CN108588019B - 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件 - Google Patents

一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件 Download PDF

Info

Publication number
CN108588019B
CN108588019B CN201810413845.1A CN201810413845A CN108588019B CN 108588019 B CN108588019 B CN 108588019B CN 201810413845 A CN201810413845 A CN 201810413845A CN 108588019 B CN108588019 B CN 108588019B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
medium
culture medium
interleukin
modulability
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810413845.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108588019A (zh
Inventor
施焕中
王雯
翟侃
伊凤双
吴秀芝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Chaoyang Hospital
Original Assignee
Beijing Chaoyang Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Chaoyang Hospital filed Critical Beijing Chaoyang Hospital
Priority to CN201810413845.1A priority Critical patent/CN108588019B/zh
Publication of CN108588019A publication Critical patent/CN108588019A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108588019B publication Critical patent/CN108588019B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2323—Interleukin-23 (IL-23)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种体外诱导初始B细胞分化为调节性B细胞的方法及其培养条件。本发明的方法是将初始B细胞在诱导培养基中进行诱导培养；所述诱导培养基由RPMI‑1640培养基、胎牛血清、脂多糖、CD40配体、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素4、白细胞介素21和白细胞介素23组成。通过本发明提供的诱导培养基培养初始B细胞，可以得到数量充足的CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞。本发明诱导培养基不仅可显著提高初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的诱导分化能力，而且还提高了诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的存活率，具有良好的应用前景。

Description

一种体外诱导初始B细胞分化为调节性B细胞的方法及其培养 条件
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外诱导初始B细胞分化为调节性B细胞的方法及其培养条件。
背景技术
胸腔积液(Pleural effusion)是以胸腔内病理性液体积聚为特征的一种常见临床症候。胸膜腔为脏层和壁层胸膜之间的潜在间隙，正常人胸膜腔内有5-15mL液体，在呼吸运动时起润滑作用。任何原因导致胸膜腔内液体产生增多或吸收减少，即可产生胸腔积液。胸腔积液中有大量的免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞、胸膜间皮细胞等，其中B细胞在胸腔积液中发挥重要的免疫作用。上世纪70年代，科学家们首次描述了一种起免疫抑制作用的B细胞，之后很多年，这类起免疫抑制作用的调节性B细胞(regulatory B，Breg)的功能才被逐渐认识。Breg细胞的分型较为繁杂，目前报道了多种Breg细胞表型：小鼠中，存在T2-MZP(transitional 2marginal-zone precursor)细胞，CD5+CD1dhiB(B10)细胞，MZ(marginal-zone)B细胞，Tim-1+B细胞，CD138+浆细胞和浆母细胞。人类中，CD19+CD24hiCD38hiCD1dhi和CD19+CD24hiCD27+等调节性B细胞表型也被报道。CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞通过产生IL-10，产生抑制T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞的功能(Rosser EC,Mauri C.Regulatory B cells:origin,phenotype,and function.Immunity 2015；42:607-12.)。
迄今为止，关于Breg细胞发育的研究不多，不同表型Breg细胞之间的关系并不清楚。已知Breg细胞通过分泌IL-10、TGF-β和IL-35影响T细胞的分化。目前有研究报道IL-1β和IL-6可诱导B细胞产生IL-10。但尚无研究报道如何诱导CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的产生。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何诱导CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的产生。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的培养基。
本发明提供的培养基包括白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素4、白细胞介素21和白细胞介素23。
进一步的，本发明提供的培养基由基础培养基、胎牛血清、脂多糖、CD40配体、所述白细胞介素1β、所述白细胞介素6、所述白细胞介素4、所述白细胞介素21和所述白细胞介素23组成。所述基础培养基可为RPMI-1640培养基。
更进一步的，所述胎牛血清在所述培养基中的体积分数为(10～20)％；
所述脂多糖在所述培养基中的浓度为(5～15)μg/ml；
所述CD40配体在所述培养基中的浓度为(0.5～1.5)μg/mL；
所述白细胞介素1β在所述培养基中的浓度为(10～30)ng/mL；
所述白细胞介素6在所述培养基中的浓度为(10～30)ng/mL；
所述白细胞介素4在所述培养基中的浓度为(10～30)ng/mL；
所述白细胞介素21在所述培养基中的浓度为(40～60)ng/mL；
所述白细胞介素23在所述培养基中的浓度为(40～60)ng/mL。
在本发明中，所述胎牛血清在所述培养基中的体积分数为10％；
所述脂多糖在所述培养基中的浓度为10μg/ml；
所述CD40配体在所述培养基中的浓度为1μg/mL；
所述白细胞介素1β在所述培养基中的浓度为20ng/mL；
所述白细胞介素6在所述培养基中的浓度为20ng/mL；
所述白细胞介素4在所述培养基中的浓度为20ng/mL；
所述白细胞介素21在所述培养基中的浓度为50ng/mL；
所述白细胞介素23在所述培养基中的浓度为50ng/mL。
上述培养基的pH为7.2-7.4。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述培养基的新用途。
本发明提供了上述培养基在制备CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞中的应用。
本发明还提供了上述培养基在诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞中的应用。
本发明还提供了上述培养基在制备诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的产品中的应用。
本发明还提供了上述培养基在提高初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的诱导分化能力中的应用。
本发明还提供了上述培养基在制备提高初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的诱导分化能力的产品中的应用。
本发明还提供了上述培养基在提高诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的存活率中的应用。
本发明还提供了上述培养基在制备提高诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的存活率的产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的方法。
本发明提供的诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的方法包括如下步骤：在上述培养基中培养初始B细胞，得到CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞。
上述方法中，所述培养的条件如下：37℃、5％CO2条件下培养5-7天；所述培养的条件具体可为：37℃、5％CO2条件下培养5天。
上述方法中，所述初始B细胞在上述培养基中的浓度为(1-5)×106细胞/mL；所述初始B细胞在上述培养基中的浓度具体可为1×106细胞/mL。
上述方法中，所述初始B细胞为胸腔积液来源的初始B细胞。
由上述方法制备得到的CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种用于诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的产品。
本发明提供的产品包括上述培养基。
本发明首次提供了一种将初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的方法以及用于将初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的诱导培养基，通过本发明提供的诱导培养基培养初始B细胞，可以得到数量充足的CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞。本发明的诱导培养基不仅能够显著提高初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的诱导分化能力，而且还提高了诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的存活率，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为胸腔积液患者初始B细胞经不同培养基诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的比例。
图2为胸腔积液患者初始B细胞经本发明的诱导培养基诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的比例。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的RPMI-1640培养基是GIBCO公司的产品，货号：11875-093；胎牛血清是GIBCO公司的产品，货号：10099-141；脂多糖(LPS)是INVIVOGEN公司的产品，货号：14D09-MM；CD40配体(CD40L)是R&D公司的产品，货号：6420-CL-025；白细胞介素1β(IL-1β)是Peprotech公司的产品，货号：200-01B；白细胞介素6(IL-6)是Peprotech公司的产品，货号：200-06；白细胞介素4(IL-4)是Peprotech公司的产品，货号：200-04；白细胞介素21(IL-21)是Peprotech公司的产品，货号：200-21；白细胞介素23(IL-23)是Peprotech公司的产品，货号：200-23。
实施例1、一种用于体外诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的培养基
本发明提供的用于体外诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的培养基是将RPMI-1640培养基、胎牛血清、脂多糖(LPS)、CD40配体(CD40L)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素21(IL-21)和白细胞介素23(IL-23)混匀得到的，其中，胎牛血清在培养基中的体积分数为10％，LPS在培养基中的浓度为10μg/mL，CD40L在培养基中的浓度为1μg/mL，IL-1β在培养基中浓度为20ng/mL，IL-6在培养基中浓度为20ng/mL，IL-4在培养基中的浓度为20ng/mL，IL-21在培养基中的浓度为50ng/mL，IL-23在培养基中的浓度为50ng/mL。培养基的pH为7.2-7.4。
实施例2、诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的方法
一、诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的方法
1、经确诊为胸腔积液患者于入院24小时内，通过规范的胸腔穿刺术采集胸腔积液500mL，并向胸腔积液样本中加入肝素抗凝。所有样本立即置于冰盒内转运至实验室。所有胸腔积液患者来源于首都医科大学附属北京朝阳医院，均知情同意。
2、将步骤1中采集的胸腔积液样本在1500rpm，4℃条件下离心10分钟，得到细胞沉淀。
3、向步骤2中获得的细胞沉淀中加入淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque gradientcentrifugation(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，采用梯度离心法分离单个核细胞，具体步骤参照文献：Determination of Interleukin 27-Producing CD4+and CD8+T Cells forThe Differentiation Between Tuberculous and Malignant Pleural Effusions中的方法。
4、采用美天旎细胞分选试剂盒从步骤3中分离得到的单个核细胞中分选得到初始B细胞，并进行细胞计数。
5、用含10％(体积分数)胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬步骤4获得的初始B细胞，按照1×106细胞/mL密度接种于96孔板中；然后每孔分别加入200μL如下32种培养基，在37℃、5％CO2条件下培养5天。32种培养基具体如下：
培养基1：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)；
培养基2：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β；
培养基3：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)；
培养基4：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-6(20ng/mL)；
培养基5：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基6：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基7：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)；
培养基8：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)；
培养基9：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基10：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基11：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)；
培养基12：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基13：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基14：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基15：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基16：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基17：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)；
培养基18：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基19：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基20：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基21：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基22：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基23：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基24：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基25：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基26：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基27：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)；
培养基28：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基29：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基30：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基31：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)；
培养基32：RPMI-1640培养基+胎牛血清(10％)+LPS(10μg/mL)+CD40L(1μg/mL)+IL-1β(20ng/mL)+IL-4(20ng/mL)+IL-6(20ng/mL)+IL-21(50ng/mL)+IL-23(50ng/mL)。
二、CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的表型鉴定
培养5天后，分别检测上述各个培养体系中CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞所占的比例。具体步骤如下：将培养第5天的各个培养体系中的细胞，用PBS重悬离心后，用流式抗体These human Abs included anti–CD19(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，货号：561295)、anti–CD24(Ebioscience公司，货号：25-0247-42)、anti–CD27(BD Biosciences，货号558664)和anti-IgD(BD Biosciences，货号555778)及同型对照抗体(BDBiosciences，Franklin Lakes，NJ)进行染色15分钟后，用PBS清洗后，加入4％多聚甲醛固定，用BD流式仪进行分析，通过与同型对照的比较进行圈门，从而确定CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞所占的比例。
结果如图1所示。初始B细胞经过培养基1-32培养5天后，培养体系中CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的比例分别为3.8％、6.3％、6.9％、5.8％、4.5％、5.3％、11.5％、6.9％、5.7％、6.0％、9.4％、7.8％、7.1％、5.7％、8.3％、6.0％、7.0％、7.2％、9.6％、9.8％、11.5％、9.0％、10.7％、12.2％、9.4％、11.2％、14.3％、16.8％、19.2％、19.5％、18.4％和23.5％。上述结果表明：初始B细胞经过培养基1-32培养5天，在培养基32(实施例1中的培养基)的培养体系中CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的比例最高，达到23.5％(图2)，说明该培养基可提高初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的诱导分化能力及诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的存活率，可用于制备或生产CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞。

Claims (13)

1.一种用于诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的培养基，所述培养基由基础培养基、胎牛血清、脂多糖、CD40配体、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素4、白细胞介素21和白细胞介素23组成。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基为RPMI-1640培养基。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：
所述胎牛血清在所述培养基中的体积分数为（10～20）%；
所述脂多糖在所述培养基中的浓度为（5～15）μg/ml；
所述CD40配体在所述培养基中的浓度为（0.5～1.5）μg/mL；
所述白细胞介素1β在所述培养基中的浓度为（10～30）ng/mL；
所述白细胞介素6在所述培养基中的浓度为（10～30）ng/mL；
所述白细胞介素4在所述培养基中的浓度为（10～30）ng/mL；
所述白细胞介素21在所述培养基中的浓度为（40～60）ng/mL；
所述白细胞介素23在所述培养基中的浓度为（40～60）ng/mL。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：
所述胎牛血清在所述培养基中的体积分数为10%；
所述脂多糖在所述培养基中的浓度为10μg/ml；
所述CD40配体在所述培养基中的浓度为1μg/mL；
所述白细胞介素1β在所述培养基中的浓度为20ng/mL；
所述白细胞介素6在所述培养基中的浓度为20ng/mL；
所述白细胞介素4在所述培养基中的浓度为20ng/mL；
所述白细胞介素21在所述培养基中的浓度为50ng/mL；
所述白细胞介素23在所述培养基中的浓度为50ng/mL。
5.权利要求1-4任一所述的培养基在制备CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞中的应用。
6.权利要求1-4任一所述的培养基在诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞中的应用。
7.权利要求1-4任一所述的培养基在制备诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的产品中的应用。
8.权利要求1-4任一所述的培养基在提高诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的存活率中的应用。
9.权利要求1-4任一所述的培养基在制备提高诱导分化后CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的存活率的产品中的应用。
10.一种诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的方法，包括如下步骤：在权利要求1-4任一所述的培养基中培养初始B细胞，得到CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述培养的条件如下：37℃、5% CO2条件下培养5-7天。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述初始B细胞在权利要求1-4任一所述的培养基中的浓度为（1-5）×106细胞/mL。
13.一种用于诱导初始B细胞分化为CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞的产品，其包括权利要求1-4任一所述的培养基。
CN201810413845.1A 2018-05-03 2018-05-03 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件 Active CN108588019B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810413845.1A CN108588019B (zh) 2018-05-03 2018-05-03 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810413845.1A CN108588019B (zh) 2018-05-03 2018-05-03 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108588019A CN108588019A (zh) 2018-09-28
CN108588019B true CN108588019B (zh) 2019-04-02

Family

ID=63620529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810413845.1A Active CN108588019B (zh) 2018-05-03 2018-05-03 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108588019B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020094121A1 (en) * 2018-11-08 2020-05-14 Tsinghua University Novel method for producing antibodies
CN113512528B (zh) * 2021-04-23 2022-04-22 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） miR-29a-3p inhibitor体外诱导人体mBreg细胞的用途及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102918395A (zh) * 2010-05-28 2013-02-06 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单个b细胞培养方法
CN106148279A (zh) * 2016-07-28 2016-11-23 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种长时间培养b细胞的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102918395A (zh) * 2010-05-28 2013-02-06 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单个b细胞培养方法
CN106148279A (zh) * 2016-07-28 2016-11-23 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种长时间培养b细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Decrease in Proportion of CD19+CD24hiCD27+ B Cells and Impairment of Their Suppressive Function in Graves’Disease;Bingbing Zha等;《PLOS ONE》;20121130;第7卷(第11期);第1-10页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108588019A (zh) 2018-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Holyoake et al. Functional differences between transplantable human hematopoietic stem cells from fetal liver, cord blood, and adult marrow
KR101680164B1 (ko) 단구 증식제, 단구 증식용 배지, 단구의 제조방법, 수지상 세포의 제조방법, 및 수지상 세포 백신의 제조방법
Jing et al. Aging is associated with a numerical and functional decline in plasmacytoid dendritic cells, whereas myeloid dendritic cells are relatively unaltered in human peripheral blood
Chaperot et al. Identification of a leukemic counterpart of the plasmacytoid dendritic cells
Pellegatta et al. The natural killer cell response and tumor debulking are associated with prolonged survival in recurrent glioblastoma patients receiving dendritic cells loaded with autologous tumor lysates
CN108588019B (zh) 一种体外诱导初始b细胞分化为调节性b细胞的方法及其培养条件
CN105087487A (zh) 一种高效扩增cik的方法
Lee et al. Clonal analysis of human dendritic cell progenitor using a stromal cell culture
TW201435087A (zh) 含免疫細胞之組成物的製造方法及癌症治療用組成物
US10113148B2 (en) Method for obtaining monocytes or NK cells
CN102988415B (zh) 人异基因有核细胞工业化制备自然杀伤性细胞(nk)及注射液
CN109486763A (zh) 外周血来源的树突状细胞培养方法
Abediankenari et al. Vaccination of diffuse large B-cell lymphoma patients with antigen-primed dendritic cells
Periasamy et al. Stroma-dependent development of two dendritic-like cell types with distinct antigen presenting capability
Nguyen-Pham et al. Optimal culture conditions for the generation of natural killer cell-induced dendritic cells for cancer immunotherapy
CN104109653B (zh) 利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血dnt细胞的方法
Dams-Kozlowska et al. Designer cytokine hyper interleukin 11 (H11) is a megakaryopoietic factor
Rochet et al. CAL72: a human osteosarcoma cell line with unique effects on hematopoietic cells
Wang et al. Changes of peripheral lymphocyte subsets and cytokine environment during aging and deteriorating gastrointestinal tract health status
Ma et al. The immunostimulatory effects of retinoblastoma cell supernatant on dendritic cells
Furukawa et al. Interleukin‐1 producing ability of leukaemia cells and its relationship to morphological diagnosis
Ward et al. CD34+-derived CD11c+++ BDCA-1++ CD123++ DC: expansion of a phenotypically undescribed myeloid DC1 population for use in adoptive immunotherapy
CN109666638A (zh) 将外周血单个核细胞诱导为cik的试剂及其所用组合物
CN108042523A (zh) 甜菜碱（Betaine）在作为预防和治疗多发性硬化症的药物中的应用
KR20220063446A (ko) 말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 분화과정 중 분화 또는 증식을 증진시키는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant