CN105039252B - 单个b细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本文报导了得到B细胞的方法，其包括以下步骤：a)标记B细胞，b)将标记的B细胞沉积为单细胞，c)和饲养细胞共培养单细胞沉积的B细胞，d)选择步骤c)中增殖和分泌IgG的B细胞并从而得到B细胞。标记可以是IgG+CD19+‑B细胞、IgG+CD38+‑B细胞、IgG+CD268+‑B细胞、IgG‑CD138+‑B细胞、CD27+CD138+‑B细胞或CD3‑CD27+‑B细胞。所述方法可包括在沉积步骤以前，在EL‑4B5培养基中在37℃孵育1小时所述B细胞的步骤。所述方法还可包括在共培养以前离心所述单细胞沉积的B细胞的步骤。在共培养中，可使用包含白介素‑1β和肿瘤坏死因子α和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowans菌株细胞或BAFF或白介素‑2和/或白介素‑10和/或白介素‑6和/或白介素‑4的饲养混合物。

Description

单个B细胞培养方法
本申请为2011年5月26日提交的、发明名称为“单个B细胞培养方法”的PCT申请PCT/EP2011/058616的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年11月28日，申请号为201180026559.6。
本文报导了得到由单个B细胞分泌的单克隆抗体的至少可变结构域的氨基酸序列的方法，所述单个B细胞是通过单细胞沉积和在饲养混合物存在下与饲养细胞共培养从来自实验动物的B细胞群中得到的。
发明背景
为了得到分泌单克隆抗体的细胞，广泛使用Koehler和Milstein开发的杂交瘤技术。但是在杂交瘤技术中，只能融合和增殖从经免疫的实验动物中得到的B细胞的一部分。B细胞的来源通常是经免疫的实验动物的器官，例如脾。
Zubler等人从1984年开始开发不同的方法用于得到分泌单克隆抗体的细胞(见例如Eur.J.Immunol.14(1984)357-63,J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。其中从经免疫的实验动物的血液中得到B细胞，并在包含细胞因子的饲养混合物的存在下与鼠EL-4 B5饲养细胞共培养。使用此方法，在共培养10-12天后可得到多达50ng/ml的抗体。
Weitkamp,J-H.,等人,(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报导了从用荧光病毒样颗粒选择的单个抗原特异性B细胞中生成针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。在US2006/0051348中报导了生产针对多种同源抗原的多种分离的抗体的方法。在WO 2008/144763和WO 2008/045140中分别报导了针对IL-6的抗体及其用途，以及得到抗原特异性B细胞的克隆群的培养方法。在US 2007/0269868中报导了得到抗原特异性B细胞的克隆群的培养方法。Masri等人(在Mol.Immunol.44(2007)2101-2106中)报导了在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达功能性Fab片段，所述片段从针对炭疽毒素的单个人淋巴细胞中得到。在WO2007/031550中报导了制备免疫球蛋白文库的方法。
发明概述
本文报导了从具有特殊性质的B细胞群中分离B细胞的方法。首先，在实验动物第一次免疫后4周内已经可以分离诱导的抗体生产细胞，并可测定抗体的结合特异性。其次，可通过以下任一步骤提高抗体生产细胞的数量和/或质量(例如抗体生产/分泌能力)：i)预孵育步骤，和/或ii)离心步骤，和/或iii)淘选步骤。第三，可通过加入IL-21，或IL-6，或SAC，或BAFF改善用于B细胞和饲养细胞共培养的饲养混合物。
因此，在一个方面本文报导了选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)任选地标记B细胞群的B细胞，
b)单独地共培养已沉积为单细胞的B细胞群的每个B细胞和饲养细胞，
c)选择在步骤b)中增殖并分泌抗体的B细胞。
在一个方面，本文还报导了得到B细胞克隆的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从实验动物中得到B细胞，
b)标记B细胞，
c)将标记的B细胞沉积为单细胞，
d)单独地共培养单细胞沉积的B细胞和饲养细胞，
e)选择在步骤d)中增殖并分泌抗体的B细胞并因此得到B细胞克隆。
在另一个方面，本文报导了生产特异性结合靶抗原的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)任选地用至少一种荧光染料标记B细胞群的细胞，
b)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养已在单独的容器中沉积为单细胞的B细胞群的每个B细胞，以得到单独的B细胞克隆和培养物上清液，
c)选择生产特异性结合靶抗原的抗体的B细胞克隆，
d)培养含有编码特异性结合靶抗原的抗体的核酸的细胞，所述抗体由步骤c)中选择的B细胞克隆生产，或为其人源化变体，并从细胞或培养物上清液中回收抗体，从而生产抗体。
在一个实施方案中，所述方法包括一个或多个以下步骤：
在步骤c)后：c1)通过逆转录酶PCR测定编码抗体的可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列，
在步骤c1)后：c2)用包含编码抗体可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序列的核酸转染细胞。
在一个方面，本文还报导了生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供(成熟的)B细胞群(从实验动物的血液中得到)，
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1至3种，或2至3种荧光染料)标记B细胞群的细胞，
c)在单独的容器中沉积经标记的B细胞群的单个细胞(在一个实施方案中，容器是多孔板的孔)，
d)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养沉积的各个B细胞(在一个实施方案中，饲养细胞是EL-4 B5细胞，在一个实施方案中，饲养混合物是天然TSN，在一个实施方案中，饲养混合物是合成的饲养混合物)，
e)测定在各个B细胞的培养基中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序来测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体可变轻和重链结构域的编码核酸，
g)为了表达抗体，将单克隆抗体可变轻和重链可变结构域编码核酸引入表达盒，
h)将核酸引入细胞，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养物上清液中回收抗体，并从而生产抗体。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在单细胞沉积以前，在共培养培养基中孵育B细胞群的步骤。在一个实施方案中，在约37℃进行孵育。在一个实施方案中，孵育进行0.5至2小时。在特定的实施方案中，孵育进行约1小时。在一个实施方案中，在约37℃进行孵育约1小时。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在共培养以前离心单细胞沉积的B细胞的步骤。在一个实施方案中，离心进行约1分钟至约30分钟。在特定的实施方案中，离心进行约5分钟。在一个实施方案中，以约100x g至约1,000x g进行离心。在特定的实施方案中，以约300x g进行离心。在一个实施方案中，以约300x g离心约5分钟。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括紧接标记步骤以前的以下步骤：用固定的抗原淘选B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心从动物血液中得到B细胞群。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在免疫后4天从实验动物血液中得到B细胞群。在另一个实施方案中，从在免疫后从4天到至少9天的实验动物血液中得到B细胞群。在进一步的实施方案中，从在免疫后从4天到9天的实验动物血液中得到B细胞群。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心分离B细胞群。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，用1至3种荧光染料进行标记。在特定的实施方案中，用2至3种荧光染料进行标记。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞的标记导致总B细胞群的0.1％至2.5％的细胞的标记。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是小鼠B细胞，或仓鼠B细胞，或兔B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在多孔板的孔中进行单细胞沉积。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，饲养细胞是鼠EL-4 B5细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，标记是IgG+CD19+-B细胞，IgG+CD38+-B细胞，IgG+CD268+-B细胞，IgG-CD138+-B细胞，CD27+CD138+-B细胞，或CD3-CD27+-B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是小鼠来源的，且标记是IgG+CD19+-B细胞，和/或IgG-CD138+-B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是仓鼠来源的，且标记是IgG+IgM--B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是兔来源的，且标记是IgG+-B细胞和/或CD138+-B细胞，或CD138+IgG+-B细胞和/或IgG+IgM--B细胞。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述共培养是在补充了10％(v/v)FCS，包含青霉素和链霉素的1％(w/v)的200mM谷氨酰胺溶液，2％(v/v)的100mM丙酮酸钠溶液，和1％(v/v)的1M 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI 1640培养基中。在另一个实施方案中，所述共培养培养基还包含0.05mMβ-巯基乙醇。
在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞与饲养细胞和饲养混合物共培养。在一个实施方案中，所述饲养混合物是天然的胸腺细胞培养物上清液(TSN)或合成的饲养混合物。
在一个特定的实施方案中，所述饲养混合物是合成的饲养混合物。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-1β和肿瘤坏死因子α。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-2(IL-2)和/或白介素-10(IL-10)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物还包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowans菌株细胞(SAC)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-21(IL-21)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子(BAFF)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-6(IL-6)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-4(IL-4)。
在一个实施方案中，在存在胸腺细胞培养物上清液作为饲养混合物时进行共培养。在特定的实施方案中，从年轻动物胸腺的胸腺细胞中得到胸腺细胞培养物上清液。
在一个实施方案中，得到B细胞克隆的方法还包括以下步骤：
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定由步骤e)的选择的B细胞克隆生产的抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体氨基酸可变结构域序列。
在一个实施方案中，所述实验动物选自小鼠、仓鼠和兔。
发明详述
本文报导的方法允许快速表征从单独的B细胞克隆得到的单克隆抗体的结合特异性，即在实验动物的第一次免疫4周内可分离诱导的抗体生产细胞，并可测定从其生产的抗体的结合特异性，其中根据B细胞共培养物上清液中的抗体量/浓度可进行至少4种不同的实验。
免疫：
通常使用非人动物，例如小鼠、兔、仓鼠和大鼠作为评估基于抗体的疗法的动物模型。因此，经常需要提供结合非人动物抗原以及人抗原的交叉反应性抗体。本文报导的方法可用于提供交叉反应性抗体。在本文报导的方法中，可使用从例如小鼠、仓鼠和兔中得到的B细胞。在一个实施方案中，小鼠是NMRI-小鼠或baIb/c-小鼠。在另一个实施方案中，仓鼠选自亚美尼亚仓鼠(灰仓鼠(Cricetulus migratorius))、中国仓鼠(黑线仓鼠(Cricetulusgriseus))和叙利亚仓鼠(金黄仓鼠(Mesocricetulus auratus))。在特定的实施方案中，仓鼠是亚美尼亚仓鼠。在一个实施方案中，兔选自新西兰白(NZW)兔、齐默尔曼兔(ZIKA)、Alicia突变株兔、basilea突变株兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、rbIgM敲除兔，及其杂种。
在一个实施方案中，选择进行免疫的实验动物，例如小鼠、仓鼠和兔不大于12周。
B细胞的来源和分离：
实验动物的血液提供了高多样性的抗体生产B细胞。从中得到的B细胞分泌的抗体在CDR内几乎不具有相同或重叠的氨基酸序列，因此显示了高多样性。
在一个实施方案中，得到从免疫后4天直到免疫或最近的加强后至少9天的实验动物的B细胞，例如来自血液的B细胞。此时间跨度允许本文报导的方法中的高灵活性。在此时间跨度中，提供大部分亲族(affine)抗体的B细胞可能从脾迁移至血液(见例如Paus，D.，等人，JEM 203(2006)1081-1091；Smith，K.G.S.，等人，EMBO J.16(1997)2996-3006；Wrammert，J.，等人，Nature 453(2008)667-672)。
可使用本领域技术人员已知的任意方法得到实验动物血液中的B细胞。例如，可使用密度梯度离心(DGC)或红血细胞裂解(裂解)。密度梯度离心相比低渗裂解提供了更高的总产量，即B细胞克隆数。另外，在通过密度梯度离心得到的细胞中，较多的细胞在共培养步骤中分裂和生长。分泌的抗体浓度相比用不同的方法得到的细胞也更高。因此，在一个实施方案中，通过密度梯度离心提供B细胞群。
表1：通过密度梯度离心(DGC)或红细胞的低渗裂解得到细胞时，IgG生产孔/细胞克隆的数目
共培养以前的选择步骤：
可从外周血单核细胞(PBMC)中富集生产特异性结合抗原的抗体的B细胞。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，从外周血单核细胞(PBMC)中富集B细胞群。
术语“特异性结合”及其语法等同形式表示抗体以10-7M或更小，在一个实施方案中以10-8M至10-13M，在另一个实施方案中，以10-9M至10-13M的解离常数(Kd)结合其靶。此术语还用于表示抗体不特异性结合存在的其他生物分子，即其以10-6M或更大，在一个实施方案中以10-6M至1M的解离常数(Kd)结合其他生物分子。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，去除PBMC中的巨噬细胞。如下所述，这是有利的，例如在兔来源的B细胞的一个实施方案中，用于共培养步骤。
可通过黏附至细胞培养板表面去除巨噬细胞(见预培养步骤)。
在本文报导的方法的一个实施方案中，细胞来自用蛋白质免疫的动物，并在标记以前去除巨噬细胞。
已发现，相比在从实验动物血液中分离和任选地富集B细胞群后直接单细胞沉积，在单细胞沉积以前在共培养培养基中孵育B细胞群提高了在单细胞沉积后得到的抗体分泌细胞的总数(以兔为例，见表2a和2b)。特别地，在EL-4 B5培养基中在约37℃下孵育约1小时，例如使用细胞培养箱。
表2a：在所有细胞的单细胞沉积以前，在EL-4 B5培养基中孵育或没有孵育1小时的IgG阳性孔/细胞克隆(rb＝兔).
＊去除巨噬细
胞和单核细胞
表2b：在B细胞单细胞沉积以前，在EL-4 B5培养基中孵育或没有孵育1小时的IgG阳性孔/细胞克隆
在本文报导的方法的一个实施方案中，从用经蛋白质免疫的动物中得到细胞并去除巨噬细胞。
通过使用淘选方法，可分别减少不产生结合抗原的抗体的细胞或同样地富集产生结合抗原的抗体的细胞。其中存在与表面结合的结合伙伴，如果进一步处理结合的细胞，则在细胞群中选择性富集与其结合的细胞，或如果进一步处理溶液中剩余的细胞，则在细胞群中减少与其结合的细胞。
表3：通过用各自的抗原淘选，富集分泌抗原特异性抗体的B细胞
在一个实施方案中本文报导的方法包括在单细胞沉积以前的选择步骤，其中基于细胞表面标记物和荧光激活细胞分选/门控选择产生特异性和/或非交叉反应性抗体的B细胞。在一个实施方案中，分选/富集/选择成熟的B细胞。为了从不同的实验动物物种选择B细胞，可使用不同的细胞表面标记物。已发现许多可用的细胞表面标记物不能提供合适的标记，无论是单独还是组合使用。
通过标记非靶细胞群和非特异性结合的淋巴细胞，可以选择性去除这些细胞。在此去除步骤中，仅可实现不完全的去除。虽然去除不是定量的，但是其对剩余细胞的后续荧光标记提供了优势，因为可减少或甚至最小化干扰细胞的数目。通过使用如下概述的标记，通过荧光激活细胞分选进行成熟的B细胞(记忆B细胞，亲和力成熟的成浆细胞和浆细胞)的单细胞沉积，在共培养步骤中可得到较高数目的IgG+-孔/细胞克隆。
术语“标记”表示存在或缺乏表面标记物，所述表面标记物可通过加入特异性结合和标记的抗表面标记物抗体测定。因此，在与各自的特异性结合和标记的抗表面标记物抗体孵育后，例如在荧光标记物的情况下通过出现荧光确定表面标记物的存在，而通过缺乏荧光确定缺乏表面标记物。
可通过使用不同的表面标记物标记不同的细胞群，例如CD3+-细胞(T细胞)，CD19+-细胞(B细胞)，IgM+-细胞(成熟的幼稚B细胞)，IgG+-细胞(成熟的B细胞)，CD38+-细胞(例如成浆细胞)，和IgG+CD38+-细胞(前浆细胞)。
如本文报导的，已开发了用于选择成熟的IgG+-B细胞(例如记忆B细胞、成浆细胞和浆细胞)的免疫荧光标记。为了选择或富集B细胞，单标记、或双标记、或三重标记细胞。还要求标记导致总细胞群的约0.1％至2.5％的标记细胞。在一个实施方案中，通过在细胞群中的0.1％至2.5％的B细胞上，在另一个实施方案中，通过在细胞群中的0.3％至1.5％的B细胞上，在另一个实施方案中，通过在细胞群中的0.5％至1％的B细胞上存在的表面分子的标记选择沉积为单细胞的B细胞。
在PBMC群中的0.5％-1％的IgG+-B细胞可被双标记为IgG+CD19+-细胞、IgG+CD38+-细胞和IgG+CD268+-细胞。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，IgG+CD19+-B细胞、IgG+CD38+-B细胞或IgG+CD268+-B细胞沉积为单细胞。
在PBMC群中的0.5％-1％的IgG--B细胞可被双标记为IgG-CD138+-细胞。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，IgG-CD138+-B细胞沉积为单细胞。
CD27+CD138+-细胞或CD3-CD27+-细胞的标记导致细胞群中约1.5％的细胞分别被标记。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，CD27+CD138+-B细胞或CD3-CD27+-B细胞沉积为单细胞。
在PBMC群中的0.6％±0.1％的IgG+-仓鼠B细胞可被双标记为IgG+IgM--仓鼠B细胞。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，IgG+IgM--仓鼠B细胞沉积为单细胞。
在一个实施方案中，从获自经免疫的动物的B细胞中将IgG-CD138+-B细胞沉积为单细胞。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，从获自经未免疫动物的B细胞中将IgG+CD19+-B细胞沉积为单细胞。在本文报导的所有方法的另一个实施方案中，从获自未经免疫或经免疫的动物的B细胞中将IgG+IgM--B细胞沉积为单细胞。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，将IgG+CD19+-鼠B细胞沉积为单细胞。此选择步骤导致在后续的共培养步骤中的提高或甚至最高产量的IgG+-孔。在本文报导的所有方法的另一个实施方案中，将IgG-CD138+-鼠B细胞沉积为单细胞。随其选择首先生产最高量的B细胞克隆的细胞，并其次选择生产最高IgG浓度的细胞(见表5)。在本文报导的所有方法的另一个实施方案中，将IgG+CD19+-鼠B细胞和IgG-CD138+-鼠B细胞沉积为单细胞。在一个特定的实施方案中，所述方法的条件是，如果细胞是兔来源的，则标记不是IgG+-B细胞和/或CD138+-B细胞的。
IgG+-鼠B细胞可用抗小鼠-IgG-抗体227(Ab 227)标记，IgG+-仓鼠B细胞可用抗仓鼠-IgG-抗体213(AB 213)和/或抗仓鼠-IgG-抗体225(AB 225)标记，兔B细胞可用抗IgG-抗体184(见表4)标记。
表4：B细胞的免疫荧光标记-该表显示了鼠B细胞(A-E)，仓鼠B细胞(F-H)和兔B细胞(I-J)的群体的平均被标记的比例
PE：藻红蛋白
APC：别藻蓝蛋白
FITC：异硫氰酸荧光素
必须指出，不是所有的市售抗体可用于标记，因为其低特异性或不存在特异性。
鼠B细胞可用抗IgG-抗体227标记，仓鼠B细胞可用抗IgG-抗体213标记。
IgG+CD19+-鼠B细胞可用抗体227和抗体218标记，
IgG+IgM--鼠B细胞可用抗体227和抗体219标记，
IgG+IgM--仓鼠B细胞可用抗体213和抗体224标记，
IgG+-兔B细胞可用抗体184标记，
IgG+IgM--兔B细胞可用抗体184和抗体254和SA 263标记，
IgG+CD138+-兔B细胞可用抗体259和抗体256标记。
鼠B细胞可用抗CD27抗体235或236(AB 235，AB 236)，抗CD38抗体192(AB 192)，抗CD138抗体233(AB 233)和抗CD268抗体246(AB 246)标记。
表5：用于测定成熟的小鼠(A-J)，仓鼠(K)和兔(L-N)B细胞的免疫荧光标记
A647：Alexa647
FITC：异硫氰酸荧光素
在一个实施方案中，所述方法包括去除B细胞群中的巨噬细胞并富集B细胞群中分泌特异性结合靶抗原的抗体的B细胞的步骤。
单细胞沉积：
本文报导的方法包括将B细胞群的B细胞沉积为单细胞的步骤。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACS)沉积为单细胞。可如前面章节中所报导地进行FACS单细胞沉积所需要的标记。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，将特定标记的B细胞沉积为单细胞。在本文报导的所有方法的另一个实施方案中，所述标记是用荧光标记的抗体来标记细胞表面标记物。在另一个实施方案中，本文报导的方法提供单克隆抗体。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，将成熟的B细胞沉积为单细胞。
也已经发现，在单细胞沉积以后和共培养以前的额外的离心步骤提供了增加的抗体分泌细胞的数目，并增加了分泌的IgG的量(以具有人免疫球蛋白基因座的实验动物为例，见表6)。
表6：在单细胞沉积后具有或不具有离心步骤的IgG阳性孔/细胞克隆
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，所述方法包括在共培养以前离心单个沉积的细胞的步骤。在一个特定的实施方案中，离心以300x g进行5分钟。
共培养：
在与饲养细胞的共培养步骤之前和之后可以有多个额外步骤。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，在饲养混合物的存在下共培养单个沉积的B细胞和饲养细胞。在特定的实施方案中，共培养B细胞和鼠EL-4 B5饲养细胞。通过如上所述的合适的免疫荧光标记可实现在共培养步骤中的产量的提高(IgG+-孔/细胞克隆数以及IgG浓度)，以及从PBMC中富集或分离成熟的IgG+-B细胞。
通过从新鲜分离的PBMC中IgG+CD19+-和/或IgG+CD38+-B细胞的单细胞沉积，可得到最高数量的IgG+-孔/细胞克隆。通过在去除巨噬细胞或KLH特异性细胞(匙孔血蓝蛋白)后IgG+CD19+-，IgG+CD38+-和/或IgG-CD138+-B细胞的单细胞沉积，可得到良好的结果。通过在去除抗原特异性B细胞后IgG+CD19+-，IgG+CD38+-和/或IgG-CD138+-B细胞的单细胞沉积，可得到改善的结果。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，将IgG+CD19+-，IgG+CD38+-和/或IgG-CD138+-B细胞沉积为单细胞。
已经发现，基于如上所述的标记的单细胞沉积导致最高比例的IgG+-孔/细胞克隆和上清中具有最高IgG浓度的孔/细胞克隆。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，将IgG+CD19+-和/或IgG-CD138+-鼠B细胞沉积为单细胞。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，将IgG+IgM--仓鼠B细胞沉积为单细胞。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，将IgG+-，和/或IgG+CD138+-，和/或CD138+-和/或IgG+IgM--兔B细胞沉积为单细胞。
表7：取决于免疫荧光标记的共培养中的产量
对于鼠B细胞，通过在每次富集(enr.)和/或去除(depl.)步骤后IgG+CD19+-细胞的单细胞沉积，在共培养后可得到最高数量的IgG+-孔/细胞克隆。备选地，通过IgG-CD138+-细胞孔/细胞克隆的单细胞沉积，在上清液中可得到最佳IgG浓度。IgG-CD138+-细胞的单细胞沉积可用于来自经免疫的动物的B细胞。IgG+CD19+-细胞的单细胞沉积可用于来自未经免疫的动物的B细胞。IgG+IgM--细胞的单细胞沉积可用于经免疫的动物和未经免疫的动物的仓鼠B细胞。IgG+-，和/或IgG+CD138+，和/或CD138+-和/或IgG+IgM--B细胞的单细胞沉积可用于兔B细胞。
用于从实验动物血液中得到的B细胞的免疫荧光标记也可用于标记从实验动物(例如小鼠，仓鼠和兔)的脾和其他免疫器官得到的B细胞。对于小鼠B细胞，来自脾的IgG+-B细胞的比例为约0.8％，相比0.4％的IgG+CD19+-细胞。对于仓鼠B细胞，对应的数值是1.9％和0.5％IgG+IgM--细胞。对于兔血液来源的B细胞，在去除巨噬细胞后发现0.2％的IgG+-细胞。在去除巨噬细胞后，来自兔的Peyer’sche斑显示0.4％的IgG+-细胞，脾显示了0.3％的IgG+-细胞。
使用本文报导的方法，在共培养约7天后，即5、6、7或8天后，特别是7或8天后，可得到从约30ng/ml至高达15μg/ml或更高的抗体浓度(平均值约500ng/ml)。使用由此提供的抗体量，可进行多种不同的分析以更详细地表征抗体，例如有关结合特异性。通过在此早期阶段在筛选/选择过程中对抗体的改进的表征，能减少需要的核酸分离和必须进行的测序反应的数量。额外地，B细胞克隆提供了一些量的允许使用退化的PCR引物的编码单克隆轻和重链可变区的mRNA，并且避免了对高特异性引物的需要。也减少了需要的PCR循环数。因此，在一个实施方案中，逆转录酶PCR使用轻和重链可变结构域的退化的PCR引物。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，所述饲养混合物是胸腺细胞培养物上清液。在特定的实施方案中，所述胸腺细胞培养物上清液从相应的年轻动物的胸腺的胸腺细胞中得到。相比从成年动物血液中分离胸腺细胞，年轻动物的胸腺特别适于使用。术语“年轻动物”表示在出现性成熟以前的动物。例如，年轻仓鼠的年龄是低于6周，特别是低于4周。例如，年轻小鼠的年龄是低于8周，特别是低于5周。
由于饲养混合物的来源是源自培养的胸腺细胞的上清液(胸腺细胞培养上清(thymocyte cultivation supernatant)-TSN)，存在相当大的批次与批次的变异。为了克服此变异性，已开发了由合成成分组成的合成的饲养混合物。由IL-1β(白介素-1β)，TNFα(肿瘤坏死因子α)，IL-2(白介素-2)和IL-10(白介素-10)组成的饲养混合物可从Tucci，A.，等人，J.Immunol.148(1992)2778-2784中得知。
本文报导了用于共培养单个沉积的B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物。本文还报导了用于合成的饲养混合物的B细胞物种特异性添加剂，其用于增加由相应的B细胞克隆分泌的抗体量。同时高产细胞含有更多的mRNA，其进而促进编码核酸的逆转录和测序，例如使用冗余的、非特异性引物组。
通过加入SAC(金黄色葡萄球菌Cowans菌株细胞，使用单个SAC批次)，可增加抗体分泌B细胞数和在共培养后上清液中的平均IgG浓度。已发现，可限定在共培养中加入的SAC的浓度范围，因为降低以及增加的SAC浓度降低分泌抗体的量。
表8a：与EL-4 B5饲养细胞共培养的从具有人IgG基因座的实验动物或野生型兔(NZW)中得到的B细胞的细胞培养物上清液的huCk ELISA(huCk＝人Cκ)或rbIgG ELISA的结果，使用TSN作为饲养混合物，加入或不加入SAC。
可以看到，从1∶20000至1∶150000的SAC比例提供了增加数量的IgG+-孔/细胞克隆，其中从1∶50000至1∶100000的比例显示了最高数量。在一个实施方案中，通过提供稀释系列和测定在哪个稀释度上加入的SAC提供最高数量的IgG阳性孔/细胞克隆，测定加入培养基中的SAC的量。
已经观察到，通过对饲养混合物加入SAC，B细胞的共培养以如下方式惊人地改变，即只有单个沉积的B细胞具有生长优势，而当使用PBL(例如B细胞和内源T细胞)混合物用于共培养时，抑制了B细胞生长。
表8b：与EL-4 B5饲养细胞共培养的PBL和单个沉积的B细胞的细胞培养物上清液的huCk ELISA或rbIgG ELISA结果，使用TSN作为饲养混合物，加入SAC
＊去除巨噬
细胞
用不同饲养混合物得到的其他数据显示在下表9和10中。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，用于B细胞共培养的合成的饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-21(白介素-21)。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，用于B细胞共培养的合成的饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和SAC。在一个特定的实施方案中，IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-21是重组的鼠IL-1β、鼠TNFα、鼠IL-2、鼠IL-10，和鼠IL-21。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，用于鼠B细胞共培养的合成的饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α和BAFF。在一个特定的实施方案中，以5ng/ml的浓度加入BAFF。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，用于仓鼠B细胞共培养的合成的饲养混合物包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α、IL-6和SAC。在一个特定的实施方案中，以10ng/ml的浓度加入IL-6。在一个特定的实施方案中，以1∶75,000的比例加入SAC。
表9：兔B细胞的细胞培养物上清液的rblgG ELISA结果，所述兔B细胞与EL-4 B5饲养细胞和包含不同组合的重组鼠物质的不同的合成饲养混合物共培养
表10：兔B细胞的细胞培养物上清液的IgG+-孔，所述兔B细胞与EL-4 B5饲养细胞和TSN或包含重组鼠物质和SAC的饲养混合物共培养(rb＝兔，m＝小鼠)
没有IL-2、没有IL-10以及没有IL-2和IL-10的饲养细胞和鼠B细胞的共培养导致IgG+-孔产量的增加，但是降低了IgG浓度。没有TNFα也降低IgG浓度。没有IL-1β，在上清中无法发现lgG。
没有IL-2或没有IL-10的仓鼠B细胞的共培养分别导致具有可检测的IgG浓度的IgG+-孔。与其相反，在没有IL-2和IL-10的共培养中几乎检测不到B细胞生长。没有TNF-α或IL-1β时，检测不到IgG分泌。
存在EL-4 B5饲养细胞时，小鼠、仓鼠和兔B细胞的共培养至少需要IL-1β和TNFα。对于鼠细胞的共培养，可省去IL-2和IL-10。可在没有IL-2或IL-10时培养仓鼠B细胞。可在没有IL-2或IL-10或IL-6时培养兔B细胞。
对于鼠和仓鼠B细胞，对饲养混合物加入IL-4增加了IgG+-孔/细胞克隆数以及上清液中的IgG浓度。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，用于鼠或仓鼠B细胞的共培养的饲养混合物包含IL-4。
对用于鼠B细胞或仓鼠B细胞的共培养的饲养混合物中加入IL-6分别导致增加的lgG+-孔/细胞克隆数或增加的IgG浓度。因此，在本文报导的所有方法的一个实施方案中，用于鼠B细胞或仓鼠B细胞的共培养的饲养混合物包含IL-6。在一个特定的实施方案中，以50ng/ml的浓度加入IL-6。在一个特定的实施方案中，如果需要高IgG浓度，则以10ng/ml的浓度加入IL-6。在一个特定的实施方案中，在选择的B细胞和EL-4 B5细胞共培养3天后加入IL-6。
本文报导的一个方面是用于共培养B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其包含IL-1β、TNFα、IL-10，和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4，和IL-6的一种或多种。
本文报导的一个方面是用于共培养B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其包含IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和SAC。
本文报导的一个方面是用于共培养鼠B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其由IL-1β、TNFα组成，并任选地包含IL-21和/或SAC和/或BAFF和/或IL-6。
本文报导的一个方面是用于共培养鼠B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其包含IL-1β、IL-2、IL-10，TNF-α和BAFF。
本文报导的一个方面是用于共培养鼠或仓鼠B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其包含IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6。
本文报导的一个方面是用于共培养仓鼠B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其由IL-1β、TNFα、和IL-2或IL-10组成，并任选地包含IL-21，和/或SAC，和/或BAFF。
本文报导的一个方面是用于共培养仓鼠B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其包含IL-1β、IL-2、IL-10、TNF-α、IL-6和SAC。
本文报导的一个方面是用于共培养兔B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其包含IL-1β、TNFα、IL-10和IL-6。
本文报导的一个方面是用于共培养兔B细胞和饲养细胞的合成的饲养混合物，其包含IL-1β、TNFα、IL-10、IL-6或IL-2，和SAC。
在一个特定的实施方案中，IL-1β、TNFα、IL-2、IL-10和IL-21是重组的鼠IL-1β、鼠TNFα、鼠IL-2、鼠IL-10，和鼠IL-21。
在一个特定的实施方案中，以5ng/ml的浓度加入BAFF。
在一个特定的实施方案中，以10ng/ml的浓度加入IL-6。
在一个特定的实施方案中，以1∶75,000的比例加入SAC。
在一个特定的实施方案中，饲养细胞是鼠EL-4 B5细胞。
加入某钾通道抑制剂(＝PAP-1，5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂内酯)惊人地以浓度依赖性的方式增加了B细胞的rblgG分泌，且不降少B细胞克隆数。通常，诱导rblgG生产力的细胞因子可与B细胞克隆总数的减少相关。PAP-1不是这种情况。
表11：B细胞的细胞培养物上清液的rblgG ELISA结果，所述B细胞在TSN和SAC(＝w/o)和不同浓度的PAP-1存在下与EL-4 B5饲养细胞共培养。DMSO：PAP-1的溶剂(1μM)
使用7.5％的TSN浓度可得到上清液中的最高IgG浓度。
表12：TSN对共培养的影响。7.5％的TSN浓度导致改善的B细胞生长和生产力
通过在96孔板的每孔中使用30,000个饲养细胞，可得到最高的IgG+-孔数和上清液中的IgG浓度的组合。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，每单个沉积的B细胞的饲养细胞数为约30,000。
表13：EL-4 B5饲养细胞的量对共培养的影响
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，所述共培养在具有圆底孔的聚苯乙烯多孔板中进行。在本文报导的所有方法的一个实施方案中，孔的工作客积为50μl至250μl。在一个特定的实施方案中，用从聚合物塑料树脂和两亲性分子的掺合物制备的非纤维基底(substrate)至少部分包被孔，其中所述两亲性分子包含亲水部分和疏水区，其中所述疏水区锚定在基底内且所述亲水部分暴露在基底上。在一个特定的实施方案中，所述两亲性分子选自乙氧基化烷基胺、聚(乙烯亚胺)、辛基德洒明碱(octyldecamine)或其混合物(见例如EP 1 860 181)。
共培养细胞的表征：
为了(定性和定量)测定共培养后分泌的IgG，通常可使用本领域技术人员已知的所有方法，例如ELISA。在本文报导的所有方法的一个实施方案中使用ELISA。在用于测定由鼠B细胞分泌的IgG的一个特定的实施方案中，使用ELISA，所述ELISA中使用抗IgG抗体AB216(捕获抗体)和AB 215(示踪抗体)。在用于测定由仓鼠B细胞分泌的IgG的一个特定的实施方案中使用ELISA，所述ELISA中使用单克隆抗体AB 220(捕获抗体)和AB 213(示踪抗体)。
取决于表征结果，可得到，即选择B细胞克隆。术语“克隆”表示来自/源自单个B细胞的分裂的和分泌抗体的B细胞群。因此，B细胞克隆生产单克隆抗体。
mRNA的分离、克隆和测序：
从B细胞中可分离总mRNA并转录为cDNA。使用特定引物可扩增同源VH-和VL-区编码核酸。通过测序这样得到的核酸，证明得到的抗体大多数(71-95％)是单克隆抗体。从各个B细胞的测序中也可看到，几乎没有得到相同的序列。因此，所述方法提供了结合相同抗原的高度多样性的抗体。
用于扩增VH-编码核酸的引物可用于从来自NMRI-小鼠、亚美尼亚仓鼠、Balb/c-小鼠以及叙利亚仓鼠和兔的细胞中得到的cDNA。
在本文报导的所有方法的一个实施方案中，氨基酸序列来源于扩增的VH-编码核酸，并且通过将氨基酸序列EVQL/QVQL定位至VSS(VH区)和DIVM/DIQM定位至KLEIK(VL区)来鉴定准确的起点和终点。
术语″抗体″表示由一条或多条基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽链组成的蛋白质。识别的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以多种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)，双抗体、单价、二价、三价或四价形式，以及双特异性、三特异性或四特异性形式(例如Huston，J.S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Bird，R.E.，等人，Science 242(1988)423-426；一般而言，Hood等人，Immunology，Benjamin N.Y.，第二版(1984)；和Hunkapiller，T.和Hood，L.，Nature 323(1986)15-16)。
本文还报导了生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供(成熟的)B细胞群(从实验动物的血液中得到)，
b)用至少一种荧光染料(在一个实施方案中用1至3种，或2至3种荧光染料)对B细胞群的细胞进行染色，
c)在单独的容器中(在一个实施方案中，所述容器是多孔板的孔)沉积经染色的B细胞群的单个细胞，
d)在存在饲养细胞和饲养混合物时培养沉积的各个B细胞(在一个实施方案中，饲养细胞是EL-4 B5细胞，在一个实施方案中，饲养混合物是天然的TSN，在一个实施方案中，饲养混合物是合成的饲养混合物)，
e)测定在各个B细胞培养中分泌的抗体的结合特异性，
f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定特异性结合的抗体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体可变轻和重链结构域的编码核酸，
g)将单克隆抗体轻和重链可变结构域的编码核酸引入用于表达抗体的表达盒中，
h)将核酸引入细胞，
i)培养细胞并从细胞或细胞培养物上清液中回收抗体，并从而生产抗体。
″表达盒″指含有必需的调控元件(例如启动子和多聚腺苷酸化位点)的构建体，用于至少表达在细胞中含有的核酸。
“实验动物”表示非人哺乳动物。在一个实施方案中，实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、非人灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
提供以下实施例以帮助理解本发明，本发明的真实范围在随附的权利要求书中示出。应当理解，可以在示出的方法中进行改动而不背离本发明的精神。
实施例
实施例1
培养基和缓冲液：
用于ELISA的封闭缓冲液包含1X PBS和1％BSA。
用于ELISA的包被缓冲液包含4.29g Na2CO3＊10H2O和2.93g NaHCO3，加水至1升的终体积，用2N HCl调为pH 9.6。
用于RNA分离的乙醇溶液包含70％乙醇或80％乙醇。
用于免疫荧光染色的FACS缓冲液包含1X PBS和0.1％BSA。
用于ELISA的IMDM缓冲液包含1X PBS，5％IMDM和0.5％BSA。
用于ELISA的孵育缓冲液1包含1X PBS，0.5％CroteinC。
用于ELISA的孵育缓冲液2包含1X PBS，0.5％CroteinC和0.02％吐温20。
用于ELISA的孵育缓冲液3包含1X PBS，0.1％BSA。
用于ELISA的孵育缓冲液4包含1X PBS，0.5％BSA，0.05％吐温，PBS(10X)，0.01MKH2PO4，0.1M Na2HPO4，1.37M NaCl，0.027M KCl，pH 7.0。
PCR缓冲液包含500mM KCl，15mM MgCl2，100mM Tris/HCl，pH 9.0。
用于ELISA的洗涤缓冲液1包含1X PBS，0.05％吐温20。
用于ELISA的洗涤缓冲液2包含1X PBS，0.1％吐温20。
用于ELISA的洗涤缓冲液3包含水，0.9％NaCl，0.05％吐温20。
EL-4 B5培养基包含RPMI 1640，10％FCS，1％谷氨酰胺/青霉素/链霉素-混合物，2％100mM丙酮酸钠，1％1M HEPES缓冲液。
实施例2
动物护理和免疫
根据德国动物保护法(TierSCHG)以及根据相应的欧洲指导方针饲养实验动物。
接收从6至8周龄的小鼠和仓鼠，并在12周龄以前免疫。抗原首先与完全弗氏佐剂(CFA)一起应用。进一步的应用使用不完全弗氏佐剂(IFA)。皮下应用含有抗原的乳剂，其中取决于接受实验动物的重量，乳剂包含从50至100μg的抗原量。
使用NZW兔(Charles River Laboratories International，Inc.)用于免疫。以1mg/ml的浓度在K3PO4缓冲液pH 7.0中溶解抗原并与完全弗氏佐剂(CFA)混合(1∶1)，直到生成稳定的乳剂。兔接受2ml乳剂的皮内(i.d.)注射，接着以1周间隔分别接受每次1ml的第二次肌肉内(i.m.)注射和第三次皮下(s.c.)注射。2周后进行1ml的第四次肌肉内注射，接着以4周间隔进行另2次皮下注射。
在免疫期间，使用抗原特异性测定来确定血清抗体效价。在1∶10000的IC50的抗体效价处，移取经免疫的动物的血液或脾。为了再活化抗原特异性B细胞，在移取血液或脾之前3天，对实验动物静脉内应用30μg至50μg的抗原。
实施例3
器官、血液和巨噬细胞的移取
通过眼球后静脉穿刺得到小鼠和仓鼠的血液。通过耳静脉或耳动脉(对于较大体积)穿刺得到兔的血液。在第3、4、5和6次免疫后4-6天从兔中收集全血(10ml)，并用于通过FACS的单细胞分选。
通过附着至细胞培养塑料分离巨噬细胞。从小鼠和仓鼠中，通过此方法可从每只动物得到约3*105个巨噬细胞。
如果需要较大量的小鼠或仓鼠巨噬细胞，则分离腹膜巨噬细胞。为此，动物必须至少3个月龄。为了移取腹膜巨噬细胞，处死动物并将5ml温度37℃的EL-4 B5培养基立刻注入腹膜腔。在揉捏动物腹部5分钟后，移取含有细胞的溶液。
实施例4
EL-4 B5细胞的培养
在37℃水浴中快速解冻冷冻的EL-4 B5细胞并用10ml EL-4 B5培养基稀释。在以300x g离心10分钟后弃上清，并在培养基中重悬沉淀。在另一次离心步骤后再次弃上清，并在1ml培养基中重悬沉淀。
以3x 104细胞/ml的细胞密度在175cm2培养瓶中接种EL-4 B5细胞。每2天测定细胞密度并调节为3x 104细胞/ml。细胞具有约12小时的倍增时间且必须在低于5x 105细胞/ml的细胞密度下培养，因为随着更高的细胞密度，细胞的刺激性会丧失。
当总细胞数为约1.5x 109细胞时，通过离心去除培养基。之后用50戈瑞(gray)(5000拉德(rad))辐射细胞。在通过锥虫蓝染色测定活细胞数后，分装5x 106至1x 107的细胞并冷冻在-80℃。
为了共培养，解冻细胞并用EL-4 B5培养基洗两次。为了测定活细胞数，用0.4％(w/v)锥虫蓝溶液以1：10稀释细胞悬浮物，并将10μl混合物转移至牛鲍(Neubauer)计数室中并计算细胞数。
实施例5
密度梯度离心
使用根据制造商的说明书A(-哺乳动物,cedarlane)通过密度梯度分离来实现外周血单核细胞(PBMC)的分离。
用磷酸缓冲盐溶液(PBS)以2∶1稀释吸取的血液。在离心管中提供相同体积的密度分离培养基，并通过管壁小心地加入经稀释的血液。以800x g离心小管20分钟，不制动(braking)。从白色中间层得到淋巴细胞。用10ml PBS补充移取的细胞并以800x g离心10分钟。弃上清并重悬沉淀，洗涤，离心。在PBS中重悬最后的沉淀。
实施例6
红血细胞的低渗裂解
为了通过低渗裂解破坏红血细胞，用水以1∶10稀释氯化铵溶液(BD LyseTM)并以1∶16的比例加至全血。为了裂解红血细胞，将混合物在黑暗中孵育15分钟。为了将细胞碎片从完整细胞中分离，将溶液以800x g离心10分钟。弃上清，在PBS中重悬沉淀，再次洗涤，离心并在PBS中重悬沉淀。
实施例7
从实验动物的内部器官制备细胞
为了制备脾和胸腺细胞，在培养皿中解剖相应的器官，并在PBS中提取细胞。为了移除剩余的组织，将细胞悬浮物过滤通过100μm的筛。为了从脾细胞中得到淋巴细胞，使用密度梯度离心。对胸腺细胞不需要另外的富集步骤。
实施例8
去除巨噬细胞
使用无菌6孔板(细胞培养级)通过非特异性黏附去除巨噬细胞和单核细胞。用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉抗生物素和对照肽包被孔。每个孔加入3ml到最多4ml培养基和最多6x106个来自经免疫的兔的外周血单核细胞，并允许在培养箱中于37℃结合60至90分钟。之后将含有淋巴细胞的上清液转移至离心管并以800x g离心10分钟。在PBS中重悬沉淀。
使用上清中50％的细胞用于淘选步骤；对其余50％细胞直接进行免疫荧光染色和单细胞分选。
实施例9
KLH特异性B细胞的去除
用包被缓冲液在多孔板的孔中室温孵育4毫升含有浓度为2μg/ml的匙孔血蓝蛋白(KLH)的溶液过夜。在去除步骤以前，去除上清液并用PBS洗2次孔。之后将血细胞调节为2x106细胞/ml的细胞密度，并向多孔板的每孔加入3ml。之后将多孔板在37℃孵育60至90分钟。将上清液转移至离心管，并用PBS洗2次孔，并在离心管中组合上清液。通过以800x g离心10分钟沉淀细胞，并在PBS中重悬沉淀。
实施例10
抗原特异性B细胞的富集
用包被缓冲液将相应的抗原稀释至2ug/ml的终浓度。将3ml此溶液加入6-孔多孔板的孔中并在室温孵育过夜。在使用前移除上清液，并用PBS洗2次孔。将B细胞溶液浓度调节为2x 106细胞/ml并向6-孔多孔板的每个孔中加入3ml。在37℃孵育板60至90分钟。移除上清，并用PBS洗孔2至4次。为了回收抗原特异性B细胞，向多孔板的孔加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液，并在37℃孵育10至15分钟。通过加入培养基终止孵育，并将上清液转移至离心管。用PBS洗2次孔，将上清液与其他上清液组合。通过以800x g离心10分钟沉淀细胞。在PBS中重悬沉淀。
实施例11
B细胞和EL-4 B5细胞的共培养
a)在具有圆底的96-孔多孔板中进行共培养。在EL-4 B5培养基中制备包含EL-4B5细胞(1.6x 106细胞/15.2ml)和细胞因子的基础溶液。向多孔板的每个孔加入200μl基础溶液。通过荧光激活的细胞分选向每个孔加入单个B细胞。在加入B细胞后，以300x g离心板5分钟。在37℃孵育板7天。
b)在培养箱中于37℃和5％CO2的大气中，用210μl/孔EL-4 B5培养基在96-孔板中培养单个分选的B细胞和Pansorbin细胞(1∶20000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，德国)，5％兔胸腺细胞上清液和λ-辐射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×104/孔)7天。移取B细胞培养物上清液用于筛选，并立刻收获细胞用于可变区基因克隆或在100μl RLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中冷冻于-80℃。
实施例12
T-细胞的培养
分别从3-4周龄的小鼠和仓鼠，或4-5周龄的兔的胸腺中分离T细胞。将细胞离心并立刻培养或以3x 107细胞的等分试样冷冻。在175cm2培养瓶中以最低细胞密度5x 105细胞/ml的EL-4 B5培养基接种胸腺细胞，并在37℃孵育48小时。
实施例13
巨噬细胞的培养
分别从至少3月龄的小鼠和仓鼠的腹膜腔中分离巨噬细胞。在EL-4 B5培养基中以至少1x 105细胞/ml的细胞密度在175cm2培养瓶中在37℃培养来自小鼠或仓鼠的腹膜腔巨噬细胞，或来自兔的血液单核细胞1.5小时。之后移除培养基并通过用温热的EL-4 B5培养基洗涤来从附着的巨噬细胞中移除未附着的细胞，接着在35ml培养基中培养48小时。
实施例14
T-细胞和巨噬细胞的共培养
在单独的瓶中培养T-细胞和巨噬细胞48小时。在组合两种细胞群以前，以800x g离心T细胞10分钟。弃上清液，并在10ml培养基中重悬细胞沉淀。将T细胞调节至5x 105细胞/ml的最低细胞密度，并对每ml培养基加入10pg佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA)和5ng或50ng植物凝集素M(PHA-M)。移除巨噬细胞的培养基并向含有巨噬细胞的瓶中加入T细胞悬浮物。在共培养36小时后，移取培养基并称之为TSN溶液。为了移除剩余的细胞，使TSN溶液过滤通过0.22μm滤器。以4ml的等分试样将TSN溶液冷冻在-80℃。
实施例15
免疫荧光染色
取决于待染色的细胞数，分别在100μl培养基(少于106个细胞)或200μl培养基(多于106个细胞)中提供细胞。用5％实验动物血清和FACS缓冲液将荧光标记的抗体分别稀释至100μl或200μl的终体积。在辊机架(roller rack)上在4℃黑暗中孵育反应混合物40分钟。孵育后，以300x g，5分钟洗2次细胞。在400μl PBS中重悬沉淀并过滤通过70μm筛。将滤过溶液转移至FACS小管，并在FACS实验开始前通过加入碘化丙啶(6.25μg/ml)直接对死细胞进行染色。如果标记的抗体是用生物素标记的，在第二步中用链霉抗生物素标记的AlexaFlour(R)647(抗体197)检测抗体。
实施例16
IgG的定量
在共培养7天后，以300x g离心进行共培养的96-孔多孔板5分钟。移取150μl上清并用PBS以2∶1的比例在第二块96-孔多孔板中稀释。
如在实施例17中所概述的进行ELISA。
以50ng/ml的浓度使用抗体。如果在5分钟的孵育时间后OD是1或超过1，则检测从0.8至108ng/ml IgG的稀释系列。
实施例17
抗原特异性IgG的检测
可以在关于特异性抗原结合方面表征由单个沉积的和共培养的B细胞或从经免疫的动物得到的B细胞生产的抗体。在室温进行ELISA，并在各个步骤之间在摇床上以20x g孵育ELISA溶液。在第一步中，抗原结合至96-孔多孔板的孔。如果抗原是蛋白质，则其已在包被缓冲液中稀释并直接应用于板。肽抗原通过特异性结合对生物素/链霉抗生物素结合。多孔板的孔可已由制造商用可溶性CroteinC(CrC)包被。如果没有，在抗原固定后用200μl封闭缓冲液孵育孔。在与100μl抗原溶液/孔(预包被的多孔板)或200μl封闭缓冲液分别孵育后，通过用洗涤缓冲液洗涤来移除未结合的抗原或封闭缓冲液。以每孔100μl的体积加入稀释的B细胞上清液并孵育。孵育后洗涤孔。之后以每孔100μl的体积加入检测抗体。抗体可缀合于辣根过氧化物酶或用生物素标记。用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶缀合物测定检测抗体。孵育后洗涤多孔板，然后每孔加入50μl含有3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的底物溶液，并孵育如表X中提供的时间。通过加入50μl硫酸终止酶促反应，使用光度计(RainbowThermo ELISA Reader)和Xread plus-软件在450nm和680nm处测定光密度。
实施例18
核糖核酸(RNA)的分离
首先通过离心沉淀必须分离RNA的细胞。通过加入100μl具有10μl/mlβ-巯基乙醇的RLT-缓冲液来裂解细胞沉淀。通过用移液器多次混合重悬细胞。将溶液转移至多孔板的孔。以200x g短暂震动板并冷冻在-20℃。
使用试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)根据制造商的说明书进行RNA的分离。
实施例19
逆转录聚合酶链式反应
在20μl的体积中进行逆转录。对每个反应进行具有和不具有逆转录酶的对照。每个反应预混合1μl dNTP(每种10mM)，0.4μl寡(dT)12-18(0.2μg)和0.6μl随机六聚体引物(0.03μg)，然后加至8.5μl在H2O中的RNA。在65℃孵育反应混合物5分钟，然后直接转移至冰上。此后预混合2μl RT-缓冲液(10x)，4μl MgCl2(25mM)，2μl DTT(0.1M)和1μl RNAse OutTM(40单位)并加至冰冷的反应混合物。在室温孵育2分钟后，加入0.5μl SuperscriptTM II逆转录酶(25单位)。在室温孵育反应混合物10分钟。
在42℃进行逆转录50分钟。在逆转录后通过在70℃孵育15分钟失活逆转录酶。将cDNA储存在-20℃。
实施例20
聚合酶链式反应
使用Taq PCR Core试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)根据制造商的说明书进行聚合酶链式反应。在20μl的体积中进行PCR。在95℃的温度下将样品转移至
实施例21
测序
所有序列通过SequiServe(Vaterstetten，德国)测定。
实施例22
淘选抗原
a)板的包被
生物素/链霉抗生物素：用0.5-2μg/ml浓度的PBS中的生物素化抗原在室温孵育无菌链霉抗生物素-包被的6-孔板(细胞培养级)1小时。在使用前，用无菌PBS洗板3次。
共价结合的蛋白质：用2μg/ml在碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠,34mM碳酸氢二钠,pH 9.55)中的蛋白质在4℃过夜包被细胞培养6-孔板。在使用前，用无菌PBS洗板3次。
b)淘选肽上的B细胞
在用相应肽包被的6-孔组织培养板上接种至多6x106细胞/4ml培养基，并允许在培养箱中在37℃结合1小时。通过用1x PBS小心地洗涤孔1-2次来去除未黏附的细胞。通过胰蛋白酶在培养箱中在37℃孵育10分钟，然后在培养基中洗2次来脱离剩下的黏连细胞。将细胞维持在冰上，直至免疫荧光染色。

Claims (14)

1.选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)与作为饲养细胞的鼠EL-4B5细胞共培养B细胞群的每个B细胞,所述每个B细胞已沉积为单细胞，
b)选择步骤a)中增殖和分泌抗体的B细胞克隆，
其中在合成的饲养混合物的存在下进行共培养，所述合成的饲养混合物包含IL-1β、TNFα、IL-10和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6的一种或多种。
2.生产与靶抗原结合的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在作为饲养细胞的鼠EL-4B5细胞和作为饲养混合物的IL-1β、TNFα、IL-10和选自IL-21、SAC、BAFF、IL-2、IL-4和IL-6的一种或多种的存在下共培养B细胞群的每个B细胞,所述每个B细胞已在单独的容器中沉积为单细胞，
b)选择生产与靶抗原特异性结合的抗体的B细胞克隆，
c)培养细胞，所述细胞含有编码由步骤b)中选择的B细胞克隆生产的抗体或其人源化变体的核酸，并从细胞或培养上清液回收抗体，并从而生产抗体。
3.根据前述权利要求任一项的方法，所述方法还包括在单细胞沉积以前在共培养培养基中孵育B细胞群的步骤。
4.根据权利要求3的方法，所述方法特征在于孵育为在约37℃进行约1小时。
5.根据权利要求1或2的方法，所述方法还包括在共培养以前离心单细胞沉积的B细胞的步骤。
6.根据权利要求5的方法，所述方法特征在于离心为以约300x g进行约5分钟。
7.根据权利要求1或2的方法，所述方法特征在于B细胞是成熟的B细胞。
8.根据权利要求1或2的方法，所述方法特征在于，对于作为单细胞沉积，B细胞用2或3种荧光染料进行标记。
9.根据权利要求8的方法，所述方法特征在于，对于作为单细胞的沉积，标记0.1％至2.5％的总B细胞群的细胞。
10.根据权利要求1或2的方法，所述方法特征在于B细胞是小鼠B细胞，或仓鼠B细胞，或兔B细胞。
11.根据权利要求1或2的方法，所述方法特征在于在补充了10％(v/v)FCS，包含青霉素和链霉素的1％(w/v)的200mM谷氨酰胺溶液,2％(v/v)的100mM丙酮酸钠溶液,和1％(v/v)的1M 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪)-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液的RPMI 1640培养基中进行共培养。
12.根据权利要求8的方法，所述方法特征在于B细胞是小鼠来源的并且标记是IgG+CD19+-B细胞，和/或IgG-CD138+-B细胞，以及IgG+CD19+-B细胞，和/或IgG-CD138+-B细胞被沉积为单细胞。
13.根据权利要求8的方法，所述方法特征在于B细胞是仓鼠来源的并且标记是IgG+IgM--B细胞，以及IgG+IgM--B细胞被沉积为单细胞。
14.根据权利要求8的方法，所述方法特征在于B细胞是兔来源的并且标记是IgG+-B细胞和/或CD138+-B细胞,或CD138+IgG+-B细胞和/或IgG+IgM--B细胞，以及IgG+-B细胞和/或CD138+-B细胞,或CD138+IgG+-B细胞和/或IgG+IgM--B细胞被沉积为单细胞。
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