CN105154400B - 多克隆抗乙肝病毒免疫细胞的扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫细胞技术领域，具体涉及多克隆抗乙肝病毒免疫细胞的扩增方法。发明通过将急性乙型肝炎恢复期患者的外周血单个核细胞分离后，用HBV抗原肽库联合IL‑7和Anti‑CD28抗体协同进行刺激，有效扩增抗原特异性细胞。本发明建立高效的抗原特异性细T细胞的扩增方法，对于研究HBV清除的免疫机制、有效评判临床预后具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞技术领域，主要涉及多克隆抗乙肝病毒免疫细胞的扩增方法。
背景技术
慢性乙型肝炎(CHB)在我国是高发传染病，由CHB逐步发展成肝硬化，到最后发展成肝癌是最常见的疾病进展“三部曲”。在我国80％以上的肝癌患者乙型肝炎病毒学(HBV)指标阳性，并且研究显示HBsAg阳性的乙肝患者发生肝癌的机会比阴性者高100倍以上，可见有效清除HBV对于阻断疾病进展、预防肝癌的发生非常重要。急性乙型肝炎和1-2％的慢性乙肝患者通过自身抗HBV免疫反应有效的清除病毒，在较短的时间内完成HBeAg血清学转换和HBsAg血清学转换，并建立起长期的免疫保护机制。进一步对患者发生HBsAg血清学转换前、转换中及转换后的临床样本的细致分析发现，抗原特异性T细胞作为机体清除病毒的主要效应性细胞，数量和频率的变化与病毒清除的效率和临床预转归密切相关。因此建立高效的抗原特异性细T细胞的扩增方法，对于研究HBV清除的免疫机制、有效评判临床预后具有重要意义。
为了解决抗原特异性T细胞扩增效率低下的问题，本发明提供了一种应用抗原特异性肽库联合细胞因子白细胞介素-7(IL-7)和Anti-CD28抗体协同进行细胞体外扩增的方法。发明通过将急性乙型肝炎恢复期患者的外周血单个核细胞分离后，用HBV抗原肽库联合细胞因子白细胞介素-7(IL-7)和Anti-CD28抗体进行刺激，有效扩增抗原特异性T细胞，包括HBV表面抗原特异性T细胞和HBV核心抗原特异性T细胞。此方法不仅能提高抗原特异性T细胞扩增的效率，而且能有效区分抗原特异性T细胞反应的表位特征，对于研究HBV清除的免疫机制、有效评判临床预后具有更为重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多克隆抗HBV免疫细胞的扩增方法，具体步骤为：
(1)选择急性乙型肝炎恢复期患者外周血的单个核细胞进行分离培养；
(2)进行HBV特异性抗原肽库联合细胞因子白细胞介素-7和Anti-CD28抗体协同刺激分离培养的外周血单个核细胞；
(3)对获得的外周血单个核细胞进行保存。
外周血单个核细胞(PBMC)分离方法包括但不限于：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)，用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077±0.01。
IL-7在免疫细胞增殖、成熟及活化过程中具有举足轻重的作用，能增强T细胞对特异性抗原刺激诱导的增殖能力。Anti-CD28抗体通过模拟T细胞的TCR激活共刺激信号，两者与抗原特异性肽库的联合，明显提升了抗原特异性T细胞扩增的效率。
进一步，HBV特异性抗原肽库为化学合成HBV特异性抗原肽库，包括HBV表面抗原肽库和HBV核心抗原肽库。HBV表面抗原肽库包括下下列4种：HBV ENV 1-110、HBV ENV 101-205、HBV ENV 196-300、HBV ENV 291-389，所述HBV核心抗原肽库包括下列2种：HBV core1-115、HBV core106-214。选用这6种HBV特异性抗原肽段分别刺激培养的外周血单个核细胞。
选择急性乙型肝炎恢复期患者其HBV血清学标志物为：HBsAg-、HBsAb+、HBeAb+、HBcAb+。其中上角标的正(+)负(-)分别表示阳性和阴性。
一种多克隆抗HBV免疫细胞的扩增方法，具体步骤为：
(1)材料选取：选取急性乙型肝炎恢复期患者的外周血(HBsAg-、HBsAb+、HBeAb+、HBcAb+)；
(2)采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单个核细胞；
(3)细胞因子白细胞介素-7和Anti-CD28抗体共同联合6种单独的HBV特异性抗原肽库刺激分离培养的外周血单个核细胞；
(4)对得到的外周血单个核细胞进行保存。
进一步的，可以对获得的外周血单个核细胞在液氮中进行长期保存，当需要时细胞复苏后进行检测。
本发明的目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含白细胞介素-7、Anti-CD28抗体和HBV特异性抗原肽库，所述HBV特异性抗原肽库选自下列6种HBV特异性抗原肽库中的一种：HBV ENV 1-110、HBV ENV 101-205、HBV ENV 196-300、HBV ENV 291-389、HBV core 1-115、HBV core106-214。该药物组合物能够有效增加外周血中抗原特异性T细胞的扩增效率。
一种多克隆抗HBV免疫细胞的检测方法，具体步骤为：
(1)选择急性乙型肝炎恢复期患者外周血的单个核细胞进行分离培养；
(2)进行HBV特异性抗原肽库联合细胞因子白细胞介素-7和Anti-CD28抗体协同刺激分离培养的外周血单个核细胞；
(3)对得到的外周血单个核细胞进行ELISPOT法检测。
进一步，HBV特异性抗原肽库为化学合成HBV特异性抗原肽库，包括HBV表面抗原肽库和HBV核心抗原肽库。HBV表面抗原肽库包括下列4种：HBV ENV 1-110、HBV ENV 101-205、HBV ENV 196-300、HBV ENV 291-389，所述HBV核心抗原肽库包括下列2种：HBV core 1-115、HBV core106-214。选用这6种HBV特异性抗原肽段分别刺激分离培养的外周血单个核细胞。
选择急性乙型肝炎恢复期患者其HBV血清学标志物为：HBsAg-、HBsAb+、HBeAb+、HBcAb+。其中上角标的正(+)负(-)分别表示阳性和阴性。
一种多克隆抗HBV免疫细胞的检测方法，具体步骤为：
(1)材料选取：选取急性乙型肝炎恢复期患者的外周血(HBsAg-、HBsAb+、HBeAb+、HBcAb+)；
(2)采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单个核细胞；
(3)细胞因子白细胞介素-7、Anti-CD28抗体联合HBV表面抗原肽库和/HBV核心抗原肽库刺激细胞；
(4)刺激后获得的抗原特异性T细胞通过ELISPOT法进行检测。
进一步，所述多克隆抗HBV免疫细胞的检测方法包括检测获得的抗原特异性T细胞分泌干扰素(IFN-γ)的情况。
本发明的目的在于提供上述方法制备抗HBV特异性免疫细胞、及其他们的检测方法。
本发明的有益效果：
(1)本发明选用HBV表面抗原肽库和核心抗原肽库进行细胞体外扩增，涵盖了HBV表面抗原和核心抗原的全部抗原表位，抗原特异性T细胞的检出效率显著提升。
(2)本发明选用HBV表面抗原肽库和核心抗原肽库联合细胞因子白细胞介素-7(IL-7)和Anti-CD28抗体协同进行细胞体外扩增的方法，提升了抗原特异性T细胞的扩增效率。
(3)本发明选择急性乙型肝炎自愈患者的外周血单个核细胞进行体外刺激，此类人群已经建立了HBV免疫保护机制，显著增加了抗HBV特异性T细胞扩增的效率。
附图说明
图1肽库联合IL-7和Anti-CD28抗体刺激细胞的ELISPOT检测结果
图2单纯肽库刺激细胞的ELISPOT检测结果
图3肽库联合IL-7刺激细胞的ELISPOT检测结果
图4肽库联合Anti-CD28抗体刺激细胞的ELISPOT检测结果
图5不同人群多克隆抗HBV免疫细胞的检测结果
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1材料的选择
收集解放军第302医院急性乙型肝炎恢复期患者的血液3份，选择乙肝肝炎血清学标志物检查结果(HBV血清学标志物检查)为：HBsAg-、HBsAb+、HBeAb+、HBcAb+的样本进行后续实验。
实施例2外周血单个核细胞分离
1.静脉取血(实施例1中血液)8ml，加入含肝素溶液(10～50u/m1血样本)的试管中，混匀，使血液抗凝。用pH7.2Hanks液将抗凝血稀释1倍。
2.吸取4ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45度角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。
3.在18℃～20℃下，用水平离心机以2000r/min离心20min。
4.用毛细吸管轻轻插到混浊带，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管中。即要吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成分。
5.用Hanks液洗涤细胞,2次，第一次2000r/min，10min；第2次1500r/min，10min，可去掉大部分混杂的血小板。
6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。
实施例3肽库合成
肽库组成包括表面抗原肽库4种，HBV ENV 1-110、HBV ENV 101-205、HBV ENV196-300、HBV ENV 291-389，核心抗原肽库2种HBV core 1-115、HBV core106-214，由赛百盛公司提供肽库定制服务。
实施例4HBV肽库刺激细胞及ELISPOT检测
4.1溶液配制
PBS：用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。
PBST：PBS加入0.05％Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25℃，可存放一个月。
70％乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。
30％乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。
包被抗体(mO-11-31-87)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。
封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液稀释10倍，每孔200μL。
抗体稀释液：用PBS将试剂盒中的稀释存储液稀释10倍。
检测抗体(mB-12-34-38)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。
酶联亲和素：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。
AEC显色液：照U-Cytech说明书，用100mL 30％乙醇溶解底物缓冲液胶囊，然后加入3.3mL AEC储存液，混合均匀后10mL每支分装，-20℃保存。使用时，解冻，每孔加入100μL。
PHA刺激物：将储存液(2mg/ml，Murex)分装成20μL/EP管，-20℃长期冻存。使用时，加入980μL U-Cytech无血清培养基(或者含10％血清的1640培养基)，成为工作液(40μg/mL，10倍终浓度)，每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。
4.2ELISPOT标准操作程序
(1)ELISPOT包被程序
1.每孔加入15μL 70％的乙醇预湿30秒。
2.加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。
3.按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4℃包被过夜。
4.第二天倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。
5.加入200μL封闭液，37℃封闭1小时。
6.倾倒封闭液，用PBS缓冲液洗涤一次，拍干，备用。
(2)铺细胞，加入刺激物，培养。
1.对照的设置：整个实验设置一组阳性对照(PHA刺激)，每一个细胞样品要设一个阴性对照(不加刺激物)。
2.填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一份标本设立单纯肽库/肽库联合单一刺激物/刺激物组合刺激的平行对照，刺激顺序为：
3.取出封闭好的板，准备加入细胞。
4.按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀。细胞浓度为5 105/well。
5.加入100μL的U-Cytech无血清培养基到阴性对照孔。
6.阳性对照孔加入10μL PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。
7.按照实验方案分别加入刺激物(肽段终浓度1mg/ml,1ul/孔；IL-7终浓度0.1ug/ml,1ul/孔；Anti-CD28终浓度1ug/ml,1ul/孔)到实验孔。
8.当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37℃培养24-28小时。
(3)培养后操作
1.倾倒孔内的细胞及培养基。
2.低渗法将细胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。
3.每孔用200μLPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。
4.按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37℃ 1小时。
5.每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。
6.按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μL，37℃1小时。
7.每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。
8.照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。
9.待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。
10.将ELISPOT板置于Biosys Bioreader4000PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，半点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。
4.3实验结果
ELISPOT实验结果显示：与用单纯肽库刺激(结果见图2)相比，肽库联合IL-7刺激细胞后斑点增加不明显(结果见图3)，肽库联合Anti-CD28抗体刺激细胞后斑点虽有增加但是增幅不大(结果见图4)，但是，出人意料的是，肽库联合IL-7和Anti-CD28抗体刺激的细胞斑点明显增多(结果见图1)，表明肽库联合IL-7和Anti-CD28抗体刺激细胞能够有效的提高抗原特异性T细胞扩增的效率。
实施例5不同人群多克隆抗HBV免疫细胞的检测
5.1材料的选择
收集解放军第302医院急性乙型肝炎患者和健康志愿者的血液各3份进行后续实验，急性乙型肝炎患者乙肝五项检查结果(HBV血清学标志物检查)为：HBsAg-、HBsAb+、HBeAb+、HBcAb+，健康志愿者乙肝五项检查结果(HBV血清学标志物检查)为：HBsAg-、HBsAb+、HBeAb-、HBcAb-。
5.2外周血单个核细胞分离
1.静脉取血(实施例5.1中血液)8ml，加入含肝素溶液(10～50u/m1血样本)的试管中，混匀，使血液抗凝。用pH7.2Hanks液将抗凝血稀释1倍。
2.吸取4ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45度角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。
3.在18℃～20℃下，用水平离心机以2000r/min离心20min。
4.用毛细吸管轻轻插到混浊带，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管中。即要吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成分。
5.用Hanks液洗涤细胞2次。第一次2000r/min，10min；第2次1500r/min，10min，可去掉大部分混杂的血小板。
6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。
5.3肽库合成
肽库组成包括表面抗原肽库4种，HBV ENV 1-110、HBV ENV 101-205、HBV ENV196-300、HBV ENV291-389，核心抗原肽库2种HBV core 1-115、HBV core106-214，由赛百盛等公司提供肽库定制的服务。
5.4HBV肽库刺激细胞及ELISPOT检测
一、溶液配制
PBS：用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制，高压灭菌。
PBST：PBS加入0.05％Tween-20，注意无菌操作。储存于20-25℃，可存放一个月。
70％乙醇：分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。
30％乙醇：分析纯乙醇30mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。
包被抗体(mO-11-31-87)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50μL。
封闭液：用PBS将试剂盒中的封闭存储液稀释10倍，每孔200μL。
抗体稀释液：用PBS将试剂盒中的稀释存储液稀释10倍。
检测抗体(mB-12-34-38)：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。
酶联亲和素：照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100μL。
AEC显色液：照U-Cytech说明书，用100mL 30％乙醇溶解底物缓冲液胶囊，然后加入3.3mL AEC储存液，混合均匀后10mL每支分装，-20℃保存。使用时，解冻，每孔加入100μL。
PHA刺激物：将储存液(2mg/ml，Murex)分装成20μL/EP管，-20℃长期冻存。使用时，加入980μL U-Cytech无血清培养基(或者含10％血清的1640培养基)，成为工作液(40μg/mL，10倍终浓度)，每孔加入10μL，终浓度4μg/mL。
二、ELISPOT标准操作程序
(1)ELISPOT包被程序
1.每孔加入15μL70％的乙醇预湿30秒。
2.加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。
3.按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4℃包被过夜。
4.第二天倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。
5.加入200μL封闭液，37℃封闭1小时。
6.倾倒封闭液，用PBS缓冲液洗涤一次，拍干，备用。
(2)铺细胞，加入刺激物，培养。
1.对照的设置：整个实验设置一组阳性对照(PHA刺激)，每一个细胞样品要设一个阴性对照(不加刺激物)。
2.填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一份标本设立刺激物组合刺激的平行对照，刺激顺序为：
3.取出封闭好的板，准备加入细胞。
4.按照实验卡片的安排，加入细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀。细胞浓度为5 105/well。
5.加入100μL的U-Cytech无血清培养基到阴性对照孔。
6.阳性对照孔加入10μL PHA，终浓度4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。
7.加入刺激物(肽段终浓度1mg/ml,1ul/孔；IL-7终浓度0.1ug/ml,1ul/孔；Anti-CD28终浓度1ug/ml,1ul/孔)到实验孔。
8.当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37℃培养24-28小时。
(3)培养后操作
1.倾倒孔内的细胞及培养基。
2.低渗法将细胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。
3.每孔用200μLPBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干。
4.按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37℃1小时。
5.每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。
6.按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μL，37℃1小时。
7.每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。
8.照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。
9.待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。
10.将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000PRO自动读板仪内，调节好合适的参数，半点计数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。
三、实验结果
ELISPPOT实验结果显示：肽库联合IL-7和Anti-CD28抗体刺激的细胞斑点明显增多(结果见图5)，表明肽库联合IL-7和Anti-CD28抗体刺激细胞能够有效的提高抗原特异性T细胞扩增的效率，有利于实验及临床检测中区分急性乙型肝炎患者和健康人群。
Claims (4)
1.一种多克隆抗HBV免疫细胞的扩增方法，具体步骤为：
（1）选择急性乙型肝炎恢复期患者外周血的单个核细胞进行分离培养；
（2）进行HBV特异性抗原肽库联合细胞因子白细胞介素-7和Anti-CD28抗体协同刺激分离培养的外周血单个核细胞；
(3)对获得的外周血单个核细胞进行保存；
其中，所述抗原肽库选自下列6种HBV特异性抗原肽库中的一种：HBV ENV 1-110、HBVENV 101-205、HBV ENV 196-300、HBV ENV 291-389、HBV core 1-115、HBV core106-214。
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，急性乙型肝炎恢复期患者HBV血清学标志物为：HBsAg-、HBsAb+、HBeAb+、HBcAb+。
3.一种药物组合物，所述药物组合物包含白细胞介素-7、Anti-CD28抗体和HBV特异性抗原肽库，其特征在于，所述抗原肽库选自下列6种HBV特异性抗原肽库中的一种：HBV ENV1-110、HBV ENV 101-205、HBV ENV 196-300、HBV ENV 291-389、HBV core 1-115、HBVcore106-214。
4.一种采用权利要求1所述的扩增方法制备的细胞。
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| Title |
|---|
| 慢性乙型肝炎患者干扰素治疗前后血清IL-7及调节性T细胞的变化;童新灯等;《胃肠病学和肝病学杂志》;20150320;第24卷(第03期);第313-315页 * |
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