JP2020141593A - アクチビンa及び/又はvpaを含む、nkt細胞培養のための添加剤、及びnkt細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】アクチビンA及び/又はVPAを含む、NKT細胞培養のための添加剤の提供。【解決手段】アクチビンA及び/又はVPAを含む、NKT細胞培養のための添加剤。NKT細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞である。アクチビンA及び/又はVPAを添加した培地で培養する工程を含む、NKT細胞の培養方法。培地におけるアクチビンAの濃度が、5〜100ng/mlであり、培地におけるVPAの濃度が、3.9〜250μMである。【選択図】なし
Description
本発明は、アクチビンA及び/又はVPAを含む、NKT細胞培養のための添加剤、及びNKT細胞の培養方法に関する。
ナチュラルキラーT細胞(NKT)細胞は、ヒト末梢血T細胞のうち0.01〜0.1%しか存在せず、採取・培養が極めて困難な細胞である。
アクチビンAをT細胞の培養のために添加することは知られている(非特許文献1及び2)。アクチビンAを脂肪前駆細胞や心筋線維芽細胞といった間葉系細胞の培養のために添加することは知られている(非特許文献3及び4)。ES細胞又はiPS細胞から血球系前駆細胞を分化誘導するためにアクチビンAを添加することは知られている(非特許文献5および6)。その他、ES細胞から内胚葉系へ分化誘導する際に使用することや(非特許文献7)、ES細胞を維持培養する際に使用することが知られている(非特許文献8)。
バルプロ酸ナトリウム(VPA)については、一般的には、抗てんかん薬として知られる。また、最近iPS細胞樹立効率の向上のために使用できることが報告されている(非特許文献9)。
よって、アクチビンAについても、VPAについても、NKT細胞の機能修飾のために細胞培養培地へ添加することは知られていない。
Huber et al., The Journal of Immunology, 182: 4633-4640, 2009
Locci et al., Nature Immunology, 17: 976-986, 2016
Zagarosi et al., Diabetes, 59: 2513-2521, 2010
Hu et al., European Journal of Pharmacology, 789: 319-327, 2016
Kennedy et al., Cell Reports, 2: 1722-1735, 2012
Cerdan et al., Stem Cells and development, 21: 2866-2877, 2012
Wang et al., Biotechnol Lett, 37: 1711-1717, 2015
Beattie et al., Stem Cell, 23: 489-195, 2005
Huangfu et al., Nature Biotechnology, 26: 1269-1275, 2008
Fujii et al., Front Immunol, 4: 409, 2013
Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016
本発明は、従来、培養が困難であると認識されていた、NKT細胞を培養するための方法であって、好ましくは長期間、増殖させることができ、活性を維持又は増強することができる方法を探索することを課題とする。
本発明者らは鋭意研究の末、アクチビンA及び/又はVPAを、NKT細胞培養のための添加剤として使用することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の要旨は、以下である。
[1]アクチビンA及び/又はVPAを含む、NKT細胞培養のための添加剤。
[2]NKT細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞である、上記[1]記載の添加剤。
[3]アクチビンA及び/又はVPAを添加した培地で培養する工程を含む、NKT細胞の培養方法。
[4]NKT細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞である、上記[3]記載の培養方法。
[5]培地におけるアクチビンAの濃度が、5〜100ng/mlである、上記[4]記載の培養方法。
[6]培地におけるVPAの濃度が、3.9〜250μMである、上記[4]記載の培養方法。
[1]アクチビンA及び/又はVPAを含む、NKT細胞培養のための添加剤。
[2]NKT細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞である、上記[1]記載の添加剤。
[3]アクチビンA及び/又はVPAを添加した培地で培養する工程を含む、NKT細胞の培養方法。
[4]NKT細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞である、上記[3]記載の培養方法。
[5]培地におけるアクチビンAの濃度が、5〜100ng/mlである、上記[4]記載の培養方法。
[6]培地におけるVPAの濃度が、3.9〜250μMである、上記[4]記載の培養方法。
本発明により、従来には知られていなかった、アクチビンA及び/又はVPAの新たな用途が提供される。本発明による培養添加剤は、NKT細胞を、長期間、生存させることができ、また増殖させ、活性を維持又は増強させるという、優れた効果を有する。特に、VPAはNKT細胞のインターフェロンγ(IFNγ)産生も増強することから、本発明により培養されたNKT細胞を投与されたガン患者の生存期間を延長することが期待できる(非特許文献10)。
本発明は、アクチビンA及び/又はVPAを含む、NKT細胞培養のための添加剤、及びNKT細胞の培養方法を提供する。
本発明におけるアクチビンAとは、TGF−βファミリーに分類されるサイトカインであって、116〜117のアミノ酸鎖が2本結合したホモダイマーをいう。
本発明におけるVPAとは、バルプロ酸ナトリウムをいうが、遊離体及びその他の塩であってもよい。
本発明におけるNKT細胞とは、ナチュラルキラーT細胞をいい、特には末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞をいう。幹細胞から分化誘導されたNKT細胞としては、ES細胞又はiPS細胞から分化誘導されたNKT細胞が挙げられる。
本発明は、アクチビンA及び/又はVPAを添加した培地で培養する工程を含む、NKT細胞の培養方法を提供する。
典型的には、iPS−NKT細胞は、iPS細胞から造血幹細胞へ1次誘導させたのち、iPS−NKT細胞へ2次誘導させ、そののちiPS−NKT細胞を純化培養することにより、得られる。
アクチビンAを培地に添加する濃度は、5ng〜100ng/ml、好ましくは10ng〜50ng/mlであればよい。
VPAを培地に添加する濃度は、3.9〜250μM、好ましくは15.6〜250μMであればよい。
本発明によるNKT細胞の培養方法では、アクチビンAはiPS−NKT細胞の純化培養の初日〜純化培養終了まで培地に継続的に存在すればよい。
本発明によるNKT細胞の培養方法では、アクチビンAをiPS−NKT細胞への2次誘導の培養初日〜純化培養終了まで継続的に培地に存在させてもよい。
本発明によるNKT細胞の培養方法では、VPAをiPS−NKT細胞の純化培養の初日〜純化培養終了まで、好ましくは純化培養の7日目〜純化培養終了まで培地に存在させればよい。
本発明によるNKT細胞の培養方法では、VPAをiPS−NKT細胞への2次誘導の培養初日〜純化培養終了まで培地に存在させてもよい。
本発明によるNKT細胞の培養方法では、アクチビンA又はVPAを単独で添加してもよく、両者を同時に添加してもよく、アクチビンAを先に添加したのちにVPAを添加してもよく、またVPAを添加したのちにアクチビンAを添加してもよい。VPAはIFNγの産生を増強することから、アクチビンAを先に添加したのちにVPAを添加することが、好ましい。
本発明によれば、VPAでNKT細胞を前処理又は培養することにより、NKT細胞を活性化することを必要とする患者、例えばガン患者の体内においてNKT細胞を活性化できる。
実施例1 iPS−NKT細胞の樹立
iPS−NKT細胞は文献(非特許文献11:Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016)に記載される方法により樹立した。iPS細胞の樹立からiPS−NKT細胞の純化培養までのスキームを、図1に示す。
具体的には、図1に示されるように、iPS細胞にコロニーを形成させ(−8〜−5日目)、造血幹細胞への1次誘導をし(0〜13日目)、iPS−NKT細胞への2次誘導をし(13〜33日目)、そしてiPS−NKT細胞の純化培養をした(33〜40又は54日目)。
iPS−NKT細胞は文献(非特許文献11:Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016)に記載される方法により樹立した。iPS細胞の樹立からiPS−NKT細胞の純化培養までのスキームを、図1に示す。
具体的には、図1に示されるように、iPS細胞にコロニーを形成させ(−8〜−5日目)、造血幹細胞への1次誘導をし(0〜13日目)、iPS−NKT細胞への2次誘導をし(13〜33日目)、そしてiPS−NKT細胞の純化培養をした(33〜40又は54日目)。
(基本培地の組成)
12ウェルの培養プレートを用い、初期播種量2.5×105/1ml/ウェルで培養開始(0日目)した。培養開始から3日目および5日目に培地0.5mlを追加し、7日目および10日目に1mlを追加した。12日目からは培地1mlを2日ごとに交換し、21日目まで培養を継続した。20%ウシ血清添加αMEMにヒトIL7 (最終5ng/ml) およびIL15(最終10ng/ml) を添加したものを基本培地とした。
12ウェルの培養プレートを用い、初期播種量2.5×105/1ml/ウェルで培養開始(0日目)した。培養開始から3日目および5日目に培地0.5mlを追加し、7日目および10日目に1mlを追加した。12日目からは培地1mlを2日ごとに交換し、21日目まで培養を継続した。20%ウシ血清添加αMEMにヒトIL7 (最終5ng/ml) およびIL15(最終10ng/ml) を添加したものを基本培地とした。
実施例2 様々な濃度のアクチビンAを添加した培養液におけるiPS−NKT細胞の純化培養(1〜100ng/ml)
実施例1で調製した基本培地に対して、1〜100ngのアクチビンAを添加し、実施例1で調製したiPS−NKT細胞を純化培養した。
アクチビンAは、純化培養の初日(造血幹細胞の誘導から33日目)に加え、その後2週間(造血幹細胞の誘導から54日目まで)培養し(37℃・5%炭酸ガス)、細胞数の変化を経時的に記録した。結果を、図2に示す。
結果から、アクチビンAの添加により、純化培養の初日から2週間を超えるまで、iPS−NKT細胞の数は増大し続けることが確認された。
また、アクチビンAの添加量が、培養液に対して5ng/ml以上である場合に、特には10ng〜50ng/mlである場合に、細胞増殖の効果は、格別に優れていることが確認された。
本実施例で増殖したiPS−NKT細胞は、その標的細胞傷害活性を維持していた。
実施例1で調製した基本培地に対して、1〜100ngのアクチビンAを添加し、実施例1で調製したiPS−NKT細胞を純化培養した。
アクチビンAは、純化培養の初日(造血幹細胞の誘導から33日目)に加え、その後2週間(造血幹細胞の誘導から54日目まで)培養し(37℃・5%炭酸ガス)、細胞数の変化を経時的に記録した。結果を、図2に示す。
結果から、アクチビンAの添加により、純化培養の初日から2週間を超えるまで、iPS−NKT細胞の数は増大し続けることが確認された。
また、アクチビンAの添加量が、培養液に対して5ng/ml以上である場合に、特には10ng〜50ng/mlである場合に、細胞増殖の効果は、格別に優れていることが確認された。
本実施例で増殖したiPS−NKT細胞は、その標的細胞傷害活性を維持していた。
実施例3 様々な濃度のVPAを添加した培養液におけるiPS−NKT細胞の純化培養(3.9〜1000μM)
実施例1で調整した基本培地に対して、3.9〜1000μMのVPAを添加し、実施例1で調製したiPS−NKT細胞を純化培養した。
VPAは、純化培養の初日(造血幹細胞の誘導から33日目)に加え、その後1週間(造血幹細胞の誘導から40日目まで)培養し(37℃・5%炭酸ガス)、細胞数の変化とIFNγの産生能を記録した。結果を、図3に示す。
結果から、VPAの添加により、純化培養の初日から1週間を超えるまで、iPS−NKT細胞の数を増大させることが確認された。また、比較的高濃度のVPAの添加により、IFNγの産生能が上昇することが確認された。
VPAの添加量が、培養液に対して3.9μM〜250μMである場合に、細胞増殖の効果は格別に優れていることが確認され、培養液に対して15.6μM〜250μMである場合に、IFNγの産生能が格別に優れていることが確認された。
実施例1で調整した基本培地に対して、3.9〜1000μMのVPAを添加し、実施例1で調製したiPS−NKT細胞を純化培養した。
VPAは、純化培養の初日(造血幹細胞の誘導から33日目)に加え、その後1週間(造血幹細胞の誘導から40日目まで)培養し(37℃・5%炭酸ガス)、細胞数の変化とIFNγの産生能を記録した。結果を、図3に示す。
結果から、VPAの添加により、純化培養の初日から1週間を超えるまで、iPS−NKT細胞の数を増大させることが確認された。また、比較的高濃度のVPAの添加により、IFNγの産生能が上昇することが確認された。
VPAの添加量が、培養液に対して3.9μM〜250μMである場合に、細胞増殖の効果は格別に優れていることが確認され、培養液に対して15.6μM〜250μMである場合に、IFNγの産生能が格別に優れていることが確認された。
Claims (6)
- アクチビンA及び/又はVPAを含む、NKT細胞培養のための添加剤。
- NKT細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞である、請求項1記載の添加剤。
- アクチビンA及び/又はVPAを添加した培地で培養する工程を含む、NKT細胞の培養方法。
- NKT細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたNKT細胞である、請求項3記載の培養方法。
- 培地におけるアクチビンAの濃度が、5〜100ng/mlである、請求項4記載の培養方法。
- 培地におけるVPAの濃度が、3.9〜250μMである、請求項4記載の培養方法。
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JP2019040414A JP2020141593A (ja) | 2019-03-06 | 2019-03-06 | アクチビンa及び/又はvpaを含む、nkt細胞培養のための添加剤、及びnkt細胞の培養方法 |
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