JPH06510672A - サプレッサーおよび前駆細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応（ＭＬＲ，）を抑制することができ る細胞集団の調製方法であって、 ヒト血液細胞供給源から得られる細胞の懸濁液を勾配分離にかけ、約５％以下の 該集団を回収することからなり、該集団は： 該勾配の最低密度フラクション中に含まれるものであるか、または 該血液細胞供給源からの未分画化細胞集団と比べてダブルネガティブサプレッサ ー（ＤＮＳ）および／またはヌル表現型のサプレッサー細胞に富んでいる細胞集 団を表すか、あるいは効果的な量のＤＮＳおよび／またはヌル表現型のサプレッ サー細胞を含んでいるが、該集団はその抑制活性を保持するように十分な数の反 作用細胞表現型を含んでいない、ことを特徴とする上記の調製方法。

６、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することができる細 胞集団の調製方法であって、 場合により、哺乳動物の血液細胞供給源から得られた細胞の懸濁液を、赤血球を すべて取り除くための処理に付し、場合により、該細胞懸濁液を、多形核細胞を すべて取り除いて単核細胞を回収するための分離に付し、場合により、該単核細 胞をプラスチック付着表面にさらして単球を除き、 該細胞懸濁液をパーコール勾配分離にかけ、そしてヌルＮＳ細胞および／または ＤＮＳ細胞に富みかつＴヘルパー細胞を含まない、もとの血液細胞供給源からの 約５％以下の細胞を回収する、 ことを特徴とする上記方法。

７、本質的にダブルネガティブサプレッサー（ＤＮＳ）細胞またはヌルＮＳ細胞 からなる細胞集団の調製方法であって、哺乳動物の血液細胞供給源から調製した 細胞懸濁液をパーコール勾配にかけ、他のＴ細胞と比べてＤＮＳ細胞について富 化された該勾配の低密度フラクション中の細胞を回収し、そして該細胞をＣＤ４ 、ＣＤ８およびＴＣＲαβに関して染色し、染色した該細胞をフローサイトメト リーにかけ、そしてＤＮＳ細胞に対応するフラクションを回収するか、あるいは 該懸濁液の残りの細胞をＣＤ４、ＣＤ１６、Ｉｇ、ＩＬ−２Ｒ１ＣＤ３、ＣＤ８ およびＴＣＲαβに関して染色し、染色した該細胞をフローサイトメトリーにか け、モしてヌル細胞に対応するフラクションを回収する、ことを特徴とする上記 方法。

８、ＤＮＳまたはヌルサプレッサー細胞の集団を増やす方法であって、 ＤＮＳまたはヌルサプレッサー細胞に富む集団を少なくとも１種のサイトカイン で処理することからなり、場合により、該細胞をＰＨＡおよび／またはＣｏｎＡ および／または抗ＣＤ３抗体で処理することをさらに含む、ことを特徴とする上 記方法。

９、請求項５．６．７または８の方法により調製された細胞の集団。

１０、移植片対宿主病の予防に用いるための請求項１の細胞系あるいは請求項２ ．３．４または９の細胞集団。

１１、骨髄移植または臓器移植の生着促進に用いるための請求項１の細胞系ある いは請求項２．３．４または９の細胞集団。

１２、造血ＣＤ３４’前駆細胞に富む血液細胞集団の調製方法であつ、て、 哺乳動物の血液細胞供給源から得られた細胞集団を、重量オスモル濃度およびｐ Ｈの生理学的条件下で密度勾配分離にかけ、そして 低密度のフラクションから該前駆細胞に富むフラクションを回収する、 ことを特徴とする上記方法。

１３、前記の回収したフラクションが密度勾配分離にかけた該細胞の５％以下に 相当し、最低密度を有するか、または前記の密度勾配がパーコール勾配で、該フ ラクションが４０〜４５％パーコールに相当するか、または前記の回収したフラ クションが少なくとも１０％のＣＤ３４”前駆細胞を含むか、または 前記の方法が、該集団を密度勾配分離工程にかける前に、哺乳動物の血液細胞供 給源を赤血球および／または多形核細胞を該集団から取り除く工程にかけること をさらに含む、請求項１２記載の方法。

１４、　請求項１２または１３の方法により調製された前駆細胞に富む細胞集団 。

１５、少なくとも１０％のＣＤ３４＋細胞を含み、実質的に赤血球と多形核細胞 を含まない、哺乳動物の血液細胞供給源から得られた細胞集団。

１６．４０〜４５％パーコールの範囲の密度に合致するような密度を有する、ま たは 前記の血液細胞供給源からの未分画化細胞集団と比べてダブルネガティブサプレ ッサー（ＤＮＳ）および／またはヌル表現型のサプレッサー細胞に富んでいる、 または効果的な量のＤＮＳおよび／またはヌル表現型のサプレッサー細胞を含ん でいるが、該集団はその抑制活性を保持するように十分な数の反作用する細胞表 現型を含んでいない、または前記の血液細胞供給源中の血液細胞の５％未満に相 当する、請求項１５記載の細胞集団。

１７、患者における造血前駆細胞集団の回復に用いるための請求項１４．１５ま たは１６記載の細胞集団。

＋８．ＰＭＡ／イオノホア処理Ｔ細胞から分離し得る、約２０ｋｄのモノマー分 子量を有する、分離精製された形の可溶性サプレッサー因子（Ｓ　Ｆ）タンパク 質であって、該Ｔ細胞はＤＮＳまたはヌル表現型を有しかつ対応する標的細胞に 対してナチュラルキラー活性を示さず、該ＳＦは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を 抑制することができるが、ＣｏｎＡ、ＰＨＡまたは抗ＣＤ３により刺激された肺 細胞でのＩＬ−２産生を抑制しないことを特徴とする、上記のタンパク質。

１９、次のＮ末端アミノ酸配列： Ｘ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａ ｌ−（Ａｌａ／Ｐｈｅ）−Ｌｅｕ−（Ｌｙｓ／Ｌｅｕ）−Ｔｙｒ−Ｇ！ｎ−Ｖａ ｌを有し、かつ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することができる、約２０ｋ ｄの分離精製された形の可溶性サプレッサー因子（ＳＦ）タンパク質。

２０、サプレッサー因子（Ｓ　Ｆ）タンパク質の調製方法であって、ＤＮＳまた はヌル表面表現型を有し、ＭＬＲを抑制し、しかも対応する標的細胞に対してナ チュラルキラー活性を示さない細胞系の培養物に、該ＳＦを上清へ分泌させるの に効果的な量のＰＭＡおよびカルシウムイオノホアを添加し、該上清を回収し、 そして 場合により、該上清を、ＤＥＡＥ−セファロースアニオン交換カラムに該ＳＦが カラムに吸着される条件下で加え、該カラムを塩勾配で溶離して複数のフラクシ ョンを得、そして該ＳＦを含有するフラクションを回収するか、または該上清を 、該ＳＦと免疫反応性の抗体をアフィニティーリガンドとして含むクロマトグラ フィーカラムに該ＳＦがカラムに吸着される条件下で加えて、該カラムから該Ｓ Ｆを溶離することがらなり、そして 該方法は、場合により、該ＤＥＡＥカラムから回収された該フラクションを、該 ＳＦと免疫反応性の抗体をアフィニティーリガンドとして含むクロマトグラフィ ーカラムに該ＳＦがカラムに吸着される条件下で加えで、該カラムから該ＳＦを 溶離するが、または 場合により、回収された該フラクションを、レンチル−レクチンクロマトグラフ ィーカラムに該ＳＦがカラムに吸着される条件下で加えて、該カラムから該ＳＦ を溶離することをさらに含む、上記方法。

２１、請求項１８または１９のＳＦと特異的に免疫反応を行う抗体またはその免 疫反応性フラグメント。

２２、活性成分としての請求項１８または１９のＳＦタンパク質を製剤上許容さ れる賦形剤と共に含有する、患者に免疫抑制を賦与するのに適した医薬組成物。

２３、請求項１８または１９のサプレッサー因子タンパク質をコードするＤＮＡ を含むＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子の組成物。

２４、適合性の宿主細胞内に導入したとき、請求項１８または１９のＳＦタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列を発現することができる発現系であって、ＳＦタン パク質を発現させることができる制御配列に機能しうる状態で連結されたＳＦタ ンパク質コード化ＤＮＡを含有する、上記の発現系。

２５、請求項２４の発現系を用いて形質転換またはトランスフェクションを行っ た組換え宿主細胞。

２６、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することができるが、Ｃ０ｎＡ、ＰＨ Ａまたは抗ＣＤ３により刺激された肺細胞でのＩＬ−２産生を抑制しないサプレ ッサー因子タンパク質の産生方法であって、 請求項２５の細胞を前記のコード化ＤＮＡが発現される条件下で培養し、 該培養物から該ＳＦタンパク質を回収する、ことからなる上記方法。

明細書 サプレッサーおよび前駆細胞 技術分野 本発明は、免疫反応を抑制することに関する。より詳細には、本発明は、宿主に おいて免疫抑制（移植片対宿主病の抑制を含む）を引き起こすことができ、かつ 移植した細胞や組織の生着（ｅｎｇｒａｆ　ｔｍｅｎｔ）を高めることができる 新鮮なまたはクローン化されたナチュラルサプレッサー細胞に関する。さらに、 本発明は、移植やアレルゲンへの応答において、または自己免疫疾患の管理にお いて免疫反応抑制能を有する可溶性の免疫抑制因子に関する。

従来技術 “免疫寛容”および“免疫抑制”とは、通常免疫反応を起こすと予想される物質 の適合性を説明するだめの一般的な用語である。

組織や細胞を、これらが存在しないかまたは免疫抑制状態でない同種異系の宿主 に移植すると、宿主の免疫系は外来抗原への免疫反応を高めることとなり（宿主 対移植片病）、より重症な場合は、移植片中の免疫担当細胞が宿主内に存在する 抗原に対して反応するようになるだろう（移植片対宿主病）。その他の望ましく ない免疫反応として、アレルギー反応や自己免疫疾患がある。前記の症状はすべ て、免疫反応を抑制することが望ましい。

哺乳動物の新生児は、同種異系の免疫担当細胞に対して、あるいは生後２，３日 以内に投与された他の抗原物質に対して持続性のある免疫寛容性を獲得する能力 をもつことが知られている。例えば、組織適合性抗原を有する同種異系物質を注 入されたマウスは、以前に注入された遺伝子型のドナー（提供者）からの皮膚移 植片をその後受は入れるようになる。比較的最近になって、新生児のこの免疫抑 制特性は、全リンパ系照射（ＴＬＩ）、すなわち非リンパ系組織が保護されてい るときに持続可能な高線量の放射線を受けた成人の場合に似ていることがわかっ た。このような照射が例えばホジキン病の治療に使用されてきた。また、ＴＬＩ を受けた成人患者は、ＴＬＩの終了の２．３日以内に投与された抗原に対して持 続的な免疫寛容性を獲得することもできる。

新生児やＴＬＩ処置患者がこれらのウィンドー（ｗｉｎｄｏｗ）期間内に投与さ れた抗原や細胞に対して免疫寛容性を獲得し得ることに関する詳細なメカニズム はわかっていない。クローン欠失と能動抑制の両方の例が提唱されている。新生 児の膵臓に少なくとも２つのタイプのサプレッサー細胞が存在することによって 事態はさらに複雑化している。１つのタイプは、ｉｎ　ｖｉけ０でヒツジ赤血球 に対する抗体応答を抑制するマクロファージ前駆細胞に相当する。

この活性はインドメタシンによって阻害されるので、これらの細胞はプロスタグ ランジン依存性であると考えられる。もう１つのタイプは、混合白血球応答（Ｍ 　Ｌ　Ｒ）を抑制するリンパ球に相当する。これらの細胞は明らかにプロスタグ ランジン非依存性である。このクラスの１群の細胞である“ヌル”細胞はＴ細胞 、Ｂ細胞またはマクロファージに特徴的な表面マーカーを欠いており、また、そ れらが抗原特異性を欠きかつ抗原による刺激なしで効果的な機能を果たす大型の 顆粒リンパ球であるという点でナチュラルキラー細胞に類似した形態をもってい る。これらの細胞の表面の表現型はＩｇ−１ＣＤ４−１ＣＤ８−１ＣＤ３−　、 ＭＡＣ−１−１ＴＣＲαβ−である。ヌルサプレッサー細胞のこの集団は、ナチ ュラルキラー（ＮＫ）細胞と対称的であるため、ナチュラルサプレッサー（ＮＳ ）細胞と呼ばれている（Ｏｓｅｒｏｆｆ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８４）　１３２：１０１）。

ヌル表現型のほかに、Ｉｇ−１ＣＤ４−　、ＣＤ８−　、ＣＤ３”、ＭＡＣ−１ −、ＴＣＲαβ１の表面表現型を含むナチュラルサプレッサー細胞がＴＬＩを受 けた成熟マウスの膵臓から回収された。これらの“ダブルネガティブ（ｄｏｕｂ ｌｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ）”サプレッサー（ＤＮＳ）はｉｎ　ｖｉｔｒｏで適切 な条件下に無限に増殖することができる（Ｈｅｒｔｅｌ−Ｗｕｌｆｆ、　Ｂ、、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８４）１３３：２７９１− ２７９６　、この文献を参照によりここに組み入れるものとする）。これらの“ ＤＮＳ″細胞は新生児膵臓、正常成体膵臓および骨髄から得られた細胞からもク ローン化することができる。

（上記のヌル細胞は成体ＴＬＩ牌臓膵臓び正常胸腺からもクローン化されている 。） 今回、クローン化ＤＮＳまたはヌル細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで投与するとき、同 時に投与した免疫担当細胞によって開始される移植片対宿主病を抑制し得ること が見いだされた。さらに、増殖したＤＮＳまたはヌル細胞は、培地上清中に、免 疫反応を抑制することができる可溶性因子を分泌する。このことは、通常用いら れる１ｎｖｉｔｒｏ試験（上記の混合白血球反応（ＭＬＲ））において同種異系 反応を抑制する能力、およびｉｎ　ｖｉｖｏて移植片対宿主病と呼ばれる急性免 疫反応を抑制しかつ移植組織の生着を促す能力から明らかである。

親出願の提出後の本発明者らの別の刊行物は細胞と分泌された因子について詳述 している。ＮＳ細胞のサプレッサー活性の様子は、５ｔｒｏｂｅｒ、　Ｓ、、　 Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８４）　２：２Ｌ９によって検討され た。クローン化サプレッサー細胞系は、Ｓｃｈｗａｄｒｏｎ、　Ｒ，Ｂ、。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　（１９８５）　１６２：２９７およびＳ ｃｈｗａｄｒｏｎ、　Ｒ，Ｂ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　（１９８９）、　ｐ、　１ ０７に詳述されている。

Ｈｅｒｔｅｌ−Ｗｕｌｆｆ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　 （１９８７）　１６６：１１６８は、クローン化ＮＳ細胞系におけるＴ細胞レセ プター遺伝子の再配列および発現を記載している。クローン化ＤＮＳ細胞系の表 面表現型はＩＬ−２Ｒ”、ＣＤ３”、ＣＤ４−１ＣＤ８−およびＴＣＲαβ“で あることが、５ｔｒｏｂｅｒ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ 　（１９８９）１４３：１１１８によって確認された。かくして、ＤＮＳ細胞は 、Ｔ細胞マーカーもＢ細胞マーカーも発現しない（ＣＤ３−　、ＴＣＲαβ−１ Ｉｇ　）ヌルＮＳ細胞とは区別される。しかしながら、両タイプ（ヌルおよびＤ ＮＳ）ともＩＬ−２の表面レセプター（ＩＬ−２Ｒ）を発現する。従って、ヌル 細胞はＣＤ３−１ＩＣＤ３−１Ｉαβ−１ＭＡＣ−１−１およびＩＬ−２Ｒ＋で ある。可溶性因子については、Ｈｅｒｔｅｌ−Ｗｕｌｆｆ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８８）１４０：２６３３に詳述されている 。最近の論文であるＰａｌａｔｈｕｍｐａｔ。

Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９９２）　１４８：３７３− ３８０には、ネズミ骨髄からのダブルネガティブサプレッサー細胞の分離が記載 されている。

移植片対宿主病をもたらす免疫担当ドナー細胞を抑制する能力は、同種異系移植 や臓器移植を成功へ導く技術の進歩を考慮すると、特に重要なこととなる。健康 な組織を、それを必要としているレシピエンド（受容者）に移植することは、現 在、主としてしシビエントに関する免疫寛容の欠如により制限されているようだ 。

かくして、移植片対宿主病の問題が解決されるならば、骨髄移植に伴う危険が大 幅に減少するだろう。全臓器移植の場合には、臓器の拒絶反応が軽減されるだろ う。

さらに、移植ｊ−だ細胞の生着を促すことが重要となる。新生児またはＴＬＩを 受けた成人へ、“ウィンドー（ｗｉｎｄｏｗ）″期間内に骨髄の形で同種異系組 織を投与すると、１７′シピエントが自分自身の抗原とこの時期に投与されたア ロ（同種異系）抗原の両方を“自己”として認識するキメラに転換されることは よく知られている。キメラの形成は生着が起こったことを示している。また、宿 主のキメラ特性は、続いて導入された免疫担当細胞が宿主組織を攻撃しないとい うものである。従って、これらのキメラは同時に投与されたドナー骨髄を受け入 れるばかりでなく、他のドナー組織も受け入れる。それ故に、キメラなレシピエ ンドは、将来、もとのドナーからの移植組織に対して寛容性をもつことになろう 。

生着を起こさせるには、細胞表面マーカーＣＤ３４に富む細胞が役に立つことが 知られている。なぜならば、このマーカーは“幹”または“前駆”細胞の特徴を 表しているからである。これらの細胞は単球、マクロファージ、リンパ球、赤血 球などを含む血液中に存在する多様な分化細胞の先祖である。かくして、移植細 胞が生着する能力は、ＣＤ３４マーカーを有する細胞による移植細胞の富化に依 存するだろう。

正常な成体レシピエンド宿主は、もちろん、最初に投与された骨髄細胞によって 生じる急性免疫反応に負けないように予防されねばならない。ＤＮＳおよびヌル ＮＳ細胞は、キメラの特徴を発現させるのに十分な程度に、即時免疫反応と他の どのような抗ドナ一応答をも弱めることができる。さらに、新鮮なまたはクロー ン化されたＤＮＳおよびヌル細胞はｉｎ　ｖｉｖｏ移植片対宿主免疫反応を防止 することもできる。分泌された因子はｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび１ｎｖｉｖｏにお いて宿主に対するドナーの、およびドナーに対する宿主の免疫反応を抑制するこ とができる。

従って、Ｄ　Ｎ　Ｓおよびヌル細胞とそれらから分泌される因子は、即時の寛容 が望まれる外来物質または組織と共に該細胞または該因子を同時投与することに よって、哺乳動物宿主に対する移植片の免疫反応あるいはドナーに対する宿主の 免疫反応を直ぢにブロックするのに有用である。さらに、そして特に、これらの 細胞および／または因子により、宿主は、ドナー組織が該細胞または該因子と同 時投与された組織と同じ遺伝子型のドナーに由来する場合、現在と将来の両移植 片に対して寛容になるだろう。

発明の開示 本発明は、希望するどの抗原に対しても免疫反応を抑制し、か一つ外来細胞の生 着を促すのに有用な因子を分泌することができる新鮮な細胞並びに不死化細胞系 を提供する。免疫反応は同種異系の組織に対する宿主の免疫反応（宿主対移植片 ）または宿主組織に対するドナー免疫担当細胞の免疫反応（移植片対宿主）であ りうる。レシピエンドのキメラの形成は生着が起こったことを示し、また、将来 の同種異系移植の受入れを可能にするものである。本発明の細胞および可溶性因 子が抑制し得る他の望ましくない免疫反応にはアレルギー反応と自己免疫疾患が 含まれる。

かくして、１つの面において、本発明は、ナチュラルサプレッサー細胞とそれら を含む細胞集団に向けられる。ナチュラルサプレッサー細胞は２つの表現型をも つ。一方の表現型である“ヌル”表現型では、表面マーカーパターンがＢまたは Ｔ細胞に特徴的なマーカー、およびマクロファージマーカーを欠いている。

“ダブルネガティブザブレラｔ−（ＤＮＳ）″細胞型では、細胞がマクロファー ジおよび免疫グロブリンに特徴的な表面マーカーと、ヘルパーＴ細胞および細胞 障害性Ｔ細胞に特徴的なＣＤ４およびＣＤ８マーカーをもそれぞれ欠いている。

しかし、ＤＮＳ細胞はＣＤ３”　、ＴＣＲαβ１であって、Ｔ細胞系列に特徴的 なこれらの特定マーカーを含んでいる。これらのサプレッサー細胞型は両方とも 増殖および／またはクローン化させることができるため細胞調製物の形で使用し 得るが、その際ヌルまたはＤＮＳ細胞の抑制効果はＣＤ４＋および／またはＣＤ ８＋リンパ球のような組成の成分を加えても相殺されない。抑制試薬としての細 胞組成物の効力はｉｎ　ｖｉｔｒｏでの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）により確か めることができる。

これらの抑制細胞系および細胞調製物は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防す るのに、あるいはキメラなレシピエンドが生じるように同種異系移植片の生着を 促すのに、骨髄移植や臓器移植との関連において有用である。本発明はまた、こ れらの細胞組成物および細胞系を調製して増殖させる方法、免疫反応を抑制する 際のそれらの使用、並びにそれらを含有する医薬組成物に向けられる。

さらに別の面において、本発明は、前駆細胞に富み、かつ単核白血球の密度勾配 選別によって簡単に得ることのできる骨髄または血液細胞の集団、およびこの集 団の調製方法に向けられる。従って、ＣＤ３４表面マーカーに富むこの集団は、 適当な密度の白血球単核サブフラクションを回収することにより得られる。

他の面において、本発明は、ナチュラルサプレッサー細胞によって分泌された可 溶性のサプレッサー因子に向けられる。この因子は望ましくない免疫反応が起こ る様々な症状において有用である。かくして、別の面は、本発明の可溶性因子を 用いてこのような症状を治療すること、およびそれに適する医薬組成物に関する 。

その他の面では、本発明は、可溶性因子タンパク質を生産するための組換え物質 および方法、並びにサプレッサー因子に特異的な抗体およびそのフラグメントに 向けられる。

図面の簡単な説明 図１は、ＮＳ細胞上清によるＭＬＲの抑制を示す。

図２Ａ−２Ｄは、それぞれ、ＭＬＲの、そしてＣｏｎＡ、ＰＨＡおよび抗ＣＤ３ ＋処理の状況下でのＴ細胞増殖に及ぼすＴＬＩ−Ｃ７細胞からの刺激された上清 の影響を示す。

図３は、ＤＥＡＥセファロースからの本発明の可溶性因子の溶出パターンを示す 。

図４は、ＩＦＮ−γで処理したＡＰＣに及ぼす精製可溶性因子の影響を示す。

図５は、同種異系刺激細胞を含むＭＬＲにおける種々の骨髄フラクションの応答 を示す。

図６は、ＭＬＲを抑制する種々の骨髄フラクションの能力を示す。

図７は、新生児における移植片対宿主反応の証拠として牌臓拡大の用量−反応曲 線を示す。

図８は、ＮＳ細胞と共にまたはＮＳ細胞なしで同種異系膵臓細胞を注入されたマ ウスの生存率を示す。

図９は、ＤＥＡＥセファロースからの本発明の可溶性因子の溶出バタ一二／を示 す。

図１０は、レンチル（ｌｅｎｔｉｌ）−レクチンからの本発明の可溶性因子の溶 出パターンを示す。

発明の実施態様 本発明は、ヒトおよび他の動物患者において免疫抑制能を有する物質および免疫 抑制方法に関する。“免疫抑制”とは、ここでは、チャレンジ（抗原投与）に対 する免疫反応を低下させる意味で用いられるものと定義される。特定の抗原に対 する免疫反応の抑制が望ましいかもしれないが、“抑制”はそのようには限定さ れない。本発明の可溶性因子の免疫反応抑制能は抗原非依存性である。

“特異的免疫寛容”とは、宿主またはドナー物質の免疫担当細胞が特定の標的抗 原に出くわしたときに免疫反応を誘起することができない宿主の特性を意味する 。標的抗原は例えば単純な可溶性タンパク質または炭水化物、感染性の細胞、ま たは細胞表面でありうる。ドナー組織は免疫担当細胞を含む同種異系の移植組織 であり得、その場合は宿主自身の組織が標的抗原となる。

“ドナー物質”とは、免疫寛容が望まれるレシピエンドに提供される物質のこと である。分子レベルでのドナー物質の免疫反応性の性質は知られていても、いな くてもよい。例えば、単に同種異系移植に対して宿主を寛容にすることが望まし いだろう。その場合、ドナー物質は免疫原および免疫担当物質ｐく移植組織中に 存在するどんなものであってもよい。

ドナー組織に対する宿主細胞の反応（宿主対移植片病）および移植片対宿主病の 反応を抑えることが望ましい。後者は宿主組織への移植組織の免疫反応を抑える ことにより達成される。このような状況のもとでは、′ドナー物質”は免疫担当 細胞を含み、該細胞は移植レシピエンドに存在するどんな抗原物質にも応答して 、この物質による免疫反応を引き起こす。

“ヌル表面表現型”とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージに特徴的な表面 マーカーを欠き、しかもナチュラルキラー細胞に類似した形態を有する本発明の １つのタイプの細胞の特性を指す。かくして、それらは抗原特異性を欠き、抗原 による刺激なしでそれらの機能を果たす大型の顆粒リンパ球である。表面マーカ ーに関して、ネズミ系での適当な表面マーカーにはＬｙｔ−Ｌｔ、ｙｔ−２、お よびネズミＩｇやＩａのような表面免疫グロブリンが含まれる。これらのマーカ ーはネズミヌルＮＳ細胞には存在しない。各哺乳動物系はその典型的な対応マー カーを含むが、ヒト系では当分野で知られた各種のモノクローナル抗体によって 認識されるマーカーを含む。

一般的には、すべてのを椎動物種の表面マーカーに関する包括的用語が用いられ るだろう。Ｔ細胞サブセットに特徴的なマーカーにはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８お よびＣＤ３４があり、免疫グロブリンに特徴的なマーカーにはＩｇがあり、そし てマクロファージに特徴的なマーカーにはＭＡＣ−１がある。従って、ネズミや ヒトを含む動物種から誘導されたヌル細胞はＩＬ−２Ｒ”、Ｉｇ−、ＭＡＣ−１ −、ＣＤ３−１ＣＤ４−　、ＣＤ８−　、ＴＣＲαβ−によって特徴づけられる 。“ＤＮＳ表現型”は、サプレッサー細胞がＣＤ４とＣＤ８のマーカーを欠くダ ブルネガティブサプレッサー表現型を指す。それらはＢ細胞やマクロファージの マーカーももっていない。しかし、これらの細胞はＣＤ３”　（それ故Ｔ細胞で ある）およびＴＣＲαβ“である。ネズミやヒトを含むを推動物からのＤＮＳ細 胞はｉ　Ｌ−２Ｒ”、Ｉｇ−２ＭＡＣ−１−１ＣＤ３”、ＣＤ４−１ＣＤ８−１ ＴＣＲαβ“によって特徴づけられる。それらはサプレッサー細胞であるので、 ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＭＬＲを抑制する。

“対応する”標的細胞とは、細胞障害性リンパ球が溶解すると予想される標準的 アッセイの細胞を指す。それらは、ネズミ系ではＹＡＣ−１で、ヒト系ではに５ ６２細胞である。

“細胞系”あるいは“細胞”、“細胞培養物”などの類似の用語は、記載した特 定の遺伝子型、その子孫、もとの細胞の本質的特徴を保持するその変異体および 誘導体を指す。自然界で起こる突然変異や故意に誘発される変異が特定の細胞系 の増殖において一般的であることはよく知られており、その多くは希望する性質 に無関係である。例えば、本発明の細胞では、上記のようなヌルまたはＤＮＳ細 胞の特徴的な表現型の表面パターンばかりでなく、混合リンパ球反応を抑制する 能力も保持されねばならない。他の代謝特性、例えば栄養要求性、抗生物質耐性 などは細胞の機能性に無関係であり、特定の“細胞系”に関するこの定義はかか る変異を有する変異体および誘導体を含むものである。さらに、２つの細胞系を ハイブリダイズさせて、両パートナ−の希望する特性を保持させることも可能で あることが理解されよう。このようなハイブリドーマは、必要な性質が保持され ている場合は、もとの細胞系の誘導体と見なされる。

本発明では、クローン化された細胞系と新たに調製された細胞培養物とが区別さ れ、いずれか一方または両方が特定の性質を有する希望の集団に富むものであっ たり、かつ／またヌルおよびＤＮＳ細胞の抑制活性を妨げる性質を有する細胞や 他の成分を含まないものである。骨髄、胸腺または牌細胞が新たに調製されるヌ ルまたはＤＮＳ細胞の適当な供給源であり、これらの細胞は下記のようにフィコ ール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）および／またはパーコール （Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配を用いて分画化することができる。

さらに、これらのフラクションは、希望する細胞の増殖を促す適当な増殖因子を 供給することにより、希望の細胞集団を富まぜることができる。これら新たに調 製されて、富化された混合集団をここでは“新鮮な”細胞と呼ぶことにする。こ れらはクローン化細胞系と区別される。クローン化細胞系は、所望により、この ような“新鮮な”細胞から調製することができ、実際には同じ遺伝子型の均質な 集団でヌル細胞かＤＮＳ細胞のいずれかである。かかる細胞系はどのようなを推 動物源からも調製しうるが、ネズミやヒト源から調製するのが最も有利である。

同様に、本発明のサプレッサー因子もを推動物からの細胞を使って調製しうる。

“混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制する”とは、同種異系源からのリンパ球を 混合するときに起こる応答において、成熟Ｔ細胞によるマーカー物質（例えばチ ミジン）の取り込みを阻止する本物質（可溶性因子または細胞）の能力を意味す る。詳細には、ｔ（ｅｒｔｅｌ−Ｗｕｌｆｆら、　１９８４　（前掲）に記載の 方法によりこの性質を試験することができる（下記参照）。一般に、ＭＬＲ抑制 は種特異的である。すなわち、Ｍ　Ｌ　Ｒアッセイ系はサプレッサー細胞と同じ 欅に由来する細胞から構成すべきである。

“同時”投与とは、概ね同時に存在すること、つまり数時間以来発明のＮＳ細胞 とＮＳ因子タンパク質はそれらのｉｎ　ｖｉｔｒｏま戸、・はｉｎ　ｖｉｖｏ活 性によって特徴づけられ、それらの活性ゆえに有用である。ｉｎ　ＶｉｉｒＯ活 性は同種異系反応を検出するための慣用プロトコールである混合白血球反応（Ｍ ＬＲ）を用いて証明される３゜このプｌＪトコールでは、ある動物種の２つの遺 伝的に異なる個体からのリンパ球を培地中で混合する。各個体の細胞は異なる主 要組織適合性抗原（ＭＨＣ）をその表面にもっているので、それぞれのＴ細胞は これらの差異に応答する。応答の測定は、一方の種の細胞を照射して未照射（応 答）細胞集団による免疫反応の刺激物質としてのみ行動させることにより単純化 される。免疫反応は応答細胞のうちの増幅Ｔ細胞によるリンホカ・インの初期分 泌を伴うと考えられ、リンホカインは細胞障害性Ｔ応答細胞の成熟化を媒介する 。、二の増殖は標識チミジン（じＨ］ＴｄＲ）の取り込みにより追跡され、応答 の抑制は標識チミジン取り込みの阻止により示される。

さらに詳しく述べると、本明細書中で実施したアッセイの１形態では、５Ｘ１０ ５個の正常Ｂ　Ａ　１−　Ｂ　／　ｃ膵臓応答細胞を、１ｎｖｉｔｒｏで照射し ておいた７、５Ｘ１０５個の正常Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ刺激細胞と混合する。４また は５日後、混合培養物に［３旧−チミジンを与え（パルス）、１８時間後にチミ ジンの取り込みを測定する。対照培養物は一般に１１０．０００±７，０００　 ｃｐｍを与え、この測定値を、ＮＳ細胞またはＮＳ因子含有上清を添加した培養 物から得られたＣｐＨｌと比較する。新鮮なまたは不死化したＤＮＳおよびヌル ＮＳ細胞と、それらが分泌する可溶性因子は、両方ともＭＬＲにおいてチミジン の取り込みを阻止することができる。

また、ＭＬＲは上清に分泌されたＩＬ−２を評価することによっても測定し得る 。上清を集め、平底マイクロタイタープレート内のＨＴ−２細胞（ｌ　Ｏ’細胞 ／ウェル）に連続希釈物として加える。３７℃で２４時間培養後、Ｍｏｓｍａｎ ｎ、　Ｔ、、　Ｊ　１ｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ（１，９８３）　６５：５５に記 載されるテトラゾリウム検定（ＭＴＴ検定）により、あるいはチミジン取り込み により増殖を測定する。チミジン取り込みの場合は、培養物をガラスフィルター 上に回収する４時間前に！μＣｉ／μＣ用のトリチウム標識ＴｄＲ（比活性６゜ ７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加え、回収した細胞をベックマン液体シンチレーションカ ウンターで計測する。ＩＬ−２の濃度は同じアッセイでの標準組換えＩＬ−２の 滴定と比べて算出する。応答細胞によるチミジンの取り込みまたはＩＬ−２産生 を阻止する能力は刺激細胞の抗原構造と無関係であり、サプレッサー細胞と応答 細胞のハブロタイブが一致する必要はない。抑制のメカニズムは不明であるが、 ＨＴ−２細胞のＩＬ−２誘導増殖もマクロファージによるＩＬ−１分泌も本発明 の細胞または因子によって直接抑制されないことが実証された。

ＧＶＨＤのｉｎ　ｖｉｔｒｏ抑制活性を評価するアッセイでは、致死量以下の線 量の放射線を照射しておいたマウスに、新鮮なまたはクローン化ＮＳ細胞の懸濁 液あるいはＮＳ因子を注入（〜、同時に同種異系の種から得られた牌細胞または 骨髄をそれぞれに投与する。

その後、宿主に対するドナー細胞の免疫攻撃に関して、致死的な移植片対宿主病 の防御により免疫抑制作用を確かめる。ＤＮＳまたはヌルＮＳ細胞呼濁液とＮＳ 因子タンパク質は、宿主組織に対する免疫担当ドナー細胞の即時免疫反応を抑制 することができる。

これらのアッセイのデータは移植片対宿主病の防御、つまり宿を組織に対するド ナー免疫担当細胞の免疫寛容性を示すが、キメラな宿主の場合には、これにより 引き続いて、宿主自身の免疫担当細胞が、補足的なやり方で、同種異系または他 の外来組織に対して寛容性を示すようになる。さらに、これらの結果は、細胞お よび因子の即時免疫抑制能を実証１７ている。

生着の増強についてのアッセイ 牌細胞よりもむ（７ろ骨髄を受け取っているレシピエンドの場合、その後の同種 異系皮膚移植片（このドナーは骨髄を採取した株のものであった）に対する免疫 寛容は、生着が起こった場合にレシピエンドにおいて達成される。これらの直接 実験結果から、ＤＮＳおよびヌルＮＳ細胞並びにＮＳ因子が生着能を有すること が実証される。移植すべき細胞は、ＣＤ３４表面マーカーを含む細胞の割合を評 価することによっても、それらの生着能についてアッセイすることができる。こ の評価は免疫蛍光染色とその後のＦＡＣ８のような標準技術を使って行われる。

下記の本発明方法はこれらの表面マーカーを有する細胞による細胞集団の富化を 提供するものである。

ＮＳ細胞の調製 ＴＬＩまたは新生児マウスから得られた牌細胞の増殖はＨｅｒｔ、ｅｌ−Ｗｕｌ ｆｆ　ら、　１９８４　（前掲）に記載の方法により行う。マウスは便利な被検 体であるので使用したが、もちろん他のを椎動物も使用できるだろう。

また、新生児から医学的指示のために摘出された、あるいは他の医学的指示のた めに全リンパ球照射を受けて最近死去した予め確認をとったドナーから摘出され た膵臓を使うことにより、培養物としてヒト細胞を利用してもよい。これとは別 に、ヌルおよびＤＮＳ表面表現型を有するヒト骨髄を使うこともできる。本発明 者らは、本質的にＤＮＳ細胞からなるサプレッサー細胞組成物を新生児肺臓、正 常成体膵臓、成体ＴＬＩ牌臓膵臓び骨髄から容易に調製できることを見いだした 。ヌル細胞は成体ＴＬＩ牌臓膵臓常胸腺から調製した。

希望する細胞集団を得るために、いろいろな分離法が使える。

一般に、細胞集団は骨髄や血液のような血液細胞供給源から誘導され、その低密 度フラクションに相当する。低密度フラクションは、その供給源に応じて、血液 細胞供給源の全細胞の約１０％以下、好ましくは５％以下である。この低密度フ ラクションの組成物は混合リンパ球反応を抑制できるが、好ましくは対応する標 的細胞集団を死滅させないものである。これらの特徴を示すためには、この低密 度フラクションは、抑制活性がＣＤ４やＣＤ８マーカーを有するヘルパーおよび 細胞障害性Ｔ細胞の免疫活性によって相殺されない、ある比率のサプレッサー細 胞（ヌルＮＳ細胞またはＤＮＳ細胞のいずれか一方もしくは両方）をもつ必要が ある。

さらに、この低密度フラクションはＣＤ３４＋細胞のような前駆細胞を含むこと ができ、またこのような前駆細胞を補充することもできる。低密度フラクション の正確な調製方法は血液細胞の供給源や希望する用途により変化するだろう。し かし、一般には、細胞密度に基づいた勾配分離が採用される。日常的な最適化の 実験によって、希望するフラクションについてｇ／ｍｌで正確な密度勾配フラク ション限界を定めることが可能である。その後、分離したフラクションの正確な 特性は、ＭＬＲを抑制することと、所望により、対応する標的細胞への細胞障害 性を示さないことの該フラクションの能力を調べることにより確定しつる。

例えば、マウス骨髄からの抑制細胞組成物の単離は、マウス骨髄からの細胞の懸 濁液をパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配で処理し、勾配フラクションを得るこ とにより実施される。全出発細胞の約５％にあたる低密度フラクションの回収が 有効な抑制組成物に相当する。同様に、ヒト骨髄を、組合せフィコール／ハイバ ーク（Ｆｉｃｏｌｌ／１（ｙｐａｑｕｅ）勾配による分画化（多形核細胞の除去 ）、赤血球を除去するためのデンプン処理、単球を除去するためのプラスチック 付着処理なとにかけ、さらに、ネズミ細胞における手順と同様にして、細胞懸濁 液をパーコール勾配にかけて出発物質のおよそ５％を含む低密度フラクションを 回収することができる。ヒト骨髄からのこれら新鮮な細胞組成物の調製は、該組 成物からあるタイプの細胞を除くようにデザインされた２、３の追加工程を必要 とする。

新鮮な細胞は、細胞懸濁液を予備分画化とその後のフローサイトメトリー法にか けて、特にＤＮＳあるいはヌルである細胞をその表面マーカーによって回収する ことにより、さらに細かく選別される。この方法では、細胞が希望する表面特性 に関して選択的に染色されるので選別可能である。

−例として、骨髄を用いる場合は、フィコール／ハイバークまたはパーコールの ような標準勾配を使ってヌルリンパ球集団を単離し、モしてＩＬ−２のような適 当なリンホカインあるいはＰＨＡで刺激したヒト末梢血リンパ球からの上清を添 加した標準組織培養培地で培養する。ヌルおよびＤＮＳ表現型はポリクローナル 集団として増殖し、その後ネズミ細胞についてここに記載したものと同様なヒト 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いてコロニーの抑制活性を調べる。単離された 表現型はネズミ系についてここに記載したものに似ている。ＭＬＲを抑制するほ かに、細胞はヌルまたはＤＮＳの表面表現型をもっているが、ナチュラルキラー 機能はもたず、すなわちそれはヒト腫瘍に５６２細胞を溶解することができない 。

希望する集団が得られたという確証は、調製した組成物の１ｎｖｉｔｒＯでのＭ ＬＲ抑制能により示される。調製物において適当な富化／枯渇が起こり、希望す る表現型が確認されたという条件で、ＭＬＲのｉｎ　ｖｉｔｒｏ抑制は、その組 成物がｉｎ　ｖｉｖｏで所望の抑制効果を示すに足る純度であることを示すだろ う。

さらに、該集団は対応する標的細胞（例えば、マウスではＹＡＣ−１、ヒトでは に５６２）を死滅させる能力が低下しているか、またはその能力がないものであ る。

分画化により富化／枯渇集団を調製することに加えて、ＩＬ−２、ＰＨＡまたは ＣｏｎＡのようなサイトカインを単独あるいは組合せで用いて希望の細胞を増や すことができる。

ネズミ系を用いる一般的方法の代表例では、新生児ＢＡＬＢ／Ｃマウス（１〜１ ４日齢）またはＴＬＩを受けていたマウスから無菌的に膵臓を摘出した。照射法 では、４〜６月齢の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウスをベンドパルビタールで毎日麻酔し、 そして５ｌａｖｉｎｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　（１９７７）　１４ ６：３４に記載される主要リンパ系器官（リンパ節、膵臓および胸腺）を照射す るように設計された装置に入れた。頭蓋骨、肺、尾および後足は遮蔽した。マウ スには９２ラド／分の線量で０．３５ｍｍ銅フィルターと５２ｃｍの線源／軸距 離を用いて２００ラド／日を一週間に５回、合計３，４００ラドを照射した。Ｔ ＬＩの間と照射終了後１週間は、飲み水にテトラサイクリンを加えた。ＴＬＩ終 了後１〜３日以内にＴＬＩ処置マウスを犠牲にした。

単細胞懸濁液は、被膜に切れ込みを入れて膵臓実質を破壊することにより調製し た。２５　Ｍｍ　ＨＥＰＥＳ、　２　Ｍｍグルタミンおよび５×ｔｏ−”Ｍ２− メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０にｌＯ％ウシ胎児血清（Ｆ　Ｃ Ｓ）とコンカナバリンＡで刺激したラット牌細胞からの１０％上清（ＣＡＳ）を 加えた培地で懸濁細胞を培養した。ＣＡＳは０ｓｅｒｏｆｆ、　Ａ、　ｅｔ　ａ ｔ、、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８４）１３２：１．０１−１１０に記載さ れるように調製した。２４ウエルプレートに１．５Ｘ１０’細胞／ウエルのアリ コートを入れ、小型フラスコの中に５　Ｘ　１．　Ｏ’細胞のアリコートを入れ た。一部の培養物では、５Ｘ１０”個のＴＬＩ処置細胞を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで １５００ラドを照射した１　ｘ　＋　ｏ’個の牌細胞（支持細胞）と共にインキ ュベートし、そして最初の２〜３週間は１０〜１４日おきに新鮮な支持細胞を加 えた。培養物には最初の２か月間にわたり２〜３日おきに１０％ＣＡＳ含有培地 を供給したが、この時点では培養細胞がプラスチック面に付着してわずかに増殖 していた。その後培養物に毎日供給し、少なくとも４８か月間ｉｎ　ｖｉｔｒｏ で維持した。培養して８か月後、ｌＯ％ＣＡＳを補充した完全培地に１．５〜５ 細胞／ｍｌをまいて限界希釈法により細胞をクローン化した。

クローン化細胞は中くらいの大きさで、顆粒状の液胞化細胞質を有していた。こ れらの細胞系（１つは新生児から得られて４ＢＡ４と命名され、ＴＬＩマウスか ら得られた他の２つはＴＬＩ−Ｃ７およびＴＬＩ−２，４Ｃと命名された）をそ の後の研究に使用した。

類似した方法で、他の種からのサプレッサー細胞の集団を刺激し、増殖させるこ とができる。例えば、膵臓、胸腺または骨髄から調製されるヒトサプレッサー細 胞集団が同様の工程を用いて得られる。

両タイプのネズミＮＳ細胞はＹＡＣ−１腫瘍細胞を溶解できず、ヒトＮＳ細胞も に５６２細胞を溶解しない。しかしながら、もちろん、それらはＭＬＲにおいて ［３Ｈ］ＴｄＲの取り込みを抑制するも今回、晴乳動物の血液細胞供給源から得 られた細胞集団を、ヒトではマーカーＣＤ３４の存在により示される前駆細胞で 富化させることができるとわかった。このような前駆細胞の富化は、幹細胞の活 性を回復させるために自己由来の幹細胞を移植する必要がある場合や、同種異系 移植の場合に有用である。例えば、致死量の化学療法および／または放射線で治 療した、乳癌、卵巣癌、骨髄腫型の癌などの腫瘍患者は、造血前駆細胞系の回復 なしでは治療に耐えて生存し続けることができない。一般に、これは患者自身の 骨髄から得られた細胞を投与することにより行われる。骨髄は白血球を分離する 処理を行って、凍結する。また、Ｇ−Ｃ８Ｆで処置した患者の末梢血から十分な 前駆血液細胞を得ることも可能になっている。しかし、血液の使用は患者にとっ て便利であるが、白血球泳動で調製しかつ貯蔵を必要とするうえに、前駆細胞を 含むと思われる白血球の数が多くて、面倒である。貯蔵はＤＭＳＯの存在下で行 われるが、ＤＭＳＯを完全に取り除くことはできない。さらに、患者の腫瘍細胞 が混入する問題もある。大多数の貯蔵細胞はパージングが実施不能である。

これらの問題は、以前には、抗ＣＤ３４抗体を含むカラムに血液から得られた白 血球調製物を通し、付着ＣＤ３４＋細胞のみを凍結することで回避していた。し がし、カラムは再使用できず、費用がかかった。

本発明方法では、ＣＤ３４“細胞の豊富な集団を含有する血液または骨髄の濃厚 部分が、高価なアフィニティーカラムを必要とせずに、密度勾配分離により得ら れる。ヒト造血前駆細胞の勾配分離のために以前に使用した条件（分離にかけた 全細胞の小割合（く５％）に前駆細胞を限定し、かつイオン強度を生理学的塩の イオン強度に調整するような予防策が講じられなかった）下では、満足のゆく富 化および収量が得られないことがわかった。本発明の方法によれば、生理学的塩 に相当するイオン強度に保持された勾配を使用し、また、もとの細胞集団に含ま れる前駆細胞の少なくとも５０％が狭い密度範囲（該勾配から得られた細胞のく ５％を占める）に回収されるように勾配を作製する。

１つの例示的アプローチとして、常法どおりに９部のパーコールに対して１部の ＩＯＸ生理食塩水を用いて原液（これを勾配作製のために生理学的塩でさらに希 釈する）を調製しても、原液をＲＰＭＩでさらに希釈して得られた勾配は（生理 学的ｐＨへのｐＨ調整を行ってさえも）目的の前駆細胞が富化されたフラクショ ンを提供できなかった。本発明の方法によれば、１２部のパーコールに対して１ 部のｌＯＸ生理食塩水の希釈（ｐＨ調整を行う）が１つの実施可能な態様であり 、これにより生理学的塩度での原液の調製を確実にすることができる。その後、 ２．５％の不連続段階で、例えばＲＰＭＩやリンゲル液のような生理学的塩に相 当する溶液の５０〜６０％希釈物を用いて原液を希釈すると、満足のゆく勾配が 得られる。

かくして、本発明方法は生理学的塩のイオン強度および重量オスモル濃度で実施 される勾配分離を提供する。１２：１のパーコール対ｌＯＸ生理食塩水の比が、 生理学的重量オスモル濃度である原液をもたらす。これは、生理学的重量オスモ ル濃度を越える従来の条件と比べて、細胞の大きさによる分布を変更する。

代表的な調製において、勾配を作製するためにメーカーの指示に従ったが、ただ しＩＯＸ濃度の生理食塩水を使用して、必要とされるパーコール１２：ｌＯＸ生 理食塩水１の希釈を行って原液を得、そのｐＨを生理学的ｐＨへ調整する。この パーコール原液の重量オスモル濃度は２８０〜２９０ｍ０ｍ５であり、ヒトのそ れに相当する。原液を得るために普通に用いられる９部のパーコール原液部のＩ ＯＸ生理食塩水の典型的希釈によれば、３１０〜３２０ｍ０ｍ５の重量オスモル 濃度が得られる。

パーコール原液の適切な希釈に関しては、２．５％の不連続段階で生理学的塩に 相当する溶液の５０〜６０％希釈物を用いて通常の勾配を作製し、この勾配に従 って分離すると、必要とされる富化フラクションの満足のゆくストックが得られ る。

一般に、富化集団は勾配にかけた細胞の５％以下、好ましくは３％以下に相当す る勾配の最低密度部分を構成する。

しかしながら、患者ごとにかなりの変動があり、該フラクションについて公知の 技法を用いて表面マーカーを調べるべきである。

自己由来の移植の場合は、ＣＤ３４マーカーのレベルを評価して、十分なパーセ ントの細胞集団が実際に前駆細胞であることを確かめるだけでよい。しかし、同 種異系の移植の場合は、ＣＤ４”、ＣＤ８＋集団が移植片対宿主病を起こさない ように十分に除去されていることを確かめることも役立つだろう。いくつかの場 合には、以下に示す４５〜４７．５％パーコール勾配に存在するフラクションが しばしば実質的な量のＣＤ３４＋を含んでいるとしても、Ｔ細胞集団がこのフラ クションに引きずられているかもしれず、そうなると同種異系の移植で使用する には望ましくないだろう。自己由来の移植において、Ｔ細胞成分を完全に枯渇さ せることは明らかに望ましいことではない。なぜなら、移植片対白血病反応や生 着が抑制されるからである。同種異系の移植でも、これらの細胞の必要性は存在 するが、これらのフラクションに含まれる本発明のサプレッサー細胞集団の存在 が移植片対宿主病を仲介するＴ細胞の能力を補うことができる。

密度勾配は一般に赤血球および／または多形核細胞を除去した細胞に対して実施 される。従って、血液や骨髄由来の細胞は初めに、赤血球を除くためのへ夕（ｈ ｅｔａ）−デンプン溶液中での沈降と、多形核細胞を除くためのフィコール勾配 にかけ、その後でそれらをパーコール勾配にかける。別の除去方法は赤血球を除 くための遠心分離を含む。その後、細胞をパーコール勾配にかけ、そして４０〜 ４５％パーコールのフラクション中に造血前駆細胞を１０〜２０倍に濃縮する。

これらのフラクション中の細胞の総数は血液細胞供給源のもとの細胞のたった５ ％にすぎないが、もとの造血前駆細胞（ＣＤ３４”）の少な（とも５０％を回収 することができる。

回収したフラクションは、ＣＤ３４マーカーの有無を調べることにより、満足の ゆく前駆細胞集団についての評価が行われる。

一般には、回収したフラクションに含まれる細胞の少なくとも１０％、好ましく は１５％、より好ましくは２０％がＣＤ３４＋マーカーをもっているだろう。

その後、回収したフラクションは貯蔵されて、この治療を必要とする患者の幹細 胞補給のために用いられる。

（来貢以下余白） 可溶性因子の調製 本発明のサプレッサー細胞系は一般的に上述のようにして誘導し、培養すること ができる。これらの細胞系は更に不死化細胞系との融合、ウィルス感染、または 当技術分野における公知の他の方法によって不死化することができる。

可溶性因子は、拡張、不死化、またはクローン化した細胞から、適切な誘導条件 によって産生される。これらの条件には、上述の特別な条件、及び培地へのホス ファチジルイノシトール経路を刺激するその他の物質の添加が含まれる。ＮＳ細 胞より分泌された因子を含有する上清は、そのまま使用してもよいし、または以 下に述べるような精製手法を施し、ＭＬＲの抑制により測定されるような活性フ ラクションを追跡することによって抑制活性を有する因子を単離することもでき る。

このようにして、ヌルまたはＤＮＳ表現型のサプレッサー細胞は、適切な誘導剤 を加えることにより、可溶性サプレッサー因子を産生ずるよう誘導することがで きる。このような誘導剤の効果的な一クラスに、ホルボールエステルのようなホ スファチジルイノシトール経路を活性化するものが含まれる。例えば、５５−２ ０ｎ／ｍｌのＰＭＡ及びｏ、０ｓ−１，０μｇ／ｍｌのカルシウムイオノホアを 培地に加えることによってＮＳ因子の分泌は刺激される。

同様の条件が、ヒトを含むいかなる哺乳類の細胞培養物からのサプレッサー因子 の産生を刺激する時にも使用される。

例に挙げたマウス細胞からのサプレッサー因子を部分的に特徴づけた。ヒトを含 む他の哺乳類種細胞からの類似の因子は、同様の特性を有する。まず第一に、単 離された細胞系の上清にＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７ 及びＩＬ−１０によって示される活性がないことを確認した。上清は、ＩＬ−３ 、ＧＭ−Ｃ８Ｆ腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、ＴＧＦ−β、及びγ−インターフェ ロン活性を有する。しがし、サプレッサー因子はこれらと同一ではないことが示 された。１Ｌ−３については、組換えＩＬ−３は標準ＭＬＲにおいて抑制活性を 示さない。組換えγ−インターフェロンは、ＩＬ−２分泌をＭＬＲの尺度として 使用した場合、抑制活性を示さない。上清からイムノアフィニティー・クロマト グラフィーによりすべてのγ−インターフェロンを除去した後も、上清の抑制活 性は保持される。

セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１５０を用いた細胞培地からのタンパ ク質の最初のクロマトグラフィー分離では、１３５ｋｄと２４０ｋｄの２つのピ ークにおいて９０％のサプレッサー活性が示された。これらのピークは、培地中 の主要なタンパク質の溶出と共にピークから除去される。典型的なやり方として は、６５０μｌの上清をセファデックス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ）　 Ｇ−１５０カラムに注ぎ入れ、ｐＨ７，２のピリジン：酢酸緩衝液またはＰＢＳ 緩衝液に溶離する。溶離液は、サイズマーカーを用いて５００μＩずっ回収する 。

セファデックス・カラムによるタンパク質分析結果が誘導細胞についても非誘導 細胞についてもまったく同じと思われるので、純粋なサプレッサー因子の比活性 は高い。しがし、誘導培養物由来の１３５ｋｄと２４０ｋｄのピークのみが抑制 活性を示す。これらのピークは、本発明のサプレッサー因子（Ｓ　Ｆ）のマルテ ィマー（ｍｕ　１　ｔ　ｉｍｅ　ｒ）を表すと考えられる。

ＴＣＩ−Ｃ７系由来のサプレッサー因子（Ｓ　Ｆ）の部分精製を後に掲げる実施 例３に記述する。簡単に述べると、上清をまず濃縮し、次にＤＥＡＥ−セファ０ −ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムによるクロマトグラフィーにかけ、塩化ナト リウムの勾配により溶離する。ＭＬＲ抑制活性を有するフラクションをプールし 、濃縮し、透析し、更にレンチル・レクチン・カラムで精製する。

レンチル・レクチン・セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂカラムが便利に 使用でき、透析したフラクションはｐＨ８，０の緩衝液に入れる。該レクチンと 結合することが知られている炭水化物、好ましくはα−メチル−Ｄ−マンノシド の線形勾配でカラム内容物を溶離する。ＭＬＲを抑制するとアッセイされたフラ クションをプールし、非還元条件のもとて５ＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動にか ける。銀染色により約２０ｋｄのバンドが検出され、これに対応する位置を溶離 すると、回収したタンパク質はＭＬＲを抑制することができる。または、レンチ ル・レクチン・カラム由来の、活性を示すフラクションを直接配列決定すること もできる。溶離タンパク質のＮ末端配列は、Ｘ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｓ　ｎ−Ｖａｌ −Ｇｔｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｖａ　１−　（Ａｌａ／Ｐｈｅ ）−Ｌｅｕ−（Ｌｙｓ／Ｌｅｕ）−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｖａｌである。位置１のア ミノ酸は明確に決定することができなかった。

免疫感作プロトコールにより適切な哺乳類宿主、典型的にはウサギの中で、ペプ チドＬｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ　１　ａ−Ｌｅｕ−（Ｌｙｓ ／Ｌｅｕ）−Ｔｙ　ｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌに対して抗体を産生させる。得られた 抗血清は、固相免疫吸着後のＭＬＲにおいて、ＰＭＡ／イオノホアで刺激したＴ Ｌ　Ｉ　−Ｃ７細胞上清由来の上清の抑制効果を除去することができる。更に、 これらの抗体は、ＳＤＳゲル上の２０ｋｄのバンドと免疫反応を起こす。

次に抗体調製物を固体担体に結合して、刺激した上清由来のＳＦのアフィニティ ー精製に使用することができる。

サプレッサー因子タンパク質の組換えによる産生本発明のサプレッサー因子タン パク質は、ＰＭＡ／イオノホアによる適切な刺激の後、細胞または細胞系より単 離することも可能であるし、また組換え手段を使って様々な宿主に産生させるこ とも可能である。上述のＮ末端アミノ酸配列は、ＤＮＡライブラリーからＳＦタ ンパク質をコードしているＤＮＡを回収するための、適切なプローブを設計する のに使われる。適切なりＮＡライブラリーはゲノムＤＮＡから作製することがで きるが、よりこのましくは、ＰＭＡ／イオノホアによる刺激の後に該ＳＦタンパ ク質の分泌が可能となった細胞または細胞系より単離したｍＲＮＡの逆転写によ りｃＤＮＡライブラリーとして作製することができる。次に、標準的ハイブリダ イゼーション条件を用いて、選り抜きのライブラリーを、上述のアミノ酸配列に 基づいて設計した変性プローブ混合物で釣り上げる。あるいは、例えば大腸菌（ Ｅ。

ｃｏｌｉ）中のλｇｔｌｌ及び、被験者にＳＦまたはそのペプチド断片を用いて 免疫感作しその抗血清を回収して調製した抗体との免疫活性により検出される、 ＳＦをコードするＤＮＡを有する形質転換体により産生されたタンパク質を用い て、発現ライブラリーを作製することもできる。

次に、ＳＦを１−ドするＤＮＡの配列決定を行なってＳＦアミノ酸配列との一致 を確認し、適切な宿主へと形質転換するための発現系にこのＤＮＡを連結する。

回収したＤＮＡは、他の哺乳動物種ライブラリー由来の対応するＳＦタンパク質 、例えばヒトＳＦなどをコー　ドするＤＮＡを回収するためのプローブとしても 使用する。

原核生物宿主にも真核細胞宿主にも適用できる広範な種類の発現系が入ｆ可能で あり、そのいくつかは実際に市販もされている。

このように、大腸菌または他の原核生物、酵母、バキュロウィルス発現系に基づ く昆虫細胞、哺乳動物細胞、及び植物細胞中での産生のための適切な発現系が入 手可能である。適切な宿主の選択は、選択された細胞の翻訳後プロセシング能力 によって決まる所望のＳＦタンパク質の形によるであろう。

形質転換した宿主細胞は、ＳＦをコードするＤＮＡの発現に好都合な条件下で培 養し、ＳＦタンパク質を培養物から回収する。

発現系は、ＳＦの分泌がうまく進むように設計することが可能である。この状況 下では、ＳＦは上清から直接精製する。あるいは、ＳＦを細胞内で産生させても よく、この状況下ではタンパク質精製に先立って細胞溶解が必要である。次にタ ンパク質をゲル濾過、クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、５ＤＳ− ＰＡＧＥ等の標準的方法を用いて精製する。

組換えによって産生されるＳＦは、汚染性病原菌（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ 　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ａｇｅｎｔｓ）の危険が全く無い状態で提供しうると いう点、及びＳＦの精製が簡素化されるように細胞蛋白質に比例して産生レベル を制御し、上げることができるという点で有利である。

抗ＳＦ抗体の調製 本発明のＳＦタンパク質は、標準的免疫法プロトコールに使用して、これと特異 的に免疫反応を起こす抗体を含有する抗血清、及びＳＦと免疫反応するモノクロ ーナル抗体の供給源を提供するために不死化することが可能な抹消血液細胞及び 膵臓細胞を産生させることができる。ＳＦまたは選ばれたそのペプチド断片は、 標準的免疫法プロトコールとアジュバント管理の下で、ウサギ、ラット、マウス 等の適切な宿主に投与される。抗血清または抗体産生細胞は、標準的技法を用い て回収する。このようにして得た抗体は、生物学的流体中のＳＦの有無またはそ のレベルを決定するアッセイシステムに有用である。

投与と使用方法 本発明のヌルまたはＤＮＳ型のＮＳ細胞、誘導した上清、及びＳＦタンパク質そ れ自体は、宿主被験者に免疫抑制及び免疫寛容を与えるのに役立つ。この処置が 可能な被験者には、ヒトを含むを椎動物種がすべて包含されるが、特にＮＳ細胞 とＳＦタンパク質組成物は哺乳動物に使用するのに適している。与えられた免疫 抑制または免疫寛容は、宿主が同時または将来において同種異系ドナーから組織 または細胞の移植を受けるのを可能にするのに特に役立つ。また、この抑制は抗 原特異的ではないので、アレルゲンや自己抗原に対し無用な免疫応答をしている 被験者はＮＳ細胞またはＳＦタンパク質の投与により恩恵を被るであろう。この ように、これらの薬剤は例えば関節リューマチや重症筋無力症のような自己免疫 疾患の治療にも役立つのである。

要求される投与レベルは、宿主の特質と免疫的挑戦の性質とに大きく左右される 。しかし、全般的な推定としては、本発明の方法では、自己のドナー物質を受け 取っている宿主に対し、その体重１ｋｇあたり約１０”−１０”個のＮＳ細胞を 、これと匹敵する数の同種異系移植に使用する細胞と一緒に投与する。投与すべ きＳＦタンパク質の量は上記と類似している。即ち、上記の細胞数とほぼ同数の 誘導細胞の上清中に産生されたタンパク質の量である。はぼ同数の外来免疫担当 細胞を一緒に投与することは、これら移植片の同時期受容を可能にする。

更に、と記の処置に続いて、ＮＳ細胞またはタンパク質因子を上記のように共注 入しておいた同一のドナーからの組織をさらに被験者に植え込みまたは注入する ことも可能である。最初の同時投与では、ドナーの免疫担当組織、またはドナー の骨髄が骨髄造血幹細胞が使用可能である。

同種異系移植に際し、骨髄移植の場合はサプレッサー細胞は好ましくはドナー由 来のものが良く、また臓器移植の場合にはレシピエンドのものが良い。自己免疫 疾患の治療における使用方法としては、患者はサプレッサー細胞の供給源として 使われる。

ＣＤ３４＋幹細胞を富化する本発明の細胞集団は、同種異系移植プロトコールに も自家移植プロトコールにも有効である。自家移植ではサプレッサー機能は要求 されないが、植え付ける（ｅｎｇｒａｆｔ）能力は極めて重要である。このよう に、選別していない集団に較べてＣＤ３４＋細胞の大きな集団を有する、本発明 の方法により得られる細胞集団は、同種異系及び自家の両プロトコールにおいて 移植の成功を促進するのに役立つ。幹細胞の供給源は一般的には骨髄である。し かし、もし被験者が血液中のこれらの細胞を富化するためにＧ−ＣＦＳのような 刺激因子による処置を受けてきたならば、供給源として血液を使用できる。例え ばＧ−ＣＦＳによる処置は、しばしば血液中の造血前駆細胞の１０倍富化をもた らす。ここに記述する適切な生理学的条件の下で密度勾配選別により得られた富 化前駆細胞集団は、血液または骨髄の部分フラクション（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏ ｎ）として、次に使用する時まで保存しておくことができる。

移植に関連して使用される細胞集団については、これらの細胞を移植片の一部と して投与する技法が移植技術の実践者には十分理解されている。簡単な医学的手 順を用いる様々な技法が使用できる。

免疫抑制それ自体の処置については、投与は典型的には静脈内（可溶性因子の場 合は特に）へか、腹腔内（ＮＳ細胞にはこちらが好ましい）への注射によって行 われる。しかし、例えば経口投与や貫粘膜投与、及び当技術分野の習熟者が理解 しているその他の製剤を用いるなどして、上記以外の投与方法を使用してもよい 。

ＳＦの医薬組成物は、投与方法に適した標準的製剤技法を用いて調製することが できる。適切な製剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ＳＰｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、マツグ・パブリッシング争カンパニー、 イーストン、ペンシルバニア州（Ｍａｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎ ｙ、　Ｈａｓ　ｔｏｎ、　ＰＡ）に見出すことができる。一般に、ＳＦ有効成分 は製剤の０．５−９０％で、緩衝剤、安定剤、担体などの適切な賦形剤が加えら れる。特別な投与経路については、浸透剤や洗浄剤など更に別の機能を有する賦 形剤を加える必要があるがもじれない。

本発明のＳＦタンパク質を投与するのに適切な被験者は、を推動物、特に哺乳動 物であり、免疫抑制を必要とする人間を含む。

一般的に、そのような人間には、関節リューマチ、重症筋無力症、若年糖尿病、 紅斑性狼癒、多発硬化症などの自己免疫状態に苦しむ人々が含まれる。適切なレ シピエンドのもう一つの主要グループには、アレルゲンに対し高度免疫応答をす る人々が含まれる。

更に別のグループには、腎臓、肺、心臓、骨髄、皮膚などの組織移植を受けた人 々が含まれる。

本発明の主題は、更に、本発明のサプレッサー因子に対し免疫反応を起こす抗体 を包含する。これらの抗体は、生物学的流体中に存在するサプレッサー因子の量 を査定するのに役立つ。このような査定は、当技術分野において周知の標準的免 疫アッセイ法により行なうことができる。このように、直接的及び競合的免疫ア ッセイの両方を用いることができる。抗体は、標識したり、固体担体に結合した り、またはそれ以外の修飾を行って、これらの方法における抗体の使用をより便 利にすることができる。本発明における使用に適する免疫アッセイプロトコール のバリエーションは、当技術分野においては周知である。

以下に述べる実施例は本発明を説明するためのものであり、これを制限するもの ではない。

実施例１ クローン化ＮＳ細胞及び上清によるＭＬＲの抑制ＮＳ細胞及びぞれらの誘導」− 清の両方が、次のように実施したＭＬＲを抑制することができた。即ち、応答細 胞（５ｘｌＯ５）と刺激細胞（７，５ｘＩＯ５）を様々な等級数のＮＳ細胞と共 に０．３ｍｌ／ウェルで、９６ウエル微量培養プレートでインキュベートした。

培地に２ｍＭグルタミン、５ｘｌＯ−’Ｍ　２−メルカプトエタノール、１００ 単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％貯蔵ヒ ト血清［ブイエスピー、バイオセル・ラボラトリーズ、カーソン、カリフォルニ ア（ＶＳＰ。

Ｂｉｏｃｅｌｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃａｒｓｏｎ、　Ｃａ１ｉｆｏ ｒｎｉａ）］を補充した。インキュベーションの前に、ＮＳ細胞と刺激細胞に３ ３００ｒａｄの放射線を浴びせた。培養物を３７℃、５％二酸化炭素のもとで５ −６日間維持した。終了の１８時間前に、各培養物にｌ／μＣ１の［’　Ｈ］　 ＴｄＲ（６，７Ｃｉ／ｍＭ）を加えた。細胞を半自動集菌器で集め、ベックマン （Ｂｅｃｋｍａｎｎ）液体シンチレーションカウンターで数を数えた。

ＴＬＩ−２，Ｂ７　（ＤＮＳ）、ＴＬＩ−２，Ｈ５（ヌル）、及びＴＬＩ−２， ４Ｃ（ＤＮＳ）と称するＴＬＩマウス牌臓内臓由来個の例示的な培養細胞系が、 ウェルあたり共培養細胞数２ｘ１０４で、ＭＬＲを有意に抑制した。Ｃ５７ＢＬ ／Ｋａ刺激細胞とＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ応答細胞を使用した場合、この濃度で ９０％の範囲内の抑制が達成された。Ａ／Ｊ応答及びＣ５７ＢＬ／Ｋａ刺激細胞 系を用いても同様の結果が得られた。

混合リンパ球反応の抑制は、培養物にＴＬＩ−２，４Ｃ（ＤＮＳ）細胞の上清を 加えても達成された（対照では１１０．０００±７．０００ｃｐｍである）。図 １は、ＭＬＲで得たデータを示し、誘導した上清とそうでない上清を加えた場合 の結果を比較している。

上清は、クローン化ＴＬＩ−２，４Ｃ細胞を１０μｇ／ｍｌＰＭＡ　（４−ホル ボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）及び０．２６μｇ／ｍｌ　Ａ ２３１８７カルシウムイオノホアを用いて３７°Ｃ１５％二酸化炭素で４時間誘 導し、その２４時間後に得た。この誘導上清の希釈物をＭＬＲに加えると、■＝ ５希釈の上清を用いた場合は７５％のＭＬＲ抑制が達成された。この希釈率では 、非誘導上清は４０％の抑制を示したにすぎない。

１：１０希釈では結果はより明確で、誘導上清が５５％の抑制を示すのに対し、 非誘導上清は３０％の反応刺激を示す。

誘導上清の活性はプロナーゼ処理により破壊され、また＞２０ｋｄの透析物と連 合する。

実施例２ クローン化活性ＮＳ細胞の上清がＩＬ−２産生に及はす影響上清は、Ｈｅｒｔｅ ｌ−Ｗｕｌｆｆ、　Ｂ、ら、Ｊ　１ｍｍｕｎｏ！　（１９８４）　！３３＋２７ ９１　（上記参照）が記述するように、成体ＴＬｒマウス（全リンパ球照射を受 けた）の内臓由来ＴＬＩ−Ｃ７（ＤＮＳ）クローンより得た。このクローンが表 面表現型ＣＤ３＋、ＣＤ４″、ＣＤ８−１ＴＣＲａβ°を有することを、５ｔｒ ｏｂｅｒ、　Ｓ、ら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８９）　＋４３・１１１８　 が記述する方法により確認した。Ｐ　ｈ、ｔ　Ａ及びＡ２３Ｉ８７を用いたこれ らの細胞の刺激は、５ｔｒｏｂｅｒ、　Ｓ、ら１．１　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９ ８７）　１３８　：６９９の記述に従って行なった。簡単に述へると、ＴＬＩ− Ｃ７細胞をＴ−７５フラスコでコンフルエンスになるまで培養した。このＴＬＩ −Ｃ７細胞に、１０％熱不活性化ＦＣ８を補充したＲＰＭＩ−１６４０に溶解し たＰＭＡ　（１０ｎ　ｇ／ｍり及びＡ２３１８７　（０，２６μｇ／ｍｌ）を最 終量２０ｍ１／フラスコとなるように加えた。４時間インキュベートした後、細 胞をＰＢＳで５回洗浄し、添加蛋白質を全く含まないＲＰＭＩ−１６４０で覆っ た。上清（この実施例で以下ＩＣ７と称する）を２４時間後に回収し、使用時ま でマイナス４０℃で凍結保存した。プロテアーゼ分解を防ぐため、保存ＩＣ７に ＰＭＳＦを０゜１ｍＭの濃度になるまで加えた。

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を上述のように実施した。ただし、チミジン取込み の代わりに上に述べたようにＩＬ−２産生を測定した。その結果を図２Ａに示す 。対照反応において、応答細胞を単独で使用した時、ＩＬ−２は全く分泌されな かった（白抜き丸参照）。刺激膵臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を加えて標 準的ＭＬＲを実施すると、ＩＬ−２産生は９６時間後に６１Ｕ／ｍｌのピークに 達する（白抜き四角参照）。しかし、最終希釈率１１５のＩＣ７が存在すると、 ＩＬ−２分泌の抑制が明確に示される。ＩＬ−２分泌は７２時間後に最大ＩＵ／ ｍｌに達するに過ぎず、その後は減少する（白抜き三角参照）。

ＰＭＡとＡ２３１８７て刺激したＴＬＩ−Ｃ７細胞は、ＴＧＦ−β、ＧＭ−Ｃ８ Ｆ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−３を分泌するが、ＩＬ−１、ＴＬ−２、ＩＬ−４、 ＩＬ−６、ＩＬ−７またはＩＬ−１０は分泌しないことが以前に報告されている ［Ｖａｎ　Ｖｌａｓｓｅｉａｅｒ、　Ｐ、ら、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（印 刷中）、参考として本明細書に包含する］。その分泌が実証されているサイトカ インを、１．０００−０，５Ｕ／ｍｌ　（ＩＦＮ−７、ＩＬ−３、ＧＮ−Ｃ３Ｆ 、ＴＮＦ−α）または酸化ＴＧＦ−βについてはｔｏ−０，５ｎｇ／ｍＩの濃度 で、標準ＭＬＲアッセイに加えた。これらの濃度は、サイトカインがＩＣＴ中に 検出されるレベルを反映している。ＭＬＲ上清中のＩＬ−２の濃度を、９６時間 培養後に測定したところ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−３及びＧＮ−Ｃ８ＦはＩＬ−２産 生に対する有意な抑制を誘導していなかった。ＴＮＦ−αとＴＧＦ−βはＭＬＲ において実際にＩＬ−２産生を抑制したが、抗ＴＮＦα及び抗ＴＧＦβ抗体を加 えてもこれらの因子の見掛は抑制活性に影響はない。したがって、ＩＬ−２産生 の抑制が事実上これらの因子によるものとは思われない。

ＩＣ７上清の、マイトジェンまたは抗体によって刺激されたＴ細胞からのＩＬ− ２産生を抑制する能力もまた試験した。これらのアッセイでは、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ 　／　ｃ膵臓細胞（５ｘｌＯ’／ウエル）を７２時間、ＭＬＲの場合と同じ条件 下で、アッセイの開始時に膵臓細胞に加えたＣｏｎＡ　（２μｇ／ｍｌ）　、Ｐ ＨＡ　Ｃ４ｕｇ／ｍ　ｌ　）または抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ハイブリドー マ細胞培養上清の１／２００最終希釈物）のいずれかの存在下で培養した。再度 、ＩＣ７の１１５最終希釈物の、上述のように測定したＩＬ−２産生に対する影 響を試験した。

結果を図２Ｂ〜２Ｄに示す。図２Ｂに示すように、ＣｏｎＡを含まない対照は、 ＩＬ−２産生を全く示さない（白抜き丸参照）が、ＣｏｎＡで刺激した膵臓細胞 （白抜き四角参照）は、２４時間後にＩＬ−２産生のピーク１６Ｕ／ｍｌを示し ている。ＩＣ７の添加は、この産生に明らかな影響を及ぼしていない（白抜き三 角参照）。刺激剤としてＰＨＡを用いても同様の結果が得られた（図２０参照） 。図２Ｄに示すように、抗ＣＤ３の刺激により誘導されたＩＬ−２産生の増大が 見られる。抗ＣＤ３で刺激された膵臓細胞は約６時間後に約２Ｕ／ｍｌのＩＬ− ２を産生じ、このレベルをアッセイ開始から約６０時間まで維持している（白抜 き三角参照）。希釈率１１５のＩＣ７の添加は、上記と同じ期間にわたってＩＬ −２分泌を約８Ｕ／ｍｌまで上昇させる。

ＩＣ７の２−１貯蔵物を、ＰＢＳ中の７ｍｇ／ｍｌのケイ酸と共に、４時間４℃ で絶え間なくかき混ぜながらインキュベートした。ケイ酸を完全に回転させ、吸 着しなかった物質を回収して。

１０ｋｄのＮＷカットオフを備えたセントリセル（Ｃｅｎｔｒｉｃｅｌｌ）濾過 装置で濃縮した。

こうして得た上清を、１ｍＭのＰＭＳＦで補充した２０ｍＭ）リス−塩酸、ｐ） （８，Ｏで透析し、同じ緩衝液を用０てＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ）カラムに４℃でかけた。カラムを２ベッド体積の開始緩衝液で洗浄し、吸 着物質を流量０゜３５ｍ１／分で、塩化ナトリウムの直線勾配（０−Ｉ　Ｍ）と ２０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ８で溶離した。１ｍｌのフラクションを回収し、最 終希釈率１１５でＭＬＲにおいて試験するまで４℃で保存した。ＭＬＲ上清は７ ２時間後に回収し、チミジン取込みを利用したＴＨ−２アツセイによりＩＬ−２ 含有量につ（為てスクリーニングした。

浴煕ハクーンを凶３にボす。ｚｓｏｎｍにおけるタンパク質含有量の測定は、２ 個の主要ピークを示している。しかし、ＭＬＲ抑制活性の大部分は、０．２から ０．４Ｍ塩化ナトリウムの間で溶離している。図３に示すフラクション１０６− １１２中の物質をプールし、濃縮し、ＰＢＳで透析した。この活性物質は、ｌ／ ３２まで希釈しても、ＭＬＲにおけるＩＬ−２産生をブロックした。

精製因子（ＳＦ）の特性づけは、ＳＦを１２時間の間ｐＨ２まで酸化するか、５ 分間煮沸するか、または透析物をアガロースビーズに固定したプロテアーゼと一 緒に４時間３７℃でインキュベートすることによりプロテアーゼ処理すると、活 性を失うことを示した。

この精製因子を用いて、ＳＦ活性の性質を更に特性づけた。ある研究では、１１ ５最終希釈物を様々な時点でＭＬＲに加え、上清を７２時間後に回収し、ＩＬ− ２産生をＭＴＴアッセイにより測定した。ＳＦはＭＬＲの最初の６０時間のうち に加えるとＩＬ−２産生を抑制するが、これより遅く、６６時間目に加えるとも はや抑制を示さない。更に、一般に抑制の効果は、ＳＦを該反応に遅く加えるほ ど小さくなる。

ＡＰＣに対するＳＦの影響も、抗原またはクラスＴＩ適合ＡＰＣで刺激したＴ細 胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生を測定することによって確かめた。胸腺由 来のクローン化マクロファージ系であるＩＥ”　ｌＧ１８−ＬＡ細胞系を０日目 に様々な濃度のＩＦＮ−７（１００−０，５Ｌｌ／ｍｌ）と−緒に２４時間イン キュベートした。細胞を洗浄し、オボアルブミン特異的かつＩＥ’−制限Ｔ制限 小細胞ハイブリドーマ系３ＤＯ，３に加えた。この混合物を更に２４時間オボア ルブミンの存在下で培養し、培養期間の最後に上清を回収して、ＩＬ−２含有量 についてスクリーニングした。ＳＦを１１５最終希釈率で、ＡＰＣ単独培養物あ るい結果はＩＦＮ−γ濃度の関数として図４に示す。図に示すように、ＡＰＣを ０日目に様々なＩＦＮ−γ濃度でインキュベートし、１日目にＡＰＣ培養物を洗 浄して抗原と共にＴ細胞を加え、そして２日目にＭＴＴアッセイにより上清のＩ Ｌ−２を調べた。ＳＦは０日目に加えた時にのみ、ＩＬ−２の産生を抑制できた （白抜き四角参照）。ＩＦＮ−γ濃度が最も低い場合を例外として、培養物がハ イブリドーマを含有してからＳＦを加えると、ＩＬ−２の産生は抑制できなかっ た（白抜き三角）。対照は白抜き丸で示しである。

ＩＥ’制限制限マツタウクジラオグロビン−特異的Ａ、２．　１ＤＨＩＡ　Ｔ細 胞ハイブリドーマと、ＩＥ”Ａ２０Ｂリンノく腫細胞を、ウマ・ミオグロビンま たはマツコラクジラ・ミオグロビン１１０−１２１ペプチドの存在下で用いるも う一つの実験系では、同様の、しかし同一ではない結果が得られた。この場合、 ＡＰＣをＳＦと一緒にプレ・インキュベートしたかどうかによって抑制が示され た。

ＴＬＩ−Ｃ７によって代表されるクローン化ＴＣＲαβ１、ＣＤ３＋、ＣＤ４− １ＣＤ８−ＮＳ細胞は、Ｐ　ＨＡ　ｌ：応答しテノ胸腺細胞増殖を抑制するより 、むしろ実際にはこの増殖を刺激する。

ブローン化ＮＳ細胞のこの能力を証明する実験が、Ｖａｎ　Ｖｌａｓｓｅｌａｅ ｒ、　Ｐ、ら、Ｃｅ１ｌ　１ｍｍｕｎｏｌ　（１９９１）　１３６：１−１５に 詳細に記述されており、その開示を参考として本明細書に包含させる。しがし、 これらのクローン化細胞は、前に述べたようにＭＬＲを抑制する。

新鮮なマウス骨髄細胞をパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度勾配分離にかけた。

低密度細胞をフローサイトメトリーにより分離し、ＤＮＳ細胞集団を得た。後者 の細胞は、１０’個を加えるとＭＬＲを約７０％抑制することが分かった。した がって、新鮮なりＮＳ細胞もクローン化ＤＮＳ細胞も共にＭＬＲを抑制する。

ヒト被験者のためのスタンフォード委員会（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｃｏｍｍ１ｔｔ ｅｅ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　５ｕｂｊｅｃｔｓ）によって確立された指針に従っ てインフォームド・コンセントを与えた後で、正常の成人ドナーから同種異系骨 髄移植のための骨髄を得た。ヒト骨髄細胞は、吸引するかまたは腸骨稜からはな して骨髄の中心部より取り出すかした。単細胞懸濁液を、フィコール−ハイバー ク（Ｆ　ｉ　ｃｏ　Ｉ　Ｉ−ＨＶｐａｑｕｅ）勾配［リンフォブレップ、ニコメ ド　ニーニス、オス口、ノルウｘ　−（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ；Ｎｙｃｏｍｅｄ 　ＡＳ、　０ｓｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙ）］を用いて分離した。これらの勾配は以 後「フィコール勾配Ｊと称する。

この勾配から、単核フラクションを回収した。回収細胞をプラスチック製ペトリ 皿にいれ４５分間３７℃で２回インキュベートすることによって単球を枯渇させ た。インキュベーション用の培地は、ＲＰＭＩ−１６４０［アプライド　サイエ ンティフィック、サンフランシスコ、カリフォルニア州（Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）］　、１０％ウシ胎児血清［ハイクロー ン、ローガン、ユタ州（ＨｙＣｌｏｎｅ、　Ｌｏｇａｎ、　ＵＴ）］、２２ｍＭ 　Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマ イシン、及び５０μＭ　２−メルカプトエタノール（ＭＥ）がらなっていた。（ 幾つかの実験では、リンパ球を富化するため、フィコール勾配から得た骨髄細胞 から更に骨髄様細胞と赤血球系細胞を枯渇させた。）フィコール精製した浮揚性 単核細胞を洗浄し、ヒトＣＤ３３に対するフィコエリトリン結合マウス・モノク ローナル抗体（Ｌｅｕ−Ｍ９；クローンＰ６７．６）［ベクトンーディッキンソ ン、マウンテン　ビュー、カリフォルニア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｊｎｓｏｎ 、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｆｅｗ、　ＣＡ）コ及びヒト・グリコホリンＡに対す るマウス・モノクローナル抗体［ジエー・グリフイン、ダナファーバー　キャン サー　センター、ボストン、マサチューセッツ州（Ｊ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、　Ｄａ ｎａ　Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ） の寄贈品〕と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。これらの段階は、初期 の測定に含まれていただけなので、後の実験では分離細胞に対するアッセイ手順 を簡素化するために省略した。過剰の抗体を除去するため、インキュベーション 混合物をコウジ血清の１ｍｌクッションの上に載せ、２５０ｘｇで１０分間遠心 にかけた。ペレットを、磁気粒子と結合したヒツジ抗マウス抗体［ダイナル　イ ンク、グレートネック、ニューヨーク（Ｄｙｎａｌ　Ｉｎｃ６．Ｇｒｅａｔ　Ｎ ｅｃｋ、　ＮＹ］を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、 前と同じようにインキュベートした。細胞を磁気粒子濃縮器［ダイナル　インク （Ｄｙｎａｌ　Ｉｎｃ、）］に５５分かけた。

非結合細胞を除去し、２回洗浄した。幾つかのケースでは、ＣＤ１１ｂに対する マウス・モノクローナル抗体（Ｍｏ−１）［ジ工−・グリフイン（Ｊ、　Ｇｒｉ ｆｆｉｎ）の寄贈品］及びグリコホリンＡに対するそれを使用して、Ｇｒｅｅｎ ｂｅｒｇ、　Ｐ、Ｌ、ら、Ｂｌｏｏｄ　（１９８５）　６５：１９０−１９７が 記述するように、「パンニングＪ　（ｐａｎｎｉｎｇ）することにより骨髄様細 胞及び赤血球系細胞を除去した。

パーコール勾配を、１段２．５％または５％で４０−５０％またＬｉ２Ｓ−５５ ％範囲のパーコール［ファルマシア　エルケービー　バイオテクノロジー、ウプ サラ、スウェーデン（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）コを用いて作製した。パーコールス トックを、製造者の指示に従って調製した。ただし、ストックを調製する時に、 １部の１０ｘ生理食塩水に対し１２部パーコールを使用した（９部パーコール： １部１０ｘ生理食塩水ではなく）。このように調製したストック溶液は、ヒト血 液の範囲である約２８０−２９０ｍ０ｍ５内の浸透性を有する。ストック溶液を ＲＰＭＩを用いて所望の百分率パーコール勾配まで希釈して、次に分離勾配を作 製した。従って、これらの勾配も生理的浸透性を維持していた。使用の前に、勾 配のｐＨ１浸透性及び正確な密度を屈折率測定によりチェックした［シー・ツァ イス（Ｃ。

Ｚｅｉｓｓ）屈折計］。

フィコールで精製した、プラスティック非付着性の、またはリンパ球を富化した 骨髄細胞は、最少密度のパーコールと混合し、不連続パーコール勾配の一番上に 置き、５５０ｘｇで３０分間２０℃で遠心分離した。各境界面の細胞を回収し、 ＭＬＲまたは造血前駆細胞アッセイで試験する前に洗浄した。

１段が５％で４５−５５％範囲のパーコールを用いた、一つの測定結果を表ＩＡ に示す。

（来貢以下余白） 低密度パーコールフラクションｌ（＜４５％パーコール）及び２（４５−・５０ ％パーコール）は、それぞれ平均で始めの骨髄サンプルの０．９％及び４％を産 生した（表ＩＡ参照）。これは、プラスティック非付着性細胞の３％と１１％に 相当する。高密度パーコールフラクション３（５０−５５％パーコール）及び４ （〉５５％）は、それぞれ平均で始めのサンプルの７％及び８％を産生じた。こ れは、非付着性細胞の２０％と２４％に相当する。全フラクションの総産生高は 非付着性細胞の５８％であった。ＣＤ３陽性細胞（Ｔ細胞）は、フィコールで分 離した骨髄（平均１７％）と比較すると、低密度フラクションでは減少した（フ ラクション１で平均６％）。対照的に、ＣＤ３陽性細胞は高密度フラクションで 増加した（フラクション４で３３％、表Ｉ参照）。同様に、ＣＤ４およびＣＤ８ 陽性細胞は、フィコールで分離した骨髄（両方とも９％）及び高密度パーコール フラクション（フラクション４では両方とも１５％）と比較すると低密度フラク ションでは減少した。対称的に、ＣＤ１６陽性細胞（ＮＫ細胞マーカー）は、高 密度フラクションに較べると（フラクション４で４％）低密度フラクションでは 富化された（フラクション２で２１％）。

追加実験で、プラスティック非付着性骨髄細胞のＣＤ３３”及びグリコホリンＡ ”　（骨髄様細胞）を磁気付着により除去した。

除去後の細胞をパーコール密度勾配分画により更に精製し、同一のドナーから調 製したＰＢＬと比較した。ＴＣＲαβを検出するため細胞を染色し、またＣＤ４ 及びＣＤ８マーカーを検出するためカウンター染色した。

表ＩＢは、上述のように作製した１段が５％で４５−５５％範囲のパーコールを 用いたパーコール分画化の結果を示す。

（来貢以下余白） 櫨　１ ＦＢＩ、の平均６５％がＣＤ８＋細胞十及びＣＤＲ＋αβ十細胞であって、ＣＤ ４−及びＣＤ８−αβ＋は１．　０％に相当した。

（ＣＤ４”　ａＢ１またはｃＤ８”　ａＢ”　）：　ＣＤ４−　ＣＤ８−　ａＢ ゛の平均比率は、約６５・ｌであった。対照的に、（ＣＤ４”αβ“またはＣＤ ８”　αβ′）・ＣＤ４−　ＣＤ８−αβ“細胞の比率は低密度骨髄フラクショ ンでは１５：ｌであり、高密度フラクション３及び４ではそれぞれ２８：１及び ４７：１に上がった。

比率の変化は、主として、低密度フラクションにおいてＣＤ４−ＣＤ８−αβ“ 細胞は除去されずＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞が除去されたためである。

パーコール勾配の１段を２．５％に、範囲を４　（１−５０％に変えた他は上述 のように行なった追加実験において、ＣＤ３４マーカーノ存在と、ＣＤ３”、Ｃ Ｄ４″１及びＣＤ８＋でマークされた細胞のバックグラウンド濃度を調べた。表 ＩＩに示す結果は、患者により多少の変動はあるが、ＣＤ３４”でマークされた 細胞の低百分率パーコールフラクションでの富化を示している。これらの分離は 、上述の手順に修正を加えて調製した細胞を使って実施した。即ち、骨髄細胞は まずヘタ（ｈ　ｅ　ｔ　ａ）澱粉溶液で処理して赤血球細胞を除去し、次にフィ コール−ハイバーク（Ｆｉｃ。

１１−　Ｈｙ　ｐ　ａ　ｑ　ｕ　ｅ　）勾配により多形核細胞を除去した。最初 の２段階を終えた後の全細胞の百分率は、全骨髄細胞の約２０％から約７５％の 範囲にあったが、概してがなり多数の細胞が回収された。

表ｌｌ ＣＤ３４”細胞の百分率 患者番号 フラクション　１　２　３↑　４↑　５↑　６↑　７↑骨髄０．３　４．９　１ ．３　０．５　ＮＤ　Ｎ１１　１．２へ夕Ｗ＆粉０．７　１．９　０．７　０． １　ＮＤ　ＮＤ　０フィコール−１，１２，００，２２，０１，２ＮＤ　３．６ １　４．５　１５．３　５．２　６゜０　９．９２５．６　４．３（４０−４２ ，５ｔ％） Ｉ　Ｉ　１３．６　１９．６２５．８　１２．７　６．３　１５．６　９．１（ ４２，５−４５Ｘ） ＩＩＩ　１０．１　７．３　１５．２　６．４ｔ　１．２　７．１　１５．０（ ４５−４７，５Ｎ） ＩＶ　３．８　１．２　０　４．３　１．０　１．５　２．０（４，７５−５０ Ｘ） Ｖ　Ｏ，２０，１０２，５’０．１　０．１　１．１（＞５０％） ↑ここに示す数値はバックグラウンドによって補正しである。

＊補正していない。

表ＩＩに示すように、パーコール勾配はＣＤ３４＋細胞が富化された集団を分離 するのに成功している。これらの細胞は、自家移植での植え込みを助けるため、 または化学療法を受けている患者が幹細胞を取替えるのに必要となる時まで、保 存しておくことができる。富化集団を含むフラクションについて患者の間で可変 性があるが、一般に富化は最も低い密度フラクションで起こっている。これらの フラクション（１＋ｌＩ＋ｌ！りが、元の細胞集団の２５％を構成する。

上に述べたように、どのフラクションを保持すべきか検証するため、ＣＤ３４マ ーカーについて全フラクションをアッセイしなければならない。更に、同種異系 移植の場合は、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８をモニターすることによってＴ細胞成 分を査定しなければならない。

上述の分離方法を、癌患者の血液を処理するための市販の白血球運搬装置（！ｅ ｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて得た白血球細胞にも適 用した。標準的手順によって得た白血球細胞をフィコール−ハイバーク（Ｆｉｃ ｏｌｉＨｙｐａｑｕｅ）勾配分離にかけ、単核細胞のみを回収し、次に上述のよ うに１段が２．５％で４０−５０％範囲のパーコールを用いるパーコール勾配分 離にかけた。そのうちの約１％がＣＤ３４マーカーを有する約１５０億の細胞を パーコール勾配分離にかけたところ、低密度フラクションは約１２億の細胞を含 み、そのうち約ｌＯ％はＣＤ３４＋であった。したがって、元の集団のＣＤ３４ ＋細胞のうち約６０−７０％が回収された。

（来貢以下余白） 実施例７ ＭＬＲを実施するために、応答及び刺激細胞を平底のミクロ培養平板にてウェル 当たり０．２ｍｌの最終容量でそれぞれｌＸｌ０’個の細胞濃度で培養した（コ スタ−、ケンブリッジ、　ＭＡ）。培養物は５％Ｃ０２にて３７℃で１２０時間 培養した。刺激細胞は＋３７ｃｓ源がらの３０００ｃＧｙで照射した（マーク■ モデル１２５照射体、Ｊ、　Ｌ、シェフアート　アンド　アソシェート、グレン ダール、　ＣＡ）。

ＤＮＡ合成は、培養期間の最後の１８時間の間ウェル当たりｌμＣｉのトリチウ ム標識チミジン（”Ｈ−ＴＣＰ、比活性６．７　Ｃｉ／ｍＭ、ニューイングラン ド　ヌクレアー社、ボストン、　ＭＡ）を添加してアッセイした。放射活性は液 体シンチレーションカウンターで測定した（ベックマン　インストールメント社 　フラトーン、　ＣＡ）。実験は３回反復して行い、その平均値を出した。標準 誤差はほとんどすべてのケースにおいて平均値の１０％以下であった。

実施例６からの種々のパーコールフラクションからの細胞は、照射された同種異 系の刺激細胞に添加され、ＭＬＲにおける応答細胞として試験された。低密度パ ーコールフラクションは乏しい応答細胞であり、’Ｈ−ＴＣＰ取込みはバックグ ラウンドに類似していた。

高密度フラクションは激しい応答を与え、前者のそれよりも約３゜５倍大きかっ た。高密度骨髄細胞の応答はＰＢＬのそれに類似していた（図５参照）。

げっ歯動物の未分画化及び低密度フラクションの骨髄細胞はＭＬＲを抑制するこ とが報告されている（パイゲンベルグ９Ｍ、ら、Ｊ！ｎ＋ｍｕｎｏｌ　（１９８ ３）　１３２　：　９７１−９７８　；　ノーヤ、Ｓ、Ｊ、、ら、　Ｊ　Ｌｅｕ ｋ　Ｂｉｏｌ（１９８８）　４３　：　２７９−２８７）。最近の研究において 、インビトロで照射された（３０００ＣＧｙ）未分画化及び分画化されたヒト骨 髄細胞の抑制作用が試験された。ＭＬＲに添加された種々のパーコールフラクシ ョンの効果の典型的な例が図６に示されている。共培養される細胞を添加しない ＭＬＲにおける”Ｈ−ＴｄＲの取込みを０％の抑制としてセットした。マウスの 結果に比較して、未分画化の照射されたヒト骨髄はＭＬＲに添加された際に、’ Ｈ−ＴｄＲの取込みを約ｌθ％だけ増加した。最低密度の骨髄細胞（ＦＲ，１） はＭＬＲを約５０％抑制した。

ＦＲ，３の高密度細胞はほとんど効果がなく、ＰＲ，４の高密度骨髄細胞は約４ ０％だけ”Ｈ−ＴｄＲの取込みを増加した。

アッセイを実施するために、最終容量２００μｍ中にｌＸｌ０’個の応答細胞及 びｌＸｌ０’個の照射された（　３０００ｃＧｙ）刺激細胞／ウェルを含有する 、９６のウェルの平底マイクロタイタープレートに種々の濃度で試験される照射 された（　３０００ｃＧｙ）細胞を添加した。

対照は、推定されるサプレッサー細胞の代わりに照射された応答細胞を添加した もの、又は細胞を添加しないものを含む。培養は５％ＣＯ□で３７℃にて保温し た。　１２０時間後に、プレートに上述のとおりにして１μＣｉ／ウエルの’） Ｉ−ＴｄＲをパルスした。すべての実験は３回反復した。抑制パーセントは、［ １−（共培養細胞を含むｃｐｍ）　／共培養細胞を含まないｃｐｍ］　ｘｒｏｏ として計算した。

精製ＣＤ１６”　（明るい）細胞は実施例６の低密度骨髄細胞（ＦＲ１及びＦＲ ２）からフローサイトメトリーにより得られ、次いで自己由来の応答細胞ＰＢＬ 及び同種異系の刺激細胞ＰＢＬを用いるＭＬＲに段階的用量で添加した。対照実 験において、低密度フラクションからの精製ＣＤ３”（明るい）細胞並びに未選 別の低密度細胞をＭＬＲに添加した。選別されたＣＤ１６＋及びＣＤ３＋細胞の いずれも試験した用量範囲において”Ｈ−ＴｄＲを抑制しなかった。しかしなが ら、未選別の低密度細胞は応答を抑制することができ、約４０％の抑制が１ｘ１ ０５の共培養細胞で観察された。

正常のマウス骨髄の低密度フラクションからのＣＤ４−　ＣＤ８−αβ“細胞は ＭＬＲ＝精製した集団を抑制しつるので、選別されたヒトＣＤ４−　ＣＤ８−α β１細胞をＭＬＲにおける抑制活性について試験した。

十分な数のこれらの細胞を得るために、骨髄細胞をフィコール勾配で分離し、次 いで抗−ＭＯ−１（抗−ＣＤ１１ｂ）及び抗グリコフォリンＡモノクローナル抗 体を用いて骨髄様細胞を除くためのパンニングを行った。非付着細胞は、フルオ レセイン結合抗αβＴＣＲ及びフィコエリトリン結合抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体 により染色された。

これらの細胞の２色分析が、同一ドナーからの同様に染色されたＰＢＬと比較さ れた。

ＣＤ４−　ＣＤ８−αβ“細胞の別個の集団が幾つかのドナーの骨髄細胞中で観 察されたが、ＰＢＬの場合には観察されなかった。骨髄細胞のＣＤ４−　ＣＤ８ −αβ１及びＣＤ４−　ＣＤ８−αβ−集団をフローサイトメトリーで精製し、 それらの表面マーカーパターンを再分析した。

ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに対する染色強度は両方の集団において鈍く、重複し た。しかしながら、ＴＣＲαβ染色に対するパターンは、５％以下の混入が判る 程度に、明るくかつ選別された細胞の明らかな分離を示した。段階的な数のＣＤ ４−、　ＣＤ８−、　ＴＣＲαβ−及びＤＮＳ細胞をＭＬＲに添加した。いずれ の集団も”Ｈ−ＴｄＲ取り込みを約４０％だけ抑制したが、ＤＮＳ細胞はＤＮＳ 集団よりも約５倍効果的であった。フィコールで分離され、上述のように“パン ニングした未選別の骨髄細胞は、試験した用量範囲においてＭＬＲを抑制できな かった。未選別細胞による抑制の欠如は、ＭＬＲを増大しうるＣＤ４”又はＣＤ ８＋細胞の存在、及び低いパーセントのＤＮＳ細胞に関連するかもしれない。

実施例８のようにして調製された、ＤＮＳに富んだ骨髄フラクションを、適当な 成長因子の存在下で培養することにより、この表現型の集団に一層富んだものと することができる。適当な成長因子は、培地の日常的な補充を行い、生成した集 団のＭＬＲ抑制能を試験することにより、容易に評価できる。

外来の免疫担当細胞が宿主の免疫抑制状態に関連して十分に少ない量で供給され るとき、外来の（ドナー）細胞は一般に宿主に対して致死的ではなく、その宿主 は膵臓拡張の形で測定しうる応答を示す。この観察に基づく移植片対宿主病のア ッセイは、サイモンセン、　Ｍ、、　Ｐｒｏｇ　Ａｌｌｅｒｇｙ　（１９６２） 　６巻、第３４９−４６７頁に開示されている。この亜致死的移植片対宿主病の アッセイは、この応答に対するＴＬＩ−２，４Ｃ及び４ＢＡ４細胞系の効果を測 定するために使用された。

ドナー細胞について適切な用量レベルを決定するために、０．５゜１．５又はＩ ＯＸ　１０’の成体Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞をＦ１クロスＢＡＬＢ／ｃＸ　Ｃ ５７ＢＬ／Ｋａ新生児宿主に注入した。成体（８〜１２週令）の解離した膵臓細 胞は組織培養液ＲＰＭＩ−１６４０（ギブコ、グランドアイランド、　ＮＹ）中 で調製され、生後４〜７日でＦ１クロスに０．１ｍｌが腹腔内注射された。８日 後、レシピエンドの膵臓が取り出され、アッセイされた。５ＸＩＯ’個の細胞を 注入すると膵臓の大きさが２゜４倍（平均）程度に増大して容易に測定しうる応 答を与え、図２に示される用量一応答曲線上にあった。

膵臓指数が計算され、これは注射していない同腹の子である対照の重量に対する 、注射したマウスの膵臓の重量比を表わす。１゜０より大きい指数は、移植片対 宿主病の指標となる。

表■は、新生児に生後４〜７日で、ＮＳ細胞又は対照ＨＴ−２細胞とともに又は これを含まずに、５Ｘ１０’個のＣ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞を腹腔内注入し、８ 日後に膵臓指数を測定した際に得られた結果を示している。予期されたとおり、 ５　ＸＩＯ＠Ｆｌ　／％イブリ・ソド膵臓細胞を注射した対照は、何らの膵臓拡 張も示さなかった。

（来貢以下余白） 表■ 膵臓指数（平均） 無添加　２．６ ＋　１５ｘ　１０’　ＴＬＩ−２，４Ｃ１，２無添加　２．７ ＋１５ｘｌＯ’　４ＢＡ４　１．８ 無添加　２．５ ＋　１５ｘ　１０’　）ＩＴ−２２，３無添加　２．６ ＋　５　ｘ　１０’　ＴＬＩ−２，４Ｃ１，６無添加　２．５ ＋　５　Ｘ　１０＠ＨＴ−２２，３ 結果によれば、外来細胞により引き起こされた膵臓の拡張を測定するとき、ＴＬ Ｉ−２，４Ｃ又は４ＢＡ４細胞を１５Ｘ　１０’細胞で共注射すると、移植片対 宿主病を抑制するのに効果があることが明らかである。注射されるＮＳ細胞を５ Ｘ１０’に減少させると、抑制量を減じるが、抑制を破壊しない。対照のＴ細胞 系（ＨＴ−２）は抑制しない。

実施例１１ クローン化したＮＳ、ｍ胞による致死的移植片対宿主病の抑制照射した離乳した ばかりの宿主に外来組織を同様に投与すると、応答は膵臓の拡張に限らず、その 注入は一般に致命的である。以前の研究では、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞をＩＶ 注射された亜致死的に照射された成体ＢＡＬＢ／ｃマウスは２週間以内に死ぬこ とを示している。

これは、部分的には膵臓におけるＴ細胞の高濃度によるものである。

０．５ｍｌ　ＲＰＭ１１６４０中の５　Ｘ　１０’　Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞 を単独で、又は、ＮＳ細胞と組み合わせて投与する前に、ＢＡＬＢ／ｃの離乳後 間もないものに６〜１２時間４００ラツドの全身照射を与えた。この状況下では 、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ１Ｍ！臓細胞を腹腔内に注入したＢＡＬＡ／ｃ　２１日令 の離乳後間もないものは死んだ（３０日までに８５％が死亡）。予期されるよう に、同様に処理されたＣ５７ＢＬ／Ｋａの離乳後間もないものは生存する。

しかしながら、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞と共注射された１５Ｘ　１０’のクロ ーン化ＮＳ細胞（ＴＬＩ−２，４Ｃ）を受容したＢＡＬＢ／ｃマウスは、宿主の ５％のみが３０日後に死んだ。１５ＸｌＯ’の４８Ａ４細胞の共注射はほんの僅 かしか効果がなかった。ＩＴ−２細胞を共注射すると、対照のものに類似の結果 を与えた。これらの結果は図８に要約されているが、ここでカッコ内の数は各群 のマウスの数を示す。１００日目における生存率は、図において４０日目に示さ れるものと同一であった。

ＨＴ−２細胞を共注射されて、生存していた数匹のマウスは発育不良であった。

上述の結果から、クローン化されたＮＳ細胞は免疫無防備状態の宿主に対して開 始された急性の移植片対宿主病を抑制しうろことが明らかである。（膵臓細胞及 びＮＳ細胞の腹腔内注射が必須であることに留意すべきである；静脈内的に実施 された同様の実験は、恐らく、ＮＳ細胞が宿主の膵臓まで移動して、ドナー細胞 と相互作用することに失敗したことにより、成功しなかった）。

上で実施したインビボ処理の条件は、しかしながら、宿主にキメラ特性を付与す るＮＳ細胞をもたらさなかった。これを実証するために、末梢血液の単核（ＰＭ Ｎ）細胞をＣ５７ＢＬ／Ｋａドナー細胞の存在について評価した。試験期間の３ ０日後に生存している宿主からＰＭＮを分離し、スラビン、Ｓ、、ら、　Ｊ　Ｅ ｘｐ　Ｍｅｄ　（１９７７）　１４６巻；第３４−４８頁に記載されているとお りに実施された微量細胞障害試験において補体を有する抗−Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ抗 血清とともに培養した。Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ特性がＰＭＮ細胞に存在する場合には 、細胞死が生じたであろう：しかしながら、何も観察されなかった。また、これ らの宿主は最初の注射後の２週間以内にはＣ５７ＢＬ／Ｋａ皮膚移植片を受容す ることができなかった。

実施例・１２ クローン化ＮＳ細胞はキメラ特性及び免疫寛容の確立を可能にするＮＳ細胞は同 種異系の膵臓細胞の注射により生じた急性の応答から個体を保護することが示さ れる一方、これらの膵臓の注射は宿主に所望の免疫寛容及びキメリズム（（ｈｉ ｍｅｒｉｓ＋ｎ）を付与することに失敗した。この失敗は注射された組織の性質 によるものかもしれず、その結果、宿主の骨髄と膵臓をＣ５７ＢＬ／Ｋａ造血幹 細胞で再集団化することに失敗したことによるかもしれない。膵臓細胞はＴ−リ ンパ球の高集団を含有しており、これが急性の移植片対宿主病の原因になると考 えられている。一方、幹細胞、これは比較的未分化であり、免疫寛容の形成の原 因となるか、又は少なくともそれに必須であると考えられているが、この細胞を 比較的低集団で含有している。

従って、上述の方法に類似する方法は、外来組織源として膵臓細胞よりもむしろ 骨髄を使用して実施された。成長したＢＡＬＢ／ｃマウスに５０ＸｌＯ’　Ｃ５ ７ＢＬ／Ｋａの骨髄細胞を腹腔内注射する１日前に、致死量の全身照射（７００ ｒａｄ）を与えた。　１５Ｘ　１０’　ＴＬＩ−２，４Ｃ細胞とともに又はそれ なしで与えた。ＮＳ細胞を共注射した時、移植片対宿主病の証拠を示すことなく 、１４匹中１２匹のマウスがその後３０日間生存した。ＮＳ細胞が与えられなか った対照においてはｌＯ匹中８匹が生存した。

全ての生存している動物からのＰＭＮを上記のように微量細胞障害試験により試 験したが、ＰＭＮ細胞の９５％の死滅から明らかなようにキメラであることがわ かった。さらに、これらは４０日後１こＣ５７ＢＬ／Ｋａを受容することができ たが、Ｃ３Ｈの皮膚移植片は受容できなかった。

このキメラの膵臓細胞を、さらに、フレッシュなりＡＬＢ／ｃマウスレシピエン ドにおいて移植片対宿主病を引き起こす能力について試験した。正常のＣ５７Ｂ Ｌ／Ｋａドナー細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ３Ｈレシピエンドのいずれかに、Ｒ ＰＭＩ−１６４０培地０．５ｍｌ中のｌ０ＸＩＯ’個の膵臓細胞を腹腔内注射し た時、注射したマウスは全て１４日以内に死んだ。予期されるように、細胞を注 入しなかった対照のマウスは生存した。キメラの膵臓細胞を同様にＢＡＬＢ／ｃ 又はＣ３Ｈマウスに注射すると、Ｃ３Ｈレシピエンドにおいてのみ移植片対宿主 病を生じた；　ＢＡＬＢ／ｃレシピエンドは、キメラ膵臓がＣ５７ＢＬ／Ｋａ骨 髄注射のみを与えた、或いは、ＮＳ細胞と組み合わせて与えたキメラドナーに由 来する場合には、そのキメラ膵臓の注入にも拘らず生存した。

キメラドナーに付与された免疫寛容はＢＡＬＢ／ｃレシピエンドに特異的であっ た。

膵臓及び骨髄細胞のフラクションの特性膵臓細胞をＣ５７ＢＬ／Ｋａ　（Ｈ−２ ＠）マウスから無菌的に取り出し、この膵臓フラクションをナイロン繊維のメツ シュを通じてＲｒ’Ｍ＋−１６４０の冷培地中にゆるやかに押出させることによ り単細胞懸濁液を調製した。骨髄細胞は、２５ゲージ針を使用してＣ５７ＢＬ／ Ｋａ　（Ｈ−２’）マウス（４〜１０週令）の大腿骨及び脛骨をＲＰＭＩ−１６ ４０の冷培地でフラッシュさせて調製した。骨髄プラグを次いで穏やかに再懸濁 させた。細胞を２度洗い、使用前に２％酢酸で計測し、生存力をトリパンブルー 染色の排除により調べた。

パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、ス ウェーデン）、これはポリビニルピロリドンでコーティングされたコロイド状の シリカから成るものであるが、これを生存しているリンパ球に使用するために最 初に等張にした。カルシウム及びマグネシウムを含有しない１０　ｘ　ＤＰＢＳ をパーコール原液に、パーコール（当初密度１．１３０ｇ／ｍｌ）　９部（Ｖ／ Ｖ）　＋：対しテＤＰＢＳを１部（Ｖ／Ｖ）（７）割合で添加し、これをｐＨ７ ，２に調節した。その後の使用のために、この作業用の原液は、４０．５ｏ：　 ５５．６０及び７０％のパーコールを含有する溶液を得るためにＲＰＭＩ−１６ ４０培地で連続的に希釈した。それぞれの密度（ｇ／ｍｌ）は、Ｌ、０５０．１ ．０６０．１．０６Ｂ、１．０７５．１．０９０であった。

７０％濃度から出発して、連続的に濃度を減少させて、パーコール溶液の各々の ２〜３ｍｌ容積を５ｍｌピペットを使用して１５ｍ１の透明なポリスチレンチュ ーブ内に重層させた。変動する数の膵臓又は骨髄細胞（１００Ｘ　１０’個の細 胞を越えない）をＲＰＭＩ−１６４０培地中に懸濁させ、パーコール勾配上に層 を形成させた。勾配を室温で２０００ｒｐｍ　（５２０ｇ）にて３０分間遠心分 離し、各々の密度の界面で細胞をパスツールピペットにより吸引し、ＲＰＭＩ− １６４０で洗った。勾配分画化の結果は表■に示される。

（来貢以下余白） フラクションは、さらに、ＣＤ４．　ＣＤ８及びＴＣＲαβ表面マーカーの存在 について、モノクローナル抗体を使用して染色した。末分画化膵臓中のαβＴＣ Ｒである細胞は、３つのすべての表面マーカーを明るく染色する（全細胞の４１ ％）。未分画化骨髄細胞は３つの全てのＴ−細胞表面マーカーに対して同様の明 るい染色パターンを有する１％以下の細胞を含んでいた。αβＴＣＲを陽性に染 色した大多数の骨髄Ｔ細胞はＣＤ４−及びＣＤ８−であった。

骨髄フラクションの分析はＴ細胞の染色パターンにほとんど変化がないことを示 した。というのは、高密度及び低密度フラクションの両方において、αβＴＣＲ ”ＣＤ４’−ＣＤ８−細胞が支配的であったからである。膵臓細胞フラクション は高密度フラクション（ＦＲ６０）においては最も豊富なもの（３８％）として 明るく染色しているＣＤ４”、ＣＤ８＋及びαβＴＣＲ＋細胞を含有しており、 低密度フラクション（ＦｌｌＩ５０）では減少していた（１２％）。αβＴＣＲ ”　ＣＤ４−　ＣＩ）８−細胞の実質的なパーセント（１３％）が低密度フラク ション（ＦＲ５０）に存在していた。骨髄において優勢なＴ−細胞サブセットも また膵臓中に見いだすことができるが、優勢な膵臓サブセットは骨髄中には検出 されなかった。

実施例１４ ＧＶＨＤを抑制し、キメリズムを促進するための富化された又は選別された新鮮 なＮＳ細胞の使用 ＧＶＨＤアッセイにおいて、３〜４週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに、細胞のｉ、ｖ 、注入の６〜１８時間前に、亜致死的全身照射（ＴＢＩ）　（４００ｒａｄ）を １回行った。ＧＶＨＤを引き起こすために、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ細胞を１回接種し た。ＧＶＨＤを抑制するために、ＢＡＬＢ／Ｃ７ウスに２．５Ｘ１０＠ＣＦ３７ ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞、及び種々の用量の分画化された成体Ｃ５７ＢＬ／にａ骨髄 及び不連続パーコール勾配から得られる膵臓細胞の組み合わせを投与した。対照 のグループには単に４００ラツドの亜致死的照射のみを、又は４００ラツドの亜 致死的照射及び２．５Ｘ　１０＠の同系ｃ　ＢＡＩ、Ｂ／ｅ）の末分画化膵臓細 胞を勾えた。すべてのグループの生存率が毎日記録された。

ＧＶＩＩＤアッセイにおいて、細胞移植後１００日目に、生存しているマウスに ついて末梢血液におけるドナー型のリンパ球の存在をアッセイ（２、補体依存性 微量細胞障害試験により同定１．た。レジビニ：／トの後部眼窩洞（ｒｅｔｒｏ −ｏｒｂｉｔａｌ　！＋ｔｒｉｕｓ）から出血させ、自戒試料をヘパリン処理し た。フィコール−ハイバーク勾配精製された末梢血リンパ球を、Ｓ、オカダら、 、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　（１９８３）３６巻　第４１′７頁に記 載されたとおりにして調製したＢＡＬＢ／ｅ抗−Ｃ５７Ｂ＋、抗血清とともに３ ７℃で３０分間培養した。培養後、ｌ：４に希釈されたロウ−ドックス〜Ｍ　（ Ｌｏｗ−Ｔｏｘ−Ｍ）ウザギ補体（Ａｃｃｕｒａ、ｔｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ　ａ ｎｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、、　Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ニーニーヨーク） を試料に添加１．た。反応混合物は再び３７℃で４５分間培養した。細胞はトリ バンブルーを含有する培地に収穫し、標準へモサイトメーターで細胞のす存率を 観察し戸、−ｏ真の細胞障害性は、抗血清で処理した後に存在する生存細胞の数 と正常ＢＡＬＢ／ｅ血清で処理した後に存在する数を比較することにより計算し た。正常Ｃ５７ＢＬ／Ｋａマウスの対照細胞障害性試験は〉９５％の値を与え、 正常ｎＡＬＢ／ｃマウスではぐ５％の値を与えた。

Φ致死的（４００ｒａｄｓ）に照射したＢＡＬＢ／ｅ宿主において未分画化Ｃ５ ７ＢＬ牌臓細胞によりＧＶＨＤを誘引させた後では、２．５Ｘ１０’細胞を投与 したレシピエンドはいずれも１１日以上は生存しなかった。

１ｘｉｏ’細胞を与えたもののうち約５０％は１００日以上生存し、０９５Ｘ１ ０’細胞を与えたものは１００％が１００日以上生存した。２．５Ｘｌ、Ｑ’又 は５Ｘ１０’朱分画化Ｃ５７ＢＬ骨髄細胞を与えたレシピエンド或は全く細胞を 与えない１ノンビエントはすべて１００日以上生存した。

異なる肺臓細胞フラクションのインビボでのＧＶＨＤ誘発能力は、亜致死的に照 射したＢＡＬＢ／Ｃレシピエンドに２．５ＸＩＯ’細胞を（静脈内）投与するこ とにより測定しｌＪｏ　ＦＲ４０又はＦＲ５０からの２．５×１０＠牌臓細胞を 投与ｌ、また動物は全て１００日以上生存し、ひだを有する毛（ｒｕｆｆｌｅｄ 　ｆｕｒ）、弓状に曲がった背面、顔の膨張、下痢、体毛の損失又は悪液質のよ うなＧＶＨＤの明らかな臨床的な症状を示さなかった。２．５ＸＩＯ’牌臓ＦＲ ５５細胞を注射したＲＡＬＢ／ｃレシビニントはすべて２０日までに死亡し、２ ．５ＸｌＯ’　ＦＲ６０細胞を与えた動物はいずれも１０日以上は生存しなかっ た。２゜５ＸＩＯ’の未分画化のＣ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞を注射したすべての 対照の動物は１１日までに死亡し、４００ラツドの亜致死的照射を行ったレシピ エンドのみが１００日間生存した。

高密度又は低密度フラクションのいずれも、１００日間の観察期間において致死 的なＧＶＨＤを誘発しなかった。

Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ骨髄フラクシヨンに関し、２．５ＸＩＯ＠の未分画化Ｃ５７Ｂ Ｌ／Ｋａ牌臓細胞により誘発されるＧＶＨＤを抑制する能力について試験した。

亜致死的に照射したＢＡＬＢ／ｃレシピエンドに２．５Ｘ１０’のＦＲ６０又は ＦＲ５０及び５５骨髄細胞を共注射すると、６０％の動物を１００日以上生存可 能にさせた。最高の保護はより低い密度のフラクションで観察された（８０％以 上の生存率）。１００日以上生存したレシピエンドの不特定の割合が穏やかな慢 性のＧＶＨＤ、即ち個々の実験に依存して、ひだを有するｔ、体毛の損失及び体 重の減少の症状を示した。２．５ＸＩＯ’の未分画化骨髄細胞を一緒に注入され た約２０％のしノシビエントは１００日以上生存した。２．５ｘｔｏ’　Ｃ５７ ＢＬ／Ｋａの朱分画化膵臓細胞のみを投与したＢＡＬＢ／ｅレシピエンドはすべ て２１日までに死んだが、照射のみ、又は照射に加えて２．５Ｘ１０’の同系（ ＢＡＬＢ／ｃ）の末分画化膵臓細胞を与えた動物はすべて１００日以−ヒ生存し た。

亜致死的に照射（、たＢＡＬＢ／ｃレシピエンドに、パーコール勾配で分画化（ ７たＣ　５７　Ｂ　Ｌ　／　Ｋ　ａ内臓細胞（各フラクションから２．５ＸＩＯ ＠細胞）を２．５Ｘ　１０’の未分画化Ｃ５７Ｂ１．／Ｋａ牌臓細胞とともに注 入した。

ＦＲ４０及びＦＲ５０のいずれも、８０％以上の１ノシビエントが１００日以上 生存することを可能にした。一方、２．５Ｘ　１０”のＦＲ５５又はＦＲ６０の 細胞を未分画化肺臓細胞とともに注入すると、レシピエンドのいずれも２０日以 上は生存しなかった。２．５ＸＩＯ’の朱分画化膵臓細胞のみを与えた対照動物 はすべて２０日以内に死んだが、照射のみを、又は、照射及び２．５ｘｌＯ’　 ＢＡＬＢ／ｃ末分画化牌臓細胞を膵臓たレシピエンドはすべて１００日以上生存 した。

ＦＲ５０牌臓細胞の段階的数量を未分画化Ｃ５７ＢＬ牌臓細胞の一定数（２，５ Ｘ　１０’）とともに、亜致死的に照射を行ったＢＡＬＢ／ｃレシピエンドに注 入し７た。２．５Ｘ１０’のＦＲ５０細胞を共注入すると、ＢＡＬＢ／ｃレンビ エントの８０％以上が１００日以上生存可能となった。ｌＸｌ０’及び０．５Ｘ ＩＯ’の細胞を共注入すると、それぞれ１００日間の生存率は７０及び５０パー セントであった。しかしながら、０．　Ｉ　Ｘ　１０’細胞を共注入した動物の ９０パーセントは、２０日以内にＧＶＨＤで死んだ。

２．５　ＸＩＯ’の朱分画化膵臓細胞のみを与えた動物はすべて、２１日以内に 死んだが、亜致死的な照射のみを与えた対照の動物はすべて１００日以上生存し た。

ＩＩＡＬＢ／ｃレシピエンドの数グループにおいて、ＢＡＬＢ／ｅ抗−Ｃ５７Ｂ Ｌ／Ｋａポリクローナル抗体及び補体を使用して、　１００日目におけるキメリ ズムを試験した。未分画化Ｃ５７Ｂ＋、／Ｋａ骨髄のみの、又はＣ５７ＢＬ／Ｋ ａ骨髄フラクシヨン（グループ１）のみの、又は膵臓フラクシヲン（グループ５ ）のみのレシピエンドはキメうではなかったが、未分画化Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓 細胞に加えて低密度骨髄（グループ２．ＦＲ５０）又は膵臓（グループ３　；　 ＦＲ４０，グループ４　；　ＦＲ５０）細胞を与えたグループはそれぞれ平均７ ３．７４及び９１％のドナー型細胞を有するキメラであった。加えて、ＣＤ４− 、　ＣＤ８−αβ１の表現型を有することが示されたＦＡＣ３選別された新鮮な 細胞は、ＧＶＨＤを抑制しかつキメリズムを促進することが実証された。

ドナーの皮膚に関してキメうであることが示されたレシピエンドに適用された皮 膚移植片はいつまでも移植片に寛容であることができた；しかしながら、非キメ ラのレシピエンドはかかる移植片を拒絶し、キメラに関連しないドナー型に由来 する移植片は３週間以内に拒絶された。

パラチュームバット、■、らの刊行物であるＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９９２ ゜１４８・３７３−３８０）、この内容は本明細書に参考として取り入れるが、 これはマウス骨髄にお１ノるヅブレッサー細胞の特性を記述している。この研究 は、特定の病原体が存在しないＣ５７ＢＬ／Ｋａ及びＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄 中で優勢なＴ細胞サブセットがＤＮＳ表面表現型を有することを示した。これら のＤＮＳ細胞を細胞選別により得たとき、混合リンパ球反応を抑制することに成 功した。肺臓中の典型的なＴ細胞のパーセントは、正常成熟マウスと比較すると 、成熟ヌードマウス又は正常新生児マウスにおいて減少していた；しかしながら 、肺臓及び骨髄中でＤＮＳ表現型を有する細胞のパーセントは存在しなかった。

病原菌フリーのマウスの骨髄Ｔ細胞の優勢なサブセットは、表面マーカー表現型 、機能、成長した胸腺への依存性、及び成る種の自己反応性Ｖβ受容体の欠失に 関して、典型的な細胞のＴ細胞と比較すると相異している。骨髄Ｔ細胞は、４８ 時間のインビトロの培養の間に再配列β鎖をもたない骨髄前駆体から直接に発生 するように見えた。

実施例Ｉ６ 成熟マウス骨髄及び肺臓中のＴ細胞のサブセットのＧＶ）ＩＤに関する作用 バラチュームバットの他の文献であるＪ　１ｍｍｕｎｏｌ　（１９９２）　１４ ８巻、第３７３から３８０頁では、この文献の開示は参考として本明細書にとり 入れられるが、正常な成熟マウスの肺臓及びＣ５７ＢＬ／Ｋａマウスの骨髄細胞 の分画化は、不連続パーコール密度勾配により行われた。ｌ、　１５０〜１．０ ６０ｇ／ｍｌのフラクションにおける肺臓細胞は、亜致死的に照射した（４００ ｒａｄ）　ＢＡＬＢ／Ｃ７ウスに未分画化Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞とともに注 入し７たときに、急性の致死的なＧＶＨＤを完全に抑制した。５Ｘ１０’程度の 少量の低密度細胞は、２．５Ｘ１０’の未分画化同種異系の肺臓細胞により引き 起こされる急性のＧＶｌ＋Ｄを抑制する。

一方、膵臓の高密度フラクションの１．０７５〜１．０９０ｇ／＋ｎｌは、亜致 死的に照射したＢＡＬＢ／ｃレシピエンドにおいて急性のＧｖＨＤを誘発した。

Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ骨髄細胞の分画化は、高密度又は低密度フラクション又は未分 画化細胞のいずれも致死的なＧＶＨＤを生じないことを示した。さらに、すべて の回収された密度フラクションは、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａの未分画化膵臓細胞ととも に注入すると、ＢＡＬＢ／ｃレシピエンドのマウスをＧＶＨＤから保護した；分 画化されていない骨髄細胞は中程度に保護的であった。低密度の骨髄フラクショ ン（１，０５０〜１．０６８ｇ／ｍｌ）は、再現可能な保護が抑制細胞に対して 誘引細胞が５＝１の割合である場合に達成しうろことを示した。

骨髄及び肺臓細胞の両方の低密度フラクションは、ＤＮＳ表現型を有する細胞が 優勢である集団において、ＴＣＲαβ、ＣＤ４＋又はＣＯＢ”ｌｉｔ＠の著しい 枯渇を示した。これらのＤＮＡ細胞の精製された集団はＧＶＨＤを抑制した。さ らに、分画化されていないＣ５７ＢＬ／Ｋａ牌臓細胞が与えられた、低密度の骨 髄又は肺臓細胞で保護されたレシピエンドはキメラであり、同種異系の移植片を 受け入れることができる。

ＳＦの精製 全リンパ系が照射された（ＴＬＩ）成体ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺臓がらＴＬｌ− ２，Ｃ７クローンを誘導した。細胞は、外因性の抗原を添加することなく、ＩＬ −２富化培地中で増殖させ、希釈を限定してクローン化し、そして、ＣＤ４−　 ＣＤ８−αβ“細胞表面マーカー表現型を発現させた。この細胞系は、熱不活性 化したｌｏ％ＦＣ３，１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン及び５Ｘ１０− ５Ｍの２−ＭＬ！を補充したＲＰＭＩ−１６４０中に維持した。培養のために、 コンカナバリンＡで刺激されたラットの肺臓細胞（ＣＡＳ）　（３０％Ｖ／Ｖ） から得られた上清を培地に添加した。

ＴＬＩ−２，Ｃ７細胞をＴ−７５フラスコ中のＣＡＳ富化培地においてコンフル エンスになるまで増殖させた。ＰＭＡ　（ｌｏｎｇ／ｍｌ）及びＡ２３１８７　 （０゜２６μｇ／ｍｌ）を、ｉｏ％の熱不活性化ＦＣ３を補充したＲＰＭＩ　１ ６４０に溶解腰最終体積が２０ｍ１／フラスコになるように細胞に添加した。

４時間培養してから、細胞をＰＢＳで５回洗い、添加された蛋白質を含有しない ＲＰＭＩ−１６４０で覆った。粗上清を２４時間後に集め、使用する迄−４０℃ に凍結保存した。

プールしておいた２１の上清を連続的に攪拌しながらＰＢＳ中の珪酸７　Ｈ／ｎ ＋１と４℃で４時間インキュベートした。次いで、珪酸をスピンダウンさせ、吸 着されなかった物質を集め、１ＯＫＤａのｍ。

Ｗ、のカットオフを備えたセントリセル濾過装置（Ｃｅｎｔｒｉｃｅｌ　Ｆｉｌ ｔｒａｔｉｏｎ　ｕｎｉｔｓ；　Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅｓａ、　Ｗａｒｒｉｎ ｇｔｏｎ、　ＰＡ）中で濃縮した；分解を防ぐために０．１ｍＭのＰＭＳＦを添 加した。

吸着されなかった上清は、１ｍＭのＰＭＳ　Ｆを補充した２０ｍＭのＴｒｉｓ− ＨＣＩ（ｐＨ８，０）緩衝液で透析を行い、同じ緩衝液を用いて、４℃で積）で 洗った後、吸着された物質を直線勾配の（０〜１．０Ｍ）　ＮａＣ１，２０ｍＭ のＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）にて０．３５ｍ１／分の流速で溶離さ せた。２ｍｌのフラクションを集め、バイオアッセイで使用する迄４℃、又は後 の研究のために一７０℃で凍結させて保存した。異なるフラクションが１１５の 最終希釈にてＭＬＲに添加され、このＭＬＲの上清は、（”Ｈ）−ＴｄＲ取込み を使用するＨＴ−２アツセイにて７２時間後にＩＬ−２をスクリーニングした。

溶離部分は図９に示されている一〇、２〜０．４ＮａＣＩで溶離するフラクショ ンは活性を示した；２個の蛋白質のピークが溶離され、一方がその活性に相当し ている。活性を有するフラクションをプールし、５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 　ｉ　＋ｎＭ　ＰＭＳＦ。

ｐＨ８，０緩衝液で透析を行い、同じ緩衝液で平衡化したレンチル−レクチンセ ファロース４Ｂカラムにかけた。４ベット体積の出発緩衝液で洗った後、結合し た蛋白質は直線勾配（０〜０．３Ｍ）の同一緩衝液中のα−メチル−Ｄ−マンノ シドにて０．２０ｍ１７分の流速で溶離させた。２ｍｌのフラクションを集め、 上述のとおりにしてアッセイした。溶離パターンは図１０に示されている。図示 されるように、僅か２個のフラクションのみが認識しうる活性を有していた。表 Ｖは、精製工程の要約を示す。

全体として、２７５倍の精製及び９％の収率が達成された。

レンチル−レクチンカラムから溶離された５００ｎｇの蛋白質を有するプールさ れた活性フラクションのアリコートは、非還元状態で５ＤＳ−ポリアクリルアミ ド（１２，５％）ゲル電気泳動により分離された。ゲルはスライスされ、各フラ グメントからアリコートが溶離され、そして、溶離物の抑制的活性をア・ソセイ した；付加的なゲルは、銀染色によりバンドを同定するために５０ｎｇの蛋白質 を用いて、還元及び非還元状態で平行して操作（７た。３個の別個の実験では、 約２０Ｋｄ　（濃いバンド）及び４０Ｋｄ　（うすいバンド）において２個のバ ンドが視覚化された。抑制的活性のアッセイでは、２０Ｋｄの領域に関連して活 性が示され、ある活性は明らかな銀染色バンドとは関連のない、より高い分子量 領域にあった。約４μｇのレンチル−レクチン　プールされた試料は、自動ペプ チド配列決定装置を使用してＮ−末端エドマン分解を行った。主要２０Ｋｄバン ド、及び微量４０Ｋｄバンドを示す５Ｏ８−ＰＡＧＥと一致する主要及び微量ア ミノ酸配列が観察された。主要アミノ酸配列は、Ｘ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ− Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａト−（Ａｌａ／Ｐｈｅ）−Ｌｅ ｕ−（Ｌｙｓ／Ｌｅｕ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌであった。第１番目の位置の アミノ酸は明確に判別できなかった。

抗体は、コアポリマーマトリックス（Ａｌａ−Ｌｙｓｔ−Ｇｌｙｓ　）と結合し ているペプチドＬｅｕ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｖａ、ｌ−Ａ　１ａ−Ｌ ｅｕ−（Ｌｙｓ／Ｌｅｕ）−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌで免疫することにより調製 した。

雄のニュージランドウサギに２個の合成ペプチドの一方を皮注射して免疫した； 最初は、等容量のフロイント完全アジュバトを混合した合成ペプチド結合体１０ ０μｇで行った。１０日後に物を採血し、等容量のフロインド不完全アジュバン トに混合し抗原の注射を繰り返した。１０日後に動物を採血し、第■サイクの後 、ウサギをと殺し、血液を凝固させ、３．００Ｏｒｐｍで２０分間回させた。予 めＰＢＳで平衡化した、アフィーゲル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ）ブｌティンＡカラム （Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に血清をのせた。カラムを５倍積ノＰＢＳテ洗い、［ｇＧ 抗体を０．３Ｍグリシン−ＨＣｌ　ｐＨ２，８からな酸洗浄液で溶離した。

以下で使用するＩｇＧ血清抗体は、最初の免疫後１０日で得られｌ５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分離されたＤＥＡＥ及びレンチル−レクチン溶離液両方において、２ ０Ｋｄバンドに相当する採血前（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）抗体よるものではない、 採血後（ｐｏｓｔ−ｂｌｅｅｄ）抗体を使用するウニスンプロットにて単一のバ ンドを検出した。ペプチドによる免疫前ではなくて、後で得られたウサギ血清１ ｇＧ抗体は、ウェスタブロットにおいて上述のレンチル　レクチンで精製した物 質に合し、これを、さらに）ＩＰＬｃで精製すると２０Ｋｄのフラクションから れた。

採血前及び免疫後（ｐｏｓｔ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）　ＩｇＧ血清抗体は アフィーゲル１０に結合させ、高レベルの抑制活性を示す粗ＴＬＩ−２Ｃ７上清 とともに１晩インキユベートした。未処理の粗上清は１　：　２０４８希釈まで ＭＩＲにおいてＩｆ、−２分泌を完全に抑制し、１：８１９２希釈まで５０％抑 制を示したが、結合した抗体とともにインキュベートした後では、１：３２希釈 においてさえも抑制活性は観察されなかっ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における 回収上清の希釈率 ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　３ ＩＦＮ−７濃　度（Ｕ／ｍ１） ＦＩＧ、　４ 応答細胞 ＦＩＧ、　５ ＵＮＦＲ，ＦＲ，Ｉ　ＦＲ，２’ＦＲ，３ＦＲ，４ＭＬＲに添加した細胞 ＦＩＧ、６ ５ｘ１０５１ｘ１０６５ｘ１ｏ６１Ｘ１ｏ７注入した細胞の数 ＦＩＧ、７ 注入後の日数 ＦＩＧ、　８ フラクション番号　（２，０ｍｌ／ＴＵＢＥ）ＦＩＧ、９ フラクション番号（２，０ｍｌ／ＴＵＢＥ）ＦＮ際調査報告 国際調ｆ＠告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　３／２０　８ ３１８−４Ｈ １５１０６８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５／１２　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、Ｅ Ｓ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　 ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳ Ｉ

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物細胞系およびその子孫であって、該細胞系はＩＬ−２Ｒ＋、Ｉｇ− 、ＣＤ４−、ＣＤ８−、ＣＤ３＋、ＭＡＣ−１−、ＴＣＲαβ＋である表面マー カーパターンにより特徴づけられるダブルネガティブサプレッサー（ＤＮＳ）細 胞系であるか、または 該細胞系はＩＬ−２Ｒ＋、Ｉｇ−、ＣＤ４−、ＣＤ８−、ＣＤ３−、ＭＡＣ−１ −、ＴＣＲαβ−である表面マーカーパターンにより特徴づけられるヌル細胞系 であり、該細胞系のそれぞれがｉｎ　ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応（ＭＬＲ） を抑制するが、対応する標的細胞を死滅させないものである、上記の細胞系およ びその子孫。
2. ２．血液細胞供給源から得られる細胞集団であって、該細胞集団は血液細胞供給 源からの未分画化細胞集団と比べてダブルネガティブサプレッサー（ＤＮＳ）お よび／またはヌル表現型のサプレッサー細胞に富んでいるか、または効果的な量 のＤＮＳおよび／またはヌル表現型のサプレッサー細胞を含んでいるが、該集団 はその抑制活性を保持するように十分な数の反作用細胞表現型を含んでいない、 ことを特徴とする上記の細胞集団。
3. ３．本質的に全ヒト骨髄細胞の約５％以下からなる細胞の集団であって、 前記５％以下はヒト骨髄からの細胞の勾配分離により得られる低密度フラクショ ンを表すか、または 前記５％以下は血液細胞供給源からの未分画化細胞集団と比べてダブルネガティ ブサプレッサー（ＤＮＳ）および／またはヌル表現型のサプレッサー細胞に富ん でいる細胞集団を表すか、あるいは 効果的な量のＤＮＳおよび／またはヌル表現型のサプレッサー細胞を含んでいる が、該集団はその抑制活性を保持するように十分な数の反作用細胞表現型を含ん でいない、ことを特徴とする上記の集団。
4. ４．効果的な量の前駆細胞をさらに含んでいる、請求項２または３記載の細胞集 団。
5. ５．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することができる細 胞集団の調製方法であって、 ヒト血液細胞供給源から得られる細胞の懸濁液を勾配分離にかけ、約５％以下の 該集団を回収することからなり、該集団は： 該勾配の最低密度フラクション中に含まれるものであるか、または 該血液細胞供給源からの未分画化細胞集団と比べてダブルネガティブサプレッサ ー（ＤＮＳ）および／またはヌル表現型のサプレッサー細胞に富んでいる細胞集 団を表すか、あるいは効果的な量のＤＮＳおよび／またはヌル表現型のサプレッ サー細胞を含んでいるが、該集団はその抑制活性を保持するように十分な数の反 作用細胞表現型を含んでいない、ことを特徴とする上記の調製方法。
6. ６．１ｎ　ｖｉｔｒｏで混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することができる細 胞集団の調製方法であって、 場合により、哺乳動物の血液細胞供給源から得られた細胞の懸濁液を、赤血球を すべて取り除くための処理に付し、場合により、該細胞懸濁液を、多形核細胞を すべて取り除いて単核細胞を回収するための分離に付し、場合により、該単核細 胞をプラスチック付着表面にさらして単球を除き、 該細胞懸濁液をパーコール勾配分離にかけ、そしてヌルＮＳ細胞および／または ＤＮＳ細胞に富みかつＴヘルパー細胞を含まない、もとの血液細胞供給源からの 約５％以下の細胞を回収する、 ことを特徴とする上記方法。
7. ７．本質的にダブルネガティブサプレッサー（ＤＮＳ）細胞またはヌルＮＳ細胞 からなる細胞集団の調製方法であって、哺乳動物の血液細胞供給源から調製した 細胞懸濁液をパーコール勾配にかけ、他のＴ細胞と比べてＤＮＳ細胞について富 化された該勾配の低密度フラクション中の細胞を回収し、そして該細胞をＣＤ４ 、ＣＤ８およびＴＣＲαβに関して染色し、染色した該細胞をフローサイトメト リーにかけ、そしてＤＮＳ細胞に対応するフラクションを回収するか、あるいは 該懸濁液の残りの細胞をＣＤ４、ＣＤ１６、Ｉｇ、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ３、ＣＤ８ およびＴＣＲαβに関して染色し、染色した該細胞をフローサイトメトリーにか け、そしてヌル細胞に対応するフラクションを回収する、ことを特徴とする上記 方法。
8. ８．ＤＮＳまたはヌルサプレッサー細胞の集団を増やす方法であって、 ＤＮＳまたはヌルサプレッサー細胞に富む集団を少なくとも１種のサイトカイン で処理することからなり、場合により、該細胞をＰＨＡおよび／またはＣｏｎＡ および／または抗ＣＤ３抗体で処理することをさらに含む、ことを特徴とする上 記方法。
9. ９．請求項５、６、７または８の方法により調製された細胞の集団。
10. １０．移植片対宿主病の予防に用いるための請求項１の細胞系あるいは請求項２ 、３、４または９の細胞集団。
11. １１．骨髄移植または臓器移植の生着促進に用いるための請求項１の細胞系ある いは請求項２、３、４または９の細胞集団。
12. １２．造血ＣＤ３４＋前駆細胞に富む血液細胞集団の調製方法であって、 哺乳動物の血液細胞供給源から得られた細胞集団を、重量オスモル濃度およびｐ Ｈの生理学的条件下で密度勾配分離にかけ、そして 低密度のフラクションから該前駆細胞に富むフラクションを回収する、 ことを特徴とする上記方法。
13. １３．前記の回収したフラクションが密度勾配分離にかけた該細胞の５％以下に 相当し、最低密度を有するか、または前記の密度勾配がパーコール勾配で、該フ ラクションが４０〜４５％パーコールに相当するか、または前記の回収したフラ クションが少なくとも１０％のＣＤ３４＋前駆細胞を含むか、または 前記の方法が、該集団を密度勾配分離工程にかける前に、哺乳動物の血液細胞供 給源を赤血球および／または多形核細胞を該集団から取り除く工程にかけること をさらに含む、請求項１２記載の方法。
14. １４．請求項１２または１３の方法により調製された前駆細胞に富む細胞集団。
15. １５．少なくとも１０％のＣＤ３４＋細胞を含み、実質的に赤血球と多形核細胞 を含まない、哺乳動物の血液細胞供給源から得られた細胞集団。
16. １６．４０〜４５％パーコールの範囲の密度に合致するような密度を有する、ま たは 前記の血液細胞供給源からの未分画化細胞集団と比べてダブルネガティブサプレ ッサー（ＤＮＳ）および／またはヌル表現型のサプレッサー細胞に富んでいる、 または効果的な量のＤＮＳおよび／またはヌル表現型のサプレッサー細胞を含ん でいるが、該集団はその抑制活性を保持するように十分な数の反作用する細胞表 現型を含んでいない、または前記の血液細胞供給源中の血液細胞の５％未満に相 当する、請求項１５記載の細胞集団。
17. １７．患者における造血前駆細胞集団の回復に用いるための請求項１４、１５ま たは１６記載の細胞集団。
18. １８．ＰＭＡ／イオノホア処理Ｔ細胞から分離し得る、約２０ｋｄのモノマー分 子量を有する、分離精製された形の可溶性サプレッサー因子（ＳＦ）タンパク質 であって、該Ｔ細胞はＤＮＳまたはヌル表現型を有しかつ対応する標的細胞に対 してナチュラルキラー活性を示さず、該ＳＦは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑 制することができるが、ＣｏｎＡ、ＰＨＡまたは抗ＣＤ３により刺激された脾細 胞でのＩＬ−２産生を抑制しないことを特徴とする、上記のタンパク質。
19. １９．次のＮ末端アミノ酸配列： 【配列があります】 を有し、かつ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することができる、約２０ｋｄ の分離精製された形の可溶性サプレッサー因子（ＳＦ）タンパク質。
20. ２０．サプレッサー因子（ＳＦ）タンパク質の調製方法であって、ＤＮＳまたは ヌル表面表現型を有し、ＭＬＲを抑制し、しかも対応する標的細胞に対してナチ ュラルキラー活性を示さない細胞系の培養物に、該ＳＦを上清へ分泌させるのに 効果的な量のＰＭＡおよびカルシウムイオノホアを添加し、該上清を回収し、そ して 場合により、該上清を、ＤＥＡＥ−セファロースアニオン交換カラムに該ＳＦが カラムに吸着される条件下で加え、該カラムを塩勾配で溶離して複数のフラクシ ョンを得、そして該ＳＦを含有するフラクションを回収するか、または該上清を 、該ＳＦと免疫反応性の抗体をアフィニティーリガンドとして含むクロマトグラ フィーカラムに該ＳＦがカラムに吸着される条件下で加えて、該カラムから該Ｓ Ｆを溶離することからなり、そして 該方法は、場合により、該ＤＥＡＥカラムから回収された該フラクションを、該 ＳＦと免疫反応性の抗体をアフィニティーリガドとして含むクロマトグラフィー カラムに該ＳＦがカラムに吸着される条件下で加えて、該カラムから該ＳＦを溶 離するか、または 場合により、回収された該フラクションを、レンチル−レクチンクロマトグラフ ィーカラムに該ＳＦがカラムに吸着される条件下で加えて、該カラムから該ＳＦ を溶離することをさらに含む、上記方法。
21. ２１．請求項１８または１９のＳＦと特異的に免疫反応を行う抗体またはその免 疫反応性フラグメント。
22. ２２．活性成分としての請求項１８または１９のＳＦタンパク質を製剤上許容さ れる賦形剤と共に含有する、患者に免疫抑制を賦与するのに適した医薬組成物。
23. ２３．請求項１８または１９のサプレッサー因子タンパク質をコードするＤＮＡ を含むＤＮＡ分子からなるＤＮＡ分子の組成物。
24. ２４．適合性の宿主細胞内に導入したとき、請求項１８または１９のＳＦタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列を発現することができる発現系であって、ＳＦタン パク質を発現させることができる制御配列に機能しうる状態で連結されたＳＦタ ンパク質コード化ＤＮＡを含有する、上記の発現系。
25. ２５．請求項２４の発現系を用いて形質転換またはトランスフェクションを行っ た組換え宿主細胞。
26. ２６．混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することができるが、ＣｏｎＡ、ＰＨ Ａまたは抗ＣＤ３により刺激された脾細胞でのＩＬ−２産生を抑制しないサプレ ッサー因子タンパク質の産生方法であって、 請求項２５の細胞を前記のコード化ＤＮＡが発現される条件下で培養し、 該培養物から該ＳＦタンパク質を回収する、ことからなる上記方法。