HSAリンカーの作製
本発明のHSAリンカー（任意で上記のペプチドコネクター、下記の一つまたは複数の結合部分、ポリペプチドベースの検出可能標識、および他のポリペプチドベースの治療剤を含んでもよい）は組み換え的に作製されてもよい。例えば、HSAリンカー（および一つまたは複数の任意のエレメント）をコードするヌクレオチド配列を、細菌（例えば、大腸菌）、昆虫、酵母もしくは哺乳動物の細胞（例えば、CHO細胞）、または哺乳動物の組織、器官もしくは生物体（例えば、トランスジェニックのげっ歯類、有蹄動物（例えば、ヤギ）または非ヒト霊長類）において、発現してもよい（例えば、プラスミド、ウイルスベクターで、またはトランスジェニックに）。宿主の細胞、組織、または器官でのHSAリンカーの発現後、当業者は、標準的なタンパク質精製方法（例えば、FPLCまたはアフィニティクロマトグラフィー）を用いてHSAリンカーを単離および精製し得る。2つの結合部分と組み合わせたHSAリンカーの産生のための組み換え発現系を図1に図示する。

本発明のHSAリンカー（上記の任意のエレメントの一つまたは複数を含んでもよい）は、合成的に作製されてもよい。例えば、HSAリンカーは、固相アプローチのようなペプチド合成の技術分野で一般に確立されている技術によって調製されてもよい。固相合成は、ポリスチレンのような不溶性の支持体またはマトリックスに連結される増殖しているペプチド鎖に対するアミノ酸残基の段階的な添加を包含する。ペプチドのC末端残基はt-ブチルオキシカルボニル基（tBoc）またはフルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）基などのN保護剤で保護されたそのアミノ基で市販されている支持体に最初に固定される。このアミノ保護基は、適切な脱保護剤、例えば、tBOCの場合TFA、またはFMOCについてはピペリジンで除去され、次のアミノ残基（N保護型）がジシクロカルボジイミド（DCC）などのカップリング剤とともに添加される。ペプチド結合の形成の際に、その試薬を支持体から洗浄する。最終残基の添加後、その剤をトリフルオロ酢酸（TFA）またはフッ化水素（HF）などの適切な試薬を用いて支持体から取り除く。必要に応じて、HSAリンカー（上記の任意のエレメントの一つまたは複数を含み得る）を1、2、3またはそれ以上のセグメントで作製してもよく、次にこれを連結して全体のHSAリンカー構築物を形成してもよい。

HSAリンカー結合部分
本発明のHSAリンカーはまた、標的の細胞、組織または器官へのこのHSAリンカー構築物の選択的かつ特異的な結合を可能にする一つまたは複数の結合部分、例えば、抗体、抗体フラグメント（本明細書において記載のとおり、例えば、単鎖Fv（scFv））またはレセプター/リガンド（すなわち、タンパク質または糖タンパク質のリガンドもしくはレセプター）を含む構築物として調製されてもよい。この結合部分は、HSAリンカーに結合されてもよい（例えば、共有結合（例えば、ペプチド結合）、イオン結合、もしくは疎水性結合を介して、または高親和性のタンパク質-タンパク質間の結合相互作用を介して（例えば、ビオチンおよびアビジン））。上記で考察したとおり、一つまたは複数のポリペプチドコネクターまたは結合部分を含む本発明のHSAリンカーは、組み換え的に作製されても、または合成的に作製されてもよい。

一つまたは複数の結合部分が本発明のHSAリンカーに結合されてもよい。一態様では、2つ以上の同一の結合部分（すなわち、同じ構造および結合親和性を有している部分）をHSAリンカーに対して、一つまたは複数（例えば、縦一列で）各々をアミノ末端およびカルボキシ末端で結合し、それによってこのHSAリンカーはその標的抗原についての結合部分の結合活性の改善が得られる。あるいは、2つ以上の異なる結合部分（例えば、2つ以上の異なる標的分子に結合親和性を有するscFv、または同じ標的分子上で2つ以上の異なるエピトープに結合親和性を有するscFvなどの抗体）をHSAリンカー（例えば、二重特異性HSAリンカーコンジュゲート）に結合して、複数の標的抗原またはエピトープがHSAリンカーコンジュゲートによって結合されることを可能にしてもよい。別の態様では、異なる種の結合部分をまたHSAリンカーに結合させて、例えば、リンカーコンジュゲートに2つ以上の異なる結合特異性またはアゴニスト/アンタゴニストの生物学的特性をもたらしてもよい。二重特異性HSAリンカーコンジュゲートの調製における使用のための結合部分対の有用な組み合わせは、参照により本明細書に組み入れられる、例えば、国際特許出願公開公報番号WO 2006/091209および同第WO 2005/117973に開示される。他の態様では、3つ以上の結合部分（例えば、同じ結合部分または異なる結合部分）をHSAリンカーに結合して本発明の剤を形成してもよい。

本発明は、少なくとも第一の結合部分および第二の結合部分（その各々がHSAリンカータンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかに、またはいずれかもしくは両方の末端に存在する、本明細書において規定されるような、ポリペプチドコネクターに結合され得る）を有する剤を特徴とする。図1は、2つの結合部分（「アーム1」および「アーム2」）が、アミノ末端のポリペプチドコネクターAASおよびカルボキシ末端のポリペプチドコネクターAAAL（配列番号5）によって変異したHSAリンカーに結合される本発明の例示的な変異HSAリンカーを図示する。結合部分（例えば、抗体またはscFv）はまた、他の遺伝子座（例えば、HSAリンカーの内部のアミノ酸残基）に対して、例えば、共有結合でまたはイオン結合で、例えば、ビオチン-アビジン相互作用を用いて結合され得る。アミン（例えば、リジン残基）およびスルフヒドリル（例えば、システイン残基）のアミノ酸側鎖のビオチン化は当技術分野において公知であり、結合部分をHSAリンカーに結合するために用いられ得る。

本発明のHSAリンカーコンジュゲートに含まれ得る結合部分としては、抗体、抗体フラグメント、レセプター、およびリガンドが挙げられる。本発明のHSAリンカーに結合された結合部分は組み換え（例えば、ヒト、マウス、キメラ、またはヒト化）であっても、合成であってもまたは天然であってもよい。本発明は完全抗体、ドメイン抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、抗体フラグメント、Fabフラグメント、F（ab'）₂分子、単鎖Fv（scFv）分子、タンデムscFv分子、抗体融合タンパク質、およびアプタマーを特徴とする。

抗体
本発明の抗体は、IgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEアイソタイプを包含する。本発明の抗体または抗体フラグメントは、本明細書において用いる場合、標的細胞の外部にまたは内部に存在する標的のタンパク質、糖タンパク質またはエピトープに結合する一つまたは複数の相補性決定領域（CDR）または結合ペプチドを含む。

本明細書に記載される多くの抗体またはそのフラグメントは、結合特異性もエフェクター機能も失うことなく、結合親和性の容認できない低下（例えば、約10^-7M未満）もなしに可変領域および定常領域の両方で重要でないアミノ酸の置換、付加または欠失を受ける場合がある。通常、このような変更を組み込む抗体または抗体フラグメントは、それが由来する参照の抗体または抗体フラグメントに対して実質的な配列同一性を呈する。ときおり、変異した抗体または抗体フラグメントであって、それが由来する参照の抗体または抗体フラグメントと比較して同じ特異性および増大した親和性を有している変異した抗体または抗体フラグメントが選択される場合がある。ファージディスプレイ技術によって、このような抗体を選択するための強力な技術が得られる。例えば、Dowerら、WO 91/17271 McCaffertyら、WO 92/01047;およびHuse、WO 92/06204（参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

本発明のHSAリンカーはまた、標的抗原に対して特異性で結合する能力を保持している抗体の一つまたは複数のフラグメントに結合され得る。抗体フラグメントとしては、別々の可変重鎖、可変軽鎖、Fab、Fab'、F（ab'）₂、Fabc、およびscFvが挙げられる。フラグメントは、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的な分離によって作製されてもよい。例えば、F（ab'）₂フラグメントは、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pubs.,N.Y.(1988)に記載の方法のような標準的な方法を用いてpH3.0〜3.5でペプシンを用いるタンパク質分解の消化によってIgG分子から得ることができる。Fabフラグメントは、限定的な還元によってF（ab'）₂フラグメントから、または還元剤の存在下でのパパインでの消化によって全抗体から得てもよい。フラグメントはまた、組み換えDNA技術によって作製され得る。選択したフラグメントをコードする核酸のセグメントを、制限酵素を用いる全長コード配列の消化によって、または新規の合成によって作製する。多くの場合、フラグメントは、ファージコーティング融合タンパク質の形態で発現される。この発現方式は、抗体の親和性鮮鋭化（sharpening）のために有利である。

ヒト化抗体
本発明はさらに本発明のHSAリンカーと組み合わせたヒト化抗体であってこの抗体CDRの一つまたは複数が非ヒト抗体配列由来であり、CDRのうち一つまたは複数ただし好ましくは全てが抗原（例えば、タンパク質、糖タンパク質、または他の適切なエピトープ）に特異的に結合するヒト化抗体を提供する。

ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と名づけられる）由来の定常フレームワーク領域、ならびにある場合には、ヒト抗体由来の可変領域のほとんどを含む。CDRのうち一つまたは複数（その全てまたは一部、ならびにCDRのうちの一つまたは複数を囲んでいる目立たないアミノ酸）がマウス抗体などの非ヒト抗体から提供される。この抗体の定常領域（単数または複数）は存在してもよいし、しなくてもよい。

ヒト可変領域ドメインフレームワークへの一つまたは複数のマウスCDRの置き換えは、ヒト可変領域ドメインフレームワークがCDRが由来するマウス可変フレームワークと同じまたは類似の高次構造をとる場合、それらの正確な空間的配向の保持を生じる可能性が最も高い。これは、ヒト抗体であってそのフレームワーク配列が、CDRが由来するマウス可変フレームワークドメインと高い程度の配列同一性および構造同一性を呈するヒト抗体由来のヒト可変ドメインを得ることによって達成される。この重鎖および軽鎖の可変フレームワーク領域は、同じヒト抗体配列由来であっても、または異なるヒト抗体配列由来であってもよい。このヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であっても、いくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であっても、またはヒト生殖系列可変ドメイン配列であってもよい。例えば、Kettleboroughら、Protein Engineering 4:773(1991);Kolbingerら、Protein Engineering 6:971(1993)を参照のこと。

適切なヒト抗体配列は、公知のヒト抗体の配列とのマウス可変領域のアミノ酸配列のアラインメントによって特定される。その比較は、重鎖および軽鎖について別々に行うが、その原理はどちらについても同様である。

キメラ抗体およびヒト化抗体および抗体フラグメントを調製する方法は、例えば、米国特許第4,816,567号、同第5,530,101号、同第5,622,701号、同第5,800,815号、同第5,874,540号、同第5,914,110号、同第5,928,904号、同第6,210,670号、同第6,677,436号、および同第7,067,313、ならびに米国特許出願公開第2002/0031508号、同第2004/0265311号、および同第2005/0226876号に記載される。抗体またはそのフラグメントの調製は、さらに、例えば、米国特許第6,331,415号、同第6,818,216号、および同第7,067,313号に記載される。

レセプターおよびリガンド
本発明は、本発明のHSAリンカーに対して結合したタンパク質または糖タンパク質のレセプターまたはリガンドを提供する。レセプターまたはリガンドと結合したHSAリンカーを用いて、分泌されたタンパク質、細胞（例えば、癌細胞）、組織または器官を、例えば、特異的に標的してもよい。さらにHSAリンカー-レセプターまたはリガンドコンジュゲートの同族の標的レセプターまたはリガンドへの特異的な結合が、細胞内または細胞間のシグナル伝達経路においてアゴニストまたはアンタゴニストの生物学的活性を生じ得る。本明細書において記載の他の結合部分と同様に、レセプターおよびリガンド、またはそのフラグメントを本発明のHSAリンカーのアミノ末端および/もしくはカルボキシ末端に、またはHSAリンカー内のアミノ酸残基に結合してもよい。

本発明のHSAリンカーに結合され得る例示的なレセプターおよびリガンドとしては限定するものではないが、インスリン様成長因子1レセプター（IGF1R）、IGF2R、インスリン様成長因子（IGF）、間葉上皮移行因子レセプター（c-met;肝細胞成長因子レセプター（HGFR）としても公知）、肝細胞成長因子（HGF）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR）、上皮細胞成長因子（EGF）、ヘレグリン、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、血管内皮成長因子（VEGF）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、TNF-β、葉酸レセプター（FOLR）、葉酸、トランスフェリンレセプター（TfR）、メソセリン、Fcレセプター、c-キットレセプター、c-キット、α4インテグリン、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95（Fasレセプター）、CD106（血管細胞付着分子1（VCAM1）、CD166（活性化白血球細胞接着分子（ALCAM））、CD178（Fasリガンド）、CD253（TNF関連アポトーシス誘発性リガンド（TRAIL））、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12（間質細胞由来因子1（SDF-1））、インターロイキン1（IL-1）、CTLA-4、レセプターαおよびβ、MART-1、gp100、MAGE-1、エフリン（Eph）レセプター、粘膜アドレシン細胞付着分子1（MAdCAM-1）、癌胎児性抗原（CEA）、Lewis^Y、MUC-1、上皮細胞接着分子（EpCAM）、癌抗原125（CA125）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、TAG-72抗原、およびその生物学的に活性なフラグメントが挙げられる。

レセプターおよびリガンドは、抗体または抗体フラグメントに関連する前記の任意の方法を用いて、発現されても、単離されても、本発明のHSAリンカーに連結されてもよい。

診断剤
本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の結合部分（例えば、抗体、抗体フラグメント、レセプター、またはリガンド）をキレート剤に、または検出可能標識にカップリングして、本発明の診断剤を形成してもよい。また、本明細書において記載されるような検出可能標識、ならびに本明細書において記載の治療剤または結合部分のうち一つまたは複数を含むHSAリンカーコンジュゲートも考慮する。

HSAリンカーおよびキレーター成分をカップリングして、HSAリンカーのトレオニン残基の遊離アミノ基を、カルボキシル基または活性化エステルなどのキレーターの適切な官能基と反応させることによってコンジュゲートを形成し得る。例えば、コンジュゲートは、エチレン鎖の上のカルボキシル置換基で官能化された場合、錯体化学の技術分野で通常である、キレーターであるエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を組み込むことによって形成され得る。

このタイプのEDTA誘導体の合成は、Aryaら（Bioconjugate Chemistry 2:323(1991)）に報告されており、ここでは、t-ブチル基での4つの配位するカルボキシル基の各々をブロックすること、一方ではエチレン鎖上のカルボキシル置換基は遊離であって、本発明の剤のペプチド部分のアミノ基と反応し、それによってコンジュゲートが形成されることが記載される。

HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートは、ペプチド性である、すなわち、固相ペプチド合成と適合性である金属キレーター成分を組み込んでもよい。この場合、このキレーターは、上記のEDTAと同じ方式で本発明のHSAリンカーにカップリングされてもよく、さらに好都合には、本発明のキレーターおよびHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートは、HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートのC末端残基から出発して全体として合成されそのキレーターのN末端残基で終わる。

HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートは、HSAリンカーの生物学的特性、HSAリンカーコンジュゲートの結合部分（単数または複数）の標的化機能、またはキレーターの金属結合機能に有害に影響することはないが、本発明のHSAリンカーをキレーターにカップリングするように機能する連結基成分をさらに組み込んでもよい。適切な連結基としては、HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートに対する、およびキレーターに対するカップリングのために反応基で官能化されたアミノ酸鎖およびアルキル鎖が挙げられる。アミノ酸鎖はキレーターがペプチド性であり、その結果HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートが固相技術によって全体として合成され得る場合、好ましい連結基である。アルキル鎖連結基は、本発明のHSAリンカーのペプチド部分のトレオニン残基のアミノ基と、カルボキシル基または活性化エステルのようなアルキル鎖上の第一の官能基との反応によってHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲート中に組み込まれ得る。引き続き、このキレーターをアルキル鎖に連結して、アルキル鎖上の第二の官能基とキレーター上の適切な基とを反応させることによってHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートの形成を完了する。アルキル鎖上の第二の官能基は、変異したHSAリンカータンパク質のトレオニン残基と反応しないがキレーター上の官能基とは反応性である置換基から選択される。例えば、キレーターがカルボキシル基または活性化エステルなどの官能基を組み込む場合、アルキル鎖連結基の第二の官能基は、アミノ基であってもよい。HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートの形成には、所望されない産物の形成を回避するために存在する官能基の保護および脱保護を要する場合があることが理解されるであろう。保護および脱保護は保護基、試薬および有機合成の技術分野で一般的なプロトコールを用いて達成される。特に上記の固相ペプチド合成で使用される保護および脱保護の技術を用いてもよい。

アルキル鎖に対する代替的な化学連結基はポリエチレングリコール（PEG）であり、これはHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲート中の組み込みについて上記されたアルキル鎖と同じ方式で官能化される。連結基は代替的には、最初にキレーターに対して、次いで本発明のHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートにカップリングされてもよいことが理解されるであろう。

本発明の一局面によれば、本発明のHSAリンカー-キレーターコンジュゲートは、複合体を形成し得る診断上有用な金属を組み込む。適切な金属としては、例えば、放射性核種、例えば、種々の形態のテクネチウムおよびレニウム（例えば、^99mTcO^3＋、99mTcO₂ ^＋、ReO^3＋、およびReO₂ ^＋）が挙げられる。HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲート内への金属の組み込みは、錯体化学の技術分野で通常の種々の方法によって達成され得る。金属がテクネチウム-99mである場合、以下の一般的手順を用いて、テクネチウム複合体を形成してもよい。HSAリンカー-キレーターコンジュゲート溶液を、エタノールのような水性アルコール中にHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートを最初に溶解することによって形成する。次いで、この溶液を脱気して酸素を除き、次いでチオール保護基を適切な試薬を用いて、例えば、水酸化ナトリウムを用いて取り除き、次いで、有機酸、例えば、酢酸（pH6.0〜6.5）で中和する。標識工程では、モリブデン発生源から得た化学量論的に過剰の過テクネチウム酸ナトリウムを、テクネチウムを還元するのに十分な塩化第一スズなどのある量の還元剤とともにコンジュゲートの溶液に添加して加熱する。この標識されたHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートを混入物である^99mTcO₄ ^-およびコロイド状^99mTcO₂からクロマトグラフィーで、例えば、C-18Sep Pakカートリッジを用いて分離してもよい。

別の方法では、本発明のHSAリンカーの標識はトランスキレート化（transchelation）反応によって達成され得る。テクネチウム供給源は、選択されたキレーターとのリガンド交換を容易にする不安定性リガンドと複合体化されたテクネチウムの溶液である。トランスキレート化に適切なリガンドとしては、酒石酸塩、クエン酸塩およびヘプタグルコン酸塩が挙げられる。この場合、好ましい還元剤は亜ジチオン酸ナトリウムである。HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートは、上記の技術を用いて標識されてもよいし、あるいはキレーター自体が標識されてその後に本発明のHSAリンカータンパク質にカップリングされて、HSAリンカー-キレーターコンジュゲートが形成されてもよいことが理解されるであろう;「前標識（prelabeled）リガンド」方法と呼ばれるプロセス。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の剤を標識するための別のアプローチは、金属キレート化の際に切断される連結を通じて固相支持体上にHSAリンカー-キレーターコンジュゲートを固定する工程を包含する。これは、キレーターが錯化原子の一つによって支持体の官能基にカップリングされるときに達成される。好ましくは、錯化イオウ原子は、マレイミドのようなイオウ保護基で官能化される支持体にカップリングされる。

診断上有用な金属で標識される場合、HSAリンカー-キレーターコンジュゲートを含む本発明の剤を用いて、癌（例えば、肺癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌）、加齢に伴う疾患（例えば、心血管系の疾患、脳血管疾患、またはアルツハイマー病）、タバコ関連の疾患（例えば、肺気腫、大動脈瘤、食道癌、または頭部および頸部の扁平上皮細胞癌）を発症するリスクのある組織を、診断画像化の技術分野で確立された手順によって検出してもよい。テクネチウム-99mなどの放射性核種金属で標識されたHSAリンカーを組み込む本発明の剤は、等張の生理食塩水などの薬学的に許容される溶液中での静脈注射によって、または本明細書において記載される他の方法によって哺乳動物（例えば、ヒト）に投与され得る。投与に適切な本発明の標識剤の量は、急速に除去されるHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートを組み込む本発明の剤が、それほど急速には除去されないHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートを組み込む剤よりも高用量で投与され得るという意味で、選択されたHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートの分布プロフィールに依存する。組織を画像化するために受容可能な単位用量は、70kgの個体にとっては約5〜40mCiの範囲である。標識されたHSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートを組み込む本発明の剤のインビボでの分布および局在化は、投与後適切な時点で、非標的組織でのクリアランスの速度に対して標的部位での蓄積の速度に依存して典型的には30分〜180分および最大約5日まで、本明細書において記載の標準的技術によって追跡され得る。

本発明のHSAリンカーまたはそれに対してコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、診断または治療の使用を容易にするように改変または標識されてもよい。検出可能標識、例えば、放射性、蛍光、重金属または他の分子を本発明の任意の剤に結合してもよい。ある剤の単一、二重または多重の標識が有利である場合がある。例えば、アミン含有側鎖または反応性基に対するキレート基を介する例えば⁹⁰Yの追加のカップリングと組み合わされた一つまたは複数の残基の放射性のヨウ素化での二重標識によって、組み合わせ標識が可能になるであろう。これは、広範に分散した小さい腫瘍細胞塊の特定などの専門的な診断要件に有用であり得る。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子または部分も、例えば、ペプチド成分のチロシン残基のハロゲン化によって改変してもよい。ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素およびアスタチンが挙げられる。このようなハロゲン化剤は、例えば、ハロゲンが放射性同位体、例えば、¹⁸F、⁷⁵Br、⁷⁷Br、¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I、¹³¹I、または²¹¹Atなどである場合、検出可能に標識され得る。本発明のハロゲン化剤は、各々の剤の分子で少なくとも一つのアミノ酸に対して、好ましくはD-Tyr残基に対して共有結合されたハロゲンを含む。他の適切な検出可能な修飾としては、本発明の剤またはアナログ、特にリジンを含むリンカーを有する剤またはアナログのリジン残基に対する他の化合物（例えば、フルオレセインなどの蛍光色素）の結合が挙げられる。

本発明のHSAリンカーを放射性標識するための放射性同位体、またはそれにコンジュゲートされる任意の分子または部分としては、本発明の剤またはそのアナログのペプチド成分の残基に対して共有結合され得る任意の放射性同位体が挙げられる。放射性同位体はまた、βもしくはγ放射線のいずれかを放射する放射性同位体から選択されてもよいし、あるいは、本発明の任意の剤は、例えば、HSAリンカーもしくはそれにコンジュゲートされた任意のペプチド剤のリジン残基（単数または複数）に共有結合され得るキレート基を含むように修飾されてもよい。次いでキレート基を、任意の種々の放射性同位体、例えば、ガリウム、インジウム、テクネチウム、イッテルビウム、レニウムまたはタリウム（例えば、¹²⁵I^、67Ga^、111In^、99mTc^、169Yb^、186Re）を含むように修飾してもよい。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分を放射性同位体の結合によって修飾してもよい。好ましい放射性同位体は、用いられるHSAコンジュゲートの生物学的半減期に対応するか、またはそれより長い放射性半減期を有している放射性同位体である。さらに好ましくはこの放射性同位体は、ハロゲン原子の放射性同位体（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素およびアスタチンの放射性同位体）、それより好ましくは⁷⁵Br、⁷⁷Br、⁷⁶Br、¹²²I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I、¹³¹I、または²¹¹Atである。

HSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分を組み込む本発明の剤は、放射性の金属にカップリングされて、X線画像または放射性療法で用いられ得る。好ましい放射性同位体としてはまた、^99mTc、⁵¹Cr、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹¹¹In、¹⁶⁸Yb、¹⁴⁰La、⁹⁰Y、⁸⁸Y、¹⁵³Sm、¹⁵⁶Ho、¹⁶⁵Dy、⁶⁴Cu、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²⁰³Pb、²¹¹Bi、²¹²Bi、²¹³Bi、および²¹⁴Biが挙げられる。この金属の選択は、所望の治療的適用または診断的適用に基づいて決定される。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分を金属成分にカップリングして、診断剤または治療剤として用いられ得る本発明の剤を作製してもよい。検出可能標識は、重元素または希土類イオン由来の金属イオン、例えば、Gd^3＋、Fe^3＋、Mn^3＋、またはCr^2＋であってもよい。HSAリンカー（それに結合された常磁性または超常磁性の金属を有する）を組み込む本発明の剤はMRI画像化適用における診断剤として有用である。本発明の剤にカップリングされ得る常磁性金属としては限定するものではないが、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（II）、鉄（III）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、プラセオジム（III）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、ガドリニウム（III）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）、およびイッテルビウム（III）が挙げられる。

キレート基は、本発明のHSAリンカーにまたはそれにコンジュゲートされた剤に対して検出可能標識または他の分子を間接的にカップリングするために用いられ得る。キレート基は本発明の剤と放射性標識、例えば、二機能性の安定なキレーターとを連結してもよいし、または一つまたは複数の末端もしくは内部のアミノ酸反応性基に連結されてもよい。本発明のHSAリンカー、またはそれに対してコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分は、イソチオシアネートβ-Alaまたは適切な非-α-アミノ酸リンカーを介して連結されてもよく、これがエドマン分解を妨げる。当技術分野で公知のキレーターの例としては、例えば、イニノカルボン（ininocarboxylic）およびポリアミノポリカルボン反応性基、イニノカルボン（ininocarboxylic）およびポリアミノポリカルボン反応性基、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、および1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA）が挙げられる。

本発明のHSAリンカーは、組み換え発現された場合、ペプチド検出可能標識または診断剤に結合されてもよい。HSAリンカーとともに検出可能標識として用いられ得るペプチドおよびタンパク質としては限定するものではないが、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質およびエピトープタグが挙げられ、その各々は下に詳細に考察される。これらの検出可能標識の一つまたは複数がまた、治療剤、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤も含む本発明のHSAリンカーに組み込まれてもよい。

蛍光タンパク質または蛍光色素、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP;配列番号47）、増強GFP（eGFP）、黄色蛍光タンパク質（配列番号48;YFP）、シアン蛍光性タンパク質（配列番号49;CFP）、および赤色蛍光性タンパク質（配列番号50;RFPまたはDsRed）、を本発明のHSAリンカーに連結された検出可能標識として用いてもよい。蛍光性タンパク質は、蛍光性タンパク質のヌクレオチド配列をコードする発現ベクターでの細胞のトランスフェクションまたは形質導入の後に細胞（例えば、血球、例えば、リンパ球）中で組み換え発現され得る。光の刺激性の周波数に対する蛍光性タンパク質の曝露の際に、蛍光性タンパク質は、顕微鏡下で眼で、または光学画像デバイスによって観察できる光を低、中または高強度で放射するであろう。本発明の剤での診断配列として用いるのに適切な例示的な蛍光タンパク質は、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、例えば、米国特許第7,417,131号および同第7,413,874号に記載される。

生物発光性のタンパク質はまた、本発明のHSAリンカーに組み込まれる検出可能標識として用いられ得る。生物発光性タンパク質、例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ホタル（配列番号51）、ウミシイタケ（Renilla）（配列番号52）、およびキノコ（Omphalotus）のルシフェラーゼ）およびエクオリンは基質（例えば、ルシフェリンおよびセレンテラジン）との化学反応の一部として発光する。本発明の一態様では、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするベクターは、本発明の方法に従って形質導入またはトランスフェクトされている細胞（例えば、血球、例えば、リンパ球）の検出をインビボ、インビトロまたはエクスビボでもたらす。本発明の診断配列としての使用に適切な例示的な生物発光性タンパク質およびそれらの使用のための方法は、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、例えば、米国特許第5,292,658号、同第5,670,356号、同第6,171,809号、および同第7,183,092に記載される。

エピトープタグは、短いアミノ酸配列、例えば、5〜20アミノ酸残基長であって、このアミノ酸は、一旦細胞中で発現されるか、細胞から分泌されるか、または標的細胞に結合されれば検出を容易にする検出可能標識として、本発明のHSAリンカー中に組み込まれ得る。診断配列としてエピトープタグを組み込む本発明の剤は、エピトープタグに特異的な抗体、抗体フラグメント、または他の結合分子との相互作用のおかげで検出され得る。エピトープタグをコードするヌクレオチド配列は、天然の遺伝子の適切な部分をクローニングすることによって、またはエピトープタグをコードするポリヌクレオチドを合成することによって作製される。エピトープタグに結合する抗体、抗体フラグメントまたは他の結合分子は直接、検出可能標識（例えば、蛍光色素、放射性標識、重金属、または酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を組み込んでもよいし、またはそれ自体、このような標識を組み込む二次抗体、抗体フラグメントもしくは他の結合分子の標的として機能してもよい。診断配列として用いられ得る例示的なエピトープタグとしては、c-myc（配列番号33）、赤血球凝集素（HA;配列番号34）、およびヒスチジンタグ（His₆;配列番号35）が挙げられる。さらに、蛍光性タンパク質（例えば、GFP）および生物発光性タンパク質もエピトープタグとして、抗体、抗体フラグメントとして機能し得、他の結合分子がこれらのタンパク質の検出用に市販されている。

診断配列（例えば、蛍光性タンパク質、生物発光性タンパク質、またはエピトープタグ）を組み込む本発明のHSAリンカー、またはそれを発現するかもしくはそれに結合された任意の細胞のインビボ、インビトロまたはエクスビボでの検出、画像化または追跡は、顕微鏡、フローサイトメーター、照度計、または他には現況の光学画像化デバイス、例えば、IVIS（登録商標）Imaging System（Caliper LifeSciences,Hopkinton,MA）を用いて達成され得る。

本発明のHSAリンカーにカップリングされる治療剤または細胞毒性剤
本発明のHSAリンカータンパク質、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分は、疾患（例えば、癌、自己免疫疾患、または心血管系の疾患）または疾患の一つまたは複数の症状を治療、阻害、軽減または緩和するために投与され得る本発明の剤を形成するために任意の公知の細胞毒性部分または治療部分にカップリングされ得る。例としては、限定するものではないが、抗腫瘍剤、例えば:アシビシン;アクラルビシン;塩酸アコダゾール;アクロニン;アドゼレシン;アドリアマイシン;アルデスロイキン;アルトレタミン;アンボマイシン（Ambomycin）;酢酸アメタントロン（A.metantrone）;アミノグルテチミド;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペルリン（Asperlin）;アザシチジン;アゼテパ（Azetepa）;アゾトマイシン（Azotomycin）;バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;塩酸ビサントレン;ビスナフィドメシル酸塩（Bisnafide Dimesylate）;ビセレシン;硫酸ブレオマイシン;ブレキナルナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カンプトテシン;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチン;カルムスチン;塩酸カルビシン;カルゼレシン;セデフィンゴール;クロラムブシル;シロレマイシン;シスプラチン;クラドリビン;コンブレテスタチンA-4;クリスナトールメシル酸塩;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;DACA（N-［2-（ジメチル-アミノ）エチル］アクリジン-4-カルボキサミド）;ダクチノマイシン;塩酸ダウノルビシン;ダウノマイシン;デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;デザグアニンメシル酸塩;ジアジクォン（Diaziquone）;ドセタキセル;ドラサチン;ドキソルビシン;塩酸ドキソルビシン;ドロロキシフェン;ドロロキシフェンクエン酸塩;プロピオン酸ドロモスタノロン;デュアゾマイシン（Duazomycin）;エダトレキサート;塩酸エフロールニチン;エリプチシン;エルサミトルシン（Elsamitrucin）;エンロプラチン;エンプロマート;エピプロピジン;塩酸エピルビシン;エルブロゾール（Erbulozole）;塩酸エソルビシン（Esorubicin）;エストラムスチン;エストラムスチンリン酸ナトリウム;エタニダゾール;エチオダイズド油I131;エトポシド;リン酸エトポシド;エトプリン（Etoprine）;塩酸ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;リン酸フルダラビン;フルオロウラシル;5-FdUMP;フルオロシタビン;ホスキドン;ホストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;塩酸ゲムシタビン;金Au198;ホモカンプトテシン;ヒドロキシ尿素;塩酸イダルビシン;イホスファミド;イルモホシン;インターフェロンα-2a;インターフェロンα-2b;インターフェロンα-n1;インターフェロンα-n3;インターフェロンβ-Ia;インターフェロンγ-Ib;イプロプラチン;塩酸イリノテカン;ランレオチド酢酸;レトロゾール;酢酸リュープロリド;リアロゾール塩酸塩;ロメトレキソールナトリウム;ロムスチン;塩酸ロソキサントロン;マソプロコール;メイタンシン;塩酸メクロレタミン;酢酸メゲストロール;メレンゲストロール酢酸;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキサート;メトトレキサートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;ミトカルシン（Mitocarcin）;ミトクロミン;ミトジリン（Mitogillin）;ミトマルシン（Mitomalcin）;マイトマイシン;ミトスペル（Mitosper）;ミトタン;塩酸ミトキサントロン;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペガスパルガーゼ;ペリオマイシン（Peliomycin）;ペンタムスチン（pentamustine）;硫酸ペプロイシン;ペルホスファミド;ピポブロマン;ピポスルファン;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン;塩酸プロカルバジン;ピューロマイシン;塩酸ピューロマイシン;ピラゾフリン;リゾキシン;リゾキシンD;リボプリン;ログレチミド;サフィンゴール;塩酸サフィンゴール;セムスチン;シムトラゼン;スパルフォセートナトリウム;スパルソマイシン;塩酸スピロゲルマニウム;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;塩化ストロンチウムSr89;スロフェヌル;タリソマイシン;タクサン;タキソイド;テコガラン（Tecogalan）ナトリウム;テガフール;塩酸テロキサントロン;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チミタック（Thymitaq）;チアゾフリン;チラパザミン;トムデックス;TOP53;塩酸トポテカン;クエン酸トレミフェン;酢酸トレストロン（Trestolone）;リン酸トリシリビン;トリメトレキサート;グルクロン酸トリメトレキサート;トリプトレリン;塩酸ツブロゾール;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;ビンブラスチン;硫酸ビンブラスチン;ビンクリスチン;硫酸ビンクリスチン;ビンデシン;硫酸ビンデシン;硫酸ビネピジン（Vinepidine）;硫酸ビングリシネート（Vinglycinate）;硫酸ビンロイロシン（Vinleurosine）;酒石酸ビノレルビン;硫酸ビンロシジン（Vinrosidine）;硫酸ビンゾリジン;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;塩酸ゾルビシン;2-クロロデオキシアデノシン;2'-デオキシホルマイシン（Deoxyformycin）;9-アミノカンプトテシン;ラルチトレキセド;N-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸;2-クロロ-2'-アラビノ-フルオロ-2'-デオキシアデノシン;2-クロロ-2'-デオキシアデノシン;アニソマイシン;トリコスタチンA;hPRL-G129R;CEP-751;リノミド（linomide）;硫黄マスタード;ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン）;シクロホスファミド;メルファラン（melphalan）;クロラムブシル;イホスファミド;ブスルファン;N-メチル-N-ニトロソ尿素（MNU）;N、N'-Bis（2-クロロエチル）-N-ニトロソ尿素（BCNU）;N-（2-クロロエチル）-N'-シクロヘキシル-イル-N-ニトロソ尿素（CCNU）;N-（2-クロロエチル）-N'-（トランス-4-メチルシクロヘキシル-N-ニトロソ尿素（MeCCNU）;N-（2-クロロエチル）-N'-（ジエチル）エチルホスホン酸-N-ニトロソ尿素（フォテムスチン）;ストレプトゾトシン;ダカルバジン（DTIC）;ミトゾロミド;テモゾロマイド;チオテパ;マイトマイシンC;AZQ;アドゼレシン;シスプラチン;カルボプラチン;オルマプラチン;オキサリプラチン;C1-973;DWA2114R;JM216;JM335;ビス（白金）;トムデックス;アザシチジン;シタラビン;ゲムシタビン;6-メルカプトプリン;6-チオグアニン;ヒポキサンチン;テニポシド9-アミノカンプトテシン;トポテカン;CPT-11;ドキソルビシン;ダウノマイシン;エピルビシン;ダルビシン;ミトキサントロン;ロソキサントロン;ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）;アムサクリン;ピラゾロアクリジン;オールトランスレチノール;14-ヒドロキシレトロレチノール;オールトランスレチノイン酸;N-（4-ヒドロキシフェニル）レチナミド;13-シス-レチノイン酸;3-メチルTTNEB;9-シス-レチノイン酸;フルダラビン（2-F-アラ-AMP）;または2-クロロデオキシアデノシン（2-Cda）が挙げられる。

他の治療用化合物としては限定するものではないが、20-ピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3;5-エチニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール;アドゼレシン;アルデスロイキン;ALL-TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドックス;アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラホリド;脈管形成インヒビター;アンタゴニストD;アンタゴニストG;アンタレリックス;抗背側化形態形成タンパク-1（anti-dorsalizing morphogenetic protein-1）;抗アンドロゲン、前立腺癌;抗エストロゲン;抗新生物薬;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィジコリングリシネート;アポトーシス遺伝子モジュレーター;アポトーシス調節因子類;アプリン酸;アラ-CDP-DL-PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アシュラクリン;アタメスタン;アトリムスチン;アクシナスタチン1;アクシナスタチン2;アクシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン;アザチロシン;バッカチンIII誘導体類;バラノール;バチマスタット;BCR/ABLアンタゴニスト類;ベンゾクロリン類;ベンゾイルスタウロスポリン;βラクタム誘導体類;β-アレチン;ベタクラマイシンB;ベツリン酸;bFGFインヒビター;ビカルタミド;ビサントレン;ビサジリジニルスペルミン;ビスナフィド;ビストラテンA;ビゼレシン;ブレフレート;ブレオマイシンA2;ブレオマイシンB2;ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルホキシイミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトテシン誘導体類（例えば、10-ヒドロキシ-カンプトテシン）;カナリポクスIL-2;カペシタビン;カルボキサミド-アミノ-トリアゾール;カルボキサミドトリアゾール;CaRest M3;CARN 700;軟骨由来インヒビター;カルゼレシン;カゼインキナーゼインヒビター類（ICOS）;カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリックス;クロリン（chlorins）;クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;シス-ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェンアナログ類;クロトリマゾール;コリスマイシンA;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチンアナログ;コナゲニン;クラムベスシジン816（crambescidin 816）;クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体類;クラシンA;シクロペンタントラキノン類;シクロプラタム;シペマイシン;シタラビンオクホスファート;細胞溶解因子;サイトスタチン;ダクリキシマブ;デシタビン;デヒドロジデムニンB;2'デオキシコホルマイシン（DCF）;デスロレリン;デキシホスファミド;デキシラゾキサン;デキシベラパミル;ジアジクオン;ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ-5-アザシチジン;ジヒドロタキソール,9-;ジオキサマイシン;ジフェニルスピロムスチン;ジスコデルモリド;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;デュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン;エドレコロマブ;エフロルニチン;エレメン;エミテフール;エピルビシン;エポチロン類（A、R＝H;B、R＝Me）;エピチロン類;エプリステリド;エストラムスチンアナログ;エストロゲンアンタゴニスト類;エストロゲンアンタゴニスト類;エタニダゾール;エトポシド;エトポシド4'-ホスフェート（エトポホス（etopofos））;エキセメスタン;ファドロソール;ファザラビン;フェンレチニド;フィルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン;フルダラビン;塩酸フルオロダウノルニシン;ホルフェニメックス;ホルメスタン;ホストリエシン;フォテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;硝酸ガリウム;ガロシタビン;ガニレリックス;ゼラチナーゼインヒビター類;ゲムシタビン;グルタチオンインヒビター類;ヘプスルファム;ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ホモハリントニン（HHT）;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマノトン;イルモホシン;イロマスタット;イミダゾアクリドン類;イミキモド;免疫刺激ペプチド類;インスリン様成長因子-1レセプターインヒビター;インターフェロンアゴニスト類;インターフェロン類;インターロイキン類;イオベングアン;ヨードドキソルビシン;イポメアノール,4-;イリノテカン;イロプラクト;イルソグラジン;イソベンガゾール;イソホモハリコンドリンB;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリドF;三酢酸ラメラリン-N;ラノレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;硫酸レンチナン;レプトールスタチン;レトロゾール;白血病抑制因子;白血球αインターフェロン;ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン;ロイプロレリン;レバミソール;リアロゾール;線状ポリアミンアナログ;親油性二糖類ペプチド;親油性白金化合物;リソクリナミド7;ロバプラチン;ロムブリシン;ロメトレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロバスタチン;ロキソルビシン;ルートテカン（lurtotecan）;ルテチウムテキサフィリン;リゾフィリン;溶菌ペプチド;メイタンシン;マンノスタチンA;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリリシンインヒビター;マトリックスメタロプロテアーゼインヒビター;メノガリル;メルバロン;メテレリン;メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIFインヒビター;イフェプリストン;ミルテホシン;ミリモスチム;ミスマッチ二本鎖RNA;ミトラシン;ミトグアゾン;ミトラクトール;マイトマイシンアナログ類;ミトナフィド;ミトトキシン線維芽細胞増殖因子サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム;モノクローナル抗体;ヒト絨毛性ゴナドトロピン;モノホスホリルリピドA＋ミオバクテリア細胞壁sk;モピダモール;多剤耐性遺伝子インヒビター;多発性腫瘍抑制因子-1ベースの療法;マスタード抗癌剤;ミカペルオキシドB;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ミリアポロン;N-アセチルジナリン;N-置換ベンズアミド類;ナファレリン;ナグレスチップ;ナロキソン＋ペンタゾシン;ナパビン;ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン;ネリドロン酸;中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド;ニサマイシン;酸化窒素モジュレーター類;ニトロキシド抗酸化物質;ニトルリン;06-ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン;オリゴヌクレオチド類;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;オラシン;経口サイトカイン誘導物質;オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン;パクリタキセルアナログ類;パクリタキセル誘導体類;パラウアミン（palauamine）;パルミトイルリゾキシン;パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン;パゼルリプチン;ペガスパルガーセ;ペルデシン;ペントサン多硫酸ナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール;ペルフルブロン;ペルホスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;フェニルアセテート;ホスファターゼインヒビター類;ピシバニル;塩酸ピロカルピン;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチンA;プラセチンB;プラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビター;白金錯体;白金化合物類;白金-トリアミン複合体;ポドフィロトキシン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プロピルビス-アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソームインヒビター類;プロテインAベースの免疫調節物質;プロテインキナーゼCインヒビター;プロテインキナーゼCインヒビター類、微小藻類（microalgal）;プロテインチロシンホスファターゼインヒビター類;プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター類;プルプリン類;ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート;rafアンタゴニスト類;ラルチトレキセド（raltitrexed）;ラモステロン;rasファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター類;rasインヒビター類;ras-GAPインヒビター;ジメチル化レテルリプチン;エチドロン酸レニウムRe 186;リゾキシン;リボザイム;RIIレチナミド;ログレチミド;ロヒツカイン（rohitukine）;ロムルチド;ロキニメックス;ルビジノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム;Sdi 1模倣物類;セムスチン;老化誘導インヒビター1（senescence derived inhibitor 1）;センスオリゴヌクレオチド類;シグナル伝達インヒビター類;シグナル伝達モジュレーター類;一本鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン;ソブゾキサン;ナトリウムボロカプテート;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール;ソマトメジン結合蛋白;ソネルミン;スパルホス酸（sparfosic acid）;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンジスタチン1;スクアラミン;幹細胞インヒビター;幹細胞分裂インヒビター類;スチピアミド、ストロメリシンインヒビター類;スルフィノシン;過活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ;スラミン;スワインソニン;合成グリコサミノグリカン類;タリムスチン;タモキシフェンメチオダイド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール;テルルラピリリウム;テロメラーゼインヒビター類;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;サリブラスチン;サリドマイド;チオコラリン;トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣物;チマルファシン;サイモポイエチンレセプターアゴニスト;サイモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズ・エチル・エチオプルプリン;チラパザミン;チタノセンジクロライド;トポテカン;トプセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳インヒビター;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼインヒビター類;チルホスチン類;UBCインヒビター類;ウベニメックス;尿生殖洞由来成長阻害因子;ウロキナーゼレセプターアンタゴニスト類;バプレオチド;バリオリンB;ベクター系、赤血球遺伝子療法;ベラレゾール;ベラミン;ベルジン類;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;ビタキシン;ボロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブおよびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。

本発明のHSAリンカー剤はまた、部位特異的にコンジュゲートされた分子および部分も包含し得る。部位特異的なコンジュゲーションによって、例えば、抗チューブリン剤、DNAマイナー・グルーブ・バインダー、DNA複製インヒビター、アルキル化剤類、アントラサイクリン類、抗生物質類、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法剤または放射線増感剤、デュオカルマイシン類、エトポシド類、フッ化ピリミジン類、イオノフォア類、レキシトロプシン類、ニトロソ尿素類、プラチノール類、プリン代謝拮抗剤類、ピューロマイシン類、ステロイド類、タキサン類、トポイソメラーゼインヒビター類、およびビンカアルカロイド類、または本明細書に記載の任意の他の分子もしくは部分を含めて細胞毒性剤、免疫調節剤または細胞増殖抑制剤の、HSAリンカー中の特異的な残基に対する制御された化学量論的結合が可能になる。

タンパク質に対して、特に抗体に対して治療剤をコンジュゲートするための技術は周知である（例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeldら、編集、Alan R.Liss,Inc.,1985);Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」Controlled Drug Delivery(Robinsonら、編集、Marcel Dekker, Inc.,第2版、1987);Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications(Pincheraら、編集、1985);「Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwinら、編集,Academic Press,1985);Thorpeら、Immunol.Rev.62:119〜58(1982);ならびにDoroninaら、「Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy」,Nature Biotech. 21:(7)778〜784(2003))。また、例えば、PCT国際公開公報番号WO 89/12624も参照のこと。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、溶解性ペプチドにカップリングして本発明の剤を形成してもよい。このような溶解性ペプチドは、細胞死を誘導し、このペプチドとしては限定するものではないが、ストレプトリシンO;イソギンチャク（stoichactis）の毒素;ファロリシン（phallolysin）;ブドウ球菌（staphylococcus）のα毒素;ホロスリンA;ジギトニン;メリチン;リゾレシチン;カルジオトキシン;およびヒモムシ（cerebratulus）のA毒素（Kemら、J.Biol.Chem.253（16）:5752〜5757,1978）が挙げられる。本発明の剤はまた、本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分（例えば、抗体または抗体フラグメントコンジュゲート）を、任意の天然に存在するペプチドリシン類といくつかの配列相同性または化学的特徴を共有する合成ペプチドに対してコンジュゲートすることによって形成され得る;このような特徴としてが限定するものではないが、直線性、正の荷電、両親媒性および疎水性環境におけるαらせん構造の形成が挙げられる（Leuschnerら、Biology of Reproduction 73:860〜865,2005）。本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、例えば、免疫グロブリンFcサブユニットのような補体媒介性細胞溶解を誘発する剤にカップリングされてもよい。本発明のHSAリンカー、またはそこにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、酵素のホスホリパーゼファミリーの任意のメンバー（例としては、ホスホリパーゼA、ホスホリパーゼB、ホスホリパーゼC、またはホスホリパーゼD）に対して、またはその触媒活性サブユニットに対してカップリングされ得る。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、検出または治療の適用のために用いられ得る剤を形成するために放射性剤にカップリングされてもよい。用いられ得る放射性剤としては限定するものではないが、フィブリノーゲン¹²⁵I;フルデオキシグルコース¹⁸F;フルオロドーパ¹⁸F;インスリン¹²⁵I;インスリン¹³¹I;ロベングアン¹²³I;ヨージパミドナトリウム¹³¹I;ヨードアンチピリン¹³¹I;ヨードコレステロール¹³¹I;ヨード馬尿酸ナトリウム¹²³I;ヨード馬尿酸ナトリウム¹²⁵I;ヨード馬尿酸ナトリウム¹³¹I;ヨードピラセト¹²⁵I;ヨードピラセト¹³¹I;ロフェタミン塩酸塩¹²³I;イオメシン¹²⁵I;イオメシン¹³¹I;ヨータラム酸ナトリウム¹²⁵I;ヨータラム酸ナトリウム¹³¹I;チロシン¹³¹I;リオチロニン¹²⁵I;リオチロニン¹³¹I;メリソプロールアセテート¹⁹⁷Hg;メリソプロールアセテート²⁰³Hg;メリソプロール¹⁹⁷Hg;セレノメチオニン⁷⁵Se;テクネチウム^99mTc三硫化アンチモンコロイド;テクネチウム^99mTcビシセート;テクネチウム^99mTcジソフェニン;テクネチウム^99mTcエチドロネート;テクネチウム^99mTcイクサメタジム;テクネチウム^99mTcフリフォスミン;テクネチウム^99mTcグルセプテート;テクネチウム^99mTcリドフェニン;テクネチウム^99mTcメブロフェニン;テクネチウム^99mTcメドロネート;テクネチウム^99mTcメドロネート二ナトリウム;テクネチウム^99mTcメルチアチド;テクネチウム^99mTcオキシドロネート;テクネチウム^99mTcペンテテート;テクネチウム^99mTcペンテテートカルシウム三ナトリウム;テクネチウム^99mTcセスタミビ;テクネチウム^99mTcシボロキシム;テクネチウム^99mTcスクシマー;テクネチウム^99mTcイオウコロイド;テクネチウム^99mTcテボロキシム;テクネチウム^99mTcテトロフォスミン;テクネチウム^99mTcチアチド;チロキシン¹²⁵I;チロキシン¹³¹I;トルポビドン¹³¹I;トリオレイン¹²⁵I;またはトリオレイン¹³¹Iが挙げられる。

さらに、放射性同位体は、HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートに対して部位特異的にコンジュゲートされ得る。利用可能な反応性基を用いて、¹²³I^、124I^、125I^、131I^、99mTc^、111In^、64Cu^、67Cu^、186Re^、188Re^、177Lu^、90Y^、77As^、72As^、86Y^、89Zr^、211At^、212Bi^、213Bi、または²²⁵Acを含めて放射性同位体の標識のために部位特異的二機能性キレート剤をコンジュゲートしてもよい。

HSAリンカーまたはHSAリンカーコンジュゲートに組み込まれるか、またはカップリングされた治療剤または細胞毒性剤はさらに、例えば、抗癌補助的増強剤を含んでもよく、これには限定するものではないが以下が挙げられる:三環系抗うつ薬（例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、トリミプラミン、ドキセピン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、アモキサピンおよびマプロチリン）;非環系抗うつ剤（例えば、セルトラリン、トラゾドンおよびシタロプラム）;Ca^2＋アンタゴニスト（例えば、ベラパミル、ニフェジピン、ニトレンジピンおよびカロベリン）、カルモジュリンインヒビター（例えば、プレニルアミン、トリフルオロペラジン、およびクロミプラミン）;アンホテリシンB;トリパラノールアナログ類（例えば、タモキシフェン）;抗不整脈薬類（例えば、キニジン）;抗高血圧薬類（例えば、レセルピン）;チオール枯渇剤（例えば、ブチオニンおよびスルホキシミン）ならびに多剤耐性低減剤、例えばクレマホル（Cremaphor）EL。

HSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分を含む本発明の剤はまた、サイトカイン（例えば、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロン-α、および腫瘍壊死因子-α）にカップリングされてもよいし、または一緒に投与されてもよい。本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、代謝拮抗剤にカップリングされてもよい。代謝拮抗剤類としては限定するものではないが、以下の化合物およびそれらの誘導体が挙げられる:アザチオプリン、クラドリビン、シタラビン、ダカルバジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビンクロルハイドレート（gencitabine chlorhydrate）、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトブロニトール、ミトタン、プログアニルクロルハイドレート、ピリメタミン、ラルチトレキセド、トリメトレキセートグルクロネート、ウレタン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチンなど。より好ましくは、本発明のHSAリンカーまたはコンジュゲートは、葉酸タイプの代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート、プログアニルクロルハイドレート、ピリメタニン、トリメトプリン、またはトリメトレキセートグルクロネートを含むあるクラスの薬剤、またはこれらの化合物の誘導体にカップリングされてもよい。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、限定するものではないが、アクラルビシンクロルハイドレート、ダウノルビシンクロルハイドレート、ドキソルビシンクロルハイドレート、エピルビシンクロルハイドレート、イダルビシンクロルハイドレート、ピラルビシン、またゾルビシンクロルハイドレート;カンプトテシン、またはその誘導体もしくは関連の化合物、例えば、10,11メチレンジオキシカンプトテシン;または種々の構造的に関連した化合物を含むメイタンシノイドファミリーの化合物のメンバー、例えば、アンサミトシンP3、メイタンシン、2'-N-デメチルメイタンブチン、およびメイタンビシクリノールを含めたアントラサイクリンファミリーの腫瘍剤にカップリングされてもよい。

本発明のHSAリンカー、またはそれにコンジュゲートされた任意の分子もしくは部分はまた、公知の化学的な方法を用いて細胞毒性剤もしくは治療剤に直接カップリングされてもよいし、または間接的な結合を介して細胞毒性剤もしくは治療剤に間接的にカップリングされてもよい。例えば、HSAリンカーは、細胞毒性剤または治療剤に結合されるキレート基に結合されてもよい。キレート基としては限定するものではないが、イニノカルボン（ininocarboxylic）およびポリアミノポリカルボン反応性基、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、および1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA）が挙げられる。一般的な方法については、例えば、Liuら、Bioconjugate Chem.12(4):653,2001;Chengら、WO 89/12631;Kiefferら、WO 93/12112;Albertら、U.S.P.N.5,753,627;およびWO 91/01144（その各々が参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

例えば、HSAリンカー,一つまたは複数の結合部分（本明細書に記載のとおり、ペプチドコネクターの介在は有無がある）、および治療剤または細胞毒性剤を含む本発明の剤は細胞または組織に対して結合部分（例えば、抗体,抗体フラグメント、またはレセプター/リガンド）によって特異的に標的され得、それによって結合部分が指向される標的細胞または組織の選択的な破壊が可能になる。例えば、本発明の剤を用いて、肺、乳房、前立腺および結腸の癌細胞を標的および破壊して、この剤がこれらの器官における癌細胞に特異的に結合する結合部分を含む場合、これらの器官に由来する癌を予防、安定化、その進行を阻害、または治療してもよい。また、例えば、本発明の剤を用いて、脈管構造、脳、肝臓、腎臓、心臓、肺、前立腺、結腸、上咽頭、中咽頭、咽頭、気管支および皮膚の細胞を標的および破壊して、加齢に関する、タバコに関する、または自己免疫疾患またはこれらの器官に関連する状態を、自己免疫疾患の場合には、例えば、自己反応性のT細胞を標的することによって（例えば、自己反応性T細胞に存在する腫瘍壊死因子レセプター2（TNFR2）に結合して拮抗することによって）、予防、安定化、その進行を阻害、または治療してもよい。

本発明のHSAリンカーは、組み換え的に発現された場合、細胞毒性ポリペプチドに結合されてもよい。細胞毒性ポリペプチドは、標的細胞（例えば、癌細胞）と接触された場合、その細胞に対して細胞毒性または細胞増殖抑制の効果を発揮する。例えば、細胞毒性ポリペプチドは、本発明のHSAリンカーと連結された場合、標的細胞に結合の際、標的細胞中で、細胞死をもたらす事象、例えば、アポトーシス、壊死または老化を誘発し得る。あるいは、本発明のHSAリンカーに連結された細胞毒性ポリペプチドは、正常な細胞生物学的活性、例えば、分裂、代謝および増殖、または異常な細胞生物学的活性、例えば、転移を妨害または阻害し得る。

例えば、カスパーゼ3に連結された本発明のHSAリンカーは、標的細胞（例えば、癌細胞）に結合して、エンドサイトーシスを受けるであろう。標的細胞によって一旦内部移行されれば、HSAリンカーコンジュゲートのカスパーゼ部分は、アポトーシス促進性のカスパーゼカスケードを開始し得、最終的には標的細胞のアポトーシスを生じる。

好ましい態様では、本発明のHSAリンカーは、癌細胞を殺傷し得る細胞毒性ポリペプチドを含む。本発明の別の態様では、この細胞毒性ポリペプチドは、癌細胞の増殖または転移を阻害する。本発明のHSAリンカーと連結された細胞毒性ポリペプチドはまた、固形腫瘍に還流する血管を形成する内皮細胞などの癌増殖に関連するか、必須であるかまたは有益である細胞の増殖を殺傷または阻害するために用いられ得る。

一態様では、本発明のHSAリンカーは、標的細胞（例えば、癌細胞）に対する細胞毒性効果または細胞増殖抑制効果の特異性、強度または期間を調節する（例えば、増大する）ように2つ以上の細胞毒性ポリペプチドを含んでもよい。

別の態様では、本発明のHSAリンカーは、細胞毒性ポリペプチド（例えば、酵素または薬物による切断の際に活性化し得る、生物学的に不活性なプロ薬剤）の活性化可能型に連結される。この態様では、細胞毒性ポリペプチドを切断し得る酵素または薬物に対するこの細胞毒性ポリペプチドプロ薬剤の曝露（例えば、インビボ）は、この細胞毒性ポリペプチドを生物学的に活性（例えば、細胞毒性または細胞増殖抑制）にする。本発明のHSAリンカーとの使用について生物学的に活性型に変換され得る生物学的に不活性な細胞毒性ポリペプチドの例はプロカスパーゼ（例えば、プロカスパーゼ8または3）である。例えば、本発明のHSAリンカーのプロカスパーゼ8ドメインは、標的細胞（例えば、癌細胞）による内部移行の際にTRAILまたはFasLによって切断され得る。一旦切断されれば、生物学的に活性なカスパーゼ8は、標的細胞のアポトーシスを促進し得る。

本発明の一態様では、本発明のHSAリンカーに連結された細胞毒性ポリペプチドは、細胞毒性または細胞増殖抑制の特性を有することが公知の全長のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント（例えば、「死ドメイン」）を含んでもよい。細胞毒性または細胞増殖抑制の特性を有するペプチド類、ポリペプチド類、またはタンパク質類は、本発明の剤への細胞毒性配列の組み込みを容易にするために変更されてもよい（例えば、アミノ酸の置換、変異、短縮、または付加を作製することによって）。望ましい変更としては、例えば、タンパク質の発現、寿命、細胞分泌および標的細胞毒性を容易にするアミノ酸配列への変化が挙げられる。

本発明はまた、任意で結合部分およびポリペプチドコネクターを含めて、本発明のHSAリンカーとの融合タンパク質として細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子を特徴とする。核酸分子はベクター（例えば、発現ベクター）に組み込まれてもよく、この結果、このベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞中での本発明のHSAリンカーの発現の際に、この細胞毒性ポリペプチド、HSAリンカー、および結合部分が、もし存在すれば、作動可能に連結される（例えば、融合されるか、隣接して連結されるか、または一緒につながれる）。本発明の細胞毒性ポリペプチドとして用いられ得るペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の例としては限定するものではないが、アポトーシス誘発性タンパク質、例えば、シトクロムc（配列番号39）;カスパーゼ（例えば、カスパーゼ3（配列番号36）およびカスパーゼ8（配列番号37））;プロカスパーゼ、グランザイム（例えば、グランザイムAおよびB（配列番号38））;腫瘍壊死因子（TNF）およびTNFレセプターファミリーのメンバー、例としては、TNF-α（TNFα;配列番号40））、TNF-β、Fas（配列番号41）およびFasリガンド;Fas-関連死ドメイン様IL-1β変換酵素（FLICE）;TRAIL/APO2L（配列番号45）およびTWEAK/APO3L（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2005/0187177号を参照のこと）;Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバー、例としては、Bax（配列番号46）、Bid、Bik、Bad（配列番号42）、Bak、およびRICK（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2004/0224389号を参照のこと）;血管アポトーシス誘発性タンパク質1および2（VAP1およびVAP2;Masudaら、Biochem.Biophys.Res.Commun.278:197〜204（2000））;ピエリシン（pierisin）（配列番号44;Watanabeら、Biochemistry 96:10608〜10613（1999））;アポトーシス誘発性タンパク質（配列番号43;AIP;Murawakaら、Nature 8:298〜307（2001））;IL-1αプロピースポリペプチド（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,191,269号を参照のこと）;アポプチンおよびアポプチン関連タンパク質、例えば、AAP-1（例えば、参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願公開第EP 1083224号を参照のこと）;抗血管形成因子、例えば、エンドスタチンおよびアンギオスタチン;ならびに他のアポトーシス誘発性タンパク質、例としては、各々が参照により本明細書に組み入れられる以下の国際特許出願公開公報番号および米国特許出願公開:米国特許出願公開第2003/0054994号、同第2003/0086919号、同第2007/0031423号、WO 2004/078112、WO 2007/012430、およびWO 2006/0125001（デルタ1およびジャグド（jagged）1の細胞内ドメイン）に記載されるものが挙げられる。

野性型HSAリンカーコンジュゲート
本発明はまた、天然に存在する野性型HSAリンカー（このアミノ酸およびヌクレオチドの配列はそれぞれ配列番号3および4に示す）を、本発明の結合剤、診断剤または治療剤の形成に包含する。配列番号3に列挙されるアミノ酸配列を有するHSAリンカーを利用する本発明の全ての態様では、一つまたは複数のポリペプチドコネクターを、上記のとおり、HSAリンカーのアミノ末端および/またはカルボキシ末端に共有結合させるか、またはHSAリンカー配列内のアミノ酸残基に共有結合させて、一つまたは複数の結合部分のコンジュゲーションを容易にする。

短縮
本発明はさらに、一つまたは複数のポリペプチドコネクターまたは結合部分と組み合わされ得る、短縮された野性型ポリペプチドを用いて形成されるコンジュゲートを特徴とする。全長の野性型HSAアミノ酸配列（すなわち、配列番号3）のアミノ酸のうち1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、200またはそれ以上を欠いている野性型HSAポリペプチドを、本明細書において記載されるような任意の結合部分または診断剤または治療剤に結合してもよい。短縮は、HSAリンカーの一端または両端に存在してもよいし、または内部残基の欠失があってもよい。2つ以上のアミノ酸残基の短縮は直線である必要はない。本発明の野性型HSAリンカーの例としては、一つまたは複数のポリペプチドコネクター、または結合部分、一つまたは複数のドメインI（配列番号56;配列番号3の残基1〜197）、ドメインII（配列番号54;配列番号3の残基189〜385）、もしくはドメインIII（配列番号57;配列番号3の残基381〜585）、またはそれらの組み合わせ、例えば、ドメインIとII、IとIII、およびIIとIIIと組み合わせて有するHSAリンカーが挙げられる。

本発明のコンジュゲート（例えば、二重特異性のHSA-薬物、または放射性同位体含有剤）の血清クリアランス速度は、上記のような短縮型の野性型HSAリンカーを含むコンジュゲートを試験することによって最適化され得る。

追加的なHSAリンカー修飾
本発明はさらに、HSAリンカーポリペプチド中のアミノ酸残基の部位特異的な化学的修飾を提供する。HSAの正確に折り畳まれた三次構造は、タンパク質の外面上で特定のアミノ酸残基を示す。化学的に反応性のアミノ酸残基（例えば、システイン）がこれらの表面露出した残基に代わってもよく、これによって診断剤または治療剤の部位特異的コンジュゲーションが可能になり得る。

本発明はまた、HSAリンカーポリペプチド配列からアスパラギン、セリンまたはトレオニン残基の追加または除去をもたらし、これらのアミノ酸残基のグリコシル化を改変する。HSAリンカーに添加されたグリコシル化部位は好ましくは、本明細書において考察されるように、表面露出される。HSAリンカー中に導入されたグリコシルまたは他の炭水化物部分は、診断剤、治療剤または細胞毒性剤に直接コンジュゲートされてもよい。

システイン（チオール）コンジュゲーション
本発明は、診断剤、治療剤または細胞毒性剤の化学的コンジュゲーションを可能にするためのシステイン残基によるHSAリンカーポリペプチドの表面露出アミノ酸残基の置換を特徴とする。HSAリンカーポリペプチドの表面に露出したシステイン残基（その天然の三次構造に折り畳まれる場合）によって、マレイミドまたはハロアセチルなどのチオール反応性基に対する診断剤、治療剤または細胞毒性剤の特異的なコンジュゲーションが可能になる。マレイミド基に対するシステイン残基のチオール官能基の求核反応性は、リジン残基のアミノ基またはN末端アミノ基などのタンパク質における任意の他のアミノ酸官能性と比較して約1000倍高い。ヨードアセチルおよびマレイミド試薬におけるチオール特異的官能性はアミン基と反応し得るが、さらに高いpH（＞9.0）およびさらに長い反応時間が必要とされる（Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,Academic Press,London）。タンパク質中の遊離チオールの量は、標準的なエルマン・アッセイを用いて評価され得る。いくつかの場合には、ジチオスレイトール（DTT）またはセレノールなどの試薬でのジスルフィド結合の還元（Singhら、Anal.Biochem.304:147〜156（2002））が、反応性の遊離チオールを生成するために必要である。

システイン置換の部位は、HSAリンカーの表面接触性の分析によって特定され得る（例えば、置換のために適切なセリンおよびトレオニン残基の特定は下記の実施例1に記載される）。表面接触性は、溶媒分子、例えば、水によって接触され得る表面積（例えば、平方オングストローム）として表現され得る。水の占有空間は1.4オングストロームの半径を有する球に近似される。タンパク質の各々のアミノ酸の表面接触性を算出するためのソフトウェアは自由に入手可能であるかまたは使用許可され得る。例えば、CCP4スイート（Suite）の結晶学プログラムは、公知のx線結晶学由来の座標を用いてタンパク質の各々のアミノ酸の表面接触性を算出するためのアルゴリズムを使用する（「The CCP4 Suite:Programs for Protein Crystallography」Acta.Cryst.D50:760〜763（1994）;www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html）。溶媒接触性はまた、スイスバイオインフォマティックス研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）からダウンロードしたフリーのソフトウェアDeep View Swiss PDB Viewerを用いて評価され得る。表面露出部位でのシステインの置換によって、診断剤または治療剤に連結したチオール反応性基に対する反応性システインのコンジュゲーションが可能になる。

グリコシル化
さらに、変更された血清クリアランス速度は、HSAリンカー中にグリコシル化部位を操作することによって達成され得る。特定の態様では、本発明のHSAリンカーはグリコシル化される。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN-連結されるかまたはO-連結される。N-連結とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-トレオニン（ここでXはプロリン以外の任意のアミノ酸に相当する）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって、可能性のあるグリコシル化部位が作製される。O-連結グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに対する糖N-アセチルガラクトサミン（aceylgalactosamine）、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つの結合を指すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンを用いてもよい。

HSAリンカーへのグリコシル化部位の付加または欠失は、アミノ酸配列を変更することによって都合よく達成され、その結果上記のトリペプチド配列のうちの一つまたは複数（N-連結グリコシル化部位について）が作製される。この変更はまた、もとのHSAリンカーの配列に対する一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加、欠失または置換によって作製され得る（O-連結グリコシル化部位について）。HSA上の得られた炭水化物構造はまた、上記のような細胞毒性剤、免疫調節剤、または細胞増殖抑制剤の部位特異的なコンジュゲーションに用いられてもよい。

治療剤と組み合わせたHSAリンカー剤
本発明はさらに、本明細書において記載されるHSAリンカー剤と、本明細書に記載される治療剤、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤のうち一つまたは複数との投与を提供する。例えば、乳癌に罹患している患者は、ErbB2を含むHSAリンカーを投与されてもよく、そしてErbB3 scFvs（例えば、B2B3-1）は、例えば、ドキソルビシン、シクロホスファミド、およびパクリタキセルと同時投与されてもよく、これは、乳癌の治療のための一般的な化学療法の投与計画である。癌の治療のために有用な追加の生物学的および化学的な剤はアペンディクスCに列挙される。

放射線療法または手術と組み合わせたHSAリンカー剤
本発明は、化学療法または手術の前、同時または後に本発明のHSAリンカー剤の投与を提供する。例えば、増殖性障害（例えば、乳癌）に罹患している患者は、HSAリンカー剤を単独で投与されてもよいし、または、癌組織の部位で標的化放射線療法または外科的介入（例えば、腫瘍摘出手術または乳房切除術）と同時に本明細書に記載の他の治療剤、細胞毒性剤もしくは細胞毒性剤と組み合わせて投与されてもよい。本発明のHSAリンカー剤と組み合わせた使用に適切な放射線療法としては、近接照射療法および標的化術中放射線療法（TARGIT）が挙げられる。

薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、一つまたは複数の結合部分（例えば、抗体または抗体フラグメント）、診断剤（例えば、放射性核種またはキレート剤）、または治療剤（例えば、細胞毒性剤または免疫調節剤）を含む本発明のHSAリンカーコンジュゲートの治療上または診断上の有効量を含む。活性成分である本発明のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合部分、診断剤、または治療剤で調製される）は、種々の薬物送達系での使用のために処方され得る。一つまたは複数の生理学的に受容可能な賦形剤または担体も、適切な製剤のために組成物に含まれてもよい。本発明での使用のために適切な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版（1985）に見出される。薬物送達のための方法の簡略な概説については、Langer Science 249:1527〜1533（1990）を参照のこと。

薬学的組成物とは、予防的および/または治療的な治療のために、経皮手段などによって、非経口、経鼻、局所（topical）、口腔、または局所（local）の投与を意図する。

通常は、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内または皮下の注射によって）、または経口摂取によって、または局所適用によって投与される。従って、本発明は、受容可能な担体、好ましくは水性の担体、例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、PBSなどに溶解されるかまたは懸濁された、本発明のHSAリンカーを含む非経口投与のための組成物を、それにコンジュゲートされた一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに、またはなしで提供する。この組成物は、pH調節剤、および緩衝化剤、等張性調節剤、保湿剤、界面活性剤などのような適切な生理学的条件に必要である場合、薬学的に許容される補助物質を含んでもよい。本発明はまた、経口送達のための組成物を提供し、この組成物は、錠剤、カプセルなどの製剤のために結合剤または充填剤などの不活性成分を含んでもよい。さらに本発明は、クリーム、軟膏などの製剤のために溶媒またはエマルジョンなどの不活性成分を含み得る局所投与のための組成物を提供する。

これらの組成物は従来の滅菌技術によって滅菌されてもよいし、または滅菌ろ過されてもよい。得られた水溶液はそのまま用いるために包装されてもよいし、または凍結乾燥されてもよく、この凍結乾燥された調製物は、投与前に、滅菌の水性担体と混合される。調製物のpHは、典型的には3〜11であり、さらに好ましくは5〜9、または6〜8であり、最も好ましくは7〜8、例えば7〜7.5である。得られた固体型の組成物は、例えば、錠剤またはカプセルの計量包装、それぞれが一定量のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）を含む、複数の単回投与単位で包装されてもよい。固体型の組成物はまた、外用適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブのように、量が可変性の容器に包装してもよい。

有効量のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）を含む組成物は、予防的および/または治療的治療のために哺乳動物（例えば、ヒト）に投与され得る。予防的な適用において、HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）を含む本発明の組成物は、疾患もしくは病態（例えば、癌、自己免疫疾患、または心血管系疾患）に感受性の、またはそうでなければそれらの疾患もしくは病態を発症するリスクがある患者に投与される。そのような量は、「予防上の有効用量」と定義される。この使用において、的確な量はやはり、患者の健康状態に依存するが、一般的に、1用量あたり約0.5mg〜約400mgのHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）（例えば、1用量あたり10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、または400mg）、および1用量あたり約0.1μgから約300mgの一つまたは複数の免疫調節剤（例えば、1用量あたり10μg、30μg、50μg、0.1mg、10mg、50mg、100mg、または200mg）の範囲におよぶ。ある用量のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）を、患者に対して予防的に、1時間あたり、1日あたり、1週間あたり、1ヶ月あたり、または1年あたり1回以上（例えば、1時間あたり、1日あたり、1週間あたり、1ヶ月あたり、または1年あたり2、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回）投与してもよい。より一般的には、1週間あたり1用量のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）が投与される。

治療の適用において、HSAリンカーコンジュゲートの用量（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）は、疾患もしくは病態（例えば、癌、自己免疫疾患、または心血管系疾患）に既に罹患している哺乳動物（例えば、ヒト）に対して、治癒に十分な量で、またはその疾患もしくは病態およびその合併症の症状の一つまたは複数を少なくとも部分的に停止しまたは軽減するのに十分な量で投与される。この目的を達成するのに十分な量は、「治療上の有効用量」と定義される。この使用の有効量は、疾患の重症度または患者の状態および全身状態に依存し得るが、一般的に、1用量あたり約0.5mg〜約400mgのHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）という範囲におよぶ（例えば、1用量あたり10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、または400mg）。ある用量のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）を、患者に対して治療として、1時間あたり、1日あたり、1週間あたり、1ヶ月あたり、または1年あたり1回以上（例えば、1時間あたり、1日あたり、1週間あたり、1ヶ月あたり、または1年あたり2、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回）投与してもよい。より一般的には、1週間あたり1用量のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）が投与される。

いくつかの態様において、患者は、HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）を、1用量あたり約0.5mg〜約400mgの範囲で1週間あたり1回以上（例えば、1週間あたり2、3、4、5、6、もしくは7回またはそれ以上）、好ましくは、1用量あたり約5mg〜約300mgで1週間あたり1回以上、さらにより好ましくは、1用量あたり約5mg〜約200mgで1週間あたり1回以上投与されてもよい。患者はまた、HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）の2週間に1回の用量を約50mg〜約800mgの範囲で、または本発明のHSAリンカー、またはこれにコンジュゲートされた任意の結合剤、診断剤および/もしくは治療剤の1ヶ月に1回の用量を約50mg〜約1,200mgの範囲で、投与されてもよい。

他の態様において、HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）は患者に対して、1週間あたり約0.5mg〜1週間あたり約400mg、1週間あたり約1.0mg〜1週間あたり約300mg、1週間あたり約5mg〜1週間あたり約200mg、1週間あたり約10mg〜1週間あたり約100mg、1週間あたり約20mg〜1週間あたり約80mg、1週間あたり約100mg〜1週間あたり約300mg、または1週間あたり約100mg〜1週間あたり約200mgの典型的な用量範囲で投与されてもよい。HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）は、1日おきに約0.5mg〜1日おきに約100mg、好ましくは、1日おきに約5mg〜1日おきに約75mg、より好ましくは、1日おきに約10mg〜1日おきに約50mg、さらにより好ましくは、1日おきに20mg〜1日おきに約40mgという範囲で投与されてもよい。HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）はまた、1週間あたり約0.5mgを3回〜1週間あたり約100mg3回、好ましくは、1週間あたり約5mgを3回〜1週間あたり約75mgを3回、より好ましくは、1週間あたり約10mgを3回〜1週間あたり約50mgを3回、さらにより好ましくは、1週間あたり約20mgを3回〜1週間あたり約40mgを3回という範囲で投与されてもよい。

本発明における方法の限定されない態様において、HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）は、哺乳動物（例えば、ヒト）に対して、1、2、3、または4時間継続的に;1日に1、2、3、または4回;1日おき、または3日目、4日目、5日目、もしくは6日目毎;1週間に1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回;2週間に1回;1ヵ月に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30回;2ヵ月に1回;6ヵ月毎に1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回;1年に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回;あるいは1年に2回投与される。HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）は、治療計画の間に異なる頻度で投与されてもよい。追加の態様において、HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）は、同じ頻度で患者に投与されても、または異なる頻度で患者に投与されてもよい。

所望の治療効果を達成するために必要な、一つまたは複数の診断剤もしくは治療剤およびHSAリンカー、またはそこにコンジュゲートされた任意の剤の量は、多数の因子、例えば、選択した特定の診断剤または治療剤（単数または複数）、投与方式、およびレシピエントの臨床状態に依存する。当業者であれば、所望の結果を達成するために、一つまたは複数の診断剤または治療剤およびHSAリンカー、またはそこにコンジュゲートされた任意の剤の適切な投薬量を決定することができるであろう。

有効量のHSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）を含む組成物の単回または複数回の投与は、治療している医師によって選択された用量レベルおよび様式で実施可能である。用量および投与の計画は、哺乳動物（例えば、ヒト）における疾患または病態の重症度に基づいて決定および調節されることが可能であり、この重症度は、臨床医によって一般に実施されている方法、または本明細書において記載されている方法に従って治療の経過を通じてモニターされ得る。

HSAリンカーコンジュゲート（一つまたは複数の結合剤、診断剤および/または治療剤とともに調製される）は、哺乳動物被験体、例えば、ヒトに対して、直接または任意の薬学的に許容される担体もしくは当技術分野で公知の塩と組み合わせて投与され得る。薬学的に許容される塩としては、製薬産業で通常用いられる非毒性の酸付加塩または金属錯体を挙げることができる。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などのような有機酸;タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどの重合酸（polymeric acid）;および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が挙げられる。金属複合体としては亜鉛、鉄などが挙げられる。一つの例示的な薬学的に許容される担体は生理食塩水である。その他の生理学的に受容可能な担体およびそれらの製剤は当業者に公知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,（第18版）,.編集A. Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,PAに記載される。

診断および治療の適用
本発明のHSAリンカーコンジュゲートは、本明細書において用いる場合、増殖性疾患（例えば、癌、例えば、黒色腫、明細胞肉腫および腎臓癌）、および自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、関節リウマチおよびブドウ膜炎）の例えば診断または治療を含めてヒトの診断適用および治療適用に用いられ得る。以下のヒトの増殖性および自己免疫疾患の考察は当業者に本発明のHSAリンカーコンジュゲートがどのように診断および治療の適用に適用され得るかを一般に理解させることを意味し、本発明の範囲を限定することを意味しない。

増殖性疾患（癌）
本発明のHSAリンカーコンジュゲートは、限定するものではないが、乳癌、黒色腫、明細胞肉腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌腫）、前立腺癌、肺癌、胃癌および卵巣癌などの増殖性疾患を診断、治療、予防または排除するために用いられ得る。増殖性疾患を有するかまたは罹患しているかを疑われる患者における診断または治療の適用のために本発明のHSAリンカーと結合される結合部分は、増殖性疾患に関連する標的分子（例えば、細胞表面レセプター、例えば、チロシンキナーゼレセプター）に特異的に結合するか、アゴナイズするか、活性化するか、アンタゴナイズするか、または阻害する能力に基づいて選択され得る。例えば、インスリン様増殖因子レセプター（IGFR、例えば、IGF1RおよびIGF2R）、線維芽細胞成長因子レセプター（FGFR）、血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）、血管内皮成長因子レセプター（VEGFR）、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）、上皮細胞成長因子レセプター（EGFR、例えば、ErbB2（HER2/neu））、Fcレセプター、c-キットレセプター、または間葉上皮移行因子レセプター（c-met:肝細胞成長因子レセプター（HGFR）としても公知）を標的する結合部分が増殖性疾患を診断または治療するために本発明のHSAリンカーに結合されてもよい。HSAリンカーコンジュゲートによる癌細胞の特異的な結合は、結合された癌細胞の検出（例えば、本明細書において記載のように、検出可能標識に結合されたHSAリンカー）または破壊（例えば、細胞毒性剤に結合されたHSAリンカー）を可能にし得る。乳癌および腎臓癌の治療のための本発明のHSAリンカーコンジュゲートの特異的な適用は、下記に記載される。

乳癌
一般的な形態の乳癌としては、浸潤性腺管癌、乳管の悪性癌、および浸潤性小葉癌、乳腺小葉の悪性癌が挙げられる。いくつかのタイプの乳癌細胞が高レベルの上皮増殖因子レセプター、特にErbB2（すなわち、HER2/neu）を高度に発現することが公知である。EGFRの異常なシグナル伝達または未制御の活性化は乳癌を含めて多くの癌の発達および進行に関連している。機能不全のEGFR経路を介して媒介された未制御の細胞増殖は、上皮に由来する広範な種々の固形腫瘍で見出され得、そしてデータは、腫瘍のEGFR発現、過剰発現および進行性の疾患に対する調節不全、転移の表現型、化学療法に対する耐性、および全体的に不良な予後と関連していた。

EGFR（例えば、抗ErbB2;トラスツズマブ）に特異的な一つまたは複数の結合部分に結合された本発明のHSAリンカーは、乳癌を診断または治療するために、本明細書において記載のような診断剤（例えば、検出可能標識）または細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、または治療剤とともに用いられてもよい。あるいは、本明細書においてさらに記載される「B2B3-1」などのErbB2およびErbB3に特異的な結合部分からなる二重特異性HSAリンカーコンジュゲートは、癌、例えば、乳癌、腎臓癌、卵巣癌および肺癌を診断または治療するために使用され得る。

上記のとおり、乳癌を治療するために用いられる本発明のHSAリンカーコンジュゲートは、放射線療法または外科的介入の前に投与されても（例えば、新補助化学療法）、同時に投与されても、または後に投与されても（例えば、アジュバント化学療法）よい。HSAリンカーコンジュゲートはまた、乳癌の治療に有用な他の化合物（例えば、抗腫瘍剤類、例えば、生物学的治療剤または化学的治療剤）と同時に投与されてもよい。例えば、表1に列挙される抗腫瘍剤類、例としては、有糸分裂抑制因子類（例えば、タキサン類）、トポイソメラーゼインヒビター類、アルキル化剤類（例えば、白金ベースの剤）、選択的エストロゲンモジュレーター（SERM）、アロマターゼインヒビター類、代謝拮抗剤類、抗腫瘍性抗生物質類（例えば、アントラサイクリン抗生物質類）、抗VEGF剤類、抗ErbB2（HER2/neu）剤類、および抗ErbB3剤が乳癌の治療のために特に有用であることが公知である。本発明のHSAリンカーコンジュゲートは、乳癌の治療のために有益であることが公知であるかまたは有益であると考えられる、添付Cに列挙される化合物を含めて任意の化合物と組み合わせて臨床医によって投与され得る。

（表１）本発明のHSAリンカーコンジュゲートと組み合わせた乳癌の治療のための例示的な抗腫瘍剤類

腎臓癌
腎臓癌、例えば、腎細胞癌腫は、伝統的な放射線療法および化学療法に対して特に耐性である。そういうものとして、本発明のHSAリンカーと組み合された生物学的療法の適用は、これらの癌に罹患している患者に魅力的な選択肢を提示する。例えば、I型インターフェロンまたはインターロイキン2レセプターをアゴナイズする結合部分と組み合されたHSAリンカーを用いて腎癌を治療してもよい。固形腫瘍として、腫瘍血管新生を標的および阻害する結合部分（例えば、抗血管内皮増殖因子（VEGF）抗体、例えば、ベバシズマブ）も治療効果に用いられ得る。

自己免疫疾患
本発明のHSAリンカーコンジュゲートを、例えば、多発性硬化症（MS）、インスリン依存性糖尿病（IDDM）、関節リウマチ（RA）、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、グレーブス病、乾癬および重症筋無力症などの、例えば、ヒト患者で自己免疫疾患および障害を診断、治療、予防または安定化するために用いてもよい。自己免疫疾患および障害は、免疫系の自己反応性の要素（例えば、T細胞、B細胞および自己反応性抗体）によって生じる。そのようなものとして、自己反応性免疫細胞および抗体を阻害、ブロック、アンタゴナイズまたは枯渇する結合部分（例えば、抗リンパ球または抗胸腺細胞グロブリン;バシリキシマブ、ダクリズマブまたはムロモナブ-CD3モノクローナル抗体）を治療用途のために本発明のHSAリンカーと結合してもよい。本明細書において定義されるように、炎症性シグナル伝達インヒビター（ISI）として機能する結合部分が、自己免疫の治療のために本発明のHSAリンカーに結合されてもよい。さらに、インテグリン機能を阻害またはアンタゴナイズする結合部分（例えば、本明細書において記載のインテグリンアンタゴニスト）は、疾患進行を軽減または停止し得る。

本発明の他の態様では、結合部分は可溶性TNFレセプター、例えば、エタネルセプトまたはレネルセプト;炎症促進性サイトカインまたは炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子、例えば、アダリムマブ、セルトリズマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、およびリツキサンに対する抗体;ドミナントネガティブ炎症促進性サイトカイン変異体、例えば、XENP345、XPROTM1595、アナキンラ、ならびに米国特許出願公開第20030166559号および同第20050265962号に開示の変異体;炎症促進性サイトカインまたは炎症促進性細胞表面シグナル伝達分子のシグナル伝達経路下流のインヒビター、例えば、DE096、5-アミノ-2-カルボニルチオペン誘導体（WO2004089929に記載）、ARRY-797、BIRB 796 BS、（1-5-tert-ブチル-2-p-トリル-2H-ピラゾール-3-イル）-3-［4-2（モルホリン-4-イル-エトキシ）-ナフタレン-1-イル］-尿素、CHR-3620、CNI-1493、FR-167653（藤沢薬品、日本、大阪）、ISIS 101757（Isis Pharmaceuticals）、ML3404、NPC31145、PD169316、PHZ1112、RJW67657、4-（4-（4-フルオロフェニル）-1-（3-フェニルプロピル）-5-（4-ピリジニル）-1H-イミダゾール-2-イル）-3-ブチン-1-オール、SCIO-469、SB202190、SB203580、（4-（4-フルオロフェニル）-2-（4-メチルスルフィニルフェニル）-5-（4-ピリジル）1H-イミダゾール）、SB239063、トランス-1-（4-ヒドロキシシクロヘキシル）-4-（4-フルオロフェニル-メトキシピリジミジン-4-イル）イミダゾール、SB242235、SD-282、SKF-86002、TAK 715、VX702、およびVX745;またはTNF-α変換酵素（TACE）のインヒビター、例えば、BB-1101、BB-3103、BMS-561392、ブチニルオキシフェニルβ-スルホンピペリジンヒドロキサマート類、CH4474、DPC333、DPH-067517、GM6001、GW3333、Ro 32-7315、TAPI-1、TAPI-2およびTMI 005）;または抗イディオタイプ剤、例えば、モノクローナル抗体、LJP394（アベテミス,RIQUENT（登録商標）、La Jolla Pharmaceuticals）。

他の態様では、結合部分は本明細書において上記されるようなインターフェロンである。本発明のHSAリンカーに結合され得る結合部分としては、例えば、インターフェロン-β（REBIF（登録商標）（IFN-β-1a）、AVONEX（登録商標）（IFN-β-1a）、およびBETASERON（登録商標）（IFN-β-1b））、インターフェロン-t（TAUFERONTM）、インターフェロン-α（例えば、ROFERON-A（登録商標）（IFN-α-2a）、INTRON-A（登録商標）（IFN-α-2b）、REBETRON（登録商標）（IFN-α-2b）、ALFERON-N（登録商標）（IFN-α-n3）、PEG-INTRON（登録商標）（モノメトキシポリエチレングリコールと共有結合的にコンジュゲートされたIFN-α-2b）、INFERGEN（登録商標）（IFN-α-2bと88％の相同性を有する、天然には存在しない1型インターフェロン）、またはPEGASYS（登録商標）（ペグ化IFN-α-1a））、およびACTIMMUNE（登録商標）（IFN-g-1b）が挙げられる。

本発明はさらに、これらの炎症促進性分子またはそれらの特異的なレセプターをアンタゴナイズして自己免疫を治療する結合部分をHSAリンカーコンジュゲートに提供する。MSおよびRAの診断および治療のための本発明のHSAリンカーコンジュゲートの具体的な適用は下記に記載されている。

多発性硬化症
多発性硬化症（MS）は中枢神経系（CNS）の神経の不可逆的な変性によって特徴付けられる神経学的疾患である。背景的な原因は明確ではないが、MS中の神経変性は脱髄またはミエリン（正常には外層に位置して神経を絶縁するタンパク質）の剥離の直接的結果である。T細胞は、MSの発達に重要な役割を果たす。炎症を起こしたMS領域（ただし白質ではない）は、ヒトHLA-DR2などのMHCクラスII関連分子によって提示される自己抗原に応答する浸潤性CD4^＋T細胞を有し得る。浸潤性CD4T細胞（T_H1細胞）は、炎症促進性サイトカインIL-2、IFN-γおよびTNF-αを生じ、これがマクロファージのような抗原提示細胞（APC）を活性化して、さらに炎症促進性サイトカイン（例えば、IL-1β、IL-6、IL-8、およびIL-12）を生成する。IL-12はさらにIFN-γ合成を誘導する。この結果は、ヒト疾患をもたらす神経鞘の進行性の脱髄である。

HSAリンカーコンジュゲートをMSの診断を補助するのに用いてもよい。本明細書において規定されるような、結合部分を含む診断用HSAリンカーコンジュゲートは、特異的に一つまたは複数の（例えば、二重特異性HSAリンカーコンジュゲート）免疫細胞活性化マーカー（例えば、CD69、CD28、HLA-DR、およびCD45）を標的する。

他の因子または細胞に対する一つまたは複数のこれらの炎症促進性または免疫細胞活性化メディエーターの不均衡は、診断剤（例えば、放射性同位体または蛍光色素）と結合されたHSAリンカーコンジュゲートを用いることによって測定され得る。

本発明のHSAリンカーコンジュゲートは、MSを発症するリスクがあるかもしくはMSに罹患している人を治療するため、または疾患の症状を予防、軽減もしくは治癒するために用いられ得る。例えば、本明細書で規定される場合、特異的にα4インテグリン（例えば、ナタリズマブ）、CD52（例えば、アレムツズマブ）、CD80、P-セレクチン、スフィンゴシン-1-リン酸レセプター-1（S1PR1）、ヒアルロン酸レセプター、白血球機能抗原-1（LFA-1）、CD11（例えば、エファリズマブ）、CD18、CD20（例えば、リツキシマブ）、CD85、ICOSリガンド、CCR2、CXCR3、またはCCR5を、標的およびアンタゴナイズする結合部分は、MSに罹患している患者での治療用途のために本発明のHSAリンカーに結合された場合有用であり得る。

同様に、I型インターフェロン（例えば、インターフェロンαおよびインターフェロンβ）を中和するか、またはI型インターフェロンレセプター（例えば、IFNaR1）をアンタゴナイズする結合部分がまた、治療適用のために本発明のHSAリンカーに結合されてもよい。

関節リウマチ
関節リウマチ（RA）は、免疫系が関節を攻撃する慢性、炎症性の自己免疫障害である。これは身体障害的でかつ疼痛性の炎症性状態であって、疼痛および関節破壊に起因して実質的な運動性の喪失をもたらし得る。RAは全身性の疾患であって、皮膚、血管、心臓、肺および筋肉を含めて身体全体にわたる関節外組織に影響する場合が多い。

RAに罹患した患者は高頻度に、HLA-DR4/DR1クラスターの細胞発現が増大している。これらの細胞表面分子の一つまたは両方に特異的なHSAリンカーコンジュゲートは、RAの診断に有用である。

本発明のHSAリンカーコンジュゲートは、RAを発症するか罹患するリスクのある人を治療してその疾患の症状を予防、軽減または治療するために用いられ得る。例えば、結合部分は、本明細書において記載のとおり、TNF-α（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、およびアダリムマブ）、IL-1（例えば、アナキンラ）、またはCTLA-4（例えば、アバタセプト）を特異的に標的およびアンタゴナイズする。B細胞を特異的に標的および枯渇する結合部分（例えば、抗CD20抗体、例えば、リツキシマブ）はまた、RAを治療または予防するために本明細書において記載のHSAリンカーに結合され得る。

ブドウ膜炎
ブドウ膜炎とは具体的には、眼の中間層の炎症を指すが、眼の内部に関与する任意の炎症性プロセスを指す場合もある。ブドウ膜炎は、もともと自己免疫である場合も、または特発性である場合もある。

本発明のHSAリンカーコンジュゲートは、ブドウ膜炎を発症するか罹患するリスクのある人を治療してその疾患の症状を予防、軽減または治療するために用いられ得る。例えば、α-フェトプロテイン（例えば、ヒトAFP;NCBIアクセッション番号.NM＿001134）、またはその生物学的に活性なフラグメントを、本発明のHSAリンカーに結合して、自己免疫または特発性のブドウ膜炎に関連する炎症を軽減または排除してもよい。

キット
本発明は、疾患または病態（例えば、癌、自己免疫疾患、または心血管系疾患）を治療するために治療上有効量で、本発明のHSAリンカー、および一つまたは複数の結合部分（例えば、抗体または抗体フラグメント）、診断剤（例えば、放射性核種またはキレート剤）、および治療剤（例えば、細胞毒性または免疫調節剤）を含む薬学的組成物を、HSAリンカーに対してそれらをコンジュゲートするために用いられ得る試薬とともに備え、この薬学的組成物が必要に応じて、さらに、薬学的に許容される担体を含むキットを提供する。このキットは、施術者（例えば、医師、看護師または患者）がそこに含まれる組成物を投与することを可能にするための説明書を備える。

好ましくは、このキットは、有効量の本発明のHSAリンカー、またはそれに対する任意の結合（例えば、抗体または抗体フラグメント（例えば、scFv））、診断（例えば、放射性核種またはキレート剤）、および/または治療（例えば、細胞毒性または免疫調節剤）のコンジュゲートを含む単一用量の薬学的組成物（単数または複数）の複数のパッケージを含む。任意で、薬学的組成物（単数または複数）を投与するために必要な説明書またはデバイスがキットに含まれてもよい。例えば、本発明のキットは、本発明のHSAリンカー、またはそこにコンジュゲートされた任意の結合剤、診断剤および/もしくは治療剤の有効量を含む一つまたは複数の充填済み注射器を提供し得る。さらにこのキットはまた、本発明のHSAリンカー、またはそこにコンジュゲートされた任意の結合剤、診断剤および/または治療剤を含む薬学的組成物（単数または複数）を用いるために疾患または病態（例えば、癌、自己免疫疾患、または心血管系疾患）に罹患している患者のための説明書または投与スケジュールなどの追加の構成要素を備えてもよい。

種々の改変および変種が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の組成物、方法およびキットでなされ得ることは当業者には明白であろう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその等価物内の範囲におさまるならば、本発明の改変および変種を包含することを意図する。

以下の実施例は、単なる例示として示しており、決して限定ではない。当業者は、種々の重要でないパラメーターを変化または改変して、本質的に同じまたは類似の結果を得ることが可能であることを容易に理解するであろう。

実施例1:細胞毒性薬物または細胞増殖抑制薬物の部位特異的コンジュゲーションのためのHSAリンカー中の残基を特定する方法
HSAに対する薬物の特異的なコンジュゲーションのための部位を特定するために、結晶構造を研究して、表面露出したセリンおよびトレオニン残基を特定した。次いで、これらの特定の表面露出したアミノ酸をシステインに変異してもよく、これによって、マレイミドのようなチオール特異的コンジュゲート剤を用いて、置換したシステインに対して薬物をコンジュゲーションさせ得る。温和な還元が薬物コンジュゲーションの前に必要であり得る。コンジュゲートされた薬物数は、HSAに導入された表面露出したシステイン残基の数によって制御される。セリンおよびトレオニンは、変異のための最も適切な残基として選択される。なぜなら他の表面露出残基もまた、システインに変異されて、細胞増殖抑制薬または細胞毒性薬に対して首尾よくコンジュゲートされ得るが、セリンおよびトレオニンは、システインとほとんどの構造的同一性を共有するからである。

HSAの結晶構造は、RSCBタンパク質データバンク（Protein Data Bank）に寄託されている（1bm0-Sugioら、「Crystal structure of human serum albumin at 2.5 A resolution」,Protein Eng.12:439〜446（1999））。この構造は、スイスバイオインフォマティックス研究所からダウンロードされたDeep View Swiss PDB Viewerを用いて分析した。50％、40％、および30％の表面露出を有するセリンおよびトレオニン残基を、システインへの変異に最も適切であると特定した（表2）。標準的な分子生物学的手順を用いて変異を導入してもよい。導入されたシステインへのチオール反応薬またはキレート剤のコンジュゲーションは、標準的なタンパク質化学技術を用いて試験してもよい。

（表２）

実施例2:アスパラギン連結グリコシル化部位の導入のためのHSAリンカーにおける残基を特定するための方法。
HSA中のアスパラギン連結グリコシル化部位の導入のための領域を特定するために、結晶構造を研究して、変異に適切である表面露出した（＞30％）アスパラギン、セリンおよびトレオニン残基を特定した。グリコシル化は、コンセンサス配列アスパラギン-x-セリン/トレオニン（ここでxはプロリンであることはできない）が存在する場合、アスパラギン残基で生じる。表2は、アスパラギン連結グリコシル化の導入のためのHSA中の可能な変異部位を列挙する。

（表３）

^＊これらの変異はまたHSA中では極めてまれに生じることが報告されている（Carlsonら、「Alloalbuminemia in Sweden:Structural study and phenotypic distribution of nine albumin variants」Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89:8225〜8229(1992）;Madisonら、「Genetic variants of human serum albumin in Italy:point mutants and a carboxyl-terminal variant」、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:6476〜6480（1994）;Hutchinsonら、「The N-terminal sequence of albumin Redhill,a variant of human serum albumin」、FEBS Lett.193:211〜212(1985);Brennanら、「Albumin Redhill(-1 Arg,320 Ala-Thr):a glycoprotein variant of human serum albumin whose precursor has an aberrant signal peptidase cleavage site」、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:26〜30(1990);Minchiotti ら、「Structural characterization of four genetic variants of human serum albumin associated with alloalbuminemia in Italy,」Eur.J.Biochem.247:476〜482(1997);Peachら、「Structural characterization of a glycoprotein variant of human serum albumin:albumin Casebrook(494 Asp-Asn),」Biochim.Biophys.Acta 1097:49〜54(1991))。

実施例3
B2B3-1は、B1D2、ヒト抗ErbB2 scFv抗体（配列番号27）およびH3、ヒト抗ErbB3 scFv（配列番号26）からなる二重特異性scFv抗体融合分子である。2つのscFvsが、改変されたヒト血清アルブミン（HSA）リンカーによって連結される。抗ErbB3 scFv、H3は短いコネクターポリペプチドを組み込んでいるHSAリンカーのアミノ末端に組み換え的に融合され、この抗ErbB2 scFv、B1D2は追加の短いコネクターポリペプチドを組み込んでいる改変HSAリンカーのカルボキシ末端に組み換え的に融合される。各々のコネクターポリペプチドは、プロテアーゼ耐性の特性に基づいて選択される。この改変されたHSAリンカーは2つのアミノ酸置換を含む。天然のHSAの34位置のシステイン残基を、この部位での酸化に起因して、潜在的なタンパク質の異質性を減じるために、セリンに変異した。天然のHSAで脱アミノに対して感受性であって、薬理学的な半減期の低下を生じ得る天然のHSAのアミノ酸503のアスパラギン残基をグルタミンに変異した。B2B3-1は、10.0nM〜0.01nMの範囲のkD、より好ましくは約0.3nMのkDを有する、その高親和性の抗ErbB2 scFv結合部分のおかげでErbB2過剰発現腫瘍に選択的に結合する。50〜1nMの範囲、より好ましくは約16nMのkDを有する、抗ErbB3 scFvによるErbB3の引き続く結合は、ErbB3のHRG誘導性リン酸化を妨げる。改変されたHSAリンカーは、二重特異性分子に対して循環半減期の延長をもたらす。B2B3-1は119.6kDaという分子量を有し、グリコシル化されない。

B2B3-1は、ErbB3のリガンド誘発性リン酸化を、その二量体化パートナーErbB2の豊富な発現を活かすことによってナノモル未満の力価で阻害して、両方のレセプターを発現する癌細胞を特異的に標的する。

実施例4
図2に示されるとおり、B2B3-1変異体は、ZR75-1乳癌細胞でHRG誘発性のpErbB3を阻害する。ZR75-1乳癌細胞をある用量範囲のB2B3-1変異体を用いて24時間、続いてHRG刺激によって処理した。pErbB3レベルは、細胞溶解液中で測定して、IC₅₀値を阻害のパーセントと一緒に算出した。平均IC₅₀値を示しており（Y軸）これには複製の実験を示しているエラーバーをともなう。阻害パーセントの値を対応するバーの上に示す。

実施例5
B2B3-1変異体 A5-HSA-B1D2（図3〜5のパネルA）、H3-HSA-B1D2（図3〜5のパネルB）、H3-HSA-F5B6H2（図3〜5のパネルC）、およびF4-HSA-F5B6H2（図3〜5のパネルD）を用いる24時間の前処理後のリン酸化ErbB3（図3A〜D）、AKT（図4A-D）、およびERK（図5A〜D）の阻害。BT474乳癌細胞をある用量範囲のB2B3-1変異体を用いて24時間処理し、続いてHRG刺激した。pErbB3、pAKT、およびpERKのレベルを細胞溶解液中で測定し、IC₅₀値を阻害のパーセントと一緒に算出した。

実施例6
図6に示すとおり、B2B3-1変異体を用いたBT474乳房腫瘍細胞の処理は、G1細胞周期停止、およびS期の細胞の集団の減少を生じる。BT474細胞を1μMのB2B3-1変異体および対照を用いて72時間処理した。処理の終わりに、細胞をトリプシン処理して、ヨウ化プロピジウムを含む低張液中に穏やかに再懸濁し、単一の細胞をフローサイトメトリーによって分析した。G1期およびS期の細胞周期分布を、細胞周期分析のために設計した曲線あてはめアルゴリズム（FlowJoソフトウェア細胞周期プラットフォーム）を用いて測定した。

実施例7
B2B3-1（配列番号16）は、ErbB3活性化を阻害し、その二量体化パートナーErbB2の豊富な発現を利用して、腫瘍細胞を標的する。高親和性抗ErbB2 scFv抗体、B1D2は、ErbB2を過剰発現する腫瘍細胞にに対するB2B3-1の標的を容易にする。B1D2を、修飾されたHSAリンカーによって、より低い親和性の抗ErbB3 scFv抗体、H3（これは、ErbB3リガンドHRGの結合をブロックし、それによってErbB3リン酸化および下流のAKTシグナル伝達を阻害する）に対して接続する。ErbB2結合scFv、B1D2は、アゴニスト活性もアンタゴニスト活性も保有しない親のscFv C6.5由来である。従ってB1D2は、単なる標的剤として機能する可能性が高い。ErbB3結合scFvの低い親和性結合は、正常な非癌性組織（ErbB3を発現するがErbB2はほとんどまたは全く発現しない）に対するB2B3-1の強力な結合を妨げ、それによって非特異的な毒性の可能性を低減する。ErbB2およびErbB3の両方を発現する腫瘍細胞では、両方のレセプターに対して結合する二重特異性B2B3-1の結合活性の影響で、ErbB3 scFvの低い親和性が克服され、HRG相互作用の強力な阻害が可能になる。

B2B3-1がErbB3に対するHRG結合を阻害する能力を、フローサイトメトリー（FACS）を用いて検討した。乳癌細胞株BT-474-M3（ErbB2を過剰発現するBT-474の変異体）の細胞を、1μMのB2B3-1を用いて前処理し、次いで10nMのビオチン化HRG1β EGFドメインとともにインキュベートした。強力な洗浄後、ストレプトアビジン-AlexaFluor 647コンジュゲートを用いて結合を評価した。全てのインキュベーションを4℃で行った。図7は、B2B3-1がErbB3に対するHRGの結合をブロックできることを示す。

実施例8
B2B3-1がErbB3に対するHRG結合をブロックする能力を示した後、本発明者らは、ErbB3を発現し、ErbB2を過剰発現する2つの細胞株上でインビトロでのErbB3シグナル伝達に対するB2B3-1の効果を検討した。乳癌細胞株BT-474-M3およびZR75-30を一晩血清飢餓させ、B2B3-1の用量滴定で24時間前処理し、次いで5nMのHRG 1β EGFドメインを用いて10分間刺激した。次いでErbB3およびAKTのリン酸化状態をELISAアッセイを用いて検査した。その結果、B2B3-1が用量依存性の方式で、かつ両方の細胞株中で強力なIC₅₀で、ErbB3およびAKTリン酸化の両方のHRG誘発性活性化を阻害することが示される（図8A〜D）。

実施例9
図9は、BT474乳癌細胞におけるシグナル伝達タンパク質に対するB2B3-1処理の効果を示す。細胞をある用量範囲のB2B3-1を用いて24時間、続いてヘレグリン刺激で処理した。pErbB2、pErbB3、pErkおよびpAKTのレベル、ならびにそれらの対応する総タンパク質レベルを、ウエスタンブロット分析によって細胞溶解液で決定した。

実施例10
図10は、B2B3-1処理したBT474乳癌細胞の免疫沈降ウエスタンブロット分析を示す。細胞をある用量範囲のB2B3-1を用いて24時間、続いてヘレグリン刺激で処理した。ErbB2会合した複合体を、抗ErbB2抗体を用いて細胞溶解液から単離し、続いてウエスタンブロット分析によってpErbB2およびpErbB3、ならびにそれらの対応する総タンパク質レベルを検出した。

実施例11
B2B3-1の抗腫瘍活性を、多数のアッセイを用いてインビトロで検討した。第一のアッセイでは、G1期におけるBT-474またはSKBR3細胞の蓄積に対するB2B3-1の影響、ならびに細胞周期のS期の付随した低下を検査した。要するに、細胞を1μMのB2B3-1またはPBSビヒクルを用いて72時間処理した。処理の終わりに、細胞をトリプシン処理して、ヨウ化プロピジウムを含む低張液中に穏やかに再懸濁し、単一の細胞をフローサイトメトリーによって分析した。G1期およびS期の細胞周期分布を、細胞周期分析のために設計した曲線あてはめアルゴリズム（FlowJoソフトウェア細胞周期プラットフォーム）を用いて測定した。B2B3-1はS期の細胞の割合をそこそこ低下し、G1期の細胞の集団を増大することが見出された（図11A）。第二の実験では、B2B3-1での処理後に形成された細胞コロニーの数を研究した。BT-474およびSKBR3乳癌細胞を1μMのB2B3-1の存在下でプレートして、培地のみの中にプレートした細胞と比較した。培地のみまたは処理を含む培地を3日ごとに補充した。14日後、コロニー数をカウントして、未処理の細胞と比較した。図11Bは、対照の細胞と比較してB2B3-1で細胞を処理した場合に形成されるコロニーの数の40〜45％の低下を示している。最終的に、B2B3-1が細胞増殖を阻害する能力は、Real-Time Cell Electronic Sensing System(RT-CES:ACEA Biosciences)を用いて細胞インピーダンスアッセイで評価した。BT-474細胞を、マイクロエレクトロニクスセンサーアレイを組み込んだプレート上に播種して、B2B3-1または培地だけを用いる用量滴定で72時間処理した。細胞電極インピーダンス応答の生成を反映するデータを72時間の間毎時間収集して、IC₅₀値を処理の68時間後に算出した。図11Cは、B2B3-1がBT-474細胞のインピーダンスを33nMというIC₅₀で阻害することができたことを示す。

実施例12
本発明者らはまた、B2B3-1が、同時にErbB2およびErbB3レセプターに結合しかつ架橋する能力に基づいてアゴニスト活性を呈するか否かを検討した。血清飢餓したZR75-1乳癌細胞を1μM B2B3-1またはPBSビヒクルとともに24時間インキュベートした。細胞をまた、B2B3-1またはPBSビヒクルを用いて24時間、続いて5nMのHRG 1β EGFドメインを用いて10分刺激した。細胞を溶解して、溶解物のpErbB3含量をELISAによって評価した。図12は、B2B3-1のみで処理した細胞が、未処理の細胞と匹敵するレベルのリン酸化ErbB3を含んだことを示し、このことはB2B3-1が非アゴニストであることを示している。

実施例13
B2B3-1がErbB2およびErbB3に対して特異的に結合し、関連のErbBファミリーのメンバー、EGFRおよびErbB4には結合しない能力をELISAによって検討した。プレートをErbB2またはErbB3のいずれかの組み換え細胞外ドメインでコーティングした。プレートを、EGFR、ErbB2、ErbB3またはErbB4の競合する組み換え細胞外ドメインの連続希釈の存在下でB2B3-1の最大半分の結合濃度を用いてブロックしてインキュベートした。結果には、可溶性のErbB2細胞外ドメインのみがErbB2コーティングしたプレートに対するB2B3-1結合をブロックすることが示される（図13A）。同様に、可溶性のErbB3細胞外ドメインだけが、ErbB3-コーティングプレートに対するB2B3-1結合をブロックした（図13B）。これらの結果、ErbB2に対する抗ErbB2アームB1D2の特異性、およびErbB3に対する抗ErbB3アームH3の特異性が示される。可溶性のErbB2細胞外ドメインをErbB3コーティングプレート上でB2B3-1とともにインキュベートした場合に観察されるシグナルの増大は、そのプレート上のErbB2、ErbB3、B2B3-1の複合体の形成に起因すると考えられる。

実施例14
B2B3-1が、ErbB2およびErbB3の両方を発現する腫瘍細胞に対して強力に結合する能力を研究した。SKO2およびSKO3は、それぞれErbB2またはErbB3と相互作用する能力を欠くB2B3-1の変異体である。MALME-3M黒色腫細胞（ほぼ等しい数のErbB2およびErbB3レセプターを発現する）を、連続希釈のB2B3-1、SKO2、またはSKO3とともにヤギ抗HSA アレクサフルオル（Alexafluor）-647コンジュゲートした抗体の飽和濃度の存在下でインキュベートした。細胞結合をフローサイトメトリーによって評価して、見かけの結合親和性を各々の分子について決定した。対照の細胞を二次抗体単独とインキュベートした。SKO2については測定可能な細胞結合は観察されず、SKO2は、ErbB3に対しては極低い親和性結合を保持しており、ErbB2結合活性は欠いている。SKO3は、機能的な高い親和性のErbB2結合scFvを保持するが、ErbB3に結合する能力は欠いており、6.7nMというK_Dを有した。B2B3-1は、0.2nMというK_Dで細胞に結合し、このことはこの二重特異性分子の結合活性の結合を示している（図14）。

実施例15
生理学的条件下でのB2B3-1の安定性を、ヒト、カニクイザルまたはマウスの血清中で100nMのB2B3-1を、37℃で120時間インキュベートすることによって評価した。

サンプルを0、24、48、72、96および120時間で取り出して、ErbB2およびErbB3の両方に対してB2B3-1が結合する能力をELISAによって測定した。このELISAは、96ウェルプレートを組み換えErbB2細胞外ドメインを用いて一晩コーティングする工程、続いてブロッキング工程および次いで、連続希釈のB2B3-1とのインキュベーションを包含する。次いで、プレートをFc-ErbB3細胞外ドメイン融合タンパク質とともに、続いてヤギ抗ヒト-Fc-HRPコンジュゲートとともにインキュベートする。プレートをスーパーシグナル化学発光基質の添加によって発色させる。図15A〜Cによって、B2B3-1が生理学的条件下で3つの種全て由来の血清中で安定に維持されたままであり、測定した全ての時点でErbB2およびErbB3の両方に結合する匹敵する能力を維持していることが示される。

実施例16:BT-474-M3乳癌異種移植片モデルにおけるB2B3-1用量応答
インビボでのB2B3-1の有効性をBT-474-M3異種移植片を保有しているヌードマウスを用いて評価した。1群あたり10匹のマウスを0.3、1、3、10、30または90mg/kgという12用量のB2B3-1を用いて3日ごとに処置した。対照群は、PBSビヒクルまたはHSAを90mg/kgのB2B3-1用量と等モルの用量で投与された。全ての用量を腹腔内（i.p.）に投与した。腫瘍の大きさを週に2回測定して、対応する腫瘍容積を算出した。結果には、B2B3-1処置は、対照群に比較してBT-474-M3腫瘍の大きさの有意な減少をもたらすことが示される（図16）。完全収縮が、最低用量のB2B3-1（0.1mg/kg）で処置したマウス以外はB2B3-1処置群の各々で観察された。

実施例17
図17A〜図17Eで示されるとおり、B2B3-1は、ErbB2依存性の方式で複数の異種移植片モデルで有効である。B2B3-1は、ErbB2を1細胞あたり1×10⁵個のレセプターで発現するCalu-3（図17A）、SKOV-3（図17B）、NCI-N87（図17C）、およびMDA-MB-361（図17E）異種移植片モデルでは有効であるが、1細胞あたり4.5×10⁴個のErbB2レセプターを発現するACHN（図17D）異種移植片モデルではそれほど作用しなかった。マウスを30mg/kgのB2B3-1を用いて3日ごとに処置した。

実施例18
ErbB2の過剰発現は、B2B3-1無応答者ADRr乳癌異種移植片モデルをB2B3-1に対する応答者に変換する（図18A B）。ErbB2は、レトロウイルス発現系を用いてADRr乳癌細胞で過剰発現された。高レベルのErbB2（ADRr-E2）を発現するトランスフェクトされた細胞をFACSを用いて選択し、引き続いてヌードマウス中に皮下注射して、異種移植片腫瘍を確立した。マウスを30mg/kgのB2B3-1を用いて3日ごとに処置した。B2B3-1に対する応答は、野性型ADRr-異種移植片（図18A）では観察されなかったが、ADRr-E2異種移植片（図18B）は、B2B3-1に応答した。

実施例19
図19A〜Bに示すとおり、B2B3-1活性は、インビトロ（図19A）およびインビボ（図19B）でErbB2発現レベルと正に相関する。ErbB3リン酸化のB2B3-1阻害を、1細胞あたり5×10⁴個のレセプター〜1細胞あたり2.4×10⁶個のレセプターにおよぶErbB2の発現レベルを有する9つの腫瘍細胞株においてELISAアッセイを用いて決定した。B2B3-1が基礎のレベル（pErbB3阻害％）までErbB3リン酸化を阻害する能力の程度は、ErbB2発現レベルと正に相関することが見出された。同様に、B2B3-1活性を低〜高レベルのErbB2を発現する10個の異種移植片モデルで評価した。異種移植片応答はまた、ErbB2発現レベルと正に相関した。

実施例20
BT474-M3乳房腫瘍細胞のB2B3-1処理によって、核に対するp27^kiplの転位が生じる（図20A）。BT474-M3細胞を1μMのB2B3-1を用いて6時間処理した。p27^kiplの細胞下の位置を免疫蛍光技術を用いて評価した。B2B3-1で処理した細胞では、p27^kiplは細胞増殖の阻害を生じることが示されている核へ転位された。p27^kiplは未処理の細胞の細胞質に残っていた。

細胞周期に対するB2B3-1の効果をさらに研究するため、B2B3-1で72時間処理したBT-474-M3細胞を、ウエスタンブロット分析を用いて細胞周期調節因子サイクリンD1についてプローブした（図20B）。細胞骨格タンパク質ビンクリンをこの実験ではタンパク質ローディング対照として用いた。B2B3-1処理によって、未処理の細胞に比較してサイクリンD1のレベルの低下が生じた。

実施例21
図21A〜Bに示されるとおり、BT474-M3乳房腫瘍異種移植片のB2B3-1処置でp27^kiplの核への転位が生じる。BT474乳房腫瘍異種移植片をB2B3-1を用いて（図21A）30mg/kgの用量で、または等モル用量のHSA（図21B）を3日ごとに用いて全部で4用量で処置した。p27^kiplについての核染色の増大がHSA対照腫瘍に比較してB2B3-1処置した腫瘍で観察され、このことはインビボでのB2B3-1の抗増殖効果を示している。

実施例22
B2B3-1処置は、BT474乳癌異種移植片腫瘍での増殖性マーカーKi67の減少を生じる。BT474-M3乳房腫瘍異種移植片を、B2B3-1（図22A）を30mg/kgの用量で用いて、または等モル用量のHSA（図22B）を用いて3日ごとに全部で4用量で処置した。

Ki67についての腫瘍切片の引き続く染色によって、HSA処置した腫瘍に比較してB2B3-1処置した腫瘍について発現パターンの減少が示された。

実施例23
B2B3-1処置では、CD31発現についてアッセイすることによって決定した場合、BT474-M3乳癌異種移植片腫瘍の血管密度の減少が生じる（図23A〜図23B）。BT474乳房腫瘍異種移植片を、B2B3-1（図23A）を用いて30mg/kgの用量で、または等モル用量のHSA（図23B）を3日ごとに用いて全部で4用量で処置した。腫瘍を血管マーカーCD31の存在について染色した。B2B3-1で処置した腫瘍は、HSAで処置した対照の腫瘍に比較して血管密度の顕著な低下を示す。

実施例24:B2B3-1は、インビボでErbB3のリン酸化を阻害する。
BT-474-M3異種移植片腫瘍を30mg/kgのB2B3-1または17.5mg/kgのHSAを用いて、3日ごとに全部で4用量処置して、腫瘍を最後の投与の24時間後に回収した。腫瘍を溶解して、SDS-PAGEに、続いてウエスタン分析に供して、B2B3-1の標的ErbB3のリン酸化の相対レベルを評価した。等量のタンパク質を、各々のレーンにロードして、総タンパク質レベルをβチューブリンについてプローブすることによって制御した。リン酸化ErbB3に特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析によって、B2B3-1処置した腫瘍は、HSA処置した腫瘍よりも含むpErbB3が少ないことが示される（図24A）。ウエスタンブロット分析の濃度測定、続いて平均のβチューブリン積分バンド強度への平均pErbB3積分バンド強度の正規化によって、B2B3-1処置した腫瘍が、対照のHSA処置した腫瘍よりも含むpErbB3が有意に少ないことが示された（図24B）。これらのデータによって、B2B3-1はインビボでその標的ErbB3のリン酸化を阻害することが確認された。

実施例25:PTEN活性が減少しているBT-474-M3異種移植片におけるB2B3-1のインビボ活性
ShRNA技術を、BT-474-M3乳癌細胞において腫瘍サプレッサー遺伝子ホスファターゼおよびテンシンホモログ（PTEN）の活性をノックアウトするために適用した。要するに、培養されたBT-474-M3細胞を、レトロウイルストランスフェクションによって、shPTENまたはshControlRNAを用いてトランスフェクトした。PTENが減少したトランスフェクトされた細胞を、FACSを用いて選択し、引き続きヌードマウスの右脇腹に皮下注射して、異種移植片腫瘍を確立した。対照のベクターでトランスフェクトした細胞を同じマウスの左脇腹に注射した。マウスを30mg/kgのB2B3-1を用いて3日ごとに、または10mg/kgのハーセプチンを用いて毎週処置した。HSAをB2B3-1と等モル用量で対照として注射した。全ての注射は腹腔内（i.p.）で行った。

B2B3-1およびハーセプチンは、対照のBT-474-M3乳癌細胞によって形成された腫瘍の大きさの低下を促進させた（図25A）が、一方、B2B3-1だけ（ハーセプチンなし）では、PTENの発現を欠いているBT-474-M3乳癌細胞によって形成される腫瘍の大きさの低下を促進させた（図25B）。

実施例26:B2B3-1は、PTEN活性が減少しているBT-474-M3乳癌細胞におけるErbB3シグナル伝達を阻害する。
B2B3-1が腫瘍異種移植片におけるErbB3シグナル伝達のリン酸化を阻害する能力をPTEN欠損BT-474-M3モデルを用いて研究した。操作された細胞株または対照の細胞株の異種移植片腫瘍を30mg/kgのB2B3-1、17.5mg/kgのHSAを用いて3日ごと、または10mg/kgのハーセプチンで毎週処置して、腫瘍を最終用量の24時間後に回収した。腫瘍を溶解して、SDS-PAGEに続いてウエスタンブロット分析に供して、B2B3-1標的ErbB3、AKTおよび総PTENレベルの相対的なレベルのリン酸化を評価した。等量のタンパク質を各々のレーンにロードして、総タンパク質レベルはPCNAについてプローブすることによって制御した。リン酸化ErbB3に特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析によって、B2B3-1処置した腫瘍は、HSA処置した腫瘍またはハーセプチン処置した腫瘍よりも含むpAKTが少ないことが示される（図26A）。ウエスタンブロット分析の濃度測定、続いて平均のPCNA積分バンド強度への平均pAKT積分バンド強度の正規化によって、B2B3-1処置した腫瘍が、対照のHSA処置した腫瘍およびハーセプチン処置した腫瘍よりも含むpAKTが有意に少ないことが示された（図26B）。

実施例27
B2B3-1の薬物動態学的パラメーターをnu/nuマウスで検討した。動物を群に無作為化して、5、15、30または45mg/kgという単一用量のB2B3-1を静脈内（IV）投与した（それぞれ、図27A〜図27D）。血液を投与前に、ならびに投与後0.5、4、8、24、48、72、および120時間で収集した。3匹のマウスを各々の時点で用いた。B2B3-1の血清レベルを2つのELISA方法を用いて測定した。第一の方法は、ErbB2およびErbB3の両方に対するB2B3-1の機能的な結合を要するが、第二の方法は、血清中のB2B3-1のHSA成分のみを測定する。HSAのELISAは、ポリクローナルの抗HSA捕獲抗体およびHRPコンジュゲートされたポリクローナル抗HSA検出抗体を利用する。HSA法に対してErbB2/ErbB3結合方法を用いて測定したB2B3-1血清濃度の減少によって機能的なB2B3-1の損失が示されるであろう。図27のA〜Dは、B2B3-1の薬物動態学的特性が、いずれのELISA方法を用いて評価した場合も、匹敵することを示しており、このことはB2B3-1がマウスの循環中で安定であることを示している。

実施例28
B2B3-1血清濃度は、2コンパートメントの、双指数モデルを用いてあてはめられ、二相性の性質を示した。終末半減期は、それぞれ、5、15、30、または45mg/kg用量において、17、16、23および18時間であると計算され、表4に示される。B2B3-1用量の増大は、曝露の直線的な増大を生じた（図28）。

（表４）マウスおよびカニクイザルでのB2B3-1の薬物動態学的特性

*動物の回復

実施例29
薬物動態分析のための血液サンプルはまた、雌カニクイザルで用量範囲決定の毒性研究から得た。この研究では、動物に4、20または200mg/kgのB2B3-1を用いて3日ごとに4用量注入投与した。サンプリングは、投与前およびピーク/トラフ濃度を得るために、各々の投与日（研究日、1日、4日、7日および10日）の投与前および5分後に、そして1日目の最初の注入の1、2、4、8、24および48時間後、ならびに10日目の最終の注入の1、2、4、8、24、48、72および120時間後に行った。投与した動物の回復については、200mg/kgの血清サンプルをまた最後の注入後、168時間、336時間および456時間で収集した。

カニクイザルの血清サンプルは、前に記載のErbB2/ErbB3 ELISA法を用いてアッセイした。各々の用量の経時的な血清濃度は図29に示す。この分析によって、1日および10日で投与した後の血清B2B3-1の平均の濃度-時間のプロフィールが質的に同様であって、濃度はCmaxから時間とともに徐々に低下していることが示された。平均の推定半減期は、1日目に38.3〜67.2時間におよび、10日目に45.0〜121.0時間におよんだ（表4）。

実施例30
B2B3-1二重特異性scFv抗体融合タンパク質をコードするプラスミドは、固有のヒト抗ErbB3 scFv（「H3」と命名される）、ヒト抗ErbB2 scFv（「B1D2」と命名される）、および改変されたヒト血清アルブミン（HSA）リンカーの遺伝子配列を組み合わせて作製した。抗ErbB3 scFv、H3は、接続ペプチド（Ala-Ala-Ser）を介してHSAリンカーのアミノ末端に組み換え的に連結し、抗ErbB2 scFv,B1D2は接続ペプチド（Ala-Ala-Ala-Leu）を介してHSAリンカーのカルボキシ末端に遺伝的に連結する。このペプチドコネクターは、哺乳動物の発現ベクターの構築の間の制限部位の導入によって形成し、単鎖抗体フラグメントおよびHSAリンカーと一緒に哺乳動物発現のための最適のコドン用法で合成した。

B1D2 scFvは、非免疫ファージディスプレイライブラリーから選択したErbB2-結合scFv C6.5の突然変異誘発によって作製したコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーから選択した。H3 scFvは、もともとSheetsらが作製した非免疫ファージディスプレイライブラリーから選択した。B1D2およびH3単鎖抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を、CHO細胞コドン優先について最適化し、B2B3-1をコードするプラスミドの引き続く構築のために合成した。

この改変されたHSAリンカーは2つのアミノ酸置換を含む。34位置でのシステイン残基をセリンに変異して、この部位での酸化に起因する潜在的なタンパク質異質性を軽減した。アミノ酸503のアスパラギン残基を、野性型HSAでは脱アミノに感受性であり、かつ薬理的な半減期の低下を生じ得るグルタミンに変異した。

改変HSAリンカーをコードする遺伝子配列を、B2B3-1をコードするプラスミドの引き続く構築のための哺乳動物発現のための最適のコドン用法で合成した。

実施例31
B2B3-1コード配列を標準的な分子生物学的技術を用いてpMP10kベースのベクター中にクローニングして、図30に示されるプラスミドpMP10k4H3-mHSA-B1D2を作製した。ほとんどの部分についてこの構築物は、通常用いられる遺伝子エレメントを使用する。B2B3-1発現は、ヒトGAPDプロモーターによって駆動される。このベクターは、マトリックス付着領域またはMARエレメントと呼ばれる遺伝子エレメントを利用する。このMAR遺伝子レエレメントは、クロマチンの動的な機構を制御して、隣接する遺伝子を周囲のクロマチンの影響から遮断し、それによって遺伝子のコピー数依存、位置独立性、発現を増大する。MARエレメントは組み換えタンパク質の産生のための発現の所望のレベルを示しているクローンを単離する可能性を向上し、かつ産生の安定性を増大することが示されている。B2B3-1構築物で用いられるMARエレメントは非コードヒトMARエレメントである。B2B3-1プラスミドに加えて、ネオマイシン抗生物質耐性プラスミド（図31）およびハイグロマイシン耐性プラスミド（図32）も安定な形質転換体を選択するために用いられた。

実施例32:初回の遺伝子トランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary）CHO-K1細胞をATCC（ATCC ＃ CCL-61）から購入した。CHO-K1細胞株は、T.T.Puckが作製した親のCHO細胞株の血清およびプロリン依存性の接着性サブクローンである。B2B3-1トランスフェクションに用いられるCHO-K1細胞は、トランスフェクションの前に血清なしの培地中で懸濁成長のために前適合させた。反復トランスフェクション手順を用いて、B2B3-1細胞株を成長させた。トランスフェクションの24時間前に、CHO-K1細胞を1.0×10⁶細胞/mLまで、8mMのL-グルタミン、0.1mMのヒポキサンチンナトリウム、および0.016mMのチミジンを補充したSFM4CHO（Serum Free）培地（HyClonc,Logan,UT）中でサブ継代した。トランスフェクションの日、細胞をOptiMEM培地（Invitrogen Corp,Carlsbad,CA）中に再懸濁して、40,000個の細胞を24ウェルプレートの各々のウェル中に入れた。最初のトランスフェクションでは、B2B3-1発現プラスミド（pMP10k4H3-mHSA-B1D2）およびネオマイシン耐性プラスミド（図30;pSV2-ネオ（Selexis,Inc.,Marlborough,MA）を、75:1（B2B3-1:ネオマイシン耐性）というモルプラスミド比を用いて一緒に混合した。そのプラスミド混合物を引き続き、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（Lipofectamine LTX,Invitrogen Corp,Carlsbad,CA）と混合し、30分間、脂質/DNA複合体を形成させた。DNA/脂質複合体を次にCHO-K1細胞に添加して、24ウェルのプレートを37℃、5％CO₂のインキュベーター中に入れた。

実施例33:高プロデューサーのための選択およびスクリーニング
各々のトランスフェクションウェルの内容物をPBSで洗浄し、トリプシン処理して、2つの96ウェルプレートにわたって分配した。用いた増殖培地は、10％のFBS（Invitrogen Corp,Carlsbad,CA）および500mg/Lのジェネティシン（G418;Invitrogen Corp,Carlsbad,CA）を補充したDMEM/F12（Invitrogen Corp,Carlsbad,CA）からなった。96ウェルプレート中の培地は、4日目に、8mMのL-グルタミン、0.1mMのヒポキサンチンナトリウム、0.016mMのチミジン、および500mg/Lのジェネティシンを補充したSFM4CHO培地に交換した。選択培地中でのさらに2週間の培養後、生きている細胞は明確なコロニーを形成した。このクローンを、定量的スポットブロット技術を用いて評価した。最大産生コロニーをトリプシン処理して、24ウェルプレートの単一のウェルに拡張した。

7日の生産性アッセイを用いて、高B2B3-1産生コロニーをスクリーニングした。拡張の際、24ウェルプレート中の細胞を、8mMのL-グルタミン、0.1mMのヒポキサンチンナトリウム、および0.016mMのチミジンを補充したSFM4CHO培地中で7日間増殖させた。使われた培地中のB2B3-1濃度を決定した。24ウェルスケール由来の最良クローンを125mLのバッフル付き振盪フラスコ中に拡張させた。8mMのL-グルタミン、0.1mMのヒポキサンチンナトリウム、および0.016mMのチミジンを補充したSFM4CHO培地中での振盪フラスコでの7日の研究を用いて、成長およびB2B3-1産生のための細胞プールをスクリーニングした。

実施例34:2回目の遺伝子トランスフェクション
初回のトランスフェクション（前記）から決定した最高産生の細胞プールを2回目にトランスフェクトして産生物を増大した。トランスフェクションの24時間前、細胞プールを1.0×10⁶細胞/mLまで、8mMのL-グルタミン、0.1mMのヒポキサンチンナトリウム、および0.016mMのチミジンを補充したSFM4CHO（Serum Free）培地中でサブ継代した。トランスフェクションの日、細胞をOptiMEM培地（Invitrogen Corp,Carlsbad,CA）中に再懸濁して、40,000個の細胞を24ウェルプレートの各々のウェル中に入れた。最初のトランスフェクションでは、B2B3-1およびハイグロマイシン耐性プラスミド（図32;pTK-Hyg（Clontech,Mountain View,CA））を50:1（B2B3-1:ハイグロマイシン耐性）というモルプラスミド比を用いて一緒に混合した。そのプラスミド混合物を引き続き、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（Lipofectamine LTX,Invitrogen Corp）と混合し、30分間、脂質/DNA複合体を形成させた。DNA/脂質複合体を次にこの細胞プールに添加して、24ウェルのプレートを37℃、5％CO₂のインキュベーター中に置いた。

実施例35:2回目のトランスフェクションからの高プロデューサーの選択およびスクリーニング
各々のトランスフェクションウェルの内容物をPBSで洗浄し、トリプシン処理して、2つの96ウェルプレートにまたがって分配した。用いた増殖培地は、10％のFBSおよび400mg/LのハイグロマイシンB（Invitrogen Corp）を補充したDMEM/F12からなった。96ウェルプレート中の培地は、4日目に、8mMのL-グルタミン、0.1mMのヒポキサンチンナトリウム、0.016mMのチミジン、および400mg/LのハイグロマイシンBを補充したHyclone SFM4CHO培地に交換した。選択のさらに2週間後、生きている細胞は明確なコロニーを形成した。このクローンを、定量的スポットブロット技術を用いて評価した。最大産生コロニーをトリプシン処理して、24ウェルプレートの単一のウェルに拡張した。

7日の生産性アッセイを用いて、高B2B3-1産生コロニーをスクリーニングした。拡張の際、細胞を7日間増殖させ、使われた培地中のB2B3-1濃度を決定した。

24ウェルプレート由来の最良クローンを、8mMのL-グルタミン、0.1mMのヒポキサンチンナトリウム、および0.016mMのチミジンを補充したHyclone SFM4CHO培地中で125mLのバッフル付き振盪フラスコ中に拡張させた。振盪フラスコでの7日の研究を用いて、成長およびB2B3-1産生のための細胞プールをスクリーニングした。使われた培地をProtein AresinおよびHPLC装置を用いて定量した。

実施例36:限界希釈クローニング
産生アッセイによって特定され最良増殖でかつ最高のB2B3-1産生性のコロニーを、125mLの振盪フラスコから移して、5つの96ウェルプレート中に、計算した細胞濃度でプレートして、1ウェルあたり1細胞とした。96ウェルのプレートを37℃でかつ5％CO₂のインキュベーターに入れた。そのウェルを週2回検査して、コロニーの形成を追跡した。単一の細胞から生じるコロニーをそのコロニーの対称形状に基づいて特定した。このようなコロニーを含むウェルに、24ウェルの7日アセスメント、および125mLの振盪スラスコの7日アセスメントによるさらなるスクリーニングのために印を付けた。

2回目の限界希釈クローニングを1回目と同様の方式で行った。追加の100mLのフィードバッチ評価を行って、クローンの選択を確認した。プレシードバンクを凍結保存した。

実施例37:B2B3-1の製剤
B2B3-1は、患者の耐容度に応じて、60分または90分の間隔にわたって静脈内インフュージョンを介して週に1回投与してもよい。B2B3-1は、無菌の20mMのL-ヒスチジン塩酸塩、150mMの塩化ナトリウム、pH6.5の溶液中に、患者（例えば、ヒト）への投与用に25mg/mLの濃度で処方してもよい。

実施例38:乳癌の治療
本発明のHSAリンカー（例えば、B2B3-1;配列番号16）を乳癌と診断された患者に投与してもよい。例えば、その癌が高レベルの上皮細胞成長因子レセプター、例えば、ErbB2（HER2/neu）を発現すると診断される患者は、ErbB2結合部分に結合されたHSAリンカーで治療されてもよい。乳癌と診断された患者を治療する医師は、その患者に適しており、かつ最適の治療利益をもたらし得る本発明のHSAリンカーを投与できる。本発明のHSAリンカーに結合された、例えば、結合部分の選択は、患者および特異的な癌変異体の臨床的決定に基づいてもよい。例えば、癌生検の遺伝型または組織学的スクリーニングによって、ErbB2の発現の増大が明らかになる場合があり、これによって抗ErbB2結合部分（例えば、B2B3-1）を組み込む本発明のHSAリンカーが治療的に用いられ得ることが示される。

本発明の一態様では、B2B3-1は、患者の耐容度次第で、例えば、60分または90分という期間にわたって静脈内注入を介して週に1回、乳癌と診断された患者に投与され得る。B2B3-1は、無菌の20mMのL-ヒスチジン塩酸塩、150mMの塩化ナトリウム、pH6.5の溶液中に、患者（例えば、ヒト）への投与用に25mg/mLの濃度で処方してもよい。本発明のB2B3-1または任意の他のHSAリンカーの投与を監督する臨床家は、任意の所定の患者のために治療の適切な経過を決定するための一般的な製剤および投与実務に従ってもよい。

本発明はさらに、ドキソルビシン、シクロホスファミドおよびパクリタキセルを含めて乳癌の治療のための一般的な化学療法計画のような、本発明のHSAリンカー（例えば、B2B3-1;配列番号16）と組み合わせた一つまたは複数の治療薬物または化合物の同時投与を提供する。あるいは、臨床家は、本発明のHSAリンカー（例えば、B2B3-1）を、外科的療法または放射線療法と組み合わせて投与して、その必要がある患者で乳癌を治療してもよい。

実施例39:卵巣癌の治療
本発明のHSAリンカーは、卵巣癌（卵巣癌腫）と診断された患者に投与されてもよく、例えば、その癌がErbB2（HER2/neu）などの上皮細胞成長因子レセプターを高レベルので発現すると診断されている患者をErbB2結合部分に結合されたHSAリンカーで治療してもよい。卵巣癌と診断された患者に対して医師が提供する治療は、その患者に適しており、かつ最適の治療利益をもたらし得る本発明のHSAリンカーを投与できる。本発明のHSAリンカーに結合された、例えば、結合部分の選択は、患者および特異的な癌変異体の臨床的決定に基づいてもよい。例えば、癌生検の遺伝型または組織学的スクリーニングによって、抗ErbB2結合部分（例えば、B2B3-1）または他の標的特異的結合部分を組み込む本発明のHSAリンカーによって標的され得るErbB2または他の標的分子（例えば、過剰発現された、癌に特異的なレセプターまたはリガンド）の発現の増大が明らかになる場合がある。

本発明の一態様では、B2B3-1は、患者の耐容度次第で、例えば、60分または90分という期間にわたって静脈内注入を介して週に1回、卵巣癌と診断された患者に投与され得る。B2B3-1は、無菌の20mMのL-ヒスチジン塩酸塩、150mMの塩化ナトリウム、pH6.5の溶液中に、患者（例えば、ヒト）への投与用に25mg/mLの濃度で処方してもよい。卵巣癌の治療のために本発明のB2B3-1または任意の他のHSAリンカーの投与を監督する臨床家は、任意の所定の患者のために治療の適切な経過を決定するための一般的な製剤および投与実務（例えば、腹腔内注射）に従ってもよい。

本発明はさらに、本発明のHSAリンカー（例えば、B2B3-1;配列番号16）と組み合わせた一つまたは複数の治療薬物または化合物の同時投与を提供する。あるいは、臨床家は、本発明のHSAリンカーを、外科的療法または放射線療法と組み合わせて投与して、その必要な患者で乳癌を治療してもよい。

実施例40
本発明のHSAリンカーコンジュゲート類は、下の表5に列挙される一つまたは複数の要素（グループA〜E）を用いて構築され得る。詳細には、下の表5にグループCとして示される本発明のHSAリンカーは、表5に示される群Aおよび群Eから選択される一つまたは複数の結合部分を組み込んでもよい。さらに、HSAリンカーコンジュゲートはまた、表5のグループBおよびDから選択される一つまたは複数のペプチドコネクターを、HSAリンカーのアミノ末端およびカルボキシ末端の各々で含んでもよい。ペプチドコネクターは、コネクター配列の長さを増大するかまたは減少するために繰り返されてもよいし、または短縮されてもよい。

本発明は、上記で考察されるHSAリンカー、ポリペプチドコネクターおよび結合部分の特定の態様を提供する。表6は、種々のErbB2特異的結合部分またはErbB3特異的結合部分との10個のHSAリンカーコンジュゲート、ならびにポリペプチドコネクターを、本発明のHSAリンカーのアミノ末端およびカルボキシ末端で列挙する。

（表６）

添付A
配列表

添付B
配列アラインメント

CDRループは、H3（ピンクつきのブルーのCDR）およびB1D2（シアンつきのピンクのCDR）内で強調している。改変したHSAに対するコネクターを赤色で示す。
B2B3/mHSA変異体についての配列アラインメント

添付C
抗癌剤

他の態様
本発明をその特定の態様を参酌して記載してきたが、さらなる改変が可能であること、および本出願は、概して本発明の原理に従う本発明の任意の変異、用途または適応を包含することを意図しており、このような技術分野内で公知のまたは慣行とされ、かつ本明細書の以前に示される本質的な特徴に適用可能であり得る本発明の開示からのこのような逸脱を含むことが理解されるであろう。

本明細書に言及される全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願がその全体が参照により組み込まれることが詳細にかつ個々に示されるのと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

ヒト血清アルブミン（HSA）リンカーと第一および第二の結合部分とを含むHSAリンカーコンジュゲートであって、以下からなる群より選択される、HSAリンカーコンジュゲート：
a)配列番号17であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-2；または
b)配列番号18であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-3；または
c)配列番号19であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-4；または
d)配列番号20であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-5；または
e)配列番号21であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-6；または
f)配列番号22であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-7；または
g)配列番号23であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-8；または
h)配列番号24であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-9；または
i)配列番号25であるアミノ酸配列を含むHSAリンカーコンジュゲートB2B3-10。
配列番号17のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号17のアミノ酸配列からなる、請求項２記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号18のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号18のアミノ酸配列からなる、請求項４記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号19のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号19のアミノ酸配列からなる、請求項６記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号20のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号20のアミノ酸配列からなる、請求項８記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号21のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号21のアミノ酸配列からなる、請求項１０記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号22のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号22のアミノ酸配列からなる、請求項１２記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号23のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号23のアミノ酸配列からなる、請求項１４記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号24のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号24のアミノ酸配列からなる、請求項１６記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号25のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のHSAリンカーコンジュゲート。
配列番号25のアミノ酸配列からなる、請求項１８記載のHSAリンカーコンジュゲート。
薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と混合された、請求項１〜１９のいずれか一項記載のHSAリンカーコンジュゲート。
請求項１〜１９のいずれか一項記載のHSAリンカーコンジュゲートを含む、医薬。
シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン（caleachimicin）、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、タキサン、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、セツキシマブ、パニツムマブ、アナキンラ、ダウノルビシン、エトポシド、イリノテカン、ミトキサントロン、テニポシド、トポテカン、ゲフィチニブ、ラパチニブ、トシル酸ラパチニブ、エルロチニブ、ネラチニブ、タネスピマイシン、ブスルファン、クロラムブシル、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、6-チオグアニン、シトシンアラビノシド、アザチオプリン、カペシタビン、クラドリビン、フルダラビン、フロクスウリジン、ペメトレキセド、ペントスタチン、ラルチトレキセド、デキサメタゾン、プレドニゾン、アルデスロイキン、セジラニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブ、イキサベピロン、ナノ粒子パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エベロリムス、シロリムス、テムシロリムス、l-アルパラギナーゼ、オクトレオチド、アバレリックス、アフィモキシフェン、アナストロゾール、ビカルタミド、ブセレリン、セトロレリックス、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ゴセレリン、リュープロリド、メゲストロール、エストラジオール、メドロキシプロゲステロン、ナンドロロン、ニルタミド、トレミフェン、トリプトレリンパモ酸塩、エンザスタウリン、ロスコビチン、アルボシジブ、ロナファルニブ、およびそれらの誘導体からなる群より選択される一つまたは複数の治療剤と組み合わせて使用するための、請求項１〜２０のいずれか一項記載のHSAリンカーコンジュゲートを含む、組成物。
治療剤がトラツズマブである、請求項２２記載の組成物。
治療剤がラパチニブである、請求項２２記載の組成物。
治療剤がタキサンである、請求項２２記載の組成物。
タキサンがパクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項２５記載の組成物。
治療剤がレトロゾールである、請求項２２記載の組成物。
疾患または障害を有している哺乳動物の治療用の医薬の製造における、請求項１〜２０のいずれか一項記載のHSAリンカーコンジュゲートまたは請求項２２〜２７のいずれか一項記載の組成物の使用。
疾患または障害が増殖性疾患である、請求項２８記載の使用。
増殖性疾患が、細胞表面レセプターを通じた細胞シグナル伝達に関連している、請求項２９記載の使用。
増殖性疾患が固形腫瘍である、請求項２９または３０記載の使用。
増殖性疾患が黒色腫、明細胞癌、リンパ腫、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、または脳腫瘍である、請求項２９〜３１のいずれか一項記載の使用。
医薬が、シクロホスファミド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレスタチン、リゾキシン、ドリスタチン、アンサマイトシンp3、メイタンシノイド、アウリスタチン、カレアキマイシン、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドキソルビシン、タキサン、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、ラロキシフェン、レトロゾール、エピルビシン、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ナタリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、アバタセプト、エタネルセプト、セツキシマブ、パニツムマブ、アナキンラ、ダウノルビシン、エトポシド、イリノテカン、ミトキサントロン、テニポシド、トポテカン、ゲフィチニブ、ラパチニブ、トシル酸ラパチニブ、エルロチニブ、ネラチニブ、タネスピマイシン、ブスルファン、クロラムブシル、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、6-チオグアニン、シトシンアラビノシド、アザチオプリン、カペシタビン、クラドリビン、フルダラビン、フロクスウリジン、ペメトレキセド、ペントスタチン、ラルチトレキセド、デキサメタゾン、プレドニゾン、アルデスロイキン、セジラニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデタニブ、イキサベピロン、ナノ粒子パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エベロリムス、シロリムス、テムシロリムス、l-アルパラギナーゼ、オクトレオチド、アバレリックス、アフィモキシフェン、アナストロゾール、ビカルタミド、ブセレリン、セトロレリックス、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ゴセレリン、リュープロリド、メゲストロール、エストラジオール、メドロキシプロゲステロン、ナンドロロン、ニルタミド、トレミフェン、トリプトレリンパモ酸塩、エンザスタウリン、ロスコビチン、アルボシジブ、ロナファルニブ、およびそれらの誘導体からなる群より選択される一つまたは複数の治療剤と組み合わせて投与することにより哺乳動物を治療するためのものである、請求項２８〜３２のいずれか一項記載の使用。
一つまたは複数の治療剤がトラツズマブである、請求項３３記載の使用。
哺乳動物がヒトである、請求項２８〜３４のいずれか一項記載の使用。