CN117625559A - 一种冻干保护剂及其制备方法和在制备假病毒冻干产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种冻干保护剂及其制备方法和在制备假病毒冻干产品中的应用。本发明提供的冻干保护剂包括甘露醇8～12wt％，海藻糖1～5wt％，牛血清白蛋白0.5～1.5wt％和余量的溶剂。本发明提供的冻干保护剂能确保假病毒冻干产品的外观良好，使假病毒保持较高的存活率。本发明所提供的冻干保护剂能够使制备得到的假病毒滴度均一，性质稳定，尤其有利于促进HPV假病毒产品产业化。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种冻干保护剂及其制备方法和在制备假病毒冻干产品中的应用。
背景技术
宫颈癌严重危害女性健康，是全世界女性中第四大常见恶性肿瘤。宫颈癌的预防手段包括接种人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)预防性疫苗和早期筛查。自2006年全球首个HPV预防性疫苗问世以来，宫颈癌的预防进入一个新的时代，许多国家将HPV预防性疫苗列入国家免疫计划。
HPV疫苗研发的一个最终目标是使开发的疫苗诱导人体产生高滴度的中和抗体，所以中和抗体检测是HPV疫苗研发过程中一个必不可少、非常关键的环节。目前，HPV预防性疫苗临床试验中用于抗体滴度检测的方法主要有ELISA法，Luminex法和假病毒法。假病毒法是模拟抗体阻断病毒进入细胞的生物过程，最能直接反映抗体的保护效果，是国际公认的HPV中和抗体检测的金标准。
现有技术一般采取自行制备假病毒的形式开展实验(下文简称液体型假病毒或液体型)。受多种因素影响，不同批次假病毒的滴度批间差大，试验人员在进行正式中和抗体检测前，需要进行多次试验验证，试验操作复杂，制备出的假病毒滴度不稳定。另外，液体剂型假病毒必须冻存于-80℃，物流运输采用干冰形式，在-20℃的条件下假病毒易失活，在较大程度上限制了假病毒法的产业化应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种冻干保护剂及其制备方法和在制备假病毒冻干产品中的应用，提高假病毒冻干产品的稳定性和耐储性。
本发明提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括如下浓度的组分：
甘露醇8～12wt％，海藻糖1～5wt％、牛血清白蛋白0.5～1.5wt％和余量的溶剂。
优选的，所述溶剂包括DMEM完全培养基。
本发明还提供了上述技术方案所述的冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
将甘露醇、海藻糖和牛血清白蛋白溶于溶剂中，除菌，得到所述冻干保护剂。
本发明还提供了上述技术方案所述的冻干保护剂或上述技术方案所述的方法制备得到的冻干保护剂在制备假病毒冻干产品中的应用。
优选的，所述假病毒包括HPV假病毒；
所述HPV假病毒的亚型包括HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV45，HPV52和HPV58中的一种或多种。
本发明还提供了一种HPV冻干假病毒，包括HPV假病毒和上述技术方案所述的冻干保护剂。
优选的，所述HPV假病毒为HPV液体型假病毒，所述HPV液体型假病毒与所述冻干保护剂的体积比为0.1～10：100；所述HPV液体型假病毒的滴度为6.88×102～3.75×105TCID50/μL。
本发明还提供了上述技术方案所述的HPV冻干假病毒的制备方法，包括如下步骤：
将HPV液体型假病毒与上述技术方案所述的冻干保护剂混合，进行真空冷冻干燥。
优选的，所述真空冷冻干燥包括以下步骤：降温至-50～-40℃，在-50～-40℃升华干燥2～3h；由-50～-40℃升温至-32～-28℃，在-32～-28℃升华干燥10～12h；由-32～-28℃升温至-22～-18℃，在-22～-18℃升华干燥4～6h；由-22～-18℃升温至-7～-3℃，在-7～-3℃升华干燥4～6h；由-7～-3℃升温至-2～2℃，在-2～2℃解析干燥2～3h；由-2～2℃升温至8～12℃，在8～12℃解析干燥2～3h；由8～12℃升温至18～22℃，在18～22℃解析干燥7～9h。
所述真空冷冻干燥的压强≤20Pa。
优选的，进行真空冷冻干燥前，在-50～-40℃下对HPV液体型假病毒与冻干保护剂的混合物预冻2～3h。
有益效果
本发明提供了一种冻干保护剂，包括甘露醇8～12wt％、海藻糖1～5wt％、牛血清白蛋白0.5～1.5wt％和余量的溶剂。本发明提供的冻干保护剂能确保假病毒冻干产品的外观良好，使其保持较高的存活率。
HPV液体型假病毒滴度波动情况很大，不同亚型、不同批次均会存在较大的变化，经实施例验证，本发明通过调整保护剂与HPV液体型假病毒配比，可将滴度变化较大的HPV液体型假病毒，制备成0.5～3.0×105TCID 50/支的HPV冻干假病毒，为实验人员提供便捷、稳定、均一的HPV假病毒产品，使HPV假病毒产品标准化，有利于促进HPV假病毒产品产业化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为HPV6亚型冻干假病毒与液体型假病毒储存在不同条件下的滴度变化情况；
图2为9个亚型(HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV45，HPV52和HPV58)冻干HPV假病毒于4℃条件下储存后的滴度变化情况；
图3为中和试验加样顺序表。
具体实施方式
本发明提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括如下浓度的组分：
甘露醇8～12wt％，海藻糖1～5wt％，牛血清白蛋白0.5～1.5wt％和余量的溶剂。
在本发明中，所述冻干保护剂包括甘露醇8～12wt％，优选为10wt％。本发明所述甘露醇能够使产品形成疏松结实的均匀骨架，保持良好的外观。
在本发明中，所述冻干保护剂包括海藻糖1～5wt％，优选为3wt％。本发明所述海藻糖能够在冻干过程中为制剂中活性成分提供保护。
在本发明中，所述冻干保护剂包括牛血清白蛋白0.5～1.5wt％，优选为1wt％。本发明所述牛血清白蛋白能够在冻干过程中为制剂中活性成分提供保护。
在本发明中，所述冻干保护剂的溶剂优选为DMEM完全培养基。本发明所述DMEM完全培养基优选包括10％胎牛血清、1％青链双抗、1％NEAA和1％L-谷氨酰胺，进一步优选为由DMEM高糖基础培养基(Cytiva)、10％胎牛血清(PAN)、1％青-链霉素溶液(100×，吉诺生物)、1％MEMNEAA(100×,GIBCO)、1％L-谷氨酰胺(100×,GIBCO)组成。DMEM完全培养基可快速适用于HPV中和抗体检测过程中广泛应用到的293FT等贴壁细胞；同时DMEM完全培养基所含多种氨基酸、维生素及无机盐可为冻干过程的假病毒提供保护。
本发明通过调整冻干保护剂的组分，可确保假病毒冻干产品的外观良好，使假病毒冻干产品保持较高的存活率。
本发明还提供了上述技术方案所述的冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
将甘露醇、海藻糖和牛血清白蛋白溶于DMEM完全培养基中，除菌，得到所述冻干保护剂。
本发明还提供了上述技术方案所述的冻干保护剂或上述技术方案所述的方法制备得到的冻干保护剂在制备假病毒冻干产品中的应用。本发明所提供的冻干保护剂在制备假病毒冻干产品时能有效提高假病毒的冻干存活率和稳定性。
在本发明中，所述假病毒优选包括HPV假病毒；所述HPV假病毒的亚型优选包括HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV45，HPV52和HPV58中的一种或多种。
本发明还提供了一种冻干HPV假病毒，包括HPV假病毒和上述技术方案所述的冻干保护剂。
在本发明中，所述HPV假病毒优选为HPV液体型假病毒，所述HPV液体型假病毒与所述冻干保护剂的体积比优选为0.1～10：100，进一步优选为0.38～3.66：100；所述HPV液体型假病毒的滴度为6.88×102～3.75×105TCID 50/μL，优选为1.77×103～9.91×104TCID50/μL。
本发明通过调整冻干保护剂与液体型假病毒配比，可将滴度变化较大的液体型假病毒，制备成滴度均一的HPV冻干假病毒，为实验人员提供便捷，稳定，均一的HPV假病毒产品，使HPV假病毒产品标准化。
本发明还提供了上述技术方案所述的冻干HPV假病毒的制备方法，包括如下步骤：
将HPV液体型假病毒与上述冻干保护剂混合，进行真空冷冻干燥。
在本发明中，所述真空冷冻干燥的步骤优选包括：降温至-50～-40℃，在-50～-40℃升华干燥2～3h；由-50～-40℃升温至-32～-28℃，在-32～-28℃升华干燥10～12h；由-32～-28℃升温至-22～-18℃，在-22～-18℃升华干燥4～6h；由-22～-18℃升温至-7～3℃，在-7～-3℃升华干燥4～6h；由-7～-3℃升温至-2～2℃，在-2～2℃解析干燥2～3h；由-2～2℃升温至8～12℃，在8～12℃解析干燥2～3h；由8～12℃升温至18～22℃，在18～22℃解析干燥7～9h；进一步优选为降温至-40℃，在-40℃升华干燥3h；由-40℃升温至-30℃，在-30℃升华干燥12h；由-30℃升温至-20℃，在-20℃升华干燥6h；由-20℃升温至-5℃，在-5℃升华干燥6h；由-5℃升温至0℃，在0℃解析干燥3h；由0℃升温至10℃，在10℃解析干燥3h；由10℃升温至20℃，在20℃解析干燥9h；所述真空冷冻干燥的压强≤20Pa。
在本发明中，所述真空冷冻干燥的升温速率优选为0.10℃/min。本发明在真空冷冻干燥过程中逐步升温能够确保冻干过程中样品彻底的升华干燥。
进行真空冷冻干燥前，本发明优选在-40～-50℃下对HPV液体型假病毒与冻干保护剂的混合物预冻2～3h，进一步优选为在-40℃下对HPV液体型假病毒与假病毒冻干保护剂的混合物预冻3h。本发明对HPV液体型假病毒与假病毒冻干保护剂的混合物进行预冻能够使冻干样品完全冻结，使产品保持一定的形状。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种冻干保护剂及其制备方法和在制备假病毒冻干产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明实施例中，复溶液均为经0.22μm滤膜过滤处理的无菌纯化水。
实施例1
一种冻干保护剂，由如下浓度的组分组成：
10wt％甘露醇、3wt％海藻糖、1wt％牛血清白蛋白和余量的DMEM完全培养基；
按照上述浓度准确称取各组分后，溶于DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、1％青链双抗、1％NEAA、1％L-谷氨酰胺)中，充分震荡混匀后，使用DMEM完全培养基定容至1000mL，在室温下混匀后，0.22μm过滤除菌，即得冻干保护剂。
对比例1～对比例6
对比例1～对比例6和实施例1中组分不同，制备方法相同，具体组分区别如下表1所示：
表1实施例1和对比例1～对比例6的组分
测试例1
取HPV液体型假病毒，随机分为7个处理组，每个处理组包括9个亚型。HPV液体型假病毒的亚型、用量、配液前滴度以及冻干保护剂的用量如下表2所示：
表2HPV液体型假病毒的亚型、用量、配液前滴度以及冻干保护剂的用量
处理1～处理7分别将HPV液体型假病毒与实施例1和对比例1～对比例6得到的冻干保护剂充分混匀后，分装成1ml/支，进行真空冷冻干燥；
处理1～处理7的真空冷冻干燥步骤具体如下：在-40℃下预冻3个小时，随后在20Pa下，开启真空冷冻干燥。冻干工艺如下：-40℃升华干燥3小时；-30℃升华干燥12小时；-20℃升华干燥6小时；-5℃升华干燥6小时；0℃解析干燥3小时；10℃解析干燥3小时；20℃解析干燥9小时。升温速率控制在0.10℃/min。对冷冻干燥后的样品进行压塞，压盖，于-20℃保存。
保存48h后，以经0.22μm滤膜过滤处理的无菌纯化水作为复溶液，使HPV冻干假病毒复溶，进行假病毒滴度检测，计算存活率，结果如表3所示。
表3冻干保护剂配方冻干外观及存活率
从表3可以看出，本发明确定的配方可确保良好的冻干样品外观及较高的存活率。
实施例2～10
实施例2～实施例10分别提供了一种HPV冻干假病毒，由HPV液体型假病毒和实施例1所制备的冻干保护剂组成，其中所使用的HPV液体型假病毒的亚型、用量、配液前滴度以及冻干保护剂的用量如下表4所示。
表4实施例2～实施例10的组分用量
实施例2～实施例10制备HPV冻干假病毒时，分别将液体型假病毒和实施例1得到的冻干保护剂分别按照表4所记载的体积比混合，充分混匀后，分装为1mL/支，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的条件如下：在-40℃下预冻3h，随后在20Pa下，开启真空冷冻干燥。冻干工艺如下：-40℃升华干燥3h；-30℃升华干燥12h；-20℃升华干燥6h；-5℃升华干燥6h；0℃解析干燥3h；10℃解析干燥3h；20℃解析干燥9h。升温速率控制在0.10℃/min，对冷冻干燥后的样品进行压塞，压盖，即得冻干HPV假病毒。
测试例2
实施例2～实施例10得到的冻干HPV假病毒于-20℃保存48h后，使用无菌水复溶制备得到的HPV冻干假病毒，进行假病毒滴度检测，结果如表5所示。
表5HPV假病毒冻干方案
由表4～表5可知，不同亚型的HPV液体型假病毒滴度波动很大，本发明通过调整冻干保护剂与液体型假病毒的配比，结合80～100％的冻干存活率，可将滴度变化较大的不同亚型的HPV液体型假病毒，均制备成了滴度为0.5～3.0×105TCID50/mL的冻干HPV假病毒，可确保HPV假病毒与中和抗体作用的相关性，并且，每支滴度为0.5～3.0×105TCID50/mL的HPV冻干假病毒在使用时加4mL复溶液复溶，所获得的假病毒溶液刚好可检测一块96孔板，因此该滴度还可确保HPV冻干假病毒具有很好的适用性。
测试例3
(1)将实施例2～实施例10制备的冻干HPV假病毒于-20℃条件下储存。并将同批次的HPV液体型假病毒进行分装，分别于-80℃及-20℃条件下储存，作为对照。
分别于储存0月，1月，2月，3月，6月，12月，18月时各取样1支，测定假病毒滴度。将各月滴度数据与初始滴度数据进行比较，计算滴度损失率，结果如图1和表6所示。
表6HPV冻干假病毒储存-20℃和HPV液体型假病毒储存-80℃及-20℃后滴度损失情况(％)
由图1和表6可知，HPV冻干假病毒在-20℃储存时性质稳定，能够将假病毒滴度维持在与液体型假病毒于-80℃储存时一致的水平，甚至效果更优。
(2)将实施例2～实施例10中制备的9个亚型(HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV45，HPV52和HPV58)HPV冻干假病毒于4℃条件下储存。分别于储存0天，2天，4天，6天时取样，测定假病毒滴度，结果如图2和表7所示。
表7HPV冻干假病毒储存在4℃时的滴度数据
由图2和表7可知，本申请所制备的冻干HPV假病毒储存在4℃6天后依旧可以将假病毒滴度保持在0.5～3.0×105TCID50/支，说明本发明所制备的冻干HPV假病毒可使用冷链运输方式进行运输。
测试例4
中和抗体检测
中和抗体在体外与假病毒中和，使得假病毒丧失感染细胞的能力，进入细胞的假病毒会表达EGFP等蛋白，基于这一原理，取实施例2～实施例10的HPV冻干假病毒样品，进行中和抗体检测，同时用同亚型液体型假病毒做对照，具体步骤如下：
1.预先铺细胞
于96孔无菌平底透明细胞培养板的四周边缘孔加入250μL无菌水，预铺293FT细胞于B2～G11各列，每孔细胞数为1.5×104个，置于37℃、5％CO2孵箱中培养4～8h。
2.中和抗体加样
由9种基因型的HPV L1抗原免疫家兔(新西兰大耳白兔，由中国食品药品检定研究院实验动物生产和供应室提供)，获得血清样品。
另取无菌96孔板(稀释板，具体见图3)，于B4～B11孔中各加入76μL DMEM完全培养基，C4-G11各孔中分别加入60μL DMEM完全培养基。于B4～B11孔中加入血清样品4μL/孔，即每个类型(HPV冻干假病毒或液体型)假病毒4个平行(即图3中S1～S4)，每个平行两复孔。
3.样品梯度稀释：
将多道电动移液器调至20μL移液和50μL混匀程序，对B4～B11孔中液体轻柔的反复吹吸8次充分混匀，然后转移20μL液体至对应的C4～C11孔，轻柔的反复吹吸8次后转移至D4～D11孔，以此类推，最后从G4～G11孔中吸弃20μL液体。
4.HPV假病毒溶液制备及中和
4.1冻干型假病毒的配制
取出冻干HPV假病毒，平衡至室温后加入4.0mL经0.22μm滤膜过滤处理的无菌纯化水复溶，用移液器轻轻地反复吹吸几次，混合均匀，尽量避免产生气泡。
4.2液体型假病毒的配制
按照预先摸索的稀释倍数，用DMEM完全培养基将HPV假病毒稀释至400±200TCID50/孔。
5.将假病毒与血清样品混合，进行中和反应。
于稀释板第B3～B11各列，每孔加入上述液体型或冻干型假病毒溶液60μL；于B2～G2孔中加入60μL培养基。将稀释板4℃放置1h。
步骤2～步骤5中加样情况如图3所示。
6.从稀释板各孔中吸取100μL上述步骤中所配制的假病毒血清混合物/培养基，贴壁缓缓加入预先已铺好细胞的培养板对应孔中，轻拍培养板四周混匀。
7.将细胞培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中培养60h～96h。
8.通过Elispot读板仪扫描并计数每孔荧光斑点数，通过与假病毒对照组荧光斑点数比较，计算感染抑制率，根据感染抑制率，使用Reed-muench法计算出当50％假病毒被抑制时抗体的稀释倍数，即ID50，用ID50来表示抗体对假病毒中和活性大小，结果如表8所示。
感染抑制率(％)＝1-(样本检测值-细胞对照值)/(病毒对照值-细胞对照值)×100％。
表8冻干HPV假病毒和液体型HPV假病毒的血清中和抗体检测情况。
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由表8可以看出，HPV冻干假病毒的中和效果能够达到与HPV液体型假病毒相当的效果，说明HPV冻干假病毒完全可以替代HPV液体型假病毒，用于中和抗体检测。
由上述实施例可知，本申请所提供的冻干保护剂能确保良好的冻干样品外观及较高的存活率，可以替代HPV液体型假病毒，使最终制得的HPV冻干假病毒可以在-20℃储存，可使用冷链运输方式进行运输，本发明能够提供便捷，稳定，均一的HPV假病毒产品，使HPV假病毒产品标准化，有利促进HPV假病毒产品产业化。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括如下浓度的组分：
甘露醇8～12wt％、海藻糖1～5wt％、牛血清白蛋白0.5～1.5wt％和余量的溶剂。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述溶剂包括DMEM完全培养基。
3.权利要求1或2所述的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将甘露醇、海藻糖和牛血清白蛋白溶于溶剂中，除菌，得到所述冻干保护剂。
4.权利要求1或2所述的冻干保护剂或权利要求3所述制备方法制备得到的冻干保护剂在制备假病毒冻干产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述假病毒包括HPV假病毒；
所述HPV假病毒的亚型包括HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV45，HPV52和HPV58中的一种或多种。
6.一种HPV冻干假病毒，其特征在于，包括HPV假病毒和权利要求1或2所述的冻干保护剂。
7.根据权利要求6所述的HPV冻干假病毒，其特征在于，所述HPV假病毒为HPV液体型假病毒，所述HPV液体型假病毒与所述冻干保护剂的体积比为0.1～10：100；所述HPV液体型假病毒的滴度为6.88×102～3.75×105TCID50/μL。
8.权利要求6或7所述的冻干HPV假病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将HPV假病毒与权利要求1或2所述的冻干保护剂混合，进行真空冷冻干燥。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥包括以下步骤：降温至-50～-40℃，在-50～-40℃升华干燥2～3h；由-50～-40℃升温至-32～-28℃，在-32～-28℃升华干燥10～12h；由-32～-28℃升温至-22～-18℃，在-22～-18℃升华干燥4～6h；由-22～-18℃升温至-7～-3℃，在-7～-3℃升华干燥4～6h；由-7～-3℃升温至-2～2℃，在-2～2℃解析干燥2～3h；由-2～2℃升温至8～12℃，在8～12℃解析干燥2～3h；由8～12℃升温至18～22℃，在18～22℃解析干燥7～9h；
所述真空冷冻干燥的压强≤20Pa。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，进行真空冷冻干燥前，在-50～-40℃下对HPV假病毒与冻干保护剂的混合物预冻2～3h。
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