ES2858450T3

ES2858450T3 - Procedimiento de cultivo de linfocitos B individuales

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Publication number: ES2858450T3
Application number: ES17169362T
Authority: ES
Inventors: Josef Endl; Natalie Schuhmacher; Sonja Offner; Josef Platzer; Basile Siewe; Irmgard Thorey
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2021-09-30
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: US20160251621A1; EP2400298A1; RU2709531C2; US20180298335A1; US20130084637A1; EP2400298B1; CA3008822C; BR112012025695A2; CA3008822A1; CA2798286A1; HK1212731A1; PL3239708T3; EP3239708A1; JP5779239B2; CA2798286C; WO2011147903A1; EP3239708B1; ES2434256T3; KR20130030758A; CN105039252A

Abstract

Uso de una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B y células de alimentación, en el que la mezcla de alimentación sintética consiste en componentes sintéticos que comprenden IL-1β, TNFα, IL-10 e - IL-2 y SAC, o - IL-6, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células de alimentación, o - IL-6 o IL-2, y SAC, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células de alimentación, o - IL-2 e IL-6, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B murinos o de hámster y células de alimentación, o - IL-2, IL-6 y SAC, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B de hámster y células de alimentación.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de cultivo de linfocitos B individuales

En el presente documento se informa de un procedimiento para obtener la secuencia de aminoácidos de al menos los dominios variables de un anticuerpo monoclonal secretado por un linfocito B individual que se ha obtenido de una población de linfocitos B de un animal de experimentación por depósito de células individuales y cocultivo con células de alimentación en presencia de una mezcla de alimentación.

Antecedentes de la invención

Para obtener células que secreten anticuerpos monoclonales se usa ampliamente la tecnología de hibridoma desarrollada por Koehler y Milstein. Pero en la tecnología de hibridoma, solo una fracción de los linfocitos B obtenidos de un animal de experimentación inmunizado se puede fusionar y propagar. La fuente de los linfocitos B, en general, es un órgano de un animal de experimentación inmunizado, tal como el bazo.

Zubler et al. comenzaron en 1984 a desarrollar un enfoque diferente para obtener células que secretaban anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183). En el mismo, los linfocitos B se obtienen de la sangre del animal de experimentación inmunizado y se cocultivan con células de alimentación EL-4 B5 murinas en presencia de una mezcla de alimentación que comprende citocinas. Con esta metodología se pueden obtener hasta 50 ng/ml de anticuerpo después de 10-12 días de cocultivo.

Weitkamp, J-H., et al., (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237) informan de la generación de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes para rotavirus a partir de linfocitos B específicos de antígeno individuales seleccionados con partículas similivíricas fluorescentes. Se informa de un procedimiento de producción de una pluralidad de anticuerpos aislados para una pluralidad de antígenos relacionados en el documento US 2006/0051348. En los documentos WO 2008/144763 y WO2008/045140, se informa de anticuerpos para IL-6 y usos de los mismos y un procedimiento de cultivo para obtener una población clonada de linfocitos B específicos de antígeno, respectivamente. Se informa de un procedimiento de cultivo para obtener una población clonada de linfocitos B específicos de antígeno en el documento US 2007/0269868. Masri et al. (en Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106) informan de la clonación y expresión en E. coli de un fragmento Fab funcional obtenido de un linfocito humano individual frente a la toxina del carbunco. Se informa de un procedimiento para preparar colecciones de inmunoglobulinas en el documento WO 2007/031550.

Patel, K.D., et al. (Clin. Immunol. 133 (2009) 251-256) informaron de que la detección de citocinas de alta sensibilidad en el síndrome coronario agudo revela una regulación por incremento de interferón gamma e interleucina-10 después del infarto de miocardio.

Bovia, F., et al. informaron de la transducción eficaz de linfocitos B humanos primarios y linfocitos B de mieloma que no se dividen con vectores lentivíricos derivados de VIH-1 (Blood 101 (2003) 1727-1733).

Es conocida una mezcla de alimentación que consiste en IL-1p (interleucina-1 beta), TNFa (factor de necrosis tumoral alfa), IL-2 (interleucina-2) e IL-10 (interleucina-10) de Tucci, A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones.

En el presente documento se informa de un procedimiento para el aislamiento de un linfocito B de una población de linfocitos B que tiene propiedades especiales. En primer lugar, ya dentro de las cuatro semanas después de la primera inmunización de un animal de experimentación, se pueden aislar las células productoras de anticuerpos inducidos y se puede determinar la especificidad de unión de los anticuerpos. En segundo lugar, es posible potenciar el número y/o la calidad (por ejemplo, la capacidad de producción/secreción de anticuerpos) de las células productoras de anticuerpos por una cualquiera de las siguientes etapas: i) una etapa de preincubación, y/o ii) una etapa de centrifugación, y/o iii) una etapa de adsorción. En tercer lugar, la mezcla de alimentación usada para el cocultivo de linfocitos B y células de alimentación se puede mejorar por la adición de IL-21, o IL-6, o SAC, o BAFF.

La materia objeto de la presente invención es el uso de una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B y células de alimentación, en el que la mezcla de alimentación sintética consiste en componentes sintéticos que comprenden IL-1p, TNFa, IL-10 e

- IL-2 y SAC, o

- IL-6, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células de alimentación, o

- IL-6 o IL-2, y SAC, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células de alimentación, o

- IL-2 e IL-6, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B murinos o de hámster y células de alimentación, o

- IL-2, IL-6 y SAC, en el que la mezcla de alimentación es para el cocultivo de linfocitos B de hámster y células de alimentación.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el uso comprende la etapa de incubación de la población de linfocitos B en el medio de cocultivo antes del depósito de células individuales. En un modo de realización, la incubación es a aproximadamente 37 °C. En un modo de realización, la incubación es durante de 0,5 a dos horas. En un modo de realización específico, la incubación es durante aproximadamente una hora. En un modo de realización, la incubación es a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente una hora. En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el uso comprende la etapa de centrifugación de los linfocitos B depositados como células individuales antes del cocultivo. En un modo de realización, la centrifugación es durante aproximadamente 1 min a aproximadamente 30 min. En un modo de realización específico, la centrifugación es durante aproximadamente 5 min. En un modo de realización, la centrifugación es a de aproximadamente 100 x g a aproximadamente 1000 x g. En un modo de realización específico, la centrifugación es a aproximadamente 300 x g. En un modo de realización, la centrifugación es durante de aproximadamente 5 min a aproximadamente 300 x g.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el uso comprende de inmediato antes de la etapa de marcaje la siguiente etapa: adsorción de los linfocitos B con antígeno inmovilizado. En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, la población de linfocitos B se obtiene de la sangre de un animal por una centrifugación en gradiente de densidad.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, la población de linfocitos B se obtiene de la sangre de un animal de experimentación después de 4 días después de la inmunización. En otro modo de realización, la población de linfocitos B se obtiene de la sangre de un animal de experimentación de desde 4 días a al menos 9 días después de la inmunización. En otro modo de realización, la población de linfocitos B se obtiene de la sangre de un animal de experimentación de desde 4 días a 9 días después de la inmunización. En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, la población de linfocitos B se aísla por centrifugación en gradiente de densidad.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son linfocitos B maduros.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el marcaje es con de uno a tres tintes fluorescentes. En un modo de realización específico, el marcaje es con dos o tres tintes fluorescentes. En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el marcaje de los linfocitos B da como resultado el marcaje de un 0,1 % a un 2,5 % de las células de la población de linfocitos B totales. En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son linfocitos B de ratón, o linfocitos B de hámster o linfocitos B de conejo.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el depósito de células individuales es en los pocillos de una placa de múltiples pocillos.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, las células de alimentación son células EL-4 B5 murinas.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el marcaje es de linfocitos B IgG+CD19+, linfocitos B IgG+CD38+, linfocitos B IgG+CD268+, linfocitos B IgG'CD138+, linfocitos B CD27+CD138+ o linfocitos B CD3'CD27+.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son de origen de ratón y el marcaje es de linfocitos B IgG+CD19+ y/o linfocitos B IgG'CD138+.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son de origen de hámster y el mareaje es de linfocitos B IgG+IgM'.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son de origen de conejo y el marcaje es de linfocitos B IgG+ y/o linfocitos B CD138+, o linfocitos B CD138+IgG+ y/o linfocitos B IgG+IgM'.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el cocultivo está en un medio RPMI 1640 complementado con f Cs al 10 % (v/v), un 1 % (p/v) de una solución de glutamina 200 mM que comprende penicilina y estreptomicina, un 2 % (v/v) de una solución de piruvato de sodio 100 mM y un 1 % (v/v) de un tampón ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazin)-etanosulfónico (HEPES) 1 M. En otro modo de realización, el medio de cocultivo comprende además beta-mercaptoetanol 0,05 mM.

El cocultivo de los linfocitos B es con células de alimentación y una mezcla de alimentación sintética.

La mezcla de alimentación sintética comprende interleucina-1 beta y factor de necrosis tumoral alfa. En un modo de realización, la mezcla de alimentación sintética comprende interleucina-2 (IL-2) e interleucina-10 (IL-10). En un modo de realización, la mezcla de alimentación sintética comprende además células de la cepa Cowans de Staphylococcus aureus (SAC). En un modo de realización, la mezcla de alimentación sintética comprende interleucina-6 (IL-6). En un modo de realización, la mezcla de alimentación sintética comprende interleucina-4 (IL-4).

En un modo de realización, el animal de experimentación se selecciona de ratón, hámster y conejo.

Descripción detallada de la invención

El uso de acuerdo con la invención permite una caracterización rápida de la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales obtenidos de clones de linfocitos B individuales, es decir, dentro de las cuatro semanas después de la primera inmunización del animal de experimentación, se pueden aislar las células productoras de anticuerpos inducidos y se puede determinar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos a partir de las mismas, con lo que se pueden realizar al menos 4 experimentos diferentes debido a la cantidad/concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cocultivo de linfocitos B.

Inmunización:

A menudo se usan animales no humanos, tales como ratones, conejos, hámsteres y ratas, como modelo animal para evaluar los tratamientos basadas en anticuerpos. Por tanto, a menudo se requiere proporcionar anticuerpos con reactividad cruzada que se unan al antígeno de animal no humano, así como al antígeno humano. El uso de acuerdo con la invención se puede usar para proporcionar anticuerpos con reactividad cruzada. En el uso de acuerdo con la invención, se pueden usar linfocitos B obtenidos, por ejemplo, de ratón, hámster y conejo. En un modo realización, el ratón es un ratón NMRI o un ratón balb/c. En otro modo de realización, el hámster se selecciona de hámster armenio (Cricetulus migratorius), hámster chino (Cricetulus griseus) y hámster sirio (Mesocricetulus auratus). En un modo de realización específico, el hámster es el hámster armenio. En un modo de realización, el conejo se selecciona de conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW), conejos Zimmermann (ZIKA), conejos de la raza mutante Alicia, conejos de la raza mutante basilea, conejos transgénicos con un locus de inmunoglobulina humana, conejos con inactivación para rblgM y cruces de los mismos.

En un modo de realización, los animales de experimentación, por ejemplo, ratones, hámsteres y conejos, elegidos para su inmunización no son mayores de 12 semanas.

Fuente y aislamiento de linfocitos B:

La sangre de un animal de experimentación proporciona una alta diversidad de linfocitos B productores de anticuerpos. Los anticuerpos secretados por linfocitos B obtenidos de la misma que casi no tienen ninguna secuencia de aminoácidos idéntica o solapante dentro de las CDR, muestran, por tanto, una alta diversidad.

En un modo de realización, los linfocitos B de un animal de experimentación, por ejemplo, de sangre, se obtienen de desde 4 días después de la inmunización hasta al menos 9 días después de la inmunización o el refuerzo más reciente. Este lapso de tiempo permite una alta flexibilidad en el uso de acuerdo con la invención. En este lapso de tiempo, es probable que los linfocitos B que proporcionan los anticuerpos más afines migren desde el bazo a la sangre (véanse, por ejemplo, Paus, D., et al., JEM 203 (2006) 1081-1091; Smith, K.G.S., et al., The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006; Wrammert, J., et al., Nature 453 (2008) 667-672).

Se pueden obtener linfocitos B de la sangre de un animal de experimentación con cualquier procedimiento conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede usar centrifugación en gradiente de densidad (DGC) o lisis de glóbulos rojos (lisis). La centrifugación en gradiente de densidad en comparación con la lisis hipotónica proporciona un mayor rendimiento global, es decir, el número de clones de linfocitos B. Además de las células obtenidas por centrifugación en gradiente de densidad, un número más grande de células se divide y crece en la etapa de cocultivo.

También la concentración de anticuerpo secretado es mayor en comparación con las células obtenidas con un procedimiento diferente. Por lo tanto, en un modo de realización, la proporción de una población de linfocitos B es por centrifugación en gradiente de densidad.

Tabla 1: número de pocillos/clones celulares productores de IgG cuando las células se obtienen por centrifugación en gradiente de densidad (DGC) o lisis hipotónica de eritrocitos.

Etapas de selección antes del cocultivo:

Se pueden enriquecer linfocitos B productores de anticuerpos que se unan específicamente a un antígeno a partir de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC). Por tanto, en un modo de realización de todos los usos, la población de linfocitos B se enriquece a partir de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC).

El término “que se une específicamente” y los equivalentes gramaticales del mismo indican que el anticuerpo se une a su diana con una constante de disociación (Kd) de 10-7 M o menos, de desde 10-8 M a 10-13 M, de desde 10-9 M a 10-13 M. El término se usa además para indicar que el anticuerpo no se une específicamente a otras biomoléculas presentes, es decir, se une a otras biomoléculas con una constante de disociación (Kd) de 10-6 M o más, de desde 10-6 M a 1 M.

En un modo de realización del uso, los PBMC tienen agotamiento de macrófagos. Esto es ventajoso como se explica anteriormente, por ejemplo, como en un modo de realización para linfocitos B de origen de conejo, para la etapa de cocultivo.

Se pueden agotar los macrófagos de PBMC por adhesión a la superficie de la placa de cultivo celular (véase la etapa de preincubación).

En un modo de realización del uso, las células son de un animal inmunizado con proteína y tienen agotamiento de macrófagos antes del marcaje.

Se ha descubierto que incubar la población de linfocitos B en medio de cocultivo antes del depósito de células individuales incrementa el número total de células que secretan anticuerpos obtenidas después del depósito de células individuales en comparación con un depósito de células individuales directamente después del aislamiento y enriquecimiento opcional de la población de linfocitos B de la sangre de un animal de experimentación (ejemplo, conejo, véanse las tablas 2a y 2b). Específicamente, la incubación es a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente una hora en medio de EL-4 B5, por ejemplo, usando una estufa de incubación de cultivo celular.

Tabla 2a: pocillos/clones celulares positivos para IgG con y sin incubación de una hora en medio de EL-4 B5 antes del depósito de células individuales de todas las células (rb=conejo).

* con agotamiento de

macrófagos y monocitos

Tabla 2b: pocillos/clones celulares positivos para IgG con y sin incubación de una hora en medio de EL-4 B5 antes del depósito de células individuales de linfocitos B.

En un modo de realización del uso, las células se obtienen de un animal inmunizado con proteína y tienen agotamiento de macrófagos.

Las células que no producen un anticuerpo que se une al antígeno o, igualmente, las células productoras de un anticuerpo que se une al antígeno se pueden reducir o enriquecer, respectivamente, usando un enfoque de adsorción. En el mismo, se presenta un compañero de unión fijado a una superficie y las células que se unen al mismo se enriquecen selectivamente en la población de células en caso de que las células unidas se procesen adicionalmente, o se reducen en la población de células en caso de que las células restantes en solución se procesen adicionalmente.

Tabla 3: enriquecimiento de linfocitos B que secretan un anticuerpo específico de antígeno por adsorción con el antígeno respectivo.

El uso comprende, en un modo de realización, antes del depósito de células individuales, una etapa de selección en la que los linfocitos B productores de anticuerpos específicos y/o sin reactividad cruzada se seleccionan en base a marcadores de superficie celular y separación de células activadas por fluorescencia/selección a través de una ventana de adquisición. En un modo de realización, se separan/enriquecen/seleccionan linfocitos B maduros. Para la selección de linfocitos B de especies de animales de experimentación diferentes se pueden usar marcadores de superficie celular diferentes. Se ha descubierto que muchos de los marcadores de superficie celular disponibles, individualmente o bien en combinación, no proporcionan un marcaje adecuado.

Con el marcaje de poblaciones de células no diana y linfocitos que no se unen específicamente es posible agotar selectivamente estas células. En esta etapa de agotamiento, solo se puede lograr un agotamiento no total. A pesar de que el agotamiento no es cuantitativo, proporciona una ventaja en el marcaje por fluorescencia subsiguiente de las células restantes, ya que el número de células interferentes se puede reducir o incluso minimizar. Por un depósito de células individuales de linfocitos B maduros (linfocitos B de memoria, plasmablastos madurados en afinidad y plasmocitos) por separación de células activadas por fluorescencia usando el marcaje como se explica anteriormente se puede obtener un mayor número de pocillos/clones celulares IgG+ en la etapa de cocultivo.

El término “marcaje” indica la presencia o ausencia de un marcador de superficie que se puede determinar por la adición de un anticuerpo anti-marcador de superficie marcado y que se une específicamente. Por tanto, la presencia de un marcador de superficie se determina, por ejemplo, en el caso de un marcador de fluorescencia, por la aparición de una fluorescencia, mientras que la ausencia de un marcador de superficie se determina por la ausencia de una fluorescencia después de la incubación con el anticuerpo anti-marcador de superficie marcado y que se une específicamente respectivo.

Se pueden marcar poblaciones de células diferentes usando marcadores de superficie diferentes, tales como células CD3+ (linfocitos T), células CD19+ (linfocitos B), células IgM+ (linfocitos B indiferenciados maduros), células IgG+ (linfocitos B maduros), células CD38+ (por ejemplo, plasmablastos) y células IgG+CD38+ (preplasmocitos).

Para una selección o enriquecimiento de linfocitos B, las células se marcan de forma individual, se marcan por duplicado o bien se marcan por triplicado. También se requiere un marcaje que dé como resultado aproximadamente de un 0,1 % a un 2,5 % de células marcadas de la población de células totales. En un modo de realización, los linfocitos B se depositan como células individuales seleccionadas por el marcaje de moléculas de superficie presentes en de un 0,1 % a un 2,5 % de los linfocitos B en la población, en otro modo de realización, en de un 0,3 % a un 1,5 % de los linfocitos B de la población, en otro modo de realización, en de un 0,5 % a un 1 % de los linfocitos B de la población.

Los linfocitos B IgG+ dentro de un 0,5 % - 1 % de la población de PBMC se pueden marcar doblemente como células IgG+CD19+, células IgG+CD38+ y células IgG+CD268+. Por tanto, en un modo de realización del uso, los linfocitos B IgG+CD19+, linfocitos B IgG+CD38+ o linfocitos B IgG+CD268+ se depositan como células individuales.

De los linfocitos B IgG- dentro de un 0,5 % - 1 % de la población de PBMC se pueden marcar doblemente como células IgG-CD138+. Por tanto, en un modo de realización del uso, los linfocitos B IgG-CD138+ se depositan como células individuales.

El marcaje de células CD27+CD138+ o células CD3-CD27+ da como resultado que aproximadamente un 1,5 % de las células de la población de células se vaya a marcar, respectivamente. Por tanto, en un modo de realización del uso, los linfocitos B CD27+CD138+ o linfocitos B CD3-CD27+ se depositan como células individuales.

De los linfocitos B de hámster IgG+ dentro de un 0,6 % ± 0,1 % de la población de PBMC se pueden marcar doblemente como linfocitos B de hámster IgG+IgM-. Por tanto, en un modo de realización del uso, los linfocitos B de hámster IgG+IgM- se depositan como células individuales.

En un modo de realización, los linfocitos B IgG-CD138+ se depositan como células individuales de los linfocitos B obtenidos de un animal inmunizado. En un modo de realización del uso, los linfocitos B IgG+CD19+ se depositan como células individuales de los linfocitos B obtenidos de un animal no inmunizado. En otro modo de realización del uso, los linfocitos B IgG+IgM' se depositan como células individuales de los linfocitos B obtenidos de un animal no inmunizado o inmunizado. En un modo de realización del uso, los linfocitos B murinos IgG+CD19+ se depositan como células individuales. Esta etapa de selección da como resultado un rendimiento mejorado o incluso el más alto de los pocillos IgG+ en la etapa de cocultivo subsiguiente. En un modo de realización de uso, los linfocitos B murinos IgG-CD138+ se depositan como células individuales. Con esto se seleccionan las células que producen la cantidad más alta de clones de linfocitos B en primer lugar y en segundo lugar la concentración más alta de IgG (véase la tabla 5). En un modo de realización del uso, los linfocitos B murinos IgG+CD19+ y los linfocitos B murinos IgG'CD138+ se depositan como células individuales. En un modo de realización específico, el uso es con la condición de que si las células son de origen de conejo, el marcaje no es de linfocitos B IgG+ y/o linfocitos B CD138+.

Los linfocitos B murinos IgG+ se pueden marcar con el anticuerpo anti-IgG de ratón 227 (Ab 227), los linfocitos B de hámster IgG+ se pueden marcar con el anticuerpo anti-IgG de hámster 213 (AB 213) y/o anticuerpo anti-IgG de hámster 225 (AB 225), y los linfocitos B de conejo se pueden marcar con el anticuerpo anti-IgG 184 (véase la tabla 4).

Tabla 4: marcaje por inmunofluorescencia de linfocitos B: la tabla presenta la fracción marcada promedio de la población de linfocitos B murinos (A-E), linfocitos B de hámster (F-H) y linfocitos B de conejo (I-J).

AB 120 - anticuerpo anti-IgG de conejo caprino Southern Biotech 4030-09

AB 184 - anticuerpo anti-Fc de IgG de conejo caprino AbDSerotech STAR121F

AB 185 - anticuerpo anti-IgG de ratón caprino Caltag M35004-3

AB 200 - anticuerpo anti-IgM de ratón caprino Invitrogen M31504

AB 212 - anticuerpo anti-IgG de hámster caprino AbDSerotech STAR79F

AB 213 - anticuerpo anti-IgG de hámster murino Becton Dickinson 554010

AB 215 - anticuerpo anti-IgG de ratón caprino Sigma B 0529

AB 217 - anticuerpo anti-IgG de ratón caprino AbDSerotech STAR120F

AB 218 - anticuerpo anti-CD 19 de ratón de rata Abeam ab22480

AB 219 - anticuerpo anti-IgM de ratón caprino Rockland 710-1607

AB 222 - anticuerpo anti-IgG de ratón caprino Abeam ab7064

AB 223 - anticuerpo anti-IgM de hámster murino Becton Dickinson 554035

AB 224 - anticuerpo anti-IgM de hámster murino Becton Dickinson 554033

AB 225 - anticuerpo anti-IgG de hámster murino Becton Dickinson 554056

AB 227 - anticuerpo anti-IgG de ratón caprino Sigma F 8264

PE: ficoeritrina

APC: aloficocianina

FITC: isotiocianato de fluoresceína

Se tiene que señalar que no todos los anticuerpos disponibles comercialmente se pueden usar para el marcaje debido a su baja o inexistente especificidad.

Los linfocitos B murinos se pueden marcar con el anticuerpo anti-IgG 227, los linfocitos B de hámster se pueden marcar con el anticuerpo anti-IgG 213.

Los linfocitos B murinos IgG+CD19+ se pueden marcar con el anticuerpo 227 y el anticuerpo 218, los linfocitos B murinos IgG+IgM- se pueden marcar con el anticuerpo 227 y el anticuerpo 219, los linfocitos B de hámster IgG+IgM- se pueden marcar con el anticuerpo 213 y el anticuerpo 224, los linfocitos B de conejo IgG+ se pueden marcar con el anticuerpo 184, los linfocitos B de conejo IgG+IgM- se pueden marcar con el anticuerpo 184 y el anticuerpo 254 y SA 263, los linfocitos B de conejo IgG+CD138+ se pueden marcar con el anticuerpo 259 y el anticuerpo 256.

Se pueden marcar linfocitos B murinos con el anticuerpo anti-CD27 235 o 236 (AB 235, AB 236), el anticuerpo anti-CD38 192 (AB 192), el anticuerpo anti-CD138233 (AB 233) y el anticuerpo anti-CD268246 (AB 246).

Tabla 5: marcaje por inmunofluorescencia para la determinación de linfocitos B maduros de ratón (A-J), hámster (K) y conejo (L-N).

AB 184 - anticuerpo anti-IgG de conejo caprino AbD Serotec STAR121F

AB 189 - anticuerpo anti-CD3 de ratón de hámster Becton Dickinson 553062

AB 192 - anticuerpo anti-CD38 de ratón de rata Becton Dickinson 553764

AB 213 - anticuerpo anti-IgG de hámster murino Becton Dickinson 554010

AB 218 - anticuerpo anti-CD 19 de ratón de rata Abeam ab22480

AB 224 - anticuerpo anti-IgM de hámster murino Becton Dickinson 554033

AB 227 - anticuerpo anti-IgG de ratón caprino Sigma F 8264

AB 233 - anticuerpo anti-CD 138 de ratón de rata Becton Dickinson 553714

AB 235 - anticuerpo anti-CD27 de ratón de hámster Becton Dickinson 558754

AB 236 - anticuerpo anti-CD27 de ratón de hámster Becton Dickinson 558753

AB 241 - anticuerpo anti-CD3 de ratón de hámster Becton Dickinson 553060

AB 246 - anticuerpo anti-BAFF-R de ratón de rata eBioscience 51-5943

AB 254 - anticuerpo anti-IgM de conejo murino Becton Dickinson personalizado

AB 256 - anticuerpo anti-IgG de rata caprino Southern Biotech 3030-09

AB 259 - anticuerpo anti-CD 138 de conejo de rata Roche Glycart AG

SA 263 - estreptavidina Invitrogen S866

A647: Alexa Fluor® 647

FITC: isotiocianato de fluoresceína

En un modo de realización, el uso comprende la etapa de agotamiento de la población de linfocitos B de macrófagos y enriquecimiento de linfocitos B de la población de linfocitos B que secretan un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno diana.

Depósito de células individuales:

El uso de acuerdo con la invención comprende la etapa de depósito de los linfocitos B de una población de linfocitos B como células individuales. En un modo de realización del uso, el depósito como células individuales es por separación de células activadas por fluorescencia (FACS). El marcaje requerido para el depósito de células individuales por FACS se puede llevar a cabo como se informa en la sección previa.

En un modo de realización del uso, los linfocitos B marcados específicamente se depositan como células individuales. En otro modo de realización del uso, el marcaje es un marcaje de marcadores de superficie celular con anticuerpos marcados con fluorescencia. En otro modo de realización, el uso proporciona anticuerpos monoclonales. En un modo de realización del uso, los linfocitos B maduros se depositan como células individuales.

También se ha descubierto que una etapa de centrifugación adicional después del depósito de células individuales y antes del cocultivo proporciona un número incrementado de células que secretan anticuerpos e incrementa la cantidad de la IgG secretada (ejemplo, animal de experimentación con locus de inmunoglobulina humana, véase la tabla 6).

Tabla 6: pocillos/clones celulares positivos para IgG con y sin etapa de centrifugación después del depósito de células individuales.

En un modo de realización del uso, el uso comprende la etapa de centrifugación de las células depositadas individuales antes del cocultivo. En un modo de realización específico, la centrifugación es durante 5 min a 300 x g.

Cocultivo:

La etapa de cocultivo con células de alimentación puede estar precedida y también sucedida por una serie de etapas adicionales.

En un modo de realización del uso, los linfocitos B depositados individuales se cocultivan con células de alimentación en presencia de una mezcla de alimentación. En un modo de realización específico, los linfocitos B se cocultivan con células de alimentación EL-4 B5 murinas. Por marcaje por inmunofluorescencia adecuado como se explica anteriormente se puede lograr un incremento del rendimiento en la etapa de cocultivo (número de pocillos/clones celulares IgG+, así como concentración de IgG) y también un enriquecimiento o aislamiento de linfocitos B IgG+ maduros de PBMC.

Con el depósito de células individuales de linfocitos B IgG+CD19+ y/o IgG+CD38+ de PBMC recién aislados, se puede obtener el número más alto de pocillos/clones celulares IgG+. Con el depósito de células individuales de linfocitos B IgG+CD19+, IgG+CD38+ y/o IgG' CD138+ después del agotamiento de macrófagos o células específicas para KLH (hemocianina de lapa californiana) se pueden obtener buenos resultados. Con el depósito de células individuales de linfocitos B IgG+CD19+-, IgG+CD38+- y/o IgG-CD138+- después del agotamiento de linfocitos B específicos de antígeno se pueden obtener resultados mejorados. Por tanto, en un modo de realización del uso, los linfocitos B IgG+CD19+, IgG+CD38+ y/o IgG-CD138+ se depositan como células individuales.

Se ha descubierto que el depósito de células individuales en base a un marcaje como se explica anteriormente da como resultado la fracción más alta de pocillos/clones celulares IgG+ y en los pocillos/clones celulares con la concentración de IgG más alta en el sobrenadante. Por tanto, en un modo de realización del uso, los linfocitos B murinos IgG+CD19+ y/o IgG-CD138+ se depositan como células individuales. En un modo de realización del uso, los linfocitos B de hámster IgG+IgM- se depositan como células individuales. En un modo de realización del uso, los linfocitos B de conejo IgG+, y/o IgG+CD138+, y/o CD138+ y/o IgG+IgM- se depositan como células individuales.

Tabla 7: rendimiento en el cocultivo dependiendo del marcaje por inmunofluorescencia.

Para linfocitos B murinos, con el depósito de células individuales de células IgG+CD19+ después de cada etapa de enriquecimiento (enr.) y/o agotamiento (ago.) se puede obtener el número más alto de pocillos/clones celulares IgG+ después del cocultivo. De forma alternativa, con el depósito de células individuales de células IgG-CD138+ se pueden obtener pocillos/clones celulares con la mejor concentración de IgG en el sobrenadante. El depósito de células individuales de células IgG-CD138+ se puede usar para linfocitos B de animales inmunizados. El depósito de células individuales de células IgG-CD19+ se puede usar para linfocitos B de animales no inmunizados. El depósito de células individuales de células IgG+IgM- se puede usar para linfocitos B de hámster de animales inmunizados y no inmunizados. El depósito de células individuales de linfocitos B IgG+, y/o IgG+CD138+, y/o CD138+ y/o IgG+IgM- se puede usar para los linfocitos B de conejo.

El marcaje por inmunofluorescencia usado para linfocitos B obtenidos de sangre de un animal de experimentación también se puede usar para el marcaje de linfocitos B obtenidos del bazo y otros órganos inmunitarios de un animal de experimentación, tal como ratón, hámster y conejo. Para linfocitos B de ratón, la fracción de linfocitos B IgG+ del bazo fue de aproximadamente un 0,8 % en comparación con un 0,4 % para células IgG+CD19+. Para linfocitos B de hámster, los números respectivos son un 1,9 % y un 0,5 % de células IgG+IgM-. Para linfocitos B derivados de sangre de conejo, se descubrió un 0,2 % de células IgG+ después del agotamiento de macrófagos. Las placas de Peyer de conejo mostraron un 0,4 % de células IgG+ y el bazo mostró un 0,3 % de células IgG+ después del agotamiento de macrófagos.

Con el uso de acuerdo con la invención, después de aproximadamente siete (7) días, es decir, después de 5, 6, 7 u 8 días, especialmente después de 7 u 8 días, se pueden obtener concentraciones de anticuerpo de cocultivo de desde aproximadamente 30 ng/ml hasta 15 pg/ml o más (valor promedio de aproximadamente 500 ng/ml). Con la cantidad de anticuerpo proporcionada de este modo, se puede realizar un alto número de análisis diferentes para caracterizar el anticuerpo, por ejemplo, con respecto a la especificidad de unión, con mayor detalle. Con la caracterización mejorada del anticuerpo en esta fase temprana en el procedimiento de cribado/selección, es posible reducir el número de aislamientos y reacciones de secuenciación de ácido nucleico requeridos que se tienen que realizar. Adicionalmente, el clon de linfocitos B proporciona una cantidad de ARNm que codifica la región variable de la cadena ligera y pesada monoclonal, lo que permite el uso de un cebador para p Cr redundante y obvia el requisito de un cebador altamente específico. También se reduce el número requerido de ciclos de PCR. Por tanto, en un modo de realización, la PCR con retrotranscriptasa es con un cebador para PCR redundante para el dominio variable de la cadena ligera y pesada.

Es especialmente adecuado usar el timo de crías de animal en comparación con el aislamiento de timocitos de la sangre de animales adultos. El término "cría de animal" indica un animal antes de que se produzca la madurez sexual. Una cría de hámster, por ejemplo, tiene una edad de menos de 6 semanas, especialmente menos de 4 semanas. Una cría de ratón, por ejemplo, tiene una edad de menos de 8 semanas, especialmente menos de 5 semanas.

Debido al origen de la mezcla de alimentación, que se deriva del sobrenadante de timocitos cultivados (sobrenadante de cultivo de timocitos, TSN), se producen variaciones considerables de lote a lote. Para superar esta variabilidad, se ha desarrollado una mezcla de alimentación sintética que consiste en componentes sintéticos. Es conocida una mezcla de alimentación que consiste en IL-1p (interleucina-1 beta), TNFa (factor de necrosis tumoral alfa), IL-2 (interleucina-2) e IL-10 (interleucina-10) de Tucci, A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784.

La presente invención comprende una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B depositados individuales y células de alimentación. La invención también comprende aditivos específicos de especies de linfocitos B para la mezcla de alimentación sintética para incrementar la cantidad de anticuerpo secretado por el clon de linfocitos B respectivo. Simultáneamente, las células altamente productoras contienen más ARNm que, a su vez, facilita la retrotranscripción y secuenciación del ácido nucleico codificante, por ejemplo, con un conjunto de cebadores no específicos redundantes.

Por la adición de SAC (células de la cepa Cowans de Staphylococcus aureus, se usó un lote de SAC individual) se puede incrementar el número de linfocitos B que secretan anticuerpos y la concentración de IgG promedio en el sobrenadante después del cocultivo. Se ha descubierto que, para la adición de SAC en el cocultivo, se puede definir un intervalo de concentraciones como reducido, así como concentraciones incrementadas de SAC reducen la cantidad de anticuerpo secretado.

Tabla 8a: resultados de un ELISA de huCk (huCk = C kappa humana) o ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B obtenidos de un animal de experimentación con locus de IgG humana o un conejo natural (NZW) cocultivados con células de alimentación EL-4 B5 y TSN como mezcla de alimentación con o sin SAC añadidas.

Se puede observar que una proporción de SAC de desde 1:20000 a 1:150000 proporciona un número incrementado de pocillos/clones celulares IgG+, con lo que la proporción de desde 1:50000 a 1:100000 muestra los números más altos. En un modo de realización, la cantidad de sAc añadida al medio de cultivo se determina proporcionando una serie de diluciones y determinando la dilución a la que las SAC añadidas proporciona el número más alto de pocillos/clones celulares positivos para IgG.

Se ha observado que por la adición de SAC a la mezcla de alimentación el cocultivo de linfocitos B se cambiaba de forma sorprendente de tal manera que solo los linfocitos B depositados individuales tenían un beneficio en el crecimiento, mientras que el crecimiento de linfocitos B se inhibía cuando se usaba una mezcla de PBL (por ejemplo, linfocitos B y linfocitos T endógenos) para el cocultivo.

Tabla 8b: resultados de un ELISA de huCk o ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de PBL y linfocitos B depositados individuales cocultivados con células de alimentación EL-4 B5 y TSN como mezcla de alimentación con SAC añadidas.

con agotamiento de

macrófagos

Se presentan otros datos obtenidos con diferentes mezclas de alimentación en las siguientes tablas 9 y 10.

En un modo de realización específico, IL-1p, TNFa, IL-2 e IL-10 son IL-1p murina, TNFa murino, IL-2 murina e IL-10 murina recombinantes.

En un modo de realización del uso, la mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B de hámster comprende IL-1 p, IL-2, IL-10, TNF-a, IL-6 y SAC. En un modo de realización específico, se añade IL-6 a una concentración de 10 ng/ml. En un modo de realización específico, se añaden SAC a una proporción de 1:75.000.

Tabla 9: resultados de un ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B de conejo cocultivados con células de alimentación EL-4 B5 y mezclas de alimentación sintéticas diferentes que comprenden sustancias murinas recombinantes en diferentes combinaciones.

Tabla 10: pocilios IgG+ sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B de conejo cocultivados con células de alimentación EL-4 B5 y TSN o una mezcla de alimentación que comprende sustancias murinas recombinantes y SAC (rb = conejo, m = ratón).

Un cocultivo de células de alimentación y linfocitos B murinos sin IL-2, sin IL-10, así como sin IL-2 ni IL-10, da como resultado un incremento del rendimiento de los pocillos IgG+ a pesar de que se reduzca la concentración de IgG. Sin TNFa, la concentración de IgG también se reduce. Sin IL-1 p, no se puede encontrar IgG en el sobrenadante.

Un cocultivo de linfocitos B de hámster sin IL-2 o sin IL-10, respectivamente, da como resultado pocillos IgG+ con concentración de IgG detectable. Por el contrario, en un cocultivo sin IL-2 ni IL-10 casi no se puede detectar ningún crecimiento de linfocitos B. En ausencia de TNF-a o IL-1p no se puede determinar la secreción de IgG.

En presencia de células de alimentación EL-4 B5, se requieren al menos IL-1 p y TNFa para el cocultivo de linfocitos B de ratón, hámster y conejo. Se pueden omitir IL-2 e IL-10 para el cocultivo de células murinas. Se pueden cultivar linfocitos B de hámster en ausencia de IL-2 o bien IL-10. Se pueden cultivar linfocitos B de conejo en ausencia de IL-2 o bien IL-10 o IL-6.

Para linfocitos B murinos y de hámster, la adición de IL-4 a la mezcla de alimentación incrementa el número de pocillos/clones celulares IgG+, así como la concentración de IgG en el sobrenadante.

La adición de IL-6 a la mezcla de alimentación para el cocultivo de linfocitos B murinos o linfocitos B de hámster da como resultado un número incrementado de pocillos/clones celulares IgG+ o concentración de IgG incrementada, respectivamente. Por tanto, en un modo de realización del uso, la mezcla de alimentación para el cocultivo de linfocitos B murinos o linfocitos B de hámster comprende IL-6. En un modo de realización específico, se añade IL-6 a una concentración de 50 ng/ml. En un modo de realización específico, se añade IL-6 a una concentración de 10 ng/ml si se requiere alta concentración de IgG. En un modo de realización específico, la adición de IL-6 es después de tres días de cocultivo de los linfocitos B seleccionados y células EL-4 B5.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B y células de alimentación que comprende IL-p, TNFa, IL-10 y una o más seleccionadas de SAC, IL-2 e IL-6.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B y células de alimentación que comprende IL-1p, TNFa, IL-2, IL-10 y SAC.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B murinos y células de alimentación que consiste en IL-1p, TNFa, y opcionalmente comprende IL-21, y/o SAC, y/o BAFF, y/o IL-6.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B murinos o de hámster y células de alimentación que comprende IL-1p, TNFa, IL-2, IL-10 e IL-6.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B de hámster y células de alimentación que consiste en IL-1p, TNFa e IL-2 o IL-10 y SAC.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B de hámster y células de alimentación que comprende IL-1p, IL-2, IL-10, TNF-a, IL-6 y SAC.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células de alimentación que comprende IL-1p, TNFa, IL-10 e IL-6.

Un aspecto de la invención es una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células de alimentación que comprende IL-1p, TNFa, IL-10, IL-6 o IL-2 y sAc .

En un modo de realización específico, se añade IL-6 a una concentración de 10 ng/ml.

En un modo de realización específico, se añaden SAC a una proporción de 1:75.000.

En un modo de realización específico, las células de alimentación son células EL-4 B5 murinas.

La adición de un inhibidor de un determinado canal de potasio (= PAP-1, 5-(4-fenoxibutoxi)psoraleno) incrementa de forma sorprendente la secreción de rbIgG de linfocitos B de una manera dependiente de la concentración sin disminuir el número de clones de linfocitos B. Normalmente una citocina que indujo la productividad de rbIgG se puede correlacionar con una disminución del número global de clones de linfocitos B. Esto no fue el caso con PAP-1.

Tabla 11: resultados de un ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B cocultivados con células de alimentación EL-4 B5 en presencia de TSN y SAC (=sin) y concentraciones diferentes de PAP-1. DMSO: disolvente para PAP-1 (1 pM).

Con una concentración de TSN de un 7,5 % se puede obtener la concentración de IgG más alta en el sobrenadante.

Tabla 12: influencia de TSN en el cocultivo. Una concentración de TSN de un 7,5 % da como resultado un crecimiento y productividad de linfocitos B incrementados

Con un número de 30.000 células de alimentación por pocilio de una placa de 96 pocilios se puede obtener el número más alto de pocillos IgG+ en combinación con una concentración de IgG en el sobrenadante. En un modo de realización del uso, el número de células de alimentación por linfocito B depositado individual es de aproximadamente 30.000.

Tabla 13: influencia de la cantidad de células de alimentación EL-4 B5 en el cocultivo.

El cocultivo, en un modo de realización del uso, es en placas de múltiples pocillos de poliestireno con pocillos con un fondo redondo. El volumen de trabajo de los pocillos, en un modo de realización del uso, es de 50 pl a 250 pl. En un modo de realización específico, los pocillos se recubren al menos parcialmente con un sustrato no fibroso preparado a partir de una combinación de resina plástica polimérica y moléculas anfipáticas, en la que la molécula anfipática comprende un resto hidrófilo y una región hidrófoba, en la que las regiones hidrófobas se anclan dentro del sustrato y los restos hidrófilos se exponen en el sustrato. En un modo de realización específico, las moléculas anfipáticas se eligen de alquilamina etoxilada, poli(etilenimina), octildecamina o mezclas de las mismas (véase, por ejemplo, el documento EP 1860 181).

Caracterización de células cocultivadas:

Para la determinación (cualitativa y cuantitativa) de IgG secretada después del cocultivo se pueden usar, en general, todos los procedimientos conocidos por un experto en la técnica, tal como un ELISA. Para la determinación de IgG secretada por linfocitos B murinos se usa un ELISA con los anticuerpos anti-IgG AB 216 (anticuerpo de captura) y AB 215 (anticuerpo trazador). Para la determinación de IgG secretada por linfocitos B de hámster se usa un ELISA con los anticuerpos monoclonales AB 220 (anticuerpo de captura) y AB 213 (anticuerpo trazador).

Dependiendo de los resultados de caracterización se puede obtener, es decir, seleccionar, un clon de linfocitos B. El término "clon" indica una población de linfocitos B que se dividen y que secretan anticuerpos que surge de/que se origina de un linfocito B individual. Por tanto, un clon de linfocitos B produce un anticuerpo monoclonal.

Aislamiento de ARNm, clonación y secuenciación:

A partir de los linfocitos B, el ARNm total se puede aislar y transcribir en ADNc. Con cebadores específicos, se puede amplificar el ácido nucleico que codifica la región VH y VL relacionada. Con la secuenciación del ácido nucleico así obtenido se confirmó que los anticuerpos obtenidos son anticuerpos monoclonales en la mayoría de los casos (71 95 %). También se puede observar de la secuenciación de los linfocitos B individuales que casi no se obtiene ninguna secuencia idéntica. Por tanto, el procedimiento proporciona anticuerpos altamente diversos que se unen al mismo antígeno.

Los cebadores usados para la amplificación del ácido nucleico que codifica VH se pueden usar para ADNc obtenido de células de ratón NMRi, hámster armenio, ratón Balb/c, así como hámster sirio y conejo.

La secuencia de aminoácidos se deriva del ácido nucleico que codifica VH amplificado y el punto de comienzo y finalización exactos se identifica localizando las secuencias de aminoácidos de EVQL/QVQL en VSS (región VH) y DIVM/DIQM en KLEIK (región VL).

El término “anticuerpo” indica una proteína que consiste en una o más cadenas polipeptídicas sustancialmente codificadas por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los diferentes genes de la región constante, así como la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)², así como monocatenarios (scFv), diacuerpos, formas monovalentes, bivalentes, trivalentes o tetravalentes, y también como forma biespecífica, triespecífica o tetraespecífica (por ejemplo, Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; en general, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2.a edición (1984); y Hunkapiller, T. y Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).

Un “casete de expresión” se refiere a una construcción que contiene los elementos reguladores necesarios, tales como promotor y sitio de poliadenilación, para la expresión de al menos el ácido nucleico contenido en una célula.

El término “animal de experimentación” indica un mamífero no humano. En un modo de realización, el animal de experimentación se selecciona de rata, ratón, hámster, conejo, primates no humanos, oveja, perro, vaca, pollo, anfibios y reptiles.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, exponiéndose su verdadero alcance en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Medios y tampones:

El tampón de bloqueo para ELISA comprende 1X PBS y BSA al 1 %.

El tampón de recubrimiento para ELISA comprende 4,29 g de Na2CO3* 10 H2O y 2,93 g de NaHCO3, añadir agua a un volumen final de 1 litro, pH 9,6 ajustado con HCl 2 N.

La solución de etanol para el aislamiento de ARN comprende etanol al 70 % o etanol al 80 %.

El tampón para FACS para la tinción con inmunofluorescencia comprende 1X PBS y BSA al 0,1 %.

El tampón IMDM para ELISA comprende 1X PBS, IMDM al 5 % y BSA al 0,5 %.

El tampón de incubación 1 para ELISA comprende 1X PBS, CroteinC al 0,5 %.

El tampón de incubación 2 para ELISA comprende 1X PBS, CorteinC al 0,5 % y Tween 20 al 0,02 %.

El tampón de incubación 3 para ELISA comprende 1X PBS, BSA al 0,1 %.

El tampón de incubación 4 para ELISA comprende 1X PBS, BSA al 0,5 %, Tween al 0,05 %, PBS (10X), KH2PO4 0,01 M, Na2HPO40,1 M, NaCl 1,37 M, KCl 0,027 M, pH 7,0.

El tampón para PCR comprende KCl 500 mM, MgCl2 15 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 9,0.

El tampón de lavado 1 para ELISA comprende 1X PBS, Tween 20 al 0,05 %.

El tampón de lavado 2 para ELISA comprende 1X PBS, Tween 20 al 0,1 %.

El tampón de lavado 3 para ELISA comprende agua, NACl al 0,9 %, Tween 20 al 0,05 %.

El medio de EL-4 B5 comprende RPMI 1640, FCS al 10 %, mezcla de glutamina/penicilina/estreptomicina al 1 %, piruvato de sodio 100 mM al 2 %, tampón HEPES1 M al 1 %.

Ejemplo 2

Cuidado animal e inmunización

Los animales de experimentación se mantuvieron de acuerdo con la Ley de Protección Animal Alemana (TierSCHG), así como de acuerdo con las directrices europeas respectivas.

Se recibieron ratones y hámsteres a una edad de desde 6 a 8 semanas y se inmunizaron antes de una edad de 12 semanas. El antígeno se aplicó en primer lugar conjuntamente con el adyuvante de Freud completo (CFA). Otras aplicaciones fueron con adyuvante de Freud incompleto (IFA). La emulsión que contenía el antígeno se aplicó por vía subcutánea, con lo que la emulsión comprendía una cantidad de desde 50 a 100 pg de antígeno dependiendo del peso del animal de experimentación receptor.

Se usaron conejos NZW (Charles River Laboratories International, Inc.) para la inmunización. Se disolvió el antígeno en tampón K³PO⁴, pH 7,0, a una concentración de 1 mg/ml y se mezcló (1:1) con adyuvante de Freud completo (CFA) hasta la generación de una emulsión estable. Los conejos recibieron una inyección intradérmica (i.d.) de 2 ml de emulsión seguida de una segunda inyección intramuscular (i.m.) y una tercera subcutánea (s.c.), cada una con 1 ml, en un intervalo de una semana. La cuarta inyección i.m. de 1 ml se realizó dos semanas más tarde, seguida de otras dos inyecciones s.c. de 1 ml en un intervalo de cuatro semanas.

Durante la inmunización, se determinó el valor de anticuerpos en suero con un ensayo específico de antígeno. A un valor de anticuerpos con una CI⁵⁰de 1:10000, se extrajo la sangre o el bazo del animal inmunizado. Para la reactivación de linfocitos B específicos de antígeno, se aplicaron por vía intravenosa de 30 pg a 50 pg del antígeno al animal de experimentación tres días antes de la extracción de sangre o del bazo.

Ejemplo 3

Extracción de órganos, sangre y macrófagos

Se obtuvo sangre de ratones y hámster por punción de la vena retrobulbérica. Se obtuvo sangre de conejos por punción de la vena de la oreja o, para volúmenes más grandes, de la arteria de la oreja. Se recogió sangre completa (10 ml) de conejos 4-6 días después de la tercera, cuarta, quinta y sexta inmunización y se usó para la separación de células individuales por FACS.

Se aislaron macrófagos de la sangre obtenida por fijación al plástico de cultivo celular. Para ratones y hámsteres, se pueden obtener aproximadamente 3*105 macrófagos de cada animal por este procedimiento.

Si se requería una cantidad más grande de macrófagos de ratón o hámster se aislaban macrófagos peritoneales. Para esto, los animales tienen que tener una edad de al menos 3 meses. Para la extracción de macrófagos peritoneales se sacrificaron los animales y se inyectaron de inmediato 5 ml de medio de EL-4 B5 con una temperatura de 37 °C en la cavidad peritoneal. Después de masajear el vientre de los animales durante 5 minutos, se extrajo la solución que contenía las células.

Ejemplo 4

Cultivo de células EL-4 B5

Se descongelaron rápidamente las células EL-4 B5 congeladas en un baño de agua a 37 °C y se diluyeron con 10 ml de medio de EL-4 b 5. Después de la centrifugación a 300 x g durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en el medio. Después de otra etapa de centrifugación, se desechó nuevamente el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1 ml de medio.

Se inocularon células EL-4 B5 a una densidad celular de 3 x 104 células/ml en matraces de cultivo de 175 m2. La densidad celular se determinó cada segundo día y se ajustó a 3 x 104 células/ml. Las células tienen un tiempo de duplicación de aproximadamente 12 horas y se tienen que cultivar a una densidad celular por debajo de 5 x 105 células/ml porque con mayor densidad celular se pierden las propiedades estimuladoras de las células.

Cuando el número de células totales fue de aproximadamente 1,5 x 109 células, se extrajo el medio por centrifugación. Luego, se irradiaron las células con 50 gray (5000 rad). Después de la determinación del número de células viables por tinción con azul tripano, entre 5 x 106 y 1 x 107 células se dividen en alícuotas y se congelan a -80 °C.

Para el cocultivo, se descongelaron las células y se lavaron dos veces con medio de EL-4 B5. Para la determinación del número de células viables, se diluye 1:10 la suspensión celular con solución de azul tripano al 0,4 % (p/v) y se transfieren 10 pl de la mezcla a una cámara de recuento de Neubauer y se contó el número de células.

Ejemplo 5

Centrifugación en gradiente de densidad

Se efectuó el aislamiento de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) por separación en gradiente de densidad con Lympholyte® de acuerdo con las instrucciones del fabricante A (Lympholyte®-mammal, cedarlane).

Se diluyó 2:1 sangre extraída con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En un frasco de centrifugadora, se proporcionó el mismo volumen de medio de separación por densidad y la sangre diluida se añade cuidadosamente por medio de la pared del frasco. El frasco se centrifugó durante 20 min a 800 x g sin frenado. Los linfocitos se obtuvieron de la capa blanca intermedia. Las células extraídas se complementaron con 10 ml de PBS y se centrifugaron a 800 x g durante 10 min. El sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió, lavó y centrifugó. El sedimento final se resuspendió en PBS.

Ejemplo 6

Lisis hipotónica de glóbulos rojos

Para la ruptura de los glóbulos rojos por lisis hipotónica, se diluyó 1:10 una solución de cloruro de amonio (BD Lyse™) con agua y se añadió a una proporción de 1:16 con respecto a sangre completa. Para la lisis de los glóbulos rojos, se incubó la mezcla durante 15 min en la oscuridad. Para la separación de los restos celulares de células intactas, se centrifugó la solución durante 10 min a 800 x g. El sobrenadante se desechó, se resuspendió el sedimento en PBS, se lavó nuevamente, se centrifugó y se resuspendió el sedimento en PBS.

Ejemplo 7

Preparación de células de órganos internos de un animal de experimentación

Para la preparación de células de bazo y timo, se disecó el órgano respectivo en una placa de Petri y se tomaron las células en PBS. Para la extracción del tejido restante, se filtró la suspensión celular a través de un tamiz de 100 pm. Para obtener linfocitos de células de bazo se empleó centrifugación en gradiente de densidad. Para las células del timo, no se requirió ninguna otra etapa de enriquecimiento.

Ejemplo 8

Agotamiento de macrófagos

Se usaron placas de 6 pocillos estériles (calidad para cultivo celular) para agotar macrófagos y monocitos a través de adhesión inespecífica. Se recubrieron pocillos con KLH (hemocianina de lapa californiana) o bien con estreptavidina y los péptidos de control. Cada pocillo se rellenó con 3 ml a un máximo de 4 ml de medio y hasta 6 x 106 leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica del conejo inmunizado y se dejó que se unieran durante de 60 a 90 minutos a 37 °C en la estufa de incubación. Después de esto, el sobrenadante que contenía linfocitos se transfirió a un frasco de centrifugación y se centrifugó a 800 x g durante 10 min. El sedimento se resuspendió en PBS.

Se usó un 50 % de las células en el sobrenadante para la etapa de adsorción; el 50 % restante de las células se sometieron directamente a tinción con inmunofluorescencia y separación de células individuales.

Ejemplo 9

Agotamiento de linfocitos B específicos para KLH

Se incubaron cuatro mililitros de una solución que contenía hemocianina de lapa californiana (KLH) con tampón de recubrimiento a una concentración de 2 pg/ml en los pocilios de una placa de múltiples pocilios durante la noche a temperatura ambiente. Antes de la etapa de agotamiento, se extrajo el sobrenadante y se lavaron los pocillos dos veces con PBS. Luego, se ajustaron los glóbulos sanguíneos a una densidad celular de 2 x 106 células/ml y se añadieron 3 ml a cada pocillo de una placa de múltiples pocillos. Luego, se incubó la placa de múltiples pocillos durante de 60 a 90 min a 37 °C. Se transfirió el sobrenadante a un frasco de centrifugación y se lavan los pocillos dos veces con PBS y se combinan los sobrenadantes en el frasco de centrifugación. Se sedimentaron las células por centrifugación a 800 x g durante 10 min y se resuspendió el sedimento en PBS.

Ejemplo 10

Enriquecimiento de linfocitos B específicos de antígeno

El antígeno respectivo se diluyó con tampón de recubrimiento a una concentración final de 2 pg/ml. Se añadieron 3 ml de esta solución al pocillo de una placa de múltiples pocillos de 6 pocillos y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Antes del uso, se extrajo el sobrenadante y se lavaron los pocillos dos veces con PBS. Se ajustó la solución de linfocitos B a una concentración de 2 x 106 células/ml y se añadieron 3 ml a cada pocillo de una placa de múltiples pocillos de 6 pocillos. Se incubó la placa durante de 60 a 90 min a 37 °C. Se extrajo el sobrenadante y se lavaron los pocillos de dos a cuatro veces con PBS. Para la recuperación de los linfocitos B específicos de antígeno, se añadió 1 ml de una solución de tripsina/EDTA a los pocillos de la placa de múltiples pocillos y se incubó durante de 10 a 15 min a 37 °C. Se detuvo la incubación por adición de medio y se transfirió el sobrenadante a un frasco de centrifugación. Se lavaron los pocillos dos veces con PBS y se combinaron los sobrenadantes con los otros sobrenadantes. Se sedimentaron las células por centrifugación durante 10 min a 800 x g. Se resuspendió el sedimento en PBS.

Ejemplo 11

Cocultivo de linfocitos B y células EL-4 B5

a) Se realizó el cocultivo en placas de múltiples pocillos de 96 pocillos con fondo redondo. Se preparó una solución base que comprendía células EL-4 B5 (1,6 x 106 células/15,2 ml) y citocinas en medio de EL-4 B5. Se añadieron 200 pl de la solución base a cada pocillo de la placa de múltiples pocillos. A cada pocillo se le añadió un linfocito B individual por separación de células activadas por fluorescencia. Después de la adición de los linfocitos B, se centrifugó la placa durante 5 min a 300 x g. Se incuba la placa durante siete días a 37 °C.

b) Se cultivaron linfocitos B separados individuales en placas de 96 pocilios con 210 pl/pocillo de medio de EL-4 B5 con células Pansorbin (1:20000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania), sobrenadante de timocitos de conejo al 5 % y células de timoma murino EL-4-B5 irradiadas con rayos gamma (2 x 104/pocillo) durante 7 días a 37 °C en una atmósfera de un 5 % de CO²en la estufa de incubación. Se extrajeron los sobrenadantes de cultivo de linfocitos B para el cribado y se recogieron de inmediato las células para la clonación de los genes de la región variable o se congelaron a - 80 °C en 100 pl de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).

Ejemplo 12

Cultivo de linfocitos T

Se aislaron los linfocitos T del timo de ratones y hámsteres de 3-4 semanas de edad o de conejos de 4-5 semanas de edad, respectivamente. Se centrifugaron las células y de inmediato se cultivaron o se congelaron en alícuotas de 3 x 107 células. Se sembraron los timocitos con una densidad celular mínima de 5 x 105 células/ml de medio de EL-4 B5 en matraces de cultivo de 175 cm2 y se incubaron durante 48 horas a 37 °C.

Ejemplo 13

Cultivo de macrófagos

Se aislaron macrófagos de la cavidad peritoneal de ratones y hámsteres, respectivamente, de una edad de al menos tres meses. Se cultivaron macrófagos peritoneales de ratones o hámsteres, o leucocitos monomorfonucleares en la sangre de conejos en medio de EL-4 B5 a una densidad celular de al menos 1 x 105 células/ml en matraces de cultivo de 175 cm2 durante 1,5 horas a 37 °C. Luego, se extrajo el medio y se extrajeron las células no fijadas de los macrófagos fijados lavándolas con medio de EL-4 B5 caliente, seguido de cultivo durante 48 horas en 35 ml de medio.

Ejemplo 14

Cocultivo de linfocitos T y macrófagos

Se cultivaron linfocitos T y macrófagos durante 48 horas en matraces separados. Antes de combinar ambas poblaciones de células, se centrifugaron los linfocitos T durante 10 min a 800 x g. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 10 ml de medio. Se ajustaron los linfocitos T a una densidad celular mínima de 5 x 105 células/ml y se añadieron 10 pg de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) y 5 ng o 50 ng de fitohemaglutinina M (PHA-M) por ml de medio. Se extrajo el medio de cultivo de los macrófagos y se añadió la suspensión de linfocitos T a los matraces que contenían macrófagos. Después de 36 horas de cocultivo, se extrajo el medio de cultivo y se denominó solución de TSN. Para la extracción de las células restantes, se filtró la solución de TSN a través de un filtro de 0,22 pm. La solución de TSN se congeló a -80 °C en alícuotas de 4 ml.

Ejemplo 15

Tinción con inmunofluorescencia

Dependiendo del número de células que se iban a teñir, se proporcionaron las células en 100 pl de medio (menos de 106 células) o 200 pl de medio (más de 106 células), respectivamente. Se diluyó el anticuerpo marcado fluorescente con suero al 5 % del animal de experimentación y tampón para FACS a un volumen final de 100 pl o 200 pl, respectivamente. Se incubó la mezcla de reacción en una balda giratoria durante 40 min a 4 °C en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces a 300 x g durante 5 min. El sedimento se resuspendió en 400 pl de PBS y se filtró a través de un tamiz de 70 pm. La solución filtrada se transfirió a un frasco de FACS y directamente antes del experimento de FACS se tiñeron las células muertas por adición de yoduro de propidio (6,25 pg/ml). Si el anticuerpo marcado estaba marcado con biotina, el anticuerpo se detectaba en una segunda etapa con Alexa Flour(R) 647 marcado con estreptavidina (anticuerpo 197).

Ejemplo 16

Cuantificación de IgG

La placa de múltiples pocillos de 96 pocillos en la que se realizó el cocultivo se centrifugó después de siete días de cocultivo a 300 x g durante 5 min. Se extrajeron 150 pl de sobrenadante y se diluyeron a una proporción de 2:1 con PBS en una segunda placa de múltiples pocillos de 96 pocillos.

Se realizó el ELISA como se explica en el ejemplo 17.

El anticuerpo se usó a una concentración de 50 ng/ml. Si la DO era o superaba a 1, después de un tiempo de incubación de 5 min, se sometía a prueba una serie de diluciones de desde 0,8 a 108 ng/ml de IgG.

Ejemplo 17

Detección de IgG específica de antígeno

Se pueden caracterizar anticuerpos producidos por linfocitos B depositados individuales y cocultivados o de linfocitos B obtenidos de un animal de experimentación inmunizado con respecto a su unión específica a antígeno. Se realizó el ELISA a temperatura ambiente y se incubó la solución de ELISA entre las etapas individuales en un agitador a 20 x g. En la primera etapa, el antígeno se unió a los pocillos de una placa de múltiples pocillos de 96 pocillos. Si el antígeno era una proteína, se había diluido en tampón de recubrimiento y se aplicaba directamente a la placa. Se unieron antígenos peptídicos por medio del par de unión específico biotina/estreptavidina. Los pocillos de la placa de múltiples pocillos ya pueden estar recubiertos con CroteinC soluble (CrC) por el fabricante. En caso contrario, los pocillos se incubaron después de la inmovilización del antígeno con 200 pl de tampón de bloqueo. Después de la incubación con 100 pl de solución de antígeno por pocilio (placa de múltiples pocilios prerrecubierta) o 200 pl de tampón de bloqueo, respectivamente, se extrajo el antígeno no unido o tampón de bloqueo lavando con tampón de lavado. Se añadieron sobrenadantes de linfocitos B diluidos en un volumen de 100 pl por pocillo y se incubaron. Después de la incubación, los pocillos se lavaron. Luego, se añadió el anticuerpo de detección en un volumen de 100 pl. El anticuerpo se puede conjugar a peroxidasa de rábano picante o bien marcar con biotina. El anticuerpo de detección se determinó con un conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Después de la incubación, se lavó la placa de múltiples pocillos y luego se añadieron 50 pl de una solución de sustrato que contenía 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) por pocillo y se incubó durante un periodo como se da en la tabla X. Se detuvo la reacción enzimática por la adición de 50 pl de ácido sulfúrico y se determinó la densidad óptica a 450 nm y 680 nm con un fotómetro (Rainbow Thermo ELISA Reader) y el programa informático Xread plus.

Ejemplo 18

Aislamiento de ácido ribonucleico (ARN)

Las células de las que se tenía que aislar el ARN se sedimentaron en primer lugar por centrifugación. El sedimento celular se lisó por la adición de 100 pl de tampón RLT con 10 pl/ml de beta-mercaptoetanol. Se resuspendieron las células por mezclado múltiple con una pipeta. Se transfirió la solución a un pocillo de una placa de múltiples pocillos. Se agitó brevemente la placa a 200 x g y se congeló a -20 °C.

El aislamiento del ARN se realizó con el kit RNeasy® (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 19

Reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción

Se llevó a cabo la retrotranscripción en un volumen de 20 pl. Para cada reacción, se realizó un control con y sin retrotranscriptasa. Por reacción, se premezclaron 1 pl de dNTP (cada uno a 10 mM), 0,4 pl de oligo(dT)^12-18(0,2 pg) y 0,6 pl de hexámero aleatorio (0,03 pg) y se añadieron a 8,5 pl de ARN en H2O. Se incubó la mezcla de reacción durante 5 min a 65 °C y luego se transfirió directamente a hielo. Después de esto, se premezclaron 2 pl de tampón RT (10 x), 4 pl de MgCl2 (25 mM), 2 pl de DTT (0,1 M) y 1 pl de RNAse Out™ (40 unidades) y se añadieron a la mezcla de reacción enfriada en hielo. Después de un tiempo de incubación de 2 min a temperatura ambiente, se añadieron 0,5 pl de retrotranscriptasa Superscript™ II (25 unidades). Se incubó la mezcla de reacción durante 10 min a temperatura ambiente.

Se llevó a cabo la traducción durante 50 min a 42 °C. Después de la traducción, se inactivó la retrotranscriptasa por incubación durante 15 min a 70 °C. El ADNc se almacenó a -20 °C.

Ejemplo 20

Reacción en cadena de la polimerasa

Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa con el kit TaqPCR Core (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo la PCR en un volumen de 20 pl. Se transfirieron las muestras al Mastercyler® a una temperatura de 95 °C.

Ejemplo 21

Secuenciación

Se determinaron todas las secuencias por SequiServe (Vaterstetten, Alemania).

Ejemplo 22

Adsorción sobre antígeno

a) Recubrimiento de placas

Biotina/estreptavidina: Se incubaron placas de 6 pocilios recubiertas con estreptavidina estériles (calidad para cultivo celular) con antígeno biotinilado a una concentración de 0,5 - 2 pg/ml en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Se lavaron placas en PBS estéril tres veces antes de su uso.

Proteína unida de forma covalente: se recubrieron placas de 6 pocillos de cultivo celular con 2 pg/ml de proteína en tampón carbonato (bicarbonato de sodio 0,1 M, hidrogenocarbonato de disodio 34 mM, pH 9,55) durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron en PBS estéril tres veces antes de su uso.

b) Adsorción de linfocitos B sobre péptidos

Se sembraron placas de cultivo tisular de 6 pocillos recubiertas con el antígeno respectivo con hasta 6x106 células por 4 ml de medio y se dejó que se unieran durante una hora a 37 °C en la estufa de incubación. Las células no adherentes se extrajeron lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Las células pegajosas restantes se separaron por tripsina durante 10 min a 37 °C en la estufa de incubación y, a continuación, se lavaron dos veces en los medios. Las células se mantuvieron en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una mezcla de alimentación sintética para el cocultivo de linfocitos B y células de alimentación, en el que la mezcla de alimentación sintética consiste en componentes sintéticos que comprenden IL-1p, TNFa, IL-10 e - IL-2 y SAC, o

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que IL-1p, TNFa, IL-2 e IL-10 son IL-1 p murina, TNFa murino, IL-2 murina e IL-10 murina recombinantes.

3. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la mezcla de alimentación sintética comprende IL-6 a una concentración de 10 ng/ml.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las células de alimentación son células EL-4 B5 murinas.