ES2927905T3

ES2927905T3 - Producción de anticuerpos ex vivo

Info

Publication number: ES2927905T3
Application number: ES14825470T
Authority: ES
Inventors: Helden Paula Maria Wilhelmina Van; Mark Jeroen Kwakkenbos; Hergen Spits; Tim Beaumont
Original assignee: Kling Biotherapeutics BV
Current assignee: Kling Biotherapeutics BV
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2034-12-24
Also published as: AU2014370516A1; BR112016014881B1; JP2017500052A; EP3087177A1; WO2015099534A1; NZ722156A; BR112016014881A2; CN106029873A; EA201691112A1; IL246409A0; BR112016014881A8; CA2934660A1; CA2934660C; IL246409B; EP4141108A1; AU2014370516B9; SG11201605126YA; US20200149007A1; DK3087177T3; HUE060145T2

Abstract

La presente invención proporciona medios y métodos para producir cultivos de células B ex vivo mejorados con un tiempo de duplicación corto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de anticuerpos ex vivo

La invención se relaciona con los campos de la medicina, la biología molecular y la inmunología.

Los cultivos de células B ex vivo son herramientas importantes para producir anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales (mAb) representan múltiples copias idénticas de una sola molécula de anticuerpo, cuyas copias se unen a antígenos con la misma afinidad y promueven las mismas funciones efectoras. Entre los beneficios de los mAbs está su especificidad por el mismo epítopo en un antígeno. Esta especificidad confiere ciertas ventajas clínicas a los mAbs sobre los tratamientos más convencionales al tiempo que ofrece a los pacientes una opción de terapia eficaz, bien tolerada con efectos colaterales generalmente bajos. Además, los mAbs son útiles para la investigación biológica y médica.

Un enfoque convencional para obtener mAbs es la tecnología de hibridomas, en la que una célula B se fusiona con una célula de mieloma con el fin de formar líneas celulares productoras de anticuerpos híbridos (hibridomas). Sin embargo, la tecnología de hibridomas con células B humanas no ha tenido mucho éxito porque los hibridomas resultantes son inestables. Mientras tanto, se ha desarrollado una tecnología mejorada en la que los cultivos de células B ex vivo se producen con una esperanza de vida replicativa prolongada (WO 2007/067046). Esta tecnología involucra a cultivos humanos ex vivo en los que Bcl-6, junto con Blimp-1 y/o un ácido nucleico antiapoptótico, se expresan en las células B. Esto mejora la esperanza de vida replicativa de estas células B. Tílcamente, las células B humanas se cultivan para obtener mAbs humanos. Se prefieren los mAbs humanos para aplicaciones terapéuticas en humanos debido a la menor inmunogenicidad en comparación con los anticuerpos de otras especies. Utilizando la tecnología de WO 2007/067046, se obtienen cultivos de células B humanas ex vivo con un tiempo medio de duplicación de aproximadamente 25-36 horas.

Con el fin de producir comercialmente mAbs de interés, tales como mAbs terapéuticos, es ventajoso usar cultivos de células B en los que las células B tienen un tiempo de duplicación corto. Un tiempo de duplicación corto también es muy importante en enfoques terapéuticos como la terapia del cáncer, por ejemplo, cuando un mamífero no humano se inmuniza con células cancerosas de un paciente, donde después de que las células B específicas del cáncer se extraigan del animal y se utilicen para producción ex vivo de anticuerpos. Dado que tales anticuerpos son un medicamento hecho a medida para cada paciente individual, deben producirse lo más rápido posible para que el paciente pueda comenzar su terapia de Ab lo antes posible. Tales anticuerpos que son específicos para el tumor del individuo no se pueden producir de antemano.

Es uno de los objetos de la presente invención proporcionar medios y métodos para producir mejores cultivos de células B ex vivo con un tiempo de duplicación más corto.

La presente invención proporciona el conocimiento de que los cultivos de células B con un tiempo de duplicación más corto, en comparación con los cultivos de células B divulgados en el documento WO 2007/067046, se obtienen cuando se utilizan células B de conejo. Mientras que las células B comúnmente utilizadas, tales como las células B humanas, las células B murinas y las células B de llama, típicamente tienen un tiempo de duplicación de 25 a 36 horas, los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que los cultivos de células B de conejo se pueden obtener con un tiempo de duplicación de 20 horas o menos. Este conocimiento permite una producción significativamente más rápida de anticuerpos de interés, lo que da como resultado un mayor rendimiento dentro de un marco de tiempo determinado, lo que es particularmente valioso para la producción comercial de anticuerpos y aplicaciones terapéuticas.

En consecuencia, la invención describe el uso de una célula B de conejo para obtener un cultivo de células B ex vivo con un tiempo medio de duplicación de 20 horas o menos. Los cultivos de células B ex vivo de conejo de acuerdo con la presente invención se obtienen típicamente mediante la expresión de Bcl-6 y una molécula de ácido nucleico antiapoptótico en una célula B de conejo. Por lo tanto, se proporciona además un método para obtener un cultivo de células B ex vivo con un tiempo medio de duplicación de 20 horas o menos, comprendiendo el método:

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Bcl-6 en una célula B e

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de una molécula de ácido nucleico antiapoptótico en dicha célula B,

caracterizado porque dicha célula B es una célula B de conejo.

Preferiblemente, los cultivos de células B ex vivo de conejo se producen con un tiempo medio de duplicación de menos de 20 horas. Más preferiblemente, dicho tiempo medio de duplicación es inferior a 19 horas o incluso inferior a 18 horas. Un tiempo de duplicación más corto permite una producción de anticuerpos más rápida y más alta, lo que mejora el tiempo y la eficacia de las pruebas y la detección de un anticuerpo deseado y el aislamiento y/o la identificación de los anticuerpos de interés. Además, si es necesario desarrollar mAb para un paciente individual, el tiempo de duplicación más corto de las células B de conejo permite un inicio más rápido de la terapia de mAb específica del paciente.

Un método de acuerdo con la presente invención, que utiliza células B de conejo, proporciona así la ventaja de que el anticuerpo puede ser obtenido, analizado, identificado, aislado y/o producido ex vivo dentro de un marco de tiempo más corto en comparación con los cultivos de células B humanos, murinos o de llama actualmente conocidos.

El hecho de que la presente invención proporcione un cultivo de células B con un tiempo de duplicación corto proporciona la ventaja de que se puede obtener una cantidad suficiente de anticuerpo en un período de tiempo más corto en comparación con los métodos existentes. Por ejemplo, en un método como se describe en el documento WO 2007/067046 una colección de células B obtenidas de un individuo humano se estabiliza utilizando Bcl-6 y un ácido nucleico antiapoptótico (o compuestos que aumentan la expresión de tales ácidos nucleicos) y posteriormente se cultiva. Esto da como resultado células B humanas estabilizadas, que son capaces tanto de proliferar como de producir anticuerpos. Durante el cultivo, las células B estabilizadas producen anticuerpos, que se secretan en el medio de cultivo. Posteriormente, estos anticuerpos se prueban preferiblemente para una especificidad (y/o afinidad) deseada. Para los procedimientos de prueba actuales, típicamente se requiere una concentración de anticuerpos de al menos 100 ng/ml de medio de cultivo. Después de 15 a 20 días de cultivo de células B humanas estabilizadas, se obtiene dicha concentración mínima de anticuerpos. Por lo tanto, al usar cultivos de células B humanas, el anticuerpo se recolecta al menos 15-20 días después de comenzar el cultivo, típicamente alrededor del día 20. Las células B de llama tienen una tasa de crecimiento similar a la de las células B humanas, por lo que si se usa un cultivo de células B de llama, el anticuerpo también se recolecta típicamente al menos 15-20 días después de comenzar el cultivo. Con las células B murinas, que tienen un tiempo de duplicación más prolongado, se obtienen típicamente anticuerpos con una concentración mínima de 100 ng/ml después de más de 20 días.

Después de probar los anticuerpos, las células B de interés correspondientes a menudo se seleccionan y aíslan para su uso posterior. Dado el hecho de que la prueba de anticuerpos normalmente toma alrededor de tres días, las células B humanas o de llama de interés típicamente se seleccionan y aíslan después de 18-23 días desde el inicio del cultivo de células B, mientras que las células B murino de interés típicamente se seleccionan y aíslan después más de 23 días. Las células B aisladas luego se cultivan adicionalmente. Un cultivo de células B con células B humanas, de llama o murinas de interés se obtiene típicamente después de aproximadamente tres semanas desde el inicio del cultivo de células B. Sin embargo, con un método de acuerdo con la presente invención, ya se obtiene una concentración de anticuerpos de al menos 100 ng/ml después de 11-12 días. Por lo tanto, el anticuerpo ya se puede recolectar 11-12 días después de comenzar el cultivo de células B, mientras que se tenía que mantener un cultivo de células B humanas (o de llama) durante al menos 15-20 días antes de recolectar el anticuerpo. Si el procedimiento de prueba lleva tres días, las células B de conejo de interés se seleccionan y aíslan dentro de los 14-15 días desde el inicio del cultivo de células B, que es significativamente más rápido en comparación con la situación en la que se cultivan células B humanas o murinas. En conclusión, mientras que tipicamente se tarda aproximadamente tres semanas en obtener un cultivo de células B humanas, de llama o murinas que produzca una concentración suficiente de anticuerpo, con el conocimiento de la presente invención, un cultivo de células B con células B de conejo que produzca una concentración suficiente de Ab es ya obtenido después de dos semanas. Esta es una gran ventaja sobre los métodos existentes. Por lo tanto, un aspecto de la invención proporciona un método para obtener anticuerpos, preferiblemente para uso en uno o más ensayos de prueba que requieren una concentración mínima de anticuerpos de al menos 100 ng/ml, comprendiendo el método:

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Bcl-6 en una célula B de conejo;

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de una molécula de ácido nucleico antiapoptótico en dicha célula B;

- cultivar dicha célula B ex vivo; y

- recolectar anticuerpos producidos por dicha célula B dentro de 10-14 días, preferiblemente dentro de 11-12 días. Dichos anticuerpos recogidos se prueban preferiblemente utilizando uno o más ensayos que requieren una concentración mínima de anticuerpos de al menos 100 ng/ml.

Como se describió anteriormente, los anticuerpos obtenidos se usan típicamente para probar una especificidad y/o afinidad deseada. Los métodos de prueba actuales a menudo requieren una concentración mínima de anticuerpos de 100 ng/ml, pero si se utilizan métodos de detección más sensibles, los anticuerpos se pueden recolectar antes. Cualquiera que sea la sensibilidad del método de prueba, usando células B de conejo con un método de acuerdo con la presente invención, la concentración mínima requerida de anticuerpos se obtiene antes en comparación con el uso de células B humanas, de llama o murinas actualmente conocidas, debido a que la concentración de anticuerpos es significativamente más rápida. tiempo de duplicación de las células B de conejo. Por ejemplo, si se requiere una concentración mínima de anticuerpos de solo 30 ng/ml, en lugar de 100 ng/ml, esta concentración generalmente se alcanza usando células B humanas después de 13 a 18 días desde el inicio del cultivo de células B, mientras que un conejo El cultivo de células B solo necesitaría de 9 a 10 días para obtener esta concentración mínima de anticuerpos. Por lo tanto, nuevamente, las pruebas de anticuerpos y el aislamiento de las células B de interés se pueden realizar antes. En la práctica, los inventores actuales obtienen y prueban los anticuerpos de conejo dentro de los 7-14 días desde el comienzo de un cultivo de células B. Antes de la presente invención, ex vivo Cultivos de células B que permiten la prueba de anticuerpos en etapas significativamente más tempranas en comparación con ex vivo no se disponía de cultivos de células B humanas. Por lo tanto, se proporciona además un método para obtener anticuerpos, comprendiendo el método:

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de una molécula de ácido nucleico antiapoptótico en dicha célula B de conejo;

- cultivar dicha célula B ex vivo; y

- recolectar anticuerpos producidos por dicha célula B dentro de 7-14 días, preferiblemente dentro de 9-12 o 9-10 días. Dichos anticuerpos recolectados se prueban preferiblemente utilizando uno o más ensayos que requieren una concentración mínima de anticuerpos de aproximadamente 30 ng/ml.

Como se usa en el presente documento, el término "célula B de conejo" significa una célula B que se ha obtenido de un conejo, o una célula B que se origina a partir de una célula B de conejo. Un ejemplo de células B que se originan a partir de una célula B de conejo es la progenie de una célula B de conejo que se forma después de uno o más ciclos de división celular. Tal progenie, por ejemplo, incluye un cultivo ex vivo de células B de conejo.

Un cultivo de células B de conejo ex vivo es un cultivo que contiene células B de conejo y/o progenie de las mismas. También pueden estar presentes en el cultivo otros tipos de células. Por ejemplo, las células estimuladoras de células B tales como las células L positivas para CD40 y/o las células EL4B5 también están típicamente presentes en un cultivo de células B de acuerdo con la invención. Además, otros tipos de células, que también estaban presentes en una muestra que contenía células B, aún podrían estar presentes en un cultivo de células B. Cuando están presentes en condiciones de cultivo de células B, tales células no B son normalmente menos capaces de proliferar en comparación con las células B, de modo que el número de tales células contaminantes típicamente disminuirá con el tiempo. Preferiblemente, al menos el 70% de las células de un cultivo de células B de conejo son células B de conejo. Más preferiblemente, al menos el 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de las células de dicho cultivo de células B de conejo son células B de conejo. En una realización particularmente preferida, las células B de conejo y las células estimuladoras de células B tales como las células L positivas para CD40 y/o las células EL4B5 son esencialmente los únicos tipos de células presentes en un cultivo de células B de conejo.

Preferiblemente, las células B de un cultivo de células B de conejo de acuerdo con la invención son progenie de una célula B de conejo original, de modo que el cultivo de células B produce anticuerpos monoclonales.

El término "tiempo medio de duplicación" se define aquí como el tiempo medio requerido, a partir de un cultivo con una cierta cantidad original de células B, para obtener un cultivo con un número de células B que es dos veces dicho número de células B originales. Dado que no todas las células B proliferarán exactamente a la misma velocidad, los valores medios se utilizan normalmente para un cultivo de células B en su conjunto.

Bcl-6 codifica un represor transcripcional que se requiere para el desarrollo y la maduración normales de las células B y las células T y que se requiere para la formación de centros germinales. Bcl-6 se expresa en gran medida en las células B del centro germinal, mientras que apenas se expresa en las células plasmáticas. Bcl-6 inhibe la diferenciación de células B activadas en células plasmáticas. En un método de acuerdo con la invención, el producto de expresión de Bcl-6 permanece presente en las células B de conejo de un cultivo ex vivo. La presencia de Bcl-6, junto con la presencia de un ácido nucleico antiapoptótico, prolonga la esperanza de vida replicativa de las células B. La expresión de Bcl-6 se induce, potencia o mantiene preferiblemente mediante la administración de un compuesto promotor de la expresión de Bcl-6 a la(s) célula(s) B de conejo usadas para el cultivo, o mediante el cultivo de células B de conejo en presencia de dicho compuesto.

Por lo tanto, se proporciona además un método de acuerdo con la invención, que comprende:

- proporcionar a dicha célula B de conejo un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-6; y/o

- cultivar dicha célula B de conejo en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-6.

En la técnica se conocen varios compuestos capaces de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-6, o la expresión de un homólogo de conejo de Bcl-6. Tal compuesto comprende, por ejemplo, una proteína Transductora de Señal de Activación y Transcripción 5 (STAT5), o una parte funcional o un derivado funcional de la misma, y/o una secuencia de ácido nucleico que la codifica. STAT5 es un transductor de señal capaz de potenciar la expresión de Bcl-6. Hay dos formas conocidas de STAT5, STAT5a y STAT5b, que están codificadas por dos genes diferentes unidos en tándem. La administración y/o activación de STAT5 da como resultado niveles potenciados de Bcl-6. Por lo tanto, STAT5, o una parte funcional o un derivado funcional del mismo, es capaz de aumentar directamente la expresión de Bcl-6. Por lo tanto, se describe un método de acuerdo con la invención que comprende proporcionar a dicha célula B de conejo STAT5, o una parte funcional o un derivado funcional del mismo, o proporcionar a dicha célula B de conejo una molécula de ácido nucleico que codifica STAT5, o una parte funcional o un derivado funcional del mismo, o cultivar dicha célula B de conejo en presencia de STAT5, o una parte funcional o un derivado funcional del mismo.

La presencia de STAT5 aumenta directamente la cantidad de Bcl-6. También es posible aumentar indirectamente la expresión de Bcl-6. Esto se hace, por ejemplo, regulando la cantidad de un determinado compuesto, que a su vez es capaz de activar directa o indirectamente STAT5 y/o aumentar la expresión de STAT5. Por lo tanto, en una realización se incrementa la expresión y/o actividad de STAT5 endógeno y/o exógeno. Por ejemplo, es posible mejorar indirectamente la expresión de Bcl-6 cultivando una célula B de conejo en presencia de interleucina (IL) 2 y/o IL4 que son capaces de activar STAT5, que a su vez aumenta la expresión de Bcl-6.

Sin embargo, se prefiere proporcionar una célula B de conejo con una molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-6. De esta forma, es posible regular directamente la concentración de Bcl-6 en dicha célula B de conejo. Por lo tanto, también se proporciona un método de acuerdo con la invención que comprende proporcionar dicha célula B de conejo con una molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-6. En una realización, dicha molécula de ácido nucleico es constitutivamente activa, lo que significa que Bcl-6 se expresa continuamente, independientemente de la presencia de un regulador. En otra realización, dicha molécula de ácido nucleico es inducible, lo que significa que su expresión está regulada por al menos un inductor y/o represor. De esta forma, se regula a voluntad la expresión de dicha molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, los sistemas de expresión Tet-On y Tet-Off (por ejemplo, Tet-On® y Tet-Off® Advanced Inducible Gene Expression Systems, Clontech) para la expresión inducible de una secuencia de ácido nucleico de interés. En estos sistemas, la expresión del activador transcripcional (tTA) está regulada por la presencia (Tet-On) o ausencia (Tet-Off) de tetraciclina (TC) o un derivado como la doxiciclina (dox). En principio, el tTA se compone de la Proteína represora Tet de Escherichia coli (TetR) y el dominio de transactivación del virus Herpes simplex VP16. tTA regula la transcripción de una secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control de un elemento sensible a tetraciclina (TRE) que comprende la secuencia de ADN del operador Tet (TetO) y una secuencia promotora, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus humano (hCMV). Una secuencia de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, Bcl6 puede colocarse corriente abajo de este promotor.

En el sistema Tet-off, tTA se une a TRE en ausencia de TC o dox y se activa la transcripción de una secuencia de ácido nucleico de interés, mientras que en presencia de TC o dox tTA no puede unirse a TRE y la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés se inhibe. Por el contrario, el sistema Tet-on utiliza un tTA inverso (rtTA) que solo puede unirse al TRE en presencia de dox. La transcripción de una secuencia de ácido nucleico de interés se inhibe en ausencia de dox y se activa en presencia de dox.

En otra realización, la expresión inducible se ejecuta utilizando un sistema de expresión génica inducible por hormonas tal como, por ejemplo, un sistema de expresión génica inducible por ecdisona (por ejemplo, RheoSwitch®, New England Biolabs) (Christopherson, KS et al. PNAS 89, 6314-8 (1992)). La ecdisona es una hormona esteroide de insecto de, por ejemplo, Drosophila melanogaster. En las células transfectadas con el receptor de ecdisona, se forma un heterodímero que con siste en el receptor de ecdisona (Ecr) y el receptor de retinoides X (RXR) en presencia de un agonista de ecdisona seleccionado de ecdisona, uno de sus análogos, tal como la muristerona A y la ponasterona A, y un agonista de ecdisona no esteroideo. En presencia de un agonista, Ecr y RXR interactúan y se unen a un elemento de respuesta de ecdisona que está presente en un casete de expresión. La expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés que se coloca en un casete de expresión corriente abajo del elemento de respuesta a ecdisona se induce por tanto exponiendo una célula B de conejo a un agonista de ecdisona.

En aún otra realización de la invención, la expresión inducible se ejecuta utilizando un sistema de expresión génica inducible por arabinosa (por ejemplo, el kit pBAD/gIII, Invitrogen) (Guzman, L.M. et al. Bacteriol 177, 4121-4130 (1995)). La arabinosa es un monosacárido que contiene cinco átomos de carbono. En las células transfectadas con el promotor PBAD inducible por arabinosa, la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés situada corriente abajo del PBAD puede inducirse en presencia de arabinosa.

También es posible utilizar (una molécula de ácido nucleico que codifica) una proteína Bcl-6, en donde la actividad de dicho Bcl-6 está regulada por al menos un inductor y/o represor. Un ejemplo no limitativo es una proteína de fusión en la que un elemento regulador se fusiona con una secuencia que codifica al menos parte de Bcl-6. Por ejemplo, un receptor de estrógeno (ER) se fusiona con Bcl-6, lo que da como resultado la proteína de fusión ER-Bcl-6. Esta proteína de fusión es inactiva porque forma un complejo con proteínas de choque térmico en el citosol. Tras la administración del inductor exógeno 4 hidroxi-tamoxifeno (4HT), la proteína de fusión ER-Bcl-6 se disocia de las proteínas de choque térmico, de modo que la parte Bcl-6 de la proteína de fusión se vuelve activa.

Como se usa en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico antiapoptótico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de retrasar y/o prevenir la apoptosis en una célula B de conejo. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico antiapoptótico es capaz de retrasar y/o prevenir la apoptosis en una célula B de conejo de tipo plasmablasto, que es capaz tanto de proliferar como de producir anticuerpos. Preferiblemente, se usa una molécula de ácido nucleico antiapoptótico que comprende una molécula de ácido nucleico exógena. Esto significa que se usa una secuencia de ácido nucleico que no se expresa naturalmente en las células B de conejo, o que se usa una copia adicional de una secuencia de ácido nucleico natural, de modo que la expresión en las células B de conejo resultantes se mejora en comparación con las células B de conejo naturales. Se conocen en la técnica diversas moléculas de ácido nucleico antiapoptótico, por lo que están disponibles diversas realizaciones. Preferiblemente, se usa una molécula de ácido nucleico antiapoptótico que es un miembro antiapoptótico de la familia Bcl-2 porque las proteínas Bcl-2 antiapoptóticas son buenas inhibidoras de la apoptosis en las células B. Muchos procesos que están controlados por la familia Bcl-2 (familia que incluye proteínas tanto pro-apoptóticas como antiapoptóticas) se relacionan con la vía mitocondrial de la apoptosis. Se prefiere el uso de miembros de la familia Bcl-2 antiapoptóticos Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, proteína A1 relacionada con Bcl-2 (también llamada Bcl2-A1 o A1), Bcl-2 como 10 (Bcl2L10) y Mcl-1 porque Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, A1, Bcl2L10 y Mcl-1 generalmente están integrados con la membrana mitocondrial externa. Se unen e inhiben directamente las proteínas proapoptóticas que pertenecen a la familia Bcl-2 para proteger la integridad de la membrana mitocondrial.

Por tanto, una realización preferida proporciona un método de acuerdo con la invención, en el que dicha molécula de ácido nucleico antiapoptótico comprende un gen antiapoptótico de la familia Bcl2, preferiblemente Bcl-xL o Mcl-1 o Bcl-2 o A1 o Bcl-w o Bcl2L10.

En una realización, la expresión de Bcl-xL o Mcl-1 o Bcl-2 o A1 o Bcl-w o Bcl2L10 se induce, potencia o mantiene mediante la administración de al menos un compuesto, capaz de promover la expresión de cualquiera de estos genes antiapoptóticos, a células B de conejo, o cultivando células B de conejo en presencia de dichos compuestos. Por lo tanto, se proporciona además un método de acuerdo con la invención, que comprende:

- proporcionar a dicha célula B de conejo un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-xL y/o Mcl-1 y/o Bcl-2 y/o A1 y/o Bcl-w y/o Bcl2L10; y/o

- cultivar dicha célula B de conejo en presencia de un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-xL y/o Mcl-1 y/o Bcl-2 y/o A1 y/o Bcl-w y/o Bcl2L10.

Preferiblemente, sin embargo, una célula B de conejo está provista de al menos una molécula de ácido nucleico que codifica un gen antiapoptótico de la familia Bcl2, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2, A1, Bcl-w y Bcl2L10. De esta forma, es posible aumentar directamente la cantidad de producto de expresión en dicha célula B de conejo. Por lo tanto, también se proporciona un método de acuerdo con la invención, que comprende proporcionar a dicha célula B de conejo al menos una molécula de ácido nucleico que codifica un gen antiapoptótico de la familia Bcl2, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2, A1, Bclw, Bcl2L10. En una realización, dicha molécula de ácido nucleico es constitutivamente activa, lo que significa que dicha molécula de ácido nucleico se expresa continuamente. En otra realización, dicha molécula de ácido nucleico es inducible, lo que significa que su expresión está regulada por al menos un inductor y/o represor. Los ejemplos no limitativos de sistemas de expresión de ácidos nucleicos inducibles conocidos en la técnica se describen anteriormente en el presente documento.

En una realización particularmente preferida, dicha molécula de ácido nucleico antiapoptótico codifica Bcl-xL o Mcl-1. De acuerdo con la presente invención, una combinación de Bcl-6 y Bcl-xL es particularmente capaz de aumentar la esperanza de vida replicativa de las células B de conejo, formando así cultivos a largo plazo de las células B similares a plasmablastos resultantes. Lo mismo es válido para una combinación de Bcl-6 y Mcl-1. Lo más preferiblemente, dicho ácido nucleico antiapoptótico codifica Bcl-xL.

Otro aspecto de la presente invención resuelve el problema de introducir eficazmente una molécula de ácido nucleico de interés en células B de conejo. Contrariamente a lo esperado, los inventores encontraron que el vector anforretroviral de uso común, que es adecuado para infectar células de roedores tales como células murinas y que, por lo tanto, se esperaba que también fuera capaz de transducir células B de conejo, parecía no transducir células B de conejo de manera eficiente; la eficiencia de transducción de un anfovector 4 días después de la transducción parecía inferior al 1% en células B de conejo. Por lo tanto, los presentes inventores tuvieron que buscar otros vehículos de administración de genes. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que un vehículo de administración de genes que comprende el dominio extracelular de una proteína de envoltura del virus de la leucemia del simio gibón (GALV) es capaz de transducir células B de conejo con una alta eficiencia, típicamente del 80-90% a los 3-5 días después transducción. Esta propiedad fue bastante inesperada, ya que el virus de la leucemia del simio gibón no infecta naturalmente a los conejos. Por lo tanto, no se esperaba que las células de conejo contuvieran un receptor para una proteína de envoltura de GALV; el hallazgo actual fue mera coincidencia. Es de destacar que la eficiencia de transducción de las células B humanas con un vector que contiene el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV es típicamente del 60-70 % a los 4 días después de la transducción, que a menudo es menor que la eficiencia de transducción de las células B de conejo con este vector, a pesar de el hecho de que las células B humanas son células de primate. Esto es sorprendente porque, dado que un simio también es un primate, se esperaba que un vector que contiene una proteína de envoltura basada en GALV fuera más capaz de infectar células de primate en comparación con células de conejo. Es de destacar que las células B murinas no se transducen de hecho de manera eficiente usando un vector que comprende el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, consistente con el hecho de que un virus de la leucemia del simio gibón no infecta a los ratones.

Ahora que se ha proporcionado el conocimiento de la presente invención de que es posible transducir eficientemente células B de conejo utilizando al menos una parte funcional del dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, y que la eficiencia de transducción es incluso mayor que la eficiencia de transducción de células B humanas, nuevas aplicaciones están disponibles. Ahora es posible introducir una molécula de ácido nucleico de interés en células B de conejo con alta eficiencia, lo que es particularmente ventajoso para producir un cultivo de células B de conejo ex vivo de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, una realización preferida de la invención proporciona un método para aumentar la esperanza de vida replicativa de una célula B de conejo, comprendiendo el método: - inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Bcl-6 en una célula B de conejo e

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de al menos un ácido nucleico antiapoptótico en dicha célula B,

caracterizado porque dicha célula B de conejo está provista de una molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-6, y/o con al menos una molécula de ácido nucleico antiapoptótico, a través de la transducción con un vehículo de administración de genes que comprende el dominio extracelular de una proteína de envoltura del virus de la leucemia del simio gibón (GALV), o al menos una parte funcional de dicho dominio extracelular, o a través de la transducción con un vehículo de administración de genes que comprende una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, o a través de transducción con un vehículo de administración de genes que comprende una proteína que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con al menos una parte funcional del dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV. En una realización preferida, dicho dominio extracelular es de una proteína de envoltura de la cepa SEATO de GALV. Dicho dominio extracelular comprende preferiblemente la secuencia

MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNP HQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLES WDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFY VCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKW DQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFY VSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREA PPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTL NATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLT LTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACST GLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREA VSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDS VSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAV RDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL. Preferiblemente, dicha identidad de secuencia es de al menos el 75 %, más preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 81 %, más preferiblemente al menos el 82 %, más preferiblemente al menos el 83 %, más preferiblemente al menos el 84 %, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 86%, más preferiblemente al menos 86%, más preferiblemente al menos 87%, más preferiblemente al menos 88%, más preferiblemente al menos 89%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91% %, más preferiblemente al menos 92 %, más preferiblemente al menos 93 %, más preferiblemente al menos 94 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente 100%.

Como comprenderá la persona experimentada, dicho dominio extracelular, que está ubicado en la superficie (envoltura) de un virus de la leucemia del simio gibón de tipo salvaje para que pueda unirse a una célula huésped, también está preferiblemente ubicado en la superficie (envoltura) de un vehículo de administración de genes para la transducción de células B de conejo. En una realización particularmente preferida, se usa un vector u otro vehículo de administración de genes que comprende una proteína de envoltura que contiene el dominio extracelular y el dominio transmembrana de una proteína de envoltura de GALV que se fusiona con el dominio citoplásmico de una proteína de envoltura anfo. Esto permite una transducción particularmente eficiente de células B de conejo, como se muestra en los Ejemplos.

Por supuesto, ahora que se ha proporcionado el conocimiento de la presente invención, las células B de conejo se pueden transducir con cualquier molécula de ácido nucleico de interés utilizando al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV. Por lo tanto, se proporciona además una célula B de conejo aislada o recombinante unida al dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, o unida a una proteína que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV. Una célula B de conejo aislada o recombinante que se une a través de al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, o a través de una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, a un suministro génico. vehículo también se proporciona adjunto. En una realización preferida, dicho dominio extracelular es de una proteína de envoltura de la cepa SEATO de GALV. Dicho dominio extracelular comprende preferiblemente la secuencia MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNP HQPMTLTWQVLSQTGDWWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLES WDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFY VCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKW DQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFY VSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREA PPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTL NATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLT LTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACST GLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREA VSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDS

VSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAV RDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL. Nuevamente, dicha identidad de secuencia es preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 81%, más preferiblemente al menos 82%, más preferiblemente al menos 83%, más preferiblemente al menos 84%, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 86 %, más preferiblemente al menos 86 %, más preferiblemente al menos 87 %, más preferiblemente al menos 88 %, más preferiblemente al menos 89 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 91 %, más preferiblemente al menos 92 %, más preferiblemente al menos 93 %, más preferiblemente al menos 94 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 96 %, más preferiblemente al menos 97 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99%, más preferiblemente 100%. Dicho vehículo de administración de genes comprende preferiblemente una molécula de ácido nucleico de interés, preferiblemente una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6 y/o una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico. Con dicho vehículo de administración de genes, se puede producir un cultivo estable de células B de conejo de acuerdo con la presente invención. Dicha secuencia de ácido nucleico antiapoptótico es preferiblemente un gen antiapoptótico de la familia Bcl2, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2, A1, Bcl-w, Bcl2L10.

También se proporciona aquí un uso del dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV para introducir una molécula de ácido nucleico de interés en una célula B de conejo, así como el uso de una proteína que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV para introducir una molécula de ácido nucleico de interés en una célula B de conejo. Además, se proporciona un uso de un vehículo de administración de genes que comprende al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, o un vehículo de administración de genes que comprende una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, dicho vehículo de administración de genes que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6, y al menos una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico, para aumentar la esperanza de vida replicativa de una célula B de conejo. En una realización preferida, dicho dominio extracelular es de una proteína de envoltura de la cepa SEATO de GALV. Dicho dominio extracelular comprende preferiblemente la secuencia

MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNP

HQPMTLTWQVLSQTGDWWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLES

WDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFY

VCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKW

DQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFY

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VSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDS

VSKLEDSLTSLSEWLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAV

RDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL.

Una proteína de envoltura quimérica preferida, que también se usa en los Ejemplos, se muestra en la Figura 9. Esta proteína de envoltura quimérica contiene el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV (con la secuencia MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNP HQPMTLTWQVLSQTGDWWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLES WDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFY VCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKW DQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFY VSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREA PPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTL NATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLT LTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACST GLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREA VSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDS VSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAV

RDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL, indicada en negrita en la Figura 9) y el dominio transmembrana de una proteína de envoltura de GALV (con la secuencia STIAGPLLLLLLLLILGPCII, indicada subrayada en la Figura 9), fusionada al dominio citoplásmico de una proteína de envoltura anfo (con la secuencia NRLVQFVKDRISWQALVLTQQYHQLKPIEYEP, indicado en cursiva y subrayado con puntos en la Figura 9). Un vector u otro vehículo de administración de genes que comprende esta proteína de envoltura quimérica preferida es particularmente capaz de introducir una molécula de ácido nucleico de interés en células B de conejo.

Por lo tanto, se proporciona además una célula B de conejo aislada o recombinante unida a una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o a una proteína que comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9 o a una proteína que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9. Una célula B de conejo aislada o recombinante que se une mediante una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o mediante una proteína que comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9 o mediante una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, a un vector u otro vehículo de administración de genes también se proporciona en el presente documento.

Tal vector u otro vehículo de administración de genes es particularmente adecuado para transducir células B de conejo con una molécula de ácido nucleico de interés. Por lo tanto, se proporciona además el uso de una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o una proteína que comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9 o una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, para introducir una molécula de ácido nucleico de interés en una célula B de conejo.

Tal vector u otro vehículo de administración de genes es particularmente adecuado para aumentar la esperanza de vida replicativa de las células B de conejo. Por lo tanto, se proporciona además un método para aumentar la esperanza de vida replicativa de una célula B de conejo, comprendiendo el método:

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Bcl-6 en una célula B de conejo y

caracterizado porque dicha célula B de conejo está provista de una molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-6, y/o con al menos una molécula de ácido nucleico antiapoptótico, a través de la transducción con un vector u otro vehículo de administración de genes que comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o una proteína que comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o una proteína que tiene al menos un 7o % de identidad de secuencia con una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9.

También se proporciona un uso de un vehículo de administración de genes que comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o una proteína que comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, comprendiendo dicho vehículo de administración de genes además una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6, y al menos una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico, para aumentar la esperanza de vida replicativa de una célula B de conejo.

Se enfatiza que, aunque un vehículo de administración de genes basado en GALV es muy adecuado para la transducción eficiente de células B de conejo con una o más moléculas de ácido nucleico de interés, tal como Bcl-6 y una molécula de ácido nucleico antiapoptótico, el uso de un vehículo de administración de genes basado en GALV no es obligatorio para obtener células B de conejo con un tiempo de duplicación corto de 20 horas o menos. También se pueden usar otros vehículos de administración de genes para introducir Bcl-6 y una molécula de ácido nucleico antiapoptótico en células B de conejo (aunque la eficiencia a menudo será menor), para producir células B de conejo con un tiempo de duplicación de 20 horas o más. menos. Siempre que Bcl-6 y una molécula de ácido nucleico antiapoptótico se introduzcan en las células B de conejo, se puede obtener un cultivo de células B de crecimiento rápido, aunque la cantidad más baja de células B de conejo transducidas originalmente puede tardar más en crecer. Una ventaja del uso de un vehículo de administración de genes que puede transducir eficientemente células B de conejo, tal como un vehículo de administración de genes basado en GALV como se describe en este documento, es que se transducirá una mayor proporción de las células B aisladas originalmente, de modo que las células B derivadas de las mismas estarán presentes en el cultivo de células B resultante. Esto da como resultado una mayor diversidad de células B dentro del cultivo de células B en comparación con una situación en la que se usa un vehículo de administración de genes con una eficiencia de transducción más baja, porque en el último caso se transduce una proporción más baja de las células B originales. La presencia de una mayor diversidad de células B dentro del cultivo de células B resultante mejora la posibilidad de aislar una o más células B con una propiedad deseada. Por lo tanto, en principio, cuanto mayor sea la eficiencia de transducción del vehículo de administración de genes, mayor será la diversidad de células B dentro del cultivo de células B resultante.

Con el fin de inducir la expresión en células B de conejo, una molécula de ácido nucleico de interés se une preferiblemente operativamente a un promotor. Los ejemplos no limitantes incluyen un promotor CMV y un promotor CAG. En un aspecto, tal promotor es inducible, lo que significa que su actividad está influenciada por al menos un compuesto, tal como por ejemplo un factor de transcripción.

Como se usa en el presente documento, el término "vehículo de administración de genes" significa cualquier compuesto capaz de transferir una molécula de ácido nucleico a una célula huésped. Ejemplos no limitantes de vehículos de administración de genes incluyen vectores (virales) y plásmidos. El término "vehículo de administración de genes que comprende al menos una parte funcional del dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV" significa un vehículo de administración de genes que comprende al menos parte del dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, en el que dicho dominio extracelular, o dicha parte del mismo, es capaz de unirse a una célula B de conejo para que el ácido nucleico pueda introducirse en dicha célula B de conejo. Como se describió anteriormente en el presente documento, dicho dominio extracelular, o parte del mismo, se localiza preferiblemente en la superficie del vehículo de administración de genes, de modo que pueda unirse a un receptor en una célula B de conejo. Asimismo, si un vehículo de administración de genes de acuerdo con la invención comprende una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con al menos una parte funcional del dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, dicha proteína se ubica preferiblemente en la superficie del vehículo de administración de genes, de tal manera que pueda unirse a un receptor en una célula B de conejo.

El porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos, o el término "% de identidad de secuencia", se define aquí como el porcentaje de residuos en una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos candidata que es idéntica a los residuos en una secuencia de referencia después de alinear las dos secuencias e introduciendo brechas, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad. Los métodos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, "Align 2".

Una proteína de envoltura de GALV es una proteína que está presente de forma natural en la envoltura viral del virus de la leucemia del simio gibón y que está implicada en la infección de las células huésped. La especificidad de la diana está típicamente determinada por la proteína de envoltura. En una realización, dicha proteína de envoltura es de la cepa SEATO de GALV. Los vectores retrovirales que contienen la proteína de envoltura de GALV se conocen en la técnica y se pueden producir usando procedimientos que se usan comúnmente en la técnica de la biología molecular, véase, por ejemplo, Lam et al., 1996.

El término "unido operativamente a un promotor" significa que una secuencia de ácido nucleico de interés está ubicada lo suficientemente cerca de un promotor de tal manera que el promotor pueda influir en la expresión de la misma. Típicamente, tal promotor inducirá o aumentará la expresión de dicho ácido nucleico de interés. El término "actividad de expresión" se refiere a dicha inducción o potenciación de la expresión.

Como se mencionó anteriormente en el presente documento, la presente invención proporciona el conocimiento de que un cultivo de células B de conejo ex vivo se puede obtener con un tiempo medio de duplicación más corto en comparación con los cultivos de células B humanos o murinos actualmente conocidos. Esto es tanto más sorprendente porque en los Ejemplos actuales se usaron compuestos que no son de conejo, tales como una secuencia de ácido nucleico de Bcl-6 humana, IL21 murina y CD40L humana. Como se muestra en los Ejemplos, los presentes inventores transdujeron células B de conejo con una molécula de ácido nucleico que contenía una secuencia Bcl-6 humana y una secuencia Bcl-xL o Mcl-1 humana. Aunque se usaron secuencias humanas y las células de conejo se cultivaron en presencia de IL21 murina y CD40L humana, sorprendentemente las células B de conejo parecían proliferar más rápido y producir más anticuerpos en comparación con las células B humanas y murinas.

Por tanto, de acuerdo con la invención, las células B de conejo proliferan muy bien utilizando compuestos humanos y murinos. Bajo estas condiciones de reacción, las células B de conejo proliferan incluso mejor que las células B humanas y murinas. Esto tiene, entre otras cosas, la ventaja de que las condiciones de reacción utilizadas actualmente para las células B humanas no tienen que ajustarse para las células B de conejo. No hay necesidad de obtener secuencias de IL21 de conejo, CD40 de conejo o ácido nucleico de conejo que codifiquen Bcl-6 o un gen antiapoptótico. En su lugar, pueden usarse compuestos humanos o murinos actualmente disponibles. Por lo tanto, un aspecto de la invención proporciona un método para aumentar la esperanza de vida replicativa de una célula B de conejo, comprendiendo el método:

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Bcl-6 en una célula B de conejo e

caracterizado porque dicha célula B de conejo está provista de al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

* una molécula de ácido nucleico que codifica un Bcl-6 que no es de conejo; y

* una molécula de ácido nucleico antiapoptótico que no es de conejo.

Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico que no es de conejo es una molécula de ácido nucleico humano porque Bcl-6 humano y secuencias antiapoptóticas humanas parecen proporcionar resultados particularmente buenos en células B de conejo. En una realización particularmente preferida, se proporciona a una célula B de conejo una molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-6 humano y a una molécula de ácido nucleico antiapoptótico humano, preferiblemente Bcl-xL humano o Mcl-1 humano o Bcl-2 humano o A1 o Bcl-w humano o Bcl2L10 humano.

Además, se proporciona un método de acuerdo con la invención, que comprende además proporcionar dicha célula B de conejo con IL21 y CD40L. Preferiblemente, se usa IL21 que no es de conejo y/o CD40L que no es de conejo. Preferiblemente, dicha IL21 es IL21 murina o humana, más preferiblemente IL21 murina. En otra realización preferida, dicho CD40L es CD40L murino o humano, más preferiblemente CD40L humano.

Además de aumentar la expresión de Bcl-6 y la expresión de una molécula de ácido nucleico antiapoptótico, también es ventajoso inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Blimp-1 en una célula B de conejo. Esto potencia la producción de anticuerpos de dicha célula B. Por tanto, un aspecto proporciona un método de acuerdo con la invención, en el que el método comprende además inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Blimp-1 en dicha célula B de conejo.

El grado de expresión de Blimp-1 en una célula B de conejo se regula de varias maneras. En una realización, a una célula B de conejo se le proporciona un compuesto que es capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1. Además, o como alternativa, se cultiva una célula B de conejo en presencia de un compuesto capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1. Por lo tanto, se proporciona además un método de acuerdo con la invención, que comprende además:

- proporcionar a dicha célula B de conejo un compuesto capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1; y/o

- cultivar dicha célula B de conejo en presencia de un compuesto capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1.

Dicho compuesto capaz de aumentar la expresión de Blimp-1 comprende más preferiblemente IL21. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, las células B de conejo se cultivan en presencia de IL21, al menos durante parte del tiempo de cultivo.

En otra realización dicho compuesto capaz de incrementar la expresión de Blimp-1 comprende una proteína Transductora de Señal de Activación y Transcripción 3 (STAT3) o una parte funcional o un derivado funcional de la misma, y/o una molécula de ácido nucleico que la codifica. STAT3 es un transductor de señales que participa en el desarrollo y la diferenciación de las células B. STAT3 es capaz de sobrerregular la expresión de Blimp-1. En una realización preferida, se proporciona a una célula B de conejo una molécula de ácido nucleico que codifica STAT3 o una parte funcional o un derivado funcional de la misma, en donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico está regulada por un inductor exógeno del represor, de modo que el grado de la expresión de STAT3 se regula a voluntad. Por ejemplo, se utiliza uno de los sistemas de expresión inducible mencionados anteriormente. En una realización, se usa un producto de fusión que comprende STAT3, o una parte funcional o un derivado funcional, y ER. Por ejemplo, a una célula B de conejo se le proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de estrógeno (ER) y STAT3 como proteína de fusión ER-STAT3. Esta proteína de fusión es inactiva porque forma un complejo con proteínas de choque térmico en el citosol. De esta forma, STAT3 no puede llegar al núcleo y la expresión de Blimp-1 no se potencia. Tras la administración del inductor exógeno 4 hidroxi-tamoxifeno (4HT), la proteína de fusión ER-STAT3 se disocia de las proteínas de choque térmico, de modo que STAT3 es capaz de ingresar al núcleo y activar la expresión de Blimp-1.

Como se usa en el presente documento, una parte funcional de STAT3 se define como un fragmento de STAT3 que tiene la misma capacidad - en especie, no necesariamente en cantidad - de aumentar la expresión de Blimp-1 en comparación con STAT3 natural. Tal parte funcional está, por ejemplo, desprovista de aminoácidos que no están, o están muy poco, implicados en dicha capacidad.

Un derivado funcional de STAT3 se define como una proteína STAT3, que ha sido alterada pero ha mantenido su capacidad - en especie, no necesariamente en cantidad - de aumentar la expresión de Blimp-1. Un derivado funcional se proporciona de muchas formas, por ejemplo mediante la sustitución conservadora de aminoácidos en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido con propiedades generalmente similares (tamaño, hidrofobicidad, etc.), de tal manera que el funcionamiento general no se ve seriamente afectado. Alternativamente, un derivado funcional, por ejemplo, comprende una proteína de fusión con un marcador detectable o con un compuesto inducible.

Dado que STAT3 es capaz de aumentar la expresión de Blimp-1, también es posible aumentar indirectamente la expresión de Blimp-1 mediante la administración de un compuesto capaz de aumentar la actividad y/o expresión de STAT3. En una realización, se proporciona a una célula B de conejo un compuesto que es capaz de potenciar la actividad de STAT3, de modo que la expresión de Blimp-1 se potencia indirectamente.

STAT3 se activa de varias formas. Preferiblemente, STAT3 se activa proporcionando una citoquina a una célula B de conejo. Las citoquinas, al estar implicadas de forma natural en la diferenciación de células B, son muy eficaces para regular las proteínas STAT. Los activadores muy efectivos de STAT3 son IL21 e IL6, pero también se sabe que IL2, IL7, IL10, ⁱL15 e IL27 activan STAT3. Además, los receptores tipo Toll (TLR), que están implicados en la inmunidad innata, también son capaces de activar STAT3. Por lo tanto, una realización proporciona un método de la invención, en el que dicha célula B de conejo se cultiva en presencia de IL21, IL2, IL6, IL7, IL10, IL15 y/o IL27. Lo más preferiblemente se usa IL21, ya que IL21 es particularmente adecuada para potenciar la producción de anticuerpos de cultivos de células B de conejo de acuerdo con la presente invención. IL21 es capaz de sobrerregular la expresión de Blimp-1, incluso cuando BCL6 contrarresta la expresión de Blimp-1.

Además, o alternativamente, se usa una Janus quinasa mutada (JAK), o un homólogo de conejo mutado de una JAK, con el fin de activar STAT3. Naturalmente, una JAK es capaz de fosforilar STAT3 después de haber sido activada por al menos una citoquina. Una Janus quinasa mutada, o un homólogo de conejo mutado de JAK, capaz de activar STAT3 independientemente de la presencia de citoquinas, es particularmente adecuado en un método de acuerdo con la presente invención.

En aún otra realización, la expresión de Blimp-1 aumenta proporcionando a una célula B de conejo una proteína supresora de señalización de citoquinas (SOCS), y/o activando una proteína SOCS dentro de dicha célula. Alternativamente, o adicionalmente, se usa al menos una de las proteínas E E47, E12, E2-2 y HEB para aumentar la expresión de Blimp-1. E47 es un factor de transcripción que pertenece a una familia de proteínas hélice-bucle-hélice, denominadas proteínas E. Hay cuatro proteínas E, E12, E47, E2-2 y HEB, que están involucradas en el desarrollo de los linfocitos. E12 y E47 están codificados por un gen, llamado E2A, que se empalma de manera diferente. Las proteínas E se han descrito como supresores de tumores. Uno de los objetivos específicos de E47 son los genes Socs1 y Socs3.

Por lo tanto, un aspecto proporciona un método de acuerdo con la presente invención, aumentando adicionalmente la expresión de Blimp-1 en una célula B de conejo proporcionando a dicha célula B un compuesto capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1, y/o cultivando dicha célula B celular en presencia de un compuesto capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1, en el que dicho compuesto comprende:

- STAT3 o una parte funcional o un derivado funcional del mismo, y/o

- un compuesto capaz de activar STAT3, y/o

- un compuesto capaz de mejorar la expresión de STAT3, y/o

- IL21, IL2, IL6, IL7, IL10, IL15, IL27, una proteína SOCS, una de las proteínas E E47, E12, E2-2 o HEB, una Janus quinasa mutada y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica STAT3, o un derivado funcional del mismo.

Lo más preferiblemente, dicho compuesto es IL21.

La invención proporciona además células B de conejo aisladas o recombinantes que se pueden obtener con un método de acuerdo con la presente invención. Tales células B de conejo aisladas o recombinantes comprenden preferiblemente una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico exógena y una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-6. Por lo tanto, se proporciona además una célula B de conejo aislada o recombinante, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-6 y una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico exógena. Como se explicó anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico exógena contiene una secuencia de ácido nucleico que no se produce de forma natural en las células B de conejo, o una copia adicional de una secuencia de ácido nucleico de célula B de conejo natural. Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2, A1, Bcl-w y Bcl2L10 son moléculas de ácido nucleico antiapoptótico preferidas. Por lo tanto, un aspecto preferido proporciona una célula B de conejo aislada o recombinante, que comprende una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-6 y una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica Bcl-xL o Mcl-1 o Bcl-2 o A1 o Bcl-w o Bcl2L10.

Dicha secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6 y dicha secuencia de ácido nucleico antiapoptótico exógeno pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico. Alternativamente, estas secuencias están presentes en al menos dos moléculas de ácido nucleico diferentes.

Preferiblemente, se usan secuencias que no son de conejo, como se explicó anteriormente. Por lo tanto, una realización preferida proporciona una célula B de conejo aislada o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico que no es de conejo y una secuencia de ácido nucleico que no es de conejo que codifica Bcl-6. Dicha secuencia de ácido nucleico que no es de conejo contiene preferiblemente secuencias humanas.

En una realización particularmente preferida, se proporciona una célula B de conejo aislada o recombinante que comprende:

- una secuencia de ácido nucleico que codifica la Bcl-6 humana, y

- una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico humano, que codifica preferiblemente Bcl-xL humana o Mcl-1 humana o Bcl-2 humana o A1 humana o Bcl-w humana o Bcl2L10 humana. De nuevo, dicha secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6 y dicha secuencia de ácido nucleico antiapoptótico pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico o, alternativamente, estas secuencias pueden estar presentes en al menos dos moléculas de ácido nucleico diferentes.

La invención también describe cultivos de células B de conejo ex vivo que pueden obtenerse mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Una ventaja importante es el hecho de que ahora se obtienen cultivos de células B ex vivo con un tiempo medio de duplicación corto. Se proporciona por lo tanto un cultivo de células B de conejo ex vivo que tiene un tiempo medio de duplicación de 20 horas o menos. Una realización preferida adicional proporciona un cultivo de células B de conejo ex vivo que comprende células B de conejo de acuerdo con la invención. Dichas células B de conejo comprenden preferiblemente una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6 humana y una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico. También se proporciona un cultivo de células B de conejo ex vivo que comprende células B de conejo en presencia de IL21 que no es de conejo y/o CD40L que no es de conejo. Preferiblemente, dicha IL21 es IL21 murina o humana, más preferiblemente IL21 murina. En otra realización preferida, dicho CD40L es CD40L murino o humano, más preferiblemente CD40L humano.

También se describe un anticuerpo cuando se obtiene por un método de acuerdo con la invención, así como un anticuerpo producido por una célula B de conejo de acuerdo con la invención o por un cultivo de células B de conejo ex vivo de acuerdo con la invención. Tal anticuerpo es particularmente útil para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

La invención se explica adicionalmente en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para aclarar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Transducción de células B

La transferencia de genes a los linfocitos mediante métodos tradicionales como la precipitación con fosfato de calcio, la formación de liposomas o la electroporación es ineficaz pero, lo que es más importante, la integración estable de genes generalmente está ausente. Sin embargo, la transducción viral conduce directamente a la integración estable del gen en el genoma de la célula diana y puede ser muy eficiente si se elige la envoltura del virus adecuada. Tanto las transducciones retrovirales como las lentivirales son adecuadas para una transferencia génica eficiente. Si bien la integración retroviral depende de la división celular, la transducción lentiviral también se puede aplicar a células que no se dividen, como las células B plasmáticas. La preparación a gran escala de retrovirus recombinantes se puede lograr fácilmente mediante el uso de líneas celulares productoras estables, tal como la plataforma de expresión Phoenix (Kinsella y Nolan, 1996). La producción de lentivirus de alto título tiende a ser más engorrosa principalmente debido a la toxicidad de las proteínas y envolturas del virus expresado.

Para los ejemplos actuales, se usó una plataforma basada en el virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), usando bien sea células productoras que expresan la envoltura del virus de la leucemia del simio Gibbon (GALV) o anfotrópicas (Wilson et al., 1995). En nuestro vector basado en GALV, el dominio transmembrana de la proteína de envoltura de la cepa SEATO de GALV se fusionó con el dominio citoplásmico de una proteína de envoltura anfo (Figura 9).

El vector de transferencia se configura de manera que Bcl-6, Bcl-xL y la proteína marcadora de proteína verde fluorescente (GFP) se traducen simultáneamente desde el mismo ARN viral (Figura 8). Este enfoque multicistrónico se logra colocando una secuencia peptídica 2A 'autoescindible' (Szymczak et al., 2004) entre las regiones codificantes BCL-6 y BCL-xL y una Secuencia de Entrada Ribosomal Interna (IRES) corriente arriba del gen informador GFP. Las eficiencias de transducción viral son altas e imparciales.

Generación de células B de conejo inmortalizadas

Las células B de memoria humana se inmortalizaron utilizando la tecnología BCL-6/Bcl-xL descrita por Kwakkenbos et al., 2010 y la solicitud de patente WO 2007/067046. En resumen, se aislaron PBMC de sangre de conejo usando un gradiente de densidad de Ficoll y se tiñeron para la expresión de Ig usando un anticuerpo que reconoce Ig (IgG H+L: cadena pesada de IgG y cadenas ligeras kappa y lambda) a veces en combinación con un anticuerpo específico de IgM. Las células B se aislaron (Ig positiva, o Ig positiva IgM negativa) usando un clasificador FACS y se estimularon en fibroblastos de células L de ratón irradiados con y (50 Gy) que expresan de manera estable CD40L (células CD40L-L, 105 células ml-1) junto con interleucina (IL)-21 de ratón recombinante durante 36-48 horas. Las células se recolectaron y lavaron con medio sin FCS y luego las células se transfirieron a Retronectin® (Takara, Shiga, Japón)- placas de cultivo de tejidos recubiertas donde se transdujeron con un vector retroviral que contenía BCL-6, Bcl-xL y GFP como proteína informadora. Como alternativa, las células se transdujeron con un vector retroviral que contenía BCL-6, Mcl-1 y GFP. Las células B transducidas se mantuvieron en cultivo con células L que expresaban ligando CD40 e IL-21. En la Figura 1 se compara la eficacia de la transducción para los retrovirus GALV y de tipo anfotrópico 4 días después de la transducción. Cuatro días después de la transducción con el retrovirus de tipo anfotrópico, se transdujo el 0.8% de las células en comparación con el 80% de las células después de la transducción con un retrovirus de tipo GALV. Claramente, el retrovirus de tipo GALV es superior al retrovirus de tipo anfotrópico para transducir células B de conejo.

Ejemplo 2

Cultivo de células.

Se mantuvieron células B (2 * 105 células ml-1) en medio de Dulbecco modificado por Iscove (Gibco) que contenía 8% de FBS y penicilina-estreptomicina (Roche) suplementado con interleucina 21 de ratón recombinante (IL-21) (50 ng ml-1) y se cultivaron en fibroblastos de células L de ratón irradiados con ^y(50 Gy) que expresan establemente CD40L (células CD40L-L, 105 células ml-1). Para determinar el tiempo de duplicación celular, las células se cultivaron en placas de 24 pocillos a 50-100.000 células/pocillo junto con células CD40L-L e IL-21. Cada 3-4 días se contaron las células y se transfirieron 50-100.000 células a un pocillo nuevo. En la Figura 2 se representan las curvas de crecimiento para las células B de dos donantes humanos (89 y 93), una muestra de células B de llama (Llama) y una muestra de células B de conejo que se transdujo con un retrovirus tipo GALV que lleva una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia Bcl-6 humana y una Bcl-xL humana (Rb 6XL). También se representa una curva de crecimiento para una muestra de conejo que se transdujo con un retrovirus de tipo GALV que porta una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia Bcl-6 humana y una Mcl-1 humana (Rb 6M). Las células B de conejo transducidas tienen un tiempo medio de duplicación de 19 horas y, por lo tanto, crecen más rápido que las células B humanas o de llama que tienen tiempos de duplicación de entre 26 y 32 horas. Estos tiempos promedio de duplicación se calcularon originalmente determinando el aumento de células B durante varios intervalos de tiempo de 3 a 4 días y promediando los resultados obtenidos. Posteriormente, se calculó el tiempo promedio general de duplicación durante todo el período de cultivo. Esto dio como resultado un tiempo medio de duplicación de las células B de conejo transducidas de 18 horas, un tiempo medio de duplicación de las células B humanas transducidas de 25-29 horas y un tiempo medio de duplicación de las células B de llama transducidas de 27 horas. Esto confirma nuestras observaciones de que nuestros métodos producen cultivos de células B de conejo con un tiempo medio de duplicación de 20 horas o menos, mientras que las células B humanas, murinas y de llama típicamente tienen un tiempo de duplicación de entre 25 y 36 horas.

Ejemplo 3

Expresión del receptor de células B y tinción específica de antígeno

Las células B humanas inmortalizadas expresan el receptor de células B. Esta cualidad permite la tinción y clasificación específicas de antígeno de las células B. Para determinar si el receptor de células B también se expresa en células B de conejo transducidas, los clones de células B se tiñen con anticuerpos marcados con fluorescencia que reaccionan específicamente con IgG de conejo, IgM de conejo o IgA de conejo. Las células B se lavaron en medio de cultivo celular frío (4 °C) y se incubaron en hielo en la oscuridad con medio de cultivo celular que contenía anticuerpos marcados con inmunofluorescencia que son específicos para IgG, IgM, IgA de conejo o antígeno marcado. Posteriormente, el exceso de anticuerpos o antígenos marcados se eliminó por lavado y la expresión del receptor de células B se analizó en un analizador FACS; el Guava easycyte (Millipore) o FACS Aria3 (BD).

En la Figura 3, se tiñeron tres clones de células B diferentes de diferentes isotipos con anticuerpos marcados con fluorescencia que reconocen específicamente el isotipo de anticuerpo de conejo IgG, IgA o IgM. Claramente, el receptor de células B puede teñirse eficazmente para los diferentes isotipos de anticuerpos de conejo. Por lo tanto, se concluyó que las células B de conejo inmortalizadas también expresan el receptor de células B.

Además, también se utilizaron proteínas de influenza marcadas con fluorescencia para teñir las células B específicas de influenza de conejos que habían sido inmunizados con una vacuna contra la influenza humana o conejos de control no tratados (Figura 4). Las células B de conejo se tiñeron con H1, H3 o influenza B marcadas con fluorescencia y se clasificaron 1 célula por pocillo utilizando un clasificador FACS.

Ejemplo 4

Desarrollo de cultivos de células B clonales de conejo derivadas de una sola célula.

Las células B transducidas se clasificaron una célula por pocillo utilizando un clasificador FACS y se cultivaron en presencia de fibroblastos de células L de ratón irradiados con y (50 Gy) que expresan de manera estable CD40L (células CD40L-L, 105 células ml-1) junto con IL-21 de ratón recombinante. Cada 3-4 días se añadieron células CD40L-L nuevas e IL-21. Comenzando 9 días después de sembrar las células (una célula por pocillo), los sobrenadantes se analizaron en ELISA para determinar la producción de inmunoglobulina G (IgG) de conejo. Para comparación, también se analizó en paralelo la IgG humana en el sobrenadante de clones de células B humanas.

En la Figura 7, la concentración de anticuerpos en el sobrenadante se representa a lo largo del tiempo a partir de los 9 días posteriores al inicio de los cultivos de células individuales. La concentración de anticuerpos se determinó para dos donantes humanos y una muestra de células B de conejo que se transdujeron con un retrovirus tipo GALV que lleva una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia Bcl-6 humana y una Bcl-xL humana y para una muestra de células B de conejo. que se transdujo con un retrovirus de tipo GALV que porta una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia Bcl-6 humana y una Mcl-1 humana. Los clones de células B de conejo producen concentraciones de IgG de 30 ng/ml y 100 ng/ml en un período de tiempo más corto (9-10 días y 11-12 días, respectivamente) que los clones de células B humanas (13-18 y 15-20 días, respectivamente). Esto proporciona la importante ventaja de que permite una exploración más temprana de los anticuerpos de interés de los clones de células B de conejo, en comparación con los clones de células B humanas.

Ejemplo 5

Inmunización de conejos.

Se inmunizaron 2 conejos blancos de Nueva Zelanda con una vacuna contra la influenza humana que contenía 15 ug H1N1, 15 ug H3N2 y 15 ug infl B en adyuvantes completos de Freund. Después de 3 semanas, los conejos fueron reforzados con la misma vacuna en adyuvantes de Freunds incompletos. Cinco días después de sangrar a los conejos de refuerzo, se aislaron las células B de la sangre y se transdujeron con un retrovirus de tipo GALV (que contiene el dominio extracelular y el dominio transmembrana de la proteína de envoltura de la cepa SEATO de GALV, fusionada con el dominio citoplásmico de una proteína de envoltura anfo) que lleva una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia Bcl-6 humana y una Bcl-xL humana. Las células B transducidas se sembraron a diferentes densidades celulares en placas de cultivo y se cultivaron como se describe en el Ejemplo 4. Además, las células B transducidas se marcaron con componentes de la vacuna marcados con fluorescencia; H1, H3 o influenza B y se clasificó 1 célula por pocillo utilizando un clasificador FACS y se cultivó como se describe en el Ejemplo 4. Se analizó la unión de los sobrenadantes de las células cultivadas a la vacuna completa o a sus componentes individuales. Los resultados se representan en las Figuras 4-6 y muestran que las células B específicas de antígeno pueden identificarse en el grupo de células B de conejos vacunados mediante la siembra de células a diferente densidad (Figura 5) y también de manera muy eficiente mediante la clasificación de las células utilizando los antígenos marcados (Figura 4 y Figura 6).

Ejemplo 6

Las células B de conejo se inmortalizan mediante la introducción de los genes Bcl-6 y Bcl-xl utilizando un retrovirus de tipo anfotrópico.

La inmortalización de células B de conejo mediante la introducción de los genes Bcl-6 y Bcl-xl puede lograrse utilizando diferentes tipos de vectores, tales como por ejemplo GALV y retrovirus de tipo anfotrófico como se muestra en el Ejemplo 1. Se continuó con el crecimiento de células B transducidas con el retrovirus de tipo anfotrófico para confirmar que la introducción de Bcl-6 y Bcl-xl por retrovirus anfotróficos también conduce a la inmortalización de células B de conejo. Cuatro días después de la transducción con el retrovirus de tipo anfotrópico, se transdujo el 0,8% de las células en comparación con el 80% de las células después de la transducción con un retrovirus de tipo GALV (Figura 1 y Figura 10). Diez días después de la transducción, el 94 % de la población celular transducida con el retrovirus anfotrófico era positiva para GFP, lo que demuestra que las células transducidas superan a las células no transducidas (Figura 10).

Para determinar el tiempo de duplicación celular, las células se cultivaron como se hizo en el Ejemplo 2 en placas de 24 pocillos a 50-100.000 células/pocillo junto con células CD40L-L e IL-21. Cada 3-4 días se contaron las células y se transfirieron 50-100.000 células a un pocillo nuevo. En la Figura 11 se representa la curva de crecimiento para células B de conejo transducidas con virus anfotrófico. El tiempo de duplicación calculado es de 19 horas, que es comparable a las células B de conejo transducidas con retrovirus tipo GALV (18 horas). En conclusión, la introducción de Bcl-6 y Bcl-xl en células B de conejo por retrovirus anfotróficos también da como resultado la inmortalización de células B de conejo, aunque la eficiencia de transducción es mucho menor en comparación con un vector basado en GALV.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1.

Transducción de células B de memoria de conejo. Se aislaron células B de conejo a partir de PBMC basándose en la expresión de Ig. Las células se activaron durante 36-40 h en células L CD40L con rm-IL-21. Las células se transdujeron con un vector retroviral que contenía BCL6 y Bcl-xL. Se ensayaron tanto retrovirus GALV como de tipo anfotrópico. A continuación, las células transducidas se cultivan en células CD40L-L en presencia de IL-21 de ratón recombinante. Después de cuatro días de cultivo, se determinó la eficiencia de transducción con base en la expresión de GFP. El retrovirus de tipo GALV mostró una eficiencia de transducción superior (80 %) en comparación con el retrovirus de tipo anfotrópico (0.8 %).

Figura 2.

Se analizaron las curvas de crecimiento para células B de conejo transducidas con un vector retroviral que contenía BCL6 y Bcl-xL o un vector retroviral que contenía BCL6 y Mcl-1. Para la comparación, se analizaron las curvas de crecimiento en células B paralelas de células de llama y células humanas de dos donantes diferentes que se transdujeron con un vector retroviral idéntico que contenía BCL6 y Bcl-xL.

Figura 3.

La expresión de inmunoglobulina de superficie IgG, IgM e IgA se detectó utilizando FACS en tres clones de células B de conejo transducidas con Bcl-6 Bcl-xL diferentes.

Figura 4.

Identificación de células B de conejo específicas de antígeno dentro de un grupo de células B de conejo con diferentes especificidades.

Figura 5.

Se obtuvieron anticuerpos de conejo específicos de antígeno contra los diferentes componentes de una vacuna contra la influenza humana que contenía 15 ug H1N1, 15 ug H3N2 y 15 ug infl B. Los conejos fueron inmunizados y reforzados con la vacuna contra la influenza humana. Las células B se inmortalizaron y sembraron a diferentes densidades en placas de 384 pocillos en células CD40L-L en presencia de IL-21 de ratón recombinante. Los anticuerpos presentes en los sobrenadantes del cultivo de células B de conejo se cribaron en ELISA para determinar la especificidad de influenza. Se observaron anticuerpos específicos de antígeno para todos los componentes de la vacuna.

Figura 6.

Células B inmortalizadas de conejos inmunizados con una vacuna de influenza humana que contenía 15 ug H1N1, 15 ug H3N2 y 15 ug infl B se tiñeron con proteínas de influenza marcadas con fluorescencia. Las células B que mostraban unión a las proteínas de la influenza se clasificaron 1 célula por pocillo en placas de 384 pocillos en células CD40L-L en presencia de IL-21 de ratón recombinante utilizando un clasificador FACSAria. Los sobrenadantes se cribaron en ELISA para detectar anticuerpos específicos contra la influenza. Se observaron anticuerpos específicos de antígeno con alta frecuencia para los componentes de la vacuna que se usaron para la clasificación específica de antígeno. Figura 7.

Concentración de anticuerpos en el sobrenadante de células B clonales en diferentes puntos de tiempo. Se sembraron células B transducidas humanas, de llama y conejo, 1 célula por pocillo en presencia de células CD40L-L irradiadas y suplementadas con IL-21 de ratón. Cada 3-4 días se repusieron células CD40L-L e IL-21. La concentración de IgG se analizó en ELISA para pocillos individuales en diferentes puntos de tiempo durante el cultivo. Cada medición se realizó en pocillos diferentes. Las células B de conejo se transdujeron con un vector retroviral que contenía BCL6 y Bcl-xL o con un vector retroviral que contenía BCL6 y Mcl-1. Todas las demás células (humanas y de llama) se transdujeron con BCL6 y Bcl-xL.

Figura 8.

Representación esquemática del vector utilizado para transducir las células B de conejo y humanas

Figura 9.

Secuencia del dominio extracelular de la proteína de envoltura de SEATO de GALV (negrita) y el dominio transmembrana de la proteína de envoltura de SEATO de GALV (subrayado), fusionados con el dominio citoplasmático de la proteína de envoltura anfo (cursiva subrayado con puntos).

Figura 10.

Transducción de células B de memoria de conejo y crecimiento de células B de conejo transducidas con retrovirus de tipo anfotrófico. Se aislaron células B de conejo a partir de PBMC basándose en la expresión de Ig. Las células se activaron durante 36-40 h en células L CD40L con rm-IL-21. Las células se transdujeron con un vector retroviral que contenía BCL6 y Bcl-xL. Se ensayaron tanto retrovirus GALV como de tipo anfotrópico. A continuación, las células transducidas se cultivaron en células CD40L-L en presencia de IL-21 de ratón recombinante. Después de cuatro días de cultivo, se determinó la eficiencia de transducción con base en la expresión de GFP. El retrovirus de tipo GALV mostró una eficiencia de transducción superior (80 %) en comparación con el retrovirus de tipo anfotrópico (0.8 %). Después de 10 días, el 94 % de las células B de conejo transducidas con retrovirus de tipo anfotrófico se inmortalizaron basándose en la expresión de GFP que muestra un crecimiento de las células transducidas sobre las células no transducidas.

Figura 11.

Se analizó una curva de crecimiento para células B de conejo transducidas con un vector retroviral de tipo anfotrófico que contenía BCL6 y Bcl-xL

Referencias

Christopherson, K.S. et al. PNAS 89, 6314-8 (1992)

Guzman, L. M. et al. Bacteriol 177, 4121-4130 (1995)

T.M. Kinsella, G.P. Nolan, Hum Gene Ther 7 (1996) 1405.

Kwakkenbos et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor- positive human memory B cells by genetic programming. Nature Medicine (2010) vol. 16 (1) pp. 123-8

Lam et al. Improved gene transfer into human lymphocytes using retroviruses with the gibbon ape leukemia virus envelope. Human gene therapy 7 (1996) 1415-1422

A.L. Szymczak, C.J. Workman, Y. Wang, K.M. Vignali, S. Dilioglou, E.F. Vanin, D.A.A. Vignali, Nat Biotechnol 22 (2004) 589.

C.A. Wilson, M.V. Eiden, W.B. Anderson, C. Lehel, Z. Olah, J Virol 69 (1995) 534.

WO 2007/067046

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para obtener un cultivo de células B ex vivo con un tiempo medio de duplicación de 20 horas o menos, comprendiendo el método:

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Bcl-6 en una célula B e

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de al menos una molécula de ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2 en dicha célula B,

caracterizado porque dicha célula B es una célula B de conejo.

2. Un método para aumentar la esperanza de vida replicativa de una célula B de conejo, comprendiendo el método: - inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Bcl-6 en una célula B de conejo e

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de al menos un ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2 en dicha célula B,

caracterizado porque dicha célula B de conejo está provista con una molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-6 y con al menos una molécula de ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2, mediante transducción con un vehículo de administración de genes que comprende al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura del virus de la leucemia del simio gibón (GALV) o una proteína que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV.

3. Uso in vitro de al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura del virus de la leucemia del simio gibón (GALV), o una proteína que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, para introducir una molécula de ácido nucleico de interés en una célula B de conejo.

4. Un método para obtener anticuerpos, que comprende:

- inducir, potenciar y/o mantener la expresión de al menos una molécula de ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2 en dicha célula B;

- cultivar dicha célula B ex vivo; y

- recolectar anticuerpos producidos por dicha célula B dentro de 7-14 días, preferiblemente dentro de 9-12 días.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en el que dicho Bcl-6 no es de conejo.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 4, en el que dicho Bcl-6 es humano o murino o de conejo.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-5, caracterizado porque dicha célula B de conejo está provista con:

* una molécula de ácido nucleico que codifica un Bcl-6 que no es de conejo, y

* al menos una molécula de ácido nucleico antiapoptótico que no es de conejo de la familia Bcl-2.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha molécula de ácido nucleico que no es de conejo es una molécula de ácido nucleico humano.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-8, en el que dicha al menos una molécula de ácido nucleico antiapoptótico se selecciona del grupo que consiste en Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2, A1, Bcl-wy Bcl2L10.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-9, en el que el método también comprende inducir, potenciar y/o mantener la expresión de Blimp-1 en dicha célula B de conejo.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-10, que comprende además proporcionar dicha célula B de conejo con IL21 y CD40L.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha IL21 es IL21 humana o de ratón y/o en el que dicha CD40L es CD40L humana o de ratón.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-12, que comprende:

- proporcionar a dicha célula B de conejo un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-6;

y/o

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-13, que comprende:

- proporcionar dicha célula B de conejo con al menos un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-xL y/o Mcl-1 y/o Bcl-2 y/o A1 y/o Bcl-w y/o Bcl2L10; y/o

- cultivar dicha célula B de conejo en presencia de al menos un compuesto capaz de potenciar directa o indirectamente la expresión de Bcl-xL y/o Mcl-1 y/o Bcl-2 y/o A1 y/o Bcl-w y/o Bcl2L10.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 4-14, que comprende además:

- proporcionar a dicha célula B de conejo al menos un compuesto capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1; y/o

- cultivar dicha célula B de conejo en presencia de al menos un compuesto capaz de aumentar directa o indirectamente la expresión de Blimp-1.

16. Una célula B de conejo aislada o recombinante unida con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura del virus de la leucemia del simio gibón (GALV), o con una proteína que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV.

17. La célula B de conejo de acuerdo con la reivindicación 16, que se une a través de al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, o a través de una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, a un vehículo de administración de genes que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6 y/o una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2.

18. La célula B de conejo de acuerdo con la reivindicación 17, en la que dicha secuencia de ácido nucleico antiapoptótico es una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2, A1, Bcl-w, Bcl2L10, y cualquier combinación de los mismos.

19. Una célula B de conejo aislada o recombinante que comprende:

- una molécula de ácido nucleico antiapoptótico que no es de conejo de la familia Bcl-2, preferiblemente codificante de Bcl-xL o Mcl-1 o Bcl-2 o A1 o Bcl-w o Bcl2L10, y

- una molécula de ácido nucleico que no es de conejo que codifica Bcl-6.

20. La célula B de conejo de acuerdo con la reivindicación 19, en la que dicha secuencia de ácido nucleico que no es de conejo es una secuencia de ácido nucleico humano.

21. Un cultivo de células B de conejo ex vivo que tiene un tiempo medio de duplicación de 20 horas o menos.

22. Un cultivo de células B de conejo ex vivo que comprende células B de conejo de acuerdo con la reivindicación 19 o 20.

23. Uso in vitro de un vehículo de administración de genes que comprende al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura del virus de la leucemia del simio gibón (GALV), o una proteína que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con al menos el dominio extracelular de una proteína de envoltura de GALV, y una secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-6, y al menos una secuencia de ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2, para aumentar la esperanza de vida replicativa de una célula B de conejo.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, o un uso de acuerdo con la reivindicación 3, o una célula B de conejo de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, o un uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho dominio extracelular es una proteína de envoltura de la cepa SEATO de GALV.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o una célula B de conejo de acuerdo con la reivindicación 17 o un uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho vehículo de administración de genes comprende una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9, o una proteína que comprende una proteína de envoltura quimérica como se muestra en Figura 9, o una proteína que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una proteína de envoltura quimérica como se representa en la Figura 9.

26. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 4-15 o 24-25, en el que dicha molécula de ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2 no es de conejo.

27. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, 4-6, 9-15 o 24-25, en el que dicha molécula de ácido nucleico antiapoptótico de la familia Bcl-2, o dicha molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-xL o Mcl -1 o Bcl-2 o A1 o Bcl-w o Bcl2L10, es de conejo.