KR20150020263A - 수지상세포 성숙화 조성물 및 이를 이용하여 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법 - Google Patents
수지상세포 성숙화 조성물 및 이를 이용하여 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 성숙화 인자로, 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 피시바닐(Picibanil; OK432) 및 폴리 IC (Poly IC) 중 하나 이상을 포함하는, 수지상세포 성숙화 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 수지상세포 성숙화 조성물은, 수지상세포의 면역반응 유도능을 향상시킬 뿐 아니라, 수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소시키고 항원 특이적 면역반응을 증가시켜 면역 치료 효과를 극대화 시키는 효과가 있다.
Description
본 발명은 수지상세포 성숙화 조성물 및 이를 이용하여 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법에 대한 것이다.
수지상세포(Dendritic Cell, DC)는 면역계에 존재하는 세포 중에서 항원을 전달하는 능력이 가장 강력한 항원제시세포(APC, Antigen Presenting Cell)이다. 수지상세포는 항원과 접한 적이 없는 원시 T 세포(naive T 세포)와 반응하여 면역을 유도할 수 있어 다른 항원제시세포와 달리 일차면역반응(primary immune response)을 효과적으로 유도하며, 이로 인해 강력한 면역기억을 유도할 수 있는 특성을 갖는 유일한 면역세포이다. 수지상세포가 면역반응을 강하게 유도할 수 있는 이유는 항원제시세포(APC, Antigen Presenting Cell)로서 세포 표면에 MHC 분자(I/II) 뿐만 아니라, 보조자극분자(co-stimulatory molecules)를 고농도로 발현하고 있으며, T 세포 활성화에 필요한 사이토카인(cytokine, IFN-alpha, IL-12, IL-18 등)을 분비하기 때문인 것으로 알려져 있다. 또한, type 1 수지상세포는 IFN-alpha, IL-12 등 Th1 면역유도 관련 사이토카인을 분비하기 때문에 항원 특이적인 Th1 세포의 증식 및 세포독성T임파구 (CTL)의 활성화를 유도할 수 있어 면역요법에 유용하게 적용 가능하다.
수지상세포를 항암면역치료에 활용하기 위해서는, 체외에서 수지상세포를 분화 제조하는 기술과 T 세포 면역을 효과적으로 유도하기 위한 성숙화 기술이 필수적이다. 체외에서 단핵구로부터 미성숙 수지상세포를 제조하는 방법이나 성숙화 과정은 전 세계적으로 아직 표준화 되어있지 못하다. 특히 분화 제조된 미성숙 수지상세포의 성숙화는 수지상세포를 림프절로 이동시켜 임파절의 원시 T 세포에 항원을 제시하여 Th1 면역반응을 유도할 수 있는 세포로 전환시키는 과정으로, 완전히 성숙한 수지상세포는 미숙한 수지상세포에 비해 세포 표면에 MHC I형 및 II형 분자, 및 T 세포 보조자극인자, 즉 CD80 및 CD86 등을 고농도로 발현한다. 또한, 성숙한 수지상세포는 다량의 사이토카인을 발현하며, 이들 사이토카인은 T 세포 면역반응 유도에 직접적으로 관여한다. 성숙화를 통한 이러한 변화에 의해 수지상세포의 T 세포 면역반응 유도능이 크게 증가하게 된다.
수지상세포 성숙화 기술로, 단핵구배양유래 배지(MCM: Monocyte Conditioned Media)를 사용하는 기술이 알려져 있다. 상기 MCM은 단핵구를 시험관에 배양하면서 수거한 배지가 성숙화 인자의 공급원으로서 사용된다. 그러나, MCM을 이용하는 방법의 경우, 외부의 위험 신호를 인식하여 단핵구가 분비하는 염증유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 분비량이 사람마다 변동 폭이 크기 때문에, 결과적으로 동일한 성숙화 조건의 제조공정을 유지하기 힘들 뿐 아니라, MCM 제조를 위하여 다량의 말초혈액단핵세포를 채취하여 사용해야 하는 매우 큰 단점이 있다. 이에, MCM을 대체할 수 있는 방법으로, MCM의 성분 중 중요한 사이토카인들을 조합하여 만든 cytokine cocktail (IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2)을 사용하는 기술이 개발되었다. Cytokine cocktail 을 사용할 경우 MCM의 문제점을 해결할 수 있을 뿐 아니라 기능면에서도 비교 우위를 보이는 수지상세포를 안정적으로 제조할 수 있다. 그러나 이들 성숙화 cytokine cocktail 만으로는 수지상세포의 성숙화가 충분히 유도되지 않는다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2011-0035633호에는 Th1 세포와 수지상세포를 이용한 세포독성 T 세포의 in vitro 유도방법이 기재되어 있으나, 상기 방법은 수지상세포가 충분히 성숙화되지 못한 상태로 이용되므로 실질적으로 충분한 면역 치료 효과를 기대하기 어렵다.
따라서, 수지상세포를 이용한 항암면역치료효과를 극대화 하기 위해서는, 수지상세포의 보다 효과적인 성숙화 기술과, 이를 통한 항원특이적인 항암면역유도능 강화 기술이 절대적으로 요구된다.
본 발명의 목적은, 수지상세포의 면역반응 유도능을 향상시킬 뿐 아니라, 수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소시키고 항원 특이적 면역반응을 증가시켜 면역 치료 효과를 극대화 시키는 수지상세포 성숙화 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 수지상세포 성숙화 조성물을 이용하여 제조되는 항원 특이적 수지상세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 성숙화 인자로, 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 피시바닐(Picibanil; OK432) 및 폴리 IC (Poly IC) 중 하나 이상을 포함하는, 수지상세포 성숙화 조성물을 제공한다.
본 발명은, 상기 수지상세포 성숙화 조성물을 이용하여 제조되는 항원 특이 면역 유도용 수지상세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 미성숙 수지상세포에 항원을 감작시키는 단계; 및 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β ; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 피시바닐(Picibanil; OK432) 및 폴리 IC(Poly IC) 중 하나 이상의 성숙화 인자를 시간차를 두고 처리하는 단계를 포함하는, 항원특이적 T 세포 면역반응 유도용 수지상세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 수지상세포 성숙화 조성물은, 수지상세포의 면역반응 유도능을 향상시킬 뿐 아니라, 수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소시키고 항원 특이적 T 세포 면역반응을 증가시켜 면역 치료 효과를 극대화 시키는 효과가 있다.
도 1은 항원(Ag)과 모든 성숙화 인자(CM)를 동시에 처리하거나(B), 또는 성숙화 인자 중 피시바닐(OK432)만을 시간차이를 두고 처리(A)하여 수지상세포를 성숙시키는 제조방법을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1-1(MAGE-1/OK+) 및 비교예 1-1의 수지상세포를 제조할 때 성숙화 과정 중 각 수지상세포가 분비한 배양액에서의 IL-12와 IL-10의 양을 측정한 결과이다. 도면에서, cvDC는 실시예 1-1이고 sDC는 비교예 1-1이다.
도 3은 실시예 1-1(MAGE-1) 및 비교예 1-1의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 T cell의 증식을 MTT assay로 분석한 결과이다. 도면에서, cvDC는 실시예 1-1이고 sDC는 비교예 1-1이다.
도 4는 실시예 1-1(MAGE-1) 및 비교예 1-1의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 배양액에서의 IFN-γ를 ELISA 방법으로 분석한 결과이다. 도면에서, cvDC는 실시예 1-1이고 sDC는 비교예 1-1이다.
도 5는 실시예 1-2(AFP/OK+), 비교예 2(Un/OK+), 비교예 3-2(AFP /OK-) 및 비교예 4(Un/OK-)의 수지상세포로 자가 T 세포를 일정비율로 자극 및 재자극을 진행하면서 IFN-γ의 양을 3회에 걸쳐 측정한 결과이다.
도 6은 실시예 1-3(GPC-3/OK+)과 비교예 2(Un/OK+), 비교예 3-3 (GPC-3 /OK-) 및 비교에 4 (Un/OK-)의 수지상세포로 유도한 CTL의 항원-특이성을 확인한 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이다.
도 7는 실시예 1-2(AFP/OK+), 비교예 2 (Un/OK+), 비교예 3-2 (AFP /OK-) 및 비교예 4 (Un/OK-)의 수지상세포에 의해 유도된 CTL의 활성을 표적(Target)세포와 반응 시킨 경우, 배양액에 분비된 IFN-γ의 양을 측정한 결과이다.
도 8는 실시예 1-2(AFP/OK+) 및 비교예 3-2 (AFP /OK-)의 수지상세포를 제조할 때 성숙화 과정 중 각 수지상세포가 배양액에 분비한 IL-12와 IL-10의 양을 측정한 결과이다.
도 9은 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3-3 (GPC-3 /OK-)의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 T cell의 증식을 MTT assay로 분석한 결과이다.
도 10은 실시예 1-2(AFP/OK+) 및 비교예 3-2 (AFP/OK-)의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 배양액에서의 IFN-γ를 ELISA 방법으로 분석한 결과이다.
도 11은 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3-3 (GPC-3/OK-)의 수지상세포를 사용하여 CTL 증폭 시 매 반응 단계별로 세포의 증식을 측정한 결과이다.
도 12는 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3 -3(GPC-3/OK-)의 수지상세포를 사용하여 CTL 유도 시 배양액에서 IFN-γ 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 13은 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 실시예 2-3 (GPC-3/OK+)의 항원-특이성을 나타낸 결과이다. 도 1의 B와 같이, 항원 및 피시바닐 외 성숙화 인자를 처리한 후, 피시바닐(OK432)을 0 시간 또는 4 시간차를 두고 처리한 수지상세포를 사용하여 유도한 CTL의 항원-특이성을 확인한 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이다.
도 14는 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 실시예 2-3 (GPC-3/OK+)의 항원-특이성적 세포독성 활성을 나타낸 결과이다.
도 15는 실시예 3-1 내지 3-5의 수지상세포의 T 세포 증식반응률을 나타낸 결과이다.
도 16은 실시예 3-1 내지 3-5의 수지상세포의 Th1 면역반응 유도능력을 나타낸 결과이다.
도 17은 실시예 3-1 내지 3-5의 수지상세포를 사용하여 유도한 CTL의 항원-특이성을 확인한 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이다.
도 2는 실시예 1-1(MAGE-1/OK+) 및 비교예 1-1의 수지상세포를 제조할 때 성숙화 과정 중 각 수지상세포가 분비한 배양액에서의 IL-12와 IL-10의 양을 측정한 결과이다. 도면에서, cvDC는 실시예 1-1이고 sDC는 비교예 1-1이다.
도 3은 실시예 1-1(MAGE-1) 및 비교예 1-1의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 T cell의 증식을 MTT assay로 분석한 결과이다. 도면에서, cvDC는 실시예 1-1이고 sDC는 비교예 1-1이다.
도 4는 실시예 1-1(MAGE-1) 및 비교예 1-1의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 배양액에서의 IFN-γ를 ELISA 방법으로 분석한 결과이다. 도면에서, cvDC는 실시예 1-1이고 sDC는 비교예 1-1이다.
도 5는 실시예 1-2(AFP/OK+), 비교예 2(Un/OK+), 비교예 3-2(AFP /OK-) 및 비교예 4(Un/OK-)의 수지상세포로 자가 T 세포를 일정비율로 자극 및 재자극을 진행하면서 IFN-γ의 양을 3회에 걸쳐 측정한 결과이다.
도 6은 실시예 1-3(GPC-3/OK+)과 비교예 2(Un/OK+), 비교예 3-3 (GPC-3 /OK-) 및 비교에 4 (Un/OK-)의 수지상세포로 유도한 CTL의 항원-특이성을 확인한 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이다.
도 7는 실시예 1-2(AFP/OK+), 비교예 2 (Un/OK+), 비교예 3-2 (AFP /OK-) 및 비교예 4 (Un/OK-)의 수지상세포에 의해 유도된 CTL의 활성을 표적(Target)세포와 반응 시킨 경우, 배양액에 분비된 IFN-γ의 양을 측정한 결과이다.
도 8는 실시예 1-2(AFP/OK+) 및 비교예 3-2 (AFP /OK-)의 수지상세포를 제조할 때 성숙화 과정 중 각 수지상세포가 배양액에 분비한 IL-12와 IL-10의 양을 측정한 결과이다.
도 9은 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3-3 (GPC-3 /OK-)의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 T cell의 증식을 MTT assay로 분석한 결과이다.
도 10은 실시예 1-2(AFP/OK+) 및 비교예 3-2 (AFP/OK-)의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 배양액에서의 IFN-γ를 ELISA 방법으로 분석한 결과이다.
도 11은 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3-3 (GPC-3/OK-)의 수지상세포를 사용하여 CTL 증폭 시 매 반응 단계별로 세포의 증식을 측정한 결과이다.
도 12는 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3 -3(GPC-3/OK-)의 수지상세포를 사용하여 CTL 유도 시 배양액에서 IFN-γ 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 13은 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 실시예 2-3 (GPC-3/OK+)의 항원-특이성을 나타낸 결과이다. 도 1의 B와 같이, 항원 및 피시바닐 외 성숙화 인자를 처리한 후, 피시바닐(OK432)을 0 시간 또는 4 시간차를 두고 처리한 수지상세포를 사용하여 유도한 CTL의 항원-특이성을 확인한 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이다.
도 14는 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 실시예 2-3 (GPC-3/OK+)의 항원-특이성적 세포독성 활성을 나타낸 결과이다.
도 15는 실시예 3-1 내지 3-5의 수지상세포의 T 세포 증식반응률을 나타낸 결과이다.
도 16은 실시예 3-1 내지 3-5의 수지상세포의 Th1 면역반응 유도능력을 나타낸 결과이다.
도 17은 실시예 3-1 내지 3-5의 수지상세포를 사용하여 유도한 CTL의 항원-특이성을 확인한 IFN-γ ELISPOT 분석 결과이다.
[발명의 실시를 위한 최선의 형태]
본 발명은, 피시바닐(Picibanil; OK432) 등의 성숙화 인자를 포함하는 수지상세포 성숙화 조성물에 대한 것이다. 특히, 본 발명자는 본 발명의 성숙화 물질 중 피시바닐(Picibanil; OK432)과 항원을 시간차를 두고 처리하여 수지상세포를 제조하는 경우, 수지상세포의 면역반응 유도능이 극히 향상될 뿐 아니라, 수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소시키고 오히려 항원 특이적인 면역반응이 증가되어 면역 치료효과가 극대화 됨을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 성숙화 인자는 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 피시바닐(Picibanil; OK432) 및 폴리 IC (Poly IC) 중 하나 이상일 수 있으며, 특히, 피시바닐(Picibanil; OK432)을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 피시바닐(Picibanil; OK432)은 세포성 면역을 증강시켜 종양에 대항하는 약으로 용혈성 연쇄 구균을 페니실린으로 처리하여 만든 것을 의미하며, 당업계에서 피시바닐(Picibanil; OK432)로 지칭되는 것이면 특별히 한정됨 없이 본 발명에 적용할 수 있다. 상기 피시바닐(Picibanil; OK432)은 종래에 소화 기관 암, 갑상선 암, 폐암 치료에 사용되었으나, 본 발명자는 이를 수지상세포 성숙화 인자로 사용하는 경우, 수지상세포의 면역반응 유도능이 극대화 됨을 확인하였다. 또한, 상기 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β ; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2) 및 폴리 IC (Poly IC)는 당업계에서 상기 물질로 인식되는 물질이면, 특별히 제한되지 않고 본 발명에 적용할 수 있다.
본 발명의 수지상세포는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640과 serum free 배지인 X-VIVO15 등 특정 배지에 국한되지 않고 우수한 면역반응 유도능을 나타낸다.
본 발명의 성숙화 조성물은 수지상세포의 면역반응 유도능을 향상시킬 뿐 아니라, 수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소시키고 항원 특이적 면역반응을 증가시키는 작용을 한다.
또한, 본 발명은 상기 성숙화 조성물을 이용하여 제조되는 항원 특이적 면역반응을 유도하는 수지상세포를 포함한다.
한편, 본 발명은, 미성숙 수지상세포에 항원을 감작시키는 단계; 및 성숙화 인자를 처리하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 면역반응을 유도하는 수지상세포를 제조하는 방법에 대한 것이다.
상기 항원 감작과 성숙화 인자의 처리는 동시에 또는 시간차로 처리할 수 있으며, 항원 감작과 성숙화 인자의 처리를 동시에 하거나, 상기 항원을 감작시키고 1 내지 30시간 후 상기 성숙화 인자를 처리하는 것이 바람직하다.
특히, 상기 성숙화 인자 중 피시바닐은, 피시바닐 외의 상기 성숙화 인자의 조합과는 별개로 시간차로 처리하는 것이 더욱 바람직하다. 즉, 피시바닐을 제외한 성숙화 인자의 조합인, 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 및 폴리 IC (Poly IC) 중 하나 이상의 성숙화 인자를 처리한 후, 피시바닐(Picibanil; OK432)을 처리할 수 있다. 피시바닐을 제외한 성숙화 인자의 조합은 항원 감작과 동시 또는 1시간 이내에 처리하는 것이 가장 바람직하며, 피시바닐은 바람직하게는 항원 감작 1시간 이후, 더욱 바람직하게는 항원 감작 및 성숙화 인자 조합 처리 후 수지상세포 수확(Harvest) 1 내지 4시간 전 처리하는 것이 바람직하다.
성숙화 인자 조합 투여와 피시바닐 처리에 시간차를 두는 경우, 수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소 및 항원 특이적 면역반응 증가 효과가 극대화 된다.
상기 성숙화 인자는 위에서 설명한 것과 동일하다.
수지상세포는 면역계에 존재하는 세포 중에서 항원을 전달하는 능력이 가장 강력한 항원제시세포이기 때문에 크기가 큰 재조합 단백질 또는 펩타이드, 암분쇄물, 리보핵산, 암세포와의 융합 또는 apoptotic 또는 necrotic 암세포 등 항원의 형태에 국한되지 않고 항원의 흡입(uptake)과 항원의 분해과정(processing)을 통하여 MHC I/II 분자에 제시할 수 있는 능력을 갖기때문에, 특정 항원에 국한되지 않고 이용 가능하다. 예를 들어, AFP (alphafetoprotein), GPC-3 (Glypican-3), PSA (prostate specific antigen), MAGE-1(Melanoma-Associated Antigen 1), PSMA (Prostate-specific membrane antigen), PAP (prostatic acid phosphatase), 암 세포 주(tumor cell line) 또는 암 조직 파쇄물(tumor lysate) 등을 이용 가능하나, 이에 국한되지 않는다.
[발명의 실시를 위한 형태]
이하, 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
<
실시예
및
비교예
>
하기 표 1에 나타낸 구성대로, 실시예와 비교예의 성숙한 수지상세포를 제조하였다.
실시예
1. 항원과
수지상세포
성숙화
조성물 동시 처리를 통한
수지상세포의
제조
상기 표 1에 나타낸 구성대로, 실시예 1의 성숙한 수지상세포를 제조하였다.
(1) 말초혈액
단핵세포
(
PBMC
)로부터 미성숙
수지상세포의
분화 (
PBMC
→
imDC
)
건강한 개체의 혈액단핵세포에 대하여, 실온의 Ficoll-Paque Plus (Endotoxin-free grade) 를 사용한 밀도구배 원심분리 (Density gradient Centrifugation) 를 수행하여 적혈구 (reticulocyte), 과립구 (granulocyte), 혈소판 (platelet), 혈장 등이 제거된 말초혈액 단핵세포 (PBMC) 를 수집하였다.
상기 말초혈액 단핵세포를 취하여 원심분리하여 세포를 수확하고, 세포를 일정농도로 자가혈장이 포함된 RPMI1640배지에 현탁하여 세포배양기에 넣어 배양하였다. 동결된 PBMC를 사용할 경우에는 해동하여 HBSS 용액과 무혈청배지로 세척하여 사용할 수 있다.
말초혈액 단핵세포로부터 단핵구의 분리는 동물 세포 배양기의 통상적인 재질인 플라스틱에 대한 흡착성 (plastic adherency)를 이용하여 실시하였다. 단핵구가 세포배양기의 바닥 재질인 플라스틱에 대한 흡착성(plastic adherency)이 대단히 높기 때문에, 배지에 현탁시킨 말초혈액 단핵세포를 37 ℃ 에서 배양한 뒤 부유 세포 (nonadherent 세포s)를 배지와 함께 제거함으로써 선택적으로 환자의 단핵구 세포가 전체 혈액세포수의 80% 이상으로 조정된 분획으로서의 부착한 세포 (adherent 세포)를 얻었다.
단핵구로부터 수지상세포 분화를 유도하는 수지상세포 분화 배지로는 사이토카인(Cytokine) 혼합물 (E. coli 발현 인간 재조합 단백질인 IL-4(Interleukin-4, 최종농도: 500 ng/mL 이하) 와 GM-CSF(JW CreaGene, 최종농도: 100 ng/mL 이하) 이 첨가된 RPMI1640 배지를 사용하였다.
(2) 미성숙
수지상세포에
항원을
감작
배양시작 3일 후 바닥으로부터 떨어져 부유하는 세포를 수거하여 계수한 다음, 일정량씩 배양용기에 옮기고 항원처리 배양을 수행하였다.
암 특이적 면역반응을 위하여 암-특이적 항원(AFP, GPC-3 또는 MAGE-1; 5∼10 μg/mL, JW CreaGene), 또는 암조직 분쇄물(T98G tumor cell line lysate; 50∼100 μg/mL, 자체 제조)을 일정농도로 각각의 배양용기에 처리하였다.
(3) 미성숙
수지상세포의
성숙화
유도 (
imDC
→
mDC
)
상기 (2)의 항원 감작과 동시에 미성숙 수지상세포의 성숙화를 유도하였다 (도 1의 B). 즉, 수지상세포의 성숙화 유도를 위하여 TNF-α (Tumor necrosis factor-α; 10ng/mL), IL-1β(Interleukin-1β; 10ng/mL), IL-6 (Interleukin-6; 10ng/mL), PGE2 (Prostaglandin E2; 1μg/mL)를 일정비율로 넣어주었다. 이 배지에는 또한 수지상세포 성숙화 및 활성화 인자로서 세포성면역 유도인자로서 TLR 신호 물질로 알려진 Poly IC(최종농도: 10 μg/mL)와 피시바닐(OK432) (의약품, Picibanil, 중외제약, 최종농도: 1∼2μg/mL) 와 IFN-γ (LG생명과학, 최종농도: 30∼1000 U/mL)를 일정 농도로 첨가하였다.
배양 최종일에 부유세포를 최종 치료제로서 수거하여 2번 세척하고 세포 동결 안정화제[DMSO를 포함하는 사람혈청 알부민(human serum albumin) 또는 사람 혈장]에 현탁하여 원액을 완성하였다.
실시예
2.
피시바닐(OK432)의
시간차 처리를 통한
수지상세포의
제조
항원(2) 및 피시바닐 외 성숙화 인자를 처리(3)하고 4시간 경과 후, 피시바닐을 처리한 점을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수지상세포를 제조하였다 (도 1의 A).
실시예
3.
피시바닐(OK432)의
시간차 처리를 통한
수지상세포의
제조
항원(2) 및 피시바닐 외 성숙화 인자의 처리(3) 시점과, 피시바닐(OK432) 처리 시점을 다음과 같이 각각 조절한 점을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수지상세포를 제조하였다 (도 1 참조).
비교예
1 내지 4. 항원을
감작하지
않거나,
피시바닐(OK432)을
처리하지 않은
수지상세포의
제조
상기 표 1에 나타낸 구성대로, 항원 처리(2)하는 단계를 수행하지 않은 점 및/또는 피시바닐을 처리하지 않은 점을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 수지상세포를 제조하였다.
<
실험예
>
실험예
1.
수지상세포의
성숙화
과정에서의
수지상세포의
분비물질 측정
실시예 1-1(MAGE-1/OK+) 및 비교예 1-1(MAGE-1/OK-)의 수지상세포를 제조할 때 성숙화 과정 중 각 수지상세포가 분비한 배양액에서의 IL-12와 IL-10의 양을 측정하여 도 2에 나타내었으며, 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와 상기 실시예 1-1 및 비교예 1-1의 수지상세포의 공배양 시 T cell의 증식과 IFN-γ를 측정하여 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.
구체적으로, IL-12와 IL-10의 양을 측정하기 위하여, 항원 처리 및 성숙화 과정에서 수지상세포가 분비한 배양액에서 IL-12와 IL-10를 ELISA 방법으로 분석하였다. 실험방법은 ELISA kit 제공회사의 메뉴얼에 따라 진행하였다. 실험결과를 도 2에 나타내었다.
또한, T cell의 증식을 측정하기 위해, Nylon wool로 분리한 자가 T 세포 1x105개와 수지상세포 1x104개를 10:1의 비율로 96 well plate에 triplicate하여 5일간 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 이용하여 살아있는 세포 염색을 통하여 세포의 증식을 확인하였다. 실험결과를 도 3에 나타내었다.
IFN-γ을 측정하기 위하여, 자가 T 세포와 수지상세포를 5일간 배양 후 배양액에서의 IFN-γ를 ELISA 방법으로 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
실험예
2.
피시바닐(OK432)에
의한 비특이적 T 세포의 유도 효과 확인(
Non
-specific T
cell
induction
by
OK432
)
피시바닐(OK432)에 의한 비특이적 T 세포의 유도 효과 확인하기 위하여, 실시예와 비교예에 따라 제조한 성숙한 수지상세포(mDC)를 사용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실시예 1-2(AFP/OK+), 비교예 2 (Un/OK+), 비교예 3-2 (AFP /OK-) 및 비교예 4 (Un/OK-)의 수지상세포와 말초혈액세포(PBMC)으로부터 분리한 자가 T 세포를, 다음과 같이 반응시키며 매 자극 1일째 배양액을 통하여 IFN-γ의 양을 측정하였다. 수지상세포 제조에 사용된 동일한 사람의 말초혈액세포로부터 nylon wool을 이용하여 T 세포를 분리하였다. 성숙한 수지상세포와 분리된 T 세포를 1:10 (2x105 : 2x106)의 비율로 혼합하여 6∼7일간 배양하였다. 1차 자극 한 T 세포는 수거하여 항원으로 감작한 수지상세포와 동일 비율(1:10)로 재자극을 수행하였다. 배양 배지(RPMI1640 + 10% AB serum)는 배양 2∼3일 마다 새로운 배지를 첨가하거나 교환하여 적절한 배양 환경을 제공하였다. 첫 번째 자극 시 IL-7 (Peprotech)을 5ng/mL의 농도로 첨가하였고, 두 번째 자극부터는 IL-2 (Proleukin)를 100U/mL 처리하였다. 항원-감작한 수지상세포로 2∼4회 반복하여 T 세포를 자극하여 유도한 CTL에 대하여 항원-특이성 및 CTL의 활성시험을 수행하였다. 유도 과정 중 T 세포와 수지상세포의 공배양 시 자극 다음 날 상층액의 일부를 취하여 IFN-γ의 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
또한, GPC-3 항원을 각각의 수지상세포로 유도된 활성 T 세포들에 대해서 항원-특이적 면역반응을 확인하기 위하여 실시예 1-3(GPC-3/OK+), 비교예 2(Un/OK+), 비교예 3-3 (GPC-3 /OK-) 및 비교예 4 (Un/OK-)의 수지상세포로 유도한 CTL의 항원-특이성을 IFN-γ ELISPOT 분석하였다. 구체적으로, 피시바닐(OK432)이 처리된 수지상세포(도 6의 w/ OK432) 또는 피시바닐(OK432)을 처리하지 않은 수지상세포(도 6의 w/o OK432)로 자극하여 IFN-γ을 분비하는 활성 T 세포의 수를 측정하였다. 1∼2x104개의 활성 T 세포와 1∼2x103개의 수지상세포를 10:1의 비율로 18∼24시간 세포배양기에서 배양 후 kit에서 제시하는 방법을 따라서 ELISPOT 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
유도한 CTL의 활성 및 항원-특이적인 반응을 확인하기 위하여, 실시예 1-2(AFP/OK+), 비교예 2 (Un/OK+), 비교예 3-2(AFP /OK-) 및 비교예 4 (Un/OK-)의 수지상세포에 의해 유도된 CTL의 활성을 표적(Target)세포와 반응 시켜, 배양액에 분비된 IFN-γ의 양을 측정하였다. 구체적으로, CTL과 HLA type이 일치하면서 항원(AFP)을 발현하는 표적세포인 HepG2 세포 1x104개와 유도한 CTL 1x105개를 1:10의 비율로 처리하여 18∼24시간 세포배양기에서 반응시킨 후 상등액을 취하여 이로부터 IFN-γ 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다. 이와 같이 측정된 IFN-γ의 양을 도 7에 나타내었다.
실험결과, 수지상세포(DC)에 피시바닐(OK432)을 처리하면 항원-비특이적 면역이 강하게 유도됨을 알 수 있었다.
실험예
3.
피시바닐(OK432)의
수지상세포
성숙화
효과 확인
항원 감작 후 성숙화 과정 시 피시바닐(OK432)의 처리 여부에 따른 수지상세포(DC)의 기능을 평가하기 위하여, AFP 또는 GPC-3를 항원으로 사용한 실시예 1-2(AFP/OK+) 및 비교예 3-2 (AFP /OK-), 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3-3 (GPC-3 /OK-)의 수지상세포를 사용하여 CTL 유도 시 세포의 증식 및 배양액에서의 성숙화 효과를 다음과 같이 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1-2(AFP/OK+) 및 비교예 3-2 (AFP /OK-)의 수지상세포를 제조할 때 성숙화 과정 중 각 수지상세포가 배양액에 분비한 IL-12와 IL-10의 양을 ELISA 방법으로 측정하여 도 8에 나타내었다.
Nylon wool로 분리한 자가 T 세포 1x105개와 실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3-3 (GPC-3 /OK-)의 수지상세포 1x104개를 10:1의 비율로 96 well plate에 triplicate하여 5일간 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 이용하여 살아있는 세포 염색을 통하여 세포의 증식을 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
또한, 실시예 1-2(AFP/OK+) 및 비교예 3-2 (AFP/OK-)의 수지상세포를 사용하여 말초혈액세포로부터 분리한 T 세포와의 공배양 시 배양액에서의 IFN-γ 를 ELISA 방법으로 분석한 결과를 도 10에 나타내었다.
실시예 1-3(GPC-3/OK+) 및 비교예 3-3 (GPC-3/OK-)의 수지상세포를 사용하여 CTL 유도 시 세포의 증식을 측정한 결과를 도 11에 나타내었으며, 각 수지상세포와 T 세포의 반복 자극 시 매 자극 1일째 취한 상등액을 취하여 ELISA 방법으로 측정한 IFN-γ의 양을 분석하여 도 12에 나타내었다.
실험결과, 피시바닐(OK432) 처리를 통하여 Th1 면역반응 유도에서 중요한 IL-12가 증가되며 (도 8: 항원 AFP 사용), T 세포 증식능이 향상되고(도 9: 항원 GPC-3 사용) Th1 면역반응의 강화를 유도(도 10: 항원 AFP 사용)함을 알 수 있었다. 또한, 활성 T 세포의 증식 능력의 향상(도 11: 항원 GPC-3 사용) 및 기능(IFN-γ) 강화(도 12: 항원 GPC-3 사용)됨을 알 수 있었다.
실험예
4. 항원과
피시바닐(OK432)의
시간차 투여에 의한 효과 확인(
RPMI1640
배지)
GPC-3를 항원으로 감작 후 피시바닐(OK432)의 처리 시기를 조절하여 성숙화 유도한 실시예 1-3과 실시예 2-3을 대상으로, 다음과 같이 ELISPOT 분석 및 세포독성활성 시험(CV)을 하였다.
피시바닐(OK432)을 항원 및 성숙화인자와 동시에 처리한 군(simultaneous)(실시예 1-3)과, 4시간 경과 후 피시바닐(OK432)을 처리한 군(4h) (실시예 2-3)의 수지상세포를 준비하였다. 각각의 수지상세포를 자가 T 세포와 반응하여 유도한 CTL 1∼5x104개와 피시바닐(OK432)을 처리하지 않은 수지상세포 1∼5x103개를 10:1의 비율로 IFN-γ capture 항체로 코팅된 플레이트에서 18∼20시간 동안 세포배양기에서 배양하였다. 이후 ELISPOT 키트에서 제공한 매뉴얼에 따라서 실험을 진행하였다. 즉, 배양 후 각 웰을 증류수와 세척용 버퍼로 세척한 후 검출용 항체를 넣어 반응시켰다. 이후 2차 항체를 넣어 1시간 동안 반응한 후 효소에 적합한 기질을 넣어 반응시킨 후 반응을 종결하였다. 하루 동안 건조시킨 후 ELISPOT reader (ImmunoSpot)를 이용하여 spot 수를 counting후 분석하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
각각 유도된 CTL을 표적세포와 반응을 시킨 후 세포독성 활성을 측정하였다. 표적세포로는 HLA-type이 일치하고 항원을 발현하는 세포(HepG2), HLA-type은 일치하지만 항원을 발현하지 않는 세포(Hep3B)와 둘 다 일치하지 않는 세포주(SN12C)를 표적세포로 세포독성 활성을 시험하였다. 표적세포 1x104개를 반응 하루 전 96 well flat bottomed plate에 분주하였고 다음 날 CTL 활성시험에 사용하였다. 활성 T 세포는 표적세포에 일정 비율로 넣어 18∼24시간 배양 후 10% formalin으로 1시간 동안 고정시키고 0.4% crystal violet으로 30분간 염색한 후 80% methanol을 첨가하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성활성을 확인하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
실험결과, 항원 처리 4시간 경과 후 피시바닐(OK432)을 처리한 군(실시예 2-3)에서 동시 처리한 군(실시예 1-3)보다 높은 항원-특이성을 확인(도 13)할 수 있었으며, 세포독성 결과에서도 4시간 이후 처리군에서 높은 활성을 나타내었다(도 14).
실험예
5. 항원과
피시바닐(OK432)의
시간차 투여에 의한 효과 확인
AFP, GPC-3 및 MAGE-1을 각각 항원으로 감작 후 피시바닐(OK432)의 처리 시기를 조절하여 성숙화 유도한 실시예 3-1 내지 3-5를 대상으로, 다음과 같이 수지상세포의 면역유도능력 및 CTL 의 항원-특이적 면역반응 유도 능력을 확인하였다.
먼저 분리한 자가 T 세포 5x106 세포를 2mL의 배양배지에 현탁하고 CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)의 최종농도가 5∼25μM의 농도가 되도록 첨가하여 37℃ 배양기에서 15분간 배양하였다. 배양배지로 두 번 세척한 후 세포를 계수하여 웰 당 1x105 세포로 넣어 준비된 수지상세포 1x104 개와 5일간 배양하였다. 배양 후 CD3 항체로 염색하여 유세포분석(FACS)을 수행하여 증식한 T 세포(CD3+CFSE10)의 비율을 분석하였으며, 그 결과는 AFP, GPC-3 및 MAGE-1을 항원으로 사용한 각각의 결과를 취합하여 도 15에 나타내었다.
또한, 분리한 자가 T 세포와 수지상세포를 10:1의 비율로 혼합하여 5일 배양 후 배양액을 취하여 ELISA 방법으로 IFN-γ을 분석하였으며, AFP, GPC-3 및 MAGE-1을 항원으로 사용한 각각의 결과를 취합하여 도 16에 나타내었다.
각각 유도된 CTL은 비교예 3의 수지상세포로 10:1의 비율로 18∼20 시간 반응을 시킨 후 IFN-γ를 분비하는 세포를 ELISPOT 분석법으로 분석하였으며, AFP, GPC-3 및 MAGE-1을 항원으로 사용한 각각의 결과를 취합하여 도 17에 나타내었다.
실험 결과, 항원처리 후 4시간 뒤 피시바닐(OK432) 처리그룹의 killing activity, ELISPOT의 항원특이성이 우수함을 확인하였다.
본 발명의 수지상세포 성숙화 조성물은, 수지상세포의 면역반응 유도능을 향상시킬 뿐 아니라, 수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소시키고 항원 특이적 T 세포 면역반응을 증가시켜 면역 치료 효과를 극대화 시키는 효과가 있다.
Claims (11)
- 성숙화 인자로, 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 피시바닐(Picibanil; OK432) 및 폴리 IC (Poly IC) 중 하나 이상을 포함하는, 수지상세포 성숙화 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
피시바닐(Picibanil; OK432)을 포함하는, 수지상세포 성숙화 조성물. - 청구항 1에 있어서,
수지상세포의 면역반응 유도능을 향상시키는, 수지상세포 성숙화 조성물. - 청구항 1에 있어서,
수지상세포의 항원 비특이적 면역반응을 감소시키는, 수지상세포 성숙화 조성물. - 청구항 1에 있어서,
수지상세포의 항원 특이적 면역반응을 증가시키는, 수지상세포 성숙화 조성물. - 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 수지상세포 성숙화 조성물을 이용하여 제조되는 항원 특이적 수지상세포.
- 미성숙 수지상세포에 항원을 감작시키는 단계; 및
인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 피시바닐(Picibanil; OK432) 및 폴리 IC (Poly IC) 중 하나 이상의 성숙화 인자를 처리하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 항원을 감작시키고, 1 내지 30시간 후 상기 성숙화 인자를 처리하는 것을 특징으로 하는, 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 성숙화 인자는 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 피시바닐(Picibanil; OK432) 및 폴리 IC (Poly IC)를 포함하는 것인, 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 성숙화 인자를 처리하는 단계는, 인터루킨-1베타 (Interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-6 (Interleukin-6; IL-6), 튜머 네크로시스 팩터 알파 (Tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터페론 감마 (IFN-γ), 프로스타글란딘 E-2 (Prostaglandin E2; PGE2), 및 폴리 IC (Poly IC) 중 하나 이상의 성숙화 인자를 처리한 후, 피시바닐(Picibanil; OK432)을 처리하는 단계인, 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 항원은 암세포주 또는 암조직의 분쇄물, AFP (alphafetoprotein), GPC-3 (Glypican-3), PSA (prostate specific antigen), MAGE-1 (Melanoma-associated antigen 1), PSMA (Prostate-specific membrane antigen), PAP (prostatic acid phosphatase) 또는 이들의 재조합 단백질 중 하나 이상인, 항원 특이적 수지상세포를 제조하는 방법.
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