JP6832705B2 - ex vivoの抗体生成 - Google Patents
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Description
- B細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、前記B細胞が、ウサギB細胞であることを特徴とする方法が更に提供される。
- ウサギB細胞におけるBcl-6の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞をex vivoで培養する工程と、
- 前記B細胞により10〜14日で、好ましくは11〜12日で生成される抗体を採集する工程と
を含む方法を提供する。前記採集される抗体は、好ましくは、少なくとも100ng/mlの最小限の抗体濃度が要求される1又は複数のアッセイを用いて試験される。
- ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記ウサギB細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞をex vivoで培養する工程と、
- 前記B細胞により7〜14日で、好ましくは9〜12又は9〜10日で生成される抗体を採集する工程と
を含む、抗体を得るための方法が更に提供される。前記採集される抗体は、好ましくは、約30ng/mlの最小限の抗体濃度が要求される1又は複数のアッセイを用いて試験される。
- Bcl-6の発現又はBcl-6のウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、及び/又は
- Bcl-6の発現又はBcl-6のウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を含む、本発明による方法が更に提供される。
- Bcl-xL及び/若しくはMcl-1及び/若しくはBcl-2及び/若しくはA1及び/若しくはBcl-w及び/若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、並びに/或いは
- Bcl-xL及び/若しくはMcl-1及び/若しくはBcl-2及び/若しくはA1及び/若しくはBcl-w及び/若しくはBcl2L10又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増強できる化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を含む、本発明による方法が更に提供される。
- ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞における少なくとも1つの抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメイン若しくは前記細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、又はGALVエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、Bcl-6をコードするか又はそのウサギ相同体をコードするか又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子並びに/或いは少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする方法を提供する。好ましい一実施形態では、前記細胞外ドメインは、GALV SEATO株のエンベロープタンパク質のものである。前記細胞外ドメインは、好ましくは、配列
- ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞における少なくとも1つの抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、図9に示すキメラエンベロープタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質、又は図9に示すキメラエンベロープタンパク質と少なくとも70%の配列同一性を有するタンパク質を含むベクター又は他の遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、Bcl-6をコードするか、又はそのウサギ相同体をコードするか、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子、及び/或いは少なくとも1つの抗アポトーシス核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする方法が更に提供される。
- ウサギB細胞におけるBcl-6又はそのウサギ相同体の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞における抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、
* 非ウサギBcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子、及び
* 非ウサギ抗アポトーシス核酸分子
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする方法を提供する。ヒトBcl-6及びヒト抗アポトーシス配列がウサギB細胞において特に良好な結果を与えるようであることから、前記非ウサギ核酸分子は、好ましくはヒト核酸分子である。特に好ましい実施形態では、ヒトBcl-6をコードする核酸分子と、ヒト抗アポトーシス核酸分子、好ましくはヒトBcl-xL又はヒトMcl-1又はヒトBcl-2又はヒトA1又はヒトBcl-w又はヒトBcl2L10をウサギB細胞に与える。
- Blimp-1の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物を前記ウサギB細胞に与える工程、及び/又は
- Blimp-1の発現又はそのウサギ相同体の発現を直接的又は間接的に増加できる化合物の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を更に含む、本発明の方法が更に提供される。
- STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/或いは
- STAT3を活性化できる化合物、及び/或いは
- STAT3の発現を増強できる化合物、及び/或いは
- IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15、IL27、SOCSタンパク質、E-タンパク質E47、E12、E2-2若しくはHEBの1つ、変異ヤヌスキナーゼ及び/或いはSTAT3又はそのウサギ相同体又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列
を含む方法を提供する。
- ヒトBcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列と、
- 好ましくはヒトBcl-xL若しくはヒトMcl-1若しくはヒトBcl-2若しくはヒトA1若しくはヒトBcl-w若しくはヒトBcl2L10、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードするヒト抗アポトーシス核酸配列と
を含む単離又は組換えウサギB細胞が提供される。ここでもまた、Bcl-6又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする前記核酸配列及び前記抗アポトーシス核酸配列は、1つの核酸分子上に存在することが可能であるか、或いは、これらの配列は、少なくとも2つの異なる核酸分子上に存在することが可能である。
B細胞の形質導入
リン酸カルシウム沈殿、リポソーム形成又はエレクトロポレーションのような伝統的な方法によるリンパ球への遺伝子導入は、非効率であるが、より重要なことには、安定な遺伝子組み込みが全般的に存在しない。しかし、ウイルス形質導入は、標的細胞のゲノムへの安定な遺伝子組み込みを直接的に導き、正しいウイルスエンベロープが選択されるならば、非常に効率的であり得る。レトロウイルス及びレンチウイルス形質導入はともに、効率的な遺伝子導入のために適切である。レトロウイルス組み込みは細胞分裂に依存するが、レンチウイルス形質導入は、形質B細胞のような非分裂細胞にも用いることができる。組換えレトロウイルスの大規模調製は、Phoenix発現プラットフォーム(Kinsella及びNolan、1996)のような安定生成株化細胞を用いることにより容易に達成できる。高力価レンチウイルスの生成は、主に、発現されるウイルスタンパク質及びエンベロープの毒性のために、より煩わしい。
Kwakkenbosら、2010及び特許出願WO 2007/067046に記載されるBCL-6/Bcl-xL技術を用いて、ヒトメモリーB細胞を不死化した。簡単に述べると、フィコール密度勾配を用いてウサギ血液からのPBMCを単離し、IgM特異的抗体と時には組み合わせて、Ig(IgG H+L:IgG重鎖並びにカッパ及びラムダ軽鎖)を認識する抗体を用いてIg発現について染色した。FACSソーターを用いてB細胞を単離し(Ig陽性、又はIg陽性+IgM陰性)、組換えマウスインターロイキン(IL)-21と一緒にCD40Lを安定的に発現するγ照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(CD40L-L細胞、105細胞ml-1)上で36〜48時間刺激した。細胞を採集し、FCSを含まない培地で洗浄し、細胞を、次いで、Retronectin(登録商標)(タカラバイオ株式会社、日本国滋賀県)でコートした組織培養プレートに移して、ここで、BCL-6、Bcl-xL及びレポータータンパク質としてGFPを含むレトロウイルスベクターを細胞に形質導入した。或いは、BCL-6、Mcl-1及びGFPを含むレトロウイルスベクターを細胞に形質導入した。形質導入されたB細胞を、CD40リガンド発現L細胞及びIL-21とともに培養で維持した。図1では、GALV及び両種指向型レトロウイルスについて、形質導入の4日後の形質導入効率を比較する。両種指向型レトロウイルスでの形質導入の4日後に、0.8%の細胞が形質導入されたのに対して、GALV型レトロウイルスを用いる形質導入の後では80%の細胞が形質導入された。明らかに、GALV型レトロウイルスは、ウサギB細胞の形質導入について、両種指向型レトロウイルスより優れている。
細胞培養。
本発明者らは、B細胞(2×105細胞ml-1)を、組換えマウスインターロイキン21(IL-21)(50ng ml-1)を補った8%FBS及びペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)を含むイスコフ改変ダルベッコ培地(Gibco社)で維持し、CD40Lを安定的に発現するγ照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(CD40L-L細胞、105細胞ml-1)上で細胞を培養した。細胞倍加時間を決定するために、CD40L-L細胞及びIL-21と一緒に50〜100,000細胞/ウェルにて24ウェルプレート中で細胞を培養した。3〜4日ごとに細胞を計数し、50〜100,000細胞を新しいウェルに移した。図2では、2つのヒトドナーからのB細胞(89及び93)、1つのラマB細胞試料(ラマ)及びヒトBcl-6配列及びヒトBcl-xLを含む核酸分子を有するGALV型レトロウイルスが形質導入された1つのウサギB細胞試料(Rb 6XL)について成長曲線を示す。ヒトBcl-6配列及びヒトMcl-1を含む核酸分子を有するGALV型レトロウイルスが形質導入された1つのウサギ試料(Rb 6M)についても成長曲線を示す。形質導入されたウサギB細胞は、19時間の平均倍加時間を有し、よって、26から32時間の間の倍加時間を有するヒト又はラマB細胞よりも速く成長する。これらの平均倍加時間は、3〜4日のいくつかの時間間隔中のB細胞の増加を決定し、得られた結果を平均することにより元々算出した。その後、培養期間全体の間の全体的な平均倍加時間を算出した。このことにより、形質導入されたウサギB細胞の平均倍加時間は18時間、形質導入されたヒトB細胞の平均倍加時間は25〜29時間、及び形質導入されたラマB細胞平均倍加時間は27時間となった。このことにより、本発明者らの方法により20時間以下の平均倍加時間を有するウサギB細胞培養物が得られるが、ヒト、マウス及びラマB細胞は、典型的に、25から36時間の間の倍加時間を有することが確認される。
B細胞受容体発現及び抗原特異的染色
不死化ヒトB細胞は、B細胞受容体を発現する。この特質により、抗原特異的染色及びB細胞の選別が可能になる。形質導入されたウサギB細胞上でB細胞受容体も発現されるかを決定するために、B細胞クローンを、ウサギIgG、ウサギIgM又はウサギIgAのいずれかと特異的に反応する蛍光標識抗体で染色する。B細胞を冷(4℃)細胞培養培地で洗浄し、ウサギIgG、IgM、IgA又は標識抗原のいずれかに特異的な免疫蛍光標識抗体を含む細胞培養培地と氷上で暗所にてインキュベートした。その後、過剰の標識抗体又は抗原を洗浄して除き、B細胞受容体発現をFACS分析器、Guava easycyte(Millipore社)又はFACS Aria3(BD社)で分析した。
単細胞由来クローンウサギB細胞培養物の発展。
形質導入されたB細胞を、ウェルあたり1細胞でFACSソーターを用いて選別し、組換えマウスIL-21と一緒に、CD40Lを安定的に発現するγ照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(CD40L-L細胞、105細胞ml-1)の存在下で培養した。3〜4日ごとに新しいCD40L-L細胞及びIL-21を加えた。細胞を播種した(ウェルあたり1細胞)9日後に開始して、ウサギ免疫グロブリンG(IgG)の生成についてELISAで上清を分析した。比較のために、ヒトB細胞クローンの上清中のヒトIgGも並行して分析した。
ウサギの免疫。
2匹のニュージーランドホワイトウサギを、完全フロイントアジュバント中に15μgのH1N1、15μgのH3N2及び15μgのinfl Bを含むヒトインフルエンザワクチンで免疫した。3週間後に、不完全フロイントアジュバント中の同じワクチンでウサギを追加免疫した。追加免疫の5日後に、ウサギから出血させ、血液からB細胞を単離し、ヒトBcl-6配列を含む核酸分子及びヒトBcl-xLを有するGALV型レトロウイルス(アンホエンベロープタンパク質の細胞質ドメインと融合したGALV SEATO株エンベロープタンパク質の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む)を形質導入した。形質導入されたB細胞を、異なる密度で培養プレートに播種し、実施例4に記載するようにして培養した。また、形質導入したB細胞を、ワクチンの蛍光標識成分、H1、H3又はインフルエンザBで標識し、ウェルあたり1細胞でFACSソーターを用いて選別し、実施例4に記載するようにして培養した。培養した細胞の上清を、完全ワクチン又はその個別の成分との結合について分析した。結果を図4〜図6に示し、結果は、細胞を異なる密度で播種することにより(図5)、また、標識抗原を用いて細胞を選別することにより非常に効率的に(図4及び図6)、ワクチン接種したウサギからB細胞プール中の抗原特異的B細胞を同定できることを示す。
ウサギB細胞は、両種指向型レトロウイルスを用いる遺伝子Bcl-6及びBcl-xlの導入により不死化される。
遺伝子Bcl-6及びBcl-xlの導入によるウサギB細胞の不死化は、実施例1に示すとおり、例えばGALV及び両種指向型レトロウイルスのような異なる型のベクターを用いることにより達成できる。両種指向型レトロウイルスが形質導入されたB細胞の成長を更に追跡して、両種指向性レトロウイルスによるBcl-6及びBcl-xlの導入がウサギB細胞の不死化も導くことを確認した。GALV型レトロウイルスの形質導入後に80%の細胞が形質導入されたのに比較して、両種指向型レトロウイルスの形質導入の4日後に、0.8%の細胞が形質導入された(図1及び図10)。形質導入の10日後に、両種指向性レトロウイルスが形質導入された細胞集団の94%がGFP陽性であり、このことは、形質導入された細胞が、非形質導入細胞よりもよく成長することを証明した(図10)。
Claims (22)
- 20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのB細胞培養物を得るための、Bcl-6をコードする外因性核酸分子を発現し、Bcl-2ファミリーの外因性抗アポトーシス核酸分子を発現する、ウサギB細胞の使用。
- 20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのB細胞培養物を得るための方法であって、前記方法が、
- B細胞におけるBcl-6をコードする外因性核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞におけるBcl-2ファミリーの少なくとも1つの外因性抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、
前記B細胞が、ウサギB細胞であることを特徴とする、方法。 - ウサギB細胞の複製寿命を増加するための方法であって、前記方法が、
- ウサギB細胞におけるBcl-6をコードする外因性核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞におけるBcl-2ファミリーの少なくとも1つの外因性抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、
テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、Bcl-6をコードする外因性核酸分子及び/又はBcl-2ファミリーの少なくとも1つの外因性抗アポトーシス核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とし、「テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの機能性部分」という用語は、ウサギB細胞と依然として結合することができ、それにより、前記ウサギB細胞の感染及び/又は形質導入を媒介する、前記細胞外ドメインの一部分を意味する、方法。 - Bcl-6をコードする外因性核酸分子及び/又はBcl-2ファミリーの外因性抗アポトーシス核酸分子をウサギB細胞に導入するための、テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分の使用であって、「テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの機能性部分」という用語は、ウサギB細胞と依然として結合することができ、それにより、前記ウサギB細胞の感染及び/又は形質導入を媒介する、前記細胞外ドメインの一部分を意味する、使用。
- - ウサギB細胞におけるBcl-6をコードする外因性核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞におけるBcl-2ファミリーの少なくとも1つの外因性抗アポトーシス核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記B細胞をex vivoで培養する工程と、
- 前記B細胞により7〜14日で、好ましくは9〜12日で生成される抗体を採集する工程と
を含む、抗体を得るための方法であって、
前記ウサギB細胞が、20時間以下の平均倍加時間を有する、方法。 - - 非ウサギBcl-6をコードする核酸分子、及び/又は
- Bcl-2ファミリーの少なくとも1つの非ウサギ抗アポトーシス核酸分子
を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とする、請求項2、3又は5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記非ウサギ核酸分子が、ヒト核酸分子である、請求項6に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの外因性抗アポトーシス核酸分子が、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10からなる群から選択される、請求項2〜3又は5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記ウサギB細胞におけるBlimp-1の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程も含む、請求項2〜3又は5〜8のいずれか一項に記載の方法。
- IL21及びCD40Lを前記ウサギB細胞に与える工程を更に含む、請求項2〜3又は5〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL21が、マウス若しくはヒトIL21であり、及び/又は前記CD40Lが、マウス若しくはヒトCD40Lである、請求項10に記載の方法。
- - STAT3をコードする核酸分子を前記ウサギB細胞に与える工程、及び/又は
- IL-21の存在下で前記ウサギB細胞を培養する工程
を更に含む、請求項2〜3又は5〜11のいずれか一項に記載の方法。 - - Bcl-xL又はMcl-1又はBcl-2又はA1又はBcl-w又はBcl2L10を好ましくはコードする、Bcl-2ファミリーの非ウサギ抗アポトーシス核酸分子、及び
- Bcl-6をコードする非ウサギ核酸分子
を含む、20時間以下の平均倍加時間を有する単離又は組換えウサギB細胞。 - 前記非ウサギ核酸配列が、ヒト核酸配列である、請求項13に記載のウサギB細胞。
- 20時間以下の平均倍加時間を有するex vivoのウサギB細胞培養物であって、前記B細胞が、Bcl-6をコードする外因性核酸配列及びBcl-2ファミリーの外因性抗アポトーシス核酸配列を含む、ウサギB細胞培養物。
- 請求項13又は14に記載のウサギB細胞を含むex vivoのウサギB細胞培養物。
- 請求項2〜3又は5〜12のいずれか一項に記載の方法により得られる場合のex vivoのウサギB細胞培養物であって、外因性Bcl-6及びBcl-2ファミリーの少なくとも1つの外因性抗アポトーシスタンパク質の発現が、誘導、維持及び/又は増強されており、前記ウサギB細胞培養物が、20時間以下の平均倍加時間を有する、ウサギB細胞培養物。
- ウサギB細胞の複製寿命を増加するための、テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分と、Bcl-6をコードする核酸配列及び/又はBcl-2ファミリーの少なくとも1つの抗アポトーシス核酸配列とを含む遺伝子送達媒体の使用であって、前記使用が、
- 前記ウサギB細胞におけるBcl-6をコードする外因性核酸分子の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と、
- 前記ウサギB細胞におけるBcl-2ファミリーの少なくとも1つの外因性抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程と
を含み、
テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも機能性部分を含む遺伝子送達媒体を用いる形質導入により、Bcl-6をコードする外因性核酸分子及び/又はBcl-2ファミリーの少なくとも1つの外因性抗アポトーシス核酸分子を前記ウサギB細胞に与えることを特徴とし、「テナガザル白血病ウイルス(GALV)エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの機能性部分」という用語は、ウサギB細胞と依然として結合することができ、それにより、前記ウサギB細胞の感染及び/又は形質導入を媒介する、前記細胞外ドメインの一部分を意味する、使用。 - 前記細胞外ドメインが、GALV SEATO株のエンベロープタンパク質のものである、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞外ドメインが、GALV SEATO株のエンベロープタンパク質のものである、請求項4又は18に記載の使用。
- 前記遺伝子送達媒体が、配列番号4に記載の配列を有するキメラエンベロープタンパク質、又は配列番号4に記載の配列を有するキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記遺伝子送達媒体が、配列番号4に記載の配列を有するキメラエンベロープタンパク質、又は配列番号4に記載の配列を有するキメラエンベロープタンパク質を含むタンパク質を含む、請求項18に記載の使用。
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