CN106029873A - 离体的抗体生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产倍增时间短的改进的离体B细胞培养物的手段和方法。

Description

离体的抗体生产
技术领域
本发明涉及医药、分子生物学和免疫学的领域。
背景技术
离体的B细胞培养物是生产抗体，优选单克隆抗体的重要工具。单克隆抗体(mAb)代表一种抗体分子的多个相同拷贝，这些拷贝以相同的亲和性结合抗原，并且促进相同的效应子功能。在mAb的益处之中，是它们对抗原上的同一表位的特异性。与其它常规治疗相比，该特异性赋予mAb特定的临床优点，同时赋予患者通常具有低副作用的有效且耐受良好的治疗选择。此外，mAb可用于生物和医学研究。
获得mAb的常规途径是杂交瘤技术，其中B细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成产生杂交抗体的细胞系(杂交瘤)。但是，使用人B细胞的杂交瘤技术不是很成功，因为得到的杂交瘤是不稳定的。同时，已经开发了改进的技术，其中生产具有延长的复制寿命的离体B细胞培养物(WO 2007/067046)。该技术涉及人的离体培养物，其中在B细胞中表达Bcl-6以及Blimp-1和/或抗凋亡的核酸。这改善了这些B细胞的复制寿命。典型地，培养人的B细胞，以获得人mAb。对于人类中的治疗应用来说，人mAb是优选的，因为与其它物种的抗体相比，人mAb具有较低的免疫原性。使用WO 2007/067046的技术，获得了平均倍增时间约为25～36小时的离体的人B细胞培养物。
为了工业生产感兴趣的mAb，诸如治疗mAb，有利地使用B细胞培养物，其中的B细胞具有较短的倍增时间。在如癌症治疗的治疗途径中，例如当使用患者的癌细胞对非人的哺乳动物进行免疫，随后从动物中收获癌症特异性B细胞并且用于离体的抗体生产时，较短的倍增时间也是非常重要的。因为这样的抗体是对个体患者的定制型药物，应当尽快生产这些抗体，以便患者能够尽快开始他/或她的Ab治疗。对个体肿瘤具有特异性的上述抗体是不能提前生产的。
发明内容
本发明的目标之一是提供用于生产具有较短倍增时间的改进的离体B细胞培养物的手段和方法。
本发明发现当使用兔B细胞时，获得了与WO 2007/067046中公开的B细胞培养物相比，具有更短倍增时间的B细胞培养物。然后，普遍使用的B细胞，诸如人的B细胞、鼠的B细胞和美洲驼的B细胞一般具有25～36小时的倍增时间，本发明人惊奇地发现可获得具有20小时或更短的倍增时间的兔B细胞培养物。这一发现允许显著更快地生产感兴趣的抗体，在给定时间范围内得到更高的产量，这对于抗体的工业生产和治疗应用是特别有价值的。
相应地，本发明提供了兔B细胞在获得具有20小时或更短的平均倍增时间的离体B细胞培养物中的应用。一般通过在兔B细胞中表达Bcl-6或其兔同源物，和抗凋亡的核酸分子，来获得根据本发明的离体兔B细胞培养物。因此，进一步提供了一种获得具有20小时或更短的平均倍增时间的离体B细胞培养物的方法，所述方法包括：
-在B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；以及
-在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持抗凋亡的核酸分子的表达，
其特征在于，所述B细胞是兔B细胞。
优选地，生产具有小于20小时的平均倍增时间的离体兔B细胞培养物。更优选地，上述平均倍增时间小于19小时或甚至小于18小时。较短的倍增时间允许较快和较高的抗体生产，这改善了测试和筛选期望抗体的时间和效率，并且改善了感兴趣抗体的分离和/或鉴定。此外，如果需要开发针对个体患者的mAb，则兔B细胞的较短的倍增时间允许更快地开始患者的特异性mAb治疗。
因此，根据本发明的方法使用兔B细胞提供了以下优点：与目前已知的人、鼠或美洲驼的B细胞培养物相比，可在更短的时间范围内离体获得、测试、鉴定、分离和/或生产抗体。
本发明提供具有短倍增时间的B细胞培养物这一事实提供了以下优点：与现有方法相比，可在更短的时间段内获得足量的抗体。例如，在WO 2007/067046公开的方法中，使用Bcl-6和抗凋亡的核酸(或增加这样的核酸表达的化合物)稳定从人类个体中获得的B细胞集合，随后进行培养。这样得到能够增殖且生产抗体的稳定的人的B细胞。在培养过程中，稳定的B细胞生产抗体，该抗体被分泌到培养基中。随后，优选测试这些抗体的期望的特异性(和/或亲和性)。对于目前的测试程序，一般需要抗体浓度至少为100ng/ml培养基。在稳定的人的B细胞培养15～20天之后，获得这样的最小抗体浓度。因此，使用人的B细胞培养物，抗体在开始培养之后至少15～20天，一般大约在第20天进行收获。美洲驼的B细胞具有与人的B细胞类似的生长速率，因此如果使用美洲驼的B细胞培养物，则一般也在开始培养之后至少15～20天时收获抗体。鼠的B细胞具有更长的倍增时间，一般在超过20天之后获得100ng/ml最小浓度的抗体。
在测试抗体之后，常常选择并且分离出感兴趣的对应的B细胞，以备进一步的使用。鉴于抗体测试正常耗费约三天，则一般从开始B细胞培养18～23天之后选择并且分离出感兴趣的人或美洲驼的B细胞，而一般在超过23天之后选择并且分离出感兴趣的鼠的B细胞。然后，对分离出的B细胞进行进一步培养。因此，一般从开始B细胞培养约三周之后，获得具有感兴趣的人、美洲驼或鼠的B细胞的B细胞培养物。然而，使用根据本发明的方法，在11～12天之后已经获得了至少100ng/ml的抗体浓度。因此，现在能够在开始B细胞培养之后11～12天时收获抗体，而之前，在收获抗体之前必须使人(或美洲驼)的B细胞培养物维持至少15～20天。如果测试程序耗费三天，则从开始B细胞培养14～15天内选择并且分离出感兴趣的兔B细胞，这显著快于培养人或鼠的B细胞的情况。总之，获得生产足够浓度的抗体的人、美洲驼或鼠的B细胞培养物一般耗费约三周，而本发明的发现，在两周之后就获得了具有生产足够Ab浓度的兔B细胞的B细胞培养物。这是与现有方法相比的主要优点。因此，本发明的一个方面提供了获得抗体的方法，优选用于需要最小抗体浓度至少为100ng/ml的一种或多种测试检验中，该方法包括：
-在兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6的表达；
-在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持抗凋亡的核酸分子的表达；
-离体培养所述B细胞；以及
-在10～14天内，优选在11～12天内，收获由所述B细胞生产的抗体。优选使用需要最小抗体浓度至少为100ng/ml的一种或多种检验，来测试收获的上述抗体。
如上所述，获得的抗体一般用于测试期望的特异性和/或亲和性。目前的测试方法常常需要100ng/ml的最小抗体浓度，但是如果使用更敏感的检测方法，则能提前收获抗体。无论测试方法的敏感性如何，由于兔B细胞的倍增时间显著更快，因此根据本发明的方法使用兔B细胞，能比使用目前已知的人、美洲驼或鼠的B细胞更早地得到所需的最小抗体浓度。例如，如果仅需要30ng/ml的最小抗体浓度，则使用人的B细胞通常从在开始B细胞培养13～18天之后达到该浓度，而兔B细胞培养仅需9～10天就会到该最小抗体浓度。因此，同样地可更早地进行抗体测试和感兴趣的B细胞的分离。在实践中，本发明人从开始B细胞培养7～14天内，得到并且测试了兔的抗体。在本发明之前，不能获得与离体的人类B细胞培养物相比，能够在显著更早的阶段进行抗体测试的离体的B细胞培养物。因此，进一步提供了获得抗体的方法，该方法包括：
-在兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；
-在所述兔B细胞中，诱导、增强和/或维持抗凋亡的核酸分子的表达；
-离体培养所述B细胞；以及
-在7～14天内，优选在9～12天或9～10天内，收获由所述B细胞生产的抗体。优选使用需要最小抗体浓度约为30ng/ml的一种或多种检验，来测试收获的所述抗体。
如本文所使用的，术语“兔B细胞”指已经从兔获得的B细胞，或者来源于兔B细胞的B细胞。来源于兔B细胞的B细胞的实例是兔B细胞在一次或多次细胞分裂周期之后形成的后代。这样的后代例如包括兔B细胞的离体培养物。
离体兔B细胞培养物是包含兔B细胞和/或其后代的培养物。其它类型的细胞也可存在于培养物中。例如，诸如CD40阳性L细胞和/或EL4B5细胞的B细胞刺激细胞通常也存在于根据本发明的B细胞培养物中。此外，也存在于含B细胞样品中的其它类型的细胞仍然可存在于B细胞培养物中。当在B细胞培养条件下存在时，这些非B细胞的增殖能力通常比B细胞弱，这样的污染细胞的数目通常会随时间逐渐降低。优选地，兔B细胞培养物的至少70％的细胞是兔B细胞。更优选地，上述兔B细胞培养物的至少75％、80％、85％、90％或95％的细胞是兔B细胞。在特别优选的实施方式中，兔B细胞和诸如CD40阳性L细胞和/或EL4B5细胞的B细胞刺激细胞基本是在兔B细胞培养物中存在的仅有的细胞类型。
优选地，根据本发明的兔B细胞培养物的B细胞是一个原始的兔B细胞的后代，这样通过所述B细胞培养物来生产单克隆抗体。
术语“平均倍增时间”在本文中被限定为，从具有一定初始量的B细胞的培养物开始，至获得具有该初始B细胞量的两倍数量的B细胞的培养物，所需的平均时间。因为不是每一个B细胞都会以完全相同的速率进行增殖，因此平均值通常用于作为一个整体的B细胞培养物。
Bcl-6编码正常B细胞和T细胞的发育和成熟，以及形成生发中心所需的转录阻抑因子。Bcl-6在生发中心的B细胞中高表达，而几乎不在浆细胞中表达。Bcl-6抑制活化的B细胞分化成浆细胞。在根据本发明的方法中，Bcl-6的表达产物，或其兔同源物的表达产物，依然存在于离体培养物的兔B细胞中。Bcl-6或其兔同源物的存在，与抗凋亡的核酸的存在一起，延长了B细胞的复制寿命。优选通过向用于培养的兔B细胞给予促Bcl-6表达的化合物或促Bcl-6的兔同源物的表达的化合物，或通过在上述化合物的存在下培养兔B细胞，诱导、增强或维持Bcl-6或其兔同源物的表达。
因此，进一步提供了根据本发明的方法，该方法包括：
-向所述兔B细胞提供能直接或间接增强Bcl-6的表达或Bcl-6的兔同源物的表达的化合物；和/或
-在能直接或间接增强Bcl-6的表达或Bcl-6的兔同源物的表达的化合物的存在下，培养所述兔B细胞。
能直接或间接增强Bcl-6的表达或Bcl-6的兔同源物的表达的各种化合物在本领域中是已知的。这样的化合物例如包括信号转导和转录活化因子5(STAT5)蛋白，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物，和/或编码STAT5的核酸序列。STAT5是能增强Bcl-6表达的信号转导因子。STAT5存在两种已知的形式，STAT5a和STAT5b，这是由两个不同的串联连接的基因编码的。给予和/或活化STAT5或其兔同源物使Bcl-6水平增强，或使Bcl-6的兔同源物水平增强。因此，STAT5或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物能够直接增加Bcl-6的表达或Bcl-6的兔同源物的表达。因此，提供了根据本发明的方法，该方法包括：向所述兔B细胞提供STAT5，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物；或者，向所述兔B细胞提供编码STAT5，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子；或者，在STAT5的存在下，或在其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的存在下，培养所述兔B细胞。
STAT5或其兔同源物的存在直接增加Bcl-6的量或Bcl-6的兔同源物的量。还可以间接增加Bcl-6的表达或Bcl-6的兔同源物的表达。这例如通过调节特定化合物的量来完成，该特定化合物反过来能够直接或间接活化STAT5或其兔同源物，和/或增加STAT5的表达或其兔同源物的表达。因此，在一个实施方式中，增加了内源性和/或外源性STAT5的表达和/或活性，或其兔同源物的表达。例如，通过在白介素(IL)2和/或IL4的存在下培养兔B细胞，可以间接增强Bcl-6的表达或其兔同源物的表达，其中IL2和/或IL4能够活化STAT5或活化STAT5的兔同源物，该STAT5或其兔的同源物反过来增加Bcl-6的表达或Bcl-6的兔同源物的表达。
如本文所使用的，术语Bcl-6或STAT5的“兔同源物”例如指对应于Bcl-6或STAT5的兔的蛋白，这意味着与人B细胞中的Bcl-6或STAT5的功能相比，Bcl-6或STAT5的“兔同源物”在兔B细胞中具有对应的类似的功能。
但是，优选提供兔B细胞，该兔B细胞具有编码Bcl-6或编码其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。通过这种方式，可以直接调节所述兔B细胞中的Bcl-6的浓度或其兔同源物的浓度。因此，还提供了根据本发明的方法，该方法包括：向所述兔B细胞提供编码Bcl-6或编码Bcl-6的兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。在一个实施方式中，所述核酸分子是组成性活化的，这意味着Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物是不依赖于调节因子的存在而持续表达。在另一实施方式中，所述核酸分子是可诱导的，这意味着该核酸分子的表达受至少一种诱导因子和/或阻抑因子的调节。通过这种方式，所述核酸分子的表达可随意进行调节。例如，Tet-On和Tet-Off表达系统(例如和Advanced Inducible Gene Expression Systems,Clontech)可用于感兴趣的核酸序列的诱导性表达。在这些系统中，转录活化因子(tTA)的表达受到四环素(TC)或衍生物如强力霉素(dox)的存在(Tet-On)或不存在(Tet-Off)的调节。原则上来讲，tTA由大肠杆菌(Escherichia coli)Tet阻抑因子蛋白(TetR)和单纯疱疹(Herpes simplex)病毒反式激活结构域VP16构成。tTA在四环素反应元件(TRE)的控制下调节感兴趣的核酸序列的转录，该四环素反应元件(TRE)包括Tet操纵子(TetO)DNA序列和启动子序列，例如人类巨细胞病毒(hCMV)启动子序列。可将编码例如Bcl6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列放置在该启动子的下游。
在Tet-off系统中，tTA在没有TC或dox的情况下结合TRE并且活化感兴趣的核酸序列的转录，而在TC或dox的存在下，tTA不能结合TRE并且抑制感兴趣的核酸序列的表达。与此相反，Tet-on系统使用反式tTA(rtTA)，该反式tTA(rtTA)仅在dox存在下结合TRE。感兴趣的核酸序列的转录在没有dox的情况下被抑制，而在存在dox的情况下被活化。
在另一实施方式中，使用激素诱导的基因表达系统，诸如蜕皮激素诱导的基因表达系统(例如New England Biolabs)(Christopherson,K.S.et al.PNAS 89,6314-8(1992))，来执行诱导性表达。蜕皮激素是来自例如果蝇(Drosophila melanogaster)的昆虫类固醇激素。在转染有蜕皮激素受体的细胞中，在蜕皮激素激动剂的存在下，形成由蜕皮激素受体(Ecr)和类视黄醇X受体(RXR)组成的异二聚体，其中蜕皮激素激动剂选自蜕皮激素，它的一种类似物(诸如幕黎甾酮(muristerone)A和百日青蜕皮酮(ponasterone)A)，和非类固醇蜕皮激素激动剂。在激动剂的存在下，Ecr和RXR相互作用并且结合存在于表达盒上的蜕皮激素反应元件。因此，通过将兔B细胞暴露于蜕皮激素激动剂，诱导位于蜕皮激素反应元件下游的表达盒中的感兴趣的核酸序列的表达。
在本发明的又一实施方式中，使用阿拉伯糖诱导性基因表达系统(例如pBAD/gIII试剂盒，Invitrogen)(Guzman,L.M.et al.Bacteriol177,4121–4130(1995))，执行诱导性表达。阿拉伯糖是含五个碳原子的单糖。在转染有阿拉伯糖诱导性启动子PBAD的细胞中，可在阿拉伯糖的存在下，诱导位于PBAD下游的感兴趣的核酸序列的表达。
还可以使用Bcl-6蛋白，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物(编码它们的核酸分子)，其中所述Bcl-6蛋白或兔同源物或功能部分或功能衍生物受到至少一种诱导因子和/或阻抑因子的调节。非限制性实例是一融合蛋白，其中调节元件与编码Bcl-6或其兔同源物的至少一部分的序列融合。例如，雌激素受体(ER)与Bcl-6融合，产生融合蛋白ER-Bcl-6。该融合蛋白是没有活性的，因为它与细胞质中的热休克蛋白形成复合体。当给予外源性诱导因子4羟基三苯氧胺(4HT)时，融合蛋白ER-Bcl-6与热休克蛋白解离，以便融合蛋白的Bcl-6部分变成有活性的。
如本文所使用的，术语“抗凋亡的核酸分子”指能够延迟和/或阻止兔B细胞中的凋亡的核酸分子。优选地，所述抗凋亡的核酸分子能够延迟和/或阻止能增殖并且产生抗体的浆母细胞样兔B细胞的凋亡。优选地，所使用的抗凋亡的核酸分子包括外源性核酸分子。这意味着，所使用的核酸序列不是在兔B细胞中天然表达的，或者使用天然存在的核酸序列的额外拷贝，这样与天然的兔B细胞相比，增强在得到的兔B细胞中的表达。各种抗凋亡的核酸分子在本领域中是已知的，这样可获得各种实施方式。优选地，所使用的抗凋亡的核酸分子是Bcl-2家族的抗凋亡成员，因为抗凋亡的Bcl-2蛋白是B细胞中优秀的凋亡抑制因子。受到Bcl-2家族(该家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白)控制的很多过程都与凋亡的线粒体途径相关。使用抗凋亡的Bcl-2家族成员Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-2相关蛋白A1(也被称为Bcl2-A1或A1)、Bcl-2样10(Bcl2L10)和Mcl-1，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物是优选的，因为Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、A1、Bcl2L10和Mcl-1通常与线粒体外膜整合。它们直接结合且抑制属于Bcl-2家族的促凋亡蛋白，以保护线粒体膜的完整性。
因此，优选实施方式提供了根据本发明的方法，其中，所述抗凋亡的核酸分子包括Bcl2家族的抗凋亡基因，优选Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物。
在一个实施方式中，通过向兔B细胞给予能够促进这些抗凋亡基因的表达的至少一种化合物，或在这样的化合物的存在下培养兔B细胞，来诱导、增强或维持Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10，或其兔同源物的表达。因此，进一步提供了根据本发明的方法，该方法包括：
-向所述兔B细胞提供能够直接或间接增强Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10，或其兔同源物的表达的化合物；和/或
-在能够直接或间接增强Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10，或其兔同源物的表达的化合物的存在下，培养所述兔B细胞。
但是，优选向兔B细胞提供编码Bcl2家族的抗凋亡基因的至少一种核酸分子，该Bcl2家族的抗凋亡基因优选选自由Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10，及其兔同源物，及其功能部分和功能衍生物所组成的组。通过这种方式，可以直接增强在所述兔B细胞中的表达产物的量。因此，还提供了根据本发明的方法，该方法包括：向所述兔B细胞提供编码Bcl2家族的抗凋亡基因的至少一种核酸分子，该Bcl2家族的抗凋亡基因优选选自由Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10，及它们的兔同源物，及它们功能部分和功能衍生物所组成的组。在一个实施方式中，所述核酸分子是组成性活化的，这意味着所述核酸分子被持续表达。在另一实施方式中，所述核酸分子是诱导性的，这意味着它的表达受到至少一种诱导因子和/或阻抑因子的调节。前文中描述了本领域已知的诱导性核酸表达系统的非限制性实例。
在特别优选的实施方式中，所述抗凋亡的核酸分子编码Bcl-xL或Mcl-1，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物。根据本发明，Bcl-6和Bcl-xL的组合能特别好地增加兔B细胞的复制寿命，从而形成得到的浆母细胞样B细胞的长期培养物。这同样也适用于Bcl-6和Mcl-1的组合。最优选地，所述抗凋亡的核酸编码Bcl-xL，或其功能部分或功能衍生物。
与天然的Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w或Bcl2L10或其兔同源物相比，Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w或Bcl2L10或其兔同源物的功能部分是蛋白质类分子，分别具有在性质上，而不一定在量上，增加兔B细胞的复制寿命的相同的能力。这样的功能部分例如缺乏那些不参与或仅非常少地参与该能力的氨基酸。
例如，在本文中，Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w和Bcl2L10，或其兔同源物的功能部分分别被定义为Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w和Bcl2L10，或其兔同源物的片段，所述片段分别保留了与全长Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w和Bcl2L10，或其兔同源物(在性质上，而不一定在量上)相同性质的抗凋亡特性。Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w或Bcl2L10，或其兔同源物的功能部分通常分别是Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w或Bcl2L10，或其兔同源物的较短片段，所述较短片段能够延迟和/或阻止兔B细胞中的凋亡。这样的功能部分例如没有不显著有助于Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w和Bcl2L10的抗凋亡活性的序列。Bcl-6或其兔同源物的功能部分通常是Bcl-6或其兔同源物的较短片段，这些较短片段能够增加兔B细胞的复制寿命。
Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w或Bcl2L10，或其兔同源物的功能衍生物分别被定义为：Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w或Bcl2L10蛋白或其兔同源物，其已经被改变但仍然具有(在性质上，而不一定在量上)增加兔B细胞的复制寿命的能力。以很多方式，例如通过保守氨基酸置换来提供功能衍生物，在该保守氨基酸置换中，一个氨基酸被另一个通常具有类似性质(大小、疏水性等)的氨基酸置换，这样整体的功能不被严重影响。或者，功能衍生物例如包括融合蛋白，该融合蛋白具有可检测的标记或具有诱导性化合物。
本发明的另一方面解决了以下问题：将感兴趣的核酸分子有效地引入到兔B细胞中。常规使用的双嗜性(ampho)逆转录病毒载体适用于感染啮齿类细胞(诸如鼠科细胞)，因此预期该双嗜性逆转录病毒载体也能转导兔B细胞，但与预期相反，发明人发现了双嗜性逆转录病毒载体显示出不能有效地转导兔B细胞；在兔B细胞中，双嗜性载体在转导后4天的转导效率显示低于1％。因此，本发明人不得不寻找其它的基因递送工具。令人惊奇地是，发明人发现包括长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外结构域的基因递送工具，能够高效率地转导兔B细胞，在转导后3～5天的转导效率通常为80％～90％。这一性质是相当出乎意料的，因为长臂猿白血病病毒天然不感染兔。因此，并没有预期兔细胞含有GALV包膜蛋白的受体；目前的发现仅是巧合。值得注意的是，尽管人类B细胞是灵长类细胞，含GALV包膜蛋白的胞外结构域的载体对人类B细胞的转导效率，在转导后4天通常为60％～70％，这常常低于该载体对兔B细胞的转导效率。这是令人惊讶的，因为猿也是灵长类，因此与兔的细胞相比，预期含GALV类包膜蛋白的载体能更好地感染灵长类细胞。值得注意的是，使用包括GALV包膜蛋白的胞外结构域的载体确实不能有效转导鼠科的B细胞，这与长臂猿白血病病毒不感染小鼠的事实一致。
现在，本发明的发现提供了可以使用GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分来有效转导兔B细胞，并且转导效率甚至高于人类B细胞的转导效率，从而可以提供新的应用。现在，可以将感兴趣的核酸分子高效率地引入到兔B细胞中，这对于产生根据本发明的离体兔B细胞培养物是特别有利的。因此，本发明的优选实施方式提供了增加兔B的细胞的复制寿命的方法，该方法包括：
-在兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；以及
-在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持至少一种抗凋亡的核酸的表达，
其特征在于，经由基因递送工具的转导，向所述兔B细胞提供编码Bcl-6的核酸分子，或编码其兔同源物的核酸分子，或编码其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或提供至少一种抗凋亡的核酸分子；所述基因递送工具包括：长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外结构域，或所述胞外结构域的至少一个功能部分，或与所述GALV包膜蛋白的胞外结构域具有至少70％序列同一性的蛋白，或与所述GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白。在一个优选实施方式中，所述胞外结构域是GALV毒株SEATO的包膜蛋白的胞外结构域。所述胞外结构域优选包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL。优选地，所述序列同一性是至少75％、更优选至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选100％。
如本领域技术人员应理解的，所述胞外结构域优选也位于基因递送工具的表面(包膜)处，用于转导兔B细胞，其中胞外结构域位于野生型长臂猿白血病病毒的表面(包膜)处以便可结合宿主细胞。在一个特别优选的实施方式中，所使用的载体或其它基因递送工具包括包膜蛋白，该包膜蛋白含胞外结构域和GALV包膜蛋白的跨膜结构域，或其功能部分，该跨膜结构域与双嗜性包膜蛋白的胞质结构域融合。如在实施例中所示，这样允许对兔B细胞进行特别有效的转导。
如本文所使用的，“GALV包膜蛋白的胞外结构域的功能部分”指所示胞外结构域中仍然能够结合兔B细胞，从而介导兔B细胞的感染和/或转导的部分。这样的功能部分可能缺少一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基对于兔B细胞的结合、感染和/或转导不是必需的。
当然，由于提供本发明的发现，因此可使用GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分，向兔B细胞转导任意感兴趣的核酸分子。因此，进一步提供了与GALV包膜蛋白的胞外结构域结合的分离或重组的兔B细胞，或与所述胞外结构域的至少一个功能部分结合的分离或重组的兔B细胞，或与GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白结合的分离或重组的兔B细胞。本文还提供了如下的分离或重组的兔B细胞，该分离或重组的兔B细胞经由GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分，或经由与GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白，与基因递送工具结合。在一个优选的实施方式中，所述胞外结构域是GALV毒株SEATO的包膜蛋白的胞外结构域。所述胞外结构域优选包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL。再次，所述序列同一性优选是至少75％、更优选至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选100％。所述基因递送工具优选包括感兴趣的核酸分子，优选编码Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和/或抗凋亡的核酸序列。使用这样的基因递送工具，可产生根据本发明的稳定的兔B细胞培养物。所述抗凋亡的核酸序列优选是Bcl2家族的抗凋亡基因，最优选选自由Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10，及其兔同源物，及其功能部分和功能衍生物所组成的组。
本文还提供了GALV包膜蛋白的胞外结构域，或其能结合兔B细胞的至少一个功能部分在将感兴趣的核酸分子引入到兔B细胞中的应用，以及与GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分有至少70％序列同一性的蛋白在将将感兴趣的核酸分子引入到兔B细胞中的应用。进一步提供了包括GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分的基因递送工具，或包括与GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白的基因递送工具在增加兔B细胞的复制寿命中的应用，所述基因递送工具进一步包括编码Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和至少一种抗凋亡的核酸序列。在一个优选实施方式中，所述胞外结构域是GALV毒株SEATO的包膜蛋白的胞外结构域。所述胞外结构域优选包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL。
图9中示出了在实施例中也使用的优选的嵌合包膜蛋白。该嵌合包膜蛋白含有GALV包膜蛋白非胞外结构域(具有序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL，在图9中以粗体所示)和GALV包膜蛋白的跨膜结构域(具有序列STIAGPLLLLLLLLILGPCII，在图9中以下划线所示)，与双嗜性包膜蛋白的胞质结构域(具有序列NRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPIEYEP，在图9中以斜体和点下划线所示)融合。包括该优选的嵌合包膜蛋白的载体或其它基因递送工具能特别有效地将感兴趣的核酸分子引入到兔B细胞中。
因此，进一步提供了一种分离或重组的兔B细胞，该分离或重组的兔B细胞与图9所示的嵌合包膜蛋白结合，或与包括图9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白结合，或与图9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70％序列同一性的蛋白结合。本文还提供了一种分离或重组的兔B细胞，该分离或重组的兔B细胞经由图9所示的嵌合包膜蛋白，或经由包括图9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或经由与图9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70％序列同一性的蛋白与载体或其它基因递送工具结合。
这样的载体或其它基因递送工具特别适用于使用感兴趣的核酸分子转导兔B细胞。因此，进一步提供了图9所示的嵌合包膜蛋白，或包括图9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或与图9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70％序列同一性的蛋白，在将感兴趣的核酸分子引入到兔B细胞中的应用。
这样的载体或其它基因递送工具特别适用于增加兔B细胞的复制寿命。因此，进一步提供了一种增加兔B细胞的复制寿命的方法，该方法包括：
-在兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；以及
-在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持至少一种抗凋亡的核酸的表达，
其特征在于，经由载体或其它基因递送工具的转导，向所述兔B细胞提供编码Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或至少一种抗凋亡的核酸分子；所述载体或其它基因递送工具包括图9所示的嵌合包膜蛋白，或包括图9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或与图9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70％序列同一性的蛋白。
还提供了基因递送工具在增加兔B细胞的复制寿命中的应用，所述基因递送工具包括图9所示的嵌合包膜蛋白，或包括图9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或与图9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70％序列同一性的蛋白，所述基因递送工具进一步包括编码Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，以及至少一种抗凋亡的核酸分子。
要强调的是，尽管基于GALV的基因递送工具非常适于使用一种或多种感兴趣的核酸分子，诸如Bcl-6和抗凋亡的核酸分子，来有效转导兔B细胞，但是基于GALV的基因递送工具对于获得具有20小时或更短的短倍增时间的兔B细胞并不是强制性的。也可使用其它基因递送工具将Bcl-6和抗凋亡的核酸分子引入到兔B细胞中(尽管效率常常较低)，以产生具有小于20小时或更短的倍增时间的兔B细胞。只要Bcl-6和抗凋亡的核酸分子被引入到兔B细胞中，就可获得快速生长的B细胞培养物，但较低量的初始转导的兔B细胞长起来可能花费较长时间。使用能有效转导兔B细胞的基因递送工具(诸如本文所述的基于GALV的基因递送工具)的优点在于，会转导较高比例的初始分离的B细胞，这样由此获得的B细胞存在于得到的B细胞培养物中。与其中使用转导效率较低的基因递送工具的情况相比，使用能有效转导兔B细胞的基因递送工具在B细胞培养物内得到B细胞的更高的多样性，因为在使用转导效率较低的基因递送工具的情况中，转导了较低比例的初始B细胞。在得到的B细胞培养物内存在B细胞的更高的多样性，改进了分离出具有期望性质的一个或多个B细胞的可能性。因此，原则上讲，基因递送工具的转导效率越高，得到的B细胞培养物内的B细胞的多样性就越高。
为了诱导兔B细胞中的表达，感兴趣的核酸分子优选与启动子可操作地连接。非限制性实例包括CMV启动子和CAG启动子。在一个方面，这样的启动子是诱导性的，这意味着它的活性受到至少一种化合物的影响，诸如转录因子。
如本文所使用的，术语“基因递送工具”指能够将核酸分子转移到宿主细胞中的任意化合物。基因递送工具的非限制性实例包括(病毒)载体和质粒。术语“包括GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分的基因递送工具”指包括GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一部分的基因递送工具，其中，所述胞外结构域或其一部分能够结合兔B细胞，以便核酸可被引入到所述兔B细胞中。如前文所述，所述胞外结构域或其一部分优选位于基因递送工具的表面，以便它可结合兔B细胞上的受体。同样，如果根据本发明的基因递送工具包括与GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分有至少70％序列同一性的蛋白，则所述蛋白优选位于所述基因递送工具的表面，以便它可结合兔B细胞上的受体。
氨基酸或核酸序列的同一性的百分比，或术语“％序列同一性”在本文中被定义为：在比对两条序列并且引入空位(如果需要)以实现最大的同一性百分比之后，在候选氨基酸或核酸序列中与参照序列中的残基相同的残基的百分比。用于进行比对的方法和计算机程序在本领域中是公知的，例如“Align 2”。
GALV包膜蛋白是在长臂猿白血病病毒的病毒包膜中天然存在的并且参与宿主细胞感染的蛋白。靶点特异性通常由包膜蛋白来确定。在一个实施方式中，所述包膜蛋白是GALV毒株SEATO的包膜蛋白。含GALV包膜蛋白的逆转录病毒载体在本领域中是已知的，并且可使用分子生物学领域中常用的程序来产生，例如参见Lam et al.、1996。
术语“与启动子可操作地连接”指感兴趣的核酸序列与启动子足够接近，以便启动子可影响感兴趣的核酸序列的表达。通常，这样的启动子诱导或增加所述感兴趣的核酸的表达。术语“表达活性”指上述表达的诱导或增强。
如前文所提到的，本发明提供了如下发现：可获得平均倍增时间比目前已知的人类或鼠科B细胞培养物短的离体兔B细胞培养物。这是更令人吃惊的，因为在本发明的实施例中使用了非兔化合物，诸如人类Bcl-6核酸序列、鼠科IL21和人类CD40L。如实施例中所示，本发明人使用含人类Bcl-6核酸序列和人类Bcl-xL或Mcl-1序列的核酸分子，转导了兔B细胞。即使使用人类序列，并且在鼠科IL21和人类CD40L的存在下培养兔细胞，兔B细胞令人吃惊地表现出比人类或鼠科的B细胞更块的增殖，并且生产出更多的抗体。
因此，根据本发明，使用人类和鼠科的化合物，兔B细胞增殖非常好。在这些反应条件下，兔B细胞的增殖甚至比人类和鼠科的B细胞还好。除其它事项外，这具有以下优点：不必对目前使用的用于人类B细胞的反应条件进行调整，以使其适用于兔B细胞。无需获得兔IL21、兔CD40，或兔的编码Bcl-6的核酸序列或抗凋亡基因。而是可使用目前可获得的人类或鼠科的化合物。因此，本发明的一个方面提供了一种增加兔B细胞的复制寿命的方法，该方法包括：
-在兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；以及
-在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持抗凋亡的核酸的表达，
其特征在于，向所述兔B细胞提供选自由以下分子组成的组中的至少一种核酸分子：
*编码非兔的Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸分子；和
*非兔的抗凋亡的核酸分子。
优选地，所述非兔的核酸分子是人类核酸分子，因为人类Bcl-6和人类抗凋亡序列似乎在兔B细胞中提供了特别好的结果。在特别优选的实施方式中，向兔B细胞提供编码人类Bcl-6的核酸分子以及人类抗凋亡的核酸分子，优选人类Bcl-xL或人类Mcl-1或人类Bcl-2或人类A1或人类Bcl-w或人类Bcl2L10。
进一步地，提供了根据本发明的方法，该方法进一步包括向所述兔B细胞提供IL21和CD40L。优选地，使用非兔IL21和/或非兔CD40L。优选地，所述IL21是鼠科或人类IL21，最优选鼠科IL21。在另一优选的实施方式中，所述CD40L是鼠科或人类CD40L，最优选人类CD40L。
除了增加Bcl-6的表达和抗凋亡的核酸分子的表达之外，还有利地诱导、增强和/或维持兔B细胞中的Blimp-1或其兔同源物的表达。这增强了所述B细胞的抗体生产。因此，一个方面提供了根据本发明的方法，其中，该方法进一步包括在所述兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Blimp-1或其兔同源物的表达。
通过多种方式，调节兔B细胞中的Blimp-1或其兔同源物的表达程度。在一个实施方式中，向兔B细胞提供能直接或间接增加Blimp-1表达或其兔同源物表达的化合物。此外，或可替代的，在能直接或间接增加Blimp-1表达或其兔同源物表达的化合物的存在下，培养兔B细胞。因此，进一步提供了根据本发明的方法，该方法进一步包括：
-向所述兔B细胞提供能直接或间接增加Blimp-1表达或其兔同源物表达的化合物；和/或
-在能直接或间接增加Blimp-1表达或其兔同源物表达的化合物的存在下，培养兔B细胞。
能增加Blimp-1的表达或其兔同源物的表达的所述化合物最优选包括IL21。因此，在本发明的一个优选实施方式中，至少在部分培养时间的过程中，在IL21的存在下，培养兔B细胞。
在另一实施方式中，能增加Blimp-1表达的所述化合物包括信号转导和转录活化因子3(STAT3)蛋白或其功能部分或功能衍生物，和/或编码STAT3蛋白或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。STAT3是信号转导因子，参与B细胞的发育和分化。STAT3能够上调Blimp-1的表达。在一个优选的实施方式中，向兔B细胞提供编码STAT3或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，其中，所述核酸分子的表达受到阻抑因子的外源性诱导因子的调节，以便对STAT3的表达程度进行随意调节。例如，使用之前提到的诱导性表达系统中的一种。在一个实施方式中，使用包括STAT3或其功能部分或功能衍生物与ER的融合产物。例如，向兔B细胞提供编码雌激素受体(ER)和STAT3作为融合蛋白ER-STAT3的核酸分子。该融合蛋白是没有活性的，因为它与细胞质中的热休克蛋白形成复合体。这样，STAT3不能到达细胞核，因此不增强Blimp-1的表达。当给予外源性诱导因子4羟基三苯氧胺(4HT)时，融合蛋白ER-STAT3与热休克蛋白解离，以便STAT3能进入细胞核并且活化Blimp-1的表达。
如本文所使用的，STAT3的功能部分被定义为与天然STAT3相比，在性质上，而不一定在量上，具有相同的增加Blimp-1或其兔同源物表达能力的STAT3片段。这样的功能部分例如没有不参与或仅非常少地参与所述能力的氨基酸。
STAT3的功能衍生物被定义为STAT3蛋白，该STAT3蛋白已经被改变了，但仍然维持了它(在性质上，而不一定在量上)增加Blimp-1或其兔同源物表达的能力。以很多方式，例如通过保守氨基酸置换来提供功能衍生物，在该保守氨基酸置换中，一个氨基酸被另一个通常具有类似性质(大小、疏水性等)的氨基酸置换，这样不严重影响整体的功能。或者，功能衍生物例如包括融合蛋白，该融合蛋白具有可检测的标记或具有诱导性化合物。
因为STAT3能够增加Blimp-1的表达，或增加它的兔同源物的表达，因此还可以通过给予能增加STAT3的活性和/或表达的化合物，来间接增加Blimp-1或其兔同源物的表达。在一个实施方式中，向兔B细胞提供能增强STAT3活性的化合物，以便间接增强Blimp-1或其兔同源物的表达。
以很多方式来活化STAT3。优选地，通过向兔B细胞提供细胞因子，来活化STAT3。天然参与B细胞分化的细胞因子在调节STAT蛋白中是非常有效的。STAT3的非常有效的活化因子是IL21和IL6，但是还已知IL2、IL7、IL10、IL15和IL27活化STAT3。此外，参与天然免疫的Toll样受体(TLR)也能活化STAT3。因此，一个实施方式提供了根据本发明的方法，其中，在IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15和/或IL27的存在下，培养所述兔B细胞。最优选使用IL21，因为IL21特别适用于增强根据本发明的兔B细胞培养物的抗体生产。甚至当BCL6阻碍Blimp-1表达时，IL21也能上调Blimp-1的表达。
进一步地，或可替代地，使用突变的Janus激酶(JAK)或JAK的突变的兔同源物，来活化STAT3。在JAK自身被至少一种细胞因子活化之后，JAK天然能使STAT3磷酸化。能不依赖于细胞因子的存在而活化STAT3的突变的Janus激酶或JAK的突变的兔同源物，特别适用于根据本发明的方法中。
在又一实施方式中，通过向兔B细胞提供细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)蛋白或其兔同源物，和/或通过活化所述细胞内的SOCS蛋白或其兔同源物，来增加Blimp-1或其兔同源物的表达。可替代地，或进一步地，使用E蛋白E47、E12、E2-2和HEB中的至少一种，来增加Blimp-1或其兔同源物的表达。E47是属于螺旋-环-螺旋蛋白家族的转录因子，被命名为E蛋白。有四种E蛋白，E12、E47、E2-2和HEB，参与淋巴细胞发育。E12和E47由一个基因(被命名为E2A)编码，该基因进行不同的剪接。E蛋白已经被描述为肿瘤抑制因子。E47的特异性靶点之一是Socs1和Socs3基因。
因此，一个方面提供了根据本发明的方法，该方法通过向兔B细胞提供能直接或间接增加Blimp-1或其兔同源物表达的化合物，和/或在能直接或间接增加Blimp-1或其兔同源物表达的化合物存在下培养所述B细胞，来进一步增加兔B细胞中的Blimp-1或其兔同源物的表达，其中所述化合物包括：
-STAT3，或其功能部分或功能衍生物，和/或
-能活化STAT3的化合物，和/或
-能增强STAT3表达的化合物，和/或
-IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15、IL27、SOCS蛋白、E蛋白E47、E12、E2-2或HEB之一、突变的Janus激酶、和/或编码STAT3或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的核酸序列。
最优选地，所述化合物是IL21。
本发明进一步提供了根据本发明的方法可获得的分离或重组的兔B细胞。上述分离或重组的兔B细胞优选包括外源性抗凋亡的核酸序列，以及编码Bcl-6或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列。因此，进一步提供了分离或重组的兔B细胞，该分离或重组的兔B细胞包括编码Bcl-6或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列，以及外源性抗凋亡的核酸序列。如之前所述，所述外源性核酸分子含有在兔B细胞中不是天然出现的核酸序列，或者含有天然兔B细胞核酸序列的额外的拷贝。Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w和Bcl2L10，及其兔同源物是优选的抗凋亡的核酸分子。因此，一个优选方面提供了分离或重组的兔B细胞，该分离或重组的兔B细胞包括：编码Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列；和，编码Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列。
所述编码Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和所述外源性抗凋亡的核酸序列可存在于一个核酸分子上。或者，这些序列存在于至少两个不同的核酸分子上。
如之前所述，优选使用非兔的序列。因此，优选实施方式提供了分离或重组的兔B细胞，该分离或重组的兔B细胞包括：非兔的抗凋亡的核酸序列，和编码Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的非兔的核酸序列。所述非兔的核酸序列优选含有人类序列。
在特别优选的实施方式中，提供了分离或重组的兔B细胞，该分离或重组的兔B细胞包括：
-编码人类Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和
-人类抗凋亡的核酸序列，该人类抗凋亡的核酸序列优选编码人类Bcl-xL或人类Mcl-1或人类Bcl-2或人类A1或人类Bcl-w或人类Bcl2L10，或其功能部分或功能衍生物。再次，所述编码Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和所述抗凋亡的核酸序列可存在于一个核酸分子上，或可替代的，这些序列可存在于至少两个不同的核酸分子上。
本发明还提供了通过本发明的方法可获得的离体兔B细胞培养物。重要的优点在于以下事实：现在获得的离体B细胞培养物具有短的平均倍增时间。因此提供了具有20小时或更短的平均倍增时间的离体兔B细胞培养物。进一步优选的实施方式提供了离体兔B细胞培养物，该离体兔B细胞培养物包括根据本发明的兔B细胞。所述兔B细胞优选包括：编码人类Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和抗凋亡的核酸序列。还提供了离体兔B细胞培养物，该离体兔B细胞培养物包括在非兔IL21和/或非兔CD40L的存在下的兔B细胞。优选地，所述IL21是鼠科或人类IL21，最优选是鼠科IL21。在另一优选实施方式中，所述CD40L是鼠科或人类CD40L，最优选是人类CD40L。
还提供了通过本发明的方法获得的抗体，以及由根据本发明的兔B细胞生产的抗体，或由根据本发明的离体兔B细胞培养物生产的抗体。上述抗体尤其可用于治疗或诊断应用。优选地，所述抗体是单克隆抗体。
在下面的实施例中，对本发明进行了进一步的解释。这些实施例并不限制本发明的范围，仅用于阐明本发明。
具体实施方式
实施例
实施例1
B细胞的转导
通过传统方法，如磷酸钙沉淀、脂质体形成或电穿孔，将基因转移到淋巴细胞中是效率低的，但更重要的是，常常缺少稳定的基因整合。然而，如果选择了适当的病毒包膜，病毒转导直接导致基因稳定地整合到靶细胞的基因组中，并且效率非常高。逆转录病毒和慢病毒转导都适用于有效的基因转移。虽然逆转录病毒整合依赖于细胞分裂，慢病毒转导也可用于不分裂的细胞，如血浆B细胞。重组的逆转录病毒的大规模制备可以很容易地通过使用稳定的生产细胞系，诸如Phoenix表达平台(Kinsella and Nolan,1996)来实现。高滴度的慢病毒的生产倾向于更加繁琐，这主要是因为表达的病毒蛋白和包膜的毒性。
对于本实施例，我们使用了基于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)的平台，该平台使用双嗜性或表达长臂猿白血病病毒(GALV)包膜的生产细胞(Wilson et al.,1995)。在我们的基于GALV的载体中，GALV毒株SEATO包膜蛋白的跨膜结构域与两性包膜蛋白的胞质结构域融合(图9)。
建立转移载体，以便Bcl-6、Bcl-xL和绿色荧光蛋白(GFP)标记物蛋白从同一病毒RNA同时翻译出来(图8)。通过使“自剪切的”2A肽序列(Szymczak et al.,2004)位于BCL-6和BCL-xL编码区之间，并且使内部核糖体进入序列(IRES)位于GFP报告基因上游，来实现该多顺反子途径。病毒转导效率是高且无偏向性的。
永生化兔B细胞的生成
使用如Kwakkenbos et al.,2010和专利申请WO 2007/067046所述的BCL-6/Bcl-xL技术，使人类记忆B细胞永生化。简单来讲，使用聚蔗糖(ficoll)密度梯度从兔血液中分离出PBMC，并且使用识别Ig(IgG H+L：IgG重链和κ和λ轻链)的抗体，有时与IgM特异性抗体组合，对Ig表达进行染色。使用FACS分选仪分离出(Ig阳性，或Ig阳性+IgM阴性)B细胞，并且在稳定表达CD40L(CD40L-L细胞，105细胞/ml)的γ辐照(50Gy)的小鼠L细胞成纤维细胞上，与重组的小鼠白介素(IL)-21一起刺激36～48小时。收获细胞，并且使用没有FCS的培养基进行冲洗，然后将细胞转移至(Takara,Shiga，日本)包被的组织培养板，在该组织培养板上，使用含BCL-6、Bcl-xL和作为报告蛋白的GFP的逆转录病毒载体转导这些细胞。可替代地，使用含BCL-6、Mcl-1和GFP的逆转录病毒载体转导细胞。使用表达CD40配体的L细胞和IL-21，维持转导的B细胞的培养。在图1中，对比了在转导后4天时，GALV和双嗜型逆转录病毒的转导效率。与GALV型逆转录病毒转导后80％的细胞被转导相比，使用双嗜型逆转录病毒仅0.8％的细胞被转导了。很明显，对于转导兔B细胞，GALV型逆转录病毒比双嗜型逆转录病毒优秀。
实施例2
细胞培养
我们将B细胞(2×105细胞/ml)维持在含8％FBS和青霉素-链霉素(Roche)，且补充有重组的小鼠白介素21(IL-21)(50ng/ml)的伊氏改良的杜氏培养基(Iscove’s modifiedDulbecco’s medium，Gibco)中，并且将它们培养在稳定表达CD40L的γ辐照(50Gy)的小鼠L细胞成纤维细胞(CD40L-L细胞，105细胞/ml)上。为了确定细胞的倍增时间，将细胞以50～100.000细胞/孔的密度，与CD40L-L细胞和IL-21一起培养在24孔板中。每3～4天对细胞进行计数，并且将50～100.000个细胞转移至新的孔。图2中，示出了来自两位人类供体(89和93)的B细胞、一个美洲鸵B细胞样品(美洲鸵)和一个转导有GALV型逆转录病毒的兔B细胞样品(Rb 6XL)的生长曲线，该GALV型逆转录病毒携带含人类Bcl-6序列和人类Bcl-xL的核酸分子。另外，示出了一个转导有GALV型逆转录病毒的兔样品(Rb6M)的生长曲线，该GALV型逆转录病毒携带含人类Bcl-6序列和人类Mcl-1的核酸分子。转导的兔B细胞具有19小时的平均倍增时间，因此生长的比人类或美洲鸵的B细胞快，其中人类或美洲鸵的B细胞的倍增时间在26小时至32小时之间。通过确定B细胞在数个3～4天的时间间隔中的增加，并且将获得的结果进行平均，来初始计算这些平均倍增时间。随后，计算在整个培养期的过程中的总平均倍增时间。这样得到转导的兔B细胞的平均倍增时间为18小时，转导的人类B细胞的平均倍增时间为25～29小时，以及转导的美洲鸵B细胞的平均倍增时间为27小时。这样证明了我们的观察，即我们的方法产生具有20小时或更短的平均倍增时间的兔B细胞培养物，而人类、鼠科和美洲鸵的B细胞通常具有在25小时至36小时之间的倍增时间。
实施例3
B细胞受体的表达和抗原特异性染色
永生化的人类B细胞表达B细胞受体。该特性使得能够对B细胞进行抗原特异性染色和分选。为了确定B细胞受体是否也在转导的兔B细胞上表达，使用与兔IgG、兔IgM或兔IgA特异性反应的荧光标记的抗体，对B细胞克隆进行染色。将B细胞在冷(4℃)的细胞培养基中进行冲洗，并且在冰上、黑暗中与含免疫荧光标记的抗体孵育，该含免疫荧光标记的抗体对兔的IgG、IgM、IgA或标记的抗原具有特异性。之后，冲洗掉多余的标记的抗体或抗原，并且在FACS分析仪(Guava easycyte(Millipore)或FACS Aria3(BD))上，分析B细胞受体的表达。
图3中，使用特异性识别兔抗体同种型IgG、IgA或IgM的荧光标记的抗体，对不同同种型的三种不同B细胞克隆进行染色。很明显，对于不同的兔抗体同种型，可对B细胞受体进行有效染色。因此，我们总结出，永生化的兔B细胞也表达B细胞受体。
此外，还使用荧光标记的流感蛋白，对来自已用人类流感疫苗免疫的兔或未经处理的对照兔的流感特异性的B细胞进行染色(图4)。使用荧光标记的H1、H3或流感B对兔B细胞进行染色，并且使用FACS分选仪以每孔1个细胞进行分选。
实施例4
一个细胞来源的克隆性兔B细胞培养物的发育。
使用FACS分选仪以每孔一个细胞分选转导的B细胞，并且在稳定表达CD40L(CD40L-L细胞，105细胞/ml)的γ辐照(50Gy)的小鼠L细胞成纤维细胞与重组的小鼠白介素(IL)-21的存在下进行培养。每3～4天，添加新鲜的CD40L-L细胞和IL-21。在接种细胞(每孔一个细胞)后9天开始，在ELISA中分析上清液的兔免疫球蛋白G(IgG)的产生。为了进行对比，还平行分析了在人类B细胞克隆的上清液中的人类IgG。
图7中，描绘了从起始一个细胞培养后的9天开始，上清液中的抗体浓度随时间的变化。确定了以下样品的抗体浓度：两位人类供体；和一个转导有GALV型逆转录病毒的兔B细胞样品，该GALV型逆转录病毒携带含人类Bcl-6序列和人类Bcl-xL的核酸分子；以及一个转导有GALV型逆转录病毒的兔B细胞样品，该GALV型逆转录病毒携带含人类Bcl-6序列和人类Mcl-1的核酸分子。来自兔的B细胞克隆在较短的时间段(分别为13～18天和15～20天)内产生30ng/ml和100ng/ml的IgG浓度。这提供了重要的优点，即与人类B细胞克隆相比，它允许更早地筛选兔B细胞克隆的感兴趣的抗体。
实施例5
兔的免疫。
使用在完全氟氏佐剂中的含15ug H1N1、15ug H3N2和15ug infl B的人类流感疫苗，对两只新西兰白兔进行免疫。三周后，使用在不完全氟氏佐剂中的相同的疫苗对兔进行增强。在增强后五天，从兔取血，从血液中分离出B细胞，并且使用GALV型逆转录病毒(含有与双嗜性包膜蛋白的胞质结构域融合的，GALV毒株SEATO包膜蛋白的胞外结构域和跨膜结构域)进行转导，其中GALV型逆转录病毒携带含人类Bcl-6序列和人类Bcl-xL的核酸分子。将转导的B细胞以不同的细胞密度接种到培养板中，并且如实施例4中所述进行培养。另外，使用疫苗的荧光标记的组分H1、H3或流感B对转导的B细胞进行标记，并且使用FACS分选仪以每孔一个细胞进行分选，并且如实施例4中所述进行培养。分析培养细胞的上清液与完整疫苗或与它的各组分的结合。结果示于图4～图6中，并且示出：可通过以不同密度接种细胞(图5)，在来自接种的兔的B细胞库中鉴定出抗原特异性B细胞；并且，也可使用标记的抗原对细胞进行分选(图4和图6)，以非常有效地在来自接种的兔的B细胞库中鉴定出抗原特异性B细胞。
实施例6
通过使用双嗜型逆转录病毒引入基因Bcl-6和Bcl-xl，使兔B细胞永生化。
可通过使用不同类型的载体，诸如实施例1中所示的GALV和双嗜型逆转录病毒引入基因Bcl-6和Bcl-xl，实现兔B细胞的永生化。进一步追踪转导有双嗜型逆转录病毒的B细胞的生长，以证实通过双嗜型逆转录病毒引入Bcl-6和Bcl-xl也导致兔B细胞的永生化。与使用GALV型逆转录病毒转导后的80％的细胞被转导相比，使用双嗜型逆转录病毒0.8％的细胞被转导了(图1和图10)。转导后十天，94％的转导有双嗜型逆转录病毒的细胞是GFP阳性的，这证明转导的细胞比非转导的细胞长的快(图10)。
为了确定细胞倍增时间，如实施例2中，将细胞以50～100.000细胞/孔的密度，与CD40L-L细胞和IL-21一起培养在24孔板中。每3～4天对细胞进行计数，并且将50～100.000个细胞转移至新的孔。图11中，描绘了转导有双嗜性病毒的兔B细胞的生长曲线。计算的倍增时间是19小时，这与转导有GALV型逆转录病毒的兔B细胞(18小时)相当。总之，尽管转导效率比基于GALV的载体低很多，但通过双嗜性逆转录病毒将Bcl-6和Bcl-xl引入到兔B细胞中，也得到兔B细胞的永生化。
附图说明
图1.
兔记忆B细胞的转导。基于Ig的表达，从PBMC中分离出兔B细胞。在CD40L L细胞上，同时使用rm-IL-21，使细胞活化36～40小时。使用含BCL6和Bcl-xL的逆转录病毒载体转导细胞。对GALV型逆转录病毒和双嗜型逆转录病毒都进行了测试。然后，在重组的小鼠IL-21的存在下，将转导的细胞培养在CD40L-L细胞上。在培养四天后，基于GFP的表达确定转导效率。GALV型逆转录病毒示出比双嗜型(0.8％)逆转录病毒优秀(80％)的转导效率。
图2.
分析兔B细胞的生长曲线，该兔B细胞转导有含BCL6和Bcl-xL的逆转录病毒载体或含BCL6和Mcl-1的逆转录病毒载体。为了进行对比，平行分析了来自美洲驼细胞和来自两位不同供体的人类细胞的B细胞的生长曲线，这些B细胞都转导有相同的含BCL6和Bcl-xL的逆转录病毒载体。
图3.
使用FACS，对三种不同的转导Bcl-6Bcl-xL的兔B细胞克隆，检测了IgG、IgM和IgA表面免疫球蛋白表达。
图4.
在具有不同特异性的兔B细胞库内，鉴定抗原特异性兔B细胞。
图5.
获得针对含15ug H1N1、15ug H3N2和15ug inflB的人类流感疫苗的不同组分的抗原特异性兔抗体。使用人类流感疫苗对兔进行免疫和增强。使B细胞永生化，并且在重组的小鼠IL-21的存在下，以不同密度接种在384孔板中的CD40L-L细胞上。在ELISA中，筛选兔B细胞培养物上清液中存在的抗体的流感特异性。针对疫苗所有组分，观察抗原特异性抗体。
图6.
使用荧光标记的流感蛋白，对来自兔的永生化B细胞进行染色，其中兔经过含15ugH1N1、15ug H3N2和15ug infl B的人类流感疫苗的免疫。使用FACSAria分选仪，将示出与流感蛋白结合的B细胞以每孔一个细胞的密度分选在384孔板中，在重组的小鼠IL-21的存在下的CD40L-L细胞上。为了流感特异性抗体，而在ELISA中对上清液进行筛选。高频率地观察到针对用于抗原特异性分选的疫苗组分的抗原特异性抗体。
图7.
在不同时间点，克隆B细胞的上清液中的抗体浓度。在辐照的CD40L-L细胞并且补充有小鼠IL-21的存在下，将人类、美洲驼和兔的转导的B细胞以每孔一个细胞的密度进行接种。每3～4天，补充CD40L-L细胞和IL-21。在培养过程中的不同时间点，在ELISA中分析各细胞的IgG浓度。每一测量在不同孔中进行。兔B细胞经含BCL6和Bcl-xL的逆转录病毒载体或含BCL6和Mcl-1的逆转录病毒载体转导。其它所有细胞(人类和美洲驼)都经BCL6和Bcl-xL转导。
图8.
用于转导兔和人类B细胞的载体的示意图。
图9.
与双嗜性包膜蛋白的胞质结构域(斜体+点下划线)融合的，GALV SEATO包膜蛋白的胞外结构域的序列(粗体)，和GALV SEATO包膜蛋白的跨膜结构域(下划线)。
图10.
兔记忆B细胞的转导，和转导有双嗜型逆转录病毒的兔B细胞的生长物。基于Ig的表达，从PBMC中分离出兔B细胞。在CD40L L细胞上，同时使用rm-IL-21，使细胞活化36～40小时。使用含BCL6和Bcl-xL的逆转录病毒载体转导细胞。对GALV型逆转录病毒和双嗜型逆转录病毒都进行了测试。然后，在重组的小鼠IL-21的存在下，将转导的细胞培养在CD40L-L细胞上。在培养四天后，基于GFP的表达确定转导效率。GALV型逆转录病毒示出比双嗜型(0.8％)逆转录病毒优秀(80％)的转导效率。转导后10天，基于GFP的表达，94％的转导有双嗜型逆转录病毒的细胞是永生化的，这示出转导的细胞比非转导的细胞长的快。
图11.
分析了兔B细胞的生长曲线，该兔B细胞转导有含BCL6和Bcl-xL的双嗜型逆转录病毒载体。
参考文件
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WO 2007/067046

Claims (27)

1.兔B细胞在获得具有20小时或更短的平均倍增时间的离体B细胞培养物中的应用。
2.一种获得具有20小时或更短的平均倍增时间的离体B细胞培养物的方法，所述方法包括：
在B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；以及
在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持至少一种抗凋亡的核酸分子的表达，
其特征在于，所述B细胞是兔B细胞。
3.一种用于增加兔B细胞的复制寿命的方法，所述方法包括：
在兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；以及
在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持至少一种抗凋亡的核酸的表达，
其特征在于，经由基因递送工具的转导，向所述兔B细胞提供编码Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或提供至少一种抗凋亡的核酸分子；所述基因递送工具包括长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分，或与所述GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白。
4.长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分，或与所述GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白，在将感兴趣的核酸分子引入到兔B细胞中的应用。
5.一种获得抗体的方法，包括：
在兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Bcl-6或其兔同源物的表达；
在所述B细胞中，诱导、增强和/或维持至少一种抗凋亡的核酸分子的表达；
离体培养所述B细胞；以及
在7～14天内，优选在9～12天内，收获由所述B细胞生产的抗体。
6.根据权利要求2、3或5中任一项所述的方法，其特征在于，向所述兔B细胞提供：
编码非兔的Bcl-6，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或
至少一种非兔的抗凋亡的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述非兔的核酸分子是人类的核酸分子。
8.根据权利要求2～3或5～7中任一项所述的方法，其中，所述至少一种抗凋亡的核酸分子包括Bcl2家族的基因，所述Bcl2家族的基因优选选自由Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、及它们的兔同源物和它们的功能部分和它们的功能衍生物组成的组。
9.根据权利要求2～3或5～8中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在所述兔B细胞中，诱导、增强和/或维持Blimp-1或其兔同源物的表达。
10.根据权利要求2～3或5～9中任一项所述的方法，进一步包括向所述兔B细胞提供IL21和CD40L。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述IL21是小鼠或人类的IL21，和/或，其中，所述CD40L是小鼠或人类的CD40L。
12.根据权利要求2～3或5～11中任一项所述的方法，包括：
向所述兔B细胞提供能直接或间接增强Bcl-6的表达或其兔同源物的表达的化合物；和/或
在能直接或间接增强Bcl-6的表达或其兔同源物的表达的化合物的存在下，培养所述兔B细胞。
13.根据权利要求2～3或5～12中任一项所述的方法，包括：
向所述兔B细胞提供能直接或间接增强Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10和/或其兔同源物的表达的至少一种化合物；和/或
在能直接或间接增强Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10和/或其兔同源物的表达的至少一种化合物的存在下，培养所述兔B细胞。
14.根据权利要求2～3或5～13中任一项所述的方法，进一步包括：
向所述兔B细胞提供能直接或间接增加Blimp-1的表达或Blimp-1的兔同源物的表达的至少一种化合物；和/或
在能直接或间接增加Blimp-1的表达或Blimp-1的兔同源物的表达的至少一种化合物的存在下，培养所述兔B细胞。
15.一种分离或重组的兔B细胞，所述分离或重组的兔B细胞与长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分结合，或与所述GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白结合。
16.根据权利要求15所述的兔B细胞，所述兔B细胞经由GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分，或经由与所述GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白，与基因递送工具结合，其中所述基因递送工具包括编码Bcl-6，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或抗凋亡的核酸序列。
17.根据权利要求16所述的兔B细胞，其中，所述抗凋亡的核酸序列是编码选自下组中的蛋白的核酸序列：Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10，它们的兔同源物，它们的功能部分，它们的功能衍生物，和它们的任意组合。
18.一种分离或重组的兔B细胞，包括：
非兔的抗凋亡的核酸分子，所述非兔的抗凋亡的核酸分子优选编码Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10或其功能部分或功能衍生物；和
非兔的核酸分子，所述非兔的核酸分子编码Bcl-6或其功能部分或功能衍生物。
19.根据权利要求18所述的兔B细胞，其中，所述非兔的核酸序列是人类的核酸序列。
20.一种离体的兔B细胞培养物，所述离体的兔B细胞培养物具有20小时或更短的平均倍增时间。
21.一种离体的兔B细胞培养物，包括根据权利要求18或19所述的兔B细胞。
22.一种离体的兔B细胞培养物，所述离体的兔B细胞培养物通过根据权利要求2～3或5～14中任一项所述的方法获得。
23.一种抗体，所述抗体通过根据权利要求2～3或5～14中任一项所述的方法获得。
24.一种抗体，所述抗体由根据权利要求18或19所述的兔B细胞生产或由根据权利要求20～22中任一项所述的离体的兔B细胞培养物生产。
25.一种基因递送工具在增加兔B细胞的复制寿命中的应用，其中所述基因递送工具包括：
长臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分，或与所述GALV包膜蛋白的胞外结构域的至少一个功能部分具有至少70％序列同一性的蛋白；以及，
编码Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和/或至少一种抗凋亡的核酸序列。
26.根据权利要求3所述的方法，或根据权利要求4所述的应用，或根据权利要求15或16所述的兔B细胞，或根据权利要求25所述的应用，其中，所述胞外结构域是GALV毒株SEATO的包膜蛋白的胞外结构域。
27.根据权利要求3所述的方法，或根据权利要求16所述的兔B细胞，或根据权利要求25所述的应用，其中，所述基因递送工具包括如图9所示的嵌合包膜蛋白，或包括如图9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或与如图9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70％序列同一性的蛋白。
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