WO2015102316A1 - 링커를 통해 연결된 동일한 표적 물질에 결합하는 항체 및 앱타머를 포함하는 집게 분자 및 이의 용도 - Google Patents

링커를 통해 연결된 동일한 표적 물질에 결합하는 항체 및 앱타머를 포함하는 집게 분자 및 이의 용도 Download PDF

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하상수
강성묵
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경희대학교 산학협력단
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    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the present invention provides a target material binding forceps molecule, a method for preparing the same, and a target material comprising the same, wherein the antibody or fragment thereof and aptamer binding to the second target position are linked via a linker.
  • the present invention relates to a composition for detecting or separating, a kit for detecting or separating a target substance containing the composition, a method for detecting or separating a target substance using the same, and a drug carrier in which a drug is mounted on the forceps molecule.
  • Antibodies are also proteins called immunoglobulins (Ig), from B cells used by the immune system to identify and neutralize foreign objects such as viruses and bacteria. It is a large Y-shaped protein produced.
  • the antibody is a substance that recognizes a specific portion of a foreign target called an antigen and specifically binds to generate an antigen-antibody reaction. Due to the specific binding between the antigen and the antibody, the antibody is used for detecting the antigen and further for diagnosing and treating diseases.
  • Antibody dimerization of antibodies has been reported as a method for improving the binding ability of such antibodies to target substances (Luo, Y. et al. , MAbs. 2009, 1 (5): 491-504).
  • the antibody has the disadvantages of low expression amount, low solubility, use of animal cell expressing cell line, high purification cost and low stability in reducing environment. Therefore, efforts to find a substance that can specifically bind to the target material in place of the antibody has been actively progressed.
  • aptamers are a special kind of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) which has a stable tertiary structure and has the characteristic of binding to a target molecule with high affinity and specificity.
  • the aptamer may be obtained from a nucleic acid library having a random sequence through a process of Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX).
  • aptamers are considered a good alternative to antibodies, and many aptamers are known to bind specifically to metal ions, small chemical molecules, proteins and even cells with nanomolar to picomolar dissociation constants. have.
  • aptamers have the following characteristics that are more advantageous in specific experiments compared to antibodies.
  • the first feature is that aptamers can be obtained from a nucleic acid library built to target certain molecules (from small inorganic ions to cells). This feature makes it possible to overcome the limitations of antibodies that must be obtained from cells or animals.
  • the second feature is that the aptamer selected from the library can be amplified or polymerized by PCR (polymerase chain reaction) in order to obtain a large amount of aptamer having high purity.
  • a third feature is that since aptamers have a relatively simple chemical structure, they are easy to modify their functional groups for other purposes, such as immobilization on solid surfaces. Finally, aptamers are much more stable than antibodies and can therefore be used in chemical applications that require more harsh conditions (high temperature or extreme pH). In addition, aptamers are highly economical because they can be chemically synthesized in large quantities, and have a target affinity comparable to that of antibodies, while being significantly smaller (about 1 to 2 nm) in size than antibodies.
  • AAP antibody-aptamer pincer
  • One object of the present invention is to provide a tongs molecule for binding a target substance, wherein an antibody or fragment thereof and aptamer binding to a second target position are linked via a linker.
  • Another object of the present invention is to prepare an antibody to which the first linker is bound and an aptamer to which the second linker is bound; And it provides a method for producing a target molecule binding forceps molecule comprising the step of linking the linker bound antibody and aptamer through a covalent bond.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing a target molecule binding forceps molecule, comprising reacting a crosslinking agent including a first functional group at one end and a second functional group at another end with an aptamer and an antibody. It is.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for detecting or separating a target substance including the target molecule binding forceps molecule.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for detecting or separating a target substance comprising the composition for detecting or separating the target substance.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for detecting or separating a target substance, the method including contacting a sample containing the target substance with a composition for detecting or separating the target substance.
  • Still another object of the present invention is to provide a drug carrier including the target molecule binding forceps molecule, wherein the aptamer binding to the second target position of the forceps molecule is loading a drug.
  • Antibody-aptamer forceps molecules comprising antibodies and aptamers targeting other binding sites of the same substance of the present invention have increased binding force tens to hundreds of times more with respect to the target molecule than when the antibody or aptamer alone is used. It can be usefully used for the detection and / or separation of trace targets.
  • the drug carrier prepared by the binding of the aptamer and the antibody of the present invention has an increased affinity for the target molecule, and thus may be used as a drug carrier for malignant tumors.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the application of the antibody-aptamer forceps molecule, drug delivery and release system according to the present invention and its principle of operation.
  • FIG. 2 shows the UV absorption spectrum of thrombin aptamers bound to anti-thrombin antibodies, specifically anti-thrombin antibodies (a) and anti-thrombin 29-mers bound to thrombin 15-mer aptamers (AAP-15). UV absorbance spectrum of anti-thrombin antibody (b) bound with aptamer (AAP-29).
  • FIG. 3 shows the UV absorbance spectra, showing the UV absorbance spectra for FAM-labeled thrombin (508 nM) (a) and FAM-labeled bovine serum albumin (BSA, 2.632 ⁇ M) (b).
  • FIG. 4 is a diagram showing the thrombin binding characteristics of the anti-thrombin antibody coupled with the anti-thrombin 15-mer aptamer according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the thrombin binding characteristics of the anti-thrombin antibody coupled with the anti-thrombin 29-mer aptamer according to an embodiment of the present invention.
  • AAP-HER2 antibody (a) bound to anti-HER2 aptamer, anti-HER2 antibody (b) bound to anti-thrombin 29-mer aptamer, single stranded DNA 1 (ssDNA1) UV absorbance spectra of anti-HER2 antibody (c) bound with anti-HER2 antibody (9G6) (d) bound with anti-HER2 aptamer.
  • FIG. 8 shows fluorescence spectral analysis of Dox-loaded anti-HER2 aptamers in the presence of HER2 epitope peptides.
  • Various concentrations of HER2 epitope solution were mixed with anti-HER2 aptamer 250 nM concentration at a fixed molar ratio of Dox 10 (a);
  • Various concentrations of Dox-loaded anti-HER2 aptamers were mixed with 250 nM HER2 epitope peptide concentrations at a fixed molar ratio of Dox 10 (b); Fluorescence spectra were obtained after 0.5 h (empty circles) and 6 h (filled circles), respectively.
  • 9 shows concentration dependent cell viability for SK-BR-3.
  • 9A shows the effect of AAP-HER2-Dox on the viability of SK-BR-3, MDA-MB-453 and MCF-7 cells.
  • 9B shows concentration dependent cell viability of AAP-HER2-Dox, Antibody-Dox, Aptamer-Dox, and Dox for SK-BR-3.
  • SK-BR-3 shows concentration dependent cell viability for SK-BR-3 in the presence of AAP-HER2-Dox, anti-HER2 antibody (antibody), anti-HER2-aptamer (aptamer).
  • SK-BR-3 cells were exposed to 0-100 nM for total antibody against AAP-HER2-Dox, anti-HER2 antibody, anti-HER2-aptamer.
  • Figure 11 shows the viability of SK-BR-3 according to time dependent incubation for Dox alone (black), Aptamer-Dox (grey), Antibody-Dox (white) and AAP-HER2-Dox (hatched), respectively. will be. 34 nM (a) and 340 nM (b) for total amount loaded and free Dox.
  • Figure 13 shows AAP-HER2-Dox, Dox-loaded anti-thrombin 29-mer aptamer bound anti-HER2 antibody, Dox-loaded ssDNA1 bound anti-HER2 antibody, anti-HER2 antibody (9G6) It shows concentration dependent cell viability against SK-BR-3 cells in the presence of bound Dox-loaded anti-HER2 aptamer and Dox alone.
  • FIG. 15 shows microscopic image analysis showing different intracellular fluorescence emission after 24 hours incubation of SK-BR-3 cells treated with AAP-HER2-Dox (0, 2.5, and 100 nM concentrations for Dox).
  • Column 1 phase difference image
  • Column 2 fluorescent image obtained with band pass filter for red fluorescence).
  • the present invention provides, in one aspect, a forceps molecule for binding a target substance, wherein an antibody or fragment thereof and aptamer binding to a second target position are linked via a linker.
  • the term “pincer” is a term used by an antibody or fragment thereof and an aptamer to describe the morphological features of a complex linked through a linker, which binds to a first target position of a target material according to the invention.
  • Complexes in which an aptamer that binds to an antibody or fragment thereof and a second target position through a linker bind to the same target substance but bind to different target positions and thus not to competitively bind to each other, but to complement one another. Therefore, it means a molecule with improved selectivity and sensitivity, which significantly improved the binding force to the target material.
  • the term "antibody” refers to a protein, also called immunoglobulin (Ig), used by the immune system to identify and neutralize foreign objects such as viruses and bacteria. It is a large Y-shaped protein produced from cells. This is called an immune response. This immune response can appear against all foreign substances coming into the body from the outside, and in particular, has been developed to effectively remove or suppress microorganisms that can cause infectious diseases. However, immune responses do not only occur against microorganisms, but they can also occur against many kinds of chemicals, their own cells, or cells transplanted externally. In general, a substance that induces various immune responses including an antibody production from the outside is defined as an antigen, and the immune response specifically refers to the specific binding to the antigen, thereby incapacitating the antigen.
  • Ig immunoglobulin
  • the antibody includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, whole antibodies and antibody fragments.
  • the term also includes chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and bivalent or bispecific molecules (eg, bispecific antibodies), diabodies, triabodies, and tetrabodies.
  • the term further encompasses single chain antibodies, caps, derivatives of antibody constant regions and artificial antibodies based on protein scaffolds that have a binding function to FcRn.
  • the total antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, each of which is linked by heavy and disulfide bonds.
  • the total antibody includes IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and IgG is a subtype, including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the antibody fragment refers to a fragment having an antigen binding function, and includes Fd, Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv.
  • Fd means the heavy chain portion included in the Fab fragment.
  • the Fab has one antigen binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain, and a first constant region of the heavy chain (CH1 domain).
  • F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Fv (variable fragment) means a minimum antibody fragment having only the heavy chain variable region and light chain variable region.
  • Double disulfide Fv (dsFv) is a disulfide bond is linked to the heavy chain variable region and the light chain variable region, and short chain Fv (scFv) is generally covalently linked to the variable region of the heavy chain and the light chain through a peptide linker.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., the entire antibody can be restricted to papain and Fabs can be obtained and pepsin can be used to obtain F (ab ') 2 fragments). Can be produced through genetic recombination techniques.
  • the fragment of the antibody used in the forceps molecule for the purposes of the present invention may be a fragment comprising an antigen binding site (paratope) which is a site that specifically recognizes and binds the antigen.
  • aptamer refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure as a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample. Through this binding, the presence of a target substance in a sample can be specifically confirmed.
  • Aptamer preparation is performed according to a general method for preparing aptamer, after determining and synthesizing the oligonucleotide having a selective and high binding ability to the target protein to be identified, and then linking the 5 'end or 3' end of the oligonucleotide to the linker. In order to be able to bind to the functional group of, it can be made by modifying with -SH, -COOH, -OH or -NH 2 .
  • the aptamer may be, for example, DNA having an amine group (-NH 2 ) group bonded to one end thereof, but is not limited thereto.
  • the aptamer that can bind to the target material of the present invention can be used as an aptamer by selecting oligonucleotides that specifically bind to the target material by using SELEX, which is an in vitro selection method.
  • SELEX which is an in vitro selection method.
  • the Selex method is an in-vitro selection method for finding single-stranded DNA or RNA oligonucleotides that perform various types of selected functions.
  • the Selex method allows for the selection of oligonucleotides from about 10 15 random populations of different sequences by the Selex method.
  • oligonucleotide has a unique three-dimensional structure
  • iterative selection of oligonucleotides with the desired function eg, selective recognition of the target material
  • traditional molecular biology By the method of amplification, the sequence of the selected oligonucleotide is amplified. Through this repetitive selection and amplification process, ultimately, oligonucleotides that have a selective binding to the desired molecule or transition states to its chemical process occupy the majority of the population. The sequence of each aptamer obtained at the end of this process is identified. Kits that automate this Selex are also available (eg, Biomek 2000 pipetting robot, Beckman Coulter, USA).
  • the aptamer may be freely selected according to the target material, and may specifically bind to the same target material as the target material specifically bound by the antibody or fragment thereof linked together through a linker, but may bind to different binding sites. It may be an aptamer, but is not limited thereto.
  • the aptamer may be a DNA aptamer, but is not limited thereto.
  • the linker linking the antibody or fragment thereof to the aptamer may be a chemical linker.
  • the forceps molecule according to the present invention is characterized by comprising an antibody and an aptamer specifically binding to different binding sites of the same target material. Therefore, these antibodies and aptamers are preferably kept in proper length, which can be achieved by linking using a linker. If the linker is too short, the relative movement or movement of the antibody or fragment thereof and the aptamer is constrained so that it does not bind to the same molecule but binds to a different molecule, resulting in a significant increase in the binding force expected when using the forceps molecule according to the present invention. Can not provide.
  • the linker is too long, the movement or movement of the antibody or fragment thereof and aptamer may be independent so that a problem of binding to different molecules rather than targeting a single molecule may appear. Therefore, it is important to choose a linker of the appropriate length.
  • the use of chemical linkers is advantageous.
  • the length of the linker may be adjusted by inserting polyethylene glycol (PEG) or the like and adjusting the number thereof.
  • the chemical linker may bind via an amine, carboxyl or sulfhydryl group on the aptamer and the antibody.
  • the chemical linker preferably comprises a functional group capable of forming a bond by targeting an amine group, a carboxyl group or a sulfhydryl group.
  • target substance includes, without limitation, a substance to be bound by using the forceps molecule of the present invention to perform separation or detection, and examples thereof include cells, proteins, nucleic acids, compounds, and the like. Materials that can be bound by antibodies or aptamers designed for the purpose of isolation or detection can be included without limitation.
  • the present invention provides a method for preparing an antibody, comprising: preparing an antibody or fragment thereof bound to a first linker and an aptamer bound to a second linker; And covalently connecting the antibody and the aptamer to which the linker is bound, an antibody or fragment thereof and an aptamer that binds to the second target position are linked via a linker. It provides a method for producing a forceps molecule for binding a target substance.
  • forceps molecules antibodies, fragments thereof, aptamers and linkers are as described above.
  • the antibody and aptamer to which the linker is bound are formed by addition, condensation or substitution reaction with a crosslinking agent via an amine, carboxyl or sulfhydryl group on the aptamer and the antibody. It may be.
  • the crosslinking agent is a carbodiimide, N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester), imidoester, pentafluor for binding to an aptamer or an antibody.
  • Pentafluorophenyl ester, hydroxymethyl phosphine, maleimide, haloacetyl, pyridyldisulfide, thiosulfonate and vinylsulfone It may be a compound comprising at least one functional group selected from the group containing, the functional group is preferably selected according to the type of functional group on the antibody or aptamer to be bonded through it.
  • Non-limiting examples of the crosslinker include EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), DCC (N, N'-dicyclohexylcarbodiimide), SATA (succinimidyl acetylthioacetate), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl-4- ( N-Dmaleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate), DMA (dimethyl adipimidate 2HCl), DMP (dimethyl pimelimidate 2HCl), DMS (dimethyl suberimidate 2HCl), DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate 2HCl), sulfo- Sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB), succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB), succini
  • the first linker and the second linker preferably further comprise functional groups capable of binding to each other to form a forceps-shaped molecule in addition to binding to the antibody or fragment thereof and aptamer.
  • the functional group bondable to each other may be a thiol group and an unsaturated carbon bond, but is not limited thereto.
  • the method may further include introducing a thiol group into either the first linker or the second linker.
  • anti-thrombin antibodies and aptamers each containing a primary amine group were used as functional groups.
  • the linker is bound by a condensation reaction of N-hydroxysuccinimide (NHS) by using a crosslinking agent including an N-acetyl-succinimidyl group capable of forming a bond by targeting an amine group. It could be.
  • the cross-linking agent reacted with the aptamer is a maleimido group containing a double bond at the other end
  • the cross-linking agent reacted with the antibody comprises an acetylthio group
  • the aptamer and the terminal is linked to a linker comprising a maleimido group at the terminal
  • a linker comprising a maleimido group at the terminal
  • the antibody in which the linker including the acetylthio group is bonded to the terminal was first reacted with NH 2 OH to convert to a thiol group.
  • the antibody having a linker comprising a thiol group at the terminal is reacted with an aptamer having a maleimido group at the terminal and reacted overnight at 37 ° C. for 0.5 to 1 hour and at 4 ° C. overnight.
  • Antibody-aptamer forceps molecules connected to each other through double bonds of pottery were obtained.
  • the present invention provides a method for binding to a first target position of a target substance, the method comprising reacting a crosslinker comprising a first functional group at one end and a second functional group at the other end with an aptamer and an antibody.
  • a crosslinker comprising a first functional group at one end and a second functional group at the other end with an aptamer and an antibody.
  • the forceps molecule, antibody, fragment thereof, aptamer, linker and crosslinker are as described above. Also functional groups on the antibodies or fragments thereof, aptamers and crosslinkers and their binding for mutual binding are also as described above.
  • the first functional group and the second functional group may be the same as or different from each other. More preferably, different ones may be used for the convenience of the reaction. If the first functional group and the second functional group are different from each other, one end of the crosslinker may specifically bind to the aptamer and the other end to the antibody through each functional group, thereby forming a forceps molecule by a one-pot reaction. can do.
  • the forceps molecule may be prepared by a sequential process of first reacting the antibody or fragment thereof or an aptamer and then reacting with the other. In this case, the concentration ratio of the antibody or fragment thereof or aptamer reacting with the crosslinker first may be adjusted to be 1: 1, that is, the binding occurs only through one of two functional groups on the same crosslinker molecule. Can be.
  • reaction of the crosslinker with the aptamer and the antibody may be performed simultaneously or sequentially.
  • reaction order is irrelevant.
  • the present invention provides a method for detecting a target substance including a forceps molecule for binding a target substance, wherein the antibody or fragment thereof and aptamer binding to the second target position are linked via a linker. Or a composition for separation is provided.
  • forceps molecules antibodies, fragments thereof, aptamers and linkers are as described above.
  • the forceps molecule may be used to detect or isolate target substances such as cells, proteins, nucleic acids, and compounds.
  • target substances such as cells, proteins, nucleic acids, and compounds.
  • the composition according to the invention can be used for the detection or separation of antigen as a target substance.
  • the present invention provides a kit for detecting or separating a target substance including the composition for detecting or separating the target substance.
  • the term “detection” refers to the act of confirming the presence of the target substance in the sample
  • “separation” refers to the act of selectively taking only the target substance from the mixed sample including the target substance.
  • the composition for detecting or separating the target material according to the present invention may be provided in the form of a biochip by immobilizing on a substrate or may be provided in a form filled in a column, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for detecting or separating a target substance, the method including contacting the sample containing the target substance with a composition for detecting or separating the target substance.
  • sample in the present invention includes, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, samples such as sputum, cerebrospinal fluid or urine, which are expected to contain the target substance to be detected.
  • the detection and separation method of the target material according to the present invention may further comprise the step of staining the target material in the sample with a phosphor or the like to facilitate the measurement or to enable quantitative analysis.
  • the present invention provides a drug delivery system comprising a forceps molecule for binding a target substance, wherein an aptamer binding to a second target position of the forceps molecule is loading a drug.
  • the drug can be loaded by known methods.
  • the drug bound to the aptamer in the drug carrier of the present invention is not particularly limited, but may be a drug to be specifically delivered to a target material.
  • it may be a chemical drug, a bio drug.
  • the chemicals include, for example, anti-inflammatory agents, analgesics, anti-arthritis agents, antispasmodics, antidepressants, antipsychotics, neurostabilizers, anti-anxiety agents, antagonists, antiparkin's disease drugs, cholinergic agonists, anticancer agents, antiangiogenic agents, Immunosuppressants, immunostimulants, antivirals, antibiotics, appetite suppressants, analgesics, anticholiners, antihistamines, antimigraine, hormones, coronary vessels, cerebrovascular or peripheral vasodilators, contraceptives, antithrombotics, diuretics, antihypertensives, Cardiovascular diseases treatment agents, diagnostic agents, cosmetic ingredients (eg, wrinkle improvement, skin aging
  • the drug is an anticancer agent.
  • the binding between the drug and the aptamer may be made in a covalent or non-covalent manner, and the drug may be noncovalently bound to the structure of the aptamer in an intercalation manner.
  • the aptamer is an oligonucleotide molecule, there is a base stacking of constituent bases, and the drug enters the intercalation method between the base stackings.
  • the AAP-HER2-Dox complex in which Dox (doxorubicin) is inserted into the DNA double structure of the anti-HER2 aptamer in an intercalation manner is Dox alone, aptamer-Dox, or antibody-Dox.
  • the killing of cancer cells, such as SK-BR-3 is particularly high, through which the drug carrier of the present invention significantly increases the affinity for the target molecule, to deliver the drug only to the target of interest It could be predicted that the therapeutic effect could be shown. This can be used for breakthrough drug delivery systems and release systems through the same.
  • the present invention provides the use of target specific binding of the forceps molecule or drug carrier.
  • anti-thrombin antibodies that specifically bind to them were purchased from Enzyme Research Laboratories and Santacruz biotech, respectively.
  • HER2 epitope peptides (INCTHSCVDLDDKGCPAEQR) were purchased from Peptron, in addition to 5 (6) -FAM, SE (5- (and-6) -carboxyfluorescein, succinimidyl ester) was purchased from ANA SPEC UV absorbance was measured using 8453 UV-visible spectrophotometer and fluorescence spectra were Synegy MX spectrofluorescence Was measured using. All experiments were performed in duplicate three times.
  • SATA sulfosuccinimidyl acetylthioacetate
  • Example 2.1 above. And the product obtained from 2.2 was mixed and reacted at 37 ° C. for 30 to 60 minutes. After reaction at 4 °C overnight. The reaction solution was centrifuged using 30k amicon. Buffer C was used as a solvent, and was repeated eight times for 30 minutes each at 10,000 rpm. The product was then stored at 4 ° C.
  • FIG. 2 shows the UV absorption spectrum of thrombin aptamers bound to anti-thrombin antibodies, specifically anti-thrombin antibodies (a) and anti-thrombin 29-mers bound to thrombin 15-mer aptamers (AAP-15). UV absorbance spectrum of anti-thrombin antibody (b) bound with aptamer (AAP-29).
  • FIG. 3 shows the UV absorption spectra, the results for FAM-labeled thrombin (508 nM) are shown in FIG. 3A.
  • BSA bovine serum albumin
  • FAM FAM was bound to BSA as in Preparation Example 1 above. Specifically, 103.8 ⁇ l of BSA solution (3 nmol) was prepared. To the BSA solution, 500 ⁇ l of PBS buffer (pH 7.0) and NaHCO 3 (pH 9.0) in a 20: 1 mixture (pH 8.3) were added. 6 ⁇ l (3 nmol) of a FAM solution prepared at a concentration of 500 ⁇ M was added to the solution and reacted at room temperature for 3 hours. The reaction solution was centrifuged using 30k microcon.
  • the binding force to thrombin of the forceps molecule prepared by binding the thrombin aptamer and anti-thrombin antibody prepared according to the present invention through a chemical linker was measured by dialysis. Specifically, the measuring device was filled with 10% ethanol using a 1-200 ⁇ l micropipette tip, and left in the same ethanol solution for 10 minutes. Then all the ethanol in the device was removed. Similarly deionized water was refilled using a tip for 1-200 ⁇ l micropipette and the device was left for 15-20 minutes in the same deionized water.
  • the fraction of thrombin (or BSA) that binds to the forceps molecule according to the concentration of the target substance is derived while changing the concentration of the reacted thrombin or BSA at the subnanomol concentration level ( ⁇ 1 nM) and 4 and 5 are shown.
  • the thrombin aptamer was used 15-mer and 29-mer DNA, the results for each is shown in Figures 4 and 5.
  • the anti-thrombin antibody and 15-mer thrombin aptamer bound antibody has a K d app (dissociaon constant) value of 567 pM for thrombin. Indicated.
  • AAP containing 29-mer aptamer was confirmed to bind to thrombin in the biphasic mode (biphasic mode) having a double K d app value of 64.5 pM and 101 pM.
  • both of the tong molecules showed little binding force to the BSA.
  • the K d app values of anti-thrombin antibodies, 15-mer DNA aptamers and 29-mer DNA aptamers reported in the art are 50 nM, 20.2 nM and 3.5 nM, respectively.
  • the binding force is 35 to 775 times improved compared to the reaction of the antibody or aptamer alone.
  • the forceps molecule according to the present invention has a very high specificity for the target molecule.
  • Binding of HER2 aptamer with HER2 antibody was made in the same way as binding of thrombin aptamer with thrombin antibody.
  • HER2 aptamer-crosslinker binding was prepared in the same way as thrombin aptamer-crosslinker binding.
  • Anti-human epidermal growth factor 2 (HER2) aptamer (SEQ ID NO: 3: 5 ') that specifically binds to HER2 -H2N- (CH2) 6-AACCG CCCAA ATCCC TAAGA GTCTG CACTT GTCAT TTTGT ATATG TATTT GGTTT TTGGC TCTCA CAGAC ACACT ACACA CGCAC A-3 ') was purchased from Bioneer.
  • a HER2 aptamer solution that specifically binds to HER2 was prepared and added to 350 ⁇ l of Buffer A (pH 7.2; 0.1 M sodium phosphate and 0.15 M sodium chloride).
  • Buffer A pH 7.2; 0.1 M sodium phosphate and 0.15 M sodium chloride.
  • SATA sulfosuccinimidyl acetylthioacetate
  • Example 4.1 above. And the product obtained from 4.2 was mixed and reacted at 37 ° C. for 30 to 60 minutes. After reaction at 4 °C overnight. The reaction solution was centrifuged using 30k amicon. Buffer C was used as a solvent, and was repeated eight times for 30 minutes each at 10,000 rpm. The product was then stored at 4 ° C.
  • Example 4 the anti-HER2 aptamer was combined with an anti-HER2 antibody (monoclonal antibody N12) to form AAP-HER2, and was formulated by binding Dox (doxorubicin) to the DNA structure of the anti-HER2 aptamer (hereinafter, , Named Dox-loaded AAP-HER2 or AAP-HER2-Dox).
  • Dox doxorubicin
  • This method was prepared according to Liu et al. (Liu et al. Journal of Translational Medicine 2012 , 10: 148).
  • AAP-HER2 antibody (a) bound to anti-HER2 aptamer, anti-HER2 antibody (b) bound to anti-thrombin 29-mer aptamer, single stranded DNA 1 (ssDNA1) UV absorbance spectra of anti-HER2 antibody (c) bound with anti-HER2 antibody (9G6) (d) bound with anti-HER2 aptamer.
  • anti-HER2 monoclonal antibody (N12) was covalently bound to each of the anti-thrombin 29-mer aptamer and ssDNA1.
  • anti-HER2 monoclonal antibody (9G6, Thermo) was used as another negative control in combination with anti-HER2 aptamer because it is known to have little potent killing effect compared to anti-HER2 antibody (N12).
  • the anti-HER2 aptamer has two recognition sites so that it can bind to the epitope peptide of HER2 with a Kd value of 18.9 nM or the extracellular domain of the HER2 protein with a Kd value of 316 nM.
  • the epitope of the anti-HER2 antibody is located at C531-A586, and the anti-HER2 antibody alone can inhibit the growth of HER2-positive tumor cells.
  • each of the two binding portions of AAP-HER2 or AAP-HER2-Dox can recognize different portions of the HER2 molecule, and the growth of tumor cells comprising HER2 is specifically inhibited by anti-HER2 antibodies and Dox. Can be.
  • AAP-HER2-Dox complex Formation of the AAP-HER2-Dox complex was confirmed based on the fact that fluorescent Dox (doxorubicin) can be quenched after being intercalated into the DNA duplex.
  • fluorescent Dox doxorubicin
  • FIG. 7 show that the anti-HER2 aptamer can be loaded into Dox, and exhibited the highest fluorescence emission when the aptamer and Dox were in a ratio of 1:10 (FIG. 7).
  • Dox could also be inserted more effectively into anti-HER2 aptamers than single-stranded DNA 1 or anti-thrombin 29-mer aptamers (ssDNA1, scrambled DNA sequences were used as negative controls) (FIG. 7D).
  • HER2 epitope solution Various concentrations of HER2 epitope solution were mixed with anti-HER2 aptamer 250 nM at a fixed molar ratio of Dox 10, and various concentrations of Dox-loaded anti-HER2 aptamer solution at a fixed molar ratio of Dox 10 resulted in HER2 epitope.
  • Fluorescence spectra of doxrubicin (Dox) were examined with a spectrophotometer of Synegy MX.
  • Fluorescence spectral analysis was performed to determine whether the presence of HER2 could alter the folding state of Dox-loaded anti-HER2 aptamer and affect the release of the drug (FIG. 8). 8 shows fluorescence spectral analysis of Dox-loaded anti-HER2 aptamers in the presence of HER2 epitope peptides.
  • HER2 epitope solution Various concentrations of HER2 epitope solution were mixed with anti-HER2 aptamer 250 nM concentration at a fixed molar ratio of Dox 10 (a); Various concentrations of Dox-loaded anti-HER2 aptamers were mixed with 250 nM HER2 epitope peptide concentrations at a fixed molar ratio of Dox 10 (b); Fluorescence spectra were obtained after 0.5 h (empty circles) and 6 h (filled circles), respectively.
  • Dox- K d app (apparent dissociation constant ) is approximately 50nM between the loaded -HER2 wherein the aptamer and HER2 epi top, as compared to the reported value between -HER2 wherein the aptamer and HER2 Kd of 18.9 nM, Dox Insertion suggests that some changes in the folding state of the anti-HER2 aptamer may be induced.
  • SK-BR-3, MDA-MB-453, and MCF-7 human breast cancer cells were obtained from ATCC, 2 mM L-glutamine, 10% fetal bovine serum, 100 IU / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin It was maintained in a tissue culture plate at 37 °C under an atmosphere of 5% CO 2 in RPMI-1640 medium containing. To keep cells in the log phase, fresh medium was reloaded two or three times a week.
  • Cell viability was measured using standard 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction assay. Briefly exponentially increasing cells were inoculated at 96 ⁇ well flat plates (200 ⁇ l / well) at a density of 5 ⁇ 10 3 per well and incubated at 37 ° C. for 24 hours. Then, AAP-HER2-Dox, antibody-Dox, aptamer-Dox, Dox, anti-HER2 antibody, and anti-HER2 aptamer, respectively, were exposed at various concentrations for 24 hours.
  • 9A shows the effect of AAP-HER2-Dox on the viability of SK-BR-3, MDA-MB-453 and MCF-7 cells.
  • 9B shows concentration dependent cell viability of AAP-HER2-Dox, Antibody-Dox, Aptamer-Dox, and Dox for SK-BR-3.
  • AAP-HER2-Dox can inhibit cell survival at different levels after 24 hours.
  • the obtained IC 50 values of AAP-HER2-Dox for SK-BR-3, MDA-MB-453 and MCF-7 cells were 15.5, 35.0 and 83.4 nM, respectively. This result is consistent with the cell expression level of HER2 and means that AAP-HER2-Dox can differentiate between target and non-target cells and can be used as DDS specific for cancer cells overexpressing HER2.
  • SK-BR-3 cells with high expression levels of HER2 at the cell membrane were selected and compared with AAP-HER2-Dox, Dox-mixed anti-HER2 ((antibody-Dox) or Dox-loaded anti-HER2 apps It was exposed to tamer (Aptamer-Dox).
  • cytotoxic effect of AAP-HER2-Dox was significantly different from the antibody Dox, aptamer-Dox or Dox alone in a concentration-dependent manner, and among the four substances, AAP-HER2-Dox was most prominent in SK-BR-3 cells.
  • IC 50 values for AAP-HER2-Dox, Antibody-Dox, Aptamer-Dox, and Dox are expected to have values of 15.5, 25.1, 38.6, and 43.9 nM for SK-BR-3, respectively, and AAP-HER2- This means that Dox has three times higher cytotoxicity than Dox.
  • SK-BR-3 shows concentration dependent cell viability for SK-BR-3 in the presence of AAP-HER2-Dox, anti-HER2 antibody (antibody), anti-HER2-aptamer (aptamer).
  • SK-BR-3 cells were exposed to 0-100 nM for total antibody against AAP-HER2-Dox, anti-HER2 antibody, anti-HER2-aptamer. Since the molar ratio of Dox / AAP-HER2 for AAP-HER2-Dox it is 1:10, IC 50 value for antibody concentration 1.55nM is equivalent to the IC 50 value for Dox concentrations 15.5nM.
  • Example 7.2 Measurement of Viability of Breast Cancer Cells of AAP-HER2-Dox Over Time
  • FIG. 11 shows SK-BR-3 according to time-dependent culture of Dox alone (black), Aptamer-Dox (grey), antibody-Dox (white) and AAP-HER2-Dox (hatched), respectively. Viability is shown. 34 nM (a) and 340 nM (b) for total amount loaded and free Dox. As a result, aptamer-Dox and antibody-Dox have a higher killing effect than Dox alone, which indicates that even in a short time, the presence of anti-HER2 aptamer or antibody increases the killing effect of Dox. Means.
  • FIG. 12 shows cells of SK-BR-3 according to time-dependent culture in the presence of Dox alone (a), aptamer-Dox (b), antibody-Dox (c) and AAP-HER2-Dox (d) Viability is shown.
  • Cells were exposed to 0-500 nM for loaded total and free Dox.
  • aptamer-Dox (b) and antibody-Dox (c) were more effective at killing cancer than Dox alone, which indicates that even in a short time, the presence of anti-HER2 aptamers or antibodies indicates that Dox can It means increasing the killing effect.
  • Example 7.3 Whether the increased cytotoxicity of the AAP system is actually due to bivalent recognition and Dox release
  • Figure 13 shows AAP-HER2-Dox, Dox-loaded anti-thrombin 29-mer aptamer bound anti-HER2 antibody, Dox-loaded ssDNA1 bound anti-HER2 antibody, anti-HER2 antibody (9G6) It shows concentration dependent cell viability against SK-BR-3 cells in the presence of bound Dox-loaded anti-HER2 aptamer and Dox alone.
  • SK-BR-3 cells were exposed to 0, 34, 68, 340, 510 nM from left to right for loaded total and free Dox, respectively.
  • FIG. 13 the effect of killing cells by the presence of either an anti-HER2 antibody or an aptamer is increased, whereby Dox-loaded anti-thrombin 29-mer aptamer, anti-HER2 antibody is bound.
  • Three negative controls of Dox-loaded ssDNA1 bound with -HER2 antibody and Dox-loaded anti-HER2 aptamer bound with anti-HER2 antibody (9G6) showed cytotoxicity similar to aptamer-Dox or antibody-Dox. Although shown, the increased cytotoxicity induced by one or two of the three individual components was of little significance compared to that induced by AAP-HER2-Dox or Dox alone.
  • Cytotoxicity of AAP-HER2-Dox was observed to be approximately 6 times higher than anti-HER2 antibody (N12 or 9G6) alone (FIGS. 12 and 13). This means that drug-loaded AAPs result in increased cytotoxicity in HER2-overexpressed human cells over each component in a cell- and concentration-dependent manner. These results reflect the difference between drug absorption mechanism and therapeutic antibody utility between antibody-Dox, aptamer-Dox, and Dox.
  • Fluorescence microscopy was used as shown in FIGS. 14 and 15 to assess intracellular uptake of Dox based on fluorescence emitted by the drug. Specifically, it was evaluated whether AAP-HER2-Dox was effectively occupied by cells, used as DDS of tumor targets, and maintaining the HER2-binding capacity of the aptamer portion of the complex while transporting the drug in the DNA structure. As a result, the complex stained most of the nuclei in HER2-overexpressed SK-BR-3 breast cancer cells (FIG. 14) and as a result had a low IC 50 .
  • FIG. 14 shows Dox release in SK-BR-3 cells treated with 100 nM in aptamer-Dox (column 1), antibody-Dox (column 2), and AAP-HER2-Dox (column 3). . Nuclei were stained by Hoechst 33258 and images confirmed after 4h incubation. As a result, AAP-HER2-Dox prepared by the binding of an antibody with drug loaded aptamer effectively increased the affinity of the AAP system for the target molecule and could be applied as a platform for target DDS against tumors. Do. This result is consistent with FIG.
  • FIG. 15 shows microscopic image analysis showing different intracellular fluorescence emission after 24 hours incubation of SK-BR-3 cells treated with AAP-HER2-Dox (0, 2.5, and 100 nM concentrations for Dox).
  • Column 1 phase difference image
  • Column 2 fluorescent image obtained with band pass filter for red fluorescence).

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Abstract

본 발명은 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 키트 및 이를 이용하는 표적 물질의 검출 또는 분리 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 표적 물질 결합용 집게 분자를 포함하는 약물 전달체로서, 상기 집게 분자의 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머는 약물을 로딩하고 있는 것인, 약물 전달체에 관한 것이다. 본 발명의 동일한 물질의 다른 결합자리를 표적으로 하는 항체와 앱타머를 포함하는 항체-앱타머 집게 분자는 해당 항체나 앱타머를 단독으로 사용하는 경우보다 표적 분자에 대해 수십 내지 수백배 증가된 결합력을 나타내므로 미량의 표적 물질의 검출 및/또는 분리에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 앱타머와 항체의 결합에 의해 제조된 약물 전달체는 타겟 분자에 대한 친화도가 증가하여, 악성 종양에 대한 약물전달체로 사용될 수 있다.

Description

링커를 통해 연결된 동일한 표적 물질에 결합하는 항체 및 앱타머를 포함하는 집게 분자 및 이의 용도
본 발명은 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 키트, 이를 이용하는 표적 물질의 검출 또는 분리 방법 및 상기 집게 분자에 약물이 탑재된 약물 전달체에 관한 것이다.
항체(antibody; Ab)는 면역글로불린(immunoglobulin; Ig)이라고도 불리는 단백질로, 바이러스나 박테리아와 같은 외래물질(foreign objects)을 동정하고(identify) 무효화하기(neutralize) 위하여 면역계에 의해 이용되는 B 세포로부터 생산되는 커다란 Y자형의 단백질이다. 상기 항체는 항원(antigen)이라 불리는 외래표적(foreign target)의 특정 부분을 인식하여, 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질이다. 이와 같은 항원과 항체의 특이적인 결합성으로 인해 항체는 항원의 검출, 나아가 질병의 진단 및 치료에 사용되고 있다. 이러한 항체의표적 물질에 대한 결합력을 향상시키기 위한 방법으로 항체의 이량체화(antibody dimerization)가 보고된 바 있다(Luo, Y. et al., mAbs. 2009, 1(5): 491-504). 그러나, 항체는 발현 양이 적고, 용해도가 낮으며, 동물세포 발현 세포주를 사용해야함은 물론, 정제 비용이 높고 환원적 환경에서 안정성이 떨어지는 등의 단점을 갖는다. 따라서, 항체를 대신하여 표적 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 발굴하고자 하는 노력이 활발히 진행되고 있다.
한편, 앱타머(aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 상기 앱타머는 무작위적인 서열을 가지는 핵산 라이브러리로부터 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정을 통해 얻을 수 있다.
이와 같은 앱타머는 항체의 좋은 대안으로 여겨지고 있는데, 많은 앱타머들은 금속이온들과 작은 화학 분자들, 단백질들, 심지어 세포에 대해서 나노몰에서 피코몰 수준의 해리상수를 가질 만큼 특이적으로 결합한다고 알려져 있다. 또한, 앱타머는 항체와 비교하여 구체적인 실험에서 보다 유리한 다음과 같은 특징들이 있다. 첫 번째 특징은 앱타머가 어떤 분자들(작은 무기이온들로부터 세포까지)을 표적으로 정할 수 있게 구축된 핵산 라이브러리로부터 얻을 수 있다는 점이다. 이와 같은 특징은 세포나 동물로부터 얻어져야 하는 항체의 제한점을 극복할 수 있게 한다. 두 번째 특징은 높은 순도를 가지는 앱타머를 다량 얻기 위하여 상기 라이브러리로부터 선정된 앱타머를 PCR(polymerase chain reaction) 과정을 통해 증폭시키거나 전사과정을 진행할 수 있다는 점을 들 수 있다. 세 번째 특징은 앱타머가 비교적 단순한 화학적 구조를 가졌기 때문에 고체표면에 고정화하는 등의 다른 목적으로 사용하고자 하는 경우 그 작용기를 수식하기 쉽다는 점이다. 마지막으로, 앱타머는 항체보다 훨씬 더 안정하기 때문에 좀 더 열악한 조건(높은 온도나 극단의 pH)을 필요로 하는 화학적 응용 과정에 이용될 수 있다. 그 밖에도 앱타머는 화학적으로 대량 합성이 가능하므로 경제성이 우수하고, 항체에 버금가는 표적 친화력을 가지는 한편, 그 크기는 항체에 비해 월등히 작다(약 1 내지 2 nm)는 특징을 가지고 있다.
항체나 앱타머보다 표적 물질에 대해 현저히 증가된 결합력을 나타냄으로써 미량의 표적 물질을 검출 및/또는 분리할 수 있는 물질을 고안하고자 예의 노력한 결과, 동일한 표적 분자의 서로 다른 결합자리에 특이적으로 결합하는 항체와 앱타머를 링커를 통해 연결시킨 집게 분자(antibody-aptamer pincer; AAP)가 표적 물질에 대해 단일 항체나 앱타머보다 현저히 향상된 결합력을 가짐을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 집게 분자에 약물 로드시, 타겟지향성 및 치료효능(예컨대, 항암 활성)이 모두 우수하게 이루어지는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제1 링커가 결합된 항체 및 제2 링커가 결합된 앱타머를 준비하는 단계; 및 상기 링커가 결합된 항체와 앱타머를 공유결합을 통해 연결시키는 단계를 포함하는, 상기 표적 물질 결합용 집게 분자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 일 말단에 제1 작용기 및 다른 말단에 제2 작용기를 포함하는 교차결합제를 앱타머 및 항체와 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 표적 물질 결합용 집게 분자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 물질 결합용 집게 분자를 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물과 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 물질의 검출 또는 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 물질 결합용 집게 분자를 포함하는 약물 전달체로서, 상기 집게 분자의 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머는 약물을 로딩하고 있는 것인, 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 동일한 물질의 다른 결합자리를 표적으로 하는 항체와 앱타머를 포함하는 항체-앱타머 집게 분자는 해당 항체나 앱타머를 단독으로 사용하는 경우보다 표적 분자에 대해 수십 내지 수백배 증가된 결합력을 나타내므로 미량의 표적 물질의 검출 및/또는 분리에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 앱타머와 항체의 결합에 의해 제조된 약물 전달체는 타겟 분자에 대한 친화도가 증가하여, 악성 종양에 대한 약물 전달체로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 항체-앱타머 집게 분자, 약물 전달 및 방출 시스템으로 적용 그리고 이의 작동 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 항-트롬빈 항체와 결합된 트롬빈 앱타머의 UV 흡광 스펙트럼을 나타내는데, 구체적으로 트롬빈 15-량체 앱타머(AAP-15)와 결합된 항-트롬빈 항체(a)과 항-트롬빈 29-량체 앱타머(AAP-29)와 결합된 항-트롬빈 항체(b)의 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 UV 흡광 스펙트럼을 나타내는데, FAM-표지된 트롬빈(508 nM)(a), 그리고 FAM-표지된 소 혈청 알부민(BSA, 2.632μM) (b)에 대한 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 항-트롬빈 15-량체 앱타머와 결합된 항-트롬빈 항체의 트롬빈 결합특성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 항-트롬빈 29-량체 앱타머와 결합된 항-트롬빈 항체의 트롬빈 결합특성을 나타낸 도이다.
도 6은 항-HER2 앱타머와 결합된 항-HER2 항체(AAP-HER2)(a), 항-트롬빈 29-량체 앱타머와 결합된 항-HER2 항체(b), 단일 가닥 DNA 1(ssDNA1)과 결합된 항-HER2 항체 (c), 항-HER2 앱타머와 결합된 항-HER2 항체(9G6) (d)의 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 Dox의 존재하에 항-HER2 앱타머 및 항-HER2 항체의 형광 스펙트럼 분석을 나타낸다. Dox의 몰비(아래에서 위쪽:0.5, 1, 4, 10, 50, 100)를 증가시키면서 항-HER2 앱타머의 농도는 고정하여 다양한 농도의 Dox 용액 제조 (a), Dox/항-HER2 앱타머의 몰비가 10 (b), Dox의 몰비(아래에서 위쪽 : 1, 2, 및 4) 를 증가시키면서 항-HER2 항체의 농도는 고정하여 다양한 농도의 Dox 용액 제조(아래에서 위쪽 : 1, 2, 및 4) (c), Dox 용액 (5 nmol) 단독(위), 항-트롬빈 29-량체 앱타머 50 nmol로 혼합하거나(중간), ssDNA1 50 nmol로 혼합하였으며(아래) 음성 대조군으로 (d)으로 사용되었다.
도 8은 HER2 에피톱 펩티드의 존재 하에서 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 형광 스펙트럼 분석을 나타낸다. 다양한 농도의 HER2 에피톱 용액은 고정된 Dox 10의 몰비에서 항-HER2 앱타머 250 nM 농도와 혼합되었다(a); Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 다양한 농도가 고정된 Dox 10의 몰비에서 HER2 에피톱 펩티드 250 nM 농도와 혼합되었다(b); 형광 스펙트럼은 각각 0.5h(빈원) 그리고 6h(채워진 원) 이후에 얻어졌다.
도 9는 SK-BR-3에 대한 농도 의존적인 세포 생존력을 나타낸다. 도 9a는 SK-BR-3, MDA-MB-453 및 MCF-7 세포의 생존력에 대한 AAP-HER2-Dox의 효과를 나타낸다. 도 9b는 AAP-HER2-Dox, 항체-Dox, 앱타머-Dox, 그리고 Dox의 SK-BR-3에 대한 농도 의존적인 세포 생존력을 나타낸다.
도 10은 AAP-HER2-Dox, 항-HER2 항체(항체), 항-HER2-앱타머(앱타머)의 존재하에서 SK-BR-3에 대한 농도 의존적인 세포 생존력을 나타낸다. SK-BR-3 세포는 AAP-HER2-Dox, 항-HER2 항체, 항-HER2-앱타머에 대한 총 항체에 대하여 0-100nM에 노출되었다.
도 11은 Dox 단독(검정), 앱타머-Dox(회색), 항체-Dox(흰색) 그리고 AAP-HER2-Dox(빗금) 각각에 대한 시간 의존적인 배양에 따른 SK-BR-3의 생존력을 나타낸 것이다. 로딩된 총양 그리고 프리 Dox에 대해서 34 nM (a), 340 nM(b)에 해당한다.
도 12는 Dox 단독 (a), 앱타머-Dox (b), 항체-Dox (c) 그리고 AAP-HER2-Dox (d)의 존재하에 시간 의존적인 배양에 따른 SK-BR-3의 생존력을 나타낸 것이다. 세포들은 로딩된 총양 그리고 프리 Dox에 대해서 0-500 nM에 노출되었다.
도 13은 AAP-HER2-Dox, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 항-트롬빈 29-량체 앱타머, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 ssDNA1, 항-HER2 항체(9G6)가 결합된 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머 그리고 Dox 단독 존재하에서 SK-BR-3 세포에 대한 농도 의존적인 세포 생존력을 나타낸다.
도 14는 앱타머-Dox (column 1), 항체-Dox (column 2), 그리고 AAP-HER2-Dox (column 3)에서 100 nM로 처리된 SK-BR-3 세포에서 Dox 방출을 나타낸다. 핵은 Hoechst 33258에 의해 염색되었고, 이미지는 4h 배양 후에 확인되었다.
도 15는 AAP-HER2-Dox(Dox에 관하여 0, 2.5, 그리고 100 nM 농도) 처리된 SK-BR-3 세포를 24시간 배양후에 다른 세포내 형광 방출을 보여주는 현미경 이미지 분석을 나타낸다. (Column 1 : 위상차 이미지, Column 2 : 빨간색 형광에 대한 밴드 패스 필터로 얻은 형광 이미지).
본 발명은 하나의 양태로서, 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자를 제공한다.
본 발명에서 용어 "집게 분자(pincer)"란 항체 또는 이의 단편 및 앱타머가 링커를 통해 연결된 복합체의 형태적인 특징을 묘사하기 위하여 사용한 용어로서, 본 발명에 따른 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된 복합체는 동일한 표적 물질에 결합하되 서로 다른 표적 위치에 결합하므로 표적 물질에 대하여 서로 경쟁적으로 결합하는 것이 아니라, 상호보완적으로 결합하므로 표적 물질에 대한 결합력이 현저히 향상된, 선택성 및 민감성이 향상된 분자를 의미한다.
본 발명에서 용어 "항체"란, 면역글로불린(immunoglobulin; Ig)이라고도 불리는 단백질로, 바이러스나 박테리아와 같은 외래물질(foreign objects)을 동정하고(identify) 무효화하기(neutralize) 위하여 면역계에 의해 이용되는 B 세포로부터 생산되는 커다란 Y자형의 단백질이다. 이를 면역 반응이라고 한다. 이러한 면역 반응은 외부에서 체내로 들어오는 모든 이물질에 대해 나타날 수 있으며, 그 중에서도 특히 감염성 질환을 일으킬 수 있는 미생물들을 효과적으로 제거하거나 억제하기 위하여 발전해 왔다. 그러나, 면역 반응은 단지 미생물들에 대해서만 일어나는 것은 아니며, 여러 종류의 화학물질이나 자신의 세포나 외부에서 이식된 세포에 대해서도 나타날 수 있다. 일반적으로 외부에서 들어와 항체 생산을 포함하는 각종 면역 반응을 유도하는 물질을 항원(antigen)이라고 정의하며, 면역 반응은 항원에 특이적으로 결합하여 결과적으로 해당 항원을 무력화시키는 것을 의미한다.
상기 항체는 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명의 목적상 집게 분자에 사용되는 항체의 단편은 항원을 특이적으로 인식하여 결합하는 부위인 항원결합부위(paratope)를 포함하는 단편일 수 있다.
본 발명에서 용어 "앱타머"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산 (DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 앱타머는, 일례로 일 말단에 아민기(-NH2)기가 결합된 DNA 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 표적 물질과 결합할 수 있는 앱타머는 인비트로 선택 방법인 셀렉스(SELEX)를 이용하여 표적 물질에 대해 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선택하여 앱타머로 이용할 수 있다. 셀렉스 방법은 다양한 형태의 선택된 기능을 수행하는 단일쇄 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드를 찾기 위한 인비트로 선택 방법으로서, 셀렉스 방법에 의해, 약 1015 개에 달하는 랜덤 집단의 서로 다른 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로부터 원하는 기능을 가진 앱타머를 찾을 수 있으며, 이때 각 올리고뉴클레오티드는 고유한 삼차원 구조를 가지며, 원하는 기능(예를 들어, 표적 물질에 대한 선택적 인식)을 가지는 올리고뉴클레오티드에 대한 반복적인 선택, 그리고 전통적인 분자생물학적인 방법에 의해 선택된 올리고뉴클레오티드의 서열을 증폭하게 된다. 이러한 반복적인 선택과 증폭 과정을 거치면서, 궁극적으로, 원하는 분자나 그 화학 과정에 대한 전이 상태(transition states)에 대해 선택적인 결합성을 가지는 올리고뉴클레오티드가 그 집단의 대부분을 차지하게 된다. 그리고 이러한 과정의 마지막에 얻어진 각 앱타머의 서열을 확인하게 된다. 이러한 셀렉스를 자동화한 키트 또한 구매가능하다(예를 들어, 바이오멕 2000 피펫팅 로봇(Biomek 2000 pipetting robot),Beckman Coulter(USA)).
상기 앱타머는 표적 물질에 따라 자유롭게 선택할 수 있으며, 바람직하게는 링커를 통해 함께 연결된 항체 또는 이의 단편이 특이적으로 결합하는 표적 물질과 동일한 표적 물질에 특이적으로 결합하되 상이한 결합자리에 결합할 수 있는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 앱타머는 DNA 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 항체 또는 이의 단편과 앱타머를 연결시키는 링커는 화학적 링커일 수 있다. 본 발명에 따른 집게 분자는 동일한 표적 물질의 다른 결합자리에 특이적으로 결합하는 항체와 앱타머를 포함하는 것이 특징이다. 따라서, 이들 항체와 앱타머는 적절한 길이를 유지하는 것이 바람직하며, 링커를 이용하여 연결함으로써 이를 달성할 수 있다. 링커가 너무 짧은 경우, 항체 또는 이의 단편 및 앱타머의 상대적인 이동 또는 움직임이 제약되어 동일한 분자에 결합하지 못하고 각기 다른 분자에 결합함으로써 본 발명에 따른 집게 분자를 이용하였을 때 기대되는 결합력의 현저한 증가를 제공할 수 없다. 한편, 링커가 너무 긴 경우, 항체 또는 이의 단편 및 앱타머의 이동 또는 움직임이 독립적이어서 단일 분자를 표적하지 못하고 각기 다른 분자에 결합하는 문제가 나타날 수 있다. 따라서, 적절한 길이의 링커를 선택하는 것이 중요하다. 이러한 측면에서 화학적 링커를 사용하는 것은 장점이 있다. 예컨대, PEG(polyethylene glycol) 등을 삽입하고 그 갯수를 조절하여 링커의 길이를 조절할 수 있다.
바람직하게, 상기 화학적 링커는 앱타머 및 항체 상의 아민기(amine), 카르복시기(carboxyl) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl)를 통해 결합할 수 있다. 따라서, 상기 화학적 링커는 아민기, 카르복시기 또는 설프히드릴기를 표적으로 하여 결합을 형성할 수 있는 작용기를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "표적 물질"이란, 본 발명의 집게 분자를 이용하여 결합시켜 분리 또는 검출 등을 수행하고자 하는 물질을 제한없이 포함하며, 그 예로는 세포, 단백질, 핵산, 화합물 등이 있다. 분리 또는 검출의 목적에 따라 디자인된 항체 또는 앱타머에 의해 결합할 수 있는 물질을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 제1 링커가 결합된 항체 또는 이의 단편 및 제2 링커가 결합된 앱타머를 준비하는 단계; 및 상기 링커가 결합된 항체와 앱타머를 공유결합을 통해 연결시키는 단계를 포함하는, 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자의 제조 방법을 제공한다.
상기 집게 분자, 항체, 이의 단편, 앱타머 및 링커에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
바람직하게, 상기 링커가 결합된 항체 및 앱타머는 앱타머 및 항체 상의 아민기(amine), 카르복시기(carboxyl) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl)를 통해 교차결합제와의 첨가, 축합 또는 치환반응에 의해 형성되는 것일 수 있다.
바람직하게, 상기 교차결합제는 앱타머 또는 항체와의 결합을 위해 카르보디이미드기(carbodiimide), N-히드록시숙신이미드에스테르(N-hydroxysuccinimide ester; NHS ester), 이미도에스테르(imidoester), 펜타플루오로페닐에스테르(pentafluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate) 및 비닐술폰(vinylsulfone)을 포함하는 군으로부터 선택되는 작용기를 하나 이상 포함하는 화합물일 수 있으며, 상기 작용기는 이를 통해 결합하게 되는 항체 또는 앱타머 상의 작용기의 종류에 따라 선택하는 것이 바람직하다.
상기 교차결합제의 비제한적인 예는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), SATA(succinimidyl acetylthioacetate), 술포-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-Dmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl Suberimidate·2HCl), DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), 술포-SIAB(sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SIAB(succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SBAP(succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate), SIA(succinimidyl iodoacetate), SM(PEG)n(succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-#ethyleneglycol ester, 상기 n=2, 4, 6, 8, 12 또는 24), SMCC(succinimidyl-4-(N-Dmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LC-SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)), 술포-EMCS(N-ε-maleimidocaproyl-oxysulfosuccinimide ester), EMCS(N-ε-maleimidocaproyl-oxysuccinimide ester), 술포-GMBS(N-γ-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester), GMBS(N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester), 술포-KMUS(N-κ-maleimidoundecanoyl-oxysulfosuccinimide ester), 술포-MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 술포-SMPB(sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB(succinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester), SMPH(succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, 술포-LC-SPDP(sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), LC-SPDP(succinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SMPT(4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha(2-pyridyldithio)toluene), DSS(disuccinimidyl suberate), BS(PEG)5(bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)), BS(PEG)9(bis(succinimidyl) nona(ethylene glycol)), BS3(bis[sulfosuccinimidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone), PDPH(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithiobis[succinimidyl propionate]), BM(PEG)n(1,8-bismaleimido-#ethyleneglycol, n=2 또는 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane), BMH(bismaleimidohexane), BMOE(bismaleimidoethane), DTME(dithiobismaleimidoethane), TMEA(tris(2-maleimidoethyl)amine), DSS(disuccinimidyl suberate), DST(disuccinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfosuccinimidylpropionate]), EGS(ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]), 술포-EGS(ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate]), TSAT(tris-succinimidyl aminotriacetate), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)일 수 있다.
상기 제1 링커 및 제2 링커는 항체 또는 이의 단편 및 앱타머와의 결합 이외에 집게 형태의 분자를 형성하기 위하여 서로 결합가능한 작용기를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
이때, 상기 서로 결합가능한 작용기는 티올기와 불포화 탄소결합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 상기 제1 링커 또는 제2 링커 중 어느 하나에 티올기를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 작용기로서 각각 일차아민기를 포함하는 항-트롬빈 항체 및 앱타머를 사용하였다. 이에 링커를 결합시키기 위하여, 아민기를 표적으로 하여 결합을 형성할 수 있는 N-아세틸-석신이미딜기를 포함하는 교차결합제를 사용하여, NHS(N-hydroxysuccinimide)를 탈락시키는 축합반응에 의해 링커가 결합될 수 있도록 하였다. 이때, 앱타머와 반응시킨 교차결합제는 다른 말단에 이중결합을 포함하는 말레이미도기를, 항체와 반응시킨 교차결합제는 아세틸티오기를 포함하므로, 말단에 말레이미도기를 포함하는 링커가 결합된 앱타머 및 말단에 아세틸티오기를 포함하는 링커가 결합된 항체를 형성하였다. 이때, 아세틸티오기로부터 말레이미도기의 이중결합으로 직접 첨가반응이 어려우므로, 말단에 아세틸티오기를 포함하는 링커가 결합된 항체를 먼저 NH2OH와 반응시켜 티올기로 전환하였다. 이에 따라 생성된 말단에 티올기를 포함하는 링커가 결합된 항체를 말단에 말레이미도기를 포함하는 링커가 결합된 앱타머와 37℃에서 0.5 내지 1시간 그리고 4℃에서 밤새도록 반응시켜 상기 티올기와 말레이미도기의 이중결합을 통해 서로 연결된 항체-앱타머 집게 분자를 수득하였다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 일 말단에 제1 작용기 및 다른 말단에 제2 작용기를 포함하는 교차결합제를 앱타머 및 항체와 반응시키는 단계를 포함하는, 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자의 제조 방법을 제공한다.
상기 집게 분자, 항체, 이의 단편, 앱타머, 링커 및 교차결합제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한 상호 결합을 위한 항체 또는 이의 단편, 앱타머 및 교차결합제 상의 작용기 및 이들의 결합 또한 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 제1 작용기 및 제2 작용기는 서로 같거나, 상이한 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 반응의 편의를 위하여 서로 상이한 것을 사용할 수 있다. 제1 작용기와 제2 작용기가 서로 상이한 경우, 각각의 작용기를 통해 교차결합제의 일 말단은 앱타머에, 다른 말단은 항체에 특이적으로 결합할 수 있으므로, one-pot 반응에 의해 집게 분자를 형성할 수 있다. 제1 작용기 및 제2 작용기가 서로 같은 경우에는 항체 또는 이의 단편, 또는 앱타머와 먼저 반응시킨 후, 다른 하나와 반응시키는 순차적인 과정을 통해 집게 분자를 제조할 수 있다. 이때, 교차결합제와 먼저 반응시키는 항체 또는 이의 단편, 또는 앱타머의 농도비를 적절히 조절하여 1:1로 즉, 동일 교차결합제 분자 상의 2개의 작용기 중 하나의 작용기를 통해서만 결합이 일어나도록 조절함으로써 수행될 수 있다.
이와 같이, 상기 교차결합제와 앱타머 및 항체와의 반응은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 순차적으로 수행하는 경우, 반응 순서는 무관하다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자를 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물을 제공한다.
상기 집게 분자, 항체, 이의 단편, 앱타머 및 링커에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 집게 분자는 세포, 단백질, 핵산 및 화합물 등의 표적 물질의 검출 또는 분리에 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 표적 물질로서 항원의 검출 또는 분리에 사용될 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 키트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "검출"은 시료 중의 표적 물질의 존재 여부를 확인하는 행위를 의미하며, "분리"는 표적 물질을 포함하는 혼합시료로부터 표적 물질만을 선택적으로 취하는 행위를 의미한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물은 기판 상에 고정시켜 바이오칩의 형태로 제공되거나, 컬럼에 충진시킨 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물과 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 물질의 검출 또는 분리 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "시료"란, 검출하고자 하는 표적 물질이 들어 있을 것으로 예상되는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 표적 물질의 검출 및 분리 방법은 측정을 용이하거나 정량 분석을 가능하게 하기 위하여 형광체 등으로 시료 중의 표적 물질을 염색하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 표적 물질 결합용 집게 분자를 포함하는 약물 전달체로서, 상기 집게 분자의 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머는 약물을 로딩하고 있는 것인, 약물 전달체를 제공한다.
상기 약물은 공지의 방법에 의해 로딩될 수 있다. 본 발명의 약물 전달체에서 앱타머에 결합되는 약물은 특별하게 제한되지 않으나, 표적 물질에 특이적으로 운반하고자 하는 약물일 수 있다. 그 예로 화학약물, 바이오약물 등 일 수 있다. 상기 화학약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스 질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 면역촉진제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제,피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제, 진단제, 미용성분(예컨대, 주름개선제, 피부노화억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약물은 항암제이다.
본 발명의 약물 전달체에서 약물과 앱타머 사이의 결합은 공유결합 또는 비공유결합 방식으로 이루어질 수 있으며, 약물은 상기 앱타머의 구조에 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 비공유결합 될 수 있다. 상기 앱타머는 올리고뉴클레오타이드 분자이기 때문에, 구성성분인 염기들의 염기스태킹(base stacking)이 있으며, 이 염기스태킹 사이에 약물이 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 들어가게 된다.
본 발명의 일실시예에서는 항-HER2 앱타머의 DNA 이중 구조에 Dox(독소루비신)이 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 삽입된 AAP-HER2-Dox 복합체가 Dox 단독, 앱타머-Dox, 항체-Dox에 비해, 암세포인 SK-BR-3의 사멸 등이 특이적으로 높은 것을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 상기 약물 전달체는 타겟 분자에 대한 친화도가 현저히 증가하여, 목적하는 타겟에만 약물을 운반하여 효과적인 치료 효능을 나타낼 수 있음을 예측할 수 있었다. 이를 통해 획기적인 약물 전달체 및 이를 통한 방출 시스템에 이용될 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 집게 분자 또는 약물 전달체의 표적 특이적 결합 용도를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 물질
트롬빈에 특이적으로 결합하는 서열의 15-량체(15-mer)(서열번호 1; 5'- H2N-(CH2)6-GGT TGG TGT GGT TGG-3' 및 29-량체(29-mer)(서열번호 2; 5'-H2N-(CH2)6-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'), HER2에 특이적으로 결합하는 항-인간 표피 성장인자 2 (HER2) (서열번호 3: 5'-H2N-(CH2)6-AACCG CCCAA ATCCC TAAGA GTCTG CACTT GTCAT TTTGT ATATG TATTT GGTTT TTGGC TCTCA CAGAC ACACT ACACA CGCAC A-3') 앱타머는 바이오니아로부터 구입하였다. 트롬빈 및 이에 특이적으로 결합하는 항-트롬빈 항체(F-1)는 각각 Enzyme Research Laboratories와 Santacruz biotech로부터 구입하였다. HER2 에피톱 펩티드(I-N-C-T-H-S-C-V-D-L-D-D-K-G-C-P-A-E-Q-R)는 펩트론에서 구입했다. 이 외에 5(6)-FAM, SE(5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester)는 ANA SPEC로부터 구입하였다. UV 흡광도는 8453 UV-가시 분광 광도계를 사용하여 측정하였으며, 형광 스펙트럼은 Synegy MX 분광형광 광도계를 사용하여 측정하였다. 모든 실험은 세 번씩 중복하여 실행하였다.
실시예 2: 트롬빈 앱타머와 트롬빈 항체의 결합
2.1. 트롬빈 앱타머와 크로스링커의 결합
Figure PCTKR2014012892-appb-I000001
트롬빈에 특이적으로 결합하는 15-량체 및 29-량체 DNA 앱터머 용액 15 ㎕(1.5 nmol)를 준비하여 완충액 A(pH 7.2; 0.1 M 인산나트륨 및 0.15 M 염화나트륨) 350 ㎕에 첨가하였다. 250 μM 농도로 제조한 술포-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 용액 60 ㎕를 상기 앱타머 용액에 첨가하고(술포-SMCC:앱타머=10:1 몰비) 실온에서 반응시켰다. 상기 반응물을 3k 아미콘(Amicon)을 이용하여 원심분리하였다. 용매로는 완충액 A를 사용하였다. 13,000 rpm으로 각 30분씩 8회 수행한 후, 동결건조시켜 보관하였다.
2.2. 항-트롬빈 항체와 크로스링커의 결합
Figure PCTKR2014012892-appb-I000002
트롬빈에 특이적으로 결합하는 항-트롬빈 항체 용액 225 ㎕(300 pmol)를 준비하여 완충액 B(pH 7.2; 0.1 M 인산나트륨(sodium phosphate), 0.15 M 염화나트륨 및 0.01 M EDTA) 300 ㎕에 첨가하였다. 250 μM 농도로 제조한 SATA(sulfosuccinimidyl acetylthioacetate) 용액 12 ㎕를 상기 항체 용액에 첨가하고(SATA:항체=10:1 몰비) 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 100 ㎖의 증류수에 NH2OH 1.65 g, 인산나트륨 1.20 g 및 EDTA 0.327 g을 용해시켜 pH 7.2의 0.5 M NH2OH, 0.1 M 인산나트륨 및 0.01 M EDTA 용액을 제조하였다. 상기 반응물에 제조한 NH2OH 용액 300 ㎕를 첨가하고 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 용액을 30k 아미콘을 이용하여 원심분리하였다. 이때, 용매로는 0.1 M 인산나트륨, 0.1 M NaCl, 0.01 M EDTA, pH 7.2의 완충액 C를 이용하였다. 상기 원심분리를 10,000 rpm으로 각 30분씩 8회 반복하였고, 이후 4℃에 보관하였다.
2.3. 항-트롬빈 항체와 트롬빈 앱타머의 결합
Figure PCTKR2014012892-appb-I000003
상기 실시예 2.1. 및 2.2로부터 수득한 생성물을 혼합하여 37℃에서 30 내지 60분 동안 반응시켰다. 이후 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 상기 반응 용액을 30k 아미콘을 이용하여 원심분리하였다. 용매로는 완충액 C를 사용하였으며, 10,000 rpm으로 각 30분씩 8회 반복하였다. 이후 생성물은 4℃에 보관하였다.
도 2는 항-트롬빈 항체와 결합된 트롬빈 앱타머의 UV 흡광 스펙트럼을 나타내는데, 구체적으로 트롬빈 15-량체 앱타머(AAP-15)와 결합된 항-트롬빈 항체(a)과 항-트롬빈 29-량체 앱타머(AAP-29)와 결합된 항-트롬빈 항체(b)의 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸다.
제조예 1: 트롬빈과 FAM의 결합
Figure PCTKR2014012892-appb-I000004
10 pmol/㎕의 농도로 제조한 트롬빈 용액 200 ㎕(2 nmol)를 준비하였다. 상기 트롬빈 용액에 PBS 완충액(pH 7.0)과 NaHCO3(pH 9.0)을 20:1로 혼합한 완충액(pH 8.3)을 500 ㎕ 첨가하였다. 상기 용액에 500 μM 농도로 제조한 FAM 용액을 4 ㎕(2 nmol) 첨가하고 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액을 30k 마이크로콘(microcon)을 이용하여 원심분리하였다. 용매로는 상기 혼합 완충액을 사용하였으며, 10,000 rpm으로 각 30분씩 8회 반복한 후 동결건조하여 보관하였다. 생성물은 UV 흡광도를 측정하여 정량하였다. 도 3은 UV 흡광 스펙트럼을 나타내는데, FAM-표지된 트롬빈(508 nM)에 대한 결과를 도 3a에 나타내었다.
제조예 2: 소형청알부민과 FAM의 결합
Figure PCTKR2014012892-appb-I000005
대조군으로서 트롬빈을 대신하여, 항-트롬빈 항체 및/또는 트롬빈 앱타머에 비특이적으로 결합하는 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)을 이용하였다. 정량을 위하여, 상기 제조예 1에서와 마찬가지로 BSA에 FAM을 결합시켰다. 구체적으로, 103.8 ㎕의 BSA 용액(3 nmol)을 준비하였다. 상기 BSA 용액에 PBS 완충액(pH 7.0)과 NaHCO3(pH 9.0)을 20:1로 혼합한 완충액(pH 8.3)을 500 ㎕ 첨가하였다. 상기 용액에 500 μM 농도로 제조한 FAM 용액을 6 ㎕(3 nmol) 첨가하고 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액을 30k 마이크로콘(microcon)을 이용하여 원심분리하였다. 용매로는 상기 혼합 완충액을 사용하였으며, 10,000 rpm으로 각 30분씩 8회 반복한 후 동결건조하여 보관하였다. 생성물은 UV 흡광도를 측정하여 정량하였다. 도 3은 UV 흡광 스펙트럼을 나타내는데, FAM-표지된 소 혈청 알부민(BSA, 2.632 μM)에 대한 결과를 도 3b에 나타내었다.
실시예 3: 투석(dialysis)을 이용한 집게 분자의 결합력 측정
본 발명에 따라 제조된 트롬빈 앱타머와 항-트롬빈 항체를 화학적 링커를 통해 결합시켜 제조한 집게 분자의 트롬빈에 대한 결합력을 투석법(dialysis)을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 1-200 ㎕ 마이크로 피펫용 팁을 사용하여 측정 장치에 10% 에탄올을 가득 채우고, 동일한 에탄올 용액에 10분간 방치하였다. 이후, 장치 내의 에탄올을 모두 제거하였다. 마찬가지로 1-200 ㎕ 마이크로 피펫용 팁을 사용하여 다시 탈이온수를 채우고 동일한 탈이온수에 장치를 15 내지 20분 동안 방치하였다. 장치 내의 탈이온수를 모두 제거하고 상기 실시예 2에서 제조한 15-량체 앱타머-항체 또는 29-량체 앱타머-항체 집게 분자와 제조예 1에 따라 제조한 트롬빈-FAM을 장치 안에 널고 총 부피가 1 ㎖이 되도록 PBS 완충액을 넣어주었다. 외부 완충액으로는 PBS 완충액 100 ㎖을 사용하였다. 상기 완충액에 장치를 담그고 마그네틱바를 이용하여 24시간 정도 교반하면서 평형이 되도록 실온에 두었다. 정량을 위하여 외부 완충액 200 ㎕를 취하여 형광을 측정하였다. 또한, 본 발명에 따른 집게 분자를 트롬빈 대신 FAM으로 표지한 BSA와 반응시키고 이를 대조군으로 사용하였다. 상기 반응시키는 트롬빈 또는 BSA의 농도를 서브나노몰농도 수준(~ 1 nM)에서 변화시키면서 표적물질의 농도에 따른 집게 분자에 결합하는 트롬빈(또는 BSA)의 분율(fraction of bound thrombin)을 도출하고 이를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 이때, 트롬빈 앱타머로는 15-량체 및 29-량체 DNA를 이용하였으며, 각각에 대한 결과를 도 4와 5에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 항-트롬빈 항체와 15-량체 트롬빈 앱타머를 결합시킨 집게 분자(antibody-aptamer pincer; AAP)는 트롬빈에 대해 567 pM의 Kd app(해리상수; dissociaon constant) 값을 나타내었다. 한편, 도 5에 나타난 바와 같이, 29-량체 앱타머를 포함하는 AAP는 64.5 pM과 101 pM의 이중 Kd app 값을 갖는 2상 모드(biphasic mode)로 트롬빈에 결합함을 확인하였다. 반면, 상기 2가지 집게 분자 모두 BSA에 대한 결합력은 거의 나타나지 않았다. 이는 당업계에 보고된 항-트롬빈 항체, 15-량체 DNA 앱타머 및 29-량체 DNA 앱타머의 Kd app 값이 각각 50 nM, 20.2 nM 및 3.5 nM임을 고려할 때, 본 발명에 따른 집게 분자의 결합력이 항체 또는 앱타머를 단독으로 반응시킨 경우와 비교하여 35 내지 775배 향상되었음을 나타내는 것이다. 또한, 상기 BSA에 대한 결과를 고려할 때, 본 발명에 따른 집게 분자는 표적분자에 대해 매우 높은 특이성을 가짐을 확인하였다.
실시예 4: HER2 앱타머와 HER2 항체의 결합
HER2 앱타머와 HER2 항체의 결합은 트롬빈 앱타머와 트롬빈 항체의 결합과 동일한 방법으로 제조되었다.
실시예 4.1. HER2 앱타머와 크로스링커의 결합
HER2 앱타머와 크로스링커의 결합은 트롬빈 앱타머와 크로스 링커의 결합과 동일한 방법으로 제조되었으며, HER2에 특이적으로 결합하는 항-인간 표피 성장인자 2 (HER2) 앱타머 (서열번호 3: 5'-H2N-(CH2)6-AACCG CCCAA ATCCC TAAGA GTCTG CACTT GTCAT TTTGT ATATG TATTT GGTTT TTGGC TCTCA CAGAC ACACT ACACA CGCAC A-3')은 바이오니아로부터 구입하였다.
HER2에 특이적으로 결합하는 HER2 앱타머 용액 1.0 nmol을 준비하여 완충액 A(pH 7.2; 0.1 M 인산나트륨 및 0.15 M 염화나트륨) 350 ㎕에 첨가하였다. 250 μM 농도로 제조한 술포-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 용액 60 ㎕를 상기 앱타머 용액에 첨가하고(술포-SMCC:앱타머=10:1 몰비) 실온에서 반응시켰다. 상기 반응물을 3k 아미콘(Amicon)을 이용하여 원심분리하였다. 용매로는 완충액 A를 사용하였다. 13,000 rpm으로 각 30분씩 8회 수행한 후, 동결건조시켜 보관하였다.
실시예 4.2. HER2 항체와 크로스링커의 결합
HER2에 특이적으로 결합하는 항-HER2 항체 용액 200 pmol을 준비하여 완충액 B(pH 7.2; 0.1 M 인산나트륨(sodium phosphate), 0.15 M 염화나트륨 및 0.01 M EDTA) 300 ㎕에 첨가하였다. 250 μM 농도로 제조한 SATA(sulfosuccinimidyl acetylthioacetate) 용액 12 ㎕를 상기 항체 용액에 첨가하고(SATA:항체=10:1 몰비) 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 100 ㎖의 증류수에 NH2OH 1.65 g, 인산나트륨 1.20 g 및 EDTA 0.327 g을 용해시켜 pH 7.2의 0.5 M NH2OH, 0.1 M 인산나트륨 및 0.01 M EDTA 용액을 제조하였다. 상기 반응물에 제조한 NH2OH 용액 300 ㎕를 첨가하고 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 용액을 30k 아미콘을 이용하여 원심분리하였다. 이때, 용매로는 0.1 M 인산나트륨, 0.1 M NaCl, 0.01 M EDTA, pH 7.2의 완충액 C를 이용하였다. 상기 원심분리를 10,000 rpm으로 각 30분씩 8회 반복하였고, 이후 4℃에 보관하였다.
4.3. 항-HER2 항체와 HER2 앱타머의 결합
상기 실시예 4.1. 및 4.2로부터 수득한 생성물을 혼합하여 37℃에서 30 내지 60분 동안 반응시켰다. 이후 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 상기 반응 용액을 30k 아미콘을 이용하여 원심분리하였다. 용매로는 완충액 C를 사용하였으며, 10,000 rpm으로 각 30분씩 8회 반복하였다. 이후 생성물은 4℃에 보관하였다.
실시예 5: Dox가 로딩된 AAP-HER2-Dox, 앱타머-Dox, 항체-Dox의 제조
항체와 약물이 로딩된 앱타머에 기초하여, AAP 시스템을 HER2 타겟된 DDSs에 적용이 가능한 지를 조사하였다.
AAP-HER2를 형성하기 위하여 실시예 4에서 항-HER2 앱타머는 항-HER2 항체(단클론 항체 N12)와 결합되었고, 항-HER2 앱타머의 DNA 구조에 Dox(독소루비신)를 결합하여 제형화하였다(이하, Dox-로딩된 AAP-HER2 또는 AAP-HER2-Dox로 명명함). 이와 같은 방법은 Liu 등의 방법(Liu et al. Journal of Translational Medicine 2012, 10:148)에 따라 제조하였다.
도 6은 항-HER2 앱타머와 결합된 항-HER2 항체(AAP-HER2)(a), 항-트롬빈 29-량체 앱타머와 결합된 항-HER2 항체(b), 단일 가닥 DNA 1(ssDNA1)과 결합된 항-HER2 항체 (c), 항-HER2 앱타머와 결합된 항- HER2 항체(9G6) (d)의 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸다.
도 6에서 음성대조군으로 항-HER2 단일클론 항체(N12)는 항-트롬빈 29-량체 앱타머와 ssDNA1 각각에 공유결합되었다. 또한, 항-HER2 단일클론 항체(9G6, Thermo)는 항-HER2 항체(N12)와 비교하여 강력한 죽이는 효과가 거의 없다고 알려져 있기 때문에 항-HER2 앱타머와 결합되어 또 다른 음성 대조군으로 사용되었다.
항-HER2 앱타머는 두개의 인식 사이트를 가지고 있어서, 18.9 nM의 Kd 값을 가진 HER2의 에피톱 펩티드 또는 316 nM의 Kd 값을 가진 HER2 단백질의 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 반면, 항 HER2 항체의 에피톱은 C531-A586에 위치하고 있고, 항-HER2 항체는 단독으로 HER2-양성의 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다. 게다가 AAP-HER2 또는 AAP-HER2-Dox의 두 개의 결합 부분 각각은 HER2 분자의 다른 부분을 인식할 수 있고, HER2를 포함하는 종양 세포의 성장은 항-HER2 항체와 Dox에 의해 특이적으로 억제될 수 있다.
AAP-HER2-Dox 복합체의 형성은 형광을 띄는 Dox(독소루비신)가 DNA 이중 구조로 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 삽입된 후에 쿠엔칭(quenching)될 수 있다는 사실에 기초하여, 확인하였다.
도 7은 Dox의 존재하에 항-HER2 앱타머 및 항-HER2 항체의 형광 스펙트럼 분석을 나타낸다. Dox의 몰비(아래에서 위쪽:0.5, 1, 4, 10, 50, 100)를 증가시키면서 항-HER2 앱타머의 농도는 고정하여 다양한 농도의 Dox 용액 제조 (a), Dox/항-HER2 앱타머의 몰비가 10 (b), Dox의 몰비(아래에서 위쪽 : 1, 2, 및 4) 를 증가시키면서 항-HER2 항체의 농도는 고정하여 다양한 농도의 Dox 용액 제조(아래에서 위쪽 : 1, 2, 및 4) (c), Dox 용액 (5 nmol) 단독(위), 항-트롬빈 29-량체 앱타머 50 nmol로 혼합하거나(중간), ssDNA1 50 nmol로 혼합하였으며(아래), 음성 대조군 (d)으로 사용되었다. 독소루비신(Dox)의 형광 스펙트럼은 Synegy MX의 분광형광 광도계로 조사하였다.
도 7의 결과를 통해, 항-HER2 앱타머는 Dox에 로딩될 수 있고, 앱타머와 Dox가 1:10의 비율일 때, 가장 높은 형광 방출을 나타내었다(도 7). 또한 Dox는 단일가닥 DNA 1이나 항-트롬빈 29-량체 앱타머보다 항-HER2 앱타머에 보다 효과적으로 삽입될 수 있었다(ssDNA1, scrambled DNA 서열은 음성 대조군으로 사용됨)(도 7D).
실시예 6: HER2 에피톱의 존재하에서 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 Dox 방출 평가
HER2 에피톱 용액의 다양한 농도가 고정된 Dox 10의 몰비에서 항-HER2 앱타머 250 nM와 혼합되었고, 고정된 Dox 10의 몰비에서 다양한 농도의 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머 용액은 HER2 에피톱 펩티드 250 nM과 혼합되었다. 독스루비신(Dox)의 형광 스펙트럼은 Synegy MX의 분광형광 광도계로 조사하였다.
HER2의 존재가 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 폴딩 상태를 변경하고 약물의 방출에 영향을 줄 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 형광 스펙트럼 분석을 수행하였다(도 8). 도 8은 HER2 에피톱 펩티드의 존재 하에서 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 형광 스펙트럼 분석을 나타낸다. 다양한 농도의 HER2 에피톱 용액은 고정된 Dox 10의 몰비에서 항-HER2 앱타머 250 nM 농도와 혼합되었다(a); Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 다양한 농도가 고정된 Dox 10의 몰비에서 HER2 에피톱 펩티드 250 nM 농도와 혼합되었다(b); 형광 스펙트럼은 각각 0.5h(빈원) 그리고 6h(채워진 원) 이후에 얻어졌다.
그 결과 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머 및 HER2 에피톱 사이의 결합 이벤트가 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 폴딩을 변화시키고, 삽입된 Dox의 방출을 유도하였다. Dox-로딩된 항-HER2 앱타머와 HER2 에피톱 사이의 Kd app(apparent dissociation constant)는 대략 50nM이고, 항-HER2 앱타머와 HER2 사이의 보고된 값이 Kd 18.9 nM인 것과 비교하여, Dox 삽입은 항-HER2 앱타머의 폴딩 상태의 일부 변경을 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 7: 세포 생존력 측정
실시예 7.1. 농도에 따른 AAP-HER2-Dox의 유방암 세포의 생존력 측정
SK-BR-3, MDA-MB-453, 및 MCF-7 인간 유방암 세포는 ATCC로부터 수득되었으며, 2 mM L-글루타민, 10 % 소 태아 혈청, 100 IU/ml의 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 5 % CO2의 분위기 하에서 37 ℃에서 조직 배양 플레이트에 유지시켰다. 로그 단계에서 세포를 유지하기 위해, 일주일에 2 또는 3회 신선한 배지를 재공급 하였다.
세포 생존력은 표준 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 환원 분석을 사용하여 측정하였다. 간단히 기하급수적으로 증가하는 세포는 96-웰의 바닥이 평평한 플레이트(200 ㎕/well)에 웰당 5X103의 밀도로 접종하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후 각각 AAP-HER2-Dox, 항체-Dox, 앱타머-Dox, Dox, 항-HER2 항체, 그리고 항-HER2 앱타머를 다양한 농도에서 24시간 동안 노출시켰다.
10㎕의 MTT 용액이 더해지고 플레이트는 37℃에서 4시간 추가 배양되었다. 포르마잔 생성물의 양은 570 nm에서 측정되었다. 세포 생존 분획은 처리되지 않은 대조군의 백분율로 계산하였다. 실험 데이터는 상응하는 IC50 값을 계산하고 이론적인 곡선을 얻기 위하여 비선형 회귀분석을 사용하여 용량 반응 곡선에 도입하였다. Axio Observer Z1 인버티드 현미경을 사용하여 형광을 분석하였다(Carl Zeiss Inc., USA).
도 9a는 SK-BR-3, MDA-MB-453 및 MCF-7 세포의 생존력에 대한 AAP-HER2-Dox의 효과를 나타낸다. 도 9b는 AAP-HER2-Dox, 항체-Dox, 앱타머-Dox, 그리고 Dox의 SK-BR-3에 대한 농도 의존적인 세포 생존력을 나타낸다.
도 9a를 통해, AAP-HER2-Dox가 24 시간 후에 다른 수준에서 세포 생존을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 구체적으로 SK-BR-3, MDA-MB-453 및 MCF-7 세포에 대한 AAP-HER2-Dox의 얻어진 IC50 값은 각각 15.5, 35.0 및 83.4 nM 였다. 이러한 결과는 HER2의 세포 발현 수준과 일치하고 AAP-HER2-Dox가 타겟과 비-타겟 세포를 구분하고, HER2가 과발현된 암세포에 대해 특이적인 DDS로 사용될 수 있음을 의미한다.
세포막에서 HER2의 높은 발현 수준을 가진 SK-BR-3 세포를 선택하여, AAP-HER2-Dox와 비교하여, Dox-혼합된 항-HER2((항체-Dox) 또는 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머(앱타머-Dox)에 노출시켰다.
도 9b를 통해 AAP-HER2-Dox의 세포 독성 효과가 항체 Dox, 앱타머-Dox 또는 Dox 단독과 농도 의존적으로 현저하게 달랐으며, 네가지 물질 중에서 AAP-HER2-Dox가 SK-BR-3 세포에서 가장 높은 세포 독성을 나타냈다. AAP-HER2-Dox, 항체-Dox, 앱타머-Dox, 그리고 Dox의 IC50 값은 SK-BR-3에 대해 각각 15.5, 25.1, 38.6, 그리고 43.9 nM 값을 가질 것으로 예측되며, AAP-HER2-Dox가 Dox보다 세배 높은 세포독성을 가짐을 의미한다.
도 10은 AAP-HER2-Dox, 항-HER2 항체(항체), 항-HER2-앱타머(앱타머)의 존재하에서 SK-BR-3에 대한 농도 의존적인 세포 생존력을 나타낸다. SK-BR-3 세포는 AAP-HER2-Dox, 항-HER2 항체, 항-HER2-앱타머에 대한 총 항체에 대하여 0-100nM에 노출되었다. AAP-HER2-Dox에 대한 Dox/AAP-HER2의 몰비가 1:10이기 때문에, 항체 농도 1.55nM에 대한 IC50 값은 Dox 농도 15.5nM에 대한 IC50 값과 동등한 것이다.
항-HER2 앱타머 단독이 SK-BR-3 세포에서 세포독성이 없음에도 불구하고(도 10), 앱타머-Dox는 Dox와 비교해도 세포독성이 있었다. 반면, 항체-Dox의 세포독성은 앱타머-Dox, 또는 Dox와 유사하다. 이러한 결과는 Dox는 항체로 로딩될 수 없고(도 7), 항-HER2 항체 단독은 HER2-양성의 종양 세포의 성장을 억제할 수 없음을 고려할 때, 흥미로운 결과였다.
실시예 7.2. 시간에 따른 AAP-HER2-Dox의 유방암 세포의 생존력 측정
앱타머-Dox 그리고 항체-Dox가 실제로 Dox의 암을 죽이는 효과를 증가시키는지를 조사하였다. 그 결과, Dox 단독과 비교하여 앱타머-Dox 그리고 항체-Dox의 세포독성이 배양시간의 함수로서 측정되었으며, 도 11과 도 12에서는 항-HER2 앱타머 또는 항체의 존재가 실제로 비교적 작지만, Dox의 암을 죽이는 효과를 증가시켰다.
구체적으로, 도 11은 Dox 단독(검정), 앱타머-Dox(회색), 항체-Dox(흰색) 그리고 AAP-HER2-Dox(빗금) 각각에 대한 시간 의존적인 배양에 따른 SK-BR-3의 생존력을 나타낸 것이다. 로딩된 총양 그리고 프리 Dox에 대해서 34 nM (a), 340 nM(b)에 해당한다. 그 결과, 앱타머-Dox, 항체-Dox는 Dox 단독에 비해 암을 죽이는 효과가 더 높았으며, 이는 짧은 시간 동안에서 조차도 항-HER2 앱타머 또는 항체의 존재는 Dox가 암을 죽이는 효과를 증가시킴을 의미한다.
또한, 도 12는 Dox 단독 (a), 앱타머-Dox (b), 항체-Dox (c) 그리고 AAP-HER2-Dox (d)의 존재하에 시간 의존적인 배양에 따른 SK-BR-3의 세포 생존력을 나타낸 것이다. 세포들은 로딩된 총양 그리고 프리 Dox에 대해서 0-500 nM에 노출되었다. 그 결과, 앱타머-Dox (b), 항체-Dox (c)는 Dox 단독보다 암을 죽이는 효과가 더 높았으며, 이는 짧은 시간 동안에서 조차도 항-HER2 앱타머 또는 항체의 존재는 Dox가 암을 죽이는 효과를 증가시킴을 의미한다.
실시예 7.3. AAP 시스템의 증가된 세포 독성이 실제로 2가 인식과 Dox 방출에 따른 것인지 여부
세가지 개개의 구성요소(예; 두 개의 인식 부분과 Dox: two recognition parts 및 Dox)로 이루어진 AAP 시스템의 증가된 세포 독성이 실제로 2가 인식(bivalent recognition)과 Dox 방출에 따른 것인지 확인하기 위하여, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 항-트롬빈 29-량체 앱타머, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 ssDNA1 (a scramble DNA sequence) 그리고 항-HER2 항체(9G6)가 결합된 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 세가지 음성 대조군을 사용한 대조군 실험이 수행되었다. 항-HER2 항체(9G6)이 선택되었는데, 이는 항-HER2 항체(N12)와 비교하여, 자신에게 강력한 죽이는 효과가 거의 없다고 알려져 있기 때문이다.
도 13은 AAP-HER2-Dox, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 항-트롬빈 29-량체 앱타머, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 ssDNA1, 항-HER2 항체(9G6)가 결합된 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머 그리고 Dox 단독 존재하에서 SK-BR-3 세포에 대한 농도 의존적인 세포 생존력을 나타낸다. SK-BR-3 세포는 로딩된 총양 그리고 프리 Dox에 대해서 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 0, 34, 68, 340, 510 nM에 노출되었다.
구체적으로, 도 13에서는 항-HER2 항체 또는 앱타머 중의 어느 하나의 존재에 의해 세포를 죽이는 효과가 증가됨에 의해, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 항-트롬빈 29-량체 앱타머, 항-HER2 항체가 결합된 Dox-로딩된 ssDNA1, 그리고 항-HER2 항체(9G6)가 결합된 Dox-로딩된 항-HER2 앱타머의 세가지 음성 대조군이 앱타머-Dox 또는 항체-Dox와 비슷한 세포독성을 나타냈음에도 불구하고, 세가지 개개의 구성요소 중의 하나 또는 둘에 의해 유도된 증가된 세포독성이 AAP-HER2-Dox 또는 Dox 단독에 의해 유도되는 것과 비교하여 의미가 거의 없었다.
AAP-HER2-Dox의 세포독성이 항-HER2 항체(N12 또는 9G6) 단독보다 대략 6배 높은 것으로 관찰되었다(도 12 및 13). 이는 약물-로딩된 AAP가 세포 그리고 농도 의존적인 방법으로 각 구성요소보다 HER2-과발현된 인간세포에 증가된 세포독성을 야기함을 의미한다. 이러한 결과는 약물 흡수 메커니즘과 항체-Dox, 앱타머-Dox, 그리고 Dox 사이에서 치료 항체 효용 사이의 차이를 반영한다.
실시예 8: Dox의 세포내 흡수 평가
약물에 의해 방출된 형광에 기초하여 Dox의 세포내 흡수를 평가하기 위해 도 14와 도 15에 도시된 바와 같이 형광현미경이 사용되었다. 구체적으로, AAP-HER2-Dox가 효과적으로 세포에 의해 차지되어, 종양 표적의 DDS로 사용되고 DNA 구조안에서 약물을 운반하는 동안 상기 복합체의 앱타머 부분이 HER2-결합능을 유지하는 지가 평가되었다. 그 결과 상기 복합체가 HER2-과발현된 SK-BR-3 유방암 세포에서 대부분의 핵을 염색하였고(도 14), 그 결과 낮은 IC50을 가졌다.
구체적으로, 도 14는 앱타머-Dox (column 1), 항체-Dox (column 2), 그리고 AAP-HER2-Dox (column 3)에서 100 nM로 처리된 SK-BR-3 세포에서 Dox 방출을 나타낸다. 핵은 Hoechst 33258에 의해 염색되었고, 이미지는 4h 배양 후에 확인되었다. 그 결과, 약물 로딩된 앱타머와 항체의 결합에 의해 제조된 AAP-HER2-Dox는 타겟 분자에 대해 AAP 시스템의 친화도를 효과적으로 증가시켰으며, 종양에 대항하여 타겟 DDS에 대한 플랫폼으로 적용이 가능하다. 이러한 결과는 도 11과 일치한다.
도 15는 AAP-HER2-Dox(Dox에 관하여 0, 2.5, 그리고 100 nM 농도) 처리된 SK-BR-3 세포를 24시간 배양후에 다른 세포내 형광 방출을 보여주는 현미경 이미지 분석을 나타낸다. (Column 1 : 위상차 이미지, Column 2 : 빨간색 형광에 대한 밴드 패스 필터로 얻은 형광 이미지).

Claims (20)

  1. 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 화학적 링커인 것인 집게 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학적 링커는 앱타머 및 항체 상의 아민기(amine), 카르복시기(carboxyl) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl)를 통해 결합하는 것인 집게 분자.
  4. 제1 링커가 결합된 항체 또는 이의 단편 및 제2 링커가 결합된 앱타머를 준비하는 단계; 및
    상기 링커가 결합된 항체와 앱타머를 공유결합을 통해 연결시키는 단계를 포함하는,
    표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 링커가 결합된 항체 및 앱타머는 앱타머 및 항체 상의 아민기(amine), 카르복시기(carboxyl) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl)를 통해 교차결합제와의 첨가, 축합 또는 치환반응에 의해 형성되는 것인 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 교차결합제는 앱타머 또는 항체와의 결합을 위해 카르보디이미드기(carbodiimide), N-히드록시숙신이미드에스테르(N-hydroxysuccinimide ester; NHS ester), 이미도에스테르(imidoester), 펜타플루오로페닐에스테르(pentafluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate) 및 비닐술폰(vinylsulfone)을 포함하는 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 화합물인 것인 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 교차결합제는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), SATA(succinimidyl acetylthioacetate), 술포-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-Dmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), DMA(dimethyl adipimidate·2HCl), DMP(dimethyl pimelimidate·2HCl), DMS(dimethyl Suberimidate·2HCl), DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate·2HCl), 술포-SIAB(sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SIAB(succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate), SBAP(succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate), SIA(succinimidyl iodoacetate), SM(PEG)n(succinimidyl-([N-maleimidopropionamido]-#ethyleneglycol ester, 상기 n=2, 4, 6, 8, 12 또는 24), SMCC(succinimidyl-4-(N-Dmaleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), LC-SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate)), 술포-EMCS(N-ε-maleimidocaproyl-oxysulfosuccinimide ester), EMCS(N-ε-maleimidocaproyl-oxysuccinimide ester), 술포-GMBS(N-γ-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester), GMBS(N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester), 술포-KMUS(N-κ-maleimidoundecanoyl-oxysulfosuccinimide ester), 술포-MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 술포-SMPB(sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), SMPB(succinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), AMAS(N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester), SMPH(succinimidyl 6-[(β-maleimidopropionamido)hexanoate]), PEG12-SPDP(2-pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydroxysuccinimide), PEG4-SPDP, 술포-LC-SPDP(sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), LC-SPDP(succinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate), SMPT(4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha(2-pyridyldithio)toluene), DSS(disuccinimidyl suberate), BS(PEG)5(bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)), BS(PEG)9(bis(succinimidyl) nona(ethylene glycol)), BS3(bis[sulfosuccinimidyl] suberate), BSOCOES(bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone), PDPH(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithiobis[succinimidyl propionate]), BM(PEG)n(1,8-bismaleimido-#ethyleneglycol, n=2 또는 3), BMB(1,4-bismaleimidobutane), BMDB(1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane), BMH(bismaleimidohexane), BMOE(bismaleimidoethane), DTME(dithiobismaleimidoethane), TMEA(tris(2-maleimidoethyl)amine), DSS(disuccinimidyl suberate), DST(disuccinimidyl tartarate), DTSSP(3,3'-dithiobis[sulfosuccinimidylpropionate]), EGS(ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]), 술포-EGS(ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate]) 및 TSAT(tris-succinimidyl aminotriacetate), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 제1 링커 및 제2 링커는 서로 결합가능한 작용기를 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 서로 결합가능한 작용기는 티올기와 불포화 탄소결합인 것인 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1 링커 또는 제2 링커 중 어느 하나에 티올기를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
  11. 일 말단에 제1 작용기 및 다른 말단에 제2 작용기를 포함하는 교차결합제를 앱타머 및 항체와 반응시키는 단계를 포함하는,
    표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1 작용기 및 제2 작용기는 서로 상이한 것인 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 교차결합제와 앱타머 및 항체와의 반응은 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것인 제조 방법.
  14. 표적 물질의 제1 표적 위치에 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머가 링커를 통해 연결된, 표적 물질 결합용 집게 분자를 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 표적 물질은 세포, 단백질, 핵산 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  16. 제14항의 조성물을 포함하는 표적 물질 검출 또는 분리용 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 조성물을 포함하는 바이오칩 또는 컬럼의 형태로 제공되는 것인 키트.
  18. 제14항의 조성물과 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 물질의 검출 또는 분리 방법.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 표적 물질 결합용 집게 분자를 포함하는 약물 전달체로서, 상기 집게 분자의 제2 표적 위치에 결합하는 앱타머는 약물을 로딩하고 있는 것인, 약물 전달체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 약물은 독소루비신인 것인, 약물 전달체.
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