BR112012025695B1

BR112012025695B1 - Método de seleção de célula b e método de produção de um anticorpo

Info

Publication number: BR112012025695B1
Application number: BR112012025695-5A
Authority: BR
Inventors: Josef Endl; Basile Siewe; Irmgard Thorey; Josef Platzer; Natalie Schuhmacher; Sonja Offner
Original assignee: F.Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2022-06-21
Also published as: US20160251621A1; EP2400298A1; RU2709531C2; US20180298335A1; US20130084637A1; EP2400298B1; CA3008822C; BR112012025695A2; CA3008822A1; CA2798286A1; HK1212731A1; PL3239708T3; EP3239708A1; JP5779239B2; ES2858450T3; CA2798286C; WO2011147903A1; EP3239708B1; ES2434256T3; KR20130030758A

Abstract

MÉTODO DE SELEÇÃO DE CÉLULA B E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO [001] É relatado no presente um método de obtenção de células B que compreende as etapas a seguir: a. marcação de células B; b. depósito das células B marcadas como células únicas; c. co-cultura das células B depositadas como células únicas com células alimentadoras; e d. seleção de um IgG de secreção e proliferação de células B na e tapa c), de forma a obter uma célula B. A marcação pode ser de células B IgG + CD19 + , células B IgG + CD38 + , células B IgG + CD268 + , células B IgG - CD138 + , células B CD27 + CD138 + ou células B CD3 - CD27 + . O método pode compreender a etapa de incubação das mencionadas células B a 37 °C por uma hora em meio B5 EL-4 antes da etapa de depósito. O método pode também compreender a etapa de centrifugação das mencionadas células B depositadas como células únicas antes da co-cultura. Na co-cultura, pode-se utiliza r uma mistura alimentadora que compreende interleucina 1 beta, fator de necros e tumoral alfa e células de linhagem Staphylococcus aureus Cowan ou BAFF ou interleucina 2 e/ou interleucina 10 e/ou interleucina 6 e/ou interleucina 4.

Description

[001] É relatado no presente um método de obtenção da sequência de aminoácidos de pelo menos dos domínios variáveis de um anticorpo monoclonal secretado por uma célula B única que tenha sido obtida de uma população de células B de um animal experimental por meio de depósito de células únicas e co-cultura com células alimentadoras na presença de uma mistura alimentadora.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Para obter células que secretam anticorpos monoclonais, é amplamente utilizada a tecnologia de hibridoma desenvolvida por Koehler e Milstein. Na tecnologia de hibridoma, entretanto, apenas uma fração das células B obtidas de um animal experimental imunizado pode ser fundida e propagada. A fonte das células B é geralmente um órgão de um animal experimental imunizado, tal como o baço.

[003] Zubler et al começaram em 1984 a desenvolver uma abordagem diferente de obtenção de células secretoras de anticorpos monoclonais (vide, por exemplo, Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183). Nela, as células B são obtidas do sangue do animal experimental imunizado e co-cultivadas com células alimentadoras B5 EL-4 murinas na presença de uma mistura alimentadora que compreende citoquinas. Com esta metodologia, até 50 ng/ml de anticorpo podem ser obtidos após dez a doze dias de co-cultura.

[004] Weitkamp, J-H. et al, (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223237) relatam a geração de anticorpos monoclonais humanos recombinantes para rotavírus de células B específicas de antígenos únicas selecionadas com partículas similares a vírus fluorescentes. Um método de produção de uma série de anticorpos isolados para uma série de antígenos cognatos é relatado em US 2006/0051348. Em WO 2008/144763 e WO 2008/045140, são relatados, respectivamente, anticorpos para IL-6 e seus usos e um método de cultura para obtenção de uma população clonal de células B específicas de antígenos. Um método de cultura para obter uma população clonal de células B específicas de antígenos é relatado em US 2007/0269868. Masri et al (em Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106) relatam a clonagem e expressão em E. coli de um fragmento de Fab funcional obtido de linfócito humano isolado contra toxina anthrax. Um método de preparação de bibliotecas de imunoglobulina é relatado em WO 2007/031550.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] É relatado no presente um método de isolamento de células B de uma população de células B que possuem propriedades especiais. Em primeiro lugar, já em quatro semanas após a primeira imunização de um animal experimental, o anticorpo induzido produtor de células pode ser isolado e a especificidade de ligação dos anticorpos pode ser determinada. Em segundo lugar, é possível aumentar o número e/ou a qualidade (tal como a capacidade de produção/secreção de anticorpos) de células produtoras de anticorpos por meio de qualquer uma das etapas a seguir: i) uma etapa de incubação prévia; e/ou ii) uma etapa de centrifugação; e/ou iii) uma etapa de extração. Em terceiro lugar, a mistura alimentadora utilizada para co-cultura de células B e células alimentadoras pode ser aprimorada por meio da adição de IL-21, IL-6, SAC ou BAFF.

[006] Desta forma, é relatado no presente como um aspecto um método de seleção de células B que compreende as etapas a seguir: a) marcação opcional das células B de uma população de células B; b) co-cultura individual de cada célula B de uma população de células B, que foram depositadas como célula única, com células alimentadoras; e c) seleção de um clone de célula B que prolifera e secreta anticorpo na etapa b).

[007] É adicionalmente relatado no presente como um aspecto um método de obtenção de clones de células B que compreende as etapas a seguir: a) obtenção de células B de um animal experimental; b) marcação das células B; c) depósito das células B marcadas como células únicas; d) co-cultura individual das células B depositadas como células únicas com células alimentadoras; e e) seleção de um clone de célula B que prolifera e secreta o anticorpo na etapa d), de forma a obter um clone de célula B.

[008] É relatado no presente como outro aspecto um método de produção de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo que compreende as etapas a seguir: a) marcação opcional das células de uma população de células B com pelo menos um corante fluorescente; b) cultura de cada célula B de uma população de células B, que foi depositada como célula única em recipientes individuais, na presença de células alimentadoras e uma mistura alimentadora, para obter clones de células B individuais e sobrenadantes de cultura; c) seleção de um clone de célula B produtor de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo; e d) cultura de uma célula que contém um ácido nucleico que codifica o anticorpo que se liga especificamente ao antígeno alvo, que é produzido pelo clone de célula B selecionado na etapa c) ou uma variante humanizada do mesmo e recuperação do anticorpo da célula ou sobrenadante de cultura, de forma a produzir o anticorpo.

[009] Em uma realização, o método compreende uma ou mais das etapas a seguir: após a etapa c): c1) determinação da sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio de cadeia leve variável e o domínio de cadeia pesada variável do anticorpo por uma PCR de transcriptase reversa; após a etapa c1): c2) transfecção de uma célula com um ácido nucleico que compreende a sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio de cadeia leve variável de anticorpo e o domínio de cadeia pesada variável.

[010] Também é relatado no presente como um aspecto um método de produção de um anticorpo que compreende as etapas a seguir: a) fornecimento de uma população de células B (maduras) (obtidas do sangue de um animal experimental); b) marcação das células da população de células B com pelo menos um corante de fluorescência (em uma realização, com um a três ou dois a três corantes de fluorescência); c) depósito de células únicas da população marcada de células B em recipientes individuais (em uma realização, o recipiente é uma cavidade de uma placa com múltiplas cavidades); d) cultura das células B individuais depositadas na presença de células alimentadoras e uma mistura alimentadora (em uma realização, as células alimentadoras são células B5 EL-4, em uma realização a mistura alimentadora é TSN natural e, em uma realização, a mistura alimentadora é uma mistura alimentadora sintética); e) determinação da especificidade de ligação dos anticorpos secretados no meio de cultura das células B individuais; f) determinação da sequência de aminoácidos do domínio de cadeia leve e pesada variável de anticorpos de ligação específica por meio de PCR de transcriptase reversa e sequenciamento de nucleotídeos, de forma a obter um domínio de cadeia leve e pesada variável de anticorpos monoclonais que codifica ácido nucleico; g) introdução do domínio variável de cadeia leve e pesada variável de anticorpo monoclonal que codifica ácido nucleico em um conjunto de expressão para expressão de um anticorpo; h) introdução do ácido nucleico em uma célula; e i) cultura da célula e recuperação do anticorpo da célula ou do sobrenadante de cultura celular, de forma a produzir um anticorpo.

[011] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, o método compreende a etapa de incubação da população de células B no meio de co-cultura antes do depósito de células únicas. Em uma realização, a incubação é realizada a cerca de 37 °C. Em uma realização, a incubação é realizada por 0,5 a duas horas. Em uma realização específica, a incubação é realizada por cerca de uma hora. Em uma realização, a incubação é realizada a cerca de 37 °C por cerca de uma hora.

[012] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, o método compreende a etapa de centrifugação das células B depositadas como células únicas antes da co-cultura. Em uma realização, a centrifugação é realizada por cerca de um minuto a cerca de trinta minutos. Em uma realização específica, a centrifugação é realizada por cerca de cinco minutos. Em uma realização, a centrifugação é realizada a cerca de 100 x g até cerca de 1000 x g. Em uma realização específica, a centrifugação é realizada a cerca de 300 x g. Em uma realização, a centrifugação é realizada por cerca de cinco minutos a cerca de 300 x g.

[013] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, o método compreende, imediatamente antes da etapa de marcação, a etapa a seguir: extração das células B com antígeno imobilizado.

[014] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a população de células B é obtida do sangue de um animal por meio de centrifugação em gradiente de densidade.

[015] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a população de células B é obtida do sangue de um animal experimental quatro dias após a imunização. Em uma outra realização, a população de células B é obtida do sangue de um animal experimental quatro dias até pelo menos nove dias após a imunização. Em uma realização adicional, a população de células B é obtida do sangue de um animal experimental quatro dias até nove dias após a imunização.

[016] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a população de células B é isolada por meio de centrifugação em gradiente de densidade.

[017] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, as células B são células B maduras.

[018] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a marcação é realizada com um a três corantes de fluorescência. Em uma realização específica, a marcação é realizada com dois ou três corantes de fluorescência.

[019] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a marcação das células B resulta em marcação de 0,1% a 2,5% das células da população total de células B.

[020] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, as células B são células B de camundongo, células B de hamster ou células B de coelho.

[021] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, o depósito de células únicas encontra-se nas cavidades de uma placa com múltiplas cavidades.

[022] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, as células alimentadoras são células B5 EL-4 murinas.

[023] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[024] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a marcação é de células B IgG+CD19+, células B IgG+CD38+, células B IgG+CD268+, células B IgG-CD138+, células B CD27+CD138+ ou células B CD3-CD27+

[025] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, as células B são de origem em camundongo e a marcação é de células B IgG+CD19+ e/ou células B IgG-CD138+

[026] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, as células B são de origem em hamster e a marcação é de células B IgG+ IgM-.

[027] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, as células B são de origem em coelho e a marcação é de células B IgG+ e/ou células B CD138+ ou células B CD138+IgG+ e/ou células B IgG+IgM-.

[028] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a co-cultura encontra-se em um meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de FCS, 1% (p/v) de uma solução 200 mM de glutamina que compreende penicilina e estreptomicina, 2% (v/v) de uma solução 100 mM de piruvato de sódio e 1% (v/v) de um tampão 1 M de ácido 2-(4-(2- hidroxietil)-1-piperazina)-etanossulfônico (HEPES). Em outra realização, o meio de co-cultura compreende adicionalmente 0,05 mM de betamercaptoetanol.

[029] Em uma realização de todos os aspectos relatados no presente, a co-cultura das células B é realizado com células alimentadoras e uma mistura alimentadora. Em uma realização, a mistura alimentadora é um sobrenadante de cultura de timócitos natural (TSN) ou uma mistura alimentadora sintética.

[030] Em uma realização específica, a mistura alimentadora é uma mistura alimentadora sintética. Em uma realização, a mistura alimentadora sintética compreende interleucina 1 beta e fator de necrose tumoral alfa. Em uma realização, a mistura alimentadora sintética compreende interleucina 2 (IL-2) e/ou interleucina 10 (IL-10). Em umarealização, a mistura alimentadora sintética compreende ainda células de linhagem Staphylococcus aureus Cowan (SAC). Em uma realização, a mistura alimentadora sintética compreende interleucina 21 (IL-21). Em uma realização, a mistura alimentadora sintética compreende fator de ativação de células B da família de fator de necrose tumoral (BAFF). Em uma realização, a mistura alimentadora sintética compreende interleucina 6 (IL- 6). Em uma realização, a mistura alimentadora sintética compreende interleucina 4 (IL-4).

[031] Em uma realização, a co-cultura é realizada na presença de um sobrenadante de cultura de timócitos como mistura alimentadora. Em uma realização específica, o sobrenadante de cultura de timócitos é obtido a partir de timócitos da glândula timo de um animal jovem.

[032] Em uma realização, o método de obtenção de um clone de célula B compreende adicionalmente a etapa de: f) determinação da sequência de aminoácidos do domínio de cadeia leve e pesada variável do anticorpo produzido pelo clone de célula B selecionado da etapa e) por meio de PCR de transcriptase reversa e sequenciamento de nucleotídeos, de forma a obter uma sequência de domínio variável de aminoácidos de anticorpo monoclonal.

[033] Em uma realização, o animal experimental é selecionado a partir de camundongo, hamster e coelho.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[034] O método relatado no presente permite rápida caracterização da especificidade de ligação de anticorpos monoclonais obtidos de clones de células B individuais, ou seja, em até quatro semanas após a primeira imunização do animal experimental, as células produtoras de anticorpos induzidas podem ser isoladas e a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos com elas pode ser determinada, em que pelo menos quatro experimentos diferentes podem ser realizados devido à quantidade/concentração de anticorpos no sobrenadante de co-cultura de células B.

IMUNIZAÇÃO:

[035] Frequentemente, animais não humanos, tais como camundongos, coelhos, hamsters e ratos, são utilizados como modelos animais para avaliar terapias com base em anticorpos. É frequentemente necessário, portanto, fornecer anticorpos com reação cruzada que se ligam ao antígeno animal não humano, bem como ao antígeno humano. O método relatado no presente pode ser utilizado para fornecer anticorpos com reação cruzada. No método relatado no presente, podem ser utilizadas células B obtidas, por exemplo, de camundongo, hamster e coelho. Em uma realização, o camundongo é um camundongo NMRI ou um camundongo balb/c. Em outra realização, o hamster é selecionado a partir de hamster armeno (Cricetulus migratorius), hamster chinês (Cricetulus griseus) e hamster sírio (Mesocricetulus auratus). Em uma realização específica, o hamster é hamster armênio. Em uma realização, o coelho é selecionado a partir de coelhos brancos da Nova Zelândia (NZW), coelhos Zimmermann (ZIKA), coelhos da linhagem mutante Alicia, coelhos de linhagem mutante da Basileia, coelhos transgênicos com local de imunoglobulina humana, coelhos knockout rbIgM e seus cruzamentos.

[036] Em uma realização, os animais experimentais, tais como camundongos, hamster e coelhos, selecionados para imunização não têm mais de doze semanas de idade.

FONTE E ISOLAMENTO DE CÉLULAS B:

[037] O sangue de um animal experimental fornece alta diversidade de células B produtoras de anticorpos. As células B obtidas a partir dele secretam anticorpos que possuem quase nenhuma sequência de aminoácidos idêntica ou sobreposta nas CDRs, de forma que exibem alta diversidade.

[038] Em uma realização, as células B de um animal experimental, tal como do sangue, são obtidas a partir de quatro dias após a imunização até pelo menos nove dias após a imunização ou o impulso mais recente. Esse período de tempo permite alta flexibilidade do método relatado no presente. Nesse período de tempo, é provável que as células B que fornecem os anticorpos mais afins migrem do baço para o sangue (vide, por exemplo, Paus, D. et al, JEM 203 (2006), 1081-1091; Smith, K. G. S. et al, The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006; Wrammert, J. et al, Nature 453 (2008) 667-672).

[039] Células B do sangue de um animal experimental podem ser obtidas com qualquer método conhecido dos técnicos no assunto. Pode- se utilizar, por exemplo, centrifugação em gradiente de densidade (DGC) ou lise de glóbulos vermelhos do sangue (lise). Centrifugação em gradiente de densidade em comparação com lise hipotônica proporciona rendimento geral mais alto, ou seja, número de clones de células B. Além disso, das células obtidas por meio de centrifugação em gradiente de densidade, um número maior de células divide-se e cresce na etapa de co-cultura. Adicionalmente, a concentração de anticorpo secretado é mais alta em comparação com células obtidas com um método diferente. Em uma realização, portanto, o fornecimento de uma população de células B é realizado por meio de centrifugação em gradiente de densidade. TABELA 1 NÚMERO DE CLONES DE CÉLULAS E CAVIDADES PRODUTORAS DE IGG QUANDO AS CÉLULAS SÃO OBTIDAS POR MEIO DE CENTRIFUGAÇÃO EM GRADIENTE DE DENSIDADE (DGC) OU LISE HIPOTÔNICA DE ERITRÓCITOS

ETAPAS DE SELEÇÃO ANTES DA CO-CULTURA:

[040] Anticorpos produtores de células B que ligam especificamente um antígeno podem ser enriquecidos a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a população de células B é enriquecida a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs).

[041] A expressão “que se liga especificamente” e seus equivalentes gramaticais indicam que o anticorpo se liga ao seu alvo com constante de dissociação (Kd) de 10-7 M ou menos, em uma realização de 10-8 M a 10-13 M, em uma realização adicional de 10-9 M a 10-13 M. A expressão é adicionalmente utilizada para indicar que o anticorpo não se liga especificamente a outras biomoléculas presentes, ou seja, ele se liga a outras biomoléculas com uma constante de dissociação (Kd) de 10-6 M ou mais, em uma realização de 10-6 M a 1 M.

[042] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, as PBMCs são esgotadas de macrófagos. Isso é vantajoso conforme descrito abaixo, tal como em uma realização para células B de origem em coelhos, para a etapa de co-cultura.

[043] Os macrófagos podem ser excluídos de PBMCs por meio de adesão à superfície da placa de cultura celular (vide a etapa de incubação prévia).

[044] Em uma realização dos métodos relatados no presente, as células são de um animal imunizado por proteína e são esgotadas de macrófagos antes da marcação.

[045] Descobriu-se que a incubação da população de células B em meio de co-cultura antes do depósito de células únicas aumenta a quantidade total de células secretoras de anticorpos obtidas após o depósito de células isoladas em comparação com o depósito de uma célula única diretamente após o isolamento e enriquecimento opcional da população de células B do sangue de um animal experimental (exemplo de coelho, vide as Tabelas 2a e 2b). Especificamente, a incubação é realizada a cerca de 37 °C por cerca de uma hora em meio EL-4 B5, utilizando, por exemplo, um incubador da cultura celular. TABELA 2A CLONES DE CÉLULAS E CAVIDADES POSITIVAS DE IGG COM E SEM INCUBAÇÃO POR UMA HORA EM MEIO EL-4 B5 ANTES DO DEPÓSITO DE CÉLULA ÚNICA DE TODAS AS CÉLULAS (RB = COELHO)

TABELA 2B CLONES DE CÉLULAS E CAVIDADES POSITIVAS DE IGG COM E SEM INCUBAÇÃO POR UMA HORA EM MEIO EL-4 B5 ANTES DO DEPÓSITO COMO CÉLULA ÚNICA DE CÉLULAS B

[046] Em uma realização dos métodos relatados no presente, as células são obtidas de um animal imunizado por proteína e esgotado de macrófagos.

[047] Células que não produzem um anticorpo que liga o antígeno ou, de forma similar, células que produzem um anticorpo que se liga ao antígeno podem ser reduzidas ou enriquecidas, respectivamente, utilizando uma abordagem de extração. Um parceiro de ligação é apresentado ligado a uma superfície e as células que se ligam a ele são enriquecidas seletivamente na população celular caso as células ligadas sejam adicionalmente processadas ou reduzidas na população celular caso as células remanescentes na solução sejam adicionalmente processadas.TABELA 3 ENRIQUECIMENTO DE CÉLULAS B QUE SECRETAM UM ANTICORPO ESPECÍFICO DE ANTÍGENO POR MEIO DE EXTRAÇÃO COM O ANTÍGENO CORRESPONDENTE

[048] O método relatado no presente compreende, em uma realização, antes do depósito da célula única, uma etapa de seleção na qual as células B que produzem anticorpos específicos e/ou sem reação cruzada são selecionadas com base em marcadores da superfície celular e seleção/supressão de células ativadas por fluorescência. Em uma realização, células B maduras são classificadas/enriquecidas/selecionadas. Para seleção de células B de diferentes espécies animais experimentais, podem ser utilizados diferentes marcadores da superfície celular. Concluiu-se que muitos dos marcadores da superfície celular disponíveis, seja individualmente ou em combinação, não fornecem marcação apropriada.

[049] Com a marcação de populações de células não alvo e linfócitos de ligação não específicos, é possível esgotar seletivamente essas células. Nesta etapa de esgotamento, pode-se atingir apenas esgotamento incompleto. Embora o esgotamento não seja quantitativo, ele fornece uma vantagem na marcação de fluorescência seguinte das células remanescentes, pois a quantidade de células interferentes pode ser reduzida ou até minimizada. Por meio de depósito de célula única de células B maduras (células B de memória, plasmablastos amadurecidos por afinidade e células de plasma) por meio de seleção de células ativada por fluorescência utilizando a marcação descrita abaixo, pode-se obter um número mais alto de clones celulares por cavidades IgG+ na etapa de co-cultura.

[050] O termo “marcação” indica a presença ou ausência de um marcador de superfície que pode ser determinado por meio da adição de um anticorpo marcador antissuperfície marcado e de ligação específica. Desta forma, a presença de um marcador de superfície é determinada, por exemplo, no caso de uma marca de fluorescência, pela ocorrência de fluorescência, enquanto a ausência de um marcador de superfície é determinada pela ausência de fluorescência após a incubação com o anticorpo marcador antissuperfície marcado e ligado especificamente correspondente.

[051] Diferentes populações celulares podem ser marcadas utilizando diferentes marcadores da superfície, tais como células CD3+ (células T), células CD19+ (células B), células IgM+ (células B nativas maduras), células IgG+ (células B maduras), células CD38+ (tais como plasmablastos) e células IgG+CD38+ (células pré-plasma).

[052] Conforme relatado no presente, desenvolveu-se marcação por imunofluorescência para seleção de células B IgG+ maduras, tais como células B de memória, plasmablastos e células de plasma. Para seleção ou enriquecimento de células B, as células são marcadas únicas, marcadas duplas ou marcadas triplas. Também é necessária uma marcação que resulte em cerca de 0,1% a 2,5% de células marcadas da população celular total. Em uma realização, as células B são depositadas como células únicas selecionadas por meio da marcação de moléculas de superfície presentes sobre 0,1% a 2,5% das células B na população, em outra realização sobre 0,3% a 1,5% das células B da população e, em realização adicional, sobre 0,5% a 1% das células B da população.

[053] As células B IgG+ na população de PBMC 0,5% - 1% podem receber marcação dupla como células CD19+IgG+, células CD38+IgG+ e células CD268+IgG+ Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B CD19+IgG+, células B CD38+IgG+ ou células B CD268+IgG+ são depositadas como células únicas.

[054] Das células B IgG- na população de PBMC, 0,5% a 1% podem receber marcação dupla como células CD138+IgG-. Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B IgG- CD138+ são depositadas como células únicas.

[055] A marcação de células CD27+CD138+ ou células CD3- CD27+ resulta em marcação de cerca de 1,5% das células da população celular, respectivamente. Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B CD27+CD138+ ou células B CD3-CD27+ são depositadas como células únicas.

[056] Das células B de hamster IgG+ na população de PBMC, 0,6% ± 0,1% podem receber marcação dupla como células B de hamster IgG+ IgM-. Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B de hamster IgG+IgM- são depositadas como células únicas.

[057] Em uma realização, células B IgG-CD138+ são depositadas como células únicas das células B obtidas de um animal imunizado. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B IgG+CD19+ são depositadas como células únicas das células B obtidas de um animal não imunizado. Em uma outra realização de todos os métodos relatados no presente, células B IgG+IgM- são depositadas como células únicas das células B obtidas de um animal imunizado ou não imunizado. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B murinas IgG+CD19+ são depositadas como células únicas. Esta etapa de seleção resulta em rendimento aprimorado ou mesmo o mais alto de cavidades de IgG+ na etapa de co-cultura a seguir. Em uma outra realização de todos os métodos relatados no presente, células B murinas IgG-CD138+ são depositadas como células únicas. Com isso, são selecionadas as células produtoras da quantidade mais alta de clones de células B no primeiro lugar e, em segundo lugar, a concentração mais alta de IgG (vide a Tabela 5). Em uma outra realização de todos os métodos relatados no presente, células B murinas IgG+CD19+ e células B murinas IgG-CD138+ são depositadas como células únicas. Em uma realização específica, o método possui a ressalva de que, se as células forem de origem em coelho, a marcação não é de células B IgG+ e/ou células B CD138+.

[058] Células B murina IgG+ podem ser marcadas com o anticorpo anti-IgG de camundong 227 (Ab 227), células B de hamster IgG+ podem ser marcadas com o anticorpo anti-IgG de hamster 213 (AB 213) e/ou anticorpo anti- IgG de hamster 225 (AB 225) e células B de coelho podem ser marcadas com o anticorpo anti-IgG 184 (vide a Tabela 4).

TABELA 4 MARCAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA DE CÉLULAS B

[059] A tabela apresenta a fração marcada média da população de células B murinas (A-E), células B de hamster (F-H) e células B de coelho (I-J).

AB 120 - anticorpo anti-IgG de coelho de cabra Southern Biotech 4030-09 AB 184 - anticorpo Fc anti-IgG de coelho de cabra AbDSerotech STAR121F AB 185 - anticorpo anti-IgG de camundongo de cabra Caltag M35004-3 AB 200 - anticorpo anti-IgM de camundongo de cabra Invitrogen M31504 AB 212 - anticorpo anti-IgG de hamster de cabra AbDSerotech STAR79F AB 213 - anticorpo anti-IgG de hamster de camundongo Becton Dickinson 554010 AB 215 - anticorpo anti-IgG de camundongo de cabra Sigma B 0529 AB 217 - anticorpo anti-IgG de camundongo de cabra AbDSerotech STAR120F AB 218 - anticorpo anti-CD19 de camundongo de rato Abcam ab22480 AB 219 - anticorpo anti-IgM de camundongo de cabra Rockland 710-1607 AB 222 - anticorpo anti-IgG de camundongo de cabra Abcam ab7064 AB 223 - anticorpo anti-IgM de hamster de camundongo Becton Dickinson 554035 AB 224 - anticorpo anti-IgM de hamster de camundongo Becton Dickinson 554033 AB 225 - anticorpo anti-IgG de hamster de camundongo Becton Dickinson 554056 AB 227 - anticorpo anti-IgG de camundongo de cabra Sigma F 8264 PE: ficoeritrina APC: aloficocianina FITC: isotiocianato de fluoresceína

[060] É necessário ressaltar que nem todos os anticorpos disponíveis comercialmente podem ser utilizados para a marcação devido à sua especificidade baixa ou inexistente.

[061] Células B murinas podem ser marcadas com o anticorpo anti- IgG 227 e as células B de hamster podem ser marcadas com o anticorpo anti-IgG 213.

[062] Células B murinas IgG+CD19+ podem ser marcadas com anticorpo 227 e anticorpo 218, células B murinas IgG+IgM- podem ser marcadas com anticorpo 227 e anticorpo 219, células B de hamster IgG+IgM- podem ser marcadas com anticorpo 213 e anticorpo 224, células B de coelho IgG+ podem ser marcadas com anticorpo 184, células B de coelho IgG+ IgM- podem ser marcadas com anticorpo 184 e anticorpo 254 e SA 263, células B de coelho IgG+CD138+ podem ser marcadas com anticorpo 259 e anticorpo 256.

[063] Células B murinas podem ser marcadas com o anticorpo anti-CD27 235 ou 236 (AB 235, AB 236), o anticorpo anti-CD38 192 (AB 192), o anticorpo anti-CD138 233 (AB 233) e o anticorpo anti-CD268 246 (AB 246). TABELA 5 MARCAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA A DETERMINAÇÃO DE CÉLULAS B DE CAMUNDONGO (A-J), HAMSTER (K) E COELHO (L-N)

AB 184 - anticorpo anti-IgG de coelho de cabra AbD Serotec STAR121F AB 189 - anticorpo anti-CD3 de camundongo de hamster Becton Dickinson 553062 AB 192 - anticorpo anti-CD38 de camundongo de rato Becton Dickinson 553764 AB 213 - anticorpo anti-IgG de hamster de camundongo Becton Dickinson 554010 AB 218 - anticorpo anti-CD19 de camundongo de rato Abcam ab22480 AB 224 - anticorpo anti-IgM de hamster de camundongo Becton Dickinson 554033 AB 227 - anticorpo anti-IgG de camundongo de cabra Sigma F 8264 AB 233 - anticorpo anti-CD138 de camundongo de rato - Becton Dickinson - 553714 AB 235 - anticorpo anti-CD27 de camundongo de hamster Becton Dickinson 558754 AB 236 - anticorpo anti-CD27 de camundongo de hamster Becton Dickinson 558753 AB 241 - anticorpo anti-CD3 de camundongo de hamster Becton Dickinson 553060 AB 246 - anticorpo anti-BAFF-R de camundongo de rato eBioscience 51 -5943 AB 254 - anticorpo anti-IgM de coelho de camundongo Becton Dickinson sob encomenda AB 256 - anticorpo anti-IgG de rato de cabra Southern Biotech 3030-09 AB 259 - anticorpo anti-CD138 de coelho de rato Roche Glycart AG SA 263 - estreptavidina Invitrogen S866 A647: Alexa Fluor® 647 FITC: isotiocianato de fluoresceína

[064] Em uma realização, os métodos compreendem a etapa de esgotamento da população de células B de macrófagos e enriquecimento de células B da população de células B secretoras de anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno alvo.

DEPÓSITO DE CÉLULAS ÚNICAS:

[065] O método relatado no presente compreende a etapa de depósito das células B de uma população de células B como células únicas. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, o depósito como células únicas é realizado por meio de seleção de células ativadas por fluorescência (FACS). A marcação necessária para o depósito de células únicas de FACS pode ser conduzida conforme relatado no capítulo anterior.

[066] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B marcadas especificamente são depositadas como células únicas. Em uma realização adicional de todos os métodos relatados no presente, a marcação é uma marcação de marcadores da superfície celular com anticorpos marcados por fluorescência. Em outra realização, os métodos relatados no presente fornecem anticorpos monoclonais. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B maduras são depositadas como células únicas.

[067] Também se descobriu que uma etapa adicional de centrifugação após o depósito de células únicas e antes da co-cultura fornece quantidade maior de células secretoras de anticorpos e aumenta a quantidade do IgG secretado (exemplo de animal experimental com local de imunoglobulina humana, vide a Tabela 6).TABELA 6 CLONES DE CÉLULAS E CAVIDADES POSITIVAS PARA IGG COM E SEM ETAPA DE CENTRIFUGAÇÃO APÓS O DEPÓSITO DE CÉLULAS ÚNICAS

[068] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, o método compreende a etapa de centrifugação das células depositadas únicas antes da co-cultura. Em uma realização específica, a centrifugação é realizada por cerca de cinco minutos a 300 x g.

Co-cultura:

[069] A etapa de co-cultura com células alimentadoras pode ser precedida e também sucedida por uma série de etapas adicionais.

[070] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, as células B depositadas únicas são co-cultivadas com células alimentadoras na presença de uma mistura alimentadora. Em uma realização específica, as células B são co-cultivadas com células alimentadoras B5 EL-4 murinas. Por meio de marcação por imunofluorescência apropriada conforme descrito acima, pode-se atingir aumento do rendimento da etapa de co-cultura (número de cavidades IgG+/clones celulares bem como concentração de IgG) e também enriquecimento ou isolamento de células B IgG+ de PBMCs.

[071] Com o depósito de células únicas de IgG+CD19+ e/ou células B IgG+ CD38+ de PBMCs recém isoladas, pode ser obtido o número mais alto de clones de células e cavidades IgG+ Com o depósito de células únicas de células B IgG+CD19+, IgG+CD38+ e/ou IgG-CD138+ após o esgotamento de macrófagos ou células específicas de KLH (hemocianina de conchas), podem ser obtidos bons resultados. Com o depósito de células únicas de células B IgG+CD19+, IgG+CD38+ e/ou IgG-CD138+ após o esgotamento de células B específicas de antígenos, podem ser obtidos resultados aprimorados. Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B IgG+CD19+, IgG+CD38+ e/ou IgG- CD138+ são depositadas como células únicas.

[072] Descobriu-se que um depósito de célula única com base em marcação conforme descrito acima resulta na fração mais alta de clones de células e cavidades IgG+ e nas cavidades e clones celulares com a concentração de IgG mais alta no sobrenadante. Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B murinas IgG+CD19+ e/ou IgG-CD138+ são depositadas como células únicas. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B de hamster IgG+IgM- são depositadas como células únicas. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, células B de coelho IgG+ e/ou IgG+CD138+ e/ou CD138+ e/ou IgG+IgM- são depositadas como células únicas. TABELA 7 RENDIMENTO DA CO-CULTURA DEPENDENDO DA MARCAÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA

[073] Para células B murinas com o depósito de células únicas de células IgG+CD19+ após cada etapa de enriquecimento (enr.) e/ou esgotamento (esg.), pode ser obtido o número mais alto de clones de células e cavidades IgG+ após a co-cultura. Alternativamente, com o depósito de células IgG-CD138+ como células únicas, podem ser obtidas cavidades e clones celulares com a melhor concentração de IgG no sobrenadante. O depósito de células únicas de células IgG-CD138+ pode ser utilizado para células B de animais imunizados. O depósito de células únicas de células IgG+CD19+ pode ser utilizado para células B de animais não imunizados. O depósito de células únicas de células IgG+ IgM- pode ser utilizado para células B de hamster de animais imunizados e não imunizados. O depósito de células únicas de células B IgG+ e/ou IgG+CD138+ e/ou CD138+ e/ou IgG+ IgM- pode ser utilizado para células B de coelho.

[074] A marcação de imunofluorescência utilizada para células B obtidas do sangue de um animal experimental pode também ser utilizada para marcação de células B obtidas do baço e outros órgãos imunológicos de um animal experimental, tal como camundongo, hamster e coelho. Para células B de camundongos, a fração de células B IgG+ do baço foi de cerca de 0,8% em comparação com 0,4% para células IgG+CD19+ Para células B de hamster, os números correspondentes são 1,9% e 0,5% de células IgG+ IgM-. Para células B derivadas de sangue de coelho, foram encontrados 0,2% de células IgG+ após o esgotamento de macrófagos. Placas Peyer’sche de coelho exibiram 0,4% de células IgG+ e baço exibiram 0,3% de células IgG+ após o esgotamento de macrófagos.

[075] Com os métodos relatados no presente após cerca de 7 (sete) dias, ou seja, após cinco, seis, sete ou oito dias, especialmente após sete ou oito dias, de co-cultura, podem ser obtidas concentrações de anticorpos de cerca de 30 ng/ml até 15 μg/ml ou mais (valor médio de cerca de 500 ng/ml). Com a quantidade de anticorpo fornecida desta forma, pode-se realizar alto número de análises diferentes para caracterizar o anticorpo, tal como com relação à especificidade de ligação, com mais detalhes. Com a caracterização aprimorada do anticorpo neste estágio inicial do processo de seleção, é possível reduzir a quantidade de isolamentos de ácido nucleico necessários e reações de sequenciamento que necessitam ser realizadas. Além disso, o clone de célula B fornece uma quantidade de mRNA que codifica região variável de cadeia leve e pesada monoclonal, permitindo o uso de primer PCR degenerado e elimina a necessidade de primer altamente específico. Adicionalmente, o número de ciclos de PCR necessários é reduzido. Desta forma, em uma realização, o PCR de transcriptase reversa encontra-se com o primer de PCR degenerado para o domínio variável de cadeia leve e pesada.

[076] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a mistura alimentadora é um sobrenadante de cultura de timócitos. Em uma realização específica, o sobrenadante de cultura de timócitos é obtido a partir dos timócitos da glândula timo do animal jovem correspondente. É especialmente apropriado o uso da glândula de timo de animais jovens em comparação com o isolamento de timócitos do sangue de animais adultos. A expressão “animal jovem” indica um animal antes da ocorrência da maturidade sexual. Um hamster jovem, por exemplo, possui idade de menos de seis semanas, especialmente menos de quatro semanas. Um camundongo jovem, por exemplo, possui idade de menos de oito semanas, especialmente menos de cinco semanas.

[077] Devido à origem da mistura de alimentador, que é derivada do sobrenadante de timócitos cultivados (sobrenadante da cultura de timócitos - TSN), ocorrem variações consideráveis entre bateladas. A fim de superar essa variabilidade, foi desenvolvida uma mistura alimentadora sintética que consiste de componentes sintéticos. Uma mistura alimentadora que consiste de IL-1β (interleucina 1 beta), TNFα (fator de necrose tumoral alfa), IL-2 (interleucina 2) e IL-10 (interleucina 10) é conhecida por meio de Tucci, A. et al, J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784.

[078] Relata-se no presente uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B depositadas únicas e células alimentadoras. Também são relatados no presente aditivos específicos de espécies de células B para a mistura alimentadora sintética para aumentar a quantidade de anticorpo secretado pelo clone de célula B correspondente. Simultaneamente, células altamente produtoras contêm mais mRNA que, por sua vez, facilita a transcrição reversa e o sequenciamento do ácido nucleico codificador, tal como com um conjunto de primers não específicos redundantes.

[079] Por meio da adição de SAC (células de linhagem Staphylococcus aureus Cowan, foi utilizado um único lote SAC), o número de células B secretoras de anticorpos e a concentração média de IgG no sobrenadante após a co-cultura podem ser aumentados. Concluiu-se que, para adição de SAC na co- cultura, pode ser definida uma faixa de concentração, pois concentrações reduzidas e aumentadas de SAC reduzem a quantidade de anticorpo secretado. TABELA 8A RESULTADOS DE ELISA HUCK (HUCK = C CAPA HUMANO) OU ELISA RBIGG DE SOBRENADANTES DA CULTURA CELULAR DE CÉLULAS B OBTIDAS DE UM ANIMAL EXPERIMENTAL COM LOCAL IGG HUMANO OU UM COELHO DO TIPO SELVAGEM (NZW) CO-CULTIVADO COM CÉLULAS ALIMENTADORAS B5 EL-4 E TSN COMO MISTURA ALIMENTADORA COM OU SEM ADIÇÃO DE SAC

[080] Pode-se observar que razão SAC de 1:20000 a 1:150000 fornece número mais alto de cavidades IgG+ e clones celulares, em que a razão de 1:50000 a 1:100000 exibe os números mais altos. Em uma realização, a quantidade de SAC adicionada ao meio de cultura é determinada por meio do fornecimento de uma série de diluições e determinação da diluição em que o SAC adicionado fornece o número mais alto de clones celulares e cavidades positivas para IgG.

[081] Observou-se que, por meio da adição de SAC à mistura alimentadora, a co-cultura de células B foi surpreendentemente alterada de tal forma que apenas células B depositadas únicas possuem benefício no crescimento, enquanto o crescimento de células B foi inibido utilizando-se uma mistura de PBL (tais como células B e células T endógenas) para co-cultura. TABELA 8B RESULTADOS DE ELISA HUCK OU ELISA RBIGG DE SOBRENADANTES DE CULTURA CELULAR DE PBLS E CÉLULAS B DEPOSITADAS ÚNICAS CO-CULTIVADAS COM CÉLULAS ALIMENTADORAS B5 EL-4 E TSN COMO MISTURA ALIMENTADORA COM ADIÇÃO DE SAC

[082] Dados adicionais obtidos com diferentes misturas alimentadoras são apresentados nas Tabelas 9 e 10 a seguir.

[083] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B compreende IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 e IL-21 (interleucina 21). Em umarealização de todos os métodos relatados no presente, a mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B compreende IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 e SAC. Em uma realização específica, IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 e IL-21 são IL-1β murino recombinante, TNFα murino, IL-2 murino, IL-10 murino e IL-21 murino.

[084] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B murinas compreende IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α e BAFF. Em uma realização específica, BAFF é adicionado em concentração de 5 ng/ml.

[085] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B de hamster compreende IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α, IL-6 e SAC. Em uma realização específica, IL-6 é adicionada em concentração de 10 ng/ml. Em uma realização específica, SAC é adicionado em razão de 1:75.000. TABELA 9 RESULTADOS DE ELISA RBIGG DE SOBRENADANTES DA CULTURA CELULAR DE CÉLULAS B DE COELHOS CO-CULTIVADAS COM CÉLULAS ALIMENTADORAS B5 EL-4 E DIFERENTES MISTURAS ALIMENTADORAS SINTÉTICAS QUE COMPREENDEM SUBSTÂNCIAS MURINAS RECOMBINANTES EM DIFERENTES COMBINAÇÕES

TABELA 10 CAVIDADES IGG+ DE SOBRENADANTES DA CULTURA CELULAR DE CÉLULAS B DE COELHO CO-CULTIVADAS COM CÉLULAS ALIMENTADORAS B5 EL-4 E TSN OU UMA MISTURA ALIMENTADORA QUE COMPREENDE SUBSTÂNCIAS MURINAS RECOMBINANTES E SAC (RB = COELHO, M = CAMUNDONGO)

[086] Co-cultura de células alimentadoras e células B murinas sem IL-2, sem IL-10, bem como sem IL-2 e IL-10, resulta em aumento do rendimento de cavidades IgG+, embora a concentração de IgG seja reduzida. Sem TNFα, a concentração de IgG também é reduzida. Sem IL-1β, nenhum IgG pode ser encontrado no sobrenadante.

[087] Co-cultura de células B de hamster sem IL-2 ou sem IL- 10, respectivamente, resulta em cavidades IgG+ com concentração de IgG detectável. Por outro lado, em uma co-cultura sem IL-2 e IL-10, quase nenhum crescimento de células B pode ser detectado. Na ausência de TNF- α ou IL-1β, nenhuma secreção de IgG pode ser determinada.

[088] Na presença de células alimentadoras B5 EL-4, pelo menos IL-1β e TNFα são necessários para a co-cultura de células B de camundongo, hamster e coelho. IL-2 e IL-10 podem ser omitidas para a co- cultura de células murinas. Células B de hamster podem ser cultivadas na ausência de IL-2 ou IL-10. Células B de coelho podem ser cultivadas na ausência de IL-2, IL-10 ou IL-6.

[089] Para células B murinas e de hamster, a adição de IL-4 à mistura alimentadora aumenta a quantidade de cavidades IgG+ e clones celulares, bem como a concentração de IgG no sobrenadante. Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a mistura alimentadora para a co-cultura de células B murinas ou de hamster compreende IL-4.

[090] A adição de IL-6 à mistura alimentadora para a co-cultura de células B murinas ou células B de hamster resulta em número maior de cavidades IgG+ e clones celulares ou maior concentração de IgG, respectivamente. Desta forma, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a mistura alimentadora para a co-cultura de células B murinas ou de hamster compreende IL- 6. Em uma realização específica, IL-6 é adicionada em concentração de 50 ng/ml. Em uma realização específica, IL-6 é adicionada em concentração de 10 ng/ml, caso seja necessária alta concentração de IgG. Em uma realização específica, a adição de IL-6 ocorre após três dias de co-cultura das células B selecionadas e células B5 EL-4.

[091] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B e células alimentadoras que compreende IL-1β, TNFα, IL-10 e uma ou mais selecionadas a partir de IL-21, SAC, BAFF, IL-2, IL-4 e IL-6.

[092] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B e células alimentadoras que compreende IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 e SAC.

[093] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B murinas e células alimentadoras que consiste de IL-1β, TNFα e compreende opcionalmente IL-21 e/ou SAC e/ou BAFF e/ou IL-6.

[094] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B murinas e células alimentadoras que compreende IL-1β, IL-2, IL-10, TNFα e BAFF.

[095] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B murinas ou de hamster e células alimentadoras que compreende IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 e IL-6.

[096] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B de hamster e células alimentadoras que consiste de IL-1β, TNFα e IL -2 ou IL-10 e compreende opcionalmente IL-21 e/ou SAC e/ou BAFF.

[097] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B de hamster e células alimentadoras que compreende IL-1β, IL-2, IL-10, TNF-α, IL-6 e SAC.

[098] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B de coelho e células alimentadoras que compreende IL-1β, TNFα, IL-10 e IL-6.

[099] Um aspecto relatado no presente é uma mistura alimentadora sintética para a co-cultura de células B de coelho e células alimentadoras que compreende IL-1β, TNFα, IL-10, IL-6 ou IL-2 e SAC.

[0100] Em uma realização específica, IL-1β, TNFα, IL-2, IL-10 e IL-21 são IL-1β murino recombinante, TNFα murino, IL-2 murino, IL-10 murino e IL-21 murino.

[0101] Em uma realização específica, BAFF é adicionado em concentração de 5 ng/ml.

[0102] Em uma realização específica, IL-6 é adicionada em concentração de 10 ng/ml.

[0103] Em uma realização específica, SAC é adicionado em razão de 1:75.000.

[0104] Em uma realização específica, as células alimentadoras são células B5 EL-4 murinas.

[0105] A adição de um inibidor de um certo canal de potássio (= PAP-1,5-(4-fenóxi butóxi) psoraleno) aumenta surpreendentemente a secreção de rbIgG de células B de forma dependente da concentração sem reduzir o número de clones de células B. Normalmente, uma citoquina que induziu a produtividade de rbIgG pode ser correlacionada com uma redução da quantidade geral de clones de células B. Este não foi o caso com PAP-1. TABELA 11 RESULTADOS DE ELISA RBIGG DE SOBRENADANTES DE CULTURA CELULAR DE CÉLULAS B CO-CULTIVADAS COM CÉLULAS ALIMENTADORAS B5 EL-4 NA PRESENÇA DE TSN E SAC (=SEM) E DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE PAP-1. DMSO: SOLVENTE PARA PAP-1 (1 MM).

[0106] Com concentração de TSN de 7,5%, pode ser obtida a concentração mais alta de IgG no sobrenadante. TABELA 12 INFLUÊNCIA DE TSN SOBRE CO-CULTURA. CONCENTRAÇÃO DE TSN DE 7,5% RESULTA EM MAIOR CRESCIMENTO E PRODUTIVIDADE DE CÉLULAS B.

[0107] Com um número de 30.000 células alimentadoras por cavidade de uma placa com 96 cavidades, pode ser obtido o número mais alto de cavidades IgG+ em combinação com a concentração de IgG no sobrenadante. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, o número de células alimentadoras por célula B depositada única é de cerca de 30.000. TABELA 13 INFLUÊNCIA DA QUANTIDADE DE CÉLULAS ALIMENTADORAS B5 EL-4 SOBRE CO- CULTURA

[0108] A co-cultura encontra-se, em uma realização de todos os métodos relatados no presente, em placas com múltiplas cavidades de poliestireno com cavidades com fundo abaulado. O volume de trabalho das cavidades é, em uma realização de todos os métodos, conforme relatado no presente de 50 μl a 250 μl. Em uma realização específica, as cavidades são revestidas ao menos parcialmente com um substrato não fibroso preparado com uma mistura de resina plástica de polímero e moléculas anfifáticas, em que a molécula anfifática compreende uma porção hidrofílica e uma região hidrofóbica, em que as regiões hidrofóbicas são ancoradas no substrato e as porções hidrofílicas são expostas sobre o substrato. Em uma realização específica, as moléculas anfifáticas são selecionadas a partir de alquilamina etoxilada, póli(etileno imina), octildecamina ou suas misturas (vide, por exemplo, EP 1.860.181).

CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS CO-CULTIVADAS:

[0109] Para a determinação (qualitativa e quantitativa) de IgG secretado após a co-cultura, podem ser utilizados geralmente todos os métodos conhecidos dos técnicos no assunto tais como ELISA. Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, utiliza-se ELISA. Em uma realização específica para determinação de IgG secretado por células B murinas, utiliza-se ELISA com os anticorpos anti-IgG AB 216 (anticorpo de captura) e AB 215 (anticorpo rastreador). Em uma realização específica para determinação de IgG secretado por células B de hamster, utiliza-se ELISA com os anticorpos monoclonais AB 220 (anticorpo de captura) e AB 213 (anticorpo rastreador).

[0110] Dependendo dos resultados de caracterização, pode ser obtido, ou seja, selecionado um clone de célula B. O termo “clone” indica uma população de células B divisoras e secretoras de anticorpo decorrentes/originárias de uma célula B única. Desta forma, um clone de célula B produz um anticorpo monoclonal.

ISOLAMENTO DE MRNA, CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO:

[0111] Das células B, o mRNA total pode ser isolado e transcrito em cDNA. Com primers específicos, pode ser amplificado o ácido nucleico codificador de região VH e VL cognato. Com o sequenciamento do ácido nucleico obtido desta forma, confirmou-se que os anticorpos obtidos são anticorpos monoclonais na maior parte dos casos (71-95%). Pode-se também observar a partir do sequenciamento das células B individuais que quase não são obtidas sequências idênticas. Desta forma, o método fornece anticorpos altamente diversos que se ligam ao mesmo antígeno.

[0112] Os primers utilizados para amplificação do ácido nucleico codificador de VH podem ser empregados para cDNA obtido de células do camundongo NMRI, hamster armênio, camundongo Balb/c, bem como do hamster sírio e do coelho.

[0113] Em uma realização de todos os métodos relatados no presente, a sequência de aminoácidos é derivada do ácido nucleico codificador de VH amplificado e o ponto inicial e final exato é identificado localizando-se as sequências de aminoácidos de EVQL/QVQL para VSS (região VH) e DIVM/DIQM para KLEIK (região VL).

[0114] O termo “anticorpo” indica uma proteína que consiste de uma ou mais cadeias de polipeptídeos substancialmente codificadas por genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os diferentes genes de região constante, bem como a série de genes de região variável de imunoglobulina. Imunoglobulinas podem existir em uma série de formatos, incluindo, por exemplo, Fv, Fab e F(ab)2 bem como cadeias únicas (scFv), diacorpos, formas monovalentes, bivalentes, trivalentes ou tetravalentes, bem como forma biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica (tal como Huston, J. S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1988) 5879-5883; Bird, R. E. et al, Science 242 (1988) 423-426; de forma geral, Hood et al, Immunology, Benjamin N. Y., segunda edição (1984); e Hunkapiller, T. e Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).

[0115] Também é relatado no presente um método de produção de um anticorpo que compreende as etapas a seguir: j) fornecimento de uma população de células B (maduras) (obtidas do sangue de um animal experimental); k) mancha das células da população de células B com pelo menos um corante de fluorescência (em uma realização, com um a três ou dois a três corantes de fluorescência); l) depósito de células únicas da população manchada de células B em recipientes individuais (em uma realização, o recipiente é uma cavidade de uma placa com múltiplas cavidades); m) cultura das células B individuais depositadas na presença de células alimentadoras e uma mistura alimentadora (em uma realização, as células alimentadoras são células B5 EL-4, em uma realização a mistura alimentadora é TSN natural e, em uma realização, a mistura alimentadora é uma mistura alimentadora sintética); n) determinação da especificidade de ligação dos anticorpos secretados na cultura das células B individuais; o) determinação da sequência de aminoácidos do domínio de cadeia leve e pesada variável de anticorpos de ligação específica por meio de PCR de transcriptase reversa e sequenciamento de nucleotídeos, de forma a obter um domínio de cadeia leve e pesada variável de anticorpos monoclonais que codifica ácido nucleico; p) introdução do domínio variável de cadeia leve e pesada de anticorpo monoclonal que codifica ácido nucleico em um conjunto de expressão para expressão de um anticorpo; q) introdução do ácido nucleico em uma célula; e r) cultura da célula e recuperação do anticorpo da célula ou do sobrenadante de cultura celular, de forma a produzir um anticorpo.

[0116] “Conjunto de expressão” designa uma construção que contém os elementos reguladores necessários, tais como promotor e local de poliadenilação, para expressão pelo menos do ácido nucleico contido em uma célula.

[0117] A expressão “animal experimental” indica um mamífero não humano. Em uma realização, o animal experimental é selecionado a partir de rato, camundongo, hamster, coelho, primatas não humanos, carneiros, cães, vacas, galinhas, anfíbios e répteis.

[0118] Os exemplos a seguir são fornecidos para ajudar na compreensão da presente invenção, cujo escopo verdadeiro é definido nas reivindicações anexas. Compreende-se que podem ser realizadas modificações nos procedimentos descritos sem abandonar o espírito da presente invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 MEIOS E TAMPÕES:

[0119] Tampão de bloqueio para ELISA compreende 1X PBS e 1% BSA.

[0120]O tampão de revestimento para ELISA compreende 4,29 g de Na2CO3*10 H2O e 2,93 g de NaHCOa com adição de água até um volume final de um litro, pH 9,6, ajustado com 2N HCl.

[0121]Solução de etanol para isolamento de RNA compreende 70% de etanol ou 80% de etanol.

[0122]Tampão de FACS para manchas de imunofluorescência compreende 1X PBS e 0,1% BSA.

[0123]Tampão IMDM para ELISA compreende 1X PBS, 5% IMDM e 0,5% BSA.

[0124]O tampão de incubação 1 para ELISA compreende 1X PBS, 0,5% CroteinC.

[0125]O tampão de incubação 2 para ELISA compreende 1X PBS, 0,5% CroteinC e 0,02% Tween 20.

[0126]O tampão de incubação 3 para ELISA compreende 1X PBS, 0,1% BSA.

[0127]O tampão de incubação 4 para ELISA compreende 1X PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween, PBS (10X), 0,01 M de KH2PO4, 0,1 M de Na2HPO4, 1,37 M de NaCl, 0,027 M de KCl, pH 7,0.

[0128]Tampão de PCR compreende 500 mM de KCl, 15 mM de MgCl2, 100 mM de Tris/HCl, pH 9,0.

[0129]O tampão de lavagem 1 para ELISA compreende 1X PBS, 0,05% de Tween 20.

[0130]O tampão de lavagem 2 para ELISA compreende 1X PBS, 0,1% de Tween 20.

[0131]O tampão de lavagem 3 para ELISA compreende água, 0,9% de NaCl e 0,05% de Tween 20.

[0132]O meio B5 EL-4 compreende RPMI 1640, 10% FCS, 1% mistura de glutamina, penicilina e estreptomicina, 2% 100 mM piruvato de sódio, 1% 1M tampão HEPES.

EXEMPLO 2 CUIDADO COM ANIMAIS E IMUNIZAÇÃO:

[0133] Os animais experimentais foram mantidos de acordo com a lei alemã de proteção aos animais (TierSCHG), bem como de acordo com as orientações europeias correspondentes.

[0134] Camundongos e hamsters foram recebidos em idade de seis a oito semanas e imunizados antes da idade de doze semanas. O antígeno foi aplicado em primeiro lugar em conjunto com adjuvante de Freud completo (CFA). Aplicações adicionais foram realizadas com adjuvante de Freud incompleto (IFA). A emulsão que contém antígeno foi aplicada por via subcutânea, em que a emulsão compreendia quantidade de 50 a 100 μg de antígeno dependendo do peso do animal experimental receptor.

[0135] Coelhos NZW (Charles River Laboratories International, Inc.) foram utilizados para imunização. O antígeno foi solucionado em tampão K3PO4, pH 7,0, em concentração de 1 mg/ml e misturado (1:1) com adjuvante de Freud completo (CFA) até a geração de emulsão estável. Os coelhos receberam injeção intradérmica (i. d.) de 2 ml de emulsão seguida por segunda injeção intramuscular (i. m.) e terceira subcutânea (s. c.) com 1 ml cada em intervalo de uma semana. A quarta injeção intramuscular de 1 ml foi realizada duas semanas mais tarde, seguida por duas injeções subcutâneas adicionais de 1 ml em intervalo de quatro semanas.

[0136] Durante a imunização, o título de anticorpo de soro foi determinado com um teste específico de antígeno. Em um título de anticorpo com IC50 de 1:10000, o sangue ou o baço do animal imunizado foi removido. Para reativação de células B específicas de antígeno, foram aplicados por via intravenosa 30 μg a 50 μg do antígeno ao animal experimental três dias antes da remoção do sangue ou do baço.

EXEMPLO 3 REMOÇÃO DE ÓRGÃOS, SANGUE E MACRÓFAGOS:

[0137] Sangue de camundongos e hamsters foi obtido por meio de pontuação da veia retrobulbérica. Sangue de coelhos foi obtido por meio de pontuação da veia da orelha ou, para volumes maiores, da artéria da orelha. Sangue integral (10 ml) foi recolhido de coelhos quatro a seis dias após a terceira, quarta, quinta e sexta imunização e utilizado para seleção de células únicas por meio de FACS.

[0138] Macrófagos foram isolados do sangue obtido por meio de ligação a plástico de cultura celular. De camundongos e hamsters, podem ser obtidos cerca de 3 x 105 macrófagos de cada animal por meio desse método.

[0139] Caso fosse necessária uma quantidade maior de macrófagos de camundongo ou hamster, eram isolados macrófagos peritoneais. Para isso, os animais necessitam ter pelo menos três meses de idade. Para a remoção de macrófagos peritoneais, os animais foram sacrificados e 5 ml de meio B5 EL-4 com temperatura de 37 °C foram imediatamente injetados na cavidade peritoneal. Após massagem da barriga do animal por cinco minutos, a solução contendo as células foi removida.

EXEMPLO 4 CULTURA DE CÉLULAS B5 EL-4:

[0140] As células B5 EL-4 congeladas foram descongeladas rapidamente em um banho com água a 37 °C e diluídas com 10 ml de meio B5 EL-4. Após centrifugação a 300 x g por dez minutos, o sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa em meio. Após uma etapa de centrifugação adicional, o sobrenadante foi novamente descartado e a pelota foi novamente suspensa em 1 ml de meio.

[0141] As células B5 EL-4 foram inoculadas em densidade celular de 3 x 104 células/ml em frascos de cultura de 175 m2. A densidade celular foi determinada em dias alternados e ajustada em 3 x 104 células/ml. As células possuem tempo de dobra de cerca de doze horas e necessitam ser cultivadas em densidade celular abaixo de 5 x 105 células/ml, pois, com densidade celular mais alta, as propriedades estimulantes das células são perdidas.

[0142] Quando o número total de células foi de cerca de 1,5 x 109 células, o meio foi removido por meio de centrifugação. Em seguida, as células foram irradiadas com cinza 50 (5000 rad). Após a determinação do número de células viáveis por meio de manchas de azul tripano, 5 x 106 a 1 x 107 células são reunidas em parcelas e congeladas a -80 °C.

[0143] Para co-cultura, as células foram descongeladas e lavadas duas vezes com meio B5 EL-4. Para determinação do número de células viáveis, a suspensão celular é diluída a 1:10 com solução de azul tripano a 0,4% (p/v), 10 μl da mistura são transferidos para uma câmara de contagem Neubauer e o número de células foi contado.

EXEMPLO 5 CENTRIFUGAÇÃO EM GRADIENTE DE DENSIDADE:

[0144] O isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foi efetuado por meio de separação em gradiente de densidade com Lympholyte® de acordo com as instruções do fabricante A (Lympholyte®-mamífero, cedarlane).

[0145] O sangue retirado foi diluído a 2:1 com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em uma ampola de centrifugação, foi fornecido o mesmo volume de meio de separação de densidade e o sangue diluído é cuidadosamente adicionado por meio da parede da ampola. A ampola foi centrifugada por vinte minutos a 800 x g sem frenagem. Os linfócitos foram obtidos da camada provisória branca. As células removidas foram suplementadas com 10 ml de PBS e centrifugadas a 800 x g por dez minutos. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi novamente suspensa, lavada e centrifugada. A pelota final foi novamente suspensa em PBS.

EXEMPLO 6 LISE HIPOTÔNICA DE GLÓBULOS VERMELHOS DO SANGUE:

[0146] Para rompimento de glóbulos vermelhos do sangue por meio de lise hipotônica, uma solução de cloreto de amônio (BD Lyse®) foi diluída a 1:10 com água e adicionada em razão de 1:16 a sangue integral. Para lise dos glóbulos vermelhos do sangue, a mistura foi incubada por quinze minutos no escuro. Para separação de fragmentos celulares de células intactas, a solução foi centrifugada por dez minutos a 800 x g. O sobrenadante foi descartado, a pelota foi novamente suspensa em PBS, novamente lavada, centrifugada e a pelota foi novamente suspensa em PBS.

EXEMPLO 7 PREPARAÇÃO DE CÉLULAS DE ÓRGÃOS INTERNOS DE UM ANIMAL EXPERIMENTAL:

[0147] Para preparação de células do timo e do baço, o órgão correspondente foi dissecado em uma placa de Petri e as células foram absorvidas em PBS. Para remoção de tecido remanescente, a suspensão celular foi filtrada através de uma peneira de 100 μm. Para obtenção de linfócitos das células do baço, empregou-se centrifugação em gradiente de densidade. Para células do timo, nenhuma etapa de enriquecimento adicional foi necessária.

EXEMPLO 8 ESGOTAMENTO DE MACRÓFAGOS:

[0148] Placas com seis cavidades estéreis (grau de cultura celular) foram utilizadas para esgotar macrófagos e monócitos por meio de adesão não específica. Cavidades foram revestidas com KLH (hemocianina de conchas) ou com estreptavidina e os peptídeos controle. Cada cavidade foi cheia com 3 ml até no máximo 4 ml de meio e até 6 x 106 células mononucleares do sangue periférico do coelho imunizado e mantida em ligação por 60 a 90 minutos a 37 °C no incubador. Em seguida, o sobrenadante contendo linfócito foi transferido para uma ampola de centrifugação e centrifugado a 800 x g por dez minutos. A pelota foi novamente suspensa em PBS.

[0149] 50% das células no sobrenadante foram utilizadas para a etapa de extração; os 50% de células restantes foram submetidos diretamente a manchas por fluorescência imune e seleção de células únicas.

EXEMPLO 9 ESGOTAMENTO DE CÉLULAS B ESPECÍFICAS DE KLH:

[0150] Quatro mililitros de uma solução contendo hemocianina de conchas (KLH) foram incubados com tampão de revestimento sob concentração de 2 μg/ml nas cavidades de uma placa com múltiplas cavidades por uma noite à temperatura ambiente. Antes da etapa de esgotamento, o sobrenadante foi removido e as cavidades foram lavadas por duas vezes com PBS. Em seguida, os glóbulos sanguíneos foram ajustados até uma densidade celular de 2 x 106 células/ml e 3 ml são adicionados a cada cavidade de uma placa com múltiplas cavidades. Em seguida, a placa com múltiplas cavidades foi incubada por sessenta a noventa minutos a 37 °C. O sobrenadante foi transferido para uma ampola de centrifugação, as cavidades são lavadas por duas vezes com PBS e os sobrenadantes são combinados na ampola de centrifugação. As células foram peletizadas por meio de centrifugação a 800 x g por dez minutos e a pelota foi novamente suspensa em PBS.

EXEMPLO 10 ENRIQUECIMENTO DE CÉLULAS B ESPECÍFICAS DE ANTÍGENO:

[0151] O antígeno correspondente foi diluído com tampão de revestimento até concentração final de 2 μg/ml. 3 ml desta solução foram adicionados à cavidade de uma placa com múltiplas cavidades de seis cavidades e incubados por uma noite à temperatura ambiente. Antes do uso, o sobrenadante foi removido e as cavidades foram lavadas por duas vezes com PBS. A solução de células B foi ajustada até concentração de 2 x 106 células/ml e 3 ml são adicionados a cada cavidade de uma placa com múltiplas cavidades de seis cavidades. A placa foi incubada por sessenta a noventa minutos a 37 °C. O sobrenadante foi removido e as cavidades foram lavadas por duas a quatro vezes com PBS. Para recuperação das células B específicas de antígeno, 1 ml de uma solução de tripsina e EDTA foi adicionado às cavidades da placa com múltiplas cavidades e incubado por dez a quinze minutos a 37 °C. A incubação foi suspensa por meio de adição de meio e o sobrenadante foi transferido para uma ampola de centrifugação. As cavidades foram lavadas por duas vezes com PBS e os sobrenadantes foram combinados com os demais sobrenadantes. As células foram peletizadas por meio de centrifugação por dez minutos a 800 x g. A pelota foi novamente suspensa em PBS.

EXEMPLO 11 CO-CULTURA DE CÉLULAS B E CÉLULAS B5 EL-4:

[0152] a) A co-cultura foi realizada em placas com múltiplas cavidades de 96 cavidades com fundo abaulado. Foi preparada uma solução base que compreende células B5 EL-4 (1,6 x 106 células/15,2 ml) e citoquinas em meio B5 EL-4. Foram adicionados 200 μl da solução base a cada cavidade da placa com múltiplas cavidades. A cada cavidade, adicionou-se uma célula B única por meio de seleção celular ativada por fluorescência. Após a adição das células B, a placa foi centrifugada por cinco minutos a 300 x g. A placa é incubada por sete dias a 37 °C.

[0153] b) Células B únicas selecionadas foram cultivadas em placas com 96 cavidades com 210 μl/cavidade de meio B5 EL-4 com células Pansorbin (1:20000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemanha), 5% de sobrenadante de timócito de coelho e células de timoma murino B5 EL-4 com irradiação gama (2 x 104/cavidade) por sete dias a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% no incubador. Sobrenadantes de cultura de células B foram removidos para seleção e as células colhidas imediatamente para clonagem genética de região variável ou congeladas a -80 °C em 100 μl de tampão RLT (Qiagen, Hilden, Alemanha).

EXEMPLO 12 CULTURA DE CÉLULAS T:

[0154] As células T foram isoladas do timo de camundongos com três a quatro semanas de idade e hamsters, ou coelhos com quatro a cinco semanas de idade, respectivamente. As células foram centrifugadas e cultivadas imediatamente ou congeladas em parcelas de 3 x 107 células. Os timócitos foram semeados com densidade celular mínima de 5 x 105 células/ml de meio B5 EL-4 em frascos de cultura de 175 cm2 e incubados por 48 horas a 37 °C.

EXEMPLO 13 CULTURA DE MACRÓFAGOS:

[0155] Macrófagos foram isolados da cavidade peritoneal de camundongos e hamsters, respectivamente, com idade de pelo menos três meses. Macrófagos peritoneais de camundongos ou hamsters ou células mononucleares sanguíneas de coelhos foram cultivados em meio B5 EL-4 em densidade celular de pelo menos 1 x 105 células/ml em frascos de cultura de 175 cm2 por uma hora e meia a 37 °C. Em seguida, o meio foi removido e células não fixadas foram removidas dos macrófagos fixados por meio de lavagem com meio B5 EL-4 quente, seguida por cultura por 48 horas em 35 ml de meio.

EXEMPLO 14 CO-CULTURA DE CÉLULAS T E MACRÓFAGOS:

[0156] Células T e macrófagos foram cultivados por 48 horas em frascos separados. Antes da combinação das duas populações celulares, as células T foram centrifugadas por dez minutos a 800 x g. O sobrenadante foi descartado e a pelota celular foi novamente suspensa em 10 ml de meio. As células T foram ajustadas em densidade celular mínima de 5 x 105 células/ml e foram adicionados 10 pg de 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) e 5 ng ou 50 ng de fito-hemaglutinina M (PHA-M) por ml de meio. O meio de cultura foi removido de macrófagos e a suspensão de células T foi adicionada aos frascos contendo macrófagos. Após 36 horas de co-cultura, o meio de cultura foi removido e denominado solução TSN. Para remoção de células restantes, a solução de TSN foi filtrada através de um filtro de 0,22 μm. A solução de TSN foi congelada a -80 °C em parcelas de 4 ml.

EXEMPLO 15 MANCHAS IMUNOFLUORESCENTES:

[0157] Dependendo do número de células a serem manchadas, as células foram fornecidas em 100 μl de meio (menos de 106 células) ou 200 μl de meio (mais de 106 células), respectivamente. O anticorpo marcado fluorescente foi diluído com 5% de soro do animal experimental e tampão FACS até volume final de 100 μl ou 200 μl, respectivamente. A mistura de reação foi incubada sobre uma prateleira rolante por quarenta minutos a 4 °C no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas por duas vezes a 300 x g por cinco minutos. A pelota foi novamente suspensa em 400 μl de PBS e filtrada através de uma peneira de 70 μm. A solução filtrada foi transferida para uma ampola FACS e, diretamente antes do experimento FACS, as células mortas foram manchadas por meio da adição de iodeto de propídio (6,25 μg/ml). Caso o anticorpo marcado fosse marcado com biotina, o anticorpo era detectado em uma segunda etapa com Farinha Alexa® 647 marcada com estreptavidina (anticorpo 197).

EXEMPLO 16 QUANTIFICAÇÃO DE IGG:

[0158] A placa com múltiplas cavidades de 96 cavidades na qual foi realizada a co-cultura foi centrifugada após sete dias de co-cultura a 300 x g por cinco minutos. 150 μl de sobrenadante foram removidos e diluídos em razão de 2:1 com PBS em uma segunda placa com múltiplas cavidades de 96 cavidades.

[0159] ELISA foi realizado conforme descrito no Exemplo 17.

[0160] O anticorpo foi utilizado em concentração de 50 ng/ml. Caso o OD fosse ou excedesse 1 após tempo de incubação de cinco minutos, era testada uma série de diluições de 0,8 a 108 ng/ml de IgG.

EXEMPLO 17 DETECÇÃO DE IGG ESPECÍFICO DE ANTÍGENO:

[0161] Os anticorpos produzidos por células B co-cultivadas e depositadas únicas ou de células B obtidas de um animal experimental imunizado podem ser caracterizados com relação à ligação de antígenos específicos. Realizou-se ELISA à temperatura ambiente e a solução de ELISA foi incubada entre as etapas individuais em um agitador a 20 x g. Na primeira etapa, o antígeno foi ligado às cavidades de uma placa com múltiplas cavidades de 96 cavidades. Se o antígeno fosse uma proteína, ele teria sido diluído em tampão de revestimento e aplicado diretamente à placa. Antígenos de peptídeos foram ligados por meio do par de ligação específico biotina/estreptavidina. As cavidades da placa com múltiplas cavidades podem já ser revestidas com CroteinC solúvel (CrC) pelo fabricante. Caso contrário, as cavidades eram incubadas após a imobilização do antígeno com 200 μl de tampão de bloqueio. Após a incubação com 100 μl de solução de antígeno por cavidade (placa com múltiplas cavidades previamente revestida) ou 200 μl de tampão de bloqueio, respectivamente, antígeno não ligado ou tampão de bloqueio foi removido por meio de lavagem com tampão de lavagem. Os sobrenadantes de células B diluídos foram adicionados em volume de 100 μl por cavidade e incubados. Após a incubação, as cavidades foram lavadas. Em seguida, adicionou-se o anticorpo de detecção em volume de 100 μl por cavidade. O anticorpo pode ser conjugado a peroxidase de rabanete silvestre ou marcado com biotina. O anticorpo de detecção foi determinado com um conjugado de estreptavidina e peroxidase de rabanete silvestre. Após a incubação, a placa com múltiplas cavidades foi lavada e, em seguida, 50 μl de uma solução de substrato contendo 3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina (TMB) foram adicionados por cavidade e incubados por um período conforme fornecido na Tabela X. A reação enzimática foi suspensa por meio da adição de 50 μl de ácido sulfúrico e a densidade ótica foi determinada a 450 nm e 680 nm com um fotômetro (Leitor ELISA Rainbow Thermo) e o software Xread plus.

EXEMPLO 18 ISOLAMENTO DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA):

[0162] As células das quais o RNA necessitava ser isolado foram peletizadas em primeiro lugar por meio de centrifugação. A pelota celular foi lisada por meio da adição de 100 μl de tampão RLT com 10 μl/ml de betamercaptoetanol. As células foram novamente suspensas por meio de mistura múltipla com pipeta. A solução foi transferida para uma cavidade de uma placa com múltiplas cavidades. A placa sofreu choque curto a 200 x g e foi congelada a -20 °C.

[0163] O isolamento do RNA foi realizado com o Kit RNeasy® (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

EXEMPLO 19 REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE DE TRANSCRIÇÃO REVERSA:

[0164] A transcrição reversa foi conduzida em volume de 20 μl.Para cada reação, realizou-se controle com e sem transcriptase reversa. Por reação, 1 μl de dNTP (a 10 mM cada), 0,4 μl de oligo(dT)12-18 (0,2 μg) e 0,6 μl de hexâmero aleatório (0,03 μg) foram previamente misturados e adicionados a 8,5 μl de RNA em H2O. A mistura de reação foi incubada por cinco minutos a 65 °C e transferida diretamente em seguida para gelo. Em seguida, 2 μl de tampão RT (10 x), 4 μl de MgCl2 (25 mM), 2 μl de DTT (0,1 M) e 1 μl de RNAse Out® (40 unidades) foram previamente misturados e adicionados à mistura de reação resfriada com gelo. Após tempo de incubação de dois minutos à temperatura ambiente, foram adicionados 0,5 μl de transcriptase reversa Superscript® II (25 unidades). A mistura de reação foi incubada por dez minutos à temperatura ambiente.

[0165] A tradução foi conduzida por cinquenta minutos a 42 °C. Após a tradução, a transcriptase reversa foi desativada por meio de incubação por quinze minutos a 70 °C. O cDNA foi armazenado a -20 °C.

EXEMPLO 20 REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE:

[0166] A reação em cadeia de polimerase foi conduzida com o Kit Taq PCR Core (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O PCR foi conduzido em um volume de 20 μl. As amostras foram transferidas para o Mastercycler® sob temperatura de 95 °C.

EXEMPLO 21 SEQUENCIAMENTO:

[0167] Todas as sequências foram determinadas por meio de SequiServe (Vaterstetten, Alemanha).

EXEMPLO 22 EXTRAÇÃO DE ANTÍGENO: a) Revestimento de placas.

[0168] Biotina/estreptavidina: placas com seis cavidades revestidas com estreptavidina estéreis (grau de cultura celular) foram incubadas com antígeno biotinilado sob concentração de 0,5 a 2 μg/ml em PBS à temperatura ambiente por uma hora. As placas foram lavadas em PBS estéril três vezes antes do uso.

[0169] Proteína ligada covalentemente: Placas de cultura celular com seis cavidades foram revestidas com 2 μg/ml de proteína em tampão carbonato (0,1 M de bicarbonato de sódio, 34 mM de hidrogênio carbonato dissódico, pH 9,55) por uma noite a 4 °C. As placas foram lavadas em PBS estéril três vezes antes do uso.

b) Extração de células B sobre peptídeos:

[0170] Placas de cultura de tecidos com seis cavidades revestidas com o antígeno correspondente foram semeadas com até 6 x 106 células por 4 ml de meio e mantidas em união por uma hora a 37 °C no incubador. Células não aderentes foram removidas por meio de lavagem cuidadosa das cavidades por uma a duas vezes com 1x PBS. As células aderidas remanescentes foram separadas por tripsina por dez minutos a 37 °C no incubador e lavadas em seguida por duas vezes em meios.

[0171] As células foram mantidas sobre gelo até a formação de manchas por fluroescência imunes.

Claims

1. MÉTODO DE SELEÇÃO DE CÉLULA B, caracterizado por compreender as etapas a seguir: a) co-cultura de cada uma das células B de uma população de células B, que foi depositada como célula única, com células murinas EL-4 B5 como células alimentadoras; b) seleção de um clone de célula B que prolifera e secreta anticorpo na etapa a), em que a co-cultura ocorre na presença de uma mistura alimentadora sintética que compreende IL-1β, TNFα, IL-10, e um ou mais selecionado(s) a partir de IL-21, SAC, BAFF, IL-2, IL-4 e IL-6.

2. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, que se liga a um antígeno alvo, caracterizado por compreender as etapas a seguir: a) co-cultura de cada célula B de uma população de células B, que foi depositada como célula única em um recipiente individual, na presença de células murinas EL-4 B5 como células alimentadoras e IL-1β, TNFα, IL-10, e um ou mais selecionado(s) a partir de IL-21, SAC, BAFF, IL-2, IL-4, e IL-6 como mistura alimentadora; b) seleção de um clone de célula B que produz um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno alvo; b1) determinação da sequência de ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia leve e o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo por uma PCR de transcriptase reversa; b2) transfecção de uma célula com um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucléico que codifica o domínio variável de cadeia leve e o domínio variável de cadeia pesada; c) cultura da célula que contém o ácido nucleico que codifica o anticorpo produzido pelo clone de célula B selecionado na etapa b) ou uma variante humanizada do mesmo, e recuperação do anticorpo a partir da célula ou sobrenadante de cultura, de forma a produzir o anticorpo.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de incubação da população de células B no meio de co-cultura antes do depósito de células únicas.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela incubação ser a 37 °C por uma hora.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de centrifugação das células B depositadas como células únicas antes da co-cultura.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela centrifugação ser por cinco minutos a 300 x g.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelas células B serem células B maduras.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelas células B serem células B de camundongo, ou células B de hamster, ou células B de coelhos.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela co-cultura ser em um meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de FCS, 1% (p/v) de uma solução 200 mM de glutamina que compreende penicilina e estreptomicina, 2% (v/v) de uma solução 100 mM de piruvato de sódio, e 1% (v/v) de um tampão 1 M de ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1- piperazina-etanossulfônico (HEPES).