CN116322714A - 使用血小板裂解物制备树突状细胞的方法 - Google Patents

使用血小板裂解物制备树突状细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供使用血小板裂解物，由单核细胞制备树突状细胞的方法。本发明的由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞的方法包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM‑CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养对从外周血中分离的单核细胞进行培养，然后添加前列腺素E2和OK432，进一步通过非贴壁培养进行培养。

Description

使用血小板裂解物制备树突状细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种由单核细胞制备树突状细胞的方法。
背景技术
已知树突状细胞(Dendritic cell：DC)是生物体内强大的抗原提呈细胞，其通过向T细胞提呈抗原来诱导免疫应答。另外，已知DC不仅直接作用于T细胞，还直接作用于B细胞、NK细胞、NKT细胞等，是在免疫反应中起中枢性作用的细胞。未成熟DC受到抗原刺激，由此随着CD40、CD80、CD86等表达上调而获得很强的刺激T细胞能力，同时转移到外周淋巴组织，通过活化对内吞的抗原具有特异性的T细胞来诱导免疫应答。
作为已认可能够从血液前驱细胞诱导树突状细胞分化的物质，一般已知有多种细胞因子。例如，有很多关于通过GM-CSF与IL-4同时使用来诱导DC分化的报告(非专利文献1)。此外，也报告有能够通过单独使用或与其他细胞因子同时使用来分化诱导DC的物质(非专利文献2)，例如报告有TNF-α、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、HGF(Hepatocyte growth factor，肝细胞生长因子)、CD40配体、M-CSF、Flt3配体、C-kit配体、TGF-β等。
在同时使用GM-CSF与IL-4来诱导分化DC的方法中，是通过贴壁培养法进行的，将单个核细胞(单核细胞与淋巴细胞)接种到培养皿中，洗涤淋巴细胞，将贴壁的单核细胞用于培养。在GM-CSF/IL-4存在下培养5～7天，通过培养基的洗涤操作、刮削(物理性剥取)来回收细胞，更换成含有佐剂(免疫增强剂)OK432的培养基(新鲜培养基)，制作成熟的DC。
另外，还报告有使用G-CSF制备树突状细胞的方法(专利文献1)和通过使用IFN的非贴壁培养制备树突状细胞的方法(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公布第WO2014/126250号
专利文献2：国际公布第WO2016/148179号
非专利文献
非专利文献1：Akagawa K.S.et al.,Blood,Vol.88,No.10(November 15),1996：pp.4029-4039
非专利文献2：O’Neill D.W.,et a.,Blood,Vol.104,No.8(October 15),2004：pp.2235-2246
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供使用血小板裂解物，由单核细胞制备树突状细胞的方法。
用于解决问题的技术方案
一直以来，虽然报告有由外周血中的单核细胞制备树突状细胞(DC)的方法，但是以往的方法中，DC的收率不足。另外，为了将DC用于癌症治疗，需要DC除了强大的抗原提呈能力及吞噬能力以外还具有细胞毒性等活性。
本发明人等为了提高DC的收率、制作功能性高的DC而进行了潜心研究。结果发现，使用血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α(PEG-IFN-α)，进而从外周血分离出单核细胞，然后通过非贴壁培养即悬浮培养来制作DC，由此能够在短时间内制作优化的DC，提高制作DC的收率，从而获得的DC也具有强大的细胞毒性，直至完成了本发明。
即，本发明如下。
[1]一种由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养对从外周血中分离的单核细胞进行培养，然后添加前列腺素E2和OK432，进一步通过非贴壁培养进行培养。
[2]根据[1]所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养进行2～5天的培养后，添加前列腺素E2和OK432，进一步进行1～2天的培养。
[3]根据[1]或[2]所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)、100U/mL～10,000U/mL的GM-CSF、500ng/mL～5μg/mL的PEG化干扰素α、5ng/mL～50ng/mL的前列腺素E2和5μg/mL～50μg/mL的OK432的无血清培养基，对单核细胞进行培养。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，无血清培养基为DCO-K。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，获得的树突状细胞的活细胞率为90％以上，获得的树突状细胞数相对于培养时的单核细胞数的比例即收率为15％以上。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，获得的树突状细胞为CD14、CD16、CD56、CD83、CD86、CCR7(CD197)、HLA-ABC、HLA-DR阳性。
[7]一种树突状细胞，其是通过[1]～[6]中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法获得的。
[8]一种药物组合物，其含有[7]所述的树突状细胞。
[9]根据[8]所述的药物组合物，其具有抗癌免疫活性，能够用于癌症治疗。
[10]一种单核细胞的分离方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)的无血清培养基，在贴壁培养容器中对外周血单个核细胞进行15分钟～3小时的培养，除去非贴壁细胞，回收贴壁细胞。
[11]根据[10]所述的单核细胞的分离方法，其使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)的无血清培养基。
[12]根据[10]或[11]所述的单核细胞的分离方法，其中，无血清培养基为DCO-K。
[13]一种单核细胞来源的细胞毒性树突状细胞的分化诱导剂，其含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF、PEG化干扰素α、前列腺素E2和OK432。
[14]根据[13]所述的单核细胞来源的细胞毒性树突状细胞的分化诱导剂，其包括：含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α的未成熟树突状细胞分化诱导剂，以及含有前列腺素E2和OK432的树突状细胞成熟剂。
[15]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中还添加癌特异性抗原以制备对癌抗原具有特异性树突状细胞毒性的树突状细胞。
[16]一种树突状细胞，其是通过[15]所述的方法获得的对癌抗原具有特异性树突状细胞毒性的树突状细胞。
[17]一种药物组合物，其含有[16]所述的树突状细胞，具有抗癌免疫活性，能够用于癌症治疗。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请第2020-184317号的公开内容。
发明效果
本发明的树突状细胞(DC)的制备方法包括在HPL、GM-CSF、PEG化干扰素(IFN)-α(PEG-IFN-α)、前列腺素E2(PGE2)和OK432存在下，通过非贴壁培养对分离的单核细胞进行培养，通过该方法能够在短时间内以高收率获得细胞毒性强大的DC。获得的DC能够适用于癌症免疫疗法。
附图说明
图1是表示预备试验1的步骤的图；
图2-1是表示预备试验1中第1天的细胞形态的观察图像的图；
图2-2是表示预备试验1中第2天的细胞形态的观察图像的图；
图3是表示在预备试验1中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到仅通过DCO-K培养基制作的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图4是表示在预备试验1中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过DCO-K+ABS培养基制作的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图5是表示在预备试验1中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过DCO-K+HPL培养基制作的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图6是表示在预备试验1中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过AIM-V培养基制作的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图7是表示在预备试验1中，利用流式细胞术对回收IFN-DC时的纯度和淋巴细胞的混入率进行评价的结果的图；
图8是表示预备试验1中活细胞率和收率的总结结果的图；
图9是表示预备试验2的步骤的图；
图10是表示预备试验2中细胞形态的观察图像的图；
图11是表示在预备试验2中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到仅通过DCO-K进行培养时的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图12是表示在预备试验2中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过DCO-K+ABS进行培养时的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图13是表示在预备试验2中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过DCO-K+HPL进行培养时的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图14是表示在预备试验2中，利用流式细胞术对回收IFN-DC时的纯度和淋巴细胞的混入率进行评价的结果的图；
图15是表示预备试验2中活细胞率和收率的总结结果的图；
图16是表示预备试验3的步骤的图；
图17是表示预备试验3中细胞形态的观察图像的图；
图18是表示在预备试验3中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过HPL 5(v/v)％进行培养时的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图19是表示在预备试验3中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过HPL 2.5(v/v)％进行培养时的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图20是表示在预备试验3中，利用流式细胞术对回收IFN-DC时的纯度和淋巴细胞的混入率进行评价的结果的图；
图21是表示预备试验3中活细胞率和收率的总结结果的图；
图22是表示预备试验4的步骤的图；
图23是表示在预备试验4中，使用添加有各浓度[0(v/v)％、1(v/v)％、5(v/v)％、10(v/v)％]的HPL的DCO-K培养基制作IFN-DC时的活细胞率、收率和淋巴细胞组分混入率的图；
图24是表示在预备试验4中，利用流式细胞术对通过各浓度[0(v/v)％、1(v/v)％、5(v/v)％、10(v/v)％]的HPL制作的IFN-DC的表型进行评价的结果的图；
图25是表示在预备试验4中，通过标记抗体，利用流式细胞术检测到通过HPL 10(v/v)％进行培养时的IFN-DC的细胞表面抗原的结果的图；
图26是表示预备试验5的步骤的图；
图27-1是表示预备试验5中细胞形态的观察图像和成熟混合物的组成的图；
图27-2是表示在预备试验5中利用流式细胞术对回收IFN-DC时的淋巴细胞的混入率进行评价的结果的图；
图28是表示在预备试验5中，使用各成熟混合物制作IFN-DC时的活细胞率、收率和淋巴细胞组分混入率的图；
图29是表示在预备试验5中，使用各成熟混合物制作的IFN-DC的表型分析结果的图；
图30是表示预备试验6的步骤的图；
图31是表示在预备试验6中，使用新鲜或冷冻保存的PBMC制作的HPL-IFN-DC的细胞毒活性测定结果(病例1)的图；
图32是表示在预备试验6中，使用新鲜或冷冻保存的PBMC制作的HPL-IFN-DC的细胞毒活性测定结果(病例2)的图；
图33是表示预备试验7的步骤的图；
图34是表示在预备试验7中，利用流式细胞术对通过未添加血清的培养基(AIM-V)制作的HPL-IFN-DC的细胞毒性T细胞诱导能力进行分析的结果的图；
图35是表示正式试验1的步骤的图；
图36-1是表示正式试验1中细胞形态的观察图像的图；
图36-2是表示正式试验1中在成熟后回收的IFN-DC和HPL-IFN-DC的活细胞率、收率和纯度的图；
图37是表示在正式试验2中，利用流式细胞术对HPL对IFN-DC的表型的影响进行分析的结果的图；
图38是表示正式试验3的步骤的图；
图39是表示正式试验3中的IFN-DC和HPL-IFN-DC的抗原吞噬能力和抗原降解能力的图；
图40是表示正式试验4的步骤的图；
图41是表示在正式试验4中，对HPL-IFN-DC分泌的参与细胞毒性T细胞诱导的细胞因子[IL-10、TGF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-12(p70)、IL-6]进行测定的结果的图；
图42是表示正式试验5的步骤的图；
图43-1是表示在正式试验5中，对将CD8阳性T细胞和MART1肽进行前脉冲处理而得到的IFN-DC和HPL-IFN-DC进行共培养，在第14天和第21天的时间点利用流式细胞术检测到MART1特异性细胞毒性T细胞的结果的图；
图43-2是表示在正式试验5中，对将CD8阳性T细胞和MART1肽进行前脉冲处理而得到的IFN-DC和HPL-IFN-DC进行共培养时的MART1特异性CD8+细胞的数量的图；
图43-3是表示在正式试验5中，对将CD8阳性T细胞和MART1肽进行前脉冲处理而得到的IFN-DC和HPL-IFN-DC进行共培养时的MART1特异性CD8+T细胞的比例的图；
图44是表示正式试验5中IFN-DC和HPL-IFN-DC中的细胞毒性T细胞诱导能力的对比的图(之一)；
图45是表示正式试验5中IFN-DC和HPL-IFN-DC中的细胞毒性T细胞诱导能力的对比的图(之二)；
图46是表示正式试验5中IFN-DC和HPL-IFN-DC中的细胞毒性T细胞诱导能力的对比的图(之三)；
图47是表示正式试验6的步骤的图；
图48-1是用斑点图像表示的由IFN-DC和HPL-IFN-DC诱导的细胞毒性T细胞针对抗原特异性地产生IFN-γ的能力的图；
图48-2是用IFN-γ产生量表示的由IFN-DC和HPL-IFN-DC诱导的细胞毒性T细胞针对抗原特异性地产生IFN-γ的能力的图；
图49是HPL-IFN-DC表现出优异的活细胞率、回收率和纯度的总结的图；
图50是表示HPL-IFN-DC的性状的总结的图；
图51是表示HPL-IFN-DC的功能评价结果的总结的图；
图52是表示使用HPL制造IFN-DC的方法的图；
图53是表示在使用HPL制作IFN树突状细胞时进行了选择性贴壁培养的单核细胞的状态的图；
图54是表示在使用HPL制作IFN树突状细胞时进行了选择性贴壁培养的单核细胞的流式细胞分析的图；
图55是表示HPL-IFN-DC的表型分析结果的图；
图56是表示IFN-DC或HPL-IFN-DC对MART-1抗原特异性细胞毒性T细胞的诱导的图；
图57是表示WT1-CTL诱导试验的步骤的图；
图58是表示用于WT1-CTL诱导试验的IL-4-DC(图58A)和HPL-IFN-DC(图58B)的制作方法的图；
图59是表示添加了WT1的IL-4-DC或HPL-IFN-DC进行的WT1-CTL诱导的对比的图；
图60是表示由IL-4-DC(WT1后脉冲)或HPL-IFN-DC(WT1前脉冲)诱导的WT1-CTL的总细胞数的图。
具体实施方式
下面对本发明进行详细说明。
在本说明书中，“A～B”(A和B是数值)如无特别说明，则表示“A以上且B以下”。本说明书中使用的“％”如无特别说明，则表示“v/v％”。
本发明是从单个核细胞中分离出单核细胞的方法，以及由单核细胞制备树突状细胞(Dendritic cell：DC)的方法。
单个核细胞是白细胞，单个核细胞分为单核细胞(Monocyte)和淋巴细胞(Lymphocyte)。单个核细胞包括外周血来源的单个核细胞(PBMC：Peripheral bloodmononuclear cells)、来自骨髓的单个核细胞、来自脾脏细胞的单个核细胞、来自脐带血的单个核细胞。其中优选外周血来源的单个核细胞。单个核细胞也可以使用血液成分单采(apheresis)装置进行分离。单个核细胞既可以使用未冷冻的新鲜单个核细胞，也可以使用冷冻的单个核细胞。在使用冷冻的单个核细胞的情况下，最终获得的树突状细胞的细胞毒活性也不会下降。
在本发明的由单核细胞制备树突状细胞的方法中，单核细胞既可以使用通过本发明的从单个核细胞中分离单核细胞的方法分离出的单核细胞，也可以使用通过其他方法分离出的单核细胞。单核细胞包括来自外周血的单核细胞、来自骨髓的单核细胞、来自脾细胞的单核细胞、来自脐带血的单核细胞，其中优选来自外周血的单核细胞。当以CD14阳性为特征，从生物体内提取单核细胞时，可以以CD14的存在为指标，使用FACS(Fluorescentactivated cell sorter，荧光激活细胞分选仪)、流式细胞仪、磁性分离装置等分离单核细胞。另外，也可以使用血液成分单采(apheresis)装置进行分离。此外，也可以使用Ficoll(注册商标)等通过密度梯度离心分离来进行分离。对单核细胞的来源动物种没有限制，可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴、人等哺乳动物。作为FACS、流式细胞仪，例如可以使用FACS vantage(贝克顿迪金森公司生产)、FACS Calibur(贝克顿迪金森公司生产)等。另外，作为磁性分离装置，例如可以使用autoMACS(注册商标)(美天旎生物技术)等。例如，可以以CD14的表达为指标，使用结合有CD14的CD14微珠并利用AutoMACS(注册商标)和CliniMACS(注册商标)技术从外周血单个核细胞(PBMC)中分离。
1.从单个核细胞中分离单核细胞
在本发明的从单个核细胞中分离单核细胞的方法中，将单个核细胞接种在黏附培养皿中进行培养，使单核细胞与培养皿黏附，由此与淋巴细胞分离。
这时，作为培养液，使用添加了血小板裂解物(PL：Platelet lysate)的未添加血清的培养基(无血清培养基)。优选地，使用人血小板来源的人血小板裂解物(HPL：Humanplatelet lysate)。HPL是纯化的人血小板裂解物，可以从血浆中的血小板纯化而得到。HPL含有PDGF、TGF-β、IGF-1、EGF等血小板源性生长因子。
HPL的制备方法没有限制，例如可以通过将血小板冷冻裂解而获得。具体地，为了使血小板裂解，可以将血浆中的1.5×109/mL的血小板在-80℃冷冻裂解。另外，优选将多名供血者的血小板聚集起来而制造。作为HPL，可以使用市售产品。例如，可以使用UltrGRO(商标)-PURE、UltrGRO(商标)-PURE GI(AventaCell BioMedical公司)等。HPL在同一生产商的批次间差异小，在不同生产商之间的差异也小。
单个核细胞在体外的培养可以使用公知的人类淋巴类细胞的培养技术来进行。
添加HPL的未添加血清的培养基没有限制，使用能够用于培养人类淋巴类细胞的培养基即可。例如，可以使用DCO-K(日水制药株式会社)、AIM-V(注册商标，赛默飞世尔科技公司)、X-VIVO5(注册商标)、HL-1(商标，LONZA株式会社)、BIOTARGET(商标)-1SFM(科斯莫生物技术有限公司)、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等。其中，优选DCO-K(日水制药株式会社)。
在这些未添加血清的培养基中，添加1(v/v)％～10(v/v)％、优选2(v/v)％～7.5(v/v)％、进一步优选2.2(v/v)％～5.3(v/v)％、特别优选2.5(v/v)％～5(v/v)％的上述HPL使用即可。如上所述，HPL在同一生产商的批次间差异小，在不同生产商之间的差异也小，因此不限于生产商和批次，使用上述浓度的HPL就能够获得相同的效果。
单核细胞具有强力的容器黏附特性，因此可以利用以下方式进行分离回收：通过贴壁培养对单个核细胞进行培养，使单核细胞黏附在培养皿、培养盘、孔板、烧瓶等培养容器上，然后除去未黏附的细胞。使用细胞能够黏附上的贴壁细胞培养容器即可。贴壁细胞培养容器可以使用广泛市售的产品。贴壁细胞培养容器可以使用低黏附培养容器，也可以使用高黏附培养容器。
培养时的pH值优选为大约6～8。培养通常可以在大约30～40℃进行15分钟～12小时，更优选进行15分钟～6小时，进一步优先进行15分钟～3小时，更进一步优选进行15分钟～1小时，再进一步优选进行20分钟～45分钟，特别优选进行25分钟～35分钟。这时，当培养时间达到1天以上时，细胞会游离、剥离。在培养时，可以根据需要，加入培养基的更换、通气、搅拌。例如，可以加入二氧化碳，二氧化碳的添加量为2.5％～10％，优选为2.5％～7.5％，进一步优选为5％。
贴壁培养后，通过洗涤除去未贴壁的细胞，可以作为贴壁培养而将单核细胞分离。此时，洗涤进行1～5次，优选进行2次。
2.由单核细胞制备树突状细胞(Dendritic cell：DC)的方法
可以使用通过上述从单个核细胞中分离单核细胞的方法分离出的单核细胞来制备树突状细胞。分离的单核细胞通过非贴壁培养即悬浮培养进行培养。为了进行非贴壁培养，使用非黏附性的孔板、培养皿、烧瓶等培养器即可。非黏附性的培养器是使用超亲水性聚合物、磷脂质聚合物、MPC聚合物等化合物覆盖培养皿表面，或者不使用覆盖剂而进行亲水性处理，使细胞不贴壁的培养器。例如，可以使用作为低附着性培养皿的HydroCell(商标)(CellSeed公司)、EZ-BindShut(注册商标)II(Iwaki)、Nunclon(商标)Vita、LIPIDURE(注册商标)Coat(日油株式会社)等。
首先将分离的单核细胞分化诱导为DC。通过向DC的分化诱导，会获得未成熟DC。然后，在特定的细胞因子的存在下对未成熟DC进行培养使其成熟，可以获得具有细胞毒性的成熟DC。
向DC的分化诱导可以通过在含有具有DC的分化诱导活性的细胞因子和HPL的未添加血清的培养基中进行培养来进行。作为未添加血清的培养基，可以使用上述从单个核细胞中分离单核细胞的方法中记载的未添加血清的培养基，其中优选DCO-K(日水制药株式会社)。另外，关于HPL，可以使用上述从单个核细胞中分离单核细胞的方法中记载的HPL，添加浓度也与上述从单个核细胞中分离单核细胞的方法中记载的浓度相同。
作为具有DC的分化诱导活性的细胞因子，可以使用GM-CSF(粒细胞单核细胞集落刺激因子)和IFN-α。IFN-α优选为PEG化干扰素(IFN)-α(PEG-IFN-α)。
PEG-IFN-α是由聚乙二醇(PEG)与IFN-α结合而成的。作为PEG-IFN-α，优选为PEG-IFN-α-2b。作为PEG-IFN-α，可以使用市售的PEG-IFN制剂。作为市售的PEG-IFN-α制剂，列举有作为PEG-IFN-α-2b制剂的佩乐能(PEGINTRON)(注册商标){通用名：聚乙二醇干扰素α-2b(基因重组)[Peginterferon Alfa-2b(Genetic Recombination)]}。
佩乐能(注册商标)以结构式H3C-(O-CH2CH2)n-OCO-干扰素α-2b来表示，由1分子的聚乙二醇单甲醚(平均分子量：约12,000)通过羰基与干扰素α-2b(基因重组)(分子量：19268.91)的氨基酸残基(Cys1、His7、Lys31、His34、Lys49、Lys83、Lys112、Lys121、Tyr129、Lys131、Lys133、Lys134、Ser163和Lys164)中的一处共价结合而形成，分子量约为32,000，分子式表示为C860H1353N229O255S9。CAS登录号为215647-85-1。
用于培养的GM-CSF的浓度，例如在以104～107细胞/ml的浓度使用单核细胞时，为100U/mL～10,000U/mL，优选为500U/mL～2,000U/mL，进一步优选为800U/mL～1,200U/mL，特别优选为1,000U/mL。或者其为10ng/mL～1,000ng/mL，优选为20ng/mL～200ng/mL，进一步优选为20ng/mL～100ng/mL。PEG-IFN-α的浓度为100ng/mL～10μg/mL，优选为500ng/mL～5μg/mL，进一步优选为500ng/mL～2μg/mL。
在HPL、GM-CSF和PEG-IFN-α存在下的培养进行2～5天，优选进行3～4天，进一步优选进行3天。通过在HPL、GM-CSF和PEG-IFN-α的存在下的培养，可以获得未成熟DC。
未成熟DC的成熟可以通过在成熟培养基中对未成熟DC进行培养来进行。成熟培养基使用含有HPL、GM-CSF、PEG-IFN-α、前列腺素E2(PGE2)和OK432的未添加血清的培养基。GM-CSF、PEG-IFN-α和前列腺素E2是细胞因子。作为未添加血清的培养基，可以使用上述从单个核细胞中分离单核细胞的方法中记载的未添加血清的培养基，其中优选DCO-K(日水制药株式会社)。另外，关于HPL，可以使用上述从单个核细胞中分离单核细胞的方法中记载的HPL，添加浓度也与上述从单个核细胞中分离单核细胞的方法中记载的浓度相同。
用于培养的GM-CSF的浓度，例如在以104～107细胞/ml的浓度使用单核细胞时，为100U/mL～10,000U/mL，优选为500U/mL～2,000U/mL，进一步优选为800U/mL～1,200U/mL，特别优选为1,000U/mL。或者其为10ng/mL～1,000ng/mL，优选为20ng/mL～200ng/mL，进一步优选为20ng/mL～100ng/mL。PEG-IFN-α的浓度为100ng/mL～10μg/mL，优选为500ng/mL～5μg/mL，进一步优选为500ng/mL～2μg/mL。PGE2的浓度为1ng/mL～100ng/mL，优选为5ng/mL～50ng/mL，进一步优选为5ng/mL～20ng/mL。OK432的浓度为1μg/mL～100μg/mL，优选为5μg/mL～50μg/mL，进一步优选为5μg/mL～20μg/mL。
利用FACS等检测单核细胞或DC的表面抗原的表达，由此可以适当地确定获得目标分化程度的细胞的浓度。
利用成熟培养基进行的培养进行10～48小时，优选进行10～36小时，进一步优选进行10～24小时，特别优选进行18～24小时，由此可以获得具有细胞毒性的DC。
用于从单个核细胞中分离单核细胞，并获得成熟细胞的总培养时间为3～7天，优选为4～6天，进一步优选为4～5天，特别优选为4天。
在含有HPL和IFN等细胞因子的未添加血清的培养基中进行培养的本发明的方法所制备的DC，称为HPL-IFN-DC。与此相对，在只有不含HPL这点与用于制备HPL-IFN-DC的未添加血清的培养基不同的未添加血清的培养基，即不含HPL的未添加血清的培养基中进行培养的方法所制备的DC，称为IFN-DC。
3.获得的HPL-IFN-DC的特性
(1)活细胞率和收率
在本发明的方法中，由于是通过非贴壁培养来从单核细胞制作DC，因此DC的活细胞率和收率都高。获得的DC的活细胞率为NIH(National Institutes of Health，美国国立卫生研究院)标准的70％以上，优选80％以上，进一步优选90％以上，进一步优选95％以上，进一步优选97％以上。另外，DC的回收率(获得的DC活细胞数相对于接种的单核细胞数的比例)为5％以上，优选为10％以上，进一步优选为15％以上，特别优选为20％以上。另外，DC的纯度为90％以上，优选为95％以上。在HPL-IFN-DC中，活细胞率、收率和纯度均高于IFN-DC。
(2)表面抗原
HPL-IFN-DC具有在形态学上有树突状突起的特征，此外，利用FACS等进行分析，作为表面抗原，CD14、CD16、CD56、CD83、CD86、CCR7(CD197)、HLA-ABC、HLA-DR为阳性。CD14是单核细胞的标记，CD56是细胞黏附分子，CD197(CCR7)是促进向淋巴结移动的分子，CD11c是树突状细胞标记。另外，CD80和CD40是与向T细胞提呈抗原的能力相关的共刺激分子，CD83是树突状细胞的成熟标记，HLA-DR是参与抗原提呈的分子。
这些表面抗原是阳性还是阴性，可以通过显微镜观察等对细胞是否被针对这些抗原的抗体染色来进行确定，抗体利用显色酶、荧光化合物等进行标记。例如，使用这些抗体对细胞进行免疫染色，确定有无表面抗原即可。另外，也可以使用结合有该抗体的磁珠来确定。此外，也可以使用FACS或流式细胞仪来确定有无表面抗原。表面抗原为阴性，是指当如上使用FACS进行分析时，未被分选为阳性细胞；以及在通过免疫染色检测表达时，未确认到表达，即使存在无法通过这些方法检测出的程度的表达，也会判断为阴性。
对比HPL-IFN-DC和IFN-DC的表面抗原的表达可以看出，HPL-IFN-DC上CD14、CD56、CCR7(CD197)和CD11c的表达与IFN-CD上的表达相比增加。在通过流式细胞术计算出细胞群体中表达各表面抗原的比例[阳性细胞(％)]的情况下，CD14在IFN-DC中为60％以下(中位数为35.8％)，而在HPL-IFN-DC中为50％以上(中位数为83.6％)；CD56在IFN-DC中为60％以下(中位数为37.6％)，而在HPL-IFN-DC中为50％以上(中位数为68.4％)；CCR7(CD197)在IFN-DC中为30％以下(中位数为10.3％)，而在HPL-IFN-DC中为20％以上(中位数为37.8％)。
即，HPL-IFN-DC中CD14阳性细胞(％)为IFN-DC中阳性细胞(％)的1.5～2.5倍；HPL-IFN-DC中CD56阳性细胞(％)为IFN-DC中阳性细胞(％)的1.5～2.5倍；HPL-IFN-DC中CCR7(CD197)阳性细胞(％)为IFN-DC中阳性细胞(％)的2.5～5倍，优选为3～5倍。
另一方面，HPL-IFN-DC上CD80、CD83、CD40和HLA-DR的表达与IFN-DC相比减少。在通过流式细胞术计算出细胞群体中表达各表面抗原的比例[阳性细胞(％)]的情况下，CD80在IFN-DC中为15％以上(中位数为84.0％)，而在HPL-IFN-DC中为60％以下(中位数为33.1％)；CD83在IFN-DC中为60％以上(中位数为86.8％)，而在HPL-IFN-DC中为80％以下(中位数为64.2％)；CD40在IFN-DC中为55％以上(中位数为98.6％)，而在HPL-IFN-DC中为95％以下(中位数为66.9％)；HLA-DR在IFN-DC中文95％以上(中位数为99.8％)，而在HPL-IFN-DC中为低于100％(中位数为92.7％)。
即，HPL-IFN-DC中CD80阳性细胞(％)为IFN-DC中阳性细胞(％)的0.3～0.5倍；HPL-IFN-DC中CD83阳性细胞(％)为IFN-DC中阳性细胞(％)的0.6～0.9倍；HPL-IFN-DC中CD40阳性细胞(％)为IFN-DC中阳性细胞(％)的0.5～0.8倍；HPL-IFN-DC中HLA-DR阳性细胞(％)为IFN-DC中阳性细胞(％)的0.8～0.95倍。
(3)抗原吞噬能力和降解能力
在HPL-IFN-DC中，与IFN-DC相比，抗原吞噬能力和抗原降解能力提高。例如，在成熟培养基中加入100μg/mL的FITC-葡聚糖(Dextran)(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)和10μg/mL的DQ-卵清蛋白(ovalbumin)(Molecular Probes)，培养24小时，之后，将回收的IFN-DC或HPL-IFN-DC用PBS洗涤2次，然后用1(v/v)％的FBS-PBS再悬浮，通过流式细胞术对吞噬能力和降解能力进行评价，从而得到了以下结果。FITC-葡聚糖ΔMFI(抗原吞噬能力)在IFN-DC中为30以下(平均17.1)，而在HPL-IFN-DC为50以上(平均68)。另外，DQ-卵清蛋白ΔMFI(抗原降解能力)在IFN-DC中为450以下(平均270.9)，而在HPL-IFN-DC为350以上(平均589.7)。
即，HPL-IFN-DC中FITC-葡聚糖ΔMFI(抗原吞噬能力)为IFN-DC中FITC-葡聚糖ΔMFI(抗原吞噬能力)的2～6倍，优选为3～5倍；HPL-IFN-DC中DQ-卵清蛋白ΔMFI(抗原降解能力)为IFN-DC中DQ-卵清蛋白ΔMFI(抗原降解能力)的1.5～3倍。
(4)细胞因子产生能力
下面的细胞因子产生量是将成熟HPL-IFN-DC在DCO-K培养基中悬浮以达到1×106细胞/mL的细胞密度，接种在培养皿中，在37℃、5％ CO2中培养24小时后，回收培养上清液，通过Bio-plex测定试剂盒(Bio-Rad Labs)对回收的培养上清液中的细胞因子进行测定时的值。另外，产生量是多次测定，例如n＝6的测定的平均值。
在HPL-IFN-DC中，使细胞毒性T细胞的诱导亢进的Th1细胞因子IL-12(p70)产生量与IFN-DC相比显著降低。IFN-DC的产生量平均为1.1pg/mL，而HPL-IFN-DC的产生量平均为0.18pg/mL。
另一方面，在HPL-IFN-DC中，抑制细胞毒性T细胞的诱导的Th2细胞因子IL-10和TGF-β的产生量与IFN-DC相比增加。关于IL-10，IFN-DC的产生量平均为11.47pg/mL，而HPL-IFN-DC的产生量平均为132.7pg/mL。另外，关于TGF-β，IFN-DC的产生量平均为8.02pg/mL，而HPL-IFN-DC的产生量平均为9.38pg/mL。
即，HPL-IFN-DC中IL-10的产生量为IFN-DC中产生量的8～15倍，优选为9～13倍；HPL-IFN-DC中TGF-β的产生量为IFN-DC中产生量的1.1～1.5倍。
另外，在HPL-IFN-DC中，引发炎症反应并参与T细胞活化和分化的TNF-α和IL-6的产生量与IFN-DC相比增加。关于TNF-α，IFN-DC的产生量平均为412.5pg/mL，而HPL-IFN-DC的产生量平均为1144.4pg/mL。另外，关于IL-6，IFN-DC的产生量平均为302.3pg/mL，而HPL-IFN-DC的产生量平均为2883pg/mL。
即，HPL-IFN-DC中TNF-α的产生量为IFN-DC中产生量的2～4倍；HPL-IFN-DC中IL-6的产生量为IFN-DC中产生量的8～15倍，优选为8～13倍。
因此，使DC分化和成熟时的培养基中的HPL的存在，会使Th1/Th2的细胞因子减少。
(5)细胞毒性T细胞诱导能力
在HPL-IFN-DC中，与IFN-DC相比，细胞毒性T细胞诱导能力增加。
(6)诱导的细胞毒性T细胞的抗原特异性IFN-γ产生能力
在HPL-IFN-DC中，与IFN-DC相比，诱导的细胞毒性T细胞的抗原特异性IFN-γ产生能力增加。
4.树突状细胞疗法
通过本发明的方法制备的DC能够用于树突状细胞疗法。作为树突状细胞疗法，例如列举有作为树突状细胞疫苗疗法而知晓的癌症免疫疗法。例如，通过本发明的方法由受试对象的单核细胞制备树突状细胞，将获得的树突状细胞回输给受试对象，由此可以将树突状细胞用于癌症治疗或预防等。此时，制备的树突状细胞可以癌症种类非特异性地发挥作用，发挥癌症治疗效果。另外，通过在制备树突状细胞时添加针对特定癌症有特异性的癌特异性抗原进行培养，癌特异性抗原会被树突状细胞内吞，可以获得具有癌种类特异性的抗癌免疫活性的树突状细胞。在制备树突状细胞时添加针对特定癌症有特异性的癌特异性抗原进行培养，称为通过癌特异性抗原对树突状细胞进行脉冲处理。关于脉冲，既可以在由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞时添加癌特异性抗原，也可以在由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞之后将树突状细胞与癌特异性抗原一起培养。前者称为前脉冲，后者称为后脉冲。另外，获得具有癌种类特异性的抗癌免疫活性的树突状细胞，称为诱导癌抗原-细胞毒性树突状细胞。作为癌特异性抗原，可以举出：白血病和其他各种癌中的WT1肽、乳腺癌中的HER2/neu、大肠癌中的CEA(癌胚抗原)、黑色素瘤(恶性黑色素瘤)中的MART-1(melan-a蛋白)和MEGA(Melanoma antigen，黑色素瘤抗原)、肝细胞癌中的GPC3(Glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)、前列腺癌中的PAP(prostate acid phosphatase，前列腺酸性磷酸酶)和PSMA(prostate specific membrane antigen，前列腺特异性膜抗原)等。本发明中，该树突状细胞能够诱导癌种类特异性细胞毒性T细胞(CTL)。具有癌种类特异性的抗癌免疫活性的树突状细胞能够用于肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、食道癌、子宫癌、肾癌、膀胱癌、淋巴瘤/白血病、脑瘤、尿道癌、肾盂输尿管癌、间皮瘤等的治疗。
需要说明的是，受试对象中的癌抗原特异性的CTL的增殖可以通过四聚体法或酶联免疫斑点检测法进行确认。
本发明包括由单核细胞制备对癌抗原具有特异性的细胞毒性的树突状细胞的方法，该方法包括：在包括使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养对从外周血中分离的单核细胞进行培养，然后添加前列腺素E2和OK432，进一步通过非贴壁培养进行培养的由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞的方法中，在添加前列腺素E2和OK432时，进一步添加癌特异性抗原。在该方法中，例如，可以使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养进行2～5天的培养后，添加前列腺素E2、OK432和癌特异性抗原，进一步进行1～2天的培养。癌特异性抗原的浓度没有限制，为0.1～1000μg/mL，优选为1～500μg/mL，进一步优选为5～300g/mL。
另外，本发明包含通过上述由单核细胞制备对癌抗原具有特异性的细胞毒性的树突状细胞的方法获得的对癌抗原具有特异性的细胞毒性的树突状细胞。
此外，也可以用于细菌和病毒的感染症的治疗。在感染症的治疗中，通过本发明的方法，在HPL、GM-CSF、PEG-IFN-α、PGE2和OK432的存在下利用非贴壁培养来培养单核细胞而制备的DC是有效的。可以通过皮内给药、皮下给药、静脉给药或淋巴结内给药等向受试对象给予制备的树突状细胞。给药量、给药时间可根据受试对象的疾病种类、疾病的严重程度、受试对象的状态进行适当决定。
5.DC分化诱导剂
本发明包括含有HPL、GM-CSF和PEG-IFN-α的单核细胞来源的DC分化诱导剂。该DC分化诱导剂也可称为DC制备剂。该DC分化诱导剂还可以含有PGE2和OK432。DC分化诱导剂可以由含有HPL、GM-CS与PEG-IFN-α的第一试剂和含有PGE2与OK432的第二试剂组成，本发明也包括含有该第一试剂和第二试剂的DC分化诱导试剂盒。含有HPL、GM-CSF与PEG-IFN-α的第一试剂用于分化诱导未成熟DC，含有PGE2与OK432的第二试剂用于使未成熟DC成熟。
通过本发明的方法，DC被诱导为成熟DC。另外，本发明也包括通过本发明的方法获得的DC和含有该DC的细胞群体。该细胞群体中，含有10％以上、30％以上、50％以上、70％以上、90％以上或95％以上的DC。
[实施例]
下面通过以下实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例的限制。
在本实施例中，将使用添加了HPL和IFN的培养基制备的DC称为HLP-IFN-DC；将使用未添加HPL而添加了IFN的培养基制备的DC称为IFN-DC。
[实施例1]使用优化了添加物(ABS或HPL)的未添加血清的培养基(DCO-K)的单核细胞分离方法和IFN-DC制作方法的建立
本实施例作为预备试验而进行。
本实施例的目的在于建立通过使用浓度得到了优化的添加物[Human serum typeAB(人AB血清)(ABS)(biowest公司生产)和Human platelet lysate(人血小板裂解物)(HPL)(AnentaCell Biomedical公司生产)]的未添加血清的培养基(DCO-K培养基，日水制药株式会社生产)来从外周血单个核细胞中分离单核细胞的方法和制作IFN-DC的方法。本实施例列举了将DCO-K用作未添加血清的培养基(无血清培养基)，但是其他未添加血清的培养基(无血清培养基)也能获得同样的结果。
评价项目如下所述。
(1)使用优化添加了ABS或HPL的DCO-K培养基制作IFN-DC，使用相差显微镜[EVOS(注册商标)FL细胞成像系统]对细胞形态进行了观察。
(2)使用台盼蓝对死细胞进行染色，从而测定IFN-DC的活细胞率，利用流式细胞术(Flow cytometry，FCM)对收率、纯度进行了评价。
(3)使用针对附加有FITC、PE、APC荧光色素的DC标记的抗体对细胞进行染色，利用流式细胞术对IFN-DC的表型进行了研究。
在树突状细胞(DC)疫苗的制作中，一般会使用从外周血单个核细胞(包含单核细胞和淋巴细胞)(PBMC：Peripheral blood mononuclear cells)中分离作为原料的单核细胞的贴壁培养法。单核细胞具有强力黏附在培养皿上的特性。将通过血液成分单采采集的患者来源的PBMC悬浮在利用添加物[最终浓度5(v/v)％的ABS或5(v/v)％的HPL]制备的未添加血清的培养基(DCO-K)中或者单独悬浮在AIM培养基(以往的方法，AIM-V培养基)中，接种到黏附培养皿中。在37℃、5％CO2的条件下进行24小时或30分钟的培养，由此使细胞黏附在培养皿底面上，筛选出单核细胞(IFN-DC疫苗的原料)和淋巴细胞。然后，对于贴壁细胞，使用添加了1μg/mL的佩乐能、100ng/mL的GM-CSF和最终浓度5(v/v)％的HPL的DCO-K培养基或AIM培养基，将其分化诱导为IFN-DC。从分化开始时起3天后，回收细胞，使用在低黏附培养皿(住友电木株式会社，Prime surface)中混合各种试剂类(1μg/mL佩乐能、100ng/mLGM-CSF、10μg/mL OK432、10ng/mL PGE2)而制成的成熟培养基和20μg/mL的肿瘤抗原肽(WT-1：Wilms tumor1)进行18～24小时的培养，由此使IFN-DC成熟。使用通过上述各种条件制作的IFN-DC，进行了预备试验1～7。
预备试验1
预备试验1：在24小时的外周血单个核细胞的贴壁培养和分化成熟过程中，使用添加了最终浓度5(v/v)％的HPL或最终浓度5(v/v)％的ABS的DCO-K培养基，或者单独使用AIM-V培养基，制作IFN-DC，将细胞形态、活细胞率、纯度(使用流式细胞仪，从FSC/SSC中确定DC组分，计算出DC组分的比例作为纯度)、淋巴细胞混入率和表型进行了对比(n＝1)。将预备试验1的步骤示于图1。
将PBMC悬浮在利用添加物[最终浓度5(v/v)％的ABS或5(v/v)％的HPL]制备的未添加血清的培养基(DCO-K)中或者单独悬浮在AIM培养基(以往的方法)中，接种到黏附培养皿(使用低黏附培养皿)中，30分钟后洗涤掉非贴壁细胞，然后用相差显微镜观察了细胞形态(第1天)。将细胞的观察图像示于图2。(a)表示仅用DCO-K培养的结果，(b)表示用DCO-K+ABS培养的结果，(c)表示用DCO-K+HPL培养的结果，(d)表示用AIM-V培养的结果。
通常在树突状细胞的制备过程中，当从通过血液成分单采采集的患者来源的PBMC中筛选单核细胞和淋巴细胞时，会在未添加血清的培养基(AIM-V)中接种外周血单个核细胞，30分钟后洗涤细胞，再进行24小时的贴壁培养，然后再次洗涤掉非贴壁细胞。因此，对于通过血液成分单采采集的患者来源的PBMC，使用添加了ABS或HPL的未添加血清的培养基(DCO-K)进行24小时的培养，使用相差显微镜对细胞进行了观察(n＝1)。
将PBMC悬浮在利用添加物[最终浓度5(v/v)％的ABS或5(v/v)％的HPL]制备的未添加血清的培养基(DCO-K)中或者单独悬浮在AIM培养基(以往的方法)中，接种到黏附培养皿中，30分钟后洗涤掉非贴壁细胞(第1天)，然后在24小时后观察了使用培养基进行了洗涤后的细胞形态(第2天)。将结果示于图2-2。与(a)相比，在添加了ABS或HPL的DCO-K培养基[(b)和(c)]中有更多的细胞游离，细胞通过洗涤操作被剥离。贴壁后，静置1天，细胞发生游离。另外，在以往的方法(d)中，进行洗涤操作，可以明确地区分出贴壁细胞和游离细胞。
通过标记抗体，利用流式细胞术检测到了在各条件下制作的IFN-DC上表达的细胞表面抗原(n＝1)。
将仅通过DCO-K培养基制作的IFN-DC的结果示于图3。在仅通过DCO-K培养基制作的IFN-DC中，检测到了与向T细胞提呈抗原的能力相关的共刺激分子CD40、CD86、CD80的表达和作为树突状细胞成熟指标的CD83、参与抗原提呈的HLA-DR以及HLA-ABC的表达。另外，虽然检测到了未成熟样的树突状细胞(CD80-/CD83-/CD86-和HLADR/HLA-ABC的亚组分)，但这表明细胞状态导致的成熟反应的不良。
将通过DCO-K+ABS培养基制作的IFN-DC的结果示于图4。在(b)中，当通过添加了血清(ABS)而形成的DCO-K培养基制作IFN-DC时，确认到了与(a)相似的表型的表达。还确认到了比(a)更多的不均匀的亚组分(CD80-/CD83-/CD86-)。
将通过DCO-K+HPL培养基制作的IFN-DC(HPL-IFN-DC)的结果示于图5。在(c)中，与(a)、(b)和使用了以往的培养基的(d)相比，确认到了CD80、CD86、CD83的表达降低和CD14、CD16、CCR7、HLA-DR、HLA-ABC的表达。尤其是明显确认到CD14、CD16和CD56的表达(CD14++CD16+CD56+CCR7+HLA-ABC+DR+的均匀的细胞群体)，显示出了与(d)那样的以往的IFN-DC完全不同的表型。
将通过以往的AIM-K培养基制作的IFN-DC的结果示于图6。在以往的方法中确认到了CD14的弱阳性和CD80、CD86、CD83、HLA-DR、HLA-ABC、CD40的表达，因此与相关文献(Terutsugu Koya et.al.Scientific reports 7,Article number 42145：2017)所报导的表型相似。
在回收在各条件下制作的IFN-DC制作DC疫苗时，利用流式细胞术对作为质量的指标的、回收IFN-DC时的纯度和淋巴细胞的混入率进行了评价。贴壁30分钟后，立即开始了分化诱导。将结果示于图7。在(a)和(b)中观察到淋巴细胞混入较多，而在添加ABS(a)或HPL(c)制作的IFN-DC中确认到淋巴细胞混入率较低，尤其是在添加了HPL的情况下，淋巴细胞混入率明显很低。纯度方面，(c)较高。这表明，在通过添加HPL来从第2天的PBMC中筛选单核细胞和淋巴细胞的过程中，淋巴细胞样的游离细胞可能正在通过剥离而被除去。
将活细胞率和收率的总结结果示于图8。添加了HPL的未添加血清的培养基DCO-K(a)的活细胞率非常高。(c)和(d)收率相同，(a)略低，(b)则明显较低。收率％＝第6天回收时的活细胞数/第1天接种时的活细胞数。在回收时的活细胞率方面，使用添加了HPL的DCO-K培养基制作的IFN-DC(c)显示出了非常高的值。
预备试验1的总结如下。
与以往的方法(d)相比，使用未添加血清的培养基DCO-K(日水制药株式会社)来制作IFN-DC(a)是可行的。使用添加了HPL的DCO-K培养基制作的IFN-DC(c)与其他组[(a)、(b)、(d)]相比，确认到了活细胞率和纯度的提升。进而，在表型方面，显示出了与CD14++、CD16+、CD56+等以往的IFN-DC不同的表型，形成了CD40+、CD86+、HLA-ABC+、HLA-DR+的极为均匀的细胞群体。
由上述结果可知，在IFN-DC的制作中，虽然从活细胞率和纯度的观点来看HPL和DCO-K是合适的，但是在从PBMC中分离单核细胞的步骤中，由于贴壁后静置1天会使细胞发生游离和剥离，因此推测收率较低。因此，定为以下步骤：在接种后30分钟的黏附反应之后，在各培养基中洗涤2次，继而进行分化诱导。
预备试验2
预备试验2：在30分钟的外周血单个核细胞的贴壁培养和分化成熟过程中，使用添加了最终浓度5(v/v)％的HPL或最终浓度5(v/v)％的ABS的DCO-K培养基，或者单独使用AIM-V培养基，制作IFN-DC，将细胞形态、活细胞率、纯度、淋巴细胞混入率和表型进行了对比(n＝1)。
将预备试验2的步骤示于图9。
在从通过血液成分单采采集的PBMC中分离单核细胞和淋巴细胞的步骤中，使用加入了(b)最终浓度5(v/v)％的ABS或(c)最终浓度5(v/v)％的HPL的DCO-K培养基，进行了30分钟的贴壁培养。接着，用培养基洗涤2次，然后用相差显微镜确认到了细胞(n＝1)。将细胞的观察图像示于图10。(a)表示仅用DCO-K培养的结果，(b)表示用DCO-K+ABS培养的结果，(c)表示用DCO-K+HPL培养的结果。
(a)中除了贴壁细胞以外，还混入了很多淋巴细胞样细胞，这表明可能无法通过洗涤来除去。在加入了添加物的DCO-K培养基[(b)和(c)]中，与(a)相比，可以观察到黏附在底面上的细胞，这表明很多淋巴细胞样细胞通过洗涤被去除。
洗涤后，添加GM-CSF/IFN-α，开始进行分化诱导。
利用流式细胞术，对在各条件下制作的IFN-DC的细胞表面抗原的表达进行了评价(n＝1)。
将仅通过DCO-K(a)进行培养时的结果示于图11。与预备试验1的(a)的结果相比，检测到了很多CD14的弱阳性、CD80、CD86、CD83、HLA-ABC、HLA-DR阳性细胞，显示出了与以往的方法[预备试验1的(d)]相似的表型。
将通过DCO-K+ABS(b)进行培养时的结果示于图12。与(a)相比，确认到CD14表达增加、CD80/CD83表达降低，显示出了与未成熟样树突状细胞的表型相似的性状。
将通过DCO-K+HPL(c)进行培养时的结果示于图13。与其他组[(a)和(b)]相比，确认到CD80/CD83的表达下降和CD14++、CD16+、CD56+、HLA-DR/HLA-ABC+的均匀的细胞群体，显示出了与预备试验1相同的趋势。
在回收在各条件下制作的IFN-DC制作DC疫苗时，利用流式细胞术对作为质量的指标的、回收IFN-DC时的纯度和淋巴细胞的混入率进行了评价。将结果示于图14。与其他组[(a)和(b)]相比，接种PBMC后，在30分钟的单核细胞分离步骤中，使用添加了HPL的DCO-K培养基(c)，则淋巴细胞混入率明显较低。淋巴细胞混入率低于1％。即使在贴壁30分钟后立即开始分化诱导，在(a)中也观察到了很多淋巴细胞混入。
将活细胞率和收率的总结结果示于图15。收率％＝第5天回收时的活细胞数/第1天接种时的活细胞数。这是将第1天接种的1天缩短后的第5天。在活细胞率方面，与其他组[(a)和(b)]相比，添加了HPL的DCO-K培养基(c)显示出了明显较高的值(n＝1)。
预备试验2的总结如下。
通过血液成分单采采集的患者来源的PBMC中的单核细胞的分离步骤中，可以通过接种后30分钟的黏附反应进行IFN-DC的分化诱导。这时，使用添加了HPL的DCO-K培养基(c)，使得活细胞率、纯度和回收率与其他组[(a)和(b)]相比，显示出了明显较高的值。在细胞表面抗原的表达方面，在添加了HPL的条件下，虽然与预备试验1同样地显示出了CD14++、CD16+、CD56+、CD86+、CCR7+、HLA-ABC+、HLA-DR+的均匀的细胞群体，但CD80和CD83显示出了较低的趋势。使用添加了ABS的DCO-K培养基，使活细胞率和收率显示出较低值，进而显示出了CD80组分的下降，因此将其从以后的预备试验中排除。
预备试验3
预备试验3：在30分钟的外周血单个核细胞的贴壁培养中，使用添加了各浓度的HPL[2.5(v/v)％或5(v/v)％]的DCO-K培养基，进行了单核细胞和淋巴细胞的筛选。接着，在分化和成熟过程中，将不在DCO-K培养基中添加HPL而制作的IFN-DC的细胞形态、活细胞率、纯度、淋巴细胞混入率和表型进行了对比(n＝1)。
将预备试验3的步骤示于图16。
预备试验3中，在IFN-DC的制作过程中，唯独使用PBMC的通过低黏附培养皿进行的单核细胞的分离步骤在使用添加了各浓度的HPL[2.5(v/v)％和5(v/v)％]的DCO-K培养基的情况下，才未在细胞中观察到较大的差异(n＝1)。将细胞的观察图像示于图17。(a)表示以2.5(v/v)％进行培养的结果，(b)表示以5(v/v)％进行培养的结果。
利用流式细胞术，对IFN-DC的细胞表面抗原的表达进行了评价(n＝1)。将通过HPL5(v/v)％进行培养时的结果示于图18，将通过HPL 2.5(v/v)％进行培养时的结果示于图19。
在回收在各条件下制作的IFN-DC制作DC疫苗时，利用流式细胞术对作为质量的指标的、回收IFN-DC时的纯度和淋巴细胞的混入率进行了评价。将结果示于图20。唯独在使用PBMC的通过低黏附培养皿进行的单核细胞的分离步骤中，在使用添加了各浓度的HPL[2.5(v/v)％和5(v/v)％]的DCO-K培养基制作的IFN-DC中，淋巴细胞混入率显示出了较低值(n＝1)。
将活细胞率和收率的总结结果示于图21。收率％＝第5天回收时的活细胞数/第1天接种时的活细胞数。这是将第1天接种缩短1天后变成的第5天。在活细胞率方面，两组显示出了76％～77％的值，没有确认到较大的差异(n＝1)。
预备试验3的总结如下。
在IFN-DC的制作过程中，在将HPL只用于单核细胞的分离步骤的情况下，在单核细胞的黏附性能方面没有观察到较大差异。
另外，虽然确认到IFN-DC的淋巴细胞混入率大幅降低，但在活细胞率和收率方面，在分化、成熟时也显示出了比添加了HPL的条件(预备试验1～2)低的值。
在表型方面，则与仅使用DCO-K制作的IFN-DC[通过预备试验1和2：(a)]相似。因此，在使用HPL制作IFN-DC时，可以期待活细胞率、收率和淋巴细胞混入率的提高。
预备试验4
在通过预备试验4制作IFN-DC时，对HPL的最佳浓度进行了研究。
预备试验4：在30分钟的外周血单个核细胞的贴壁培养和分化成熟过程中，将使用添加了各浓度[0～10(v/v)％]的HPL的DCO-K培养基制作的IFN-DC的细胞形态、活细胞率、纯度、淋巴细胞混入率和表型进行了对比(n＝3)。
将预备试验4的步骤示于图22。
预备试验4中，从单核细胞的分离步骤开始到分化、成熟过程为止，对使用添加了各浓度[0(v/v)％、1(v/v)％、5(v/v)％、10(v/v)％]的HPL的DCO-K培养基制作IFN-DC时的活细胞率、收率、淋巴细胞组分混入率和表型的变化进行了评价。将结果示于图23。A表示活细胞率，B表示收率，C表示淋巴细胞组分混入率。与仅通过DCO-K(a)制作的IFN-DC相比，在使用5(v/v)％的HPL(c)的情况下，活细胞率和收率最高(n＝3)。
利用流式细胞术，对通过各浓度[0(v/v)％、1(v/v)％、5(v/v)％、10(v/v)％]制作的IFN-DC的表型进行了评价(n＝3)。将结果示于图24。
与仅使用DCO-K(a)的情况相比，CD14和CD56的表达依赖于HPL的浓度而增加，虽然CD80和CD83的表达下降，但确认到依赖于HPL的浓度而恢复。进一步通过点阵图进行评价时，确认到CD86+HLA-ABC+DR+的均匀的细胞群体依赖于HPL的浓度而收敛。
利用流式细胞术，对通过HPL 1(v/v)％～10(v/v)％进行培养时的IFN-DC的细胞表面抗原的表达进行了评价(n＝1)。将通过HPL 10(v/v)％进行培养时的结果示于图25。确认到CD80/CD86和HLA-ABC/HLA-DR的细胞群体依赖于HPL的浓度而收敛。
预备试验4的总结如下。
从单核细胞的分离步骤开始到分化成熟过程为止，使用添加了各浓度[1(v/v)％、5(v/v)％、10(v/v)％]的HPL的DCO-K培养基制作IFN-DC，利用流式细胞术对活细胞率、收率、纯度和表型进行了评价。
在以HPL 1(v/v)％～10(v/v)％的浓度制作的IFN-DC中，确认到CD80/CD86的表达水平依赖于浓度而恢复，以及HLA-ABC/HLA-DR的细胞群体依赖于浓度而收敛。进一步以5(v/v)％的浓度添加HPL，在制作的IFN-DC中，活细胞率和收率显示出了最高的值。预备试验4的结果表明，在HPL-IFN-DC的制作中，从制造费用、活细胞率、收率和纯度来看，HPL的最佳浓度为5(v/v)％。
预备试验5
预备试验5：对在使用HPL制作IFN-DC时，在成熟过程的阶段是否添加试剂类(HPL、OK432、细胞因子)所引起的表型、活细胞率、收率和纯度的变化进行了对比和研究(n＝1)。
将预备试验5的步骤示于图26。
预备试验5中，在HPL-IFN-DC的制作过程中，对成熟培养基中的各试剂的必要性进行了评价(n＝1)。在HPL-IFN-DC的成熟过程中，使用了各组分的成熟混合物(成熟培养基)[(a)～(d)]。将使用的成熟混合物[(a)～(d)]的组分(B)和IFN-DC的显微镜图像(A)示于图27-1。如图27-1所示，作为添加到成熟混合物中的细胞因子，使用了GM-CSF、IFN-α2b和PGE2。
在HPL-IFN-DC的成熟过程中，在使用各组分的成熟混合物[(a)～(d)]的情况下，均确认到树突状突起，在细胞形态方面未确认到明显的变化。
利用流式细胞术，对回收IFN-DC时的淋巴细胞的混入率进行了评价。将结果示于图27-2。在预备试验5中，由于在单核细胞的黏附分离步骤中使用了HPL[5(v/v)％]，因此淋巴细胞混入率均低于1％(n＝1)。
图28示出了在各条件下制作的IFN-DC的活细胞率(A)、收率(B)和淋巴细胞混入率(C)。由于在成熟过程中除去了HPL、OK432或细胞因子，因此活细胞率和收率显示出了较低值(n＝1)。
利用流式细胞术，对使用成熟培养基制作HPL-IFN-DC时的表型分析进行了评价(n＝1)。
图29示出了在各条件下制作的IFN-DC的表型分析结果。与(a)相比，在去除了HPL的成熟培养基(b)中，CD80、CCR7、CD40、CD11c的表达显示出较低趋势。对比(a)和(c)可知，由于从成熟培养基中去除了细胞因子和OK432，因此确认到作为DC的抗原提呈能力的指标的CD83、CD40、CCR7的表达降低。
从预备试验5的结果确认到，在HPL-IFN-DC的制作步骤中，成熟时的HPL的有无会影响到活细胞率和收率。另外，确认到当在成熟培养基中去除OK432和细胞因子时，与抗原提呈能力相关的CD83、CD40的表达降低，以及与淋巴细胞诱导能力相关的CCR7的表达降低，因此表明HPL-IFN-DC的功能方面有所下降。因此，在HPL-IFN-DC的制作过程中，必须添加HPL、细胞因子、OK432。
预备试验6
作为IFN-DC的特征之一，具有杀伤癌细胞的细胞毒活性。对使用添加有HPL的DCO-K培养基制作的IFN-DC(HPL-IFN-DC)的细胞毒性进行了考察。另外，为了对HPL-IFN-DC的起始原料(PBMCs)的保存状态是否会影响细胞毒性进行评价，对由新鲜的PBMC或冷冻保存的PBMC制作的HPL-IFN-DC的细胞毒活性进行了对比。
预备试验6：将癌细胞株的慢性髓性白血病株K562(ATCC,Mianassas,VA,USA)，用添加有荧光色素羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；5μM；Molecular Probes)的含0.1％ FBS的PBS以1×106细胞/mL进行悬浮，在37℃以10分钟的条件进行反应后，用AIM-V培养基进行了洗涤。使用含10(v/v)％FBS的AIM-V培养基，将用5×105细胞的HPL-IFN-DC(效应细胞，未染色)和CFSE染色的癌细胞(K562：靶细胞)按照E:T＝50:1的比例混合后，在37℃进行18小时的反应。用FACS流式缓冲液洗涤2次后，为了判定死细胞，用2μg/mL的碘化丙啶(PI；西格玛奥德里奇公司，日本东京)进行10分钟染色，使用流式细胞仪进行分析。将除去了自然死细胞的CFSE阳性K562细胞中的PI阳性细胞的比例作为细胞毒活性(％cytotoxicity)进行了评价(n＝2)。
图30示出了预备试验6的步骤。
以前，小屋等人报告称，使用CD14微珠(美天旎生物技术，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)从患者来源的PBMC中纯化单核细胞，进而使用未添加血清的培养基(AIM-V)制作的IFN-DC具有细胞毒活性(Koya et al.Scientific Report 7,Article number：42145：2017)。
因此，对使用添加有HPL的未添加血清的培养基(DCO-K)制作的IFN-DC中的细胞毒活性进行了测定。另外，由于表明IFN-DC的细胞毒活性可能会因冷冻保存而损失，因此也额外对冷冻和未冷冻情况下的细胞毒活性进行了评价(n＝2)。
图31和图32示出了使用新鲜或冷冻保存的PBMC制作的HPL-IFN-DC的细胞毒活性测定结果。图31表示使用样本#10的情况的结果，图32表示使用IFNDC-KMU-000作为样本的结果。A表示对照组(k562)，B表示使用新鲜PBMC的情况的结果，C表示使用冷冻PBMC的情况的结果。图31中，新鲜HPL-IFN-DC为4.2％，冷冻HPL-IFN-DC为3.8％；图32中，新鲜HPL-IFN-DC为1.6％，冷冻HPL-IFN-DC为1.8％。
无论是否冷冻，使用添加有HPL的DCO-K培养基制作的HPL-IFN-DC都具有相同的细胞毒活性，没有差别。
从预备试验6可知，作为IFN-DC特征之一的细胞毒活性在HPL-IFN-DC中显示出了较低值。另外，由新鲜或冷冻保存的PBMC制作的HPL-IFN-DC在细胞毒活性方面没有差异，未确认到原料的冷冻所造成的影响。
预备试验7
在预备试验7中，对HPL-IFN-DC中的CD8+T细胞诱导能力进行了评价。
将对制作的持有HLA-A*02:01的患者来源的癌抗原MART-1(Melanoma AntigenRecognized by T cell-1，T细胞识别黑素瘤抗原1)进行前脉冲处理而得到的IFN-DC或者HPL-IFN-DC(基本培养基均使用AIM培养基)与1×106的外周血淋巴细胞(PeripheralBlood Lymphocytes：PBL)按1:10的比例混合，在添加有IL-2(5ng/mL)、IL-7(5ng/mL)、IL-15(10ng/mL)的AIM-V培养基中培养3天。然后，根据细胞的增殖，补充含10(v/v)％ABS的AIM-V培养基，在从培养开始时起第7天和第14天再次添加IFN-DC或HPL-IFN-DC，在第21天回收细胞，根据MART1特异性CD8T细胞的诱导对抗原提呈能力进行了评价。用CD8-FITC、CD3-APC、T-select HLA-A*0201MART-1四聚体-ELAGIGILTV-PE对回收的细胞进行染色，使用流式细胞仪检测MART-1特异性的CD8+T细胞(n＝1)。
图33示出了预备试验7的步骤。
利用流式细胞术，对通过未添加血清的培养基(AIM-V)制作的HPL-IFN-DC的细胞毒性T细胞诱导能力进行了分析(n＝1)。将结果示于图34。A表示CD8+T细胞的分析结果，B表示IFN-DC的分析结果，C表示HPL-IFN-DC的分析结果。与使用未添加血清的培养基(AIM-V)制作的IFN-DC相比，在添加有HPL的情况下显示出了较低的抗原提呈能力(IFN-DC：3.28％，HPL-IFN-DC：1.55％)。点阵图内的％表示CD8+T细胞中的MART-1特异性CTL诱导的比例。
在AIM-V中添加5％(v/v)的HPL而制作的IFN-DC中，MART1特异性CD8+T细胞诱导能力显示出了较低值。这表明，AIM-V与DCO-K培养基的成分差异影响到了IFN-DC的抗原提呈能力。
预备试验中的结论
对使用单核细胞的新型IFN-DC的制作方法的有效性进行评价，确定了步骤。
在单核细胞的黏附性能(原料的纯化)、IFN-DC分化诱导和成熟步骤中，从活细胞率、收率和纯度(淋巴细胞混入率)的结果可以推测，在无血清培养基(DCO-K)中添加HPL的制作方法是具有创造性和新颖性的步骤。
作为加工物的成熟HPL-IFN-DC的表型呈现CD86+HLA-ABC+DR+的均匀的细胞群体，HPL的添加使CD14和CD56阳性率提高，CD56+、CD80+、CD83+细胞比例确认到浓度依赖性的表达。
在添加有1(v/v)％～10(v/v)％HPL的DCO-K中，HPL可以应用于制作单核细胞来源的IFN-DC。
虽然有CD56的表达，但在HPL-IFN-DC中未观察到杀伤活性的提升。
在已经评价的使用AIM-V和HPL进行制作的情况下，与单独使用AIM-V的情况相比，IFN-DC的抗原提呈能力较低。
综上所述，可以判断，面向临床应用的IFN-DC的制作方法中，通过无血清培养基(DCO-K)与5(v/v)％HPL的组合进行单核细胞黏附、分化诱导和成熟的步骤是最合适的。
在下面的实施例2(正式试验)中，通过该制作步骤进行了考察。
[实施例2]使用添加有HPL[5(v/v)％]的未添加血清的培养基(DCO-K)的单核细胞分离方法和IFN-DC制作方法的建立
本实施例作为正式试验而进行。
确定为在通过实施例1的预备试验从患者来源的PBMC中分离单核细胞的步骤(30分钟)、分化成熟过程中，使用添加有HPL[5(v/v)％]的未添加血清的培养基(DCO-K)制作IFN-DC的步骤。
确定的步骤：
使用通过最终浓度5(v/v)％的HPL调整的未添加血清的培养基(DCO-K)，将通过血液成分单采采集的患者来源的外周血单个核细胞(PBMC：Peripheral blood mononuclearcells)接种在黏附培养皿中。在37℃、5％CO2的条件下进行30分钟的培养，由此使细胞黏附在培养皿底面上，筛选出单核细胞和淋巴细胞。然后，对于贴壁细胞，使用添加有1μg/mL的佩乐能、100ng/mL的GM-CSF和HPL的DCO-K培养基，将其分化诱导为IFN-DC。从分化开始时起3天后，回收细胞，使用在低黏附培养皿中混合各种试剂类(10μg/mL OK432、10ng/mL PGE2)而制成的成熟培养基和20μg/mL的肿瘤抗原肽(WT-1：Wilms tumor1)进行18～24小时的培养，由此使IFN-DC成熟。将步骤示于图35。
使用通过该建立的步骤制作的HPL-IFN-DC，进行了正式试验(n＝6)。
正式试验1
在正式试验1中，对HPL-IFN-DC和IFN-DC中的细胞存活率、回收率和纯度进行了对比考察(n＝6)。
将通过血液成分单采从患者体内采集的外周血来源的单个核细胞悬浮在添加有HPL[5(v/v)％]的DCO-K培养基中，接种到黏附培养皿中。在37℃、5％CO2中进行30分钟的培养，洗涤掉非贴壁细胞，由此分离出单核细胞。对于贴壁细胞，使用添加有佩乐能和GM-CSF的分化诱导培养基，将其分化诱导为IFN-DC。从分化时起3天后回收细胞，将其悬浮在添加有各种试剂类(佩乐能、GM-CSF、PGE2、OK432)的成熟培养基中，同时接种到低黏附培养皿中，由此使其成熟。24小时后回收细胞，使用相差显微镜对细胞形态进行了观察。图36-1示出了观察图像。A表示IFN-DC的观察图像，B表示HPL IFN-DC的观察图像。由于观察到了树突状突起，因此表明正在分化成DC。未确认到HPL的有无所引起的细胞形态的变化。
之后，对成熟后回收的IFN-DC的活细胞率、收率和纯度进行了对比。将结果示于图36-2。A表示活细胞率(viability)，B表示收率(yield)，C表示纯度(purity)。在添加HPL制作的IFN-DC(HPL-IFN-DC)中确认到显著增加(活细胞率：IFN-DC，84.2％；HPL-IFN-DC95.5％；收率：IFN-DC 14.1％；HPL-IFN-DC 25.4％；纯度：IFN-DC，83.1％；HPL-IFN-DC，99.1％)。正式试验1的结果表明，在添加HPL[5(v/v)％]制作的IFN-DC中，活细胞率、收率和纯度显示出了较高值。
正式试验2
在正式试验2中，利用流式细胞术对HPL对IFN-DC的表型的影响进行了分析(n＝6)。
将结果示于图37。与IFN-DC相比，在添加HPL制作的HPL-IFN-DC中，确认到了单核细胞的标记CD14、细胞黏附分子CD56、促进向淋巴结移动的分子CCR7(CD197)，以及树突状细胞的标记之一CD11c的表达显著增加。另外，还确认到与向T细胞提呈抗原的能力相关的共刺激分子CD80和CD40、树突状细胞的成熟标记CD83，以及参与抗原提呈的分子HLA-DR的表达显著下降。
正式试验3
在正式试验3中，利用流式细胞术，使用FITC-葡聚糖(FITC-dextran)和DQ-卵清蛋白(DQ-OVA)，对HPL-IFN-DC和IFN-DC中的抗原吞噬能力和降解能力进行了评价。
在成熟过程中，在成熟培养基中加入100μg/mL的FITC-葡聚糖(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)和10μg/mL的DQ卵清蛋白(Molecular Probes)，培养24小时。之后，将回收的IFN-DC或HPL-IFN-DC用PBS洗涤2次，然后用1(v/v)％的FBS-PBS再悬浮，利用流式细胞术对吞噬能力和降解能力进行了评价(n＝6)。将步骤示于图38。
利用流式细胞术，使用FITC-葡聚糖和DQ-卵清蛋白，对IFN-DC和HPL-IFN-DC的抗原吞噬能力和抗原降解能力进行了评价(n＝6)。将结果示于图39。研究FITC-葡聚糖的摄入和DQ-OVA的降解能力，用ΔMFI的点阵图表示抗原吞噬能力和抗原降解能力。A表示FITC-葡聚糖的结果，B表示DQ-卵清蛋白的结果。
与IFN-DC相比，在添加有HPL的IFN-DC中显示出了较高的抗原吞噬能力和降解能力(FITC-葡聚糖ΔMFI：IFN-DC,17.1；HPL-IFN-DC,68.0；DQ-卵清蛋白ΔMFI：IFN-DC,270.9；HPL-IFN-DC,589.7)。
正式试验4
在正式试验4中，对IFN-DC和HPL-IFN-DC中各种细胞因子的产生能力进行了评价。
将IFN-DC和通过确定的步骤制作的成熟HPL-IFN-DC悬浮在DCO-K培养基中以达到1×106细胞/mL的细胞密度，接种到培养皿中。在37℃、5％CO2中培养24小时后，回收培养上清液。对于回收的培养上清液，通过Bio-plex测定试剂盒(Bio-Rad Labs)对各种细胞因子类[IL-6、IL-10、IL-12(p70)、IFN-γ、TNF-α]进行了测定。另外，使用人TGF-β1QuantikineELISA试剂盒(R&D systems)对TGF-β进行了测定(n＝6)。将步骤示于图40。
接着，使用Bio-plex测定试剂盒(Bio-Rad Labs)，对HPL-IFN-DC分泌的参与细胞毒性T细胞诱导的细胞因子[IL-10、TGF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-12(p70)、IL-6]进行了测定(n＝6)。将结果示于图41。
与IFN-DC相比，使细胞毒性T细胞的诱导亢进的Th1细胞因子IL-12(p70)在HPL-IFN-DC中显著较低(IL-12产生：IFN-DC,1.1pg/mL；HPL-IFN-DC,0.18pg/mL)，在具有相同作用的IFN-γ中未观察到变化(IFN-γ产生：IFN-DC,0.59pg/mL；HPL-IFN-DC,0.38pg/mL)。相反，抑制细胞毒性T细胞的诱导的Th2细胞因子IL-10和TGF-β在HPL-IFN-DC中观察到了增加趋势(IL-10产生：IFN-DC,11.47pg/mL；HPL-IFN-DC,132.7pg/mL；TGF-β产生：IFN-DC,8.02pg/mL,HPL-IFN-DC,9.38pg/mL)。引发炎症反应并参与T细胞活化和分化的TNF-α和IL-6的分泌，在HPL-IFN-DC中显著增加(IL-6产生：IFN-DC,302.3pg/mL；HPL-IFN-DC,2883pg/mL；TNF-α：IFN-DC,412.5pg/mL；HPL-IFN-DC,1144.4pg/mL)。
由此可见，HPL会使IFN-DC产生的Th1/Th2细胞因子发生变化。
正式试验5
在正式试验5中，对IFN-DC和HPL-IFN-DC的MART1特异性CD8+T细胞诱导能力进行了评价。将步骤示于图42。
对使用添加有HPL的DCO-K培养基制作的HPL-IFN-DC的细胞毒性T细胞诱导能力进行了评价(n＝6)。
对将CD8阳性T细胞和MART1(Melanoma Antigen Recognized by T cell-1，T细胞识别黑素瘤抗原1)肽进行前脉冲处理而得到的IFN-DC和HPL-IFN-DC进行共培养，在第14天和第21天的时间点利用流式细胞术检测到了MART1特异性细胞毒性T细胞。图43-1示出了利用流式细胞术进行分析的结果，图43-2示出了各处理组中的MART1特异性CD8+T细胞数，图43-3示出了MART1特异性CD8+T细胞(MART-CTL、MART1特异性CTL阳性细胞)的比例。在第14天和第21天的时间点，与IFN-DC相比，在HPL-IFN-DC中确认到MART1特异性细胞毒性T细胞诱导的显著增加(第14天的MART1四聚体+CTL的阳性细胞数的中位数：CD8+T细胞,1.37×103细胞；CD8+T细胞+IFN-DC,2.45×104细胞；CD8+T细胞+HPL IFN-DC,2.25×105细胞；第21天的MART1四聚体+CTL的阳性细胞数的中位数：CD8+T细胞,3.64×103细胞；CD8+T细胞+IFN-DC,2.54×105细胞；CD8+T细胞+HPL IFN-DC,1.45×106细胞；n＝6)。
关于IFN-DC和HPL-IFN-DC中的细胞毒性T细胞诱导能力，进行单组彼此的显著性差异检验并进行了对比(仅在第14天和第21天进行对比)。
这里，作为5份病例(病例2、病例3、病例4、病例5和病例6)，将点阵图的图表记载为图44(A：病例2、B：病例3)、图45(A：病例4、B：病例5)和图46(病例6)(图表的形式参考上述内容)。
正式试验6
通过酶联免疫斑点检测法，对由IFN-DC和HPL-IFN-DC诱导的细胞毒性T细胞对抗原特异性地产生IFN-γ的能力进行了评价(n＝6)。将步骤示于图47。
图48-1示出了斑点图像，图48-2示出了IFN-γ分泌量(产生量)。与IFN-DC相比，在HPL-IFN-DC中，细胞毒性T细胞分泌的抗原特异性IFN-γ显著增加。
正式试验结果总结
图49～51中总结了正式试验1～6的结果的详细数值。
如图49所示，HPL-IFN-DC表现出优异的活细胞率、回收率和纯度。另外，如图50所示，HPL-IFN-DC具有DC在以往所没有的性状。图51示出了DC的功能评价结果。在HPL-IFN-DC的功能评价中，与IFN-DC相比，确认到抗原吞噬能力和降解能力、细胞因子产生能力、细胞毒性T细胞诱导能力较高。
由正式试验的结果确认到，使用添加有5(v/v)％HPL的无血清培养基(DCO-K)制作的IFN-DC，其制造步骤中的单核细胞的分离提高，最终产物的活细胞率、收率和纯度也提高。另外，树突状细胞的功能方面的评价中，从抗原提呈能力、吞噬能力、降解能力的成绩可以断定，其为具有创造性和新颖性的IFN-DC制作方法。
HPL-IFN-DC的表型的结果显示了CD14+、CD56+、CD86+、CCR7+、HLA-ABC/DR+的均匀的细胞群体，确认到CD56+、CD80+、CD83+的细胞比例的表达依赖于HPL浓度而增加，具有现阶段报告的DC组分中所没有的新性状。
另外，虽然观察到与向T细胞提呈抗原的能力相关的共刺激分子CD80和CD40、树突状细胞的成熟标记CD83的比例在HPL-IFN-DC中降低，诱导细胞毒性T细胞的Th1细胞因子之一IL-12(p70)的分泌下降，抑制性的Th2细胞因子IL-10的分泌增加，但是也确认到抗原提呈能力较高，具有显著的细胞毒性T细胞诱导能力。
通过添加有HPL的无血清培养基(DCO-K)制作IFN-DC的方法，与不添加HPL相比，确认到活细胞率、回收率和纯度提高，显示出优异的抗原提呈能力、降解能力和吞噬能力，因此可以期待作为对癌免疫和控制感染有益的新型DC疫苗。
[实施例3]WT1肽脉冲IFN树突状细胞疫苗
使用HPL制造IFN-DOC
将外周血单个核细胞(PBMC)在培养基中悬浮，接种到培养皿中，30分钟后通过洗涤除去非贴壁细胞，使用GM-CSF和IFN-a，从贴壁的单核细胞进行分化诱导。在第4天添加OK-432、PGE2、肽，在18-24小时后回收细胞。将步骤示于图52。在第5天，确认到树突状细胞的特征，即明显的细胞群形成。
使用HPL制作IFN树突状细胞时的单核细胞的选择性贴壁培养
在以往的方法中使用的AIM-V培养基是用于研究的试剂，而非按照用于临床的规格管理制造的。因此，使用GMP级的DCO-K培养基(无血清培养基，成分已知)进行了培养。在接种外周血单个核细胞时，相比单独使用DCO-K培养基使单核细胞黏附，可以使用HPL来使单核细胞选择性地黏附。将树突状细胞的培养状态示于图53。图53A表示未使用HPL制作的IFN-DC，图53B表示使用HPL制作的IFN-DC(HPL-IFN-DC)。将流式细胞术示于图54。由流式细胞术的图像可知，使用HPL制作的IFN-DC(HPL-IFN-DC)(图54A)与未使用HPL制作的IFN-DC(图54B)相比，淋巴细胞组分的混入得到了大幅抑制(IFN-DC,22.1％；HPL-IFN-DC,0.88％)。
HPL-IFN-DC的表型分析
使用HPL选择性地使单核细胞黏附，使用GM-CSF和IFN-α进行分化诱导，通过溶链菌和PGE2进行成熟处理后，利用流式细胞仪对表型进行了观察。将结果示于图55。在IFN-树突状细胞中，确认到了报告的细胞表面标记CD11c、CD40、CD56、CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、HLA-DR的表达。
IFN-DC或HPL-IFN-DC对MART-1抗原特异性细胞毒性T细胞的诱导
对摄入了MART-1 26-35A27L肽的IFN-DC或HPL-IFN-DC与CD8+T细胞进行共培养，由此进行了体外CTL诱导试验。培养开始21天后，检测MART-1特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxicity T lymphocyte,CTL)。将结果示于图56。与IFN-DC(图56A)进行对比，在HPL-IFN-DC(图56B)确认到了MART-1特异性CTL的高诱导(IFN-DC,0.69％；HPL-IFN-DC,5.47％)。
添加有WT1的IL-4-DC或HPL-IFN-DC进行的WT1-CTL诱导的对比
实施内吞了WT1抗原的DC和CD8+T细胞的体外CTL诱导试验，在培养开始21天后回收细胞，利用WT1-四聚体分析对诱导的WT1-CTL诱导比例进行了评价。将WT1-CTL诱导试验的步骤示于图57。将用于WT1-CTL诱导试验的IL-4-DC和HPL-IFN-DC的制作方法示于图58。关于IL-4-DC，对于在第7天回收的IL-4-DC，使用100μg/ml的WT1-235杀手肽在4℃处理30分钟，用于试验(WT1肽后脉冲)。另外，关于HPL-IFN-DC，在第4天的成熟混合物中添加WT1-235杀手肽，将第5天回收的HPL-IFN-DC用于试验(WT肽前脉冲)。将利用WT1-四聚体分析对诱导的WT1-CTL诱导比例进行评价的结果示于图59。与现有的IL-4-DC相比，HPL-IFN-DC显示出了较高的WT-CTL诱导能力。
图60示出了由IL-4-DC(WT1后脉冲)或HPL-IFN-DC(WT1前脉冲)诱导的WT1-CTL的总细胞数。使用各DC，对CD8+T细胞进行3次刺激后(直到第21天为止)，确认到WT1-CTL增加。与IL-4-DC相比，在HPL-IFN-DC中确认到了较高的诱导。只有CD8+T用于未利用各DC进行刺激的阴性对照组。
工业实用性
通过本发明的方法制备的树突状细胞(DC)能够用于树突状细胞疗法。
本说明书中引用的全部的发行物、专利及专利申请直接通过引用而并入说明书中。

Claims (15)

1.一种由单核细胞制备具有细胞毒性的树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养对从外周血中分离的单核细胞进行培养，然后添加前列腺素E2和OK432，进一步通过非贴壁培养进行培养。
2.根据权利要求1所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM-CSF和PEG化干扰素α的无血清培养基，通过非贴壁培养进行2～5天的培养后，添加前列腺素E2和OK432，进一步进行1～2天的培养。
3.根据权利要求1或2所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)、100U/mL～10,000U/mL的GM-CSF、500ng/mL～5μg/mL的PEG化干扰素α、5ng/mL～50ng/mL的前列腺素E2和5μg/mL～50μg/mL的OK432的无血清培养基，对单核细胞进行培养。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，无血清培养基为DCO-K。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，获得的树突状细胞的活细胞率为90％以上，获得的树突状细胞数相对于培养时的单核细胞数的比例即收率为15％以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法，其中，获得的树突状细胞为CD14、CD16、CD56、CD83、CD86、CCR7(CD197)、HLA-ABC、HLA-DR阳性。
7.一种树突状细胞，其是通过权利要求1～6中任一项所述的由单核细胞制备树突状细胞的方法获得的。
8.一种药物组合物，其含有权利要求7所述的树突状细胞。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其具有抗癌免疫活性，能够用于癌症治疗。
10.一种单核细胞的分离方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)的无血清培养基，在贴壁培养容器中对外周血单个核细胞进行15分钟～3小时的培养，除去非贴壁细胞，回收贴壁细胞。
11.根据权利要求10所述的单核细胞的分离方法，其使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)的无血清培养基。
12.根据权利要求10或11所述的单核细胞的分离方法，其中，无血清培养基为DCO-K。
13.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中还添加癌特异性抗原以制备对癌抗原具有特异性树突状细胞毒性的树突状细胞。
14.一种树突状细胞，其是通过权利要求13所述的方法获得的对癌抗原具有特异性树突状细胞毒性的树突状细胞。
15.一种药物组合物，其含有权利要求14所述的树突状细胞，具有抗癌免疫活性，能够用于癌症治疗。
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