TWI753442B - 一種體外活化免疫細胞之方法 - Google Patents

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本發明係關於一種體外活化免疫細胞之方法，該方法係以含有Muparfostat之培養基進行周邊血單核球細胞之培養，有效抑制自然殺手細胞及T細胞於細胞表面表現LAG-3，藉由阻斷細胞抑制性訊號的傳遞，增強自然殺手細胞及T細胞的活性。

Description

一種體外活化免疫細胞之方法
本發明係關於一種體外活化免疫細胞之方法。
免疫細胞治療是將病人本身的免疫細胞在體外增殖和活化後，再回輸至體內的一種治療方式。目前免疫細胞治療已逐漸被應用於癌症治療上，成功的關鍵在於瞭解各類免疫細胞的特性和功能，並根據癌症患者的狀況及基因特性來選擇最合適的免疫細胞類型，例如自然殺手細胞(NK細胞)、T細胞等。
免疫細胞存在於周邊血液。自血液分離出的周邊血單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中，存在數種類型的細胞，包含血球細胞、淋巴球細胞及血小板。其中，淋巴球細胞即包含NK細胞、T細胞、NKT細胞、B細胞等免疫細胞。
由於NK細胞及T細胞之活性係受到活化或抑制性受體的調控。其中，表現於NK細胞及T細胞表面的LAG-3，屬於抑制性的受體，亦稱為免疫檢查點。當LAG-3與其配體結合時，將對NK細胞或T細胞傳導抑制性的訊息，進而抑制NK細胞或T細胞的活性。因此以NK細胞及T細胞進行細胞療法的挑戰在於是否能夠使該細胞持續被活化，不被抑制性受體的訊息所抑制。近幾年發現，使用抗LAG-3抗體能夠阻斷LAG-3所傳導之抑制性訊息，促進NK細胞或T細胞活化。然而，抗LAG-3抗體用於培養細胞僅提供暫時性的阻斷效果，不但成本高且LAG-3抗體尚於試驗階段，注射至人體內仍存在一定疑慮，因此仍極需要開發出一種方便、有效、安全的體外活化免疫作用細胞之方法。
Muparfostat，又稱為PI-88，是天然酵母菌發酵產物經磺化所得的磺酸化單磷酸甘露寡聚糖，已知為乙醯肝素酶抑制劑(heparinase inhibitor)，具有抑制血管新生及抑制癌細胞轉移的效果。Muparfostat應用於體外免疫細胞培養方法與效用，目前未有相關研究。
本發明於一方面，係提供一種體外活化免疫細胞之方法，其包含以下步驟：自一血液檢體分離出周邊血單核球細胞；自該周邊血單核球細胞懸浮於一含有Muparfostat之培養基並置於一細胞培養盤中；每日於該培養基添加Muparfostat，培養4至18天。
在一具體實施例中，前述Muparfostat每日於培養基添加的量係300μg/ml；在一較佳實施例中，前述培養基另包含基礎培養基及細胞激素。在另一較佳實施例中，該細胞激素係介白素2；其中該介白素2於該培養基之濃度係介於500至1000IU/ml。
在一具體實施例中，前述免疫細胞包含自然殺手細胞及T細胞。
本發明於另一方面，係提供一種體外抑制免疫細胞表現LAG-3之方法，其包含以下步驟：自一血液檢體分離出周邊血單核球細胞；自該周邊血單核球細胞懸浮於一含有Muparfostat之培養基並置於一細胞培養盤中；每日於該培養基添加Muparfostat，培養4至18天。
前面的概述，以及本發明以下的詳細描述，在結合圖式一起閱讀時將可以被更好地理解。為了說明本發明，所附圖式示出一些，但不是所有的，可替代的具體實施例。然而，應該理解的是，本發明並不限於所示的精確安排和手段。這些圖式，其被併入並構成說明書的一部分，有助於解釋本發明的原理。
第1圖係本發明之免疫細胞體外活化方法流程圖。
第2圖係依本發明培養PBMC後，針對表現LAG-3的自然殺手細胞進行數量分析。
第3圖係依本發明培養PBMC後，針對細胞中LAG3蛋白質的表現量進行分析。
第4圖係依本發明培養PBMC並將其與一癌細胞株共同培養後，針對表現LAG-3的T細胞進行數量分析。其中，第4圖A為PBMC與A549癌細胞株共同培養之分析結果；而第4圖B為PBMC與HepG2癌細胞株共同培養之分析結果。
第5圖係依本發明培養PBMC並將其與一癌細胞株共同培養後，針對表現LAG-3的自然殺手細胞(NK細胞)進行數量分析。其中，第5圖A為PBMC與A549癌細胞株共同培養之分析結果；而第5圖B為PBMC與HepG2癌細胞株共同培養之分析結果。
有鑑於上述待解決之問題，本發明提出一種體外活化免疫細胞之方法，該方法係以含有Muparfostat之培養基進行周邊血單核球細胞之培養，有效抑制自然殺手細胞及T細胞於細胞表面表現LAG-3，藉由阻斷細胞抑制性訊號的傳遞，增強自然殺手細胞及T細胞的活性。
定義
除非另有定義，所有在此使用的技術及科學術語，具有與本發明所屬領域之通常知識者一般所理解的意義相同的意義。當有所衝突時，以本文件及其所定義者為準。
於此處所使用者，「約」、「大約」、或「大概」一般應指一特定數值或範圍的20%以內，較佳10%以內，及更佳5%以內。在此所使用的數值為近似值，代表若未明示地陳述，「約」、「大約」、或「大概」等詞可以被推斷適用。
於本發明中，「自然殺手細胞」(natural killer cell)或「NK細胞」係指細胞表面抗原呈現CD3- CD56+的細胞。
於本發明中，「T細胞」(T cell)係指細胞表面抗原呈現CD3+的細胞。
於本發明中，「免疫細胞」係指周邊血單核球細胞中的淋巴球細胞。
於本發明中，免疫細胞被「活化」係以下列方式判斷：當NK細胞或T細胞不表現LAG-3時，該NK細胞或該T細胞具有較佳的活性。
材料與方法
本發明所述周邊血檢體，係依據倫理委員會通過之計畫，自受試者手臂採集全血，置於無菌採血管，於室溫存放待後續處理。
本發明所使用之基礎培養基可選用自：CellGro SCGM(CellGenix公司)、KBM 501(Kohjin Bio公司)、AIM-V(Thermo Fisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM或RPM1-1640等市售之基礎培養基。
本發明所述培養基中，有時含有適當的蛋白質、細胞激素、抗體、血清、化合物等成分。所述細胞激素有時為介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-7(IL-7)、介白素-12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)或介白素-21(IL-21)。
製備muparfostat(PI-88)及包含其中的硫化磷酸甘露聚醣成份之方法已被美國專利公開號20140135282以及P.N.Handley等人所揭示(2017年)。P.N.Handley等人發表於醣類研究446-447第68至75頁之「對酵母菌Pichia(Hansenula)holstii NRRL Y2448磷酸甘露聚醣之寡糖磷酸鹽級分的新結構洞悉」一文中，揭示了PI-88的硫化磷酸甘露聚醣成份之以下化學結構通式：
Figure 109118017-A0101-12-0006-1
自血液檢體分離周邊血單核球細胞之方法
抽取7.5-8ml之血液於採血管中，該採血管含有抗凝血劑-肝素，以及Ficoll-Hypaque試劑，外加一聚脂凝膠隔層以分離前述二液體。於 室溫下以1800g將採血管離心20分鐘。離心完成後，收集血漿分層用於後續之細胞培養，並留下5至10mm的血漿層於介面上，操作時不擾動細胞層。接著以移液器收集介面的周邊血單核球細胞層至15ml圓錐形管中，以10ml磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Phosphate buffer saline；簡稱PBS)清洗PBMC並翻轉圓錐形管5次，再以400g進行離心5分鐘。重複前述清洗步驟兩次之後，以5ml的PBS將細胞再懸浮。計算細胞數，通常1ml全血能夠分離出1.3x106的PBMC。
體外活化免疫細胞之方法
將PBMC以每孔1 x 106細胞的密度置於六孔細胞培養盤，並加入培養基，在37℃及5% CO2的環境下培養。所述培養基係以AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)為基礎培養基，並添加濃度範圍介於500~1000IU/ml的介白素-2(Novartis公司)，以及添加濃度為300μg/ml的Muparfostat。此後，每隔二至三天觀察細胞之生長狀況，依細胞生長狀況更換新鮮的NK細胞培養基至第18天為止。培養期間，每隔二至三天添加濃度範圍介於500~1000IU/ml的介白素-2(Novartis公司)；每日添加濃度為300μg/ml的Muparfostat。最後，將培養盤中的細胞與培養基混合液移至離心管，以離心方式收集所述混合液中之細胞，再以PBS清洗，重複此步驟三次後，以PBS將細胞均勻的打散，如此即獲得活化後的免疫細胞。
以流式細胞儀分析細胞表面抗原
以2x105細胞/200μl將活化後的細胞置於96孔盤，並加入3μl螢光標記之抗體於4℃反應30分鐘，接著以PBS清洗3次後，加入400μl之PBS懸浮細胞，再以流式細胞儀分析細胞表面之螢光標記。上述螢光標記之抗體包含anti-CD3抗體(clone UCTH1)、anti-CD56抗體(clone HCD56)以及anti-LAG-3抗體(clone 11C3C65)。
PBMC與癌細胞株共同培養之測試
將1 x 106的A549癌細胞株及3 x 106的HepG2癌細胞株置於T25細胞培養瓶中，添加適量培養基後培養一天。隔日，將癌細胞株以PBS清洗後，與新鮮製備的3 x 106的周邊血單核球細胞共同培養，在37℃及5% CO2的環境下培養至第四天。每日於實驗組之培養基添加濃度為300μg/ml的Muparfostat；對照組則於培養期間不添加Murpafostat。第四天，將細胞與培養基混合液移至離心管，以離心方式收集所述混合液中之細胞，再以PBS清洗以2x105細胞/200μl將活化後的細胞置於96孔盤，並加入3μl螢光標記之抗體於4℃反應30分鐘，接著以PBS清洗3次後，加入400μl之PBS懸浮細胞，再以流式細胞儀分析細胞表面之螢光標記。上述螢光標記之抗體包含anti-CD3抗體(clone UCTH1)、anti-CD56抗體(clone HCD56)以及anti-LAG-3抗體(clone 11C3C65)。
以西方墨點法分析LAG-3蛋白質表現
將周邊血單核球細胞以第[0028]段所述的方法培養至第18天後，以RIPA溶液(Tris-HCl 50mM pH 7.5,NaCl 150mM,NP-40 1%,SDS 0.1%) 裂解培養後的PBMC以及CMV3-His-LAG-3轉殖的293ft細胞(陽性對照組)。以12%的SDS-PAGE分離來自PBMC及293ft細胞的蛋白質，並將蛋白質轉印至PVDF膜(BIO-RAD公司)。所述PVDF膜預先以含有4%小牛血清(BSA)的PBS於室溫下進行封閉一小時。接著，將PVDF模與一級抗體結合，該抗體包含anti-LAG-3(17B4)抗體(以1：1000的比例添加；Novus Biologicals公司)以及anti-GAPDH(GT239)抗體(GeneTex公司)。將PVDF膜以PBST清洗三次，每次十分鐘，再加入二級抗體Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG+IgM(H+L)抗體(以1：10000的比例添加；Jackson ImmunoResearch Inc公司)，於室溫下反應一小時。接著，將PVDF膜以PBST清洗三次後，以Trident femto Western HRP Substrate(GeneTex公司)偵測訊號。最後以ImageJ影像分析程式判讀相對的蛋白質量。
實施例
實施例1、培養基添加Muparfostat之培養結果
第2圖係依本發明培養PBMC後，針對表現LAG-3的自然殺手細胞進行數量分析。由第2圖可發現，當培養基未添加Muparfostat，在第18天，表現LAG-3的自然殺手細胞(即表面抗原為LAG-3+CD3-CD56+之細胞)佔PBMC中NK細胞總數的83%；相較於此，當每日於培養基添加濃度為300μg/ml的Muparfostat，在第18天，LAG-3+CD3-CD56+細胞數量下降，只佔NK細胞總數的64%。此結果顯示，於培養基添加Muparfostat有效增加不表現LAG-3的NK細胞數，該類NK細胞具有較佳的活性。
為進一步探究Muparfostat對於活化免疫細胞之作用機制，針對細胞中LAG3蛋白質的表現量進行分析。第3圖係依本發明培養PBMC後，針對細胞中LAG3蛋白質的表現量進行分析。結果顯示，相較於未添加Muparfostat的對照組，添加Muparfostat培養後的PBMC，其LAG-3蛋白質的表現量為對照組的58%。由第3圖可發現，Muparfostat有助於抑制LAG-3蛋白質於免疫細胞的表現量，進而阻斷LAG-3所傳遞的抑制性訊息，達到活化免疫細胞的效果。
實施例2、與癌細胞株共同培養的測試結果
為模擬免疫細胞與癌細胞互動的情境，本實施例係將PBMC與癌細胞株共同培養。所述癌細胞株包含A549癌細胞株(非小細胞肺癌細胞株)以及HepG2細胞株(肝癌細胞株)。第4圖係依本發明培養PBMC並將其與癌細胞株共同培養後，針對表現LAG-3的T細胞進行數量分析。其中，第4圖A為PBMC與A549癌細胞株共同培養之分析結果，該結果顯示，在未添加Muparfostat的對照組中，表現LAG-3的T細胞佔PBMC總數的5.3%，而在添加Muparfostat的實驗組中，表現LAG-3的T細胞數量減少，僅佔PBMC總數的3.2%。第4圖B為PBMC與HepG2癌細胞株共同培養之分析結果，該結果顯示，在未添加Muparfostat的對照組中，表現LAG-3的T細胞佔PBMC總數的5.2%，而在添加Muparfostat的實驗組中，表現LAG-3的T細胞數量明顯減少，僅佔PBMC總數的1%。
第5圖係依本發明培養PBMC並將其與一癌細胞株共同培養後，針對表現LAG-3的自然殺手細胞(NK細胞)進行數量分析。其中，第5圖A為PBMC與A549癌細胞株共同培養之分析結果，該結果顯示，在未添加Muparfostat的對照組中，表現LAG-3的NK細胞佔PBMC總數的5%，而在添加Muparfostat的實驗組中，表現LAG-3的NK細胞數量減少，僅佔PBMC總數的3.2%。第5圖B為PBMC與HepG2癌細胞株共同培養之分析結果，該結果顯示，在未添加Muparfostat的對照組中，表現LAG-3的NK細胞佔PBMC總數的7.7%，而在添加Muparfostat的實驗組中，表現LAG-3的NK細胞數量明顯減少，僅佔PBMC總數的1.5%。綜上，於培養基添加Muparfostat有效增加不表現LAG-3的NK細胞數量及T細胞數量，該類NK細胞及T細胞具有較佳的活性，因此可達到活化免疫細胞的效果。

Claims (8)

  1. 一種體外活化T細胞或自然殺手細胞之方法，其包含以下步驟：(a)自一血液檢體分離出周邊血單核球細胞；(c)將該周邊血單核球細胞懸浮於一含有Muparfostat之培養基並置於一細胞培養盤中培養；以及(d)每日於該培養基添加Muparfostat，培養4至18天。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該Muparfostat每日於培養基添加的量係300μg/ml。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該培養基另包含基礎培養基以及介白素2。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該介白素2於該培養基之濃度係介於500至1000 IU/ml。
  5. 一種體外抑制T細胞或自然殺手細胞表現LAG-3之方法，其包含以下步驟：(a)自一血液檢體分離出周邊血單核球細胞；(c)將該周邊血單核球細胞懸浮於一含有Muparfostat之培養基並置於一細胞培養盤中培養；以及(d)每日於該培養基添加Muparfostat，培養4至18天。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該Muparfostat每日於培養基添加的量係300μg/ml。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該培養基另包含基礎培養基以及介白素2。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該介白素2於該培養基之濃度係介於500至1000 IU/ml。
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Pisano C., et al., "The potential of heparanase as a therapeutic target in cancer", Biochem Pharmacol. 2014 May 1; 89(1): 12–19. doi:10.1016/j.bcp.2014.02.010. *

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