CN116426474A - 一种脐血来源的uct细胞的制备方法与抗肿瘤的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，针对现有技术抗胃癌作用小，对肿瘤细胞杀伤力小，增殖能力差，杀伤活性差，原料短缺，无法广泛应用等问题，现提出如下方案，包括以下步骤：S1：脐带血制备；本发明的目的是通过脐血CIK细胞在培养后3天开始增殖，5‑6天开始迅速增殖制备性能最佳的UCT细胞，其CD3+CD8+细胞比例明显高于单纯CIK，CD3+CD8+细胞分泌的IFN‑γ、TNF‑α和IL‑8明显高于单纯CIK细胞。增强对胃癌细胞的杀伤作用，通过调节免疫系统间接杀伤胃癌细胞，UCT细胞明显增殖，增强了其抗胃癌作用，脐带血原料来源广泛，容易解决原料短缺的问题，可广泛用于UCT细胞共培养的临床应用。

Description

一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用。
背景技术
细胞免疫治疗是提高免疫系统抗肿瘤活性的一种很有前途的策略。基于利用免疫系统的概念，基于细胞的免疫治疗方法已经发展了几个概念，包括LAK、TIL、CAR-T、NK和CIK过继细胞治疗或基于DC的免疫治疗的癌症疫苗。树突状细胞(DC)是最强大和唯一专业的抗原呈递细胞，可以激活naïve T细胞。树突状细胞作为免疫反应的启动体，在介导免疫细胞的抗肿瘤活性方面发挥着重要作用。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIKs)是由抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子诱导的一组异质细胞。CIK细胞结合了T细胞的抗肿瘤活性和类似自然杀伤细胞（NK）的非主要组织相容性复合体（MHC）限制性杀伤功能，在恶性肿瘤的免疫治疗中具有广阔的前景。尽管绝大多数脐带血的经验集中在造血重建上，但对脐带血细胞亚群知识的激增以及体外培养技术的进步扩大了这一丰富资源的潜力。因为脐带血有能力产生整个造血系统，我们现在有了一个新的NK细胞来源，DC细胞和T细胞用于治疗恶性肿瘤。
胃癌是一种恶性肿瘤，其发生与饮食习惯、遗传因素以及其他胃部疾病的存在有高度的相关性。如果早期胃癌未得到及时诊断，晚期胃癌患者5年生存率低于20%。近年来，免疫疗法的迅速发展弥补了传统疗法的不足。细胞免疫疗法，如淋巴因子激活杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)等免疫细胞，已迅速发展成为仅次于手术、放疗、化疗的第四线癌症治疗方法。多项研究表明DC-CIK可有效治疗多种实体肿瘤，包括非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌等，且无严重不良反应。目前，外周血(PB)是DC-CIK的主要来源。但在老年患者中重复采集PB比较困难，健康状况较差的癌症患者无法获得足够数量的抗肿瘤T淋巴细胞。脐血来源的CIK细胞(CB-CIK)可以很容易地获得并在体外大量扩增。在多种类型的肿瘤中，CB-CIK可导致肿瘤细胞死亡。与PB-CIK (PB-CIK)相比，CB-CIK具有增殖率提高、免疫原性降低、主要功能组分CD3+CD56+细胞比例较高、抗各种恶性肿瘤的能力更强等优点。然而，关于脐血来源的DC-CIK细胞，以及NK细胞的混合培养及诱导刺激的方法在临床应用报道甚少。因此，为了有效清除胃癌患者残留的胃癌细胞，降低胃癌患者的复发率，观察发现UCT细胞对胃癌SGC7901细胞具有明显杀伤作用的影。
自然杀伤细胞(NK)是先天免疫系统的淋巴细胞，能够杀死不同的靶细胞，如癌细胞和病毒感染的细胞，而无需事先激活，使其成为癌症免疫治疗的有吸引力的候选细胞。脐带血作为NK细胞来源用于免疫治疗也受到限制，因为脐血NK细胞数量少。此外，DC和CIK结合，通过分泌趋化因子，促进效应T细胞在肿瘤部位周围的积累，会提高肿瘤治疗的疗效。在我们的研究中，可以从脐血中分离出脐血单个核细胞，并很容易导入DC - CIK。脐血DC-CIK以及NK效应细胞容易扩增，以一定比例混合培养，培养期结束时至少可以在患者体内注入1×1010个UCT细胞。在体外，CB-DC-CIK可诱导胃癌细胞死亡，产生大量的细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，增强对肿瘤的杀伤作用。因此，我们提出一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术抗胃癌作用小，对肿瘤细胞杀伤力小，增殖能力差，杀伤活性差，原料短缺，无法广泛应用等问题，而提出的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，包括以下步骤：
S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存；
S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液；
S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤；
S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天；
S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合；
S6：MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，检测免疫表型和细胞因子表达。
优选的，所述S1中，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，在依照GMP标准设立的实验室中，使用全自动脐带血制备系统，在封闭状态下通过离心，完成脐带血造血干细胞的分离，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
优选的，所述S2中，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离单核细胞（MNC）并用无血清RPMI 1640洗涤分离液，在RPMI 1640培养基中培养，将粘附细胞悬浮在RPMI 1640培养基中2h，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4 500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rh TNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
优选的，所述S3中，CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤，将MNC细胞浓度调整为1×106/mL，1000 U/ mL的IFN-α加入到里面然后在二氧化碳培养箱中培养，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300 U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
优选的，所述S4中，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天，浓度为2 ×106细胞/ml，在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中添加2000 UIL-2/mL（中国四环生物制药公司）、0.01KE/mL A组链球菌（中国路亚制药公司）、5 μM唑来膦酸盐（诺华制药公司）、IL-2/mL(四环生物制药，中国) 、0.01KE/mL A组链球菌(鹿亚制药，中国)和5μM唑来膦酸盐(诺华制药)。
优选的，所述S5中，DC与CIK细胞共培养，将第一步中培养5天的成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，计数后按1:5的比例培养，含有500 U/mL rh IL-2的培养基。
优选的，所述S5中，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束，我们将培养至十二天的这群细胞称作UCT（脐血来源的细胞因子诱导的抗原特异性T细胞Umbilical cord blood-derived cytokines induced by antigen-specific T cells）。
优选的，所述S6中，MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，以SGC7901细胞为靶细胞，以培养12 天的CIK和UCT细胞为效应细胞，按5:1、10:1和20:1的比例混合，取胃癌SGC7901细胞，取对数生长期，浓度调整为1×105/mL，按效靶比分别调整CIK和UCT细胞，将分为实验组、效应细胞组和靶细胞组，每组有3个平行孔，实验组分别加效应细胞和靶细胞100 μL，效应细胞组分别加入效应细胞和1640培养基100 μL，靶细胞组分别加入靶细胞和1640培养基100 μL，所有细胞在37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后加入10 μL的MTT试剂，4h后加入100 μL的甲臜溶液，4h后，用自动免疫分析仪在570nm波长处测量吸光度，杀死率计算如下：
（%）=[1-（一个效应靶细胞孔值-一个效应细胞孔值）/一个靶细胞孔值]*100%
检测免疫表型和细胞因子表达，收集培养第八天的细胞，将细胞调整至最终浓度2×106 cells/mL，用流式细胞术检测CIK细胞、UCT细胞的免疫表型，ELISA法测定细上清IFN-γ、IL-8、TNF-α含量。
一种脐血来源的UCT细胞的制备用于抗肿瘤的应用。
本发明的有益效果为：
1、采用UCT对肿瘤细胞的直接杀伤作用，与CIK相比，UCT具有明显的增殖和杀伤活性。
2、研究结果显示UCT细胞可增强肿瘤细胞SGC7901的摄取，促进抗肿瘤作用，提高免疫力的能力，UCT细胞可引起肿瘤细胞免疫原性细胞死亡（ICD）。
本发明的目的是脐血CIK细胞在培养后3天开始增殖，5-6天开始迅速增殖。在培养脐血CIK，和NK细胞的第七天，发现UCT细胞的增殖明显大于单纯CIK细胞以及NK细胞。本专利中制备了性能最佳的UCT细胞，其CD3+ CD8+细胞比例明显高于单纯CIK， CD3+ CD8+细胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-8明显高于单纯CIK细胞，增强了对胃癌细胞的杀伤作用，通过调节免疫系统间接杀伤胃癌细胞，UCT细胞明显增殖，增强了其抗胃癌作用。脐带血原料来源广泛，容易解决原料短缺的问题，也不容易引起免疫排斥反应，可广泛用于UCT细胞共培养的临床应用。
附图说明
图1是本发明提出的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用的流程示意图；
图2是本发明提出的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用的实施例一的流程图或系统图；
图3是本发明提出的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用的实施例二的流程图或系统图。
实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例
参照图1-2，一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，包括如下步骤：
S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存；
S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液；
S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤；
S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天；
S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合；
S6：MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，检测免疫表型和细胞因子表达。
本实施例中，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，在依照GMP标准设立的实验室中，使用全自动脐带血制备系统，在封闭状态下通过离心，完成脐带血造血干细胞的分离，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
本实施例中，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离单核细胞（MNC）并用无血清RPMI 1640洗涤分离液，在RPMI 1640培养基中培养，将粘附细胞悬浮在RPMI 1640培养基中2h，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4 500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rh TNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
本实施例中，CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI1640培养基洗涤，将MNC细胞浓度调整为1×106/mL，1000 U/ mL的IFN-α加入到里面然后在二氧化碳培养箱中培养，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300 U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
本实施例中，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天，浓度为2 ×106细胞/ml，在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中添加2000 UIL-2/mL（中国四环生物制药公司）、0.01KE/mL A组链球菌（中国路亚制药公司）、5 μM唑来膦酸盐（诺华制药公司）、IL-2/mL(四环生物制药，中国) 、0.01KE/mL A组链球菌(鹿亚制药，中国)和5μM唑来膦酸盐(诺华制药)。
本实施例中，DC与CIK细胞共培养，将第一步中培养5天的成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，计数后按1:5的比例培养，含有500 U/mL rh IL-2的培养基。
本实施例中，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束，我们将培养至十二天的这群细胞称作UCT（脐血来源的细胞因子诱导的抗原特异性T细胞Umbilical cord blood-derived cytokines induced by antigen-specific Tcells）。
本实施例中，MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，以SGC7901细胞为靶细胞，以培养12 天的CIK和UCT细胞为效应细胞，按5:1、10:1和20:1的比例混合，取胃癌SGC7901细胞，取对数生长期，浓度调整为1×105/mL，按效靶比分别调整CIK和UCT细胞，将分为实验组、效应细胞组和靶细胞组，每组有3个平行孔，实验组分别加效应细胞和靶细胞100 μL，效应细胞组分别加入效应细胞和1640培养基100 μL，靶细胞组分别加入靶细胞和1640培养基100 μL，所有细胞在37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后加入10 μL的MTT试剂，4h后加入100μL的甲臜溶液，4h后，用自动免疫分析仪在570nm波长处测量吸光度，杀死率计算如下：
（%）=[1-（一个效应靶细胞孔值-一个效应细胞孔值）/一个靶细胞孔值]*100%
检测免疫表型和细胞因子表达，收集培养第八天的细胞，将细胞调整至最终浓度2×106 cells/mL，用流式细胞术检测CIK细胞、UCT细胞的免疫表型，ELISA法测定细上清IFN-γ、IL-8、TNF-α含量。
一种脐血来源的UCT细胞的制备用于抗肿瘤的应用。
实施例
参照图1和图3，一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，包括如下步骤：
S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存；
S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液；
S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤；
S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天；
S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合；
S6：MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，检测免疫表型和细胞因子表达。
本实施例中，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，在依照GMP标准设立的实验室中，使用全自动脐带血制备系统，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
本实施例中，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，在RPMI 1640培养基中培养，将粘附细胞悬浮在RPMI 1640培养基中2h，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4 500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rh TNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
本实施例中，CIK细胞诱导培养，将MNC细胞浓度调整为1×106/mL，1000 U/ mL的IFN-α加入到里面然后在二氧化碳培养箱中培养，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300 U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
本实施例中，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中添加2000 UIL-2/mL（中国四环生物制药公司）、0.01KE/mL A组链球菌（中国路亚制药公司）、5 μM唑来膦酸盐（诺华制药公司）、IL-2/mL(四环生物制药，中国) 、0.01KE/mL A组链球菌(鹿亚制药，中国)和5μM唑来膦酸盐(诺华制药)。
本实施例中，DC与CIK细胞共培养，将第一步中培养5天的成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，计数后按1:5的比例培养，含有500 U/mL rh IL-2的培养基。
本实施例中，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束，我们将培养至十二天的这群细胞称作UCT（脐血来源的细胞因子诱导的抗原特异性T细胞Umbilical cord blood-derived cytokines induced by antigen-specific Tcells）。
本实施例中，MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，以SGC7901细胞为靶细胞，以培养12 天的CIK和UCT细胞为效应细胞，按5:1、10:1和20:1的比例混合，将分为实验组、效应细胞组和靶细胞组，每组有3个平行孔，实验组分别加效应细胞和靶细胞100 μL，效应细胞组分别加入效应细胞和1640培养基100 μL，靶细胞组分别加入靶细胞和1640培养基100 μL，所有细胞在37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后加入10 μL的MTT试剂，4h后加入100μL的甲臜溶液，4h后，用自动免疫分析仪在570nm波长处测量吸光度，杀死率计算如下：
（%）=[1-（一个效应靶细胞孔值-一个效应细胞孔值）/一个靶细胞孔值]*100%
检测免疫表型和细胞因子表达，收集培养第八天的细胞，将细胞调整至最终浓度2×106 cells/mL，用流式细胞术检测CIK细胞、UCT细胞的免疫表型，ELISA法测定细上清IFN-γ、IL-8、TNF-α含量。
一种脐血来源的UCT细胞的制备用于抗肿瘤的应用。
实施例
参照图1，一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，包括如下步骤：
S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存；
S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液；
S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤；
S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天；
S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合；
S6：MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，检测免疫表型和细胞因子表达。
本实施例中，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，在依照GMP标准设立的实验室中，使用全自动脐带血制备系统，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
本实施例中，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离单核细胞（MNC）并用无血清RPMI 1640洗涤分离液，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4 500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rh TNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
本实施例中，CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI1640培养基洗涤，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
本实施例中，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天，浓度为2 ×106细胞/ml，在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中添加2000 UIL-2/mL（中国四环生物制药公司）、IL-2/mL(四环生物制药，中国) 、0.01KE/mL A组链球菌(鹿亚制药，中国)和5μM唑来膦酸盐(诺华制药)。
本实施例中，DC与CIK细胞共培养，将第一步中培养5天的成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，计数后按1:5的比例培养，含有500 U/mL rh IL-2的培养基。
本实施例中，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束，我们将培养至十二天的这群细胞称作UCT（脐血来源的细胞因子诱导的抗原特异性T细胞Umbilical cord blood-derived cytokines induced by antigen-specific Tcells）。
本实施例中，MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，以SGC7901细胞为靶细胞，以培养12 天的CIK和UCT细胞为效应细胞，按5:1、10:1和20:1的比例混合，实验组分别加效应细胞和靶细胞100 μL，效应细胞组分别加入效应细胞和1640培养基100 μL，靶细胞组分别加入靶细胞和1640培养基100 μL，所有细胞在37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后加入10μL的MTT试剂，4h后加入100 μL的甲臜溶液，4h后，用自动免疫分析仪在570nm波长处测量吸光度，杀死率计算如下：
（%）=[1-（一个效应靶细胞孔值-一个效应细胞孔值）/一个靶细胞孔值]*100%
检测免疫表型和细胞因子表达，收集培养第八天的细胞，将细胞调整至最终浓度2×106 cells/mL，用流式细胞术检测CIK细胞、UCT细胞的免疫表型，ELISA法测定细上清IFN-γ、IL-8、TNF-α含量。
实施例
参照图1，一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，包括如下步骤：
S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存；
S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液；
S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤；
S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天；
S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合；
S6：MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，检测免疫表型和细胞因子表达。
本实施例中，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，完成脐带血造血干细胞的分离，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
本实施例中，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离单核细胞（MNC）并用无血清RPMI 1640洗涤分离液，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4 500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rh TNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
本实施例中，CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI1640培养基洗涤，将MNC细胞浓度调整为1×106/mL，1000 U/ mL的IFN-α加入到里面然后在二氧化碳培养箱中培养，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300 U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
本实施例中，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，浓度为2 ×106细胞/ml，在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中添加2000 UIL-2/mL（中国四环生物制药公司）、0.01KE/mL A组链球菌（中国路亚制药公司）、5 μM唑来膦酸盐（诺华制药公司）、IL-2/mL(四环生物制药，中国) 、0.01KE/mL A组链球菌(鹿亚制药，中国)和5μM唑来膦酸盐(诺华制药)。
本实施例中，DC与CIK细胞共培养，将第一步中培养5天的成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，计数后按1:5的比例培养，含有500 U/mL rh IL-2的培养基。
本实施例中，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束。
本实施例中，MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，以SGC7901细胞为靶细胞，以培养12 天的CIK和UCT细胞为效应细胞，按5:1、10:1和20:1的比例混合，取胃癌SGC7901细胞，取对数生长期，浓度调整为1×105/mL，按效靶比分别调整CIK和UCT细胞，将分为实验组、效应细胞组和靶细胞组，每组有3个平行孔，实验组分别加效应细胞和靶细胞100 μL，效应细胞组分别加入效应细胞和1640培养基100 μL，48h后加入10 μL的MTT试剂，4h后加入100 μL的甲臜溶液，4h后，用自动免疫分析仪在570nm波长处测量吸光度，杀死率计算如下：
（%）=[1-（一个效应靶细胞孔值-一个效应细胞孔值）/一个靶细胞孔值]*100%
检测免疫表型和细胞因子表达，收集培养第八天的细胞，将细胞调整至最终浓度2×106cells/mL，用流式细胞术检测CIK细胞、UCT细胞的免疫表型，ELISA法测定细上清IFN-γ、IL-8、TNF-α含量。
实施例
参照图1，一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，包括如下步骤：
S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存；
S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液；
S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤；
S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天；
S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合；
S6：MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，检测免疫表型和细胞因子表达。
本实施例中，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，在依照GMP标准设立的实验室中，使用全自动脐带血制备系统，在封闭状态下通过离心，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
本实施例中，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离单核细胞（MNC）并用无血清RPMI 1640洗涤分离液，在RPMI 1640培养基中培养，将粘附细胞悬浮在RPMI 1640培养基中2h，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4 500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rh TNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
本实施例中，CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI1640培养基洗涤，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
本实施例中，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天，浓度为2 ×106细胞/ml，在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中添加2000 UIL-2/mL（中国四环生物制药公司）、0.01KE/mL A组链球菌（中国路亚制药公司）、5 μM唑来膦酸盐（诺华制药公司）、IL-2/mL(四环生物制药，中国) 、0.01KE/mL A组链球菌(鹿亚制药，中国)和5μM唑来膦酸盐(诺华制药)。
本实施例中，DC与CIK细胞共培养，将第一步中培养5天的成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，计数后按1:5的比例培养，含有500 U/mL rh IL-2的培养基。
本实施例中，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束，我们将培养至十二天的这群细胞称作UCT（脐血来源的细胞因子诱导的抗原特异性T细胞Umbilical cord blood-derived cytokines induced by antigen-specific Tcells）。
本实施例中，MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，以SGC7901细胞为靶细胞，以培养12 天的CIK和UCT细胞为效应细胞，按5:1、10:1和20:1的比例混合，取胃癌SGC7901细胞，每组有3个平行孔，实验组分别加效应细胞和靶细胞100 μL，效应细胞组分别加入效应细胞和1640培养基100 μL，靶细胞组分别加入靶细胞和1640培养基100 μL，所有细胞在37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后加入10 μL的MTT试剂，4h后加入100 μL的甲臜溶液，4h后，用自动免疫分析仪在570nm波长处测量吸光度，杀死率计算如下：
（%）=[1-（一个效应靶细胞孔值-一个效应细胞孔值）/一个靶细胞孔值]*100%
检测免疫表型和细胞因子表达，收集培养第八天的细胞，将细胞调整至最终浓度2×106 cells/mL，用流式细胞术检测CIK细胞、UCT细胞的免疫表型，ELISA法测定细上清IFN-γ、IL-8、TNF-α含量。
对比例一
与实施例一不同之处在于，S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，在依照GMP标准设立的实验室中，使用全自动脐带血制备系统，在封闭状态下通过离心，完成脐带血造血干细胞的分离，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
对比例二
与实施例二不同之处在于，S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，在RPMI 1640培养基中培养，将粘附细胞悬浮在RPMI 1640培养基中2h，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4 500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rhTNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
对比例三
与实施例三不同之处在于，S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300 U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
对比例四
与实施例三不同之处在于，S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，浓度为2 ×106细胞/ml，在AIM-V无血清培养基(Life Technologies)中添加2000 UIL-2/mL（中国四环生物制药公司）、0.01KE/mL A组链球菌（中国路亚制药公司）、5 μM唑来膦酸盐（诺华制药公司）、IL-2/mL(四环生物制药，中国) 、0.01KE/mL A组链球菌(鹿亚制药，中国)和5μM唑来膦酸盐(诺华制药)。
对比例五
与实施例三不同之处在于，S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束，我们将培养至十二天的这群细胞称作UCT（脐血来源的细胞因子诱导的抗原特异性T细胞Umbilical cord blood-derived cytokines induced by antigen-specific T cells）。
实验例
将实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用进行试验，得出结果如下：
实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五的脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用对比现有的脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，增殖时间显著降低，抗胃癌效用显著增强，且实施例一为最佳实施例。
检测报告
本发明的目的是针对现有技术抗胃癌作用小，对肿瘤细胞杀伤力小，增殖能力差，杀伤活性差，原料短缺，无法广泛应用等问题，提出一种脐血来源的UCT细胞的制备方法与抗肿瘤的应用，通过脐血CIK细胞在培养后3天开始增殖，5-6天开始迅速增殖制备性能最佳的UCT细胞，其CD3+ CD8+细胞比例明显高于单纯CIK，CD3+ CD8+细胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-8明显高于单纯CIK细胞。这不仅增强了对胃癌细胞的杀伤作用，通过调节免疫系统间接杀伤胃癌细胞。结果发现UCT细胞明显增殖，增强了其抗胃癌作用。脐带血原料来源广泛，容易解决原料短缺的问题，可广泛用于UCT细胞共培养的临床应用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：脐带血制备，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，对检验合格的脐带血进行冻存；
S2：DC细胞的培养制备，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液；
S3：CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤；
S4：脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天；
S5：DC与CIK细胞共培养，将成熟DC和第二步中的CIK细胞混合；
S6：MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，检测免疫表型和细胞因子表达。
2.根据权利要求1所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，所述S1中，脐带血制备前，称量体积确认至符合储存标准，对制备前后的脐带血进行细胞计数，在依照GMP标准设立的实验室中，使用全自动脐带血制备系统，在封闭状态下通过离心，完成脐带血造血干细胞的分离，分离后的脐带血造血干细胞要保留检测样本，预留的脐带血样本，则与预留的母亲静脉血一起进行随后一系列安全性、有效性检测，对检验合格的脐带血进行长期冻存。
3.根据权利要求1所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，所述S2中，DC细胞的培养制备方法，脐带血取自足月分娩的婴儿健康女性20mL，用肝素钠抗凝，用淋巴细胞分离液分离单核细胞并用无血清RPMI 1640洗涤分离液，在RPMI 1640培养基中培养，将粘附细胞悬浮在RPMI 1640培养基中2h，培养基中含有rhGM-CSF 550 U/mL、rh IL- 4500 U/mL，rh SCF 100 g/L，rh TNFα 10 ug/L，持续4天，培养基每隔一天更换一半剂量，并添加细胞因子。
4.根据权利要求1所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，所述S3中，CIK细胞诱导培养，收集脐带血MNC的非粘附细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗涤，将MNC细胞浓度调整为1×106/mL，加入1000 U/ mL的IFN-α，在二氧化碳培养箱中培养，24h后，加入1 g/mL的CD3 单克隆抗体，1000 U/mL的重组人的IL-2，300 U/ mL的重组人的IL-1，每三天更换一半剂量的培养基添加细胞因子以保持细胞浓度在(1-2)×106/mL。
5.根据权利要求1所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，所述S4中，脐血中NK细胞的制备，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从20mL脐血中分离出MNCs，单核细胞在T175细胞培养瓶培养5天，浓度为2×106细胞/ml，在AIM-V无血清培养基中添加2000 UIL-2/mL、0.01KE/mL A组链球菌、5 μM唑来膦酸盐、IL-2/mL 、0.01KE/mL A组链球菌和5μM唑来膦酸盐。
6.根据权利要求1所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，所述S5中，DC与CIK细胞共培养，将第一步中培养5天的成熟DC和第二步中的CIK细胞混合，计数后按1:5的比例培养，含有500 U/mL rh IL-2的培养基。
7.根据权利要求1所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，所述S5中，在第七天将NK细胞与DC-CIK细胞混合培养比例为2:5，直至培养到第十二天结束。
8.根据权利要求1所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备方法，其特征在于，所述S6中，MTT法检测UCT细胞对靶细胞的杀伤活性，以SGC7901细胞为靶细胞，以培养12 天的CIK和UCT细胞为效应细胞，按5:1、10:1和20:1的比例混合，取胃癌SGC7901细胞，取对数生长期，浓度调整为1×105/mL，按效靶比分别调整CIK和UCT细胞，将分为实验组、效应细胞组和靶细胞组，每组有3个平行孔，实验组分别加效应细胞和靶细胞100μL，效应细胞组分别加入效应细胞和1640培养基100μL，靶细胞组分别加入靶细胞和1640培养基100 μL，所有细胞在37℃恒温CO2培养箱中培养，48h后加入10μL的MTT试剂，4h后加入100μL的甲臜溶液，4h后，用自动免疫分析仪在570nm波长处测量吸光度，杀死率计算如下：
（%）=[1-（一个效应靶细胞孔值-一个效应细胞孔值）/一个靶细胞孔值]*100%
检测免疫表型和细胞因子表达，收集培养第八天的细胞，将细胞调整至最终浓度2×106cells/mL，用流式细胞术检测CIK细胞、UCT细胞的免疫表型，ELISA法测定细上清IFN-γ、IL-8、TNF-α含量。
9.权利要求1-8任一项所述的一种脐血来源的UCT细胞的制备用于抗肿瘤的应用。
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