KR20130030758A - 단일 ｂ-세포 배양법 - Google Patents

단일 ｂ-세포 배양법 Download PDF

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Abstract

본원에서는 하기 단계들: a) B-세포를 라벨링함, b) 라벨링된 B-세포를 단일 세포로서 침전시킴, c) 단일 세포로 침전된 B-세포를 공급자 세포와 공동-배양함, d) 단계 c) 에서 IgG 를 증식하고 분비하는 B-세포를 선택하고, 이로써 B-세포를 수득함을 포함하는 B-세포의 수득 방법이 보고된다. 라벨링은 IgG+CD19+-B-세포, IgG+CD38+-B-세포, IgG+CD268+-B-세포, IgG-CD138+-B-세포, CD27+CD138+-B-세포 또는 CD3-CD27+-B-세포의 것일 수 있다. 본 방법은 침전 단계 이전에 EL-4 B5 배지에서 37 ℃ 에서 1 시간 동안 상기 B-세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 또한 공동-배양 전에 상기 단일 세포 침전된 B-세포를 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다. 공동-배양에서, 인터류킨-1베타, 및 종양 괴사 인자 알파 및 스타필로코커스 아우레우스 균주 코완 세포 또는 BAFF 또는 인터류킨-2 및/또는 인터류킨-10 및/또는 인터류킨-6 및/또는 인터류킨-4 를 포함하는 공급자 혼합물이 사용될 수 있다.

Description

단일 Ｂ-세포 배양법 {SINGLE B-CELL CULTIVATION METHOD}
본원에서는 단일 세포 침전과, 공급자 혼합물 (feeder mix) 의 존재 하 공급자 세포 (feeder cell) 와의 공동-배양으로 인한, 실험 동물로부터의 B-세포 모집단으로부터 수득되어진 단일 B-세포에서 분비된 모노클로날 항체의 적어도 가변 도메인의 아미노산 서열을 수득하는 방법이 보고된다.
모노클로날 항체를 분비하는 세포를 수득하기 위한 Koehler 와 Milstein 가 개발한 하이브리도마 기법이 광범위하게 사용된다. 그러나, 이 하이브리도마 기법에서는 오로지 면역화된 실험 동물에서 수득한 B-세포의 분획만이 융합 및 증식될 수 있다. B-세포의 공급원은 비장과 같은 면역화 실험 동물의 기관이 일반적이다.
Zubler 등은 1984 년에 모노클로날 항체를 분비하는 세포 수득에 대한 상이한 접근법을 개발하기 시작했다 (예, 문헌 [Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183)] 참조). 이 문헌에서 B-세포를 면역화 실험 동물의 혈액에서 수득하여 쥣과 동물 EL-4 B5 공급자 세포와 함께 사이토카인 포함 공급자 혼합물의 존재 하에서 공동 배양했다. 이 방법으로, 50 ng/ml 이하의 항체를 10 ~ 12 일의 공동 배양 후에 수득할 수 있다.
Weitkamp, J-H., 등 (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237) 은, 형광 바이러스형 입자로 선택된 단일 항원-특이적 B-세포로부터, 로타바이러스에 대한 재조합 인간 모노클로날 항체의 제조를 보고한다. 복수의 관련 항원에 대한 복수의 단리된 항체의 제조 방법은 US 2006/0051348 에 보고되어 있다. WO 2008/144763 및 WO 2008/045140 에는, IL-6 에 대한 항체 및 이의 용도 및 항원-특이적 B 세포의 클로날 모집단의 수득을 위한 배양 방법이 각각 보고되어 있다. 항원-특이적 B-세포의 클로날 모집단의 수득을 위한 배양 방법은 US　2007/0269868 에 보고되어 있다. Masri 등 (Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106) 은, 탄저균 독소에 대항하는 단일의 인간 림프구로부터 수득된 작용성 Fab 단편의 E.coli 에서의 클로닝 및 발현을 보고하였다. 면역글로불린 라이브러리의 제조 방법은 WO 2007/ 031550 에 보고되어 있다.
본 발명의 개요
본원에서는, 특수 특성을 갖는 B-세포 모집단에서의 B-세포의 단리 방법을 보고한다. 먼저, 실험 동물의 제 1 면역화 후 4 주 이내에 이미 유도된 항체를 생성하는 세포를 단리할 수 있으므로, 항체의 결합 특이성을 판정할 수 있다. 둘째로, 다음 단계 중 어느 하나로써, 항체 생성 세포의 개수 및/또는 품질 (예, 항체 생산성/분비 능력) 을 증진시킬 수 있다: i) 사전-인큐베이션 단계, 및/또는 ii) 원심분리 단계, 및/또는 iii) 패닝 (panning) 단계. 셋째로, B-세포의 공동 배양에 사용된 공급자 혼합물 및 공급자 세포를, IL-21, 또는 IL-6, 또는 SAC, 또는 BAFF 의 첨가에 의해 개선할 수 있다.
즉, 본원에서는 한 양태로서 하기 단계를 포함하는 B-세포의 선택 방법을 보고한다:
a) 임의로는, B-세포의 모집단의 B-세포를 라벨링함,
b) 단일 세포로서 침전되어진 B-세포의 모집단의 각 B-세포를 공급자 세포와 개별적으로 공동 배양함,
c) 단계 b) 에서 항체를 증식 및 분비하는 B-세포 클론을 선택함.
본원에서는 추가로 한 양태로서 하기 단계를 포함하는 B-세포 클론을 수득하는 방법을 보고한다:
a) 실험 동물로부터 B-세포를 수득함,
b) B-세포를 라벨링함,
c) 라벨링된 B-세포를 단일 세포로서 침전시킴,
d) 단일 세포로 침전된 B-세포를 공급자 세포와 개별적으로 공동 배양함,
e) 단계 d) 에서 항체를 증식하고 분비하는 B-세포 클론을 선택하고, 이로써 B-세포 클론을 수득함.
본원에서, 또 다른 양태로서, 하기 단계를 포함하는 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 보고한다:
a) 임의로는, 하나 이상의 형광 염료로 B-세포의 모집단의 세포들을 라벨링함,
b) 개별 용기 내 단일 세포로서 침전된 바 있는 B-세포의 모집단의 각 B-세포를 공급자 세포 및 공급자 혼합물의 존재 하에서 배양하여, 각 B-세포 클론 및 배양 상청액을 수득함,
c) 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 B-세포 클론을 선택함,
d) 단계 c) 에서 선택된 B-세포 클론에 의해 제조되어진, 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 인코딩 (encoding) 하는 핵산을 함유하는 세포, 또는 이의 인간화 변이체를 배양하고, 이 항체를 세포 또는 배양 상청액으로부터 회수해 항체를 제조함.
한 구현예에서, 방법은 하기 단계를 하나 이상 포함한다:
단계 c) 이후: c1) 역전사 효소 PCR 에 의한, 항체의 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 측정함,
단계 c1) 이후: c2) 항체 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산으로 세포를 트랜스펙션함.
본원에서는, 한 양태로서, 하기 단계를 포함하는 항체의 제조 방법을 보고한다:
a) (실험 동물의 혈액에서 수득한) (성숙한) B-세포의 모집단을 제공함,
b) B-세포의 모집단의 세포를 하나 이상의 형광 염료 (한 구현예에서는 1 내지 3 개, 또는 2 내지 3 개의 형광 염료) 로 라벨링함,
c) 각 용기 내에 라벨링된 B-세포 모집단의 단일 세포를 침전시킴 (한 구현예에서는, 상기 용기는 멀티 웰 플레이트의 웰임),
d) 공급자 세포 및 공급자 혼합물의 존재 하에서 침전된 각 B-세포를 배양함 (한 구현예에서는, 공급자 세포는 EL-4 B5 세포이고, 한 구현예에서, 공급자 혼합물은 천연 TSN 이고, 한 구현예에서 공급자 혼합물은 합성 공급자 혼합물임),
e) 각 B-세포의 배양 배지에서 분비된 항체의 결합 특이성을 측정함,
f) 역전사효소 PCR 에 의해 특이적으로 결합하는 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 측정하고, 이로써 핵산을 인코딩하는 모노클로날 항체 가변 경쇄 및 중쇄 도메인을 수득함,
g) 항체 발현을 위한 발현 카세트에서 모노클로날 항체 가변 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 도입함,
h) 핵산을 세포에 도입함,
i) 세포를 배양하고 이 세포에서 또는 세포 배양액에서 항체를 회수하고, 이로써 항체를 제조함.
본원에서 보고된 모든 양태의 한 구현예에서, 방법은 단일 세포로의 침전 이전에 공동-배양 배지 내 B-세포의 모집단을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 인큐베이션은 약 37 ℃ 에서 실시된다. 한 구현예에서, 인큐베이션은 0.5 내지 2 시간 동안 실시된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 약 1 시간 동안 실시된다. 한 구현예에서, 인큐베이션은 약 37　℃ 에서 약 1 시간 동안 실시된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 방법은 공동-배양 전 이전에 단일 세포로 침전된 B-세포를 원심분리하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 원심분리는 약 1 분 내지 약 30 분 동안 실시된다. 특정 구현예에서, 원심분리는 약 5 분 동안 실시된다. 한 구현예에서, 원심분리는 약 100 x g 내지 약 1,000 x g 에서 실시된다. 특정 구현예에서, 원심분리는 약 300 x g 에서 실시된다. 한 구현예에서, 원심분리는 약 5 분 동안 약 300 x g 에서 실시된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 방법은 라벨링 단계 바로 직전에 하기 단계를 포함한다: B-세포를 고정화 항체로 패닝함.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포의 모집단은 밀도 구배 원심분리에 의해 동물의 혈액에서 수득된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포의 모집단은 면역화 후 4 일 후에 실험 동물의 혈액에서 수득된다. 또 다른 구현예에서, B-세포의 모집단은 면역화 후 4 일 내지 적어도 9 일 후 실험 동물의 혈액에서 수득된다. 추가 구현예에서, B-세포의 모집단은 면역화 후 4 일 내지 9 일의 실험 동물의 혈액에서 수득된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포의 모집단은 밀도 구배 원심분리에 의해 단리된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포는 성숙한 B-세포이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 라벨링은 1 내지 3 개의 형광 염료로 실시된다. 특정 구현예에서, 라벨링은 2 또는 3 개의 형광 염료로 실시된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포의 라벨링은, 전체 B-세포 모집단의 세포들의 0.1 % 내지 2.5 % 에서의 라벨링이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포는 마우스 B-세포, 또는 햄스터 B-세포, 또는 토끼 B-세포이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 단일 세포 침전은 멀티 웰 플레이트의 웰에서 실시된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 공급자 세포는 쥣과 동물 EL-4 B5 세포이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 라벨링은 IgG+CD19+-B-세포, IgG+CD38+-B-세포, IgG+CD268+-B-세포, IgG-CD138+-B-세포, CD27+CD138+-B-세포, 또는 CD3-CD27+-B-세포의 것이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포는 마우스 기원이고, 라벨링은 IgG+CD19+-B-세포, 및/또는 IgG-CD138+-B-세포의 것이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포는 햄스터 기원이고, 라벨링은 IgG+IgM--B-세포의 것이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포는 토끼 기원이고, 라벨링은 IgG+-B-세포 및/또는 CD138+-B-세포, 또는 CD138+IgG+-B-세포 및/또는 IgG+IgM--B-세포의 것이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 공동 배양은, 10 % (v/v) FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 1 % (w/v) 의 200 mM 글루타민 용액, 2 % (v/v) 의 100 mM 나트륨 피루베이트 용액 및 1　% (v/v) 의 1 M 2-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진)-에탄 술폰산 (HEPES) 버퍼로 보충된 RPMI 1640 에서 실시된다. 또 다른 구현예에서, 공동-배양 배지는 추가로 0.05 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함한다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, B-세포의 공동-배양은 공급자 세포 및 공급자 혼합물과 함께 실시된다. 한 구현예에서, 공급자 혼합물은 천연 흉선세포 배양 상청액 (TSN) 또는 합성 공급자 혼합물이다.
한 특정 구현예에서, 공급자 혼합물은 합성 공급자 혼합물이다. 한 구현예에서, 합성 공급자 혼합물은 인터류킨-1 베타 및 종양 괴사 인자 알파를 포함한다. 한 구현예에서, 합성 공급자 혼합물은 인터류킨-2 (IL-2) 및/또는 인터류킨-10 (IL-10) 을 포함한다. 한 구현예에서, 합성 공급자 혼합물은 스타필로코커스 아우레우스 균주 코완 세포 (Staphylococcus aureus strain Cowans cells; SAC)를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 합성 공급자 혼합물은 인터류킨-21 (IL-21) 을 포함한다. 한 구현예에서, 합성 공급자 혼합물은 종양 괴사 인자 패밀리 (BAFF) 의 B-세포 활성화 인자를 포함한다. 한 구현예에서, 합성 공급자 혼합물은 인터류킨-6 (IL-6) 을 포함한다. 한 구현예에서, 합성 공급자 혼합물은 인터류킨-4 (IL-4) 을 포함한다.
한 구현예에서, 공동-배양은 공급자 혼합물로서 흉선세포 배양 상청액의 존재 하에서 실시된다. 특정 구현예에서, 흉선세포 배양 상청액은 어린 동물의 가슴샘의 흉선세포로부터 수득된다.
한 구현예에서, B-세포 클론의 수득 방법은 추가로 하기 단계를 포함한다:
f) 역전사 PCR 및 뉴클레오티드 시퀀싱으로써, 단계 e) 의 선택된 B-세포 클론으로부터 생성된 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 측정하고, 이로써 모노클로날 항체 아미노산 가변 도메인 서열을 수득함.
한 구현예에서, 실험 동물은 마우스, 햄스터, 및 토끼에서 선택된다.
본 발명의 상세한 설명
본원에서 보고된 방법은 각 B-세포 클론으로부터 수득된 모노클로날 항체들의 결합 특이성의 신속한 특징 분석 (characterization) 을 가능하게 하고, 즉 실험 동물의 제 1 면역화 후 4 주 이내에 유도된 항체를 생성하는 세포를 단리할 수 있어 이로부터 생성된 항체들의 결합 특이성을 측정할 수 있고, 이때 B-세포 공동-배양 상청액 중 항체 함량/농도로 인해 4 가지 이상의 상이한 실험들을 수행할 수 있다.
면역화:
마우스, 토끼, 햄스터 및 래트 등과 같은 비(非)인간 동물이 흔히 항체-기반 치료법을 평가하기 위한 동물 모델로서 사용된다. 따라서, 비인간 동물 항원뿐 아니라 인간 항원에 결합하는 교차반응성 항체의 제공이 자주 요구된다. 본원에서 보고된 바와 같은 방법이 교차반응성 항체를 제공하는데 사용될 수 있다. 본원에서 보고된 바와 같은 방법에서는, 예를 들어 마우스, 햄스터 및 토끼로부터 수득된 B-세포가 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 마우스는 NMRI-마우스 또는 balb/c-마우스이다. 또 다른 구현예에서, 햄스터는 아르메니아 햄스터 (크리세툴루스 미그라토리우스; Cricetulus migratorius), 중국 햄스터 (크리세툴루스 그리세우스; Cricetulus griseus), 및 시리아 햄스터 (메소크리세툴루스 아우라투스; Mesocricetulus auratus) 에서 선택된다. 특정 구현예에서, 햄스터는 아르메니아 햄스터이다. 한 구현에에서, 토끼는 New Zealand White (NZW) 토끼, Zimmermann-토끼 (ZIKA), Alicia-돌연변이형 균주 토끼, 바실레아 (basilea) 돌연변이형 균주 토끼, 인간 면역글로불린 유전자자리를 갖는 트랜스제닉 토끼, rbIgM knock-out 토끼, 및 이의 이종교배 토끼로부터 선택된다.
한 구현예에서, 면역화를 위해 선택된 실험 동물, 예를 들어 마우스, 햄스터 및 토끼는 12 주령 이하이다.
B-세포의 공급원 및 단리:
실험 동물의 혈액은 매우 다양한 항체 생성 B-세포를 제공한다. 이로부터 수득된 B-세포는 CDR 내에 아미노산 서열이 동일 또는 중복되는 것이 거의 없는 항체를 분비하므로, 고 다양성을 보인다.
한 구현예에서, 실험 동물의 B-세포, 예를 들어 혈액으로부터의 B-세포는, 면역화 후 4 일에서 면역화 또는 최신 부스트 (boost) 이후 적어도 9 일까지에서 수득된다. 상기 시간 기간은 본원에서 보고된 바와 같은 방법에서 높은 유연성을 허용한다. 이 시간 기간에, 가장 밀접한 인척 항체를 제공하는 B-세포가 비장에서 혈액으로 이동할 확률이 크다 (예를 들어, 문헌 [Paus, D., et al., JEM 203 (2006) 1081-1091; Smith, K.G.S., et al., The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006; Wrammert, J., et al., Nature 453 (2008) 667-672] 참조).
실험 동물의 혈액으로부터의 B-세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 밀도 구배 원심분리 (Density Gradient Centrifugation; DGC) 또는 적혈구 용해 (용해) 를 사용할 수 있다. 저장성 (hypotonic) 용해와 비교시 밀도 구배 원심분리가 전반적으로 더 높은 수율을 제공하고, 다시 말해 더 많은 B-세포 클론을 제공한다. 부가적으로 밀도 구배 원심분리에 의해 수득된 세포로부터, 다수의 세포가 공동 배양 단계에서 분열 및 성장한다. 또한 분비된 항체의 농도는 상이한 방법으로 수득된 세포와 비교시 더 높다. 따라서, 한 구현예에서, B-세포의 모집단의 제공은 밀도 구배 원심분리를 통한다.
표 1: 세포를 밀도 구배 원심분리 (DGC) 또는 적혈구의 저장성 용해를 통해 수득시 IgG 생성 웰/세포 클론의 개수
Figure pct00001

공동-배양 이전 선택 단계:
항원을 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 B-세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 에서 풍부할 수 있다. 그리하여, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, B-세포 모집단은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 에서 강화된다 (enrichment).
용어 "특이적으로 결합" 및 이의 문법적 동의어는 항체가 이의 타겟에 10-7 M 이하, 한 구현예에서는 10-8 M 내지 10-13 M, 추가 구현예에서는 10-9 M 내지 10-13 M 의 해리 상수 (Kd) 로 결합하는 것을 의미한다. 이 용어는 항체가 존재하는 다른 생체 분자와 특이적으로 결합하지 않는다는 것을, 즉 이것이 다른 생체 분자와는 10-6 M 이상, 한 구현예에서는 10-6 M 내지 1 M 의 해리 상수 (Kd) 로 결합한다는 것을 추가로 지시하는데 사용된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, PBMC 는 대식세포가 결핍 (depletion) 되어 있다. 이는 하기에서 개괄한 바와 같이, 예를 들면 토끼 기원의 B-세포에 대한 한 구현예에서와 같이, 공동-배양 단계에 있어서 유리하다.
대식세포는 세포 배양 플레이트의 표면 부착에 의해 PBMC 에서 결핍될 수 있다 (사전인큐베이션 단계 참조).
본원에서 보고된 바와 같은 방법의 한 구현예에서, 세포는 단백질-면역화 동물 유래의 것이고, 라벨링 이전에 대식세포가 결핍된 것이다.
단일 세포 침전 이전에 공동-배양 배지에서 B-세포의 모집단을 인큐베이션하는 것은, 실험 동물의 혈액 유래 B-세포 모집단의 단리 및 선택적인 강화 직후에 단일 세포로서 침전하는 것과 비교할 때, 단일 세포 침전 후에 수득된 항체 분비 세포의 총 개수를 증가시킨다는 점을 발견한 바 있다 (예, 토끼, 표 2a 및 2b 참조). 특히, 인큐베이션은 약 37 ℃ 에서 약 1 시간 동안, EL-4 B5 배지에서, 예를 들면 세포 배양 인큐베이터를 이용하여 실시된다.
표 2a: 모든 세포의 단일 세포 침전 이전에 EL-4 B5 배지에서 한 시간 인큐베이션 존재 및 부재 하에서 IgG 양성 웰/세포 클론 (rb= 토끼).
Figure pct00002
표 2b: B-세포의 단일 세포 침전 이전에 EL-4 B5 배지에서 1 시간 인큐베이션 존재 및 부재하 IgG 양성 웰/세포 클론.
Figure pct00003
본원에서 보고된 바와 같은 방법의 한 구현예에서, 세포는 단백질-면역화된 동물에서 수득되고 대식세포가 결핍되어 있다.
항원 결합 항체를 생성하지 않는 세포, 또는 마찬가지로 항원 결합 항체를 생성하는 세포는 각각 패닝 접근법을 이용함으로써 감소될 수 있거나 또는 강화될 수 있다. 여기서, 결합 파트너가 표면에 부착되어 제공되어, 거기에 결합하는 세포는 세포 모집단에서 선택적으로 강화되거나 (이 경우는 결합하는 세포가 추가로 프로세싱됨), 또는 세포 모집단에서 감소된다 (이 경우는 용액 중에 잔류하는 세포가 추가로 프로세싱됨).
표 3: 각 항원으로의 패닝에 의한 항원-특이적 항체를 분비하는 B-세포의 강화
Figure pct00004
본원에서 보고된 바와 같은 방법은 한 구현예에서 단일 세포 침전 이전에 특이적 및/또는 비(非)교차반응성 항체를 생성하는 B-세포를 세포 표면 마커 및 형광 활성화된 세포 분류/게이팅 (gating) 을 기반으로 선별하는 선택 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 성숙한 B-세포는 분류/강화/선택된다. 상이한 실험 동물 종으로부터의 B-세포의 선택을 위해, 상이한 세포 표면 마커가 사용될 수 있다. 이용가능한 세포 표면 마커 대부분은 각각 또는 조합되어서도 적절한 라벨링을 제공하지 않는다는 점이 발견된 바 있다.
비(非)타겟 세포 모집단 및 비특이적 결합 림프구의 라벨링으로, 이들 세포를 선택적으로 결핍시킬 수 있다. 이 결핍 단계에서는, 거의 전체적인 결핍이 달성될 수 있을 지경이다. 비록 이 결핍은 정량적이지 않지만, 간섭 세포의 개수를 감소할 수 있거나 심지어는 최소화할 수 있기 때문에, 잔류 세포의 후속 형광 라벨링에 있어서 이점을 제공한다. 하기에 개괄한 라벨링을 이용한 형광 활성화된 세포 분류에 의한 성숙한 B-세포 (메모리 B-세포. 친화도 성숙 형질모세포 및 형질세포) 의 단일 세포 침전에 의해, 더 많은 수의 IgG+-웰/세포 클론을 공동 배양 단계에서 수득할 수 있다.
용어 "라벨링"은 특이적으로 결합하고 라벨링된 항-표면 마커 항체의 첨가에 의해 판정될 수 있는 표면 마커의 존재 또는 부재를 지칭한다. 즉, 표면 마커의 존재는 예를 들면 형광 라벨의 경우 형광 발생에 의해 판정되고, 표면 마커의 부재는 각각의 특이적 결합 및 라벨링된 항-표면 마커 항체로의 인큐베이션 후 형광의 부재에 의해 판정된다.
상이한 세포 모집단은 CD3+-세포 (T-세포), CD19+-세포 (B-세포), IgM+-세포 (성숙한 미노출 (naive) B-세포), IgG+-세포 (성숙한 B-세포), CD38+-세포 (예, 형질모세포), 및 IgG+CD38+-세포 (예비-형질 세포) 등의 상이한 표면 마커를 이용함으로써 라벨링될 수 있다.
본원에 보고된 바와 같이, 성숙한 IgG+-B-세포, 예컨대 메모리 B-세포, 형질모세포, 및 형질 세포의 선택을 위한 면역-형광 라벨링이 개발된 바 있다. B-세포의 선택 또는 강화를 위해서는, 세포는 단일 라벨링 또는 이중 라벨링 또는 삼중 라벨링된다. 또한 전체 세포 모집단 중 약 0.1　% 내지 2.5　% 의 라벨링된 세포를 도모하는 라벨링이 요구된다. 한 구현예에서, B-세포는 모집단 내 0.1　% 내지 2.5　% 의 B-세포 상에 존재하는 표면 분자, 또 다른 구현예에서는 0.3　% 내지 1.5　% 의 모집단의 B-세포 상에, 추가 구현예에서는 0.5　% 내지 1　% 의 모집단의 B-세포 상에 존재하는 표면 분자의 라벨링에 의해 선택된 단일 세포로서 침전된다.
PBMC 모집단 내 IgG+-B-세포 0.5 % - 1 % 가 IgG+CD19+-세포, IgG+CD38+-세포, 및 IgG+CD268+-세포로서 이중 라벨링될 수 있다. 따라서, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서는, IgG+CD19+-B-세포, IgG+CD38+-B-세포, 또는 IgG+CD268+-B-세포가 단일 세포로서 침전된다.
PBMC 모집단 내 IgG--B-세포 중, 0.5 % - 1 % 가 IgG-CD138+-세포로서 이중 라벨링될 수 있다. 따라서, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법들의 한 구현예에서 IgG-CD138+-B-세포가 단일 세포로서 침전된다.
CD27+CD138+-세포 또는 CD3-CD27+-세포의 라벨링은 각각, 라벨링되는 세포 모집단의 세포 중 약 1.5% 이다. 따라서, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, CD27+CD138+-B-세포 또는 CD3-CD27+-B-세포는 단일 세포로서 침전된다.
PBMC 모집단 내 IgG+-햄스터-B-세포 중에서,0.6　% ± 0.1　% 가 IgG+IgM--햄스터-B-세포로서 이중 라벨링될 수 있다. 따라서, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, IgG+IgM--햄스터-B-세포는 단일 세포로서 침전된다.
한 구현예에서, IgG-CD138+-B-세포는 면역화 동물로부터 수득된 B-세포로부터 단일 세포로서 침전된다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, IgG+CD19+-B-세포는 비면역화 동물로부터 수득된 B-세포로부터 단일 세포로서 침전된다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 또 다른 구현예에서, IgG+IgM--B-세포는 비면역화 또는 면역화 동물로부터 수득된 B-세포로부터 단일 세포로서 침전된다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, IgG+CD19+-쥣과 동물-B-세포가 단일 세포로서 침전된다. 상기 선택 단계는 후속의 공동배양 단계에서 개선된 또는 심지어는 가장 높은 수율의 IgG+-웰을 도모한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 또 다른 구현예에서, IgG-CD138+-쥣과 동물-B-세포는 단일 세포로서 침전된다. 이와함께, 우선 다량의 B-세포 클론을 생성하고, 둘째로는 가장 높은 농도의 IgG 를 야기하는 세포를 선택한다 (표 5 참조). 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 또 다른 구현예에서, IgG+CD19+-쥣과 동물-B-세포 및 IgG-CD138+-쥣과 동물-B-세포는 단일 세포로서 침전된다. 한 특정 구현예에서, 방법은 세포가 토끼 기원인 경우, 라벨링이 IgG+-B-세포 및/또는 CD138+-B-세포의 것이 아닌 조건을 갖는다.
IgG+-쥣과 동물-B-세포는 항-마우스-IgG-항체 227 (Ab 227)로 라벨링될 수 있고, IgG+-햄스터-B-세포는 항-햄스터-IgG-항체 213 (AB 213) 및/또는 항-햄스터-IgG-항체 225 (AB 225) 로 라벨링될 수 있고, 토끼 B-세포는 항-IgG-항체 184 로 라벨링될 수 있다 (표 4 참조).
표 4: B 세포의 면역형광 라벨링 - 이 표는 쥣과 동물 B-세포 (A-E), 햄스터 B-세포 (F-H) 및 토끼 B-세포 (I-J) 의 모집단의 평균 라벨링된 분획을 제시한다.
Figure pct00005
AB 120 - 염소 항-토끼 IgG-항체 Southern Biotech 4030-09
AB 184 - 염소 항-토끼 IgG Fc-항체 AbDSerotech STAR121F
AB 185 - 염소 항-마우스 IgG-항체 Caltag M35004-3
AB 200 - 염소 항-마우스 IgM-항체 Invitrogen M31504
AB 212 - 염소 항-햄스터 IgG-항체 AbDSerotech STAR79F
AB 213 - 마우스 항-햄스터 IgG-항체 Becton Dickinson 554010
AB 215 - 염소 항-마우스 IgG-항체 Sigma B 0529
AB 217 - 염소 항-마우스 IgG-항체 AbDSerotech STAR120F
AB 218 - 래트 항-마우스 CD19-항체 Abcam ab22480
AB 219 - 염소 항-마우스 IgM-항체 Rockland 710-1607
AB 222 - 염소 항-마우스 IgG-항체 Abcam ab7064
AB 223 - 마우스 항-햄스터 IgM-항체 Becton Dickinson 554035
AB 224 - 마우스 항-햄스터 IgM-항체 Becton Dickinson 554033
AB 225 - 마우스 항-햄스터 IgG-항체 Becton Dickinson 554056
AB 227 - 염소 항-마우스 IgG-항체 Sigma F 8264
PE: 피코에리트린
APC: 알로피코시아닌
FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트
낮은 또는 존재하지 않는 특이성으로 인해, 반드시 시판중인 항체가 라벨링에 사용될 수 있는 것은 아니라는 점에 주목해야만 한다.
쥣과 동물-B-세포는 항-IgG-항체 227 로 라벨링될 수 있고, 햄스터-B-세포는 항-IgG-항체 213 로 라벨링될 수 있다.
IgG+CD19+-쥣과 동물-B-세포는 항체 227 및 항체 218 로 라벨링될 수 있고, IgG+IgM--쥣과 동물-B-세포는 항체 227 및 항체 219 로 라벨링될 수 있고, IgG+IgM--햄스터-B-세포는 항체 213 및 항체 224 로 라벨링될 수 있고, IgG+-토끼-B-세포는 항체 184 로 라벨링될 수 있고, IgG+IgM--토끼-B-세포는 항체 184 및 항체 254 및 SA 263 로 라벨링될 수 있고, IgG+CD138+-토끼-B-세포는 항체 259 및 항체 256 로 라벨링될 수 있다.
쥣과 동물 B-세포는 항-CD27 항체 235 또는 236 (AB 235, AB 236), 항-CD38 항체 192 (AB 192), 항-CD138 항체 233 (AB 233) 및 항-CD268 항체 246 (AB 246) 로 라벨링될 수 있다.
표 5: 성숙한 마우스- (A-J), 햄스터- (K) 및 토끼 (L-N)-B-세포의 측정을 위한 면역 형광 라벨링
Figure pct00006
AB 184 - 염소 항-토끼 IgG-항체 AbD Serotec STAR121F
AB 189 - 햄스터 항-마우스 CD3-항체 Becton Dickinson 553062
AB 192 - 래트 항-마우스 CD38-항체 Becton Dickinson 553764
AB 213 - 마우스 항-햄스터 IgG-항체 Becton Dickinson 554010
AB 218 - 래트 항-마우스 CD19-항체 Abcam ab22480
AB 224 - 마우스 항-햄스터 IgM-항체 Becton Dickinson 554033
AB 227 - 염소 항-마우스 IgG-항체 Sigma F 8264
AB 233 - 래트 항-마우스 CD138-항체 Becton Dickinson 553714
AB 235 - 햄스터 항-마우스 CD27-항체 Becton Dickinson 558754
AB 236 - 햄스터 항-마우스 CD27-항체 Becton Dickinson 558753
AB 241 - 햄스터 항-마우스 CD3-항체 Becton Dickinson 553060
AB 246 - 래트 항-마우스 BAFF-R-항체 eBioscience 51-5943
AB 254 - 마우스 항-토끼 IgM-항체 Becton Dickinson 맞춤 제작
AB 256 - 염소 항-래트 IgG-항체 Southern Biotech 3030-09
AB 259 - 래트 항-토끼 CD138-항체 Roche Glycart AG
SA 263 - 스트렙타비딘 Invitrogen S866
A647: Alexa Fluor?647
FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트
한 구현예에서, 방법은 B-세포 모집단의 대식 세포를 결핍하고, 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 B-세포 모집단의 B-세포를 강화하는 단계를 포함한다.
단일 세포 침전:
본원에서 보고된 바와 같은 방법은 단일 세포로서 B-세포 모집단의 B-세포 침전 단계를 포함한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 단일 세포로서의 침전은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 를 통한다. FACS 단일 세포 침전에 요구되는 라벨링은 이전 섹션에 보고된 바와 같이 실행 할 수 있다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 특이적 라벨링된 B-세포가 단일 세포로서 침전된다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 추가 구현예에서, 라벨링은 형광 라벨링된 항체를 갖는 세포 표면 마커의 라벨링이다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같은 방법은 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 성숙한 B-세포는 단일 세포로서 침전된다.
단일 세포 침전 후 및 공동 배양 이전 추가의 원심분리 단계가 증가된 개수의 항체 분비 세포를 제공하고, 분비된 IgG 의 양을 증가시킨다 (인간 면역글로불린 유전자자리를 갖는 예의 실험 동물, 표 6 참조).
표 6: 단일 세포 침전 이후 원심분리 단계 존재 및 부재 하 IgG 양성 웰/세포 클론.
Figure pct00007
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 방법은 공동-배양 이전에 단일의 침전된 세포를 원심분리하는 단계를 포함한다. 한 특정 구현예에서, 원심분리는 5 분 동안 300 x g 에서 실시된다.
공동-배양:
공급자 세포를 이용한 공동-배양 단계는 다수의 추가 단계들 이전 및 이후일 수 있다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 단일의 침전된 B-세포는 공급자 세포와 공급자 혼합물의 존재 하에서 공동-배양된다. 특정 구현예에서, B-세포는 쥣과 동물 EL-4 B5 공급자 세포와 공동 배양된다. 상기에서 개괄한 바와 같은 적절한 면역 형광 라벨링에 의해 공동 배양 단계에서의 수율 증가 (IgG+-웰/세포 클론의 개수 및 IgG-농도) 및 나아가 PBMC 로부터의 성숙한 IgG+-B-세포의 강화 또는 단리가 달성될 수 있다.
갓 단리된 PBMC 로부터 IgG+CD19+- 및/또는 IgG+CD38+-B-세포의 단일 세포 침전으로, 가장 많은 수의 IgG+-웰/세포 클론이 수득될 수 있다. IgG+CD19+-, IgG+CD38+- 및/또는 IgG-CD138+-B-세포의, 대식세포 또는 KLH-특이적 세포 (키홀 림펫 헤모시아닌) 의 결핍 후의 단일 세포 침전으로, 양호한 결과가 수득될 수 있다. 항원-특이적 B-세포의 결핍 후 IgG+CD19+-, IgG+CD38+- 및/또는 IgG-CD138+-B-세포의 단일 세포 침전으로, 개선된 결과가 수득될 수 있다. 따라서, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, IgG+CD19+-, IgG+CD38+- 및/또는 IgG-CD138+-B-세포가 단일의 세포로서 침전된다.
상기 개괄된 바와 같은 라벨링을 기초로 하는 단일 세포 침전은 가장 높은 분획의 IgG+-웰/세포 클론 및 상청액 내 가장 높은 IgG-농도를 갖는 웰/세포 클론을 도모한다는 점이 밝혀져 있다. 따라서, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, IgG+CD19+- 및/또는 IgG-CD138+-쥣과 동물-B-세포가 단일의 세포로서 침전된다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, IgG+IgM--햄스터-B-세포가 단일의 세포로서 침전된다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, IgG+-, 및/또는 IgG+CD138+-, 및/또는 CD138+- 및/또는 IgG+IgM--토끼-B-세포가 단일의 세포로서 침전된다.
표 7: 면역 형광 라벨링에 따른 공동-배양 수율
Figure pct00008
쥣과 동물 B-세포에 있어서, 각 강화 및/또는 결핍 단계 이후 IgG+CD19+-세포의 단일 세포 침전으로 공동-배양 이후 가장 많은 개수의 IgG+-웰/세포 클론이 수득될 수 있다. 대안적으로, IgG-CD138+-세포의 단일 세포 침전으로, 상청액 내 최고의 IgG-농도를 갖는 웰/세포 클론이 수득될 수 있다. IgG-CD138+-세포의 단일 세포 침전은 면역화 동물로부터의 B-세포에 있어서 사용될 수 있다. IgG+CD19+-세포의 단일 세포 침전은 비면역화 동물로부터의 B-세포에 있어서 사용될 수 있다. IgG+IgM--세포의 단일 세포 침전은 면역화 및 비면역화 동물의 햄스터-B-세포에 있어서 사용될 수 있다. IgG+-, 및/또는 IgG+CD138+-, 및/또는 CD138+- 및/또는 IgG+IgM--B-세포의 단일 세포 침전은 토끼-B-세포에 있어서 사용될 수 있다.
실험 동물의 혈액으로부터 수득된 B-세포에 대해 사용된 면역 형광 라벨링은 또한 마우스, 햄스터 및 토끼 등의 실험 동물의 비장 및 기타 면역 기관으로부터 수득된 B-세포의 라벨링에 대해 사용될 수 있다. 마우스 B-세포에 있어서, 비장 유래 IgG+-B-세포의 분획은 IgG+CD19+-세포에 대한 0.4 % 와 비교시 약 0.8 % 였다. 햄스터 B-세포에 있어서, 각각의 수는 1.9 % 및 0.5 % IgG+IgM--세포이다. 토끼-혈액 유래 B-세포에 있어서, 0.2　% 의 IgG+-세포가 대식 세포의 결핍 후 발견되었다. 토끼 유래 파이어 판 (Peyer'sche plaque) 은 0.4 % 의 IgG+-세포를 보이고, 비장은 대식세포 결핍 후 0.3 % 의 IgG+-세포를 보였다.
본원에서 보고된 바와 같은 방법으로, 공동 배양 약 칠 (7) 일 후, 즉 5, 6, 7 또는 8 일 후, 특히 7 또는 8 일 후, 약 30 ng/ml 내지 15 ㎍/ml 이하의 항체 농도가 수득될 수 있다 (평균값 약 500 ng/ml). 이로써 제공된 양의 항체로, 항체를 더 자세히 특징 분석하기 위해, 예를 들면 결합 특이성에 관한 특징 분석하기 위해 다수의 상이한 분석들을 수행할 수 있다. 선별/선택 공정에서 상기 초기 단계에서의 항체의 개선된 특징 분석으로, 수행되어야 할 요구되는 핵산 단리 및 시퀀싱 반응의 수를 감소시킬 수 있다. 부가적으로, B-세포 클론은 모노클로날 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 mRNA 을 축퇴성 PCR 프라이머 (degenerated PCR primer) 사용을 허용해 제공하고, 고 특이적 프라이머의 필요성은 배제한다. 또한, 요구되는 PCR 사이클 수가 감소된다. 따라서, 한 구현예에서, 역전사 효소 PCR 은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대한 축퇴성 PCR 프라이머로 실시된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 공급자 혼합물은 흉선세포 배양 상청액이다. 특정 구현예에서, 흉선세포 배양 상청액은 각 어린 동물의 흉선의 흉선세포로부터 수득된다. 특히 성인 동물 혈액으로부터 흉선세포의 단리와 비교시 어린 동물의 흉선을 이용하는 것이 적합하다. 용어 "어린 동물"이란, 성적 성숙이 일어나기 전 동물을 지칭한다. 어린 햄스터는, 예를 들어 6 주령 미만, 특히 4 주령 미만이다. 어린 마우스는 예를 들어 8 주령 미만, 특히 5 주령 미만이다.
배양된 흉선세포의 상청액 (흉선세포 배양 상청액 - TSN) 으로부터 유래되는 공급자 혼합물의 기원으로 인해, 상당한 배치 (batch) 대 배치 편차가 발생한다. 이러한 변동성을 극복하기 위해, 합성 성분들로 이루어진 합성 공급자 혼합물이 개발된 바 있다. IL-1β (인터류킨-1　베타), TNFα (종양 괴사 인자 알파), IL-2 (인터류킨-2) 및 IL-10 (인터류킨-10)으로 이루어진 공급자 혼합물이 문헌 [Tuccci, A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784] 으로부터 공지되어 있다.
여기에는, 단일 침전된 B-세포 및 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이 보고되어 있다. 또한 각 B-세포 클론에 의해 분비된 항체의 양을 증가시키기 위한 합성 공급자 혼합물에 대한 B-세포-종-특이적 첨가제가 여기에 보고되어 있다. 부수적으로 고생성 세포는 예를 들면 과잉의 비특이적 프라이머 세트를 이용해 결과적으로 역전사 및 인코딩 핵산의 시퀀싱을 용이하게 하는 더 많은 mRNA 를 포함한다.
SAC (스타필로코커스 아우레우스 균주 코완 세포, 단일의 SAC 무리를 사용하였음) 의 첨가에 의해, 항체를 분비하는 B-세포의 개수 및 공동-배양 후 상청액 내 평균 IgG-농도가 증가될 수 있다. 공동-배양에서 SAC 의 첨가에 있어서, 감소뿐 아니라 증가된 농도의 SAC 가 항체 분비량을 감소시킬 수 있기 때문에 농도 범위는 규정될 수 있음이 발견되었다.
표 8a: SAC 를 첨가하거나 또는 첨가하지 않을 때, 공급자 혼합물로서의 TSN 및 EL-4 B5 공급자 세포와 함께 공동-배양된 야생형 토끼 (NZW) 또는 인간 IgG 유전자자리를 갖는 실험 동물로부터 수득된 B-세포의 세포 배양 상청액의 huCk ELISA (huCk = 인간 C 카파) 또는 rbIgG ELISA 결과
Figure pct00009
Figure pct00010
1:20000 내지 1:150000 의 SAC 비는, IgG+-웰/세포 클론 수를 증가시키고, 1:50000 내지 1:100000 의 비가 가장 높은 수를 나타낸다는 점을 알 수 있을 것이다. 한 구현예에서, 배양 배지에 첨가되는 SAC 의 양은, 단계 희석물을 제공하고 첨가된 SAC 가 가장 많은 수의 IgG 양성 웰/세포 클론을 제공하는 희석물을 측정함으로써 판정된다.
놀랍게도, SAC 를 공급자-혼합물에 첨가할 때, 단일 침전된 B-세포에서만이 성장에 있어서 이로운 반면, 공동-배양을 위한 PBL (예, B 세포 및 내생성 T 세포) 혼합물을 이용하는 경우에서의 B-세포의 성장은 억제되는 방식으로, B-세포의 공동-배양에서 변화가 있다는 점이 관찰되었다.
표 8b: SAC 첨가와 함께, 공급자 혼합물로서의 TSN 및 EL-4 B5 공급자 세포와 공동-배양된 단일 침전된 B-세포 및 PBL 의 세포 배양 상청액의 huCk ELISA 또는 rbIgG ELISA 의 결과
Figure pct00011
상이한 공급자 혼합물로 수득된 추가 데이타를 하기 표 9 및 10 에 제시한다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, B-세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물은 IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 및 IL-21 (인터류킨-21) 을 포함한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, B-세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물은 IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 및 SAC 을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 및 IL-21 은, 재조합 쥣과 동물 IL-1β, 쥣과 동물 TNFα, 쥣과 동물 IL-2, 쥣과 동물 IL-10, 및 쥣과 동물 IL-21 이다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 쥣과 동물 B-세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물은 IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α 및 BAFF 을 포함한다. 한 특정 구현예에서, BAFF 는 5 ng/ml 농도로 첨가된다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 햄스터 B-세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물은 IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α, IL-6 및 SAC 를 포함한다. 한 특정 구현예에서, IL-6 은 10 ng/ml 의 농도로 첨가된다. 한 특정 구현예에서, SAC 는 1:75,000 비로 첨가된다.
표 9: 상이한 조합으로 재조합 쥣과 동물 물질들을 포함하는 상이한 합성 공급자 혼합물 및 EL-4 B5 공급자 세포와 공동-배양된 토끼 B-세포의 세포 배양 상청액의 rbIgG ELISA 의 결과
Figure pct00012
표 10: SAC, 및 재조합 쥣과 동물 물질들을 포함하는 공급자 혼합물 또는 TSN 및 EL-4 B5 공급자 세포와 함께 공동-배양된 토끼 B-세포의 세포 배양 상청액의 IgG+-웰 (rb = 토끼, m = 마우스).
Figure pct00013
공급자 세포 및 쥣과 동물 B-세포를, IL-2 없이, IL-10 없이뿐 아니라, IL-2 및 IL-10 없이 공동 배양하면, IgG 농도는 감소하나, IgG+-웰의 수율은 증가한다. TNFα가 없으면, IgG-농도는 또한 감소된다. IL-1β 이 없는 경우에는, 어떠한 IgG 도 상청액에서 찾아볼 수 없다.
햄스터 B-세포를 각각 IL-2 없이 또는 IL-10 없이 공동배양하면, 탐지가능한 IgG-농도를 갖는 IgG+-웰이 도모된다. 이와 반대로, IL-2 및 IL-10 없이 공동 배양하는 경우, B-세포 성장은 거의 검출할 수 없을 정도이다. TNF-α 또는 IL-1β 의 부재하에서는 어떠한 IgG-분비도 측정될 수 없다.
EL-4 B5 공급자 세포의 존재하에서, 적어도 IL-1β 및 TNFα 가 마우스, 햄스터 및 토끼 B-세포의 공동 배양에 요구된다. IL-2 및 IL-10 는 쥣과 동물 세포의 공동-배양에 대해서는 생략될 수 있다. 햄스터 B-세포는 IL-2 또는 IL-10 의 부재 하에서 배양될 수 있다. 토끼 B-세포는 IL-2 또는 IL-10 또는 IL-6 의 부재 하에서 배양될 수 있다.
쥣과 동물 및 햄스터 B-세포에 있어서, IL-4 의 공급자 혼합물로의 첨가로, IgG+-웰/세포 클론의 개수뿐 아니라, 상청액 내 IgG 의 농도가 증가된다. 즉, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 쥣과 동물- 또는 햄스터-B-세포의 공동-배양을 위한 공급자 혼합물은 IL-4 를 포함한다.
쥣과 동물-B-세포 또는 햄스터-B-세포의 공동-배양을 위한 공급자 혼합물에 IL-6 의 첨가는, IgG+-웰/세포 클론 수 증가 또는 IgG-농도 증가를 각각 도모한다. 따라서, 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 쥣과 동물-B-세포 또는 햄스터-B-세포의 공동-배양을 위한 공급자 혼합물은 IL-6 을 포함한다. 한 특정 구현예에서, IL-6 은 50 ng/ml 의 농도로 첨가된다. 한 특정 구현예에서, 고 IgG-농도가 요구되는 경우, IL-6 은 10 ng/ml 의 농도로 첨가된다. 한 특정 구현예에서, IL-6 의 첨가는, 선택된 B-세포 및 EL-4 B5 세포의 공동 배양 3 일 후에 실시된다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, TNFα, IL-10, 및 IL-21, SAC, BAFF, IL-2, IL-4, 및 IL-6 으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, B-세포와 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 및 SAC 를 포함하는, B-세포와 공급자 세포의 공동 배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, TNFα 로 이루어지고, 임의로는 IL-21, 및/또는 SAC, 및/또는 BAFF, 및/또는 IL-6 을 포함하는, 쥣과 동물 B-세포와 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α 및 BAFF 을 포함하는, 쥣과 동물 B-세포와 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 및 IL-6 을 포함하는, 쥣과 동물 또는 햄스터 B-세포와 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, TNFα, 및 IL-2 또는 IL-10 로 이루어지고, 임의로는 IL-21, 및/또는 SAC, 및/또는 BAFF 를 포함하는, 햄스터 B-세포와 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α, IL-6 및 SAC 를 포함하는, 햄스터 B-세포와 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, TNFα, IL-10, 및 IL-6 를 포함하는, 토끼 B-세포와 공급자 세포의 공동-배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
본원에서 보고된 바와 같은 한 양태는, IL-1β, TNFα, IL-10, IL-6 또는 IL-2, 및 SAC 을 포함하는, 토끼 B-세포와 공급자 세포의 공동 배양을 위한 합성 공급자 혼합물이다.
한 특정 구현예에서, IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 및 IL-21 은, 재조합 쥣과 동물 IL-1β, 쥣과 동물 TNFα, 쥣과 동물 IL-2, 쥣과 동물 IL-10, 및 쥣과 동물 IL-21 이다.
한 특정 구현예에서, BAFF 는 5 ng/ml 의 농도로 첨가된다.
한 특정 구현예에서, IL-6 는 10 ng/ml 의 농도로 첨가된다.
한 특정 구현예에서, SAC 는 1:75,000 비로 첨가된다.
한 특정 구현예에서, 공급자 세포는 쥣과 동물 EL-4 B5 세포이다.
특정 칼륨 채널의 저해제 (= PAP-1, 5-(4-페녹시 부톡시) 프소라렌) 의 첨가는, 놀랍게도 B-세포 클론 수를 감소시키지 않으면서 농도 의존 방식으로 B-세포의 rbIgG 분비를 증가시킨다. 통상, rbIgG 생산을 유도하는 사이토카인은 B-세포 클론의 총 개수 감소와 상관관계가 있을 수 있다. 이는 PAP-1 의 경우는 아니었다.
표 11: TSN 및 SAC (=w/o) 및 상이한 농도의 PAP-1 의 존재하 EL-4 B5 공급자 세포와 공동-배양된 B-세포의 세포 배양 상청액의 rbIgG ELISA 결과. DMSO: PAP-1 에 대한 용매 (1 μM).
Figure pct00014
7.5 % 의 TSN 농도로, 상청액 내 가장 높은 IgG 농도가 수득될 수 있다.
표 12: 공동-배양에 대한 TSN 의 영향. 7.5% 의 TSN 농도가 B-세포 성장 및 생산성을 개선시킨다.
Figure pct00015
96-웰 플레이트의 웰 당 30,000 개의 공급자 세포를 이용하는 경우, 상청액 내 IgG 농도와 조합하여 가장 높은 수의 IgG+-웰이 수득될 수 있다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 단일의 침전된 B-세포 당 공급자 세포 개수는 약 30,000 이다.
표 13: 공동-배양에 대한 EL-4 B5 공급자 세포 함량의 영향
Figure pct00016
공동-배양은 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 원형 바닥을 갖는 웰이 있는 폴리스티렌 멀티 웰 플레이트에서 실시된다. 웰의 작용 부피는 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 50 ㎕ 내지 250　㎕ 이다. 한 특정 구현예에서, 웰은 중합체 플라스틱 수지 및 양친매성 분자의 블렌드로부터 제조된 비(非)섬유성 기질로 적어도 부분적으로 코팅되는데, 이때 상기 양친매성 분자는 친수성 부분 및 소수성 영역을 포함하며, 이 소수성 영역은 기질 내에 안착되고, 친수성 부분은 기질 상에 노출된다. 한 특정 구현예에서, 양친매성 분자는 알킬아민 에톡실화, 폴리 (에틸렌 이민), 옥틸데카민 또는 이의 혼합물로부터 선택된다 (예, EP　1 860 181 참조).
공동-배양된 세포의 특징 분석:
공동-배양 이후 분비된 IgG 의 (정성 및 정량) 측정을 위해, 일반적으로는 당업자에게 공지된 모든 방법, 예컨대 ELISA 가 사용될 수 있다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, ELISA 가 사용된다. 한 특정 구현예에서, 쥣과 동물 B-세포에 의해 분비된 IgG 의 측정을 위해서, 항-IgG 항체 AB 216 (포획 항체) 및 AB 215 (추적자 항체) 를 갖는 ELISA 가 사용된다. 한 특정 구현예에서, 햄스터 B-세포에 의해 분비된 IgG 의 측정을 위해서, 모노클로날 항체 AB 220 (포획 항체) 및 AB 213 (추적자 항체) 를 갖는 ELISA 가 사용된다.
특징 분석 결과에 따라, B-세포 클론이 수득, 즉 선택될 수 있다. 용어 "클론"이란, 단일의 B-세포에서 야기된/기원된 항체 분비 B-세포 및 분열 모집단을 지칭한다. 따라서, B-세포 클론은 모노클로날 항체를 생성한다.
mRNA 의 단리, 클로닝 및 시퀀싱:
B-세포로부터 총 mRNA 는 단리 및 cDNA 에 전사될 수 있다. 특정 프라이머로, 동계 (cognate) VH- 및 VL-영역 인코딩 핵산을 증폭할 수 있다. 이로 수득된 핵산의 시퀀싱으로, 수득된 항체가 대부분의 경우 (71~ 95%) 모노클로날 항체임을 확인하였다. 또한, 각 B-세포의 시퀀싱으로부터, 어떠한 동일한 서열들도 거의 수득되지 않음을 알 수 있다. 따라서, 방법은 동일한 항원에 결합하는 매우 다양한 항체를 제공한다.
VH-인코딩 핵산의 증폭에 사용된 프라이머는 NMRI-마우스, 아르메니아 햄스터, Balb/c-마우스뿐 아니라 시리아 햄스터 및 토끼의 세포로부터 수득된 cDNA 에 사용될 수 있다.
본원에서 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 아미노산 서열은 증폭된 VH-인코딩 핵산으로부터 유도되고, 정확한 출발 및 말단 지점은 EVQL/QVQL 내지 VSS (VH-영역) 및 DIVM/DIQM 내지 KLEIK (VL-영역) 의 아미노산 서열의 위치를 찾음으로써 동정된다.
용어 "항체"는 면역글로불린 유전자로 실질적으로 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드 사슬(들)로 이루어진 단백질을 지칭한다. 인지된 면역글로불린 유전자는 상이한 불변 영역 유전자 및 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 예를 들면 Fv, Fab, 및 F(ab)2 뿐 아니라 단일 사슬 (scFv), 디아바디, 1가, 2가, 3가 또는 4 가 형태 및 나아가 2중특이적, 3중특이적 또는 4중특이적 형태를 비롯해 다양한 형태로 존재할 수 있다 (예, Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; 일반적으로, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); 및 Hunkapiller, T. 및 Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).
또한, 하기 단계를 포함하는 항체 제조 방법이 본원에서 보고되어 있다:
a) (실험 동물의 혈액에서 수득한) (성숙한) B-세포의 모집단을 제공함,
b) B-세포의 모집단의 세포를 하나 이상의 형광 염료 (한 구현예에서는 1 내지 3, 또는 2 내지 3 개의 형광 염료) 로 염색함,
c) 각 용기 내 B-세포의 염색된 모집단의 단일의 세포를 침전함 (한 구현예에서, 용기는 멀티 웰 플레이트의 웰임).
d) 공급자 세포 및 공급자 혼합물 (한 구현예에서, 공급자 세포는 EL-4 B5 세포이고, 한 구현예에서, 공급자 혼합물은 천연 TSN 이고, 한 구현예에서, 공급자 혼합물은 합성 공급자 혼합물임) 의 존재하에서 침전된 각 B-세포를 배양함,
e) 각 B-세포의 배양에서 분비된 항체의 결합 특이성을 측정함,
f) 역전사 PCR 및 뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 특이적으로 결합하는 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 측정하고, 이로써 모노클로날 항체 가변 경쇄 및 중쇄 도메인 인코딩 핵산을 수득함,
g) 모노클로날 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 인코딩 핵산을 항체의 발현을 위한 발현 카세트에 도입함,
h) 핵산을 세포에 도입함,
i) 세포를 배양하고 이 세포 또는 세포 배양 상청액에서 항체를 회수하고 이로써 항체를 제조함.
"발현 카세트" 란, 적어도 세포 내 함유된 핵산의 발현을 위한 프로모터 및 폴리아데닐화 부위와 같은 필수 조절 요소를 포함하는 구축물을 지칭한다.
용어 "실험 동물"은, 비인간 포유동물을 지칭한다. 한 구현예에서, 실험 동물은 래트, 마우스, 햄스터, 토끼, 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류로부터 선택된다.
하기의 실시예를 본 발명의 이해를 돕고자 제공하는데, 이의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면 기술된 절차를 수정할 수 있다고 여겨진다.
실시예
실시예 1
배지 및 버퍼:
ELISA 용 블로킹 버퍼는 1X PBS 및 1% BSA 를 포함한다.
ELISA 용 코팅 버퍼는 4.29g Na2CO3* 10 H2O 및 2.93g NaHCO3 를 포함하고, 최종 1 리터 부피가 되게 물이 첨가되며, 2N HCl 로 pH 9.6 조절된다.
RNA 단리용 에탄올-용액은 70 % 에탄올 또는 80 % 에탄올을 포함한다.
면역형광염색을 위한 FACS-버퍼는 1X PBS 및 0.1 % BSA 를 포함한다.
ELISA 용 IMDM-버퍼는 1X PBS, 5 % IMDM 및 0.5 % BSA 를 포함한다.
ELISA 용 인큐베이션 버퍼 1 은 1X PBS, 0.5 % CroteinC 을 포함한다.
ELISA 용 인큐베이션 버퍼 2 는 1X PBS, 0.5 % CroteinC 및 0.02 % Tween 20 을 포함한다.
ELISA 용 인큐베이션 버퍼 3 은 1X PBS, 0.1 % BSA 을 포함한다.
ELISA 용 인큐베이션 버퍼 4 는 1X PBS, 0.5 % BSA, 0.05 % Tween, PBS (10X), 0.01 M KH2PO4, 0.1 M Na2HPO4, 1.37 M NaCl, 0.027 M KCl, pH 7.0 을 포함한다.
PCR-버퍼는 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 100 mM Tris/HCl, pH 9.0 을 포함한다.
ELISA 용 세정 버퍼 1 은 1X PBS, 0.05 % Tween 20 을 포함한다.
ELISA 용 세정 버퍼 2 는 1X PBS, 0.1 % Tween 20 을 포함한다.
ELISA 용 세정 버퍼 3 은 물, 0.9 % NaCl, 0.05 % Tween 20 을 포함한다.
EL-4 B5 배지는 RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % 글루타민/페니실린/스트렙토마이신-혼합물, 2 % 100 mM 나트륨 피루베이트, 1 % 1 M HEPES 버퍼를 포함한다.
실시예 2
동물 관리 및 면역화
독일 동물 보호법 (TierSCHG) 및 각 유럽 지침서에 준수하여 실험 동물을 수용하였다.
6 내지 8 주령의 마우스 및 햄스터를 입수하여, 12 주령 이전에 면역화하였다. 항원을 처음에는 프로드 완전 아주번트 (complete Freud's adjuvant; CFA) 와 함께 적용하였다. 불완전 프로드 아주번트 (IFA) 로 추가 적용하였다. 입수 실험 동물의 체중에 따라 50 내지 100 ㎍ 항원을 포함하는 항원 함유 에멀젼을 피하 적용하였다.
NZW 토끼 (Charles River Laboratories International, Inc.) 를 면역화에 사용하였다. 안정된 에멀젼 생성시까지, 항원을 1　mg/ml 의 농도의 K3PO4 버퍼 pH 7.0 에 용해하고, 프로드 완전 아주번트 (CFA) 와 (1:1) 혼합하였다. 상기 토끼에 2 ml 의 에멀젼을 피내 (i.d.) 주사 후에, 2 차 근육 내 (i.m.) 주사 및 3 차 피하 (s.c.) 주사 (각각 1 ml) 를 1 주일 간격으로 투여하였다. 1 ml 의 4 차 i.m. 주사를 2 주 후에 투여한 후, 2 회 추가의 1 ml s.c. 주사를 4 주 간격으로 투여했다.
면역화 동안, 혈청 항체 역가를 항원 특이성 검정으로 측정했다. 1:10000 의 IC50 을 가진 항체 역가에서, 면역화 동물의 혈액 또는 비장을 취했다. 항원 특이성 B-세포의 재활성화를 위해, 30 ㎍ 내지 50 ㎍ 의 항원을 실험 동물 정맥내에 혈액 또는 비장을 취하기 3 일 전에 적용하였다.
실시예 3
기관, 혈액 및 대식세포의 제거
마우스 및 햄스터의 혈액을 안구뒤 정맥을 끊어 수득하였다. 토끼의 혈액을 귀 정맥을 끊어 수득하거나, 또는 더 많은 양을 수득하기 위해서는 귀 동맥을 끊어 수득하였다. 전혈 (10 ml) 을 토끼에서 3 차, 4 차, 5 차 및 6 차 면역화 후 4-6 일 후에 수집하여 FACS 에 의한 단일 세포 분류에 사용했다.
대식세포를 수득한 혈액으로부터 세포 배양 플라스틱으로의 부착에 의해 단리하였다. 마우스 및 햄스터로부터, 약 3*105 대식세포를 각 동물로부터 상기 방법에 의해 수득할 수 있다.
다량의 마우스 또는 햄스터 대식세포가 필요한 경우, 복막 대식세포를 단리리하였다. 이를 위해, 동물은 적어도 3달령이어야 한다. 복막 대식세포의 제거를 위해, 동물을 희생시키고, 37　℃ 의 온도에서의 5 ml 의 EL-4 B5 배지를 즉시 복막강에 주입하였다. 동물의 배를 5분 니딩 (kneading) 후, 세포 함유 용액을 제거하였다.
실시예 4
EL-4 B5 세포의 배양
동결 EL-4 B5 세포를 37 ℃ 수조에서 신속하게 해동하고, 10 ml EL-4 B5 배지로 희석하였다. 300 x g 에서 10 분 원심분리 후, 상청액을 버리고, 펠릿을 배지에서 재현탁하였다. 추가 원심분리 단계 후, 상청액을 다시 버리고, 펠릿을 1 ml 배지에서 재현탁하였다.
EL-4 B5 세포를 175 ㎡ 배양 플라스크 내 3 x 104 세포/ml 의 세포 밀도로 접종하였다. 세포 밀도를 이틀 마다 측정하고, 3 x 104 cell/ml 로 조절하였다. 세포는 약 12 시간의 배가 시간을 갖고, 5 x 105 세포/ml 미만의 세포 밀도로 배양해야 하는데, 그 이유는 더 큰 세포 밀도로는 세포의 자극 특성을 잃기 때문이다.
총 세포수가 약 1.5 x 109 세포인 경우, 배지를 원심분리를 통해 제거하였다. 그 후에 세포를 50 그레이 (5000 rad) 로 조사하였다. 트립탄 블루로써 생세포수를 측정한 후, 5 x 106 내지 1 x 107 세포 염색물을 분취해 -80 ℃ 에서 동결하였다.
공동-배양을 위해, 상기 세포를 해동시키고 2 회 EL-4 B5 배지로 세정했다. 생세포수 측정을 위해, 세포 현탁액을 0.4 % (w/v) 트립탄 블루 용액으로 1:10 희석하고, 10 ㎕ 의 혼합물을 Neubauer 계측 챔버로 옮겨, 세포수를 카운팅했다.
실시예 5
밀도 구배 원심분리
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 제작자 지침 A 에 따라 Lympholyte? 로 밀도 구배 분리로써 단리했다. (Lympholyte?-mammal, cedarlane).
채취한 혈액을 인산염완충 식염수 (PBS) 로 2:1 희석했다. 원심분리기 바이얼에, 동일 부피의 밀도 분리 배지를 제공하고, 희석한 혈액을 조심스럽게 바이얼 벽을 통해 첨가했다. 바이알을 20 분 800 x g 에서 제동 없이 원심분리하였다. 림프구를 백색 중간층에서 수득했다. 제거된 세포를 10 ml PBS 로 보충하고, 800 x g 에서 10 분 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 재현탁하고, 세정하고, 원심분리하였다. 최종 펠릿을 PBS 에서 재현탁했다.
실시예 6
적혈구의 저장성 용해
적혈구의 저장성 용해에 의한 파괴를 위해서, 염화암모늄 용액 (BD LyseTM) 을 물로 1:10 희석하고, 1:16 의 비로 전혈에 첨가했다. 적혈구 용해를 위해, 혼합물을 15 분 암실에서 인큐베이션하였다. 온전한 세포로부터 세포 잔사물 (cell debris) 을 분리하기 위해, 용액을 10 분 800 x g 에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 PBS 중에 재현탁하고, 다시 세정하고, 원심분리한 다음 펠릿을 PBS 에 재현탁하였다.
실시예 7
실험 동물의 내부 기관의 세포 제조
비장 및 흉선 세포의 제조를 위해, 각 기관을 페트리 디쉬에서 절개하고, 세포를 PBS 에 녹였다. 남은 조직의 제거를 위해, 세포 현탁액을 100 μM 체를 통해 여과했다. 비장 세포로부터 림프구를 수득하기 위해, 밀도 구배 원심분리를 활용했다. 흉선 세포에 있어서, 어떠한 추가적인 강화 단계는 요구되지 않았다.
실시예 8
대식세포의 결핍
멸균 6-웰 플레이트 (세포 배양 등급) 을 이용해 대식세포 및 단핵구를 불특정 부착을 통해 결핍시키는데 사용하였다. 웰을 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌) 또는 스트렙타비딘 및 대조군 펩티드로 코팅하였다. 각 웰을 3 ml 내지 최대 4 ml 배지와 6x106 이하의 면역화 토끼의 말초 혈액 단핵 세포로 충전하고, 60 분 내지 90 분간 37　℃ 에서 인큐베이터에서 결합되도록 허용하였다. 그 후에, 림프구 함유 상청액을 원심분리 바이얼에 옮기고, 800 x g 에서 10 분간 원심분리하였다. 펠릿을 PBS 에 재현탁하였다.
상청액 중 50　% 의 세포를 패닝 단계에 사용했다; 나머지 50　% 의 세포는 면역 형광 염색 및 단일 세포 분류에 직접 적용하였다.
실시예 9
KLH-특이적 B-세포의 결핍
키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 함유 용액 4 밀리리터를 하룻밤 실온에서 멀티 웰 플레이트의 웰에서 2 ㎍/ml 농도의 코팅 버퍼로 인큐베이션하였다. 결핍 단계 이전에, 상청액을 제거하고, 웰을 PBS 로 2 회 세정했다. 그 후에, 혈액 세포를 2 x 106 세포/ml 의 세포 밀도로 조절하고, 3 ml 를 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 그 후, 멀티 웰 플레이트를 60 내지 90 분 37　℃ 에서 인큐베이션하였다. 상청액을 원심분리 바이얼로 옮기고, 웰을 2 회 PBS 로 세정하고, 상청액을 원심분리 바이알에서 조합하였다. 세포를 800 x g 에서 10 분 원심분리해 펠릿화하고, 펠릿을 PBS 에서 재현탁하였다.
실시예 10
항원-특이성 B-세포의 강화
각 항원을 코팅 버퍼로 2　㎍/ml 의 최종 부피로 희석하였다. 3 ml 의 상기 용액을 6-웰 멀티 웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 하룻밤 실온에서 인큐베이션하였다. 사용 이전에, 상청액을 제거하고, 웰을 2 회 PBS 로 세정하였다. B-세포 용액을 2 x 106 세포/ml 의 농도로 조절하고, 3 ml 을 6-웰 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 60 내지 90 분 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 상청액을 제거하고, 웰을 2 내지 4 회 PBS 로 세정했다. 항원-특이성 B-세포의 회수를 위해, 1 ml 의 트립신/EDTA-용액을 멀티 웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 10 내지 15 분 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 배지 첨가로 중단하고 상청액을 원심분리 바이얼에 옮겼다. 웰을 2 회 PBS 로 세정하고 상청액을 다른 상청액과 조합했다. 세포를 원심분리로 10 분 800 x g 에서 펠릿화하였다. 펠릿을 PBS 에 재현탁했다.
실시예 11
B-세포 및 EL-4 B5 세포의 공동-배양
a) 공동-배양을 둥근 바닥 96-웰 멀티 웰 플레이트에서 수행했다. EL-4 B5 세포 (1.6 x 106 세포 / 15.2 ml) 및 EL-4 B5 배지 내 사이토카인을 포함하는 기본 용액을 제조했다. 200 ㎕ 의 기본 용액을 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 각 웰에, 단일의 B-세포를 형광 활성화 세포 분류에 의해 첨가했다. B-세포의 첨가 후, 플레이트를 5 분 300 x g 에서 원심분리했다. 플레이트를 7 일 간37 ℃ 에서 인큐베이션했다.
b) 단일 분류된 B 세포를, Pansorbin 세포 (1:20000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland), 5　% 토끼 흉선세포 상청액 및 감마-조사된 EL-4-B5 쥣과 동물 흉선종 세포 (2 x 104/웰) 을 갖는 210　㎕/웰 EL-4 B5 배지를 담은 96-웰 플레이트에서 7 일간 37　℃ 에서 5　% CO2 의 분위기 하 인큐베이터에서 배양했다. B 세포 배양 상청액을 스크리닝을 위해 제거하고, 세포를 가변 영역 유전자 클로닝을 위해 즉각 수집하거나 또는 -　80　℃ 에서 100　㎕ RLT 버퍼 중 (Qiagen, Hilden, Germany) 에서 동결하였다.
실시예 12
T-세포의 배양
T-세포를, 3-4 주령의 마우스 및 햄스터의 흉선에서, 또는 4-5 주령 토끼의 흉선에서 각각 단리하였다. 세포를 원심분리하고 즉시 배양하거나 또는 3 x 107 세포의 분취량으로 동결했다. 흉선세포를 175 ㎠ 배양 플라스크 내 EL-4 B5 배지에 5 x 105 세포/ml 의 최소 세포 밀도로 시딩하고 48 시간 동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다.
실시예 13
대식세포의 배양
대식세포를 3달령 이상의 마우스 및 햄스터의 복막강에서 각각 단리하였다. 마우스 또는 햄스터의 복막 대식세포, 또는 토끼의 혈액 단핵 세포를 1.5 시간 37 ℃ 에서 175 ㎠ 배양 플라스크 내 1 x 105 세포/ml 이상의 세포 밀도로 EL-4 B5 배지에서 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 비부착 세포를 부착된 대식세포로부터 가온 EL-4 B5 배지로 세정함으로써 제거한 후, 48 시간 동안 35 ml 배지에서 배양하였다.
실시예 14
T-세포 및 대식세포의 공동-배양
T-세포 및 대식세포를, 별개의 플라스크에서 48 시간 동안 배양하였다. 두 세포 모집단을 조합하기 이전에, T-세포를 10 분 800　x　g 에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 10 ml 배지에서 재현탁하였다. T-세포를 5 x 105 세포/ml 의 최소 세포 밀도로 조절하고, 배지 1 ml 당 10 pg 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA) 및 5 ng 또는 50 ng 피토헤마글루티닌 M (PHA-M) 을 첨가했다. 배양 배지에서 대식세포를 제거하고 T-세포 현탁액을 대식세포 함유 플라스크에 첨가했다. 36 시간의 공동-배양 후, 배양 배지를 제거하고, 이를 TSN 용액으로 명명했다. 잔류 세포 제거를 위해, TSN 용액을 0.22 μm 필터를 통해 여과했다. TSN 용액을 4 ml 의 분취량으로 -　80　℃ 에서 동결하였다.
실시예 15
면역형광 염색
염색되는 세포의 개수에 따라, 세포를 100 ㎕ 배지 (106 개 미만의 세포) 또는 200 ㎕ 배지 (106 개 초과의 세포) 에 각각 제공하였다. 형광 라벨링된 항체를, 실험 동물 5 % 혈청 및 FACS 버퍼로 각각 100 ㎕ 또는 200 ㎕ 의 최종 부피로 희석했다. 반응 혼합물을 40 분간 4 ℃ 에서 암실 내 롤러 랙 상에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2 회 300 x g 에서 5 분 세정하였다. 펠릿을 400 ㎕ PBS 에서 재현탁하고, 70 μm 체를 통해 여과하였다. 여과된 용액을 FACS-바이알로 옮기고, FACS 실험 바로 직전에 죽은 세포를 프로피듐 요오다이드 (6.25 ㎍/ml) 의 첨가로 염색했다. 라벨링된 항체를 비오틴으로 라벨링한 경우에는, 항체를 스트렙타비딘 라벨링된 Alexa Flour(R) 647 (항체 197) 을 이용한 제 2 단계에서 검출하였다.
실시예 16
IgG 의 정량화
공동 배양을 수행한 96-웰 멀티 웰 플레이트를, 공동 배양 7 일 후에 300 x g 에서 5 분 동안 원심분리했다. 150 ㎕ 상청액을 제거하고, 제 2 의 96-웰 멀티 웰 플레이트에서 PBS 와 2:1 의 비율로 희석했다.
ELISA 를 실시예 17 에서 개괄한 바와 같이 수행했다.
항체를 50 ng/ml 의 농도에서 이용했다. OD 가 5 분의 인큐베이션 후 1 이거나 1 을 초과한 경우, 0.8 내지 108 ng/ml IgG 의 계단 희석물을 테스트하였다.
실시예 17
항원-특이성 IgG 의 검출
단일 침전되고 공동 배양된 B-세포에 의해 생성되거나 또는 면역화 실험 동물에서 수득한 B 세포로부터 생성된 항체는 특이적 항원 결합으로 특징 분석될 수 있다. ELISA 를 실온에서 수행하였고, ELISA-용액을 각 단계 사이에서 진탕기 상 20 x g 에서 인큐베이션하였다. 제 1 단계에서, 항원을 96-웰 멀티 웰 플레이트의 웰에 결합시켰다. 항원이 단백질인 경우, 이를 코팅 버퍼 중에서 희석하고 직접 플레이트에 적용하였다. 펩티드 항원을 특이적 결합쌍 비오틴/스트렙타비딘을 통해 결합시켰다. 멀티 웰 플레이트의 웰은 이미 제작자가 가용성 CroteinC (CrC) 로 코팅할 수 있다. 그렇지 않은 경우에는, 웰을 200 ㎕ 블로킹 버퍼로 항원의 고정 후 인큐베이션하였다. 웰 당 100 ㎕ 항원 용액으로 (사전-코팅된 멀티 웰 플레이트) 또는 200 ㎕ 블로킹 버퍼로 각각 인큐베이션 후, 비결합된 항원 또는 블로킹 버퍼를 세정 버퍼로 세정하여 제거하였다. 희석된 B-세포 상청액을 웰 당 100 ㎕ 의 부피로 첨가하고 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 웰을 세정했다. 그 후, 탐지 항체를 웰 당 100 ㎕ 의 부피로 첨가하였다. 항체를 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 콘쥬게이션할 수 있거나, 또는 비오틴으로 라벨링할 수 있다. 탐지 항체를 스트렙타비딘-서양고추냉이 퍼옥시다아제 콘쥬게이트로 측정하였다. 인큐베이션 후, 멀티 웰 플레이트를 세정하고, 그 후 3,3',5,5' 테트라메틸 벤지딘 (TMB)함유 기질 용액 50 ㎕ 을 웰마다 첨가하고, 인큐베이션하였다. 효소 반응을 50 ㎕ 황산 첨가로 중단하고, 광학 밀도를 450 nm 및 680 nm 에서 광도계 (Rainbow Thermo ELISA Reader) 및 Xread 플러스-소프트웨어로 측정하였다.
실시예 18
리보핵산 (RNA) 의 단리
세포 (RNA 는 단리했어야 함) 를 처음에는 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 이 세포 펠릿을 10 ㎕/ml 베타-메르캅토에탄올을 갖는 100 ㎕ RLT-버퍼의 첨가로 용해하였다. 세포를 피펫으로 다중 혼합함으로써 재현탁하였다. 용액을 멀티 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 플레이트를 곧 200 x g 에서 충격을 주고 -20 ℃ 에서 동결했다.
RNA 의 단리를 RNeasy?Kit (Qiagen, Hilden, Germany) 로 제작자 지침에 따라 수행했다.
실시예 19
역전사 중합효소 연쇄 반응
역전사를 20 ㎕ 부피로 수행했다. 각 반응의 대조군은 역전사효소로 및 역전사효소 없이 수행하였다. 반응에 있어서, 1 ㎕ dNTP (각, 10 mM), 0.4 ㎕ 올리고(dT)12-18 (0.2 ㎍) 및 0.6 ㎕ 랜덤 헥사머 (0.03 ㎍) 를 사전-혼합하였고, H2O 중 8.5 ㎕ RNA 에 첨가했다. 반응 혼합물을 5 분 동안 65 ℃ 에서 인큐베이션하고, 직후 얼음에 옮겼다. 그 후, 2 ㎕ RT-버퍼 (10 x), 4 ㎕ MgCl2 (25 mM), 2 ㎕ DTT (0.1 M) 및 1 ㎕ RNAse OutTM (40 단위) 를 사전-혼합하고, 빙냉 반응 혼합물에 첨가했다. 실온에서 2 분의 인큐베이션 시간 후, 0.5 ㎕ SuperscriptTM II 역전사효소 (25 단위) 를 첨가했다. 반응 혼합물을 10 분 실온에서 인큐베이션하였다.
번역은 50 분 동안 42 ℃ 에서 수행했다. 번역 후, 역전사효소를 15 분 동안 70 ℃ 에서의 인큐베이션으로써 불활성화시켰다. cDNA 를 -20 ℃ 에서 보관했다.
실시예 20
중합효소 연쇄 반응
중합효소 연쇄 반응을 Taq PCR Core Kit (Qiagen, Hilden, Germany) 로 제작자 지침에 따라 실시했다. PCR 을 20 ㎕ 의 부피로 수행했다. 샘플을 95℃ 의 온도에서 Mastercyler? 에 옮겼다.
실시예 21
시퀀싱
모든 서열을 SequiServe (Vaterstetten, Germany) 로 측정했다.
실시예 22
항원 패닝
a) 플레이트 코팅
비오틴/스트렙타비딘: 멸균의 스트렙타비딘-코팅된 6-웰 플레이트 (세표 배양 등급) 를, 1 시간 동안 실온에서 PBS 중 비오티닐화 항원으로 0.5 - 2　㎍/ml 의 농도에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 멸균 PBS 에서 사용하기 전 3 회 세정하였다.
공유 결합된 단백질: 세포 배양 6-웰 플레이트를 4 ℃ 에서 하룻밤에 걸쳐 탄산염 버퍼 중 (0.1 M 중탄산나트륨, 34 mM 탄산수소디나트륨, pH 9.55), 2 ㎍/ml 단백질로 코팅했다. 플레이트를 멸균 PBS 로 사용하기 전에 3 회 세정했다.
b) 펩티드 상 B-세포의 패닝
각 항원으로 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트를 4 ml 배지 당 6x106 이하의 세포로 시딩하고, 인큐베이터에 1 시간 동안 37　℃ 에서 결합되게 허용하였다. 비부착 세포를 조심스럽게 웰을 1-2 회 1xPBS 로 세정하여 제거했다. 잔류하는 점착성 세포를 트립신으로 인큐베이터에 10 분간 37　℃ 에서 떼어낸 후 배지에서 2 회 세정했다. 세포를 얼음 상에 면역 형광 염색될때까지 유지하였다.

Claims (21)

  1. 하기 단계를 포함하는, B-세포의 선택 방법:
    a) 단일 세포로서 침전되어진 B-세포 모집단의 B-세포 각각을 공급자 세포와 공동-배양함,
    b) 단계 a) 에서 항체를 증식시키고 분비하는 B-세포 클론을 선택함.
  2. 하기 단계를 포함하는, 타겟 항원에 결합하는 항체의 제조 방법:
    a) 공급자 세포 및 공급자 혼합물의 존재 하에서, 개별 용기 내 단일 세포로서 침전되어진 B-세포 모집단의 각 B-세포를 공동-배양함,
    b) 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 B-세포 클론을 선택함,
    c) 단계 b) 에서 선택된 B-세포 클론에 의해 생성된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포, 또는 이의 인간화 변이체를 배양하고, 세포 또는 배양 상청액에서 항체를 회수하여 이로써 항체를 제조함.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단일 세포 침전 이전에 공동-배양 배지에서 B-세포의 모집단을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 인큐베이션이 약 37　℃ 에서 약 1 시간 동안 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-배양 이전에 단일 세포 침전된 B-세포를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 원심분리가 약 5 분 동안 약 300 x g 에서 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포의 모집단이 밀도 구배 원심분리에 의해 단리되는 점을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포가 성숙한 B-세포인 점을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 라벨링이 2 또는 3 개의 형광 염료로 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 총 B-세포 모집단 중 0.1 % 내지 2.5 % 의 세포가 라벨링되는 점을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포가 마우스 B-세포, 또는 햄스터 B-세포, 또는 토끼 B-세포인 점을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 공급자 세포가 쥣과 동물 EL-4 B5 세포인 점을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-배양이 FCS 10 % (v/v), 페니실린 및 스트렙토마이신 포함 200 mM 글루타민 용액 1 % (w/v), 100 mM 나트륨 피루베이트 용액 2 % (v/v), 및 1 M 2-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진)-에탄 술폰산 (HEPES) 버퍼 1　% (v/v) 로 보충된 RPMI 1640 배지에서 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포가 마우스 기원의 것이고, 라벨링은 IgG+CD19+-B-세포, 및/또는 IgG-CD138+-B-세포의 것인 점을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포가 햄스터 기원의 것이고, 라벨링은 IgG+IgM--B-세포의 것인 점을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 10 항 및 제 12 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포가 토끼 기원의 것이고, 라벨링은 IgG+-B-세포 및/또는 CD138+-B-세포, 또는 CD138+IgG+-B-세포 및/또는 IgG+IgM--B-세포의 것인 점을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-배양이 인터류킨-1　베타 및 종양 괴사 인자 알파, 및 인터류킨-2 및 인터류킨-10 및 스타필로코커스 아우레우스 균주 코완 세포를 포함하는 합성 공급자 혼합물의 존재하에서 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-배양이 인터류킨-1　베타 및 종양 괴사 인자 알파, 및 인터류킨-2 및 인터류킨-10 및 인터류킨-21 을 포함하는 합성 공급자 혼합물의 존재하에서 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-배양이 인터류킨-1　베타 및 종양 괴사 인자 알파, 및 인터류킨-2 및 인터류킨-10 및 종양 괴사 인자 패밀리의 B-세포 활성화 인자 (BAFF) 를 포함하는 합성 공급자 혼합물의 존재하에서 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-배양이 공급자 혼합물로서 흉선세포 배양 상청액의 존재하에서 실시되는 점을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 흉선세포 배양 상청액이 어린 동물의 흉선의 흉선세포에서 수득되는 점을 특징으로 하는 방법.
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