CN109157518B

CN109157518B - 慢病毒载体冻干保存方法及制剂

Info

Publication number: CN109157518B
Application number: CN201811122174.XA
Authority: CN
Inventors: 接振旺; 林高坤
Original assignee: Hope Biological Technology Suzhou Co ltd
Current assignee: Suzhou Houpu Huikang Biomedical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109157518A

Abstract

本发明涉及慢病毒载体新型冻干保存方法及制剂。本发明揭示了一种新的制备慢病毒载体(颗粒)冻干制剂的方法，本发明的方法制备的慢病毒载体冻干制剂，不管在室温还是低温条件下均能够长时间地保持高的病毒滴度。本发明还提供了适用于这一方法的冻干保护剂，其能良好地保留病毒活性，并且其还具有配方简易、制备方便的特点。

Description

慢病毒载体冻干保存方法及制剂

技术领域

本发明属于病毒学以及生物制剂保存领域；更具体地，本发明涉及慢病毒载体新型冻干保存方法及制剂。

背景技术

癌症免疫疗法和单基因疾病的治疗方式的开发使人们对慢病毒载体的使用越来越感兴趣。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染免疫细胞、神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。在目前新型的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)或者嵌合抗原受体NK细胞免疫疗法(CAR-NK)领域内有着很广泛的应用，是携带CAR基因整合至T/NK细胞的常用方式。另外，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

慢病毒目前还没有形成稳定的产品，主要的原因是从上游生产到下游纯化和制剂配方还没有形成成熟的工艺过程。而对于其制剂配方和冻干工艺的研究内容更是少之又少，这一部分的研究的重要性往往被人们所忽视。

慢病毒载体的长期储存是本领域的难题，其要求非常低的温度如-80℃，而在-20℃保存则不能超过一周。用于临床基因治疗和细胞免疫治疗方案的慢病毒载体目前存在着比疫苗更加严重的低温保存和冷链运输的问题，已经配制成液体的慢病毒载体需要储存在≤-65℃并在冷冻状态下运输，这要求更加严格的运输和储存条件，如此低温条件极大地增加了其存储和运输成本，也为慢病毒的质量保证带来了安全隐患。目前往往采用干冰来运输。并且，病毒的反复冻融也会极大地降低病毒滴度。

本领域中，目前对于慢病毒载体的制剂及冻干工艺开发还未见文献研究结果和专利公开，其原因一方面可能在于整个慢病毒的产业化目前处于起步阶段，慢病毒的上游工艺目前还处于起步阶段，下游工艺更是得不到发展；另一方面，慢病毒载体制剂和冻干工艺的研究和开发还存在着技术障碍。

因此，开发慢病毒载体的冻干稳定保存工艺成为了整个基因治疗和细胞免疫治疗亟需解决的问题。获得配方简易、制备方便、稳定的冻干保护剂对慢病毒的广泛应用显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供慢病毒载体新型冻干保存方法及制剂。

在本发明的第一方面，提供一种制备慢病毒载体(颗粒)冻干制剂的方法，包括：将慢病毒载体与冻干保护剂混合，冷冻干燥；其中，所述的冻干保护剂包括：海藻糖：5～30％(w/w)；二价阳离子：0.1～80mM；和氨基酸：0.02～5％(w/w)。

在一个优选例中，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁶，较佳地高于5×10⁶，更佳地高于1×10⁷，如高于2×10⁷或3×10⁷。

在另一优选例中，所述的慢病毒载体的滴度在1×10⁶～1×10⁹。

在另一优选例中，所述的冻干保护剂包括：海藻糖：10～20％(w/w)；二价阳离子：0.5～20mM；和氨基酸：0.05～3％(w/w)。

在另一优选例中，所述的二价阳离子由CaCl₂和MgSO₄产生，且包括：CaCl₂：0.2～3mM，较佳地0.4～2mM；MgSO₄：0.15～2mM，较佳地0.3～1.5mM。

在另一优选例中，所述的氨基酸包括：L-丙氨酸、L-组氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸，或它们的组合。

在另一优选例中，所述的氨基酸选自：

(a)L-丙氨酸，以及选自L-组氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸的任一或多种；

(b)L-组氨酸、以及选自脯氨酸、色氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸的任一或多种；

(c)L-丙氨酸；

(d)L-组氨酸；或

(e)L-丙氨酸以及L-组氨酸的组合。

在另一优选例中，其中L-丙氨酸或L-组氨酸的用量为：L-丙氨酸：0.03～2％(w/w)，较佳地为0.05～1.5％(w/w)；或L-组氨酸：0.06～4％(w/w)，较佳地为0.09～3％(w/w)。

在另一优选例中，冷冻干燥的程序依次包括：-60±5℃预冻3±2小时；-35±5℃1500±500min，真空度1±0.2Pa；-20±2℃600±100min，真空度1±0.2Pa；0±2℃1800±500min，真空度1±0.2Pa。

在另一优选例中，所述的慢病毒载体为携带目的基因的载体。

在本发明的另一方面，提供一种慢病毒载体(颗粒)冻干制剂，所述的慢病毒载体冻干制剂包括：慢病毒载体以及冻干保护剂；其中，所述的冻干保护剂包括：海藻糖：5～30％(w/w)；较佳地为10～20％(w/w)；CaCl₂：0.2～3mM；较佳地为0.4～2mM；MgSO₄：0.15～2mM；较佳地为0.3～1.5mM；和氨基酸：0.02～5％(w/w)；较佳地为0.05～3％(w/w)。

在一个优选例中，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁶，较佳地高于5×10⁶，更佳地高于1×10⁷(如，高于2×10⁷或3×10⁷)。

在另一优选例中，其中L-丙氨酸和/或L-组氨酸的用量为：L-丙氨酸：0.03～2％(w/w)，较佳地为0.05～1.5％(w/w)；L-组氨酸：0.06～4％(w/w)，较佳地为0.09～3％(w/w)。

在本发明的另一方面，提供一种冻干保护剂，较佳地为用于慢病毒载体的冻干保护剂，包括：海藻糖：5～30％(w/w)；较佳地为10～20％(w/w)；CaCl₂：0.2～3mM；较佳地为0.4～2mM；MgSO₄：0.15～2mM；较佳地为0.3～1.5mM；和氨基酸：0.02～5％(w/w)；较佳地为0.05～3％(w/w)。

在一个优选例中，所述的海藻糖、氨基酸、CaCl₂以及MgSO₄作为冻干保护剂的发挥活性的活性组分。

在另一优选例中，各组分在溶液、培养基或缓冲液中混合；较佳地，所述的缓冲液为PBS。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的冻干保护剂的制备方法，包括：将海藻糖，氨基酸，CaCl₂和MgSO₄按照所述比例混合于溶液或缓冲液中；较佳地，所述的缓冲液为PBS。

在本发明的另一方面，提供所述的冻干保护剂的用途，用于制备慢病毒载体(颗粒)冻干制剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于进行慢病毒载体冷冻干燥的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的冻干保护剂，以及说明冷冻干燥方法的使用说明书。

在本发明的另一方面，提供一种用于进行目的基因转染的试剂盒，其中含有所述的慢病毒载体(颗粒)冻干制剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、不同的温度下，不同的冻干保护剂基础缓冲液对慢病毒滴度的影响。

图2、慢病毒载体冻干后常温保存15天滴度值，以冻干前的慢病毒载体的滴度值作为对照。

图3、慢病毒冻干后4℃保存35天滴度值，以冻干前的慢病毒载体的滴度值作为对照。

图4、慢病毒冻干后-80℃保存90天滴度值，以冻干前的慢病毒载体的滴度值作为对照。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种新的制备慢病毒载体(颗粒)冻干制剂的方法，本发明的方法制备的慢病毒载体冻干制剂，不管在室温还是低温条件下均能够长时间地保持高的病毒滴度。本发明还提供了适用于这一方法的冻干保护剂，其能良好地保留病毒活性，并且其还具有配方简易、制备方便的特点。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“目的基因”是指感兴趣的基因，该基因需要藉由慢病毒来引入到细胞内或组织中。

慢病毒制剂

冻干保存和运输是慢病毒载体这一非常脆弱和需要低温的物质来说是最优的保存方式。然而，慢病毒载体具有其特殊性，其与目前常用于冻干保存的抗原、疫苗存在很大的差异，现有常规的冻干制剂并不适用于慢病毒载体。例如，本发明人在研究之初，将疫苗冻干保护剂(蔗糖、山梨醇、明胶、蛋白质等保护剂)用于慢病毒载体，结果发现在同样的冻干和保存条件下，这些冻干保护剂对于慢病毒在冻干时和冻干后的保护作用均较低；此外，本发明人也应用了其它的多种疫苗冻干制剂，结果发现均无法有效地进行慢病毒载体的冻干。

因此，本发明人针对慢病毒载体的冻干保存进行研究，通过大量的实验研究，确定了优选的原料及配比方案，获得了本发明的方法及慢病毒制剂。本发明的方法冻干保存的慢病毒载体在冻干过程中、冻干后4℃长期保存和常温长期保存都能良好地保留生物活性。

作为本发明的优选方式，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁶，较佳地高于5×10⁶，更佳地高于1×10⁷，更佳地高于2×10⁷或3×10⁷。

作为本发明的优选方式，所述的二价阳离子的浓度在0.1-80mM，较佳地为0.5-20mM，更佳地为0.6～10mM；例如0.8mM，1mM，1.5mM，2mM，5mM，10mM。作为本发明的更为优选的方式，所述的二价阳离子为钙离子、镁离子或它们的组合，更优选的是它们两者的组合。

作为本发明的优选方式，用于配制本发明的冻干保护剂的各组分的用量如表1所示。

表1

作为本发明的优选方式，所述的氨基酸包括：L-丙氨酸、L-组氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸，或它们的组合。更为优选地，所述的氨基酸是包含L-丙氨酸和/或L-组氨酸的氨基酸。最为优选地，所述的氨基酸是L-丙氨酸和L-组氨酸的组合。其中，L-丙氨酸可以为0.03～2％(w/w)，较佳地为0.05～1.5％(w/w)，更佳地为0.05～0.5％(w/w)，如0.1％(w/w)，0.2％(w/w)，0.3％(w/w)。其中，L-组氨酸可以为0.06～4％(w/w)，较佳地为0.09～3％(w/w)，更佳地为0.09～0.9％(w/w)，如0.1％(w/w)，0.3％(w/w)，0.5％(w/w)。

本发明的冻干保护剂含有海藻糖和特定的氨基酸作为主要组分。糖是常被使用的冻干制剂成分，是蛋白质的非特异性稳定剂，在冻干的各个阶段(如冷冻、冻融及升华干燥等)均能对慢病毒起到一定的保护作用。目前用于冻干常用的糖包括：蔗糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、麦芽糖、海藻糖等，其中蔗糖是最为常用的。然而，本发明人在研究中发现，与蔗糖相比，对于慢病毒而言，使用海藻糖具有更高的玻璃化温度、更低的引湿性、更不具有还原性。

本发明人发现，冷冻干燥时，在预冻过程中，结晶型氨基酸能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的慢病毒结构的破坏，氨基酸在冻干过程中还可防止有效组分随水蒸气一起升华逸散。本发明人还发现，在冷冻过程中，低浓度的丙氨酸和组氨酸等氨基酸氨酸可通过抑制磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止慢病毒载体受到损伤，从而有效地避免了慢病毒载体的生物活性的下降。

本发明人发现，在冷冻过程中，加入二价阳离子可延迟海藻糖结晶，结晶抑制的机制可能包括在二价阳离子和磷酸根阴离子存在下氢键网络的变化或/和分子迁移率的变化。与仅含有磷酸盐缓冲液的甘露醇基质相比，二价阳离子显示出协同冻干保护效应，导致初始包封程度的显著增加，并且还影响储存期间慢病毒载体降解的动力学。

本发明也包括主要由海藻糖、氨基酸、二价阳离子按照适当配比构成的混合物。为了便于储存，可将各个组分按照配比混合后，形成固体混合物，易于储存和运输，在需要的时候，再将混合物与水混合、溶于水中，制成所述的冻干保护剂。

本发明也包括将所述的混合物溶于少量的缓冲液中，制成的冻干保护剂的浓缩制剂，以易于储存和运输。在需要的时候，将该浓缩制剂进行稀释。此外，本发明也包括将所述的混合物溶于大量的缓冲液中，形成的稀释制剂。

将表1所述配方的组分被溶于缓冲液如PBS中，从而制备成本发明的具有保护作用的冻干保护剂。较佳地，在进行混合后，还包括灭菌的步骤。灭菌可以采用本领域技术人员熟知的方法，例如过滤除菌。

在制备本发明的慢病毒载体(颗粒)冻干制剂时，除了由海藻糖、氨基酸(优选L-丙氨酸、L-组氨酸)、二价阳离子构成的活性组分以外，还可包括其它的次要成分，例如一些常规的辅助成分或赋形剂，更具体地例如pH调节剂、防腐剂等等。应理解，这些都是在生物制品领域所常规应用的。

本发明制备的冻干保护剂在慢病毒冻干的过程中能够起到保持pH、调节渗透压、减少冰晶形成等良好的保护作用，有效地保护了在冻干过程中冷冻时冰晶形成、pH、含水量等因素变化对慢病毒的破坏作用。应用本发明的冻干保护剂冻干后，慢病毒保存在4℃35天和常温15天后慢病毒滴度还保存为最初滴度的90％以上，冻存于-80℃90天后滴度基本不降低。同时，本发明的冻干保护剂配方简易、制备方便、保护效果优良，无毒无副作用，在使用过程中对环境无污染，是效果优异的慢病毒冻干保护剂。

本发明的方法，将冻干保护剂与慢病毒载体进行混合、冻干，制成包含慢病毒载体的混合物或其经过冻干的产物，其中含有的慢病毒能够保留较好的生物活性。

冷冻干燥方法

良好的冻干工艺具有两方面的关键要素。首先，确定冷冻保护剂，这是最关键的步骤。冻干保护剂的组成关系到冷冻、升华等步骤的实施，关系到慢病毒载体的生物活性的保留情况。其次，合理的冻干工艺也是关键性的方面，该工艺不仅要考虑所需冻干的物质的特性，还要综合考虑热力学性能(冻干工艺曲线)、结晶程度、崩解温度或共晶温度、亚稳状态间隙物质的相变化、溶液的结晶热、间隙物质的熔化温度等因素，在此基础上进行优化。

作为本发明的优选实施例，冷冻干燥的程序依次包括：-60±5℃预冻3±2小时；-35±2℃1500±500min，真空度1±0.2Pa；-20±2℃600±100min，真空度1±0.2Pa；0±2℃1800±500min，真空度1±0.2Pa。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、慢病毒制备及基础溶液的选择

1、慢病毒制备

慢病毒LV-GFP(pCDH-EF1a-eGFP，购自Addgene)的制备方法如下：

(1)细胞接种

待293T细胞长到80％以上时进行传代，以T175培养瓶为例：

1)将含有10％FBS的DMEM培养基、胰酶、PBS在37℃水浴锅内预热；

2)用移液管将培养瓶内的上清弃掉，用6ml的PBS润洗一次；

3)加入3ml胰酶(0.5％)，轻轻摇晃培养皿，使胰酶完全覆盖培养瓶细胞表面；

4)消化1min左右，快速使用3-7ml左右含10％FBS的DMEM培养基终止消化；

5)将消化好的细胞吹打下来收集至离心管内，1000r/min，3min；

6)弃上清，加入适量新鲜的含10％FBS的DMEM培养基进行重悬，吹打均匀成单细胞悬液，计数，将6～7×10⁷个细胞与适量培养基均匀混合成细胞悬液至最终体系为200ml，接种在一个2层细胞工厂内，细胞工厂中的细胞长至80％即可进行转染；

7)37℃，5％CO₂培养箱内静置培养。

(2)细胞转染

细胞接种第二天，进行转染实验，所需试剂、质粒及用量如表2和表3所示：

表2

质粒名称	用量(μg)
		目的质粒	50
△R	67.5
		Rev	37.5
Vsv-G	152.5

表3

试剂名称	用量(ml)
		无菌去离子水	6.75
2×HBS	7.5
		2.5mol/L氯化钙溶液	0.75

(3)慢病毒包装操作步骤

1)将所需的水、2×HBS、氯化钙溶液，在生物安全柜内用0.22μm的滤膜进行过滤备用；

2)向2支离心管内分别加入一定体积的水、HBS，然后在水中加入相应用量的目的质粒、包装质粒，用移液管吹打混匀，再逐滴加入氯化钙溶液混；吸至另一支加有HBS的离心管内，混匀静置6-10min；

3)将2层细胞工厂中的培养基转移至混合容器中，向培养基中加入15ml上述转染混合溶液，充分混匀后加入细胞工厂

4)转染12-16h后，弃去上清液，加入200ml新鲜的培养基；

5)48h后观察细胞状态并进行病毒上清液的第一次收取，收取完成，补加200ml新鲜的培养基，并留2-3ml样品；

6)72h后观察细胞状态进行病毒上清液的第二次收取，收取完成后留2-3ml样品；

7)将病毒上清液保存于-80℃冰箱内。

2、基础溶液的选择

为了研究慢病毒载体在基础溶液中的载体稳定性数据，本发明人测定了细胞培养上清液(CCS)和PBS中的慢病毒载体稳定性的数值。将前述制备的慢病毒载体分别加入到PBS中或CCS中，使其滴度为6×10⁷TU/ml，在25℃和37℃下保存，测定慢病毒载体稳定性。

结果显示，在25℃和37℃下长达168小时的保存和测定过程中，慢病毒载体在PBS中比在CCS中更稳定。与37℃相比，25℃时的稳定性也得到改善。

在稀释到PBS之前使用100kDa MWCO膜的浓缩步骤将从样品中除去一些蛋白质，已知蛋白质对LV具有稳定作用，因此预期PBS样品的稳定性降低。然而结果却是在PBS中具有更好的稳定性，更优化的pH可能有助于提高慢病毒载体在PBS中的稳定性。见图1。

实施例2、冻干保护剂的筛选

1、制剂配制以及分组

配制潜在可用的多组试剂，以研究效果最为理想的冻干制剂。包括六组如下：

(1)Buffer 1：0.7M四甲基胍(TMG)，0.5M蔗糖，0.135M棉子糖(raffinose)，加入到PBS中；

(2)Buffer 2：5％水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate，LAH)，10％蔗糖，加入到PBS中；

(3)Buffer 3：3.5％水解明胶(hydrolyzed gelatin)，0.1M 3.5％D-山梨醇，加入到PBS中；

(4)Buffer 4：15％(w/w)海藻糖(trehalose dihydrate)，0.09％(w/w)L-丙氨酸，0.15％(w/w)L-组氨酸(L-Histidine)，0.8mM CaCl₂，0.5mM MgSO₄，加入到PBS中；

(5)Buffer 5：PBS；

(6)Buffer 6：培养后上清(蛋白浓度8mg/ml)。

2、慢病毒的冻干试验

取滴度为2.49×10⁸的慢病毒(如实施例1的方法制备)上清10ml，经过100kDa超滤管浓缩为1ml体积，分别取150ul和5800ul各组制剂混匀后进行分装混合，共6组(Buffer 1～Buffer 6)，每组分别编号A-F号。这6组每组含6瓶，分别编号1-6，每瓶1ml。所有样品共36瓶。

将冻干前的慢病毒溶液每组的第6号瓶取50ul进行滴度测定。作为冻干前滴度值。

滴度测定方法如下：

第一天：HEK-293T细胞铺板

(1)取对数生长期的293T细胞进行消化铺板，以24孔细胞板为例，每孔铺入1×10⁵个细胞，总体积500ul/孔(10％FBS的DMEM)；

(2)置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养(18～24h)，此时细胞汇合度以50～60％为宜；

同时，额外多准备1孔细胞(计数孔)用于次日细胞计数。

第二天：慢病毒感染

(1)胰酶消化计数孔内的细胞，确定慢病毒感染前293T细胞数目(N)；

(2)从-80℃取出慢病毒，置于4℃解冻，解冻完成后，使用无血清DMEM(含Polybrene 8ug/ml)配制3种不同稀释度(100倍，500倍，2500倍)的慢病毒感染体系，每孔慢病毒感染体积为200ul；

(3)取出24孔慢病毒滴度检测细胞板，每孔小心弃去200ul细胞培养液，再缓慢加入200ul慢病毒感染体系，轻轻晃匀；

(4)置于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养。

第三天：补液

(1)取出24孔慢病毒滴度检测细胞板，每孔分别补加500ul 10％FBS的DMEM培养液；

(2)置于37℃、5％CO₂细胞培养箱继续培养48小时。

第五天：收集细胞并流式分析

(1)取出24孔慢病毒滴度检测细胞板，使用胰酶消化，收集各孔细胞，将细胞转移至1.5ml离心管中；

(2)4℃，1500rpm，离心5min收集细胞沉淀；

(3)小心弃去上清，每管使用1ml预冷的PBS重悬细胞沉淀；

(4)4℃，1500rpm，离心5min洗涤2-3次；

(5)洗涤完成后，小心弃去离心管内PBS，再用500ul预冷的PBS重悬细胞沉淀，并转移至流式管中；

(6)流式上机检测，检测GFP表达阳性的细胞，收集数据并分析结果。其中，流式细胞术(FACS)检测慢病毒滴度的方法如下：

(a)慢病毒滴度计算：

滴度计算数据选择：选择阳性率介于1％～20％间的组别用于滴度计算；

滴度计算公式如下：

Titer(TU/mL)＝D*F*N*P/V

其中：

N＝慢病毒感染前细胞数目；

P＝细胞阳性率(1％～20％)；

V＝每孔细胞慢病毒感染体积，比如此方案中V(mL)＝200(μl)×10^-3；

DF＝稀释倍数，稀释10倍，DF＝10^-1，稀释100倍，DF＝10^-2，稀释1000倍，DF＝10^-3；

TU＝感染滴度。

测得冻干前慢病毒滴度数据如表4。

表4、冻干前慢病毒滴度数据

将所有样品共36只进行冻干。进行冻干，冻干程序如下：

-60℃预冻3小时；

-35℃1500min，真空度1Pa；

-20℃600min，真空度1Pa；

0℃1800min，真空度1Pa。

冻干后的样品，取编号为A、B和C、D的样品分别保存于常温(25℃)和低温(4℃)的恒温恒湿环境内15天和35天，-80℃保存90天。每组恒温恒湿保存时间截止后将1-6号样品各加入1ml细胞培养基进行溶解，溶解后的溶液通过0.22um滤膜进行过滤除菌然后进行滴度测定，滴度测定方法如前。滴度测定的结果如表5所示。

表5、冻干后滴定测定结果

根据前面的表4和表5的冻干前、冻干后常温15天、4℃保存35天、-80℃保存90天测得的平均病毒滴度数据进行综合和统计，如表6所示。

表6

冻干前后数据统计如图2～4。

针对各组的操作过程以及结果数据，除了Buffer3外，冻干后的各组制剂在加入培养基后能够迅速溶解，形成均一的溶液。具体情形如下：

Buffer1组：在冻干后不能形成固定的形态，外观不符合要求；冻干后常温15天的滴度为冻干前的70％，冻干后4℃保存35天的滴度为冻干前的79％。冻干后-80℃保存90天的滴度为冻干前的89.5％。

Buffer2组：虽然在4℃下保存效果较好，但是在常温保存情况下却慢病毒滴度损失很大，冻干后常温15天的滴度为冻干前的50％。冻干后-80℃保存90天的滴度为冻干前的96.6％。

Buffer3组：冻干后很难复溶，需要进行37℃孵育才能完全溶解形成均一的溶液，操作程序复杂，不适宜应用。

Buffer4组：冻干外观较好，复溶后为透明均一的溶液；在常温和4℃保存都有良好的效果，慢病毒在冻干后常温放置15天后，其滴度为冻干前的90％，在4℃长期保存35天后滴度值下降为冻干前的91％。冻干后-80℃保存90天的滴度为冻干前的97％。

Buffer6组：慢病毒在冻干后常温放置15天后滴度有极为显著(数量级)的下降，在4℃长期保存35天后滴度值下降为冻干前的55％。可见，虽然在4℃下保存效果还可以，但是在常温保存情况下却慢病毒滴度损失很大。

根据上述，Buffer4在冻干后长期保存过程中可以有效地保护慢病毒滴度不受损失和破坏，是受试各组中效果最好的，特别适用于作为慢病毒冻干保护剂。

实施例3～6、配方I～IV的冻干保护剂的配制及效果测定

配制配方I～IV的制剂，具体如下：

配方I：12％海藻糖，0.05％L-丙氨酸，0.25％L-组氨酸，1.5mM CaCl₂，0.3mMMgSO₄，加入到PBS中。

配方II：15％海藻糖，0.08％L-丙氨酸，0.15％L-组氨酸，1.2mM CaCl₂，0.4mMMgSO₄，加入到PBS中。

配方III：20％海藻糖，0.12％L-丙氨酸，0.1％L-组氨酸，0.7mM CaCl₂，0.7mMMgSO₄，加入到PBS中。

配方IV：9％海藻糖，0.15％L-丙氨酸，0.08％L-组氨酸，0.5mM CaCl₂，1mM MgSO₄，加入到PBS中。

以慢病毒LV-GFP为实验对象，检测上述配方I～IV作为冻干保护基的效果。取滴度为2.49×10⁸的慢病毒上清10ml，经过100kDa超滤管浓缩为1ml体积，分别取150ul和5800ul各组制剂混匀后进行分装混合。冻干前取样后，按照实施例1相同的方法进行冻干：

-60℃预冻3小时；

-35℃1500min，真空度1Pa；

-20℃600min，真空度1Pa；

0℃1800min，真空度1Pa。

采用实施例1相同的方法对于冻干前的样品进行滴定测定，以及对于冻干后的样品进行保存和滴定测定。

结果如下：

配方I：冻干外观好，复溶后为透明均一的溶液；在常温和4℃保存都有良好的效果，慢病毒在冻干后常温放置15天后滴度为冻干前的90％以上，在4℃长期保存35天后滴度值为冻干前的91％以上。

配方II：冻干外观好，复溶后为透明均一的溶液；在常温和4℃保存都有良好的效果，慢病毒在冻干后常温放置15天后滴度为冻干前的90％以上，在4℃长期保存35天后滴度值为冻干前的91％以上。

配方III：冻干外观好，复溶后为透明均一的溶液；在常温和4℃保存都有良好的效果，慢病毒在冻干后常温放置15天滴度为冻干前的90％以上，在4℃长期保存35天后滴度值为冻干前的91％以上。

配方IV：冻干外观好，复溶后为透明均一的溶液；在常温和4℃保存都有良好的效果，慢病毒在冻干后常温放置15天后滴度为冻干前的90％以上，在4℃长期保存35天后滴度值为冻干前的91％以上。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种制备慢病毒载体冻干制剂的方法，其特征在于，包括：将慢病毒载体与冻干保护剂混合，冷冻干燥；其中，所述的冻干保护剂包括：

海藻糖：5～30％(w/w)；

CaCl₂：0.2～3mM；

MgSO₄：0.15～2mM；

L-丙氨酸：0.03～2％(w/w)；和

L-组氨酸：0.06～4％(w/w)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁶。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的慢病毒载体的滴度高于5×10⁶。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁷。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的冻干保护剂包括：海藻糖：10～20％(w/w)。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的冻干保护剂包括：

CaCl₂：0.4～2mM；

MgSO₄：0.3～1.5mM。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中L-丙氨酸或L-组氨酸的用量为：

L-丙氨酸：0.05～1.5％(w/w)；

L-组氨酸：0.09～3％(w/w)。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，冷冻干燥的程序依次包括：-60±5℃预冻3±2小时；-35±5℃1500±500min，真空度1±0.2Pa；-20±2℃600±100min，真空度1±0.2Pa；0±2℃1800±500min，真空度1±0.2Pa。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的慢病毒载体为携带目的基因的载体。

10.一种慢病毒载体冻干制剂，其特征在于，所述的慢病毒载体冻干制剂包括：慢病毒载体以及冻干保护剂；其中，所述的冻干保护剂包括：

海藻糖：5～30％(w/w)；

CaCl₂：0.2～3mM；

MgSO₄：0.15～2mM；

L-丙氨酸：0.03～2％(w/w)；和

L-组氨酸：0.06～4％(w/w)。

11.如权利要求10所述的慢病毒载体冻干制剂，其特征在于，所述的冻干保护剂包括：

海藻糖：10～20％(w/w)；

CaCl₂：0.4～2mM；

MgSO₄：0.3～1.5mM；

L-丙氨酸：0.05～1.5％(w/w)；和

L-组氨酸：0.09～3％(w/w)。

12.如权利要求10所述的慢病毒载体冻干制剂，其特征在于，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁶。

13.如权利要求12所述的慢病毒载体冻干制剂，其特征在于，所述的慢病毒载体的滴度高于5×10⁶。

14.如权利要求13所述的慢病毒载体冻干制剂，其特征在于，所述的慢病毒载体的滴度高于1×10⁷。

15.一种冻干保护剂，其特征在于，包括：

海藻糖：5～30％(w/w)；

CaCl₂：0.2～3mM；

MgSO₄：0.15～2mM；

L-丙氨酸：0.03～2％(w/w)；和

L-组氨酸：0.06～4％(w/w)。

16.如权利要求15所述的冻干保护剂，其特征在于，包括：

海藻糖：10～20％(w/w)；

CaCl₂：0.4～2mM；

MgSO₄：0.3～1.5mM；

L-丙氨酸：0.05～1.5％(w/w)；和

L-组氨酸：0.09～3％(w/w)。

17.如权利要求15～16任一所述的冻干保护剂，其特征在于，各组分在溶液中混合。

18.如权利要求15～16任一所述的冻干保护剂，其特征在于，各组分在溶液培养基或缓冲液中混合。

19.如权利要求18所述的冻干保护剂，其特征在于，所述的缓冲液为PBS。

20.一种制备权利要求15～19任一所述的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括：将海藻糖，L-丙氨酸，L-组氨酸，CaCl₂和MgSO₄按照所述比例混合于溶液中。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述的溶液为缓冲液。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为PBS。

23.权利要求15～19任一所述的冻干保护剂的用途，其特征在于，用于制备慢病毒载体冻干制剂。

24.一种用于进行慢病毒载体冷冻干燥的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：权利要求15～19任一所述的冻干保护剂，以及说明冷冻干燥方法的使用说明书。

25.一种用于进行目的基因转染的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求10～14任一所述的慢病毒载体冻干制剂。